CN112533632A - 用于预防和治疗癌症的gremlin-1拮抗剂 - Google Patents

用于预防和治疗癌症的gremlin-1拮抗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN112533632A
CN112533632A CN201980041089.7A CN201980041089A CN112533632A CN 112533632 A CN112533632 A CN 112533632A CN 201980041089 A CN201980041089 A CN 201980041089A CN 112533632 A CN112533632 A CN 112533632A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
grem
antagonist
antibody
grem1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980041089.7A
Other languages
English (en)
Inventor
G·C·G·戴维斯
S·雷德哈姆
A·萨内提诺
K·克拉克
D·赫维特
V·潘那果普洛斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Adelaide
UCB Biopharma SRL
Oxford University Innovation Ltd
Original Assignee
University of Adelaide
UCB Biopharma SRL
Oxford University Innovation Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1809946.5A external-priority patent/GB201809946D0/en
Priority claimed from GBGB1815694.3A external-priority patent/GB201815694D0/en
Application filed by University of Adelaide, UCB Biopharma SRL, Oxford University Innovation Ltd filed Critical University of Adelaide
Publication of CN112533632A publication Critical patent/CN112533632A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

本发明涉及在治疗或预防癌症的方法中使用的抗GREM1拮抗剂。

Description

用于预防和治疗癌症的GREMLIN-1拮抗剂
发明领域
本发明涉及抗GREM1拮抗剂用于癌症治疗方法中。所述癌症通常是具有基质的实体癌，通常具有基质GREM1过表达。所述癌症可有上皮GREM1过表达。本发明进一步涉及用GREM1拮抗剂和另外的抗癌剂(如化学治疗剂)，以及相关的组合物的联合治疗。本发明还涉及基于基质GREM1过表达的癌症的检测、预后预测和治疗选择。
发明背景
Gremlin-1(也称为Drm和CKTSF1B1和GREM1)是一种184个氨基酸的糖蛋白，是半胱氨酸结分泌蛋白(cystine-knot secreted protein)Dan家族的一部分(与Cerberus和Dan等一起)。GREM1结合BMP-2、4和7并抑制其信号传导能力，以及记载的可能通过VEGFR2的激动作用发挥的促血管生成作用。GREM1的主要作用是在发育过程中，其中在肾脏形成和肢芽(limb bud)形成过程中至关重要。这些重要的作用使得GREM1纯合敲除在小鼠中是胚胎致死的。
在成人期，GREM1水平的升高与特发性肺纤维化和肺动脉高压有关，其中BMP2、4和7信号传导降低，伴随TGFβ水平升高。在糖尿病和慢性同种异体移植肾病中，GREM1表达与纤维化评分相关。
GREM1水平升高还与硬皮病、糖尿病肾病、神经胶质瘤、头颈癌、前列腺癌和结肠直肠癌等尤其有关(Sneddon等人；Guan等人)。GREM1已被证明在体外激活癌细胞侵袭和增殖，并被认为在子宫癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和肉瘤中起作用。
需要确定用于治疗和预防癌症的有效疗法。
发明概述
发明人惊奇地发现，GREM1拮抗剂是，对抗伴有基质和/或上皮GREM1过表达的肿瘤(包括结肠直肠癌和多发性骨髓瘤)的有效的治疗和预防试剂。基于这些结果，发明人设想GREM1拮抗剂将在癌症的治疗和预防中具有普遍用途，包括具有基质GREM1过表达的其他癌症。本文提供的体内结果说明了通过施用GREM1拮抗剂长期预防各种小鼠肿瘤模型中瘤形成的诱导，以及通过施用GREM1拮抗剂对已有肿瘤的显著治疗效果。因此，发明人的发现提供了预防和治疗癌症的新方法，包括对标准化学治疗剂有抗性的癌症。
因此，在本发明的第一方面，提供了用于治疗或预防癌症的方法中的抗GREM1拮抗剂。
在本发明的另一方面，提供了用于治疗癌症的方法中的抗癌剂，其中该方法包括分别、顺序或同时施用抗GREM1拮抗剂。
在本发明的另一方面，提供了治疗癌症的方法，包括给有需要的受试者施用治疗有效量的抗GREM1拮抗剂。
在本发明的又一方面，提供了包含抗GREM1拮抗剂和另外的抗癌剂的组合物或试剂盒。
在本发明的另一方面，提供了用于检测患者中癌症的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，其中GREM1的基质过表达指示该患者患有癌症。
在本发明的又一方面，提供了用于对患者进行癌症预后的方法，该方法包括确定所述癌症是否包括GREM1的基质过表达，其中癌症中GREM1的基质过表达表明患者的预后比GREM1的正常基质表达的情况更差。
在本发明的另一方面，提供了用于确定患有或疑似患有癌症或处于患癌症风险中的患者是否可能对化学治疗剂的治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，从而预测患者是否可能对化学治疗剂的治疗有应答。
在本发明的另一方面，提供了用于确定患有或疑似患有癌症或处于患癌症风险中的患者是否可能对GREM1拮抗剂的治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，从而预测患者是否可能对GREM1拮抗剂的治疗有应答。
附图简述
图1。HEK-ID1报告基因测定中免疫接种衍生抗体的信号恢复百分比。
图2。HEK-ID1报告基因测定中文库衍生抗体的信号恢复百分比。
图3。用人Gremlin(图3A)和小鼠Gremlin(图3B)滴定的HEK-ID1报告基因测定的结果，以及抗体7326(显示为抗体PB376)在恢复BMP的信号传导中的效果。
图4。Gremlin-Fab复合物的结构模型，突出显示了可能的BMP结合区和Fab表位。
图5。接种后第0天和第7天来自小鼠肠隐窝的器官样培养物。培养基含有重组蛋白补充剂和/或测试抗Grem1抗体。E＝表皮生长因子，G＝Grem1，R＝Rspo1。
图6。从Vil1-Grem1小鼠上皮提取的蛋白质的蛋白质印迹。以30mg/kg施用6周的抗体能够恢复上皮pSMAD1,5信号传导。
图7。用抗Grem1抗体治疗6周后，用抗体治疗的Vil1-Grem1动物表型。抗体治疗使小肠表型正常化，并防止深度息肉病的发展。抗体治疗通过将Ki67、Sox9、EphB2和溶菌酶染色适当限制在肠隐窝的底部，并在小肠绒毛的分化细胞中分辨正常CK20染色，防止绒毛异位隐窝的形成并使细胞命运的决定正常化。
图8。长期抗Grem1抗体治疗后Grem1引发的息肉病小鼠品系的Kaplan-Meier存活图。
图9。Apc驱动的肿瘤发生中的基质Grem1。A.野生型和Villin-CreERT2上的Grem1ISH；Apc fl/fl小鼠对急性上皮Apc缺失的反应显示基质Grem1的深度上调。B.ApcMin小鼠中基质Grem1的转基因缺失减少了在285天时突变Apc肿瘤的负荷。C.用抗Grem1抗体延长治疗(30mg/kg/周)减少ApcMin肿瘤负荷并延长动物寿命。
图10。在骨髓瘤患者的原代基质培养物中Grem1表达升高。从来自年龄和性别匹配的健康供体和骨髓瘤患者的骨髓环锯衍生的基质细胞培养物中提取RNA，并通过实时PCR分析Grem1上的表达。与健康供体相比，骨髓瘤患者群中Grem1的表达显著更高。数据表示为针对ActB标准化的mRNA表达。(平均值±标准差，＊＊P<0.001，T检验，正常；n＝17和MM；n＝15)。
图11。在健康C57Bl6/KaLwRij.Hsd小鼠和注射5TGM1.Bmx1MM PC、患有可通过BLI检测到的疾病的小鼠的密质骨中分析了Grem1的表达。(平均值±标准差，P＝0.1120，T检验，正常；n＝11且携带肿瘤；n＝9)。(B)从荷瘤小鼠后肢分离的BM基质中的Grem1表达与如BLI所检测的相应肢体中的肿瘤负荷相关(Pearson相关；p<0.05，R2＝0.414)。
图12。在与以下共培养24、48和72小时后，分析小鼠骨髓来源的基质OP9细胞系中的Grem1表达：(A)5TGM1.Bmx1细胞，共培养于上层3μm跨孔(transwell)；(B)5TGM1.亲本细胞，直接铺于贴壁基质细胞上。对于接触培养，OP9.GFP+细胞通过流式细胞术从5TGM1.亲本MM PC中分选出来，用于通过实时PCR分析Grem1的表达。共培养72小时后，在OP9基质细胞中观察到Grem1表达的显著增加。数据表示为相对于ActB、并标准化到仅有培养基的对照的mRNA表达。(3次重复实验的平均值±标准误，＊P<0.05，t检验)。
图13。在与各种人MM细胞系共培养72小时的正常人基质中分析Gremlin1的表达。在收集以用于分析Grem1表达之前，从基质中洗涤MM细胞。在KMS-11(p＝0.0159)和U266(p＝0.0343)共培养条件下，Gremlin1表达显著增加(ANOVA)。数据以与三个单独的正常基质供体的共培养物的重复形式呈现，针对仅有培养基的对照进行了标准化。
图14。在OP9-基质细胞中Grem1转基因表达由(A)RT-PCR和(B)蛋白质印迹证实。如通过相对荧光素酶活性测定的，与仅用OP9载体的对照的共培养物相比，5TGM1 MM PC与经修饰而过表达Grem1的OP9-基质细胞在(C)细胞接触(D)跨孔共培养物中显示出升高的增殖率。(3个重复实验的平均值±SEM，＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001，t检验)。
图15。(A)与用IgG对照处理的小鼠相比，注射5TGM1.Bmx1 MM PC并随后用Grem1中和抗体处理的C57Bl6/KaLwRij小鼠在4周后显示出总体肿瘤负荷的显著降低，如BLI所示。平均值±SEM，n＝每组13只小鼠＊＊＊＊P<0.0001，单向ANOVA。(B)对注射肿瘤细胞后第4周放血的小鼠进行SPEP试验。相对于血清白蛋白的M-峰强度被用作疾病负荷的量度。与接受IgG对照处理的小鼠相比，用抗Grem1抗体处理的小鼠具有显著较低的M-峰强度。平均值±SD，＊＊P<0.01，t检验。(C)用IgG对照和Grem1中和抗体处理的小鼠的代表性的BLI腹侧扫描图像。
图16。在OP9-Grem1过表达细胞或仅有载体的对照存在的情况下，在3μm跨孔中共培养5TGM1 MM细胞72小时。通过蛋白质印迹分析来自5TGM1细胞的裂解物的Smads 1/5/9磷酸化。与仅有载体的对照相比，当在存在Grem1过表达BM基质细胞的情况下培养时，5TGM1细胞显示Smads 1/5/9的磷酸化减少。Hsp90用作上样对照。图像代表两次重复实验。
图17。在用20ng/ml重组IL6处理72小时后，评估BM基质细胞系OP9的Grem1表达。在用IL6刺激的OP9细胞中观察到Grem1表达显著增加。(3次重复实验的平均值±SEM，＊＊P<0.01)。
图18。(A)与接受IgG对照(Ab101.4)处理的小鼠相比，在接种5TGM1.Bmx1 MM PC之前接受Grem1中和抗体(Ab7326)处理的C57Bl6/KaLwRij小鼠在细胞接种后4周显示出总体肿瘤负荷显著降低，如BLI所示。平均值±标准误，n＝每组7-8只小鼠＊＊＊＊P<0.0001，单向方差分析。(B)对注射肿瘤细胞后第4周放血的小鼠进行SPEP试验。相对于血清白蛋白的M-峰强度被用作疾病负荷的量度。与接受IgG对照处理的小鼠相比，用抗Grem1抗体处理的小鼠具有显著更低的M-峰强度。平均值±标准差，＊＊P<0.0001，t检验。(C)接种肿瘤细胞后4周，用IgG对照和Grem1中和抗体处理的小鼠的代表性BLI腹侧扫描图像。
图19。Grem1 mRNA表达的定量RT-PCR分析。在常氧和低氧条件下培养48小时后，在(A)人MDA-MB-231-TXSA乳腺癌细胞和(B)人MF9乳腺成纤维细胞中分析Grem1基因表达(n＝1)。表达水平通过RT-PCR测定，并针对β-肌动蛋白标准化。三个孔的平均值±标准差，＊p<0.05，＊＊p<0.005，学生不成对t检验。
图20。响应于Grem1刺激的人乳腺癌细胞增殖。用不同浓度的rhGrem1刺激MDA-MB-231-TXSA细胞，并在常氧(每对的左侧柱)和低氧条件(每对的右侧柱)下培养(A)24小时和(B)48小时。数据是一式三份进行的三次独立实验的代表。平均值±标准差，＊p<0.05，＊＊p<0.005，＊＊＊p<0.0005，Tukey多重比较检验的双向方差分析。
图21。响应于基质来源的Grem1的鼠4T1乳腺癌细胞增殖。将4T1细胞与表达Grem1的基质细胞或载体对照OP9基质细胞共培养72小时。数据是一式三份进行的三次独立实验的代表。平均值±标准差，＊＊＊p<0.0005，Student不配对t检验(双侧)。
图22。新型抗Grem1抗体(Ab7326)逆转了小鼠4T-1乳腺癌细胞中Grem1介导的Smad1/5/9磷酸化的抑制。用所示的联合处理刺激鼠4T1乳腺癌细胞2小时，并用对磷酸-Smad1/5/9有反应性的抗体进行蛋白质印迹分析(上图)。β-肌动蛋白(下图)作为上样对照。
图23。单一疗法和联合疗法对VG/Min小鼠的效果。
图24。多种实体肿瘤中的Grem1表达。
图25。膀胱癌中Grem1表达与存活指示的关系。顶线–Grem1低；底线–Grem1高。
图26。胰腺导管腺癌中Grem1表达与存活指示的关系。顶线–Grem1低；底线–Grem1高。
图27。卵巢腺癌中Grem1表达与存活指示的关系。顶线–Grem1低；底线–Grem1高。
图28。基底乳腺癌中Grem1表达与存活指示的关系。顶线–Grem1低；底线–Grem1高。
图29。肺癌中Grem1表达与存活指示的关系。顶线–Grem1低；底线–Grem1高。
图30。用抗Grem1抗体处理6周后，经抗体处理的Vil1-Grem1肠表型。
图31。长期抗Grem1抗体处理后Grem1引发的息肉病小鼠品系的Kaplan-Meier存活图。(A)Vil1-Grem1小鼠。(B)Vil1-Grem1；ApcMin小鼠。
图32。(A)Kaplan-Meier图显示，用抗Grem1抗体(30mg/kg/周)进行长期处理可减少ApcMin肿瘤负荷并延长动物寿命。(B)ApcMin和Grem1的原位杂交。
图33。与IgG对照相比，当小鼠(A)接种肿瘤细胞后和(B)接种肿瘤细胞前用Grem1中和抗体Ab7326处理时，C57Bl6/KaLwRij小鼠后肢骨中的肿瘤负荷显著降低(如生物发光成像(bioluminescent imaging，BLI)所示)。在(C)接种肿瘤细胞后或(D)接种肿瘤细胞前的情形下，在处理组之间观察到脾脏肿瘤负荷呈下降趋势。Student t检验，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。
图34。对(A)Vil1-Grem1小鼠和(B)ApcMin小鼠中已建立的息肉病进行处理的Kaplan Meier存活图。中位生存:ApcMin:运载体：192天(n＝15)；ApcMin抗Grem1:264.5天(n＝10)；Vil-Grem1运载体:242天(n＝13)；和Vil-Grem1抗Grem1:477天(n＝8)，两种情况下的对数秩p<0.01。箭头表示治疗组处理开始。
图35。显示四个处理组中的存活和结肠息肉负荷的图，即：(i)未处理的Vil1-Grem1小鼠(VG+无处理)；(ii)仅用偶氮甲烷处理的Vil1-Grem1小鼠(VG+AOM+无处理)；(iii)仅用抗Grem1抗体处理的Vil1-Grem1小鼠(VG+α-Grem1)；和(iv)用偶氮甲烷和抗Grem1抗体处理的Vil1-Grem1小鼠(VG+AOM+α-Grem1)。(A)Kaplan-Meier曲线表示小鼠的存活。(B)显示结肠息肉负荷的图。(C)显示结肠息肉大小的图。
图36。WT、未处理的Vil1-Grem1和抗Grem1抗体处理的Vil1-Grem1小鼠的绒毛中Foxl1表达的基质水平(＊:p值<0.05，＊＊:p值<0.01)。
图37。Vil1-Grem1小鼠小肠中Foxl1(绿色)和Wnt5a(红色)的多重荧光ISH。使用DAPI对切片进行复染。观察到Foxl1和Wnt5a的联合表达(在黄色区域)。
图38。野生型、Vil1-Grem1和处理模型中Wnt配体和特络细胞(telocyte)细胞标志物的组织表达。抗体处理后，在野生型和Vil1-Grem1小鼠中使用ISH的(A)Wnt 5A；(B)Wnt2B；和(C)Foxl特络细胞标志物表达和定量。
图39。Vil1-Grem1的Kaplan Meier存活曲线；用对照运载体(线D，中位存活45天，n＝13)和抗Grem1抗体以每周15mg/kg(线A，中位存活76.5天，n＝6)、每周30mg/kg(线B，中位存活108天，n＝15，正在进行的实验：两只小鼠仍然存活)和每周60mg/kg(线C，中位存活111天，n＝7，正在进行的实验：五只小鼠仍然存活)处理ApcMin小鼠模型。
图40。已确立的息肉病的预防治疗和治疗的Kaplan Meier生存曲线。箭头表示处理组中的处理开始时间点。
(A)Vil1-Grem1小鼠。运载体(实线)：中位存活242天(n＝13)；抗Grem1疗法晚期治疗(点线)：519天，n＝7；抗Grem1早期治疗(虚线)：540天，(n＝11)两组的对数秩p<0.01。(B)ApcMin。运载体(实线)：中位存活:192天(n＝15)；抗Grem1晚期治疗(点线)：261天(n＝11)；抗Grem1早期治疗(虚线)：424.5天，(n＝10)，两组的对数秩p<0.01。
图41。与用同种型对照抗体(Ab101.4)处理的小鼠相比，通过全身性CA注射接种PyMT-B01乳腺癌细胞并用Grem1中和抗体(Ab7326)处理的C57BL6小鼠具有显著降低的肿瘤负荷。(A)在研究结束时(第13天)小鼠的IVIS·BLI成像显示，与Ab101.4处理的小鼠相比，Ab7326处理的小鼠的肿瘤负荷显著降低。平均值±标准误，Student t检验，Ab101.4；n＝12，Ab7326；n＝13，＊p<0.05。(B)在第13天的代表性BLI成像。
图42。与用同种型对照(Ab101.4)处理的小鼠相比，用Grem1中和抗体(Ab7326)处理的携带PyMT-B01肿瘤的C57BL6小鼠的肺和肝转移减少。(A)显示与Ab101.4处理的小鼠相比，AB7326处理的小鼠的肺中肿瘤负荷的离体BLI成像结果的图。(B)显示Ab7326和Ab101.4处理组中肝脏肿瘤负荷的BLI成像结果的图。平均值±标准误，Student t检验，Ab101.4；n＝6，Ab7326；n＝7，＊p<0.05。
图43。显示用同种型对照抗体(AbA33)和Grem1中和抗体(UCB6114)处理的携带MDA-MB-231肿瘤的NSG小鼠的IVIS·BLI成像结果的图。平均值±标准误，Student t检验，n＝8，p>0.05。
图44。在接种肿瘤细胞后第22天，用同种型对照(AbA33)或Grem1中和抗体(UCB6114)处理的携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠的代表性IVIS·BLI成像。
图45。显示用同种型对照抗体(AbA33)或Grem1中和抗体(UCB6114)处理的携带MDA-MB-231肿瘤的NSG小鼠的肺的离体IVIS BLI成像结果的图。平均值±标准误，Studentt检验，n＝8，p>0.05。
图46。显示通过全身性CA注射接种PC-3前列腺癌细胞并用Grem1中和抗体(UCB6114)或同种型对照抗体(AbA33)处理的NSG小鼠BLI成像结果的图。对(A)全身；(B)离体肝脏BLI；(C)离体后肢；和(D)离体肺进行BLI成像。平均值±标准误，Student t检验，n＝5-7，＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。
图47。在研究结束时(第25天)，用同种型对照抗体(AbA33)或Grem1中和抗体(UCB6114)处理全身性PC-3肿瘤负荷的NSG小鼠的代表性BLI图像。在最终全身扫描后，解剖肝脏、后肢和肺并立即进行离体成像。
发明详述
应该理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要进行调整。还应当理解，这里使用的术语仅仅是为了描述本发明的特定实施例，而不是为了进行限制。
此外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“抑制剂”包括两种或更多种这样的抑制剂，或者提及“寡核苷酸”包括两种或更多种这样的寡核苷酸等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，在此全部引入作为参考。
癌症的治疗和预防
本发明提供了用于预防或治疗癌症的方法中的抗GREM1拮抗剂。所述癌症通常具有基质(如促结缔组织增生基质(desmoplastic stroma))，典型地具有基质GREM1过表达。所述癌症可另外地或替代地具有上皮GREM1过表达或由GREM1引发。
癌症
所述癌症可以是具有基质(通常为促结缔组织增生基质)的任何癌症或肿瘤。所述癌症可以是由GREM1引发的任何癌症或肿瘤。所述癌症可以是任何观察到基质和/或上皮GREM1过表达的癌症。所述癌症或肿瘤可具有基质GREM1过表达，而没有上皮GREM1过表达。所述癌症或肿瘤可具有上皮GREM1过表达，而没有基质GREM1过表达。在优选的实施方案中，所述癌症或肿瘤具有在促结缔组织增生基质中的GREM1过表达。
所述癌症或肿瘤可以是实体瘤。所述实体瘤可具有促结缔组织增生基质。
可以治疗的特别优选的癌症包括结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、前列腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、肝癌、脾癌、骨癌和骨肉瘤。可以治疗的癌症可以是肠癌、结肠癌或直肠癌。待治疗的癌症可以是扩散性癌症，例如转移性癌症。扩散性癌症应该被理解为已从体内最初的起源部位扩散的癌症。例如，扩散性癌症可以是起源于患者的骨髓、结肠、前列腺或乳房组织，但已经扩散到例如患者的肝脏或肺部的癌症。
所述GREM1拮抗剂也可用于防止癌症的扩散。
所述GREM 1拮抗剂可用于预防与癌症相关的息肉病。
分级系统用于癌症生物学和医学，根据癌细胞细胞分化的缺乏对其进行分类。这反映了癌细胞在形态上不同于癌细胞来源组织中发现的健康细胞的程度。分级系统可用于提供特定癌症预计增长速度的指示。通常使用的癌症等级是等级(G)X和1至4级。GX表明癌症等级无法被评估。G1(低级)癌细胞具有与正常健康细胞相似的形态(即，它们分化良好)，并且预计生长缓慢，并且扩散的可能性较小。G2(中级)癌细胞是中等分化的，即它们看起来更不正常，并且预计比G1细胞生长稍快。G3(高级)癌细胞与正常细胞相比具有非常不同的形态(即，它们分化差)，并且预期比G1细胞和G2细胞生长更快。G4(高级)癌细胞是未分化的(也称为间变性的(anaplastic))，并且预计具有最高的增殖能力。
癌症分级不同于癌症分期，后者给出了癌症可能如何扩散的指示。常见的癌症分期系统有五个阶段，称为0期：原位癌细胞(即位于它们的正常组织中)；I期：癌症位于身体的一个部位；II期：癌症局部进展；III期：癌症也是局部进展(癌症被定为II期还是III期可取决于癌症的具体类型)；和IV期：癌症经常已经转移或扩散到其他器官或全身。
本领域技术人员知晓如何确定癌症的等级和/或阶段。在一个实施方案中，本发明涉及抗GREM1拮抗剂用于治疗和/或预防已建立的癌症的用途。在一个实施方案中，所述癌症是已建立的癌症。已建立的癌症可以是高等级癌症，例如G3或G4癌症。已建立的癌症可以是II期或以上的癌症。已建立的癌症可以是III期或IV期癌症。在一个实施方案中，所述已建立的癌症是已经转移的IV期癌症。
结肠直肠癌
本发明在一个优选方面涉及结肠直肠癌的预防或治疗。作为背景，肠粘膜是一个复杂的生态系统，上皮与其微环境、特别是其下的基质具有相互依赖的关系。间充质-上皮串扰(crosstalk)密切参与调节体内平衡，并在肠再生和癌症中动态改变。细胞信号传导网络是区室间(inter-compartmental)串扰和控制上皮细胞命运决定的效应子途径，但可被结肠直肠癌中的肿瘤微环境所吸收(co-opted)和破坏。
目前对结肠直肠癌的化疗管理在过去的20年里没有实质性的改变，其主要是基于使用联合细胞毒性剂(如FOLFOX和FOLFIRI方案，http://www.cancerresearchuk.org/ about-cancer/cancer-in-general/treatment/cancer-drugs/drugs)来对抗增殖的肿瘤上皮，而对这些上皮靶向剂的耐药性可能出现。现在比以往更重要的是确定结肠直肠癌的新疗法。
因此，一种特别优选的用于治疗的癌症或肿瘤是结肠直肠癌或结肠直肠肿瘤。要治疗的结肠直肠癌的一种特别优选的形式特征在于基质细胞中GREM1过表达、即基质GREM1过表达的结肠直肠癌。所述基质细胞可以是癌症相关的成纤维细胞。基质GREM1过表达的结肠直肠癌可显示没有上皮GREM1过表达。具有基质GREM1过表达的结肠直肠癌可包括基质Foxl1过表达。用于治疗的结肠直肠癌的一种特别合适的形式是间充质亚型结肠直肠癌，也被描述为CMS4(Guinney等人，Nat Med 2015)的结肠直肠癌。也可以治疗结肠直肠癌的任何其他亚型，包括上文Guinney等人所述的CMS1、CMS2和CMS3中的任何一种。本文所述的结肠直肠癌可以是近端结肠直肠癌(或近端结肠直肠肿瘤)。所述近端结肠是脾曲上游的大肠区域，即盲肠、升结肠和横结肠。这个区域的癌症或肿瘤也被称为右侧癌症或肿瘤。本发明可涉及治疗右侧结肠直肠癌或右侧结肠直肠肿瘤。
所述结肠直肠癌可以是远端结肠直肠癌(或远端结肠直肠肿瘤)。远端结肠是脾曲下游的大肠区域，即降结肠、乙状结肠和直肠。这个区域的癌症或肿瘤也被称为左侧癌症或肿瘤。本发明可涉及治疗左侧结肠直肠癌或左侧结肠直肠肿瘤。具有GREM1基质过表达的癌症可以优选为散发性(sporadic)癌症。所述散发性癌症可由体细胞突变引起。所述散发性癌症可由致癌物质引起。散发性癌症不是由遗传基因突变引起的。所述散发性癌症可引起GREM1基质过表达。散发性癌症的增殖可能依赖于癌症中GREM1的基质过表达。
在北欧白人中，至少有三个邻近GREM1的单核苷酸多态性(SNP)与结肠直肠癌(CRC)的风险独立相关，并且可能在其他种族中也是如此(Tomlinson等人，PLos Genet，2011)。这与GREM1的表达有直接联系，其他SNP可能也有类似的作用。此外，BMP2附近的两个常见SNP、BMP4附近的两个SNP和BMP7附近的一个SNP影响BMP配体的表达并影响CRC的风险。因此，所述癌症可以包含一个或多个上述SNP。
根据本发明用于治疗的另一种类型的癌症或肿瘤是在上皮细胞中表现出GREM1过表达的癌症或肿瘤。上皮细胞中GREM1的过表达可导致所述癌症。所述癌症的增殖可依赖于GREM1的上皮过表达。因此，所述癌症可以是上皮来源的。所述癌症通常是结肠直肠癌或十二指肠癌。优选地，所述癌症是结肠直肠癌。所述癌症可以是由GREM1引发的。由GREM1引发的是指增强GREM1活性或表达的诱变事件是所述癌症的原因。这种癌症可由于遗传的基因突变造成。因此，所述癌症可以是家族性癌症(见下文)。
要治疗的优选类型的结肠直肠癌可能对一种或多种已知的抗癌剂(比如化学治疗剂)具有抗性，如下文进一步描述的。
所述结直肠癌可以是扩散性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是转移性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是肺转移性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是肝脏转移性结肠直肠癌。所述结肠直肠癌可以是骨转移性结肠直肠癌。
所述结肠直肠癌的特征可以是Foxl1的基质过表达。所述结肠直肠癌的特征可以是一种或多种Wnt配体的基质过表达。例如，所述结肠直肠癌可以是特征为Wnt5A和/或Wnt2B的基质过表达。如果所述结肠直肠癌具有Foxl1和/或Wnt配体如Wnt5A或Wnt2B的基质过表达，则所述结肠直肠癌可能特别适合于使用GREM1拮抗剂进行预防或治疗。
家族性癌症
家族性癌症包括由GREM1编码基因中的一个或多个突变，或影响GREM1基因表达的任何其他突变引起的癌症。常染色体显性病症遗传性混合息肉病综合征(HereditaryMixed Polyposis Syndrome，HMPS)是由GREM1上游的40kb复制引起的，其导致病理性区表达转变，从局限性的间充质梯度转变为整个上皮的异位GREM1基因表达。
接受抗GREM1拮抗剂治疗的受试者可先前已被确定有患家族性癌症的风险。例如，所述受试者可已经根据其家族史和/或因为受试者携带已知会导致家族性癌症或增加其发展风险的基因突变而被确定为处于风险中。
所述家族性癌症可以是林奇综合征，也称为遗传性非息肉病性结肠直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)。所述家族性癌症可以是家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)。
本发明人已经证明，使用抗GREM1抗体显著增加了Apc Min模型小鼠的存活(参见例如下面的实施例11、19和23)。Apc Min小鼠是家族性腺瘤性息肉病(FAP)的成熟模型。因此，患有FAP的患者或受试者可能特别适合用抗GREM1拮抗剂治疗。用抗GREM1拮抗剂(例如抗GREM1抗体)治疗或预防的家族性癌症可以是FAP病。可以对以前患有FAP病的受试者预防性施用抗GREM1拮抗剂，以便例如防止复发。可以对先前未患FAP但先前已被确定有患FAP风险的受试者预防性施用抗GREM1拮抗剂。受试者可能已被确定有患FAP的风险，因为已发现该受试者在他们的Apc基因中携带有害突变。
多发性骨髓瘤
本发明在另一个优选方面涉及多发性骨髓瘤的治疗或预防。多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一种血液恶性肿瘤，其特征是骨髓(BM)中浆细胞(PC)的克隆性增殖。众所周知，BM支持MM中的肿瘤生长，肿瘤细胞和BM之间的双向信号传导对MM PC的持续生长、扩散和存活至关重要。细胞和非细胞BM成分对MM PC的生长和扩散有不同的影响。虽然最近的研究已经确定了在疾病进展中起作用的BM成分，并且已经开发出了针对这些成分的治疗方法，但是MM的标准护理治疗仍然主要依赖于针对肿瘤细胞本身。虽然这种疗法在延长患者生存方面是有效的，但由于BM在MM细胞的生长、扩散、存活和耐药性方面起着重要作用，因此需要针对疾病这一重要方面的更有效的疗法。事实上，MM在很大程度上是一种无法治愈的疾病，疾病复发是有效治疗这种疾病所面临的关键问题。
因此，本发明还优选涉及多发性骨髓瘤的治疗或预防。多发性骨髓瘤通常包括骨髓中存在多于一块浆细胞团。因此多发性骨髓瘤通常与骨髓中浆细胞的异常增殖有关。一种特别优选的进行治疗的多发性骨髓瘤形式的特征在于骨髓中GREM1的过表达。因此，多发性骨髓瘤可包含基质GREM1过表达。基质GREM1过表达可存在于骨的密质骨区室内。基质GREM1过表达可反映基质细胞数量的增加，或现有的GREM1表达基质细胞中GREM1表达水平的增加。骨髓可以包含骨组织(osteochrondroreticular)(OCR)干细胞。过表达GREM1的基质细胞可包含OCR干细胞。一种优选类型的要治疗的多发性骨髓瘤可对一种或多种已知的抗癌剂(比如化学治疗剂)具有抗性，如下文进一步描述的。
乳腺癌
本发明在另一个优选方面涉及乳腺癌的治疗或预防。如实施例中更详细描述的，发明人已经观察到GREM1诱导乳腺癌细胞增殖，并且进一步观察到乳腺癌细胞与表达Grem-1的基质细胞的共培养也诱导这种增殖。此外，GREM1拮抗剂能够中和GREM1对乳腺癌细胞的激活作用。
因此，在乳腺癌中获得的结果支持GREM1在乳腺癌细胞增殖中的作用，包括通过在基质细胞中的GREM1表达。
发明人还在临床前小鼠模型中证明了GREM1拮抗剂在预防和治疗乳腺癌中的体内功效(见下面的实施例24)。特别是，观察到用GREM1拮抗剂治疗的乳腺癌荷瘤小鼠显示总体肿瘤负荷、肺肿瘤负荷和肝脏肿瘤负荷减少。
因此，本发明通过施用抗GREM1拮抗剂来治疗和预防乳腺癌。所述乳腺癌可包括基质GREM1过表达。过表达GREM1的基质乳腺细胞可包含基质成纤维细胞，在本文中也称为癌症相关成纤维细胞。要治疗的优选类型的乳腺癌可对一种或多种已知的抗癌剂(例如化学治疗剂)具有抗性，如下文进一步描述的。所述乳腺癌可是扩散性乳腺癌。所述乳腺癌可以是转移性乳腺癌。所述乳腺癌可是肺转移性乳腺癌。所述乳腺癌可以是肝转移性乳腺癌。所述乳腺癌可以是骨转移性乳腺癌。
前列腺癌
另一方面，本发明涉及前列腺癌的治疗或预防。
如实施例25中更详细描述的，发明人已经在临床前小鼠模型中证明了GREM1拮抗剂在预防和治疗前列腺癌中的功效。特别是，观察到用GREM1拮抗剂治疗的前列腺癌荷瘤小鼠显示总体肿瘤负荷、肝脏肿瘤负荷、骨骼肿瘤负荷和肺肿瘤负荷减少。
因此，本发明通过施用抗GREM1拮抗剂进一步提供了前列腺癌的治疗和预防。所述前列腺癌可能是扩散性前列腺癌。所述前列腺癌可是转移性前列腺癌。所述前列腺癌可以是肺转移性前列腺癌。所述前列腺癌可以是肝转移性前列腺癌。所述前列腺癌可以是骨转移性前列腺癌。
其他癌症
除了在结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌的治疗和预防中的具体示例性应用之外，发明人设想这些癌症中所示的GREM1拮抗剂的治疗功效也将适用于具有相应特征的其他癌症的治疗。特别地，设想GREM1拮抗剂将对于预防或治疗其中存在基质和/或上皮GREM1过表达的癌症有用，这种过表达有助于恶性细胞生长。此类癌症包括胰腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、头颈癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、肝癌、脾癌、骨癌和骨肉瘤。使用公开可获得的数据(来自R2服务器，https://hgserver1.amc.nl/cgi- bin/r2/main.cgi)确定的各种实体肿瘤中Grem1表达和生存指示之间的关系在图24至29中示出。
基质和上皮
本文针对预防或治疗所描述的癌症可能包括基质和/或上皮GREM1过表达。
本文使用的术语“基质细胞”或“基质”是指组织或器官的结构和/或结缔部分。
基质组织主要由含有结缔组织细胞的细胞外基质组成。细胞外基质主要由基质(一种多孔的水合凝胶，主要由蛋白多糖聚集体组成)和结缔组织纤维组成。基质中通常有三种类型的纤维:I型胶原纤维、弹性纤维和网状(III型胶原)纤维。成纤维细胞和周细胞是最常见的基质细胞类型。
在癌症或肿瘤的情况下(例如，起始于组织或器官的上皮)，组织或器官的基质可以帮助癌症的生长和发展。与癌症或肿瘤相关的基质可以是由癌症或肿瘤周围的纤维或结缔组织生长引起的促结缔组织增生基质。
GREM1的过表达可以在基质的任何部分/任何基质细胞中观察到。基质细胞可以是成纤维细胞或成纤维细胞样支持细胞。基质细胞可以是分离自上述任何癌症或肿瘤的促结缔组织增生基质的成纤维细胞或成纤维细胞样支持细胞，如在结肠直肠癌中分离自结肠或直肠、或在多发性骨髓瘤中分离自骨髓。基质细胞可以是与癌症相关的成纤维细胞。
本文使用的术语“上皮”是指来源于组织或器官外层的细胞。对于结肠，肠上皮是形成胃肠道小肠和大肠的腔表面或内层的细胞层。它由简单的柱状上皮组成。“上屏障”(“upper barrier”)是由四种肠上皮细胞类型：吸收性肠细胞、杯状细胞、Paneth细胞和肠内分泌细胞组成的肠上皮单层柱状细胞。小肠和大肠的上屏障特征相似。主要区别在于十二指肠、空肠和回肠中存在隆起(elevation)和突起(projection)(圆形皱襞、绒毛和微绒毛)，从而增加了吸收表面。这在结肠中没有被观察到，而是显示出平坦的表面。在称为绒毛的粘膜突起(protrusion)中，有称为李氏隐窝(crypts of Lieberkühn)的弯曲，这是不同的腺体内陷。观察到有上皮GREM1过表达的细胞可以是任何上皮细胞，比如任何肠上皮细胞。
虽然不受理论的约束，但本发明人推测上皮和/或基质中GREM1的过表达可能促进干细胞/祖细胞表型(增加干细胞/祖细胞的数量)，促进上皮干细胞行为并驱动癌症进展和/或对化学治疗剂的抗性。因此，根据本发明使用的GREM1拮抗剂可以在要预防或治疗癌症的受试者的组织或器官的上皮中，比如在肠上皮中，防止异常癌症干细胞/祖细胞表型的诱导，减少上皮干细胞行为和/或减少干细胞/祖细胞的数量。GREM1拮抗剂影响干细胞行为的能力可以通过评估已知的上皮和癌症干细胞标志物进行临床分析。
GREM1
在蛋白质的上下文中，在本发明中使用的术语GREM1或Gremlin-1是指通常具有在UniProt条目O60565(SEQ ID NO:1)中列出的氨基酸序列的蛋白质，人类GREM1。术语GREML1和Gremlin-1也可以指如下Gremlin-1多肽，其:
(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，其带有或不带有N-末端信号肽，即可以包含SEQ ID NO:21示出的成熟的肽序列或由其组成；或者
(b)是相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代、修饰、缺失或插入的衍生物，其带有或不带有N-末端信号肽(如SEQ ID NO:21所示)，保留了Gremlin-1的活性，比如SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
(b)其变体，这种变体通常与SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21)保持至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的同一性(或甚至约96％、97％、98％或99％的同一性)。换句话说，这种变体可与SEQ ID NO:1保持约60％-约99％的同一性，合适地与SEQ ID NO:1有约80％-约99％的同一性，更合适地与SEQ ID NO:1有约90％-约99％的同一性，最合适地与SEQ ID NO:1有约95％-约99％的同一性。下文进一步描述变体。
如下文进一步讨论的，残基号通常基于SEQ ID NO:1的序列来引用。然而，本领域技术人员可以容易地将残基编号外推至如上所述的衍生物或变体序列。在引用残基号时，本发明还涵盖变体或衍生序列上的这些残基。
GREM1或Gremlin-1核酸序列可以包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37或其变体或者由它们组成。变体核酸序列在下面进一步描述。GREM1或Gremlin-1核酸序列可以包含或由任何GREM1转录本变体组成。GREM1转录本变体的例子是转录本1(NCBI:NM_013372.6；ENSEMBL:ENST00000560677.5)；转录本2：NCBI:NM_001191323.1；ENSEMBL:ENST00000560830.1)；转录本3：NCBI:NM_001191322.1；ENSEMBL:ENST00000622074.1。截至2018年6月18日，以上述登记号可获得的序列通过引用并入本文。
过表达
基质和/或上皮中GREM1的过表达可以通过任何手段确定。GREM1的过表达典型地通过与相同组织类型的正常细胞中的标志物水平，即基础表达水平进行比较来确定。该表达典型地相对于其他基因(优选包含一个或多个看家基因)的表达水平进行标准化。GREM1也可以被分类为在癌症患者人群中显示阈值百分比的过表达或低表达。该人群中每个患者的过表达可高于几何平均数的2倍。该人群中至少10％，更优选至少15％或更多的患者可表现出这种过表达。
GREM1基质过表达是指基质GREM1水平高于匹配的正常组织。例如，基质GREM1水平可能比匹配的正常组织高至少两倍。
当GREM1过表达时，其量可以相对于基础量增加任何量。例如，由GREM1引发的癌症如HMPS可包括上皮GREM1的几千倍的上调，而在正常上皮中没有观察到GREM1的表达。包含基质GREM过表达的散发性癌症可能包含超过该器官的正常基质中生理性GREM1表达水平的任何水平的基质GREM1过表达。本领域技术人员能够评估与相同类型的正常细胞中GREM1水平相比较基质或上皮中的过表达。
所确定的量可以是mRNA的量。因此，癌症可能包括GREM1mRNA的过表达。所述癌症可包含与相同组织类型的正常细胞相比增加量的GREM1 mRNA。该mRNA可以增加任何数量。可以使用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)，比如实时qRT-PCR、定量基因分析(Affymetrix/Thermo Fisher)，通过northern印迹或使用微阵列、RNA测序来测量mRNA的量。优选通过将样品的基因表达与该特定基因在由针对该基因为二倍体的肿瘤组成的参考样品中的表达水平分布进行比较来确定mRNA表达。z评分可以使用RNAseq通过预期最大化(RSEM)算法(cBioportal for Cancer Genomics,www.cbioportal.org；Gao等人,2013andSerami等人2012)来获得。比参考组的平均值高或低2个标准差的z评分优选分别被认为是过表达或低表达。
确定的量可以是蛋白质的量。癌症可包括GREM1蛋白的过表达，比如与相同组织类型的正常细胞相比。蛋白质可以增加任何数量。可以使用免疫组织化学、蛋白质印迹、质谱或荧光激活细胞分选(FACS)，包括通过使用本发明的抗GREM1抗体，来测量蛋白质的量。用于确定表达的阈值可因所使用的技术而异，并且可以通过免疫组织化学评分进行验证。
因此，如本文所述，GREM1拮抗剂在治疗或预防患者中癌症的用途可以包括(a)测量癌症中GREM1的量，和(b)如果癌症包含GREM1的过表达，则向患者施用GREM1拮抗剂，从而治疗或预防所述癌症。GREM1的量可以是mRNA或蛋白质的量，以及上述任何过表达。
样品
上述测量可以在来自患者的任何合适的样品中进行。测量可以在从患者中获得的癌症或肿瘤活组织检查中进行。基质和/或上皮(基质和/或上皮细胞)可以从活组织检查中分离出来。活组织检查组织可以是福尔马林固定、石蜡包埋(formalin fixed paraffinembedded，FFPE)的组织或新鲜组织。该组织可以是胰腺组织、膀胱组织、肺组织、子宫内膜组织、乳房组织、胃组织、十二指肠组织、食管组织、骨髓或结肠直肠组织。以上讨论的任何方法都可以在癌症活组织检查中进行。这些方法也可以在患者血液中循环的癌细胞上进行。RNA方法可以在尿或血液外泌体上进行。
拮抗剂
抗GREM1拮抗剂是任何降低GREM1功能或活性的分子。抗GREM1拮抗剂可以以任何量降低GREM1的功能或活性。抗GREM1拮抗剂可以降低GREM1的功能或活性至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，或者可以阻止GREM1的任何功能或活性。抗GREM1拮抗剂降低GREM1功能或活性的程度可以通过在存在和不存在抗GREM1拮抗剂的情况下测量细胞中GREM1的功能或活性来确定。细胞可以是正常细胞或癌细胞。细胞可以是如上所述的癌细胞。它们可以是结肠直肠癌细胞。如实施例中所述，结肠直肠癌细胞可存在于Vil1-Grem1和/或APC(MIn)小鼠模型中。因此，可以在由GREM1引发的癌症或导致基质GREM1过表达的散发性癌症的小鼠模型中进行GREM1拮抗剂在结肠直肠癌中的活性的体内测定。可替代地，癌细胞可以是多发性骨髓瘤癌细胞，比如从骨髓中存在的骨髓瘤分离出的浆细胞。更一般地说，可以在体外或体内测定通过任何方式显示出降低GREM1功能或活性的GREM1拮抗剂阻止或减少癌细胞(如结肠直肠癌细胞或多发性骨髓瘤癌细胞或乳腺癌细胞)增殖的能力，或防止、减少或消除癌症或肿瘤的能力。
拮抗剂可以通过任何方式降低GREM1功能。它可以直接或间接增加或减少影响GREM1功能的任何分子的活性或数量。它可以在mRNA或蛋白质水平上减少GREM1的量。它可以增加GREM1的降解。它可以通过抑制性修饰降低GREM1的功能。它可以降低增强GREM1功能的分子的转录。它可以使用试剂如锌指核酸酶来破坏编码GREM1的DNA或增强GREM1功能的分子。
拮抗剂可以是与Gremlin-1相互作用的药剂。与Gremlin-1相互作用的试剂通常是结合Gremlin-1的试剂。与Gremlin-1相互作用的试剂可以调节Gremlin-1。抑制性调节剂可能对Gremlin-1的任何功能有影响，但通常会降低Gremlin-1与BPM(BMP 2/4/7)的结合。该拮抗剂可以是BMP-7模拟分子。Gremlin-1是BMP的负调节因子，因此减少的结合将增加通过BMP的信号传导。活化调节剂可以增加Gremlin-1与BMP的结合。
BMP结合和信号传导可以通过本领域已知的任何方法检测。例如，本申请的实施例描述了SMAD磷酸化测试。SMAD1、5和8在BMP信号传导时被磷酸化。因此，SMAD磷酸化的增加可用于确定增加的BMP信号传导，这可反映与Gremlin-1的结合的减少。实施例还描述了Id1报告基因测试，其中Id1基因是BMP信号传导的靶基因。因此，该测试中信号传导恢复的增加也可用于确定试剂是否抑制Gremlin-1与BMP的结合。
拮抗剂可以通过结合GREM1的活性位点起作用，或者通过结合在不同的位点别构地起作用。拮抗剂可以通过结合GREM1的调节因子或配体起作用，从而减少GREM1的活化。拮抗剂可以是可逆的或不可逆的。
GREM1拮抗剂可以是小分子抑制剂、肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
GREM1的拮抗剂可以是与编码GREM1的mRNA或编码增强GREM1活性的分子的mRNA特异性杂交的寡核苷酸。GREM1的拮抗剂可以是编码任何降低GREM1功能的分子的多核苷酸。例如，GREM1拮抗剂可以是编码本文所述的抗GREM1抗体的多核苷酸。
GREM1的拮抗剂可以是特异性结合任何靶分子(通常是蛋白质)的抗体，从而直接或间接降低GREM1的功能。拮抗剂可以是特异性结合GREM1的抗体。在这方面，抗体可以通过变构失活或通过阻断活性所需的其靶标和配体之间的相互作用来降低GREM1的功能。
拮抗剂与蛋白质残基的相互作用可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定，比如通过x射线结晶学确定的残基与试剂之间的距离(通常小于
Figure BDA0002844022100000232
或小于
Figure BDA0002844022100000231
)。如以下实施例中所讨论的，可以被治疗剂靶向的Gremlin-1的区域可以包括氨基酸Asp92-Leu99、Arg116-His130、Ser137-Ser142、Cys176-Cys178。这些都在Gremlin-1表面上突变的那些的
Figure BDA0002844022100000233
以内。
抗体拮抗剂
本文所指的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。抗体是指包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白或其抗原结合部分，重链和轻链通过二硫键相互连接。每个重链由一个重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区组成。每个轻链由一个轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区，其间穿插着更保守的区域，称为框架区。
抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
根据本发明使用的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且典型地将是单克隆抗体。根据本发明使用的抗体可以是嵌合抗体、CDR移植抗体、纳米抗体、人或人源化抗体或其任何抗原结合部分。为了产生单克隆抗体和多克隆抗体，实验动物通常是非人类哺乳动物，比如山羊、兔子、大鼠或小鼠，但是抗体也可以在其他物种中产生。
多克隆抗体可以通过常规方法产生，比如用目标抗原免疫合适的动物。随后可从动物中取出血液，并纯化IgG部分。
在需要对动物进行免疫的情况下，可以通过使用众所周知的常规方案对动物(例如非人动物)施用多肽来获得针对Gremlin-1的抗体，参见例如《实验免疫学手册》，D.M.Weir(编辑)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986。许多温血动物，如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、骆驼或猪，都可以被免疫。但是，小鼠、兔、猪和大鼠一般最适合。
单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,1983,Immunology Today,4:72)和EBV杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)。
根据本发明使用的抗体也可以使用单淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达从单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生，所述单淋巴细胞被选择用于通过例如Babcook，J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377所描述的方法产生特异性抗体。
也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生抗体，包括Brinkman等人公开的方法(摘自J.Immunol.Methods,1995,182:41-50)，Ames等人(J.Immunol.Methods,1995,184:177-186)，Kettleborough等人(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958)，Persic等人(Gene,1997 187 9-18)，Burton等人(Advances in Immunology,1994,57:191-280)和WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
全人抗体是指其中重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在)都来自人，或者与人来源的序列基本相同，但不必定来自相同抗体的抗体。全人抗体的例子可以包括由例如上述噬菌体展示方法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，其中小鼠免疫球蛋白可变区和任选地恒定区基因已经被它们的人对应物替代，例如在欧洲专利0546073,美国专利5,545,806,美国专利5,569,825,美国专利5,625,126,美国专利5,633,425,美国专利5,661,016,美国专利5,770,429,欧洲专利0438474和欧洲专利0463151中的一般性描述。
可替代地，根据本发明使用的抗体可以通过包括用Gremlin-1免疫原免疫非人类哺乳动物的方法产生；从所述哺乳动物获得抗体制剂；由此衍生出识别Gremlin-1的单克隆抗体。
根据本发明使用的抗体分子可以包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段或抗原结合部分。术语抗体的“抗原结合部分”是指保留选择性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。抗体及其片段和抗原结合部分可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体和上述任何一种的表位结合片段(例如参见Holliger和Hudson，2005，NatureBiotechnic.Biotech。23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域中是众所周知的(例如参见Verm等人,1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。本发明中使用的其他抗体片段包括国际专利申请WO 2005/003169、WO 2005/003170和WO 2005/003171中描述的Fab和Fab’片段以及国际专利申请WO2009/040562中描述的Fab-dAb片段。多价抗体可以包含多种特异性或者可以是单特异性的(例如参见WO 92/22853和WO 05/113605)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选片段以使用。
可以根据抗体分子的推测功能，特别是可能需要的效应子功能来选择抗体分子的恒定区结构域，如果存在的话。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型。可替代地，当抗体分子用于治疗目的且不需要抗体效应子功能时，可以使用IgG2和IgG4同种型。
可以通过重组方式制备、表达、产生或分离根据本发明使用的抗体，比如(a)从对于目的免疫球蛋白基因而言为转基因的或跨染色体的动物(例如小鼠)中分离的抗体，或由其制备的杂交瘤，(b)从被转化以表达目的抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组、组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。
根据本发明使用的抗体可以是人抗体或人源化抗体。本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本文所述的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体：其中来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。
这种人抗体可以是人单克隆抗体。这种人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，该动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
可以通过体外免疫人淋巴细胞，然后用爱泼斯坦-巴尔病毒转化淋巴细胞来制备人抗体。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”是指CDR移植的抗体分子，其中来自另一种哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上。可以在人框架序列内进行另外的框架区修饰。
如本文所用，术语“CDR移植的抗体分子”是指这样的抗体分子，其中重链和/或轻链包含来自供体抗体(例如鼠或大鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(如果需要，包括一个或多个修饰的CDR)被移植到受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中。有关综述请参见Vaughan等人，Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，不是转移整个CDR，而是将上述任一CDR中的一个或多个特异性决定残基转移到人抗体框架中(例如，参见Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方案中，只有来自上述一个或多个CDR的特异性决定残基被转移到人抗体框架中。在另一个实施方案中，只有来自上述每个CDR的特异性决定残基被转移到人抗体框架中。
当CDR或特异性决定残基被移植时，可以使用任何合适的受体可变区框架序列，考虑到CDR来源的供体抗体的种类/类型，包括小鼠、灵长类和人框架区。合适地，根据本发明的CDR移植抗体具有可变结构域，该可变结构域包含人受体框架区以及一个或多个上述CDR或特异性决定残基。因此，在一个实施方案中提供了中和性CDR移植抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。
可用于本发明的人框架的例子是：KOL,NEWM,REI,EU,TUR,TEI,LAY and POM(上述Kabat等人)。例如，重链可以使用KOL和NEWM，轻链可以使用REI，重链和轻链都可以使用EU、LAY和POM。可替代地，可以使用人种系序列；这些可在例如：http://www.vbase2.org/(见Retter等人,Nucl.Acids Res.(2005)33(附件1),D671-D674)中获得。
在本文所述的CDR移植抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于相同的抗体，并且如果需要，可以包含具有来源于不同链的框架区的复合链。
此外，在本文所述的CDR移植抗体中，框架区不需要与受体抗体的序列完全相同。例如，对于该受体链类别或类型，不常见的残基可被改变为更频繁出现的残基。或者，可以改变受体框架区中的选定残基，使其对应于供体抗体中相同位置的残基(参见Reichmann等人，1998，Nature,332,323-324)。这种变化应保持在最低限度以恢复供体抗体亲和力。WO91/09967中提出了选择受体框架区中可能需要改变的残基的方案。
本领域技术人员还将理解，抗体可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这种修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化的变化。一种常见的修饰是由于羧肽酶的作用(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所述)导致羧基末端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)的缺失。
在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域，抗体轻链包含CL结构域，κ或λ。
生物分子，如抗体或片段，含有酸性和/或碱性官能团，从而赋予分子净正电荷或负电荷。总的“观察到的”电荷数量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或表面不带净电荷的pH。在一个实施方案中，根据本公开的抗体或片段具有至少为7的等电点(pI)。在一个实施方案中，抗体或片段的等电点至少为8，比如8.5、8.6、8.7、8.8或9。在一个实施方案中，抗体的pI为8。诸如＊＊ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html(见Walker,The ProteomicsProtocols Handbook,Humana Press(2005),571-607)的程序可用于预测抗体或片段的等电点。
为了表征优选的Gremlin-1表位，发明人单独结晶了人Gremlin-1，并与称为Ab7326(Fab片段)的抗体复合。Gremlin-1的结晶使得BMP结合位点的推定残基得以确定。此外，用Ab 7326(一种变构抑制抗体)结晶，使得抗体表位中的残基得以确定。结合该表位的抗体在治疗与Gremlin-1相关的疾病中具有作为治疗剂的特定潜力。
本文所述的优选的Ab 7326抗体已被鉴定结合下列Gremlin-1的残基:Ile110(131)、Lys126(147)、Lys127(148)、Phe128(149)、Thr129(150)、Thr130(151)、Arg148(169)、Lys153(174)和Gln154(175)，其中Lys126(147)、Lys127(148)、Phe128(149)、Thr129(150)、Thr130(151)、Arg148(169)、Lys153(174)和Gln154(175)存在于一个Gremlin-1单体上，Ile110(131)存在于第二Gremlin-1单体上。不在括号中的编号是基于结构文件(与基于结构比对的鼠Gremlin-2的编号匹配)。括号中的编号代表基于SEQ ID NO:1的UniProt条目O60565。如实施例部分所讨论的，这些表位残基是通过对Gremlin-1-Ab 7326Fab复合物的
Figure BDA0002844022100000291
处进行NCONT分析来鉴定的。
因此，本文所述的抗体可结合包含至少一个选自Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175的残基的表位(残基号基于SEQ ID NO:1)。本文所述的抗体可结合包含2、3、4、5、6、7、8或所有9个这些残基(优选至少5个残基)的表位。
本文所述的抗体还可以识别其中Ile131存在于与其他残基不同的Gremlin-1单体上的表位。
虽然这些残基是为人Gremlin-1的特定序列提供的，但是本领域技术人员可以使用常规技术容易地将这些残基的位置外推至其他相应的Gremlin序列(例如小鼠)。因此，本发明还提供了与包含这些其它Gremlin序列中相应残基的表位结合的抗体。
为了筛选结合特定表位的抗体，可以进行常规的交叉阻断测试，如在Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所述。其他方法包括丙氨酸扫描突变体(alanine scanning mutants)、肽印迹(Reineke(2004)MethodsMol Biol248:443-63)或肽切割分析。此外，可以采用诸如抗原表位切除、抗原表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。这样的方法在本领域是众所周知的
抗体表位也可以通过x射线结晶学分析来确定。因此，本公开的抗体可以通过结合到Gremlin-1的抗体的x射线晶体学分析来评估。特别地，可以以这种方式通过确定Gremlin-1上抗体互补位(paratope)残基
Figure BDA0002844022100000301
内的残基来鉴定表位。
因此，本文所述的抗体可以结合包含至少一个选自Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126和Phe138的残基的Gremlin-1上的表位，其中残基编号根据SEQ ID NO:1。本文进一步描述了结合包括Trp93、Phe117、Tyr119、Phe125、Tyr126和Phe138的所有的表位的抗体。另外描述的是结合包含以下残基的表位的抗体:Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175。优选地，Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175位于Gremlin-1的一个单体上，Ile131位于Gremlin-1的另一个单体上(Gremlin-1二聚体结合BMP二聚体)。
如果通过x射线结晶学测定，抗体互补位在Gremlin-1残基的
Figure BDA0002844022100000302
范围内，则抗体可结合上述Gremlin-1残基。
结合本文公开的表位的抗体可以包含SEQ ID NO:4至6(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)的至少一个、至少两个或全部三个重链CDR序列。这些是如使用Kabat方法测定的实施例的Ab 7326抗体的HCDR1/HCDR2/HCDR3序列。
用于确定CDR序列的Kabat和Chothia方法(以及其他技术)是本领域众所周知的。可以使用任何合适的方法来确定CDR序列，并且在本发明中，虽然通常使用Kabat，但是也可以使用其他技术。在本发明中，SEQ ID NO:3代表了使用Chothia&Kabat联合定义所确定的Ab 7326HCDR1序列。
根据本发明使用的抗体可以包含SEQ ID NO:7至9(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)的至少一个、至少两个或所有三个轻链CDR序列。这些是使用Kabat方法的Ab 7326的LCDR1/LCDR2/LCDR3序列。
所述抗体优选包含至少一个SEQ ID NO:6的HCDR3序列。
典型地，所述抗体包含至少一个选自SEQ ID NO:4至6的重链CDR序列和至少一个选自SEQ ID NO:7-9的轻链CDR序列。所述抗体可以包含至少两个选自SEQ ID NO:4至6的重链CDR序列和至少两个选自SEQ ID NO:7-9的轻链CDR序列。所述抗体典型地包含所有三个SEQ ID NO:4至6的重链CDR序列(分别为HCDR1/HCDR2/HCDR3)和所有三个SEQ ID NO:7-9的轻链CDR序列(分别为LCDR1/LCDR2/LCDR3)。所述抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
所述抗体可以包含SEQ ID NO:10或12的重链可变区(HCVR)(Ab 7326变体1和2的HCVR)。所述抗体可以包含SEQ ID NO:11或13的轻链可变区(LCVR)(Ab 7326变体1和2的LCVR)。所述抗体优选包含SEQ ID NO:10或12的重链可变区序列和SEQ ID NO:11或13的轻链可变区序列(尤其是SEQ ID NO:10/11或12/13的HCVR/LVCR对)。
所述抗体可以包含下述的重链(H-链)序列：
SEQ ID NO:14小鼠全长IgG1重链变体1，或
SEQ ID NO:28小鼠全长IgG1重链变体2，或
SEQ ID NO:30人全长IgG1重链变体1，或
SEQ ID NO:16人全长IgG1重链变体2，或
SEQ ID NO:22人全长IgG4P重链变体1，或
SEQ ID NO:34人全长IgG4P重链变体2，或
SEQ ID NO:18Fab重链变体1，或
SEQ ID NO:32Fab重链变体2。
所述抗体可以包含下述的轻链(L-链)序列：
SEQ ID NO:15小鼠全长IgG1轻链变体1，或
SEQ ID NO:29小鼠全长IgG1轻链变体2，或
SEQ ID NO:31人全长IgG1轻链变体1，或
SEQ ID NO:17人全长IgG1轻链变体2，或
SEQ ID NO:23人全长IgG4P轻链变体1，或
SEQ ID NO:35人全长IgG4P轻链变体2，或
SEQ ID NO:19Fab轻链变体1，或
SEQ ID NO:33Fab轻链变体2。
在一个实例中，所述抗体包含下述的重链/轻链序列对：
SEQ ID NO:14/15小鼠全长IgG1变体1，或
SEQ ID NO:28/29小鼠全长IgG1变体2，或
SEQ ID NO:30/31人全长IgG1变体1，或
SEQ ID NO:16/17人全长IgG1变体2，或
SEQ ID NO:22/23人全长IgG4P变体1，或
SEQ ID NO:34/35人全长IgG4P变体2，或
SEQ ID NO:18/19Fab轻链变体1，或
SEQ ID NO:32/33Fab轻链变体2。
相应序列的变体形式可以互换。例如，所述抗体可以包含下述的重链/轻链序列对：
SEQ ID NO:14/29小鼠全长IgG1重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO:28/15小鼠全长IgG1重链变体2/轻链变体1，或
SEQ ID NO:30/17人全长IgG1重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO:16/31人全长IgG1重链变体2/轻链变体1，或
SEQ ID NO:22/35人全长IgG4P重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO:34/23人全长IgG4P重链变体2/轻链变体1，或
SEQ ID NO:18/33Fab重链变体1/轻链变体2，或
SEQ ID NO:32/19Fab重链变体2/轻链变体1。
所述抗体可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
所述抗体可以可替代地是或可以包含上述特定序列之一的变体。抗体变体的以下描述也适用于如上所述的GREM1多肽变体的选择。
例如，变体可以是任何上述氨基酸序列的取代、缺失或添加变体。
变体抗体可以包含1、2、3、4、5、最多10、最多20个或更多(通常最多50个)来自上述特定序列的氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可包括单个氨基酸的缺失、小组氨基酸如2、3、4或5个氨基酸的缺失，或较大氨基酸区域的缺失，如特定氨基酸结构域或其他特征的缺失。“取代”变体通常涉及用相同数量的氨基酸替换一个或多个氨基酸，并进行保守的氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的替代氨基酸取代，例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水氨基酸、另一种疏水氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸。可用于选择合适的取代的20种主要氨基酸的一些性质如下:
Figure BDA0002844022100000331
Figure BDA0002844022100000341
“衍生物”或“变体”通常包括其中出现在序列中的氨基酸是其结构类似物而不是天然存在的氨基酸的那些。序列中使用的氨基酸也可以是衍生的或修饰的，例如标记的，只要抗体的功能不会受到显著的不利影响。
如上所述的衍生物和变体可以在抗体的合成过程中或通过产生后修饰来制备，或者当抗体是重组形式时，使用已知的定点诱变、随机诱变或核酸酶切和/或连接的技术来制备。
变体抗体可以具有与本文公开的氨基酸序列(特别是HCVR/LCVR序列和H-链和L-链序列)具有超过约60％，或超过约70％，例如75％或80％，典型地超过约85％，例如超过约90％或95％氨基酸同一性的氨基酸序列。此外，所述抗体可以是变体，其与本文公开的HCVR/LCVR序列和H-链和L-链序列具有超过约60％，或超过约70％，例如75％或80％，典型地超过约85％，例如超过约90％或95％的氨基酸同一性，同时保留这些序列所公开的精确CDR。变体可以保留与本文公开的HCVR/LCVR序列和H-链和L-链序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性(在某些情况下，同时保留精确的CDR)。
变体典型地保持约60％至约99％的同一性，约80％至约99％的同一性，约90％至约99％的同一性或约95％至约99％的同一性。这种水平的氨基酸同一性可以在相关的序列号序列的全长上或在该序列的一部分上看到，例如在大约20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸上看到，取决于全长多肽的大小。
就氨基酸序列而言，“序列同一性”是指当使用ClustalW(Thompson等人，1994，上文)评估时具有所述值的序列，其具有以下参数:
成对比对参数-方法：精确，矩阵：PAM，空位罚分(Gap open penalty)：10.00，空位延伸罚分(Gap extension penalty)：0.10；
多个比对参数-矩阵：PAM，空位罚分：10.00，％延迟识别：30，惩罚末端空位：开，空位分离距离：0，负矩阵:否，空位延伸罚分：0.20，特定残基的空位罚分：开，亲水性空位罚分：开，亲水性残基：GPSNDQEKR。特定残基的序列同一性旨在包括简单衍生的相同残基。
因此，提供了具有维持这些链的功能或活性的特定序列和变体的抗体。
抗体可以与上述定义的H-链/L-链、HCVR/LCVR或CDR序列竞争结合Gremlin-1或结合相同的表位。特别地，抗体可以与包含SEQ ID NO:4/5/6/7/8/9的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列组合的抗体竞争结合Gremlin-1或结合相同的表位。抗体可能与包含SEQ ID NO:10/11或12/13的HCVR和LCVR序列对或SEQ ID NO:14/15或16/17的全长链的抗体竞争结合Gremlin-1，或结合相同的表位。
术语“表位”是由抗体结合的抗原的区域。表位可以被定义为结构性或功能性的。功能表位通常是结构表位的一个子集，其残基直接影响相互作用的亲和力。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括分子的化学活性表面基团的决定簇，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位，或者与参考抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗体结合相同的表位，允许参考抗体在饱和条件下与蛋白质或肽结合。接下来，评估测试抗体与蛋白质或肽结合的能力。如果测试抗体在蛋白质或肽与参考抗体饱和结合后能够与蛋白质或肽结合，则可以得出结论，测试抗体与参考抗体结合的表位不同。另一方面，如果测试抗体在蛋白质或肽与参考抗体饱和结合后不能与蛋白质或肽结合，那么测试抗体可能结合与本发明的参考抗体结合的表位相同的表位。
为了确定抗体是否与参考抗体竞争结合，上述结合方法在两个方向上进行。在第一个方向上，允许参考抗体在饱和条件下与蛋白质/肽结合，然后评估测试抗体与蛋白质/肽分子的结合。在第二个方向上，允许测试抗体在饱和条件下与蛋白质/肽结合，然后评估参考抗体与蛋白质/肽的结合。如果在两个方向上，只有第一个(饱和的)抗体能够与蛋白质/肽结合，那么可以得出结论，测试抗体和参考抗体竞争结合该蛋白质/肽。如本领域技术人员所理解的，与参考抗体竞争结合的抗体不必定结合与参考抗体相同的表位，但可通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。
如果两种抗体中的每种竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。也就是说，一种抗体的1、5、10、20或100倍过量抑制另一种抗体的结合至少50％、75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测试中测量的那样(参见，例如，Junghans等人,Cancer Res,1990:50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗体结合的氨基酸的所有突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体有相同的表位。如果减少或消除一种抗体结合的氨基酸的一些突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体有重叠的表位。
然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认观察到的测试抗体结合的缺乏实际上是由于与参考抗体结合相同的表位，还是说空间阻断(或另一种现象)是观察到的结合缺乏的原因。可以使用ELISA、RIA、表面离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测试来进行这类实验。
可以通过例如标准ELISA或蛋白质印迹法来检测抗体与Gremlin-1的结合。ELISA也可用于筛选与靶蛋白呈阳性反应的杂交瘤。抗体的结合选择性也可以通过监测抗体与表达靶蛋白的细胞的结合来确定，例如通过流式细胞术。因此，筛选方法可以包括通过进行ELISA或蛋白质印迹或通过流式细胞术来鉴定能够结合Gremlin-1的抗体的步骤。
抗体可以选择性(或特异性)识别Gremlin-1。当抗体或其它化合物与对其具有选择性的蛋白质以优先或高亲和力结合，但基本上不与其它蛋白质结合或以低亲和力结合时，其“选择性结合”或“选择性识别”蛋白质。可以通过确定抗体是否结合如上所述的其他相关蛋白或是否区分它们来进一步研究抗体的选择性。根据本发明使用的抗体通常识别人Gremlin-1.。
抗体也可对相关蛋白质，或对人Gremlin-1和对来自其他物种的Gremlin-1具有交叉反应性。
就特异性(或选择性)而言，应理解抗体与目标蛋白结合，而与任何其他分子没有显著的交叉反应性。交叉反应性可以通过本文描述的任何合适的方法来评估。如果抗体与另一个分子的结合强度为与目标蛋白的结合强度的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％，则可以认为抗体的交叉反应性是显著的。特异性(或选择性)的抗体可以以小于其与目标蛋白结合的强度的约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的强度与另一分子结合。抗体与另一分子的结合强度可以为小于其与目标蛋白结合强度的约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％、小于约2％或小于约1％。
先前已经描述了抗gremlin抗体，例如WO2014/159010A1(Regeneron)描述了抑制Gremlin-1活性的抗gremlin抗体，在25℃时结合亲和力KD值为从625pM至270nM。Ciuclan等人(2013)描述了结合亲和力KD为5.6×10-10M的抗Gremlin-1单克隆抗体。。
本文(以及2017年12月19日提交的PCT/GB2017/083650，其全部内容通过引用并入本文)中新描述的抗Gremlin-1抗体是Gremlin-1活性的变构抑制剂，并且结合到远离BMP结合位点的如上所述的新表位。抗体以异常高的亲和力结合Gremlin-1，Kd值<100pM。因此，这些抗体代表了对目前可用抗体的显著改进，并有望特别用于治疗Gremlin-1介导的疾病。
因此，适用于本发明的抗体可以对(人)Gremlin-1具有高亲和力结合。抗体可具有<1nM的解离常数(KD)，优选<500pM。在一个实例中，抗体具有小于200pM的解离常数(KD)。在一个实例中，抗体具有小于100pM的解离常数(KD)。多种方法可用于确定抗体对其靶抗原的结合亲和力，如表面离子共振测定法、饱和测定法或免疫测定法，如ELISA或RIA，这是本领域技术人员所熟知的。确定结合亲和力的示例性方法是使用CM5传感器芯片在BIAcoreTM2000仪器(Biacore AB，Freiburg，德国)上进行表面离子共振分析，如Krinner等人,(2007)Mol.Immunol.February；44(5):916-25.(Epub 2006May 11))所述。
根据本发明使用的抗体通常是抑制性抗体。Gremlin-1负向调节BMP-2、4和7，因此抑制Gremlin-1导致通过BMP的信号传导增加。
如上所述，本申请的实施例描述了用于筛选抗体是否能够抑制Gremlin 1的两种功能性测试，即SMAD磷酸化测试和Hek Id1报告基因测试。典型地，抑制性抗体恢复SMAD磷酸化和/或在Hek Id1报告基因测试中恢复BMP的信号传导。与BMP对照相比，SMAD磷酸化可以恢复到至少80％、90％或100％。在Hek Id1报告基因测试中，抑制性抗体的IC50可小于10nM，优选小于5nM。
一旦鉴定和选择了合适的抗体，可以通过本领域已知的方法鉴定抗体的氨基酸序列。编码抗体的基因可以用简并引物克隆。抗体可以通过常规方法重组产生。
本公开还提供了编码本文新描述的抗体分子的重链和/或轻链可变区(或全长H-链和L-链)的分离的DNA序列。
变体多核苷酸可以包含序列表中给出的任何核酸序列(包括GREM1和抗GREM1抗体核酸序列)的1、2、3、4、5、最多10、最多20、最多30、最多40、最多50、最多75个或更多个核酸取代和/或缺失。通常，变体具有1-20、1-50、1-75或1-100个取代和/或缺失。
合适的变体可以与本文公开的任何一种核酸序列的多核苷酸至少约70％同源，通常与其至少约80％或90％同源，更合适的是至少约95％、97％或99％同源。变体可以保持至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体通常保持约60％至约99％的同一性，约80％至约99％的同一性，约90％至约99％的同一性或约95％至约99％的同一性。这些水平的同源性和同一性通常至少存在于多核苷酸的编码区。测量同源性的方法在本领域是众所周知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，同源性是基于核酸同一性来计算的。这种同源性可以存在于至少约15个、至少约30个、例如至少约40个、60个、100个、200个或更多个连续核苷酸(取决于长度)的区域内。这种同源性可存在于未修饰的多核苷酸序列的整个长度上。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，该程序可用于计算同源性(例如，用其默认设置)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12,p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或排列序列(通常基于它们的默认设置)，例如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300；Altschul,S,F等人(1990)J MolBiol 215:403-10中所述。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字节来识别高评分序列对(HSP)，所述短字节是当短字节与数据库序列中相同长度的字节对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T的字节。T被称为邻近字节评分阈值(neighbourhoodword score threshold)(Altschul等人，上文)。这些最初的邻近字节命中充当种子，用于启动搜索以找到包含它们的HSP。字节命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对分数可以增加为止。当下列情况发生时，在每个方向上的字节命中延伸停止：由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积比对评分变为零或更低；或者到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用字长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)，比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于约1，典型地小于约0.1，合适地小于约0.01，最合适地小于约0.001，则认为一个序列与另一个序列相似。例如，最小和概率可以在约1至约0.001的范围内，通常约0.01至约0.001。
同源物可以与相关多核苷酸中的序列不同少于约3、5、10、15、20个或更多个突变(每个突变可以是取代、缺失或插入)。例如，同源物可有3-50个突变、通常是3-20个突变的不同。可以在同源物的至少30个，例如至少约40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域上测量这些突变。
在一个实施方案中，由于遗传密码中的冗余，变体序列可以不同于序列表中给出的特定序列。DNA编码有4个主要的核酸残基(A、T、C和G)，并使用这些残基来“拼写”代表生物体基因中编码蛋白质的氨基酸的三个字母密码子。沿着DNA分子的线性密码子序列被翻译成由这些基因编码的蛋白质中氨基酸的线性序列。该编码是高度简并的，61个密码子编码20种天然氨基酸，3个密码子代表“停止”信号。因此，大多数氨基酸是由大于一个密码子编码的——事实上有几个是由四个或更多不同的密码子编码的。因此，本发明的变体多核苷酸可以编码与本发明的另一种多核苷酸相同的多肽序列，但是可以具有不同的核酸序列，这是由于使用不同的密码子来编码相同的氨基酸。
该DNA序列可以包括合成的DNA，例如通过化学处理产生的合成的DNA，cDNA，基因组DNA或其任意组合。
可以通过本领域技术人员熟知的方法获得编码本文所述抗体分子的DNA序列。例如，可以根据需要从确定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列。
构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员熟知的。在这方面，可参考冷泉港出版社出版的“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York and the Maniatis Manual。
核酸拮抗剂
多核苷酸，如核酸，是包含两个或多个核苷酸的聚合物。核苷酸可以是天然的或人工的。核苷酸通常含有一个核碱基、一个糖和至少一个连接基团，如磷酸酯、2’邻甲基、2’甲氧基乙基、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯或硫代磷酸酯基团。核碱基通常是杂环的。核碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，更具体地说是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有一磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸盐可以附着在核苷酸的5’或3’侧。
核苷酸包括但不限于腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、5-甲基胞苷一磷酸、5-甲基胞苷二磷酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羟基甲基胞苷一磷酸、5-羟基甲基胞苷二磷酸、5-羟基甲基胞苷三磷酸、环腺苷一磷酸(cAMP)、环鸟苷一磷酸(cGMP)、腺苷三磷酸(ATP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、5-甲基-2’-脱氧胞苷一磷酸、5-甲基-2’-脱氧胞苷二磷酸、5-甲基-2’-脱氧胞苷三磷酸、5-羟基甲基2’-脱氧胞苷一磷酸、5-羟基甲基2’-脱氧胞苷二磷酸、5-羟基甲基2’-脱氧胞苷三磷酸。核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。
核苷酸可包含额外的修饰。尤其是，合适的修饰的核苷酸包括但不限于2’氨基嘧啶(如2’-氨基胞苷和2’-氨基尿苷)、2’-羟基嘌呤(如2’-氟嘧啶(如2’-氟胞苷和2’氟尿苷))、羟基嘧啶(如5’-α-P-硼烷尿苷)、2’-邻甲基核苷酸(如2’-邻甲基腺苷、2’-邻甲基鸟苷、2’-邻甲基胞苷和2’-邻甲基尿苷)、4’-硫嘧啶(如4’-硫尿苷和4’-硫胞苷)和具有核碱基修饰的核苷酸(如5-戊烯基-2’脱氧尿苷、5-(3-氨丙基)-尿苷和1,6-二氨基己基-N-5-氨甲酰基甲基尿苷)。
多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式相互连接。核苷酸可以通过磷酸酯、2’邻-甲基、2’甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯连接。如在核酸中，核苷酸典型地由它们的糖和磷酸基团连接。核苷酸可以像嘧啶二聚体一样通过它们的核碱基连接。
GREM1拮抗剂可以是编码本文所述的抗GREM1抗体的多核苷酸。
多核苷酸可以是核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)、吗啉代核酸或具有核苷酸侧链的其他合成聚合物。多核苷酸可以是单链或双链的。
多核苷酸序列可以被克隆到任何合适的表达载体中。在表达载体中，编码构建体的多核苷酸序列典型地与能够提供由宿主细胞表达编码序列的控制序列可操作地连接。这样的表达载体可用于表达构建体。
在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是编码本文所述的抗GREM1抗体的多核苷酸。该多核苷酸可被提供用于基因治疗。多核苷酸可以在能够在体内提供抗GREM1抗体表达的任何合适的载体中被提供。
编码抗GREM1抗体的多核苷酸可以是DNA序列。该DNA序列可以在任何合适的载体中被提供，例如表达载体，用于给有需要的受试者施用。例如，可以在能够在体内提供抗GREM1抗体表达的表达载体中向受试者施用该DNA序列。表达载体可以是病毒表达载体，如腺相关病毒(AAV)载体。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是编码本文所述的抗GREM1抗体的DNA序列。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是用于基因治疗的DNA序列，其中该DNA序列编码本文所述的抗GREM1抗体。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是包含编码本文所述抗GREM1抗体的DNA序列的AAV。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是用于基因治疗的AAV，其中AAV包含编码本文所述的抗GREM1抗体的DNA序列。
编码抗GREM1抗体的多核苷酸可以是RNA序列。该RNA序列可以在任何合适的载体中被施用给有需要的受试者。RNA序列可以是信使RNA(mRNA)序列。该mRNA序列可以以稳定的形式被施用给有需要的受试者。例如，mRNA序列可以在脂质纳米颗粒(LNP)组合物中被提供。LNP组合物可以包含任何合适的能够封装该mRNA序列的LNP，以增加所述mRNA序列的稳定性。因此，在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是编码本文所述的抗GREM1抗体的稳定的mRNA序列。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是用于基因治疗的稳定的mRNA序列，其中该mRNA序列编码本文所述的抗GREM1抗体。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是LNP组合物，其包含编码本文所述的抗GREM1抗体的mRNA。在一个实施方案中，抗GREM1拮抗剂是用于基因治疗的LNP组合物，其中LNP组合物包含编码本文所述的抗GREM1抗体的mRNA。
术语“可操作地连接”是指一种并列(juxtaposition)，其中所描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以这样的方式连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。可以将相同或不同多核苷酸的多个拷贝引入载体中。
然后可以将表达载体引入合适的宿主细胞中。因此，可以通过将编码构建体的多核苷酸序列插入表达载体，将载体导入相容的细菌宿主细胞，并在导致多核苷酸序列表达的条件下使宿主细胞生长来产生构建体。
基于核酸的GREM1拮抗剂可以降低GREM1的表达。用于敲低(knock down)蛋白质表达的反义和RNA干扰(RNAi)技术在本领域中是众所周知的，并且可以采用标准方法来敲低目标分子的表达。反义和siRNA技术都会干扰mRNA。反义寡核苷酸通过与mRNA的一部分结合(杂交)来干扰mRNA。因此，反义寡核苷酸被设计成与mRNA互补(尽管寡核苷酸不必是100％互补的，如下所述)。换句话说，反义寡核苷酸可以是cDNA的一部分。再者，寡核苷酸序列可以不是与cDNA序列100％相同的。这也在下面讨论。RNAi涉及双链RNA的使用，例如小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，它们可以结合到mRNA上并抑制蛋白质表达。
因此，拮抗剂可以是一种寡核苷酸，其与编码GREM1的mRNA特异性杂交，如SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:37或其变体的编码序列。当寡核苷酸以优先或高亲和力与靶序列杂交，但基本上不杂交、不杂交或仅以低亲和力与其它序列杂交时，它与靶序列“特异性杂交”。更优选地，寡核苷酸以比其它核酸杂交的Tm大至少5℃、至少10℃、至少20℃、至少30℃或至少40℃的Tm与靶序列杂交。允许杂交的条件在本领域是众所周知的(例如，Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:a laboratory manual,3rd edition,Cold Spring HarbourLaboratory Press；and Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel等人编辑.,Greene Publishing and Wiley-lnterscience,New York(1995))。杂交条件可以是本领域所述的严格条件
寡核苷酸是短核苷酸聚合物，典型地具有50个或更少的核苷酸，例如40个或更少、30个或更少、22个或更少、21个或更少、20个或更少、10个或更少或5个或更少的核苷酸。所用的寡核苷酸长度可以是20至25个核苷酸，更优选长度为21或22个核苷酸。核苷酸可以是天然的或人工的。核苷酸可以是上述的任何一种。
GREM1拮抗剂可以是结合GREM1的抗体，典型地特异性结合GREM1。当抗体以优先或高亲和力与蛋白质结合，但基本上不结合、不结合或仅以低亲和力与其他蛋白质结合时，抗体“特异性结合”该蛋白质。例如，当抗体优先或高亲和力地结合靶标，但基本上不结合、不结合或仅低亲和力地结合其它人蛋白质时，抗体“特异性地结合”靶分子。
如果抗体结合的Kd为1×10-7M或更小，更优选地5×10-8M或更小，更优选地1×10-8M或更小，或更优选地5×10-9M或更小，则抗体以优先或高亲和力结合。如果抗体结合的Kd为1×10-6M或更高，更优选地1×10-5M或更高，更优选地1×10-4M或更高，更优选地1×10-3M或更高，甚至更优选地1×10-2M或更高，则抗体以低亲和力结合。抗体可以是例如单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、CDR移植抗体或人源化抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，如Fab、F(ab’)2或Fv片段。
患者
根据本发明可以治疗任何患者。患者典型地是人。然而，患者可以是另一种哺乳动物，如商业养殖动物，如马、牛、羊、鱼、鸡或猪，实验动物，如小鼠或大鼠，或宠物，如豚鼠、仓鼠、兔子、猫或狗。
药物组合物、剂量和剂量方案
本发明的GREM1拮抗剂可以在药物组合物中被提供。药物组合物通常将是无菌的，并且典型地将包括药学上可接受的运载体和/或佐剂。本发明的药物组合物可以另外包含药学上可接受的佐剂和/或运载体。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。该运载体可以适合肠胃外施用，例如静脉内、肌内、皮内、眼框内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。可替代地，运载体可以适合于非肠胃外施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径。运载体可适合口服施用。根据施用途径的不同，调节剂可以被包裹在一种材料中，以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。
本发明的药物组合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物学活性并且不产生任何不希望的毒理学效应的盐。这样的盐的例子包括酸加成(addition)盐和碱加成盐。
药学上可接受的载体包括水性运载体或稀释剂。可用于本发明药物组合物的合适的水性运载体的例子包括水、缓冲水和盐水。其他运载体的例子包括乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。在许多情况下，希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。
治疗组合物在生产和储存条件下典型地必须是无菌和稳定的。该组合物可被配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。
本发明的药物组合物可以包含另外的活性成分。
包含本文所述拮抗剂的试剂盒和使用说明也在本公开的范围内。试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂，例如本文讨论的另外的治疗剂或预防剂。
本文所述的拮抗剂或其制剂或组合物可被施用用于预防性和/或治疗性治疗。
在治疗应用中，将化合物以足以治愈、缓解或部分阻止病症或其一种或多种症状的量施用给已经患有上述疾病(disorder)或病症的受试者。这样的治疗性治疗可以降低疾病症状的严重程度，或者增加无症状期的频率或持续时间。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。
在预防性应用中，将制剂以足以预防或减少病症或其一种或多种症状的后续影响的量施用给有上述疾病或病症风险的受试者。足以实现这一点的量被定义为“预防有效量”。每个目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和总体状态。
施用对象可以是人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长目动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。对人施用是典型的。
本发明的拮抗剂或药物组合物可以使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种施用途径施用。如技术人员所理解的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而变化。本发明的化合物或药物组合物的施用途径的例子包括静脉内、肌内、皮内、眼框内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常是注射。可替代地，本发明的抗体/调节剂或药物组合物可以通过非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径。本发明的抗体/调节剂或药物组合物可以用于口服施用。
本发明的抗体/调节剂或药物组合物的合适剂量可以由熟练的医生确定。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对特定患者、组合物和施用方式有效实现所需治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和既往病史，以及医学领域熟知的类似因素。
合适的剂量可以是例如待治疗患者的约0.01μg/kg至约1000mg/kg体重，典型地约0.1μg/kg至约100mg/kg体重。例如，合适的剂量可以是每天约1μg/kg至约10mg/kg体重，或者每天约10μg/kg至约5mg/kg体重。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单剂量，可以随时间施用几次分开的剂量，或者可以根据治疗情况的需要按比例减少或增加剂量。本文所用的剂量单位形式是指适合作为给待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，该活性化合物经计算可与所需的药物运载体一起产生所需的治疗效果。
施用可以是单剂量或多剂量。可以通过相同或不同的途径和在相同或不同的位置施用多剂量。可替代地，可以通过缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少频率的施用。剂量和频率可根据拮抗剂在患者体内的半衰期和所需治疗的持续时间而变化。
如上所述，本发明的调节剂/抗体或药物组合物可以与一种或多种其他治疗剂共同施用。
两种或多种试剂的联合施用可以通过多种不同的方式实现。两者可以在单一组合物中一起施用，或者它们可以作为联合治疗的一部分在分开的组合物中施用。例如，一种可以在另一种之前或分开施用，在另一种之后或相继施用，或者与另一种同时(concurrently)或同步(simultaneously)施用。
药物组合物和施用方式
用于本文所述治疗方法的拮抗剂可以配制成药物组合物。除了治疗活性成分之外，这些组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、运载体、稀释剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这样的材料应该是无毒的，并且应该不干扰活性成分的功效。药物运载体或稀释剂可以是例如等渗溶液。
运载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌内和腹膜内途径。例如，固体口服剂型可以与活性物质一起含有稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；粘合剂；例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；解聚剂，例如淀粉、藻酸、藻酸盐或羟乙酸淀粉钠；起泡混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸盐；以及通常用于药物制剂中的无毒且药理上无活性的物质。这样的药物制剂可以以已知的方式制造，例如，通过混合、制粒、压片、糖衣或薄膜包衣工艺。
口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并含有10％至95％，优选25％至70％的活性成分。在药物组合物冻干的情况下，冻干材料可以在施用前重构，例如悬浮液。重构优选在缓冲液中进行。
可以提供给个人口服施用的胶囊、片剂和丸剂具有肠溶衣，该肠溶衣包含例如丙烯酸树脂(Eudragit)“S”、丙烯酸树脂(Eudragit)“L”、醋酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。
用于口服施用的液体分散体可以是糖浆、乳剂或悬浮液。糖浆可以含有例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇作为运载体。
悬浮液和乳液可以含有例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为运载体。用于肌内注射的悬液或溶液可以与活性物质一起包含药学上可接受的运载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如丙二醇)，以及如果需要的话，合适量的盐酸利多卡因。
用于静脉内施用或输注的溶液可以包含作为运载体的例如无菌水，或者优选地它们可以是无菌的、水性的、等渗盐溶液的形式。
对于栓剂，传统的粘合剂和运载体可以包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以由含有0.5％至10％，优选1％至2％活性成分的混合物制成。
多核苷酸或寡核苷酸抑制剂可以是裸核苷酸序列或与阳离子脂质、聚合物或靶向系统结合。它们可以通过任何可用的技术来递送。例如，多核苷酸或寡核苷酸可以通过针注射引入，优选皮内、皮下或肌内。可替代地，多核苷酸或寡核苷酸可以使用递送装置如颗粒介导的基因递送直接递送穿过皮肤。多核苷酸或寡核苷酸可以局部施用到皮肤或粘膜表面，例如通过鼻内、口服或直肠内施用。
多核苷酸或寡核苷酸构建体的摄取可以通过几种已知的转染技术来增强，例如包括使用转染剂的那些技术。这些试剂的例子包括阳离子试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖，以及脂质转染剂，例如脂质体转染剂(lipofectam)和转染剂(transfectam)。可以改变待施用的多核苷酸或寡核苷酸的剂量。
施用典型地以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防可被视为治疗)，这足以显示对个体的益处，例如预防或延迟疾病或病症发作、改善一种或多种症状、诱导或延长缓解或延迟复发或再现的有效量。
剂量可以根据各种参数来确定，尤其是根据所使用的物质；待治疗的个体的年龄、体重和状况；施用途径；和所需的方案。医生将能够确定任何特定个体所需的施用途径和剂量。根据上述情况，典型的每日剂量为每kg体重约0.1至50mg。剂量可以作为单剂提供，或者可以作为多剂提供，例如以规则的间隔施用，例如每小时施用2、3或4次。典型地，多核苷酸或寡核苷酸抑制剂的施用范围为1pg至1mg、优选1pg至10μg核酸用于颗粒介导的递送，以及10μg至1mg核酸用于其他途径。
上面提到的技术和方案(protocol)的例子可以在Remington's PharmaceuticalSciences(第20版,2000,Lippincott,Williams&Wilkins出版)中找到。
治疗组合物
如上所述的本发明组合物可以单独使用/施用，或者与其他治疗组合物或治疗组合联合使用/施用，例如作为辅助治疗。其它治疗组合物或治疗例如可以是本文所讨论的一种或多种，并且可以与本发明的组合物同时或依次施用。
如上所述，GREM1拮抗剂在联合治疗中具有特别的用途，因为它们可用于使癌症或肿瘤对另一种抗癌剂(如化学治疗剂)或另一种癌症疗法(如放疗或手术)敏感。在没有GREM1拮抗剂的情况下，癌症可能对其他抗癌剂或癌症疗法具有抗性。
因此，抗GREM1拮抗剂可与任何其他癌症疗法或任何其他癌症治疗剂如化学治疗剂联合使用。其他癌症疗法可选自任何已知的相关癌症疗法，如任何已知的结肠直肠癌疗法。其他癌症疗法可以是放射疗法。合适的放射疗法治疗描述在例如Van Cutsem(和其他人)Annals of Oncology,2014.Vol 25,Issue 3中。放射治疗可以在癌症手术之前或在癌症手术之后进行。放射治疗可以是辅助性放射治疗。放射治疗可以与化疗联合进行，例如施用如下所述的化学治疗剂。
癌症的其它治疗剂，如化学治疗剂，可以选自相关癌症的任何已知治疗剂，包括相关癌症的任何已知化学治疗剂或化学治疗剂的组合。例如，GREM1拮抗剂可以与5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康和亚叶酸中的一种或多种联合使用，特别是在结肠直肠癌的治疗中。以下在用于治疗的组合物和试剂盒的上下文中描述了将GREM1拮抗剂与其它抗癌剂组合用于治疗结肠直肠癌和多发性骨髓瘤的联合治疗的进一步实例。当不与GREM1拮抗剂联合施用时，癌症可对一种或多种化学治疗剂(如上述化学治疗剂之一)有抗性。GREM1拮抗剂可与西妥昔单抗、纳武利尤单抗或贝伐单抗联合使用。可以施用结合了抗GREM1特异性和纳武利尤单抗或贝伐单抗特异性的双特异性抗体。
作为上述方面的一部分，本发明提供了抗GREM1拮抗剂，用于在根据本发明的治疗和/或预防癌症的方法中的用途，其中该方法包括分别、顺序或同时施用化学治疗剂。本发明还提供了用于根据本发明的治疗和/或预防癌症的方法中的抗GREM1拮抗剂，其中该方法包括分别、顺序或同时的放射治疗。本发明还提供了用于治疗具有基质GREM1过表达癌症的方法中的化学治疗剂，其中该方法包括分别、顺序或同时施用抗GREM1拮抗剂。本发明还提供了用于预防或治疗具有上皮GREM1过表达的癌症的方法中的化学治疗剂，其中该方法包括分别、顺序或同时施用抗GREM1拮抗剂。
另外提供了包含抗GREM1拮抗剂和另外的抗癌剂的组合物或试剂盒。另外的抗癌剂可以是靶向治疗剂或化学治疗剂。另外的抗癌剂可以是任何上述抗癌剂。组合物或试剂盒中可以掺入多于一种这样的另外的抗癌剂。该组合物或试剂盒可包含抗GREM1拮抗剂和一种或多种选自以下的抗癌剂：5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康和亚叶酸、西妥昔单抗、纳武利尤单抗和贝伐单抗，特别是作为用于治疗结肠直肠癌的组合物或试剂盒的一部分。用于治疗多发性骨髓瘤的组合物或试剂盒可包含抗GREM1拮抗剂和一种或多种抗CD38抗体(如达雷木单抗)、抗SLAMF7抗体(如艾洛珠单抗)和/或抗IL-6抗体(如司妥昔单抗)。可以在组合物或试剂盒中提供联合抗GREM1特异性和其他上述特异性之一的双特异性抗体。优选的组合物包括抗GREM1拮抗剂和抗IL-6抗体(优选司妥昔单抗)。用于治疗多发性骨髓瘤的组合物或试剂盒可包含抗GREM1拮抗剂和硼替佐米和/或iMID(来那度胺/pomalenomide)或其类似物。上述任何组合物和试剂盒中的抗GREM1拮抗剂可以优选为抗GREM1抗体。
治疗指示(Therapeuticindications)
本发明的拮抗剂用于治疗或预防癌症。
癌症的预防可以包括防止受试者被诊断患有癌症或推迟癌症的发作。癌症的预防还可包括预防先前已被诊断患有癌症的受试者的癌症复发或再现。癌症的预防可另外包括增加未被诊断为患有癌症或先前已被诊断为患有癌症的受试者的存活。
癌症的治疗可以改善癌症的一种或多种症状，诱导或延长癌症的缓解，或延迟癌症的复发或再现。治疗可以治愈、减轻或部分抑制癌症。它可导致疾病症状的严重性的降低，或无症状期的频率或持续时间的增加。癌症的治疗还可以包括阻止癌症(例如，已确定的癌症)从其在患者体内的初始部位扩散到患者体内的一个或多个第二(secondary)部位。因此，癌症的治疗可以包括预防现有癌症的扩散或转移。结肠直肠癌的治疗可以减少息肉负荷(息肉的数量)，例如通过内窥镜检查进行的分析。多发性骨髓瘤的治疗可导致骨髓肿瘤负荷的减少，例如通过MRI/CT扫描的分析，和/或浆细胞负荷的减少，这可在骨髓活检后确定，和/或一种或多种血清标志物如单克隆抗体产生(副蛋白)和血清游离轻链(freelight chain)(FLC)比率的减少，和/或相关的骨骼溶解损伤的减少，这可通过放射照相术(radiography)检测到。
检测和诊断
基于基质GREM1和癌症之间的相关性，本发明还提供了检测和诊断癌症、预测癌症预后和预测癌症对治疗的应答性的附加手段。
因此，本发明提供了检测患者中癌症的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，其中GREM1的基质过表达表明患者患有癌症。本发明还提供了一种预测患者中癌症预后的方法，该方法包括确定癌症是否包括GREM1的基质过表达，其中癌症中GREM1的基质过表达表明患者的预后比GREM1的基质正常表达的情况更差。所述癌症可以是本文所述的任何癌症。所述癌症优选为结肠直肠癌，典型地包括促结缔组织增生基质，多发性骨髓瘤或乳腺癌。
诊断包括确定个体是否患有癌症或肿瘤和/或确定癌症或肿瘤的严重程度。
预后包括预测个体是否会发展成癌症或肿瘤、他们是否需要治疗、个体将需要的治疗类型、他们是否会对治疗有应答、他们是否和/或何时会遭受癌症发作、复发或再现、症状或癌症发作、复发或再现的严重程度或持续时间。预后方法可以预测从癌症中缓解的个体是否会复发。预测个体是否会复发包括确定个体会复发的可能性，和/或预测他们何时会复发。本发明还提供了用于确定患有或疑似患有癌症或有患癌症风险的患者是否可能对化学治疗剂治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，从而预测该患者是否可能对化学治疗剂治疗有应答。
本发明还提供了方法，用于确定患有或疑似患有癌症或有患癌症风险的患者是否可能对GREM1拮抗剂的治疗有应答，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，从而预测患者是否可能对GREM1拮抗剂的治疗有应答。上述方法可进一步预测对GREM1拮抗剂和化学治疗剂联合治疗的应答性，或对包括GREM1拮抗剂的施用和放疗的联合治疗的应答性。
个体对给定治疗的应答性的预测意味着预期个体从接受治疗中获得益处或足够程度的益处。个体对治疗的预测的无应答性意味着不预期个体从接受治疗中获得益处或足够程度的益处。预测应答的方法可以在施用GREM1拮抗剂或化学治疗剂之前进行。然后，在为个体选择或推荐合适的治疗时，可以考虑该预测。可替代地，该方法可在用疗法治疗后进行，并用于监测和预测个体对治疗的应答。典型地，该方法用于预测个体是否会对该疗法的治疗产生初级(primary)应答，即该个体在首次接受治疗时是否会应答。在某些情况下，该方法用于预测继发性无应答性，即最初对治疗有应答的个体是否会在以后停止对治疗有应答或对治疗应答不佳。
根据本发明，与参考样品或参考水平相比，个体中GREM1的基质和/或上皮水平的增加表明与癌症的存在相关的阳性诊断，例如个体患有癌症或特定形式的癌症或患有更严重的癌症。GREM1的基质和/或上皮水平的增加也表明负面的预后，即个体的预测结果差，例如个体对特定的治疗将不会应答、从癌症缓解的个体将会复发、或者个体发展成癌症的风险增加。
相反，GREM1水平降低或正常水平表明诊断为阴性，例如该个体没患有癌症或癌症不太严重。GREM1水平降低可表明正面的预后(positive prognosis)，这对患者来说是一个好的结果，例如，个体对特定的治疗将会应答、或者从癌症中缓解的个体将不会复发，或者不会增加发展成疾病或病况的风险。为了诊断个体是否患有癌症，参考样品或水平典型地代表没患有相关癌症或怀疑患有癌症但随后被证实没患有癌症的个体中GREM1的基线水平。
诊断或预后的方法可以包括为个体选择或推荐合适的治疗，即基于诊断或预后。然后，可以对该个体施用所选择的或推荐的治疗。因此，上述检测、诊断、预后和应答性的预测的方法可进一步包括向该个体施用一种或多种预防性或治疗性抗癌剂，或施用癌症疗法如放射疗法的步骤。所述一种或多种试剂典型地包含GREM1拮抗剂，任何一种可进一步包含如上所述的另外的抗癌剂。
在一些情况下，与参考样品或参考水平相比，GREM1的过表达表明个体对GREM1拮抗剂的治疗将会应答。然后可以选择或推荐包括使用GREM1拮抗剂的治疗，然后可以进一步施用给该个体。类似地，可以基于GREM1的过表达选择包括使用GREM1拮抗剂和另外的抗癌剂的治疗。
在其他情况下，与参考样品或参考水平相比，GREM1水平降低或正常水平表明该个体对GREM1拮抗剂的治疗将不会应答。然后不向该个体施用GREM1拮抗剂。进而，可以选择或推荐对个体进行除GREM1拮抗剂以外的治疗性治疗，然后可以进一步对个体施用。
在本发明的所有方面，可以选择患有癌症(例如结肠直肠癌或多发性骨髓瘤或乳腺癌)的个体或怀疑患有该疾病或病症的个体和/或具有发展该疾病或病症风险的个体进行治疗或鉴定。例如，该个体可能尚未被正式诊断，但由于存在一种或多种症状，可能被怀疑患有该疾病或病症。如果个体具有一种或多种与癌症相关的风险因素和/或一种或多种增加其癌症易感性的倾向(predisposition)，则该个体可被认为具有患癌症的风险。与结肠直肠癌相关的风险因素包括上述的SNP和例如在如上所述的Tomlinson等人，PLosGenet，2011中，以及遗传性基因突变，如GREM1编码基因的一个或多个突变，或影响GREM1基因表达的任何其他突变，包括引起HMPS的突变。
以下实施例说明了本发明。
实施例
实施例1-蛋白质表达、纯化、重折叠和结构测定。
蛋白质表达和包涵体制备
将被优化用于在大肠杆菌中表达的一个截短的人Gremlin-1编码序列(SEQ IDNO:20)使用BamHI/XhoI克隆到修饰的pET32a载体(Merck Millipore)中，产生编码具有N-末端6His-TEV标签的Gremlin序列的载体(pET-hGremlin1)。
表达序列:
MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD；SEQID NO:2(6His-TEV标签的非Gremlin残基以斜体显示)。序列编号基于UniProt O60565和SEQ ID NO:1。
用pET-hGremlin1质粒DNA转化BL21(DE3)细胞。从LB/Amp琼脂平板上挑取一个氨苄青霉素抗性菌落，用于接种100ml的LB/Amp起始培养物。在37℃下振荡(200rpm)16小时后，用25ml起始培养物接种500mL的2xTY/Amp培养基。在37℃下振荡(250rpm)培养，直到OD600达到3。随后，用20mL MOPS+甘油进料混合物(glycerol feed mix)(1M MOPS pH 7.4，40％甘油，0.5％MgSO4，0.42％MgCl2)补充培养基，用300μM IPTG诱导，并进一步在17℃下以180rpm孵育16小时。在离心机中收获细胞(在4℃下4000g，20分钟)。
在4℃下将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(PBS pH 7.4，0.35mg/ml溶菌酶，10μg/ml脱氧核糖核酸酶和3mM MgCl2)中，通过在4℃下以3500g离心30分钟来收集不溶性级分。通过重悬于洗涤缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH 8.0)中将沉淀的包涵体洗涤三次，然后以21000g离心15分钟。在没有Triton X-100的情况下，使用洗涤缓冲液进行另外两次洗涤。
溶解
将包涵体重悬在变性缓冲液(8M尿素，100mM Tris，1mM EDTA，10mM Na2S4O6和100mM Na2SO3，pH 8.5)中，在室温下搅拌16小时，并以21000g离心15分钟来澄清。
折叠前纯化
将溶解的包涵体装载到Sephacryl S-200 26/60柱(120mL)上，该柱在8M尿素、50mM MES、200mM NaCl、1mM EDTA、pH 6.0中平衡。将含有Gremlin-1蛋白的级分用6M尿素、20mM MES、pH 6.0稀释，并装载到HiTrap SP HP阳离子交换柱上，用1M NaCl梯度以10个柱体积(10CV)洗脱。合并含有纯化的变性hGremlin-1蛋白的级分。
重折叠
将变性的纯化Gremlin-1蛋白逐滴加入重折叠缓冲液(50mM Tris，pH 8.5，150mMNaCl，5mM GSH和5mM GSSG，0.5mM半胱氨酸，5mM EDTA，0.5M精氨酸)至最终浓度为0.1mg/ml，并在4℃下持续搅拌孵育5天。5天后，用20mM HEPES、100mM NaCl(pH 7.5)对Gremlin-1蛋白进行透析。
透析后，将蛋白质应用于肝素HiTrap柱，并使用0-100％梯度肝素洗脱缓冲液(20mM HEPES，1M NaCl，pH 7.5)以20CV洗脱。正确折叠的蛋白质在1M NaCl下洗脱，而任何错误折叠的蛋白质在较低盐浓度下洗脱。
在1M NaCl下洗脱的蛋白质在S75 26/60柱上浓缩并进一步纯化，该柱用20mMHepes，pH 7.5，1M NaCl平衡。
蛋白质通过SDS PAGE(在凝胶中迁移)进行表征，使用液相色谱质谱(LC-MS)证明了具有预期的分子量和正确的二硫键排列，并在细胞测试(ID1报告基因测试)中具有活性。
Gremlin 1结构测定
通过以1∶1的比例混合6.6mg/ml的Gremlin 1溶液和0.1M柠檬酸(pH 4)、1M氯化锂和27％聚乙二醇(PEG)6000，使用悬滴法生长Gremlin 1蛋白质晶体。在收集数据之前，通过向结晶缓冲液中加入20％甘油对晶体进行冷冻保护(cryo-protect)。衍射数据在DiamondLight Source收集，并使用XDS进行处理(Kabsch,Wolfgang(2010)ActaCrystallographica Section D 66,125—132)。衍射数据统计总结在下表中:
表2:衍射数据统计
Figure BDA0002844022100000581
Figure BDA0002844022100000591
＊括号中的值对应最高分辨率的外壳
＊＊r.m.s.d均方根差
通过使用Phaser(McCoy等人,J Appl Cryst(2007),40,658-674)和可从专有的(proprietary)Gremlin-1/Fab复合物坐标(coordinate)获得的Gremlin-1模型进行分子替换来对Gremlin-1结构进行解析。所得到的Gremlin-1模型包含四个Gremlin-1单体的拷贝，它们以两个二聚体的形式存在。用Coot(Emsley等人Acta Crystallographica Section D:Biological Crystallography 66(4),486-501)进行模型修正，用Refmac(Murshudov etal REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.ActaCrystallographica Section D:Biological Crystallography.2011；67(Pt 4):355-367)对坐标细化。用Molprobity(Chen等人(2010)MolProbity:all-atom structurevalidation for macromolecular crystallography.Acta Crystallographica D66:12-21)验证最终的坐标。上面的表2显示了模型细化(refinement)统计的概要。在2017年12月19日提交的PCT/EP2017/083650的表1(图1)中提供了Gremlin-1结晶学的全部结构数据，其通过引用并入本文。
实施例2——Gremlin-1上的BMP结合残基
如上所述，Gremlin-1属于骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂蛋白家族的一个亚组，称为DAN家族。在DAN家族中，Gremlin-1与Gremlin-2(PRDC)具有最大的同源性。
实施例1中解析的
Figure BDA0002844022100000601
人Gremlin-1结构与已发表的小鼠Gremlin-2结构有许多共同特征(Nolan等人(2013)，Structure，21，1417–1429)。总体折叠非常相似，其中Gremlin-1的两个拷贝形成一个反平行的非共价二聚体，排列成拱形。每一个单体都采用特征性的手指-手腕-手指的排列方式，在与手指相对的手腕末端有一个半胱氨酸结基序。在两种结构中可见的序列中，蛋白质之间的序列同一性从52％上升到67％。最高度保守的区域位于延展的二聚体界面，这里所有的关键接触残基都是100％保守的。
已通过诱变鉴定出BMP2、4和7与小鼠Gremlin-2(PRDC)和DAN(NBL1)结合所涉及的残基(Nolan等人(2013),Structure,21,1417–1429和Nolan等人(2014)J.Biol.Chem.290,4759-4771)。预测的BMP结合表位包括跨越二聚体凸表面上两种单体的疏水贴片。通过诱变鉴定出6个残基：Trp72、Phe96、Tyr98、Phe104、Tyr105和Phe117，其在人Gremlin-1中是100％保守的(基于小鼠Gremlin-2序列编号)。同源性的程度延伸到在两种蛋白质中采用相同构象的侧链的定位。
根据结构比对，在Gremlin PDB文件中使用的氨基酸编号与已发表的小鼠的Gremlin-2结构中的编号相匹配。这使得在描述结构时能够对氨基酸进行相似比较。然而，为了清楚起见，下文显示了经鉴定为在BMP结合中起作用的关键残基，基于SEQ ID NO:1的PDB文件和UniProt文件的编号列在括号中：
Trp72(93)、Phe96(117)、Tyr98(119)、Phe104(125)、Tyr105(126)和Phe117(138)。
在小鼠Gremlin-2和人Gremlin-1中，疏水性BMP结合表位被每个蛋白质的N末端残基形成的α螺旋部分掩埋。已经提出了BMP结合的一个模型，其中N末端可以弯曲，暴露出完整的BMP结合界面(Nolan等人(2013),Structure,21,1417–1429)。在目前的分析中，在使表面揭示每种蛋白质上的BMP结合面的相似性之前，从人Gremlin-1和小鼠Gremlin-2结构中去除了N末端残基。
文献仅描述了对BMP结合有影响的六个位点的诱变。实际的BMP表位可能覆盖了更大的表面区域，包括邻近的氨基酸。通过突出显示Gremlin-1表面上突变残基的
Figure BDA0002844022100000611
内的所有残基，揭示了Gremlin-1的一个更大区域，该区域可能潜在地是治疗剂的靶标。这一更广泛的区域包含人Gremlin-1的下列氨基酸:
Asp92-Leu99
Arg116-His130
Ser137-Ser142
Cys176-Cys178
(编号基于SEQ ID NO:1)
通过将已发表的信息与人Gremlin-1的晶体结构信息相结合，已经鉴定出了人Gremlin-1中为阻断其与BMP的相互作用的治疗干预提供了一条潜在途径的区域。
实施例3–Hek Id1报告基因测试
背景
Hek Id1报告基因测试使用克隆12Hek293-Id1报告细胞。该细胞系稳定转染了Id1转录因子。Id1是BMP信号通路中的转录因子。已知Gremlin与BMP结合，阻止其与受体结合，从而降低报告基因的荧光素酶信号。因此，使用这种报告子测试，有可能筛选抗Gremlin抗体，并看看是否有任何阻断Gremlin与BMP相互作用的抗体。如果存在这种相互作用的阻断，则可以在这些细胞中看到荧光素酶信号的恢复。
方法
克隆12细胞在含有10％FCS、1x L-谷氨酰胺和1x NEAA的DMEM中培养。细胞也在潮霉素B(200μg/ml))的存在下生长，以确保细胞不会失去Id1基因的表达。在含有0.5％FCS、1x L-谷氨酰胺和1x NEAA的DMEM中对细胞进行测试。细胞在测试中的短时间内不需要潮霉素B。
在PBS中洗涤细胞，用细胞解离缓冲液提离细胞，离心细胞并计数，然后以5x104个/孔接种在70μl(密度为7.14×105个/ml)中。所用的板是白色不透明的聚-D-赖氨酸包被的96孔无菌板。细胞在培养箱中放置大约3-4小时以稳定下来。BMP异二聚体在4mM盐酸中重构至200μg/ml。用玻璃瓶(glass vial)将BMP在测试介质中稀释至10μg/ml，得到新的工作储液。
在聚丙烯平板中，以1:2的比例稀释Gremlin-1，形成8点剂量反应曲线，最高终剂量为1μg/ml。
每孔加入20μl的额外体积的培养基，平板在37℃孵育45分钟。
将制备的100x BMP加入除仅含细胞的孔之外的所有孔中。所有的孔都用测试培养基加至60μl，并在37℃下再培养45分钟
孵育后，在测量发光信号之前，将30μl的样品转移到检测板的每个孔中并孵育20-24小时。
在室温下提前解冻Cell Steady Glo。添加该试剂前，将检测板冷却至室温约10-15分钟。荧光素酶信号是通过在室温下在摇床上加入cell steady glo试剂(100μl)20分钟并使用Synergy 2上的细胞滴定glo方案测量发光来检测的。
最大信号由含有BMP的孔产生，最小信号由仅含有细胞的孔产生。
结果
在Hek-Id1报告基因测试中测试了Gremlin-1全长和截短形式，以确认对BMP4/7的阻断活性。
基于测试中的最大和最小信号以及使用4参数对数拟合拟合的数据，计算剂量反应测试的抑制百分比。IC50是根据曲线的拐点计算的。
表3:Hek-Id1报告基因测试中全长Gremlin-1和截短Gremlin-1的效力结果。
Figure BDA0002844022100000621
Figure BDA0002844022100000631
结论
Gremlin 1能够在Hek-Id1报告基因测试中抑制BMP 4/7信号传导。
实施例4-抗Gremlin-1抗体的产生
如实施例1所述，通过使用纯化的gremlin-1进行免疫，并通过文库淘选，获得抗Gremlin-1抗体。所述文库是内部制备的，是一个未被引发的人类文库，其V区是从献血中扩增出来的。
免疫接种从第一轮免疫接种中产生了26种不同的结合Gremlin-1的抗体。这些抗体被放大和纯化，用于筛选试验中的测试。
来自文库的25种人和小鼠交叉反应性抗体使用来自R&D系统的重组人Gremlin淘选。选择10种抗体进行放大并纯化为scFv，用于筛选试验中的测试。
实施例5-抗Gremlin-1抗体的筛选
使用实施例3中描述的Hek-Id1报告基因测试并通过测量SMAD磷酸化来筛选抗体。SMAD1、5和8在BMP信号传导时被磷酸化。因此，Gremlin-1抑制剂增加SMAD磷酸化。
对A549细胞或人肺成纤维细胞进行SMAD磷酸化测定。使用MSD确定磷酸化水平。
结果
在Hek-Id1报告基因测试中，免疫接种衍生的抗体没有明显的击中(针对BMP4/7异二聚体测试10倍过量的抗体)。结果如图1所示。
相比之下，许多文库衍生的抗体能够在Hek-Id1报告基因测试中恢复信号(对50％gremlin剂量采用50倍过量的抗体)(图2)。其中，Ab2416和Ab2417含有高水平的内毒素。Ab7326在10倍过量和80％抑制Gremlin-1浓度下保持阻断能力。
其他结果如图3A(人gremlin)和3B(小鼠Gremlin)所示。这些图显示Ab7326(标记为PB376)的滴定值高达15nM。当被人(IC50为1.3nM)或小鼠(IC50为0.2nM Gremlin)阻断时，Ab7326显示出恢复BMP的信号传导。该抗体同时作为人和小鼠IgG1发挥功能。
小鼠和人全长IgG1的序列如下所示。为了合成小鼠和人全长IgG1蛋白，将来自文库的Ab7326可变区重新克隆到包含适当抗体恒定区的载体中。
因为Ab7326来自一个未被引发的人类文库，其中Ab被克隆为scFv，为了将7326的可变区重新克隆为全长抗体或Fab，有必要使用引物池/简并引物对VH和VK进行PCR扩增。然后将扩增的PCR产物消化并同时克隆到小鼠和人类载体中。当通过引物池/简并引物扩增VH和VK时，获得了产物的两种变体形式，其不同之处在于在PCR过程中由细微不同的引物退火产生的单个氨基酸残基。
如下所示，重链可变区的两种变体形式在位置6处有一个氨基酸不同，轻链可变区的两种变体形式在位置7处有一个氨基酸不同:
·重链可变区变体1在位置6处有谷氨酸(E)。
·重链可变区变体2在位置6处有谷氨酰胺(Q)。
·轻链可变区变体1在位置7处有丝氨酸(S)。
·轻链可变区变体2在位置7处有苏氨酸(T)。
小鼠全长IgG1–重链变体1(SEQ ID NO:14)
Figure BDA0002844022100000641
小鼠全长IgG1–轻链变体1(SEQ ID NO:15)
Figure BDA0002844022100000651
小鼠全长IgG1–重链变体2(SEQ ID NO:28)
Figure BDA0002844022100000652
小鼠全长IgG1–轻链变体2(SEQ ID NO:29)
Figure BDA0002844022100000653
人全长IgG1–重链变体1(SEQ ID NO:30)
Figure BDA0002844022100000654
人全长IgG1–轻链变体1(SEQ ID NO:31)
Figure BDA0002844022100000661
人全长IgG1–重链变体2(SEQ ID NO:16)
Figure BDA0002844022100000662
人全长IgG1–轻链变体2(SEQ ID NO:17)
Figure BDA0002844022100000663
使用Kabat法测定抗体CDR(在上述序列中用粗体突出显示)。使用Chothia定义的其他HCDR1残基用斜体表示。恒定区序列带下划线。
用抗Gremlin 1抗体对p-SMAD信号传导的恢复显示在下表4中。
表4:p-SMAD信号传导的恢复
Figure BDA0002844022100000664
Figure BDA0002844022100000671
结果显示为由单独BMP(对照BMP)引起的SMAD磷酸化的百分比。使用来自特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞进行实验。在室温下预孵育rhGremlin-1和抗Gremlin-1抗体45分钟。然后将rhGremlin-1和抗Gremlin-1抗体与BMP一起加入细胞中30分钟。
表5显示了SMAD磷酸化试验的进一步结果，其中研究了用抗Gremlin-1抗体对Gremlin 1-BMP复合物中的BMP-2或BMP4/7进行的置换。再次使用来自特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞进行实验。rhBMP-2或rhBMP 4/7在室温下与rhGremlin-1预孵育1小时。BMP-2-或BMP4/7-Gremlin-1复合物与不同浓度的抗Gremlin-1抗体在4℃孵育过夜。抗体浓度代表板上的最终浓度。
表5:抗Gremlin-1抗体对Gremlin 1-BMP复合物中的BMP-2或BMP4/7的置换
Figure BDA0002844022100000672
Figure BDA0002844022100000681
表5中显示的结果表明，Ab7326可以从Gremlin 1-BMP复合物中置换已经复合的BMP-2或BMP-4/7。Ab7326可以在比对照抗体2484低得多的浓度下实现这种置换。这提供了Ab7326是变构抑制剂的证据，与我们的发现一致，即Ab7326的结合位点远离gremlin-1上的已知BMP结合区。因此，即使BMP已经与gremlin-1复合，Ab7326也能够进入变构结合位点，从而显著提高对gremlin活性的抑制。
实施例6-获得Gremlin-1与7326Fab形成复合物的晶体结构
人Gremlin-1与抗体7326Fab形成复合物的晶体结构在
Figure BDA0002844022100000684
的分辨率下被解结构。Fab序列如下所示:
重链：SEQ ID NO:18
Figure BDA0002844022100000682
轻链：SEQ ID NO:19
Figure BDA0002844022100000683
然后使用CCP4软件NCONT来识别Gremlin-1和Fab之间在
Figure BDA0002844022100000691
下的所有接触。鉴定出以下残基:Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175(编号基于SEQ ID NO:1的UniProt序列(结构文件中编号为Ile110、Lys126、Lys127、Phe128、Thr129、Thr130、Arg148、Lys153和Gln154，与小鼠Gremlin-2的编号相匹配)。
图4显示了Gremlin-Fab复合物的结构模型，其中Fab表位残基相对于BMP结合区显示。
Ab7326是一种抑制性抗体，其变构地发挥作用，即它远离BMP结合区发生结合。
实施例7-抗Gremlin-1抗体Ab7326与Gremlin-1结合的亲和力测量。
方法
在GE Healthcare Bio-Sciences AB的Biacore T200系统上，通过使用表面等离子共振(SPR)技术的双分子相互作用分析来确定抗Gremlin mIgG对人Gremlin 1的亲和力。抗Gremlin mIgG由固定的抗小鼠Fc表面捕获，Gremlin 1在捕获的mIgG上滴定。
捕获配体(山羊抗小鼠IgG的亲和F(ab’)2片段，Fc片段特异性，115-006-071，Jackson ImmunoResearch Inc.)通过胺偶联化学，使用600秒的活化和失活注射，在CM4传感器芯片的流动小室2上以50μg/ml在10mM NaAc，pH 5.0中固定至约1600响应单位(RU)的水平。HBS-EP+缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20)用作流动缓冲液，流速为10μl/min。与流动小室2一样通过活化和失活表面而在流动小室1上制备参考表面，但其中省略捕获配体。
测试缓冲液为HBS-EP+加额外的150mM NaCl，最终NaCl浓度为300mM加1％CMD40。在流动小室1和2上注射60秒的抗Gremlin mIgG(在流动缓冲液中为5μg/ml)，在固定的抗小鼠IgG，Fc表面上获得约100RU的捕获水平。重组人Gremlin 1在流动缓冲液中从5nM(使用2倍稀释度)滴定，并以30μl/min的流速注射到流动小室1和2中3分钟，然后是5分钟的解离阶段。还包括一个仅缓冲液的对照。以10μl/min的流速通过60秒注射50mM HCl、30秒注射5mMNaOH和30秒注射50mM HCl来再生表面。
使用Biacore T200评估软件确定动力学数据。亲和力测量在25℃下进行。
结果
发现取为5次测定的平均KD值的结合亲和力低于100pM。
实施例8-抗Grem1抗体抑制小鼠器官样培养物
材料和方法
小鼠程序。所有程序都是根据英国内政部法规(Home Office UK regulations)和1986年动物(科学程序)法案(the Animals(Scientific Procedures)Act 1986)进行的。所有小鼠都被安置在Functional Genomics Facility,Wellcome Trust Centre for HumanGenetics,Oxford University的动物单位中。本研究中使用的所有株系都在C57Bl/6J背景上保持≥6代。以前曾报道过ApcMin(1)和Vil1-Grem1(2)、Apcfl/fl(3)和VillinCreERT2(4)小鼠的基因分型方案。为了产生Kaplan-Meier数据，当达到人道终点(表现出贫血、驼背(hunch)和不活动)时，处死小鼠。抗Grem1抗体(UCB Ab7326小鼠IgG1，也用于所有随后的小鼠实验)或小鼠IgG1对照Ab101.4抗体(UCB)以每周或每两周10mg/kg或30mg/kg的剂量皮下注射施用。对于长期治疗群，从6周龄开始，对Vil-Grem1和ApcMin小鼠每周递送30mg/kg剂量，Vil1-Grem1/ApcMin群治疗从3周龄开始，每周两次，共6周，此后每周一次。
组织准备和组织学。在预先确定的时间点或出现肠息肉症状(贫血、驼背)时，通过颈椎脱臼处死小鼠。立即取出肠道，分为小肠(近端/SB1、中间/SB2和远端/SB3)和大肠。使用肠道准备装置(5)纵向打开肠道，在PBS中洗涤，在10％中性缓冲福尔马林(NBF)中固定过夜。为了使息肉可视化，用0.2％亚甲蓝对肠道准备进行10秒钟的染色，并借助于灯箱进行观察。将10％福尔马林固定的组织标本包埋在石蜡中，然后以4μm切片。按照标准方案包埋固定标本并进行苏木精-伊红染色。
免疫组织化学。福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片(4μm)在二甲苯中去蜡，并通过分级酒精到水进行再水合。用1.6％H2O2封闭内源过氧化物酶20分钟。为了回收抗原，切片在10mmol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中压力蒸煮5分钟。切片用10％血清封闭30分钟。载玻片与一抗一起孵育2小时。本研究中使用了以下抗体；细胞角蛋白20(Abcam，ab118574，1:200)，EphB2(R和D，AF467，1:125)，Ki67(CST，122025，1:500)，溶菌酶(DAKO，EC 3.2.1.17，1:500)和Sox9(Millipore，ab5535，1:1000)。在室温下应用适当的二级抗体1小时。然后切片在ABC(Vector labs)中孵育30分钟。应用DAB溶液2-5分钟，并用显微镜监测颜色反应的显影。载玻片用苏木精复染，脱水，清除，然后固定。
原位杂交(ISH)。使用DEPC(Sigma)处理的水制备4μm切片。按照制造商的说明，使用Grem1(314741)(Advanced Cell Diagnostics)探针和RNAscope 2.5HD检测试剂盒(Advanced Cell Diagnostics)进行原位杂交。
小鼠肠隐窝培养。如Sato等人(6)所述，分离和培养小鼠肠隐窝。简而言之，将隐窝分离出来，重新悬浮在Matrigel(BD Biosciences)中，并铺在24孔板中。覆盖基础培养基(高级Dulbecco改良Eagle培养基/添加了青霉素/链霉素、10mmol/L HEPES、Glutamax、1xN2、1x B27(均来自Invitrogen)和1mmol/L N-乙酰半胱氨酸(Sigma)的F12)，其中包含以下生长因子：50ng/ml的表皮生长因子(Life Technologies)，100ng/ml的Gremlin1(R andD)，500ng/ml的R-spondin1(R and D)[EGR培养基]。使用浓度为1mg/ml的抗Grem1抗体(UCB)。每两天换一次培养基。
蛋白质印迹。结肠上皮细胞的分离是通过在4℃搅拌下用30mM EDTA孵育2cm长的组织2小时来进行的。沉淀的上皮细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，加入蛋白酶抑制剂(Complete Mini,Roche)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP,Roche)。所有裂解物均使用BCA测定(Thermo Scientific)进行定量，用适量的4x上样染料(Invitrogen)稀释35mg，并在95℃变性5分钟。根据制造商的方案，用NuPAGE凝胶系统(Invitrogen)进行蛋白质印迹。简而言之，将变性的裂解物上样到4-12％的凝胶上，并在100V下运行至少2小时。将凝胶转移到半干仪中的PVDF膜上(120mA，至少2小时)，并在室温下在含有10％乳的TBS(Marvel)中孵育1小时进行封闭。然后将膜在适当的一抗中孵育过夜，其中一抗处于含有5％乳、pSmad1/5/8(CellSignalling，9516S，1:500)、肌动蛋白(Santa Cruz，sc-47778，1:2500)的TBS中。洗涤后，膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时。进一步洗涤后，在ECL试剂(GE healthcare)中孵育印迹，并通过化学发光膜(GE healthcare)检测化学发光。
结果描述(参见图5)
小鼠器官样培养物用于评估抗GREM1抗体的效果。成功的肠上皮器官样培养物依赖于外源BMP拮抗剂的培养基补充。重组Noggin和Gremlin1可以互换使用，在没有这些蛋白质之一的情况下，肠隐窝培养物不会进展到超过培养的第4天。
大约60％的隐窝在完全添加重组表皮生长因子(E)、Grem1(G)和R-Spondin1(R)的培养基(EGR培养基)中形成器官样。在缺乏重组Grem1的培养基(ER培养基)中，培养成功率在第7天降至小于2％。
向另外完全补充的培养基中添加1mg/ml的抗Grem1抗体(EGR+抗体)阻止了成功的肠器官样培养物，这与完全补充的培养基中Grem1的BMP拮抗效果的消除一致。这些结果与排除Grem1的培养基(ER)无法区分。
实施例9-在经处理的Vil1-Grem1动物中，抗Grem1抗体处理部分恢复了肠pSMAD1、 5信号传导(也参见图6)
上皮BMP活性可以通过SMAD 1、5、8细胞内信号传导转导子的磷酸化来测量。
在Vil1-Grem1动物中，Grem1的异常上皮表达通过促进位于结肠隐窝基底之外的细胞中异常的干/祖细胞表型而引发息肉病。Vil1-Grem1小鼠从大约8周龄开始发展深度泛肠息肉病，其特征为绒毛异位隐窝形成、异常细胞增殖和绒毛发育异常的开始。
Vil1-Grem1小鼠中异常的上皮Grem1表达抑制了生理性肠BMP途径活性，伴随通过蛋白质印迹检测到的pSMAD1、5蛋白水平的降低。
以30mg/kg的剂量每周皮下施用剂量抗Grem1抗体能够在Vil1-Grem1肠上皮中恢复肠上皮pSMAD1、5信号传导，但较低剂量的10mg/kg不可以。表明Grem1的功能性拮抗作用。
实施例10-抗-Grem1抗体处理消除Vil1-Grem1泛肠息肉病表型并恢复正常细胞命 运决定(见图7和30)
对Vill-Grem1小鼠每周两次皮下施用抗Grem1抗体(30mg/kg)持续6周，也导致了这种泛肠息肉病表型的剂量依赖性和高度显著的消除，以及该动物模型特有的异常肠隐窝-绒毛结构的治疗性接近正常化。
经处理的动物的免疫组织化学染色显示逆转了未处理组织特征性的绒毛异位隐窝形成和混乱细胞命运决定(图7和30)。
实施例11-在患有Grem1引发的息肉病的动物模型中用抗Grem1抗体延长治疗是安 全的并且显著延长动物寿命(见图8和31)
每周2次(Vil1-Grem1；ApcMin)或每周一次(Vil1-Grem1)用抗Grem1抗体以30mg/kg的剂量皮下处理动物，开始于3周龄(Vil1-Grem1；ApcMin)或6周龄(Vil1-Grem1)。
在Grem1引发的肿瘤发生模型中，抗Grem1抗体的长期施用减缓了息肉的形成，减少了肿瘤负荷，并在Vil1-Grem1动物中显著延长了动物寿命。这种肿瘤消除效应在由异常上皮Grem1表达引起的损害中也是一致的，甚至在侵袭性Vil1-Grem1；ApcMin株中也是如此，其中抗体处理使动物寿命增加一倍以上(VG-min平均寿命为46天，而经处理的VG-min平均寿命为108天，p＝2.21x10-6)。
迄今为止，在处理超过400天的动物中没有观察到一致的不良事件。
实施例12-Grem1的药理学下调减弱了ApcMin小鼠中突变Apc驱动的肿瘤发生(见图 9和32)
还在由上皮Apc失活引起的散发性癌症的小鼠模型中研究了GREM1拮抗作用的效果。上皮-间充质信号传导串扰意味着基质细胞对Apc的急性上皮失活有反应，在Villin-CreeR 2；Apcfl/fl小鼠中，Apc的上皮细胞失活后仅5天，肠肌层和固有层Grem1就迅速上调(图9A)。
6周龄时开始的抗Grem1抗体长期治疗对ApcMin小鼠息肉发展具有一致的效果，其通过减少的肿瘤负荷而延长了动物的存活。这项工作表明，Grem1的基质上调可加剧突变Apc驱动的肿瘤发生，而抗Grem1治疗可有用于治疗非Grem1引发的肿瘤发生。
实施例13-Grem1在骨髓瘤骨髓微环境中过表达，并可以被靶向以减少骨髓瘤的生 长
这项研究首次证明，Grem1在多发性骨髓瘤(MM)疾病进展中起作用。对来自患者骨髓(BM)环锯活检的基质细胞的分析表明，MM期间来自BM微环境的Grem1表达显著增加。此外，本文提供的数据表明，增加的Grem1水平会促进MM PC的增殖，且Grem1可被靶向以在MM的临床前小鼠模型中显著减少MM肿瘤负荷。这是第一个证明Grem1在MM疾病进展中起作用的证据，并因此代表了MM治疗的治疗靶点。
方法
骨髓瘤细胞系的培养:除非另有说明，所有组织培养基都含有10％(v/v)FCS和添加剂(2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、15mM HEPES、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素；全部来自Sigma-Aldrich,Sydney,Australia)。小鼠5TGM1 MM细胞维持在添加了20％(v/v)FCS和添加剂的Iscove改良Eagle培养基(Iscove's Modified Eagle's Medium)中。我们之前已经用编码胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Noll等人，2014)的三联(trimodality)逆转录病毒NES-TGL构建体(Diamond等人,2009；Ponomarev等人，2004)修饰了5TGM1细胞(Dallas等人，1999)，并建立了一种表现出一致的骨向性(bone tropism)(Noll等人，2014；Noll等人，2015)的新的克隆亚系。OP9骨髓基质细胞维持在含有10％(v/v)FCS和添加剂的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)中。在添加了20％(v/v)FCS和添加剂的Iscove改良Eagle培养基中维持5TGM1细胞和OP9细胞的共培养物。人骨髓瘤细胞系RPMI-8226、U266、KMS-11和H929都在RPMI-1640培养基中培养(Cheong等人，2015)。所有细胞系都保存在37℃、含有5％二氧化碳的湿润环境中。
从鼠BM基质中分离RNA：对C57BL6/KaLwRij.Hsd小鼠注射5x105个5TGM1.Bmx1 MMPC，建立肿瘤生长超过4周(如前所述)(Noll等人，2014年；Hewett等人，2017年)。简而言之，将5TGM1细胞以每ml 5×106个细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后将5×105个细胞注射入6至8周龄的C57BL/KaLwRij小鼠的尾静脉中。在腹膜内注射(i.p.)150mg/kg的D-荧光素(Biosynth,Raad,Switzerland)后，使用Xenogen IVIS 100成像系统(Caliper LifeSciences,Hopkinton,USA)通过全动物生物发光成像(bioluminescent imaging，BLI)监测肿瘤的生长。使用活体成像软件对肿瘤负荷进行定量。根据SAHMRI伦理学SAM165，对有肿瘤负荷的小鼠和年龄匹配的非肿瘤对照组进行人道处死。分离每只小鼠的股骨和胫骨，用PBS、2％FCS和2mM EDTA(PFE)冲洗骨髓。压碎骨头，并在摇动培养箱中于37℃在3ml的3mg/ml胶原酶I中将其消化2小时。用PFE稀释悬浮液至10ml。1400g离心5min以收集细胞。用1xPFE清洗并重复离心。将细胞沉淀和骨碎片重悬在1ml TRIzol(Thermo FisherScientific Inc.,Massachusetts,USA)中，涡旋并在冰上孵育15分钟。收集TRIzol并通过氯仿/异丙醇沉淀进行RNA提取处理(如前所述)。
评估人和鼠基质中的Grem1表达:在知情同意的情况下，从阿德莱德皇家医院(Royal Adelaide Hospital)(Adelaide,Australia)随机选择的有症状MM患者和血液学正常的年龄匹配对照中收集髂嵴环钻。所有MM患者都是新诊断的，以前没有接受过治疗。本研究的伦理批准获自皇家阿德莱德医院机构伦理审查委员会(the Royal AdelaideHospital institutional ethics review committee)(伦理批准号#030206)。从每个环钻离体扩增贴壁的基质细胞，并在进一步传代后冷冻保存。基质样品从液氮储存中取出，培养24小时，然后收集在TRIzol中，用于如前所述的下游RNA提取。在使用SuperScriptIII(Thermo Fisher Scientific Inc.,Massachusetts,USA)产生cDNA之前，用RQ1脱氧核糖核酸酶(Promega，Wisconsin，USA)对RNA进行脱氧核糖核酸酶处理。使用RT2SYBR-greenmaster mix(Qiagen，Hilden，Germany)在BioRad CFX Connect上对人和鼠样品中的Grem1表达进行定量PCR分析，使用标准曲线法标准化成作为内源对照的B-肌动蛋白。使用了下列引物：
小鼠Grem1：正向5’-GCGCAAGTATCTGAAGCGAG-3’(SEQ ID NO:38)；反向5'-CGGTTGATGATAGTGCGGC-3'(SEQ ID NO:39)，
人Grem1：正向5'-AGGCCCAGCACAATGACTCAG-3'(SEQ ID NO:40)；反向5'-GTCTCGCTTCAGGTATTTGCG-3'(SEQ ID NO:41)；
B-肌动蛋白：正向5’-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’(SEQ ID NO:42)；
反向5'-GTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'(SEQ ID NO:43).
鼠基质Grem1过表达细胞系的产生：从胃肠癌生物学组SAHMRI友好提供的pCMV6-KR载体中分离出鼠Grem1的cDNA。通过EcoR1和Not1限制性酶消化切除小鼠Grem1序列，并将其克隆到pLeGoiT2载体中。在慢病毒感染OP9-GFP+细胞后，用FACS分选GFP和TdTomato阳性细胞。通过定量PCR和蛋白质印迹证实转基因表达。
MM PC和BM基质共培养：OP9基质细胞分别以[细胞密度]接种在6cm TC培养皿和24孔板中，并允许贴附5小时。以1×105个细胞/ml悬浮5TGM1 MM PC，并将其加入基质细胞培养物中。共培养开始后24、48和72小时收集基质细胞。对于接触式共培养，通过FACS从GFP阴性的5TGM1-亲代MM PC中分离GFP+OP9细胞，以获得纯基质群体用于分析。对于非接触式共培养，在共培养期间，使用4μm跨孔将5TGM1.Bmx1 PC与OP9细胞分开。将人MM细胞系RPMI-8226、U266、KMS-11和H929的每个与从造血健康个体分离的3个原代人BM基质细胞样品培养72小时。用1xPBS从贴壁的基质中彻底清洗人MM细胞系两次。在TRIzol中裂解基质细胞，并通过氯仿/异丙醇分离对其进行处理。在用SuperScriptIII(Invitrogen)产生cDNA之前，用RQ1脱氧核糖核酸酶对RNA进行脱氧核糖核酸酶处理。通过使用前述引物序列的定量PCR评估Grem1表达。
荧光素酶扩增试验:将Grem1过表达和仅含载体的OP9基质细胞接种到24孔板中，每孔含5x10^4个细胞，并让其贴附过夜。第二天将5TGM1.Bmx1 MM PC接种到两种基质细胞群体上并培养72小时。孵育后，通过剧烈移液将每个孔的全部内容物转移到相应的微量离心管中。通过在4℃下以2000g离心5分钟来收集细胞。用PBS洗涤细胞一次。在1x细胞裂解缓冲液(供应商名称)中裂解每个孔的细胞沉淀。将20μl细胞裂解物转移到96孔板中。在读取板之前，立即向细胞裂解物中加入100μl荧光素酶反应缓冲液(5mM MgCl2、30mM HEPES、150μM ATP、250μM辅酶A和150μg/mL D-荧光素)。使用Wallac 1420Victor微孔板读数器(Perkin Elmer,Massachusetts,USA)测量生物发光，光强度用作MM PC数的正相关性。
在系统性MM免疫活性小鼠模型中靶向Grem1：对C57BL/KaLwRij小鼠(6-8周龄)通过尾静脉注射接种5x105个5TGM1.Bmx1细胞。接种5TGM1.Bmx1 MM PC后3天，对KaLwRij小鼠通过皮下(s.c.)注射施用30mg/kg的Grem1中和抗体Ab7326或IgG对照Ab101.4(UCB-Pharma，UK)。在4周模型期间，每3天对小鼠进行一次处理。如前所述，通过BLI每周监测肿瘤负荷。实验结束时，通过尾部放血收集血液，以2100g离心10分钟，并收集血清。按照制造商的说明，使用Hydragel 30β1β2试剂盒(Sebia Electrophoresis,Georgia,USA)分析血清副蛋白水平。相对于血清白蛋白水平定量对应于副蛋白的条带。(SAHMRI动物伦理SAM165)
统计:数值数据以平均值±平均值标准误(S.E.M.)表示。通过Student t检验分析代表两种测试条件的数据。通过单向方差分析(ANOVA)分析具有两个以上测试条件的数据，随后通过Tukey多重比较事后检验来确定差异的统计显著性。所有的统计分析都是使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software,Inc,San Diego,CA)进行的。所有实验一式三份进行。
结果描述
Grem1表达在MM骨髓基质中上调
在从健康和MM患者来源的BM基质中获得的mRNA样本中分析了Grem1的表达。与来自年龄匹配的造血正常供体的BM基质(n＝17)相比，MM患者BM基质(n＝15)的Grem1表达显著较高(p<0.001)(图10)。也在5TGM1/KaLwRij.Hsd小鼠模型中进行了Grem1表达的研究。从健康和携带MM肿瘤的C57BL/KaLwRij.Hsd小鼠中分离出密质骨并分析Grem1表达的差异。与健康对照组相比，来自荷瘤小鼠的BM基质的Grem1表达没有显著增加，但是观察到Grem1表达增加的趋势(图11A)。重要的是，通过生物发光成像测定，肿瘤负荷最大的小鼠表现出最高的Grem1表达(图11B)。这一结果表明，响应于MM肿瘤生长的Grem1增加支持了在人类情形中的这一发现。
MM细胞促进BM基质中Grem1表达增加
利用鼠MM细胞系5TGM1.Bmx1和BM衍生的基质细胞系OP9进行共培养实验，以确定MM PC在BM微环境中对Grem1表达的影响。共培养72小时后，在MM PC存在下培养的BM基质细胞中的Grem1表达明显高于不与MM PC系接触的BM基质细胞中的Grem1表达(p<0.05)(图12a)。在共培养的较早时间点24小时和48小时并未显示基质Grem1表达的显著变化(图12a)。共培养在跨孔和细胞接触条件下进行，然而只有细胞接触共培养显示出基质Grem1表达的变化(图12b)。来源于造血正常个体的原代人骨髓基质细胞也与人MM细胞系KMS-11、RPMI.8226、H929和U266一起培养。KMS-11和U266细胞系在共培养72小时后显示出诱导BM基质中Grem1表达增加的能力，而与细胞系RPMI.8226和H929的共培养没有导致基质中Grem1表达的变化(图13)。
Grem1表达增加促进MM PC增殖
为了进一步研究Grem1在MM环境中的重要性，产生了过表达Grem1的基质细胞，并将其与5TGM1 MM PC共培养。在跨孔和细胞接触培养条件下，当与过表达Gremlin1的基质细胞共培养时，MM PC的增殖显著增加(图14)(分别为p<0.01和p<0.001)。与过表达Grem-1的BM基质共培养的MM PC随后显示出BMP信号传导途径激活的减少，如Smads-1/5/9磷酸化减少所表明的(图16)。众所周知，BMP途径抑制MM PC增殖并促进细胞凋亡，代表观察到的MMPC增殖减少的一种潜在机制(Hjertner等人，2001；Holien等人，2012)。
靶向Grem1降低体内MM肿瘤负荷
为了检验Gremlin1在体内MM肿瘤形成和生长中的重要性，我们使用了5TGM1/KaLwRij小鼠MM模型。在疾病开始后，小鼠被随机分配(n＝13/处理组)接受Gremlin1中和抗体(Ab7326，UCB-CellTech，UK)或IgG对照的处理，并通过生物发光成像在四周内每周监测疾病负荷。这些研究表明，用抗Gremlin1治疗显著降低了体内MM肿瘤负荷(图15)(双向方差分析，p＝0.0056)。疾病负荷的SPEP分析证明了可比较的结果，与对照处理的小鼠相比，用抗-Grem1抗体处理的小鼠相对于血清白蛋白具有显著较低的M-峰强度。
讨论
MM患者BM基质中Grem1增加的发现与先前报道的微环境细胞群产生的Grem1增加的研究一致。此外，在患有MM样肿瘤的小鼠骨骼中，观察到Grem1表达增加的趋势。当利用用于体内模型的细胞系进行进一步的研究时，表明直接在来源于BM的基质细胞系上培养小鼠MM PC系时，基质中的Grem1表达有后续增加。当MM PC不能与基质细胞直接细胞接触时，这一发现没有再现，但是观察到表达增加的趋势。这表明基质中导致Grem1表达增加的MM细胞衍生因子主要依赖于细胞接触。在与正常人基质一起培养的四种人MM细胞系中的两种中也观察到了这种现象。MM细胞系KMS-11和U266能够诱导Grem1表达增加，但RPMI.8226和H929细胞系不能。一些人类MM细胞系具有诱导Grem1表达变化的能力，但其他细胞系没有，这可能表明这些细胞系之间负责Grem1调节的关键因子的表达存在根本差异，初步研究表明白细胞介素-6(IL-6)在MM中有调节Grem1的作用(图17)。还需要进一步的研究来确定细胞系诱导基质Grem1表达的能力是否与其对Grem1的增殖响应相关。
为了检测Grem1在MM中的作用，产生过表达Grem1的BM基质细胞，并将其与MM PC共培养，以部分复制肿瘤微环境和肿瘤细胞之间的串扰。MM PC在与过表达Grem1的基质细胞的共培养中显示出显著的增殖增加。观察到BMP信号传导下游激活的减少，如响应于Grem1增加而发生的Smads 1、5和9的磷酸化减少所指示的(图16)。
由于Grem1在MM中显示出明显的促有丝分裂作用，我们研究了治疗性靶向Grem1是否代表了一种治疗选择。在MM的5TGM1/KaLwRij小鼠模型中使用Grem1中和抗体Ab7326显示了MM肿瘤负荷减少了近50％。由于5TGM1 MM PC不表达Grem1，这种效应可以归因于纯粹靶向微环境的结果。
总之，这项研究表明，Grem1代表了MM中的治疗靶点。
实施例14-在MM小鼠模型中对Grem1进行预处理
介绍
在对小鼠接种多发性骨髓瘤(MM)肿瘤3天后应用Grem1中和抗体导致肿瘤负荷减少约50％。这确立了Grem1在MM疾病进展中的明确作用，然而，Grem1是否在MM疾病发生中起作用仍有待确定。为了解决这个问题，在接种肿瘤前，将Grem1中和抗体施用于5TGM1/KaLwRij小鼠模型。
方法
在全身性MM免疫活性鼠模型中，在接种肿瘤细胞前靶向Grem1:在接种肿瘤前三天和一天，通过皮下(s.c.)注射给C57BL/KaLwRij小鼠(6-8周龄)施用两剂30mg/kg的Grem1中和抗体Ab7326或IgG对照Ab101.4(UCB-Pharma,UK)。在第0天，通过尾静脉注射对小鼠接种5x105个5TGM1.Bmx1细胞。在4周模型期间，每3天通过皮下注射使小鼠继续接受30mg/kg的Grem1中和抗体Ab7326或IgG对照Ab101.4UCB-Pharma,UK)。如前所述，通过BLI每周监测肿瘤负荷。实验结束时，通过尾部放血收集血液，以2100g离心10分钟，并收集血清。根据制造商的说明，使用Hydragel 30β1β2试剂盒(Sebia Electrophoresis,Georgia,USA)分析血清副蛋白水平。将对应于副蛋白的条带相对于血清白蛋白水平进行定量。(SAHMRI AnimalEthics SAM165)
结果/讨论
我们以前的数据表明，在5TGM1/KaLwRij小鼠骨髓瘤模型中，可以靶向Grem1以减少MM肿瘤负荷。这表明Grem1是导致疾病进展的关键微环境因素，并可被治疗性靶向。然而，目前尚不清楚Grem1是否也在MM疾病的发生中起作用。为了解决这个问题，在接种MM肿瘤细胞之前，小鼠接受了Grem1中和抗体处理，或IgG对照。如图18所示，观察到接种肿瘤细胞后4周，肿瘤负荷减少了约75％。
与接种肿瘤细胞后进行处理相比，在施用MM肿瘤细胞前阻断Grem1显示了在研究结束时总肿瘤负荷额外减少了25％。在肿瘤模型开始前施用时Grem1中和抗体的效力增加表明了Grem1在MM疾病开始中的作用。
实施例15–Grem1诱导的乳腺癌细胞增殖和用抗Grem1抗体拮抗Grem 1效应
材料和方法
实时聚合酶链式反应(RT-PCR)
将人MDA-MB-231-TXSA乳腺癌细胞和人MF9乳腺成纤维细胞接种到6孔板中，并在常氧或低氧条件下培养48小时。常氧条件维持在37℃，5％CO2、20％O2，而低氧条件维持在5％O2、10％CO2的低氧体外室中(Coy Laboratory Products，Grass Lake,MI,USA)。用TRIzol(Life Technologies,Calsbad,CA,USA)提取总的RNA。用脱氧核糖核酸酶I(Promega,Madison,WI,USA)去除基因组DNA污染后，用superscript IV(Invitrogen,Carlsbad,CA)合成cDNA。使用SYBR Green Fluor qPCR master mix(Qiagen)在Biorad CFXConnect上通过RT-PCR对1μg的每种RNA反转录，并将Grem1基因表达进行定量。一式三份进行实验，应用2-ΔCT方法使基因表达针对β-肌动蛋白标准化。数据显示为相对于正常氧对照的倍数变化。
引物对:
人Grem1:
5'-AGGCCCAGCACAATGACTCAG-3'(正向)(SEQ ID NO:40),
5'-GTCTCGCTTCAGGTATTTGCG-3'(反向)(SEQ ID NO:41)；
β-肌动蛋白:
5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'(正向)(SEQ ID NO:42),
5'-GTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'(反向)(SEQ ID NO:43).
缺氧时的增殖试验
将表达荧光素酶的MDA-MB-231-TXSA细胞接种在96孔微量滴定板(1×104个细胞/孔)中。在常氧或低氧条件下培养细胞，并允许其贴附过夜。然后在用浓度增加的rhGrem1蛋白(0-1000ng/ml)处理前，将细胞血清饥饿6小时。在24和48小时时间点，评估荧光素酶表达并用作细胞数量的替代测量。简而言之，在1xPBS中洗涤细胞，随后在细胞培养裂解缓冲液(Promega)中裂解细胞。将荧光素酶测定试剂(5mM MgCl2、30mM HEPES、150μM ATP、50mg/mL辅酶A和150μg/mL D-荧光素(Biosynth AG，Staad，Switzerland)添加到细胞裂解物中，并立即使用光度计平板读数器(Wallac 3000)对发光进行定量。
跨孔共培养增殖试验
将表达荧光素酶的鼠4T1乳腺癌细胞(1×104个细胞)接种到24孔板的3μm聚碳酸酯膜跨孔(Costar,Washington,D.C.,USA)中。过夜培养后，使4T1细胞在无血清DMEM中饥饿6小时以同步细胞生长。在10％FCS DMEM中，将之前用对照或表达Grem1的pLEGOiT2构建体转导的GFP+鼠基质OP9细胞接种到下腔室(2x104个细胞)中。在通过荧光素酶表达分析4T1细胞增殖之前将细胞共培养72小时。
蛋白质印迹分析
将鼠4T1 BrCa细胞接种到6孔板中，培养至80％汇合。使细胞在无血清培养基中饥饿过夜，然后用指定的处理刺激2小时。制备细胞裂解物，在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上分离等量的蛋白质(50μg)，并转移到硝酸纤维素膜上。用磷酸-Smad1/5/9抗体进行免疫印迹(cell signalling technologies，1:1000稀释)。通过用抗β-肌动蛋白抗体(Sigma Aldrich,1:2500稀释)印迹膜来证实蛋白质样品的相等上样。使用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Bioscience,Lincoln,NE,USA)对蛋白质进行可视化。
结果和讨论:
我们发现Grem1在低氧条件下诱导人乳腺癌细胞增殖。虽然Grem1促进乳腺癌增殖的机制尚不清楚，但BMP的表达已被证明在低氧条件下在其他几种细胞类型中升高。因此，Grem1可能通过抑制BMP的抗增殖作用来诱导低氧条件下的增殖。在常氧(20％O2)或低氧(5％O2)条件下培养人MDA-MB-231-TXSA乳腺癌细胞和人MF9乳腺成纤维细胞48小时。通过RT-PCR定量Grem1 mRNA显示，与常氧对照相比，在低氧条件下，在MDA-MB-231-TXSA细胞(p＝0.0024)和MF9细胞(p＝0.034)中Grem1的表达均升高(图19)。
当在低氧条件下培养时，与常氧条件相比，rhGrem1刺激MDA-MB-231-TXSA增殖的剂量依赖性增加，分别在24小时和48小时后最大增加1.5倍(p<0.005)和1.7倍(p<0.0005)(图20)。
为了进一步研究Grem1是否在其他基质因子的情况下诱导乳腺癌细胞增殖，将鼠4T1乳腺癌细胞与表达Grem1或对照载体的基质OP9细胞共培养。培养72小时后，基质细胞来源的Grem1显著增加乳腺癌细胞增殖1.8倍(p<0.0005)(图21)。这进一步表明，Grem1可能通过拮抗基质来源的BMP来诱导增殖。
由于Grem1是一种已知的BMP-2/4/7拮抗剂，我们通过蛋白质印迹分析评估了UCB抗体Ab7326抑制Grem1诱导的Smad1/5/9磷酸化抑制的能力。小鼠4T1乳腺癌细胞暴露于10ng/ml的导致Smad1/5/9磷酸化的BMP2。与100ng/ml rhGrem1共孵育抑制这种BMP2介导的Smad1/5/9磷酸化。值得注意的是，与暴露于与同种型对照预孵育的rhGrem1的4T1细胞相比，rhGrem1与Ab7326预孵育部分恢复了4T1细胞中的Smad1/5/9磷酸化(图22)。这些结果证实Ab7326可以有效地靶向和中和Grem1的作用。
实施例16–单一疗法和联合疗法在VG/Min小鼠中的效果
小鼠在35日龄或从35日龄起(这在Vil1-Grem1/ApcMin疾病进程中是非常晚的)接受每周30mg/kg的抗Grem1抗体和/或每天两次40mg/kg的5-氟尿嘧啶(5FU，Sigma)腹腔注射治疗。为了产生Kaplan-Meier数据，当达到人道终点(小鼠表现出贫血、驼背和不活动)时处死小鼠。
在疾病的此晚期阶段用5FU或抗Grem1进行单一治疗对小鼠的寿命没有影响，但联合治疗显著延长了小鼠的寿命(中位生存:无治疗45天(n＝9)，5FU单独47天(n＝4)，抗Grem1单独49.5天(n＝6)，联合治疗76.5天(n＝6):对数秩p<0.01)，见图23。这些数据显示了使用抗Grem1抗体和靶向针对增殖上皮的标准化疗一起的联合治疗在晚期既定疾病中的疗效。
实施例17–人类患者衍生的异种移植物(PDX)模型中抗Grem1抗体的效果
抗gremlin-1Ab7326作为小鼠IgG1的功效将在八个患者衍生的异种移植物(PDX)模型中进行测试。人类PDX模型的选择是基于其GREM1基因产物相对于对照组织的表达增加。选择的模型包括来源于胰腺癌、肺癌、肾癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌和肝癌的异种移植物。将每周皮下注射Ab7326。将在整个模型期间评估肿瘤大小，并在实验结束时收集和分析肿瘤和血浆样本。
实施例18——抗Grem1抗体对C57Bl6/KaLwRij小鼠中肿瘤负荷的影响(图33)
观察到当对小鼠用Grem1中和抗体Ab7326治疗时，C57Bl6/KaLwRij小鼠后肢骨骼中的肿瘤负荷显著降低(见图33)。与IgG对照相比，在接种肿瘤细胞后施用抗-Grem1抗体时，肿瘤负荷显著降低(由BLI测量)(图33A)。同样与IgG对照相比，当在接种肿瘤细胞之前施用抗-Grem1抗体时，肿瘤负荷也显著降低(由BLI测量)(图33B)。在(图33C)接种肿瘤细胞后组和(图33D)接种肿瘤细胞前组中，在用抗Grem1抗体治疗的组中也观察到脾脏肿瘤负荷呈下降趋势。
C57Bl6/KaLwRij小鼠是多发性骨髓瘤(MM)的模型，其中MM细胞在骨髓(BM)和脾脏中生长。图33中的数据表明，抗Grem1治疗靶向BM相关肿瘤以及脾脏中的MM细胞。因此，抗Grem1治疗可用于治疗骨驻留肿瘤如骨肉瘤，以及分散性癌症如肝癌、乳腺癌和/或前列腺癌。
实施例19-用抗-Grem1抗体对已建立的Vil1-Grem1和ApcMin息肉病进行晚期治疗 减缓了疾病进展并恢复Vil1-Grem1小鼠肠道表型(图34)
对于ApcMin小鼠从4月龄时开始、对于Vil1-Grem1小鼠从5月龄时开始，以每周皮下注射30mg/kg的剂量施用抗Grem1抗体(UCB)或对照抗体(UCB)。
在开始抗体治疗之前，对小鼠进行老化，使其发展肠息肉病(ApcMin小鼠在4月龄时，Vil1-Grem1小鼠为5月龄时)。为了产生Kaplan-Meier数据，当达到人道终点(小鼠表现出贫血、驼背和不活动)时处死小鼠。在Vil1-Grem1(A)和ApcMin(B)模型中，用抗Grem1抗体治疗显著延长了小鼠的寿命。定时处死显示经过4周的治疗Vil1-Grem1肠表型逆转。
实施例20-抗-Grem1抗体处理保护Vil1-Grem1小鼠免受AOM诱变(图35)
Vill-Grem1小鼠中上皮Grem1的异常表达促进了上皮干细胞/祖细胞表型(Davis等人，2015)，我们假设这些细胞易受体细胞突变的影响。我们使用氮氧甲烷(AOM)施用来检测对未处理的Vil1-Grem1和抗Grem1处理的Vil1Grem1小鼠的诱变效应。AOM是一种有据可查的诱变剂，广泛用于鼠模型中，以重现自发性CRC致癌作用(Neufert和Neurath，2007)。为了产生Kaplan-Meier数据，当达到人道终点(小鼠表现出贫血、驼背和不活动)时处死小鼠。
小鼠每周接受三次皮下注射剂量为30mg/kg的抗Grem1抗体，随后每周接受三次腹腔注射剂量为10mg/kg的偶氮甲烷(AOM，Sigma)或运载体(生理盐水)，然后再接受三周的每周30mg/kg的抗Grem1抗体处理。处理在90日龄或从90日龄开始，这在Vil1-Grem1疾病进程中是足够晚的，以确保祖细胞群的扩增和随后异位隐窝病灶的形成。
AOM施用显著增强了未处理的Vil1-Grem1小鼠的息肉形成。在AOM处理的动物中结肠息肉负荷显著增加(图35B)。这对小鼠存活有负面影响(图35A):比较VG+无处理组和VG+AOM+无处理组。通过在诱变处理期间施用抗Grem1抗体部分消除了AOM处理的动物的肿瘤负荷增加和存活降低:比较VG+AOM+无处理组与VG+AOM+αGrem1组。这些数据表明，Vil1-Grem1小鼠中抗Grem1抗体对细胞命运决定的正常化阻止了上皮干细胞/祖细胞的增殖，并保护上皮免受AOM诱变损伤。
实施例21-Foxl1、Wnt5A和Wnt 2B表达在Vil1-Grem1基质中上调，并且这种表型通 过抗Grem1抗体处理而被消除(图36-38)
为了研究在经抗体处理和未经处理的Vil1-Grem1小鼠(n＝4)的绒毛异位隐窝中Wnt配体表达的来源，我们使用Foxl1原位杂交(ISH)来鉴定亚上皮telocyte细胞，如Shoshkes-Carmel等人所述(2018)。使用HALO图像分析软件定量Foxl1表达水平。未处理的Vill1-Grem1小鼠中绒毛基质Foxl1表达显著增加(p＝0.0037)(图36和图38C)。用抗Grem1抗体处理恢复了Foxl1表达水平(p值WT对比抗体处理的Vil1-Grem1小鼠(p＝0.4864)，表明基质重塑和Foxl1细胞募集是上皮Grem1依赖性的。
为了确定Foxl1+细胞产生哪些调节子(mediator)，使用多重ISH来证明绒毛上皮下成纤维细胞中Foxl1和Wnt5A联合表达(见图37)。染色标记出细的带长突起的结构，类似于Shoshkes-Carmel等人(2018)描述的telocyte。
Vil1-Grem1模型中的上皮Grem1表达导致绒毛基质细胞群活化，其随后表达Wnt配体5A和2B。用抗Grem1抗体治疗可防止基质细胞活化并消除Wnt配体表达(图38A和38B)，表明基质重塑是上皮Grem1依赖性的。
方法
原位杂交法
使用DEPC(Sigma)处理的H2O进行石蜡切片(厚度＝0.4μm)，切片在60℃烘烤2小时。将组织去石蜡并在室温(RT)下用RNAscope过氧化氢(ACD 322335)处理10分钟。在100℃下，使用RNAscope 1X Target Retrieval Reagents试剂(1:10ACD 322000)进行抗原修复15分钟。使用HybEZ杂交系统(ACD)在40℃下用RNAscope蛋白酶Plus(ACD 322331)处理样品30分钟。探针在40℃孵育2小时。使用的探针如下:LGR4(ACD 318321)、LGR5(ACD 312171)、FZD5(ACD 404911)、FZD7(ACD 534101)、WNT2B(ACD 405031)、WNT5A(ACD 316791)、WNT5A-C3(ACD 316791-C3)和FOXL1(ACD 407401)。载玻片用苏木精(棕色)或DAPI(荧光)进行复染。
ISH定量
使用Aperio CS2数字病理扫描仪(Leica Biosystems)以20倍的放大率扫描载玻片。用Aperio ImageScope病理切片观察软件(magnification)对每只小鼠100个绒毛进行注释。使用HALO图像分析平台(PerkinElmer)对Foxl1表达水平进行定量，并表示为每个区域的DAB染色百分比。使用双向方差分析和应用Bonferroni校正的多重比较来比较不同条件下的DAB水平。p值<0.05时，认为差异是显著的。使用统计软件R进行分析。
实施例22-抗-Grem1抗体在Vil1-Grem1；ApcMin处理的小鼠中显示剂量反应关系 (图39)
抗Grem1抗体(UCB)或对照抗体(UCB)以15、30和60mg/kg的可变剂量每周皮下注射，每周两次持续6周，此后每周一次，从Vil1-Grem1；ApcMin小鼠的第21天开始。为了生成Kaplan-Meier数据(如图39所示)，当达到人道终点(小鼠表现出贫血、驼背和不活动)时，处死小鼠。抗Grem1治疗以剂量依赖的方式延长了小鼠的寿命，从每周剂量>30mg/kg起没有额外的存活益处。
实施例23-在Vil1-Grem1小鼠和ApcMin小鼠中用抗Grem1抗体进行早期和晚期治疗 的比较(图40)
从42日龄开始(早期治疗)或肠息肉病发展后120天开始(晚期治疗)，以30mg/kg的剂量对Vill-Grem1小鼠(图40A)和ApcMin小鼠(图40B)每周皮下注射，施用抗Grem1抗体(UCB)或对照抗体(UCB)。
为了产生Kaplan-Meier数据，当达到人道终点(小鼠表现出贫血、驼背和不活动)时处死小鼠。在这两个时间点开始的抗Grem1抗体治疗显著延长了小鼠的寿命。具体来说，对于Vil1-Grem1小鼠(图40A)，运载体组的中位生存(242天(n＝13))通过抗Grem1抗体治疗显著增加:晚期治疗:519天；早期治疗:540天。在ApcMin小鼠中(图40B)，由于用抗Grem1抗体治疗，运载体处理组的中位生存从192天显著延长至261天(晚期治疗)和424.5天(早期治疗)。
实施例24–在乳腺癌临床前模型中，使用Grem1中和抗体显著减少了骨和肺中乳腺 癌肿瘤的生长(图41-45)
使用新型抗Grem1中和单克隆抗体，使用两种临床相关的乳腺癌临床前小鼠模型，研究了Grem1在乳腺癌的建立和进展中的体内作用。
方法
细胞培养
PyMT-B01小鼠来源的乳腺癌细胞由Sheila Stewart教授(St Louis,MO,USA)惠赠，人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231由Toshiyuki Yoneda博士(之前在University of TexasHealth Sciences Centre,San Antonio,TX)惠赠。两种细胞系都表达由SFG-NES-TGL载体的逆转录病毒表达产生的荧光素酶(Ponomarev,V.等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004。31(5):p.740-51)。癌细胞在37℃，5％CO2的湿润环境下，在Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM，Life Technologies,Australia)中培养，培养基中添加10％胎牛血清(FBS，Life Technologies,Australia)、100IU/mL青霉素(Life Technologies,Australia)、100μg/mL链霉素(Life Technologies,Australia)和25mM HEPES(Life Technologies,Australia)。
动物
动物研究按照Animal Ethics Committee of the South Australian Healthand Medical Research Institute(SAHMRI)批准的动物规程程序进行，伦理编号为SAM373，并符合“Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals forScientific Purposes”中所制定的指南。
乳腺癌临床前模型中的Grem1抗体治疗
PyMT-B01:在接种肿瘤细胞前的那周，对5周龄的C57BL6免疫活性小鼠皮下(s.c)施用两次30mg/kg剂量的抗Grem1抗体Ab7326或IgG对照Ab101.4。经尾动脉全身注射1×105个表达荧光素酶的PyMT-B01小鼠乳腺癌细胞。
MDA-MB-231:在接种肿瘤细胞前的那周，对5周龄的NOD/SciD/γ(NSG)免疫缺陷小鼠皮下注射两次30mg/kg剂量的抗Grem1抗体UCB6114或IgG对照AbA33。经尾动脉全身注射1×105个表达荧光素酶的MDA-MB-231人乳腺癌细胞。
在研究期间，治疗持续每周两次。以每周的间隔，对小鼠腹腔注射(i.p.)施用150mg/kg的荧光素，并使用Xenogen IVIS生物发光成像系统进行成像，使用活体成像软件对肿瘤负荷进行定量。根据动物伦理要求，研究分别在PyMT-B01和MDA-MB-231模型的注射肿瘤细胞后第13天和第22天结束。在处死动物后解剖器官，并对其进行离体BLI成像以分析肿瘤转移。
结果
在研究结束时，当通过尾动脉注射肿瘤时，与用同种型对照Ab101.4处理的小鼠相比，用Grem1中和抗体Ab7326处理的携带PyMT-B01肿瘤的小鼠显示总肿瘤负荷减少了35％(图41)。这种BLI信号主要集中在后肢，表明该模型涉及广泛的骨肿瘤。与同种型对照相比，在用Grem1中和抗体处理的小鼠中也观察到肺转移肿瘤负荷的统计学显著减少(图42A)。在用Grem1中和抗体处理的携带PyMT-B01肿瘤的小鼠中也观察到肝转移肿瘤负荷呈下降趋势(图42B)。
在第二项研究结束时(第22天)，与用AbA33处理的对照组相比，在Grem1中和抗体(UCB6114)处理组中，携带MDA-MB-231肿瘤的NSG小鼠的平均肿瘤负荷更低(图43)。
我们还观察到，在用抗Grem1抗体(UCB6114)处理的小鼠中，肺转移的平均肿瘤负荷减少(图45)。这些结果表明，用Grem1中和抗体靶向Grem1显著减少了乳腺癌肿瘤在骨和肺中的生长。这些研究支持了抗Grem1治疗可能代表转移性乳腺癌的一项合适治疗选择的假设。总之，本发明人首次提供证据证明了体内用Grem1中和抗体靶向Grem1代表了减少乳腺癌骨和肺转移性肿瘤生长的一种有效治疗策略。
实施例25-在前列腺癌的临床前模型中，使用Grem1中和抗体减少了前列腺癌肿瘤 的生长(图46和47)
使用新型抗Grem1中和单克隆抗体(UCB6114)，研究了Grem1在前列腺癌临床前小鼠模型中对前列腺癌的建立和发展的体内作用。
方法
细胞培养
从ATCC(Manassas,VA,USA)获得PC-3人前列腺癌细胞系。该细胞系表达由SFG-NES-TGL载体的逆转录病毒表达产生的荧光素酶(Ponomarev,V.等人，2004)。癌细胞在37℃、5％CO2的湿润环境下，在补充有10％胎牛血清(FBS，Life Technologies，Australia)、100IU/mL青霉素(Life Technologies，Australia)、100μg/mL链霉素(Life Technologies，Australia)和25mM HEPES(Life Technologies，Australia)的RPMI1640(LifeTechnologies，Australia)中培养。
动物
动物研究按照the Animal Ethics Committee of the South AustralianHealth and Medical Research Institute(SAHMRI)批准的动物规程程序进行，伦理编号为SAM373，并符合“Australian Code of Practice for the Care and Use of Animalsfor Scientific Purposes”所制定的指南。
前列腺癌临床前模型中的Grem1抗体治疗
在接种肿瘤细胞前的那周，对5周龄的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)免疫缺陷小鼠皮下注射(s.c.)施用两次30mg/kg剂量的抗Grem1抗体(UCB6114)或IgG对照AbA33。经尾动脉(CA)全身注射5×105个表达荧光素酶的PC-3小鼠前列腺癌细胞。
在研究期间，抗体治疗持续每周两次。以每周的间隔对小鼠腹腔注射(i.p.)施用150mg/k g的荧光素，并使用Xenogen IVIS生物发光成像系统进行成像，使用活体成像软件(PerkinElmer,MA,USA)对肿瘤负荷进行定量。在每项研究结束时，处死动物后解剖器官，并对其进行离体BLI成像以分析肿瘤转移。
结果
除了BLI提供的骨骼肿瘤负荷的证据之外，PC-3前列腺癌模型从第7天起显示出显著的肝脏肿瘤负荷(前列腺癌转移的另一个常见部位)。与用同种型对照抗体(AbA33)处理的小鼠相比，在用Grem1中和抗体(UCB6114)处理的小鼠中观察到全动物(图46A)和肝脏(图46B)肿瘤负荷显著降低。对用Grem1中和抗体处理的小鼠也观察到后肢(图46C)和肺部(图46D)肿瘤负荷呈下降趋势。
序列表
SEQ ID NO:1(人Gremlin-1；Uniprot ID:O60565)
MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:2(带有N末端标签的结晶学中使用的人截短型Gremlin-1)MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:3(Ab7326 HCDR1，结合Kabat和Chothia)
GYTFTDYYMH
SEQ ID NO:4(Ab7326 HCDR1 Kabat)
DYYMH
SEQ ID NO:5(Ab7326 HCDR2 Kabat)
LVDPEDGETIYAEKFQG
SEQ ID NO:6(Ab7326 HCDR3 Kabat)
DARGSGSYYPNHFDY
SEQ ID NO:7(Ab7326 LCDR1 Kabat)
KSSQSVLYSSNNKNYLA
SEQ ID NO:8(Ab7326 LCDR2 Kabat)
WASTRES
SEQ ID NO:9(Ab7326 LCDR3 Kabat)
QQYYDTPT
SEQ ID NO:10(Ab7326重链可变区变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:11(Ab7326轻链可变区变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:12(Ab7326重链可变区变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:13(Ab7326轻链可变区变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:14(小鼠全长IgG1重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:15(小鼠全长IgG1轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:16(人全长IgG1重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17(人全长IgG1轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:18(Fab重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO:19(Fab轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:20(不带有N末端标签的用于结晶学的人截短型Gremlin-1)
AMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:21(SEQ ID NO:1的成熟Gremlin-1序列，缺少氨基酸1-21的信号肽)
KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
SEQ ID NO:22(人IgG4P重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:23(人IgG4P轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:24(人IgG1重链DNA变体1)
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttcccgctcgctccatcatcgaagtctaccagcggaggcactgcggctctcggttgcctcgtgaaggactacttcccggagccggtgaccgtgtcgtggaacagcggagccctgaccagcggggtgcacacctttccggccgtcttgcagtcaagcggcctttactccctgtcatcagtggtgactgtcccgtccagctcattgggaacccaaacctacatctgcaatgtgaatcacaaacctagcaacaccaaggttgacaagaaagtcgagcccaaatcgtgtgacaagactcacacttgtccgccgtgcccggcacccgaactgctgggaggtcccagcgtctttctgttccctccaaagccgaaagacacgctgatgatctcccgcaccccggaggtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcacatgaggacccagaggtgaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaagtccacaatgccaaaactaagcccagagaagaacagtacaattcgacctaccgcgtcgtgtccgtgctcacggtgttgcatcaggattggctgaacgggaaggaatacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgccggcaccgatcgagaaaactatctccaaagcgaagggacagcctagggaacctcaagtctacacgctgccaccatcacgggatgaactgactaagaatcaagtctcactgacttgtctggtgaaggggttttaccctagcgacattgccgtggagtgggaatccaacggccagccagagaacaactacaagactacccctccagtgctcgactcggatggatcgttcttcctttactcgaagctcaccgtggataagtcccggtggcagcagggaaacgtgttctcctgctcggtgatgcatgaagccctccataaccactatacccaaaagtcgctgtccctgtcgccgggaaag
SEQ ID NO:25(人IgG1轻链DNA变体1)
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
SEQ ID NO:26(人IgG4P重链DNA变体1)
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctccagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtcttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagcctgggcaag
SEQ ID NO:27(人IgG4P轻链DNA变体1)
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
SEQ ID NO:28(小鼠全长IgG1重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO:29(小鼠全长IgG1轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:30(人全长IgG1重链变体1)
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:31(人全长IgG1轻链变体1)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:32(Fab重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO:33(Fab轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:34(人IgG4P重链变体2)
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:35(人IgG4P轻链变体2)
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:36(人Gremlin-1；全长序列)
actcggtgcgccttccgcggaccgggcgacccagtgcacggccgccgcgtcactctcggtcccgctgaccccgcgccgagccccggcggctctggccgcggccgcactcagcgccacgcgtcgaaagcgcaggccccgaggacccgccgcactgacaggtgagcgcggacgcacccggcagggatgtgagtgggcggagggaagagggccgcaaaccaacccaggacccgctcagttccacgcgcggcagccctccgtgcgcgcaggctcgggtgcgttgttcgcgggggtgaattgtgaagaaccatcgcggggtccttcctgctgaggccgcggacaccgtgacctcgctgctctgggtctgcagggaaacgtaggaaaaaaagttgtcaggagcgggcaggatgacccccacatcccgtttccacctcccggaggcccccgaacacgctcctggtgctggtggcagcagcgcctggcagacgcgcccgcttagcgagggcgcgaagtccaggccgccagagcgcaggagcatccggacctgctagtcggccgctgactgcgcggcgagttgccttgagagggtcccatgtgcttggggcgccgcgctgggtctgggggcgtcttggggcgcccattggagtccgcgggttggagcatccggagaatccatgatgtgtgcatttgccgatccccgaggtgagatggagactggcaagggcagagccgctgtgttcagccacagcggaaaaccgaacggtgggtaatccgacagctgcggtgcggggcgcggccctggccgcggggtccagcgaacccgcagtgctcacaaggcagacaccacacgcgctcgcggaccggccacgcactcgcgggcgctcgcttctctactccagcctcttccccgccccgcgcacgcccgagctgaatggtagacgttctggcgccgggcagcggccaccggctggttcccacttccgcgcgcaccccttaaactgtgttctagaggccccagcctcgccttgcagcgcctcactagctcctgaggactagggactggcggctgaggcgggttggcggctgcaacgagctgggcgtctttcgttctctctcgctgcctggctggctccgctggcccctccacagcttgcggagcaaggccatagcaggggagtgggaggtatattggggctgtcacctccttgctggccggagttatttgtagactacagactccggaagaacagacgcgccaccgctctcgcttggcattgccttcggatcgcagctcctccttgggggtgccccagcttggcgtttatttgcctgcgccaggctctggcgacggtcaccgggccaggcggggagggacggacggcaggtgaccagcctctgctgtgaagaaattcctgcgcgcccggagctgtccctaatgcattcccgggtcgaatccgtctactgccttcccctcctcgaccgactccgaatctcggctcttatagacagaaatacagcctcagcgttaggggttaaaatccccctcttaaacggtccgagggcagagaggtgaccaccgataggtaattggatctcctgctggaaagagcaaatctgagcggtgtgcgcgtctgtttatgttccccttcgagatggtgccaggacacgaactgattaaaacaatctattgtgttaagtgggtcactagggttttaagctgtcccagggaccccagagtagtggcttccttctggctgtacacacaagttaaataaatagcgtagaagaggttaagataaccccattctagggtgaggagtcctctttcatccctagggcttccccctccccttttctctttttttggaaggagggggagcatgagagtcttgagggggggatgtacttttcaaagcaaggagggaaagatcttaagaaaactatatattctcactgccccccaagccaagtctataacagtaggtgatttgattactatctctggataaatggcactgtcaaattgttaatattaactatttcagggatttttagcagggtagtggcagtatgtgtgcgtgtgtgtgtgtgtgtctgtgtgtgtgtgtttaacctccaggtcattgtaggaattagagtcttttgtaaactttgtaatttcacaggtttcctattttcttaaaagttcatttttagtgaaatgttttggtaacccacgctctgtaggaaatccaggttggctaatgcggtctttatgtgagtagttacacagggaaggataaaaaccttttatgtcctacatctctgaatgagggctgcctaccctgtctttgaaactaagccgaagatgccttcagtctgaatggtcaagtattaaaagtgataaaatgcaaagaaatttcatgccgcagacacctcccccaagaactgcttgttgacagcaaagctgtggaacatgttccacaacagagagtaaaggacagccaggaaatataaaccttttatgtaaaggaaaggcaggtgggggacagtggttaggggaggtgactgcagcctctaaccaaaaggcaaccatcaggcaagtgctaccagcccgtgtcttcgatctgcaaggaattttctttagttttaacatatgctcttagaaattcaaagtacaacaggaattcctgggacaagagaaatctttttattcacatgtgaacatgaagatacaaaatagataattattttatttatagcactcttcaaattgtattgcattagaaaacatatccattgacccactgttaaggacagcactgggtgtcaataggacagtggttaaggacctgtgtttggggctagatagaattgggtttaaactgctggctgggctgggcacagtggctcacaccggtaatcccagcactttgggaggccaaggaggacggatcacctgaggtcgggagttcgacaccagcctgaccaacatggaaaaatcccgtctctactaaaaacacaaaattagccaggcatggtggtgcatgcctgcaatcccagctacttgggaggctgaggcaggagaattgcttgaaaccgggaggcggaggttgtggtgagcccagatagcgccattgcattccagcctgggcaacacgagtgaaaactccgtcaaaaaaacaaaacaaaacaaacaaacaaaaaaatgctggctttcccacttatgagctgtgtgaccttggacaaatttccaacttttctgagtgtagattccctgattggtaaaaggaagatgatattatctacctcatattttgttatgaaaaataaatgataaaattgggtcagaaatcagcataatgcctggcacagtaagggcttcaaaataaaaggtagctcttattattagtaatggtgttaggaaaagtagcaatgttatacagaaccaggatatatcacagggcagttctgaaattaaatcctgaatcctggccgggtgaggtggctcacgcttgtaatcctaagcactttcggagactgaggcaggcggatcacgaggtcaggagtttgagaccagcctggccaacacactgaaatcccgtctctactaaaaatacaaaaattagctgggtgtggtggcaggcgcctataatctcagctacttgggaggctgaggcaggagaatcacttgagcccaggaggcggaggttgcagtgagctgatatcgtgccagtgcactccagcctgggtgacatctcttaaaaaaaaaaatcctgaataccacactacgcagtgactaacacatctttcactacagaacagaacctgtaacttggccgtctctcagcagtgctgctcagtgaacatttaataatttattactttctaactcgtttcttgttgacctcaagaattgtacatagtcattaactttcctaagaaaatctttgacaaacatagagctcctgagatatttcacaaccaggtggtctcctccctgtcctatgcaatgttgggccccagcctgatttagccgacctggtcttcagacttgagaggctgtttagggttcttacaacacaaaggggatgagactttatcctctacctgtgtgccaacaagggattcttcttatctccttggtgcaacttgtctgaaaaagaaagtcaacacaattatcttcttaaaagttaaagatcaaattaaaaataagctatagttttcccaaagatttagacctgagaaaaaggaatagatctttctaaaacctggcctgcacttagagcatttgtagtcacttccactatttcttatgctgagagaataatttgatgtcatgcctattgaatgtctttctaaagcttgattcatcaggaggaactgaccagaagtccatgcacagacatttggctttcactgtaattcctactcaaaactccctttcactgattatgagcaggttgcttagctaaaatgagaaatacagcaagaagagggatggaaagagctggcttaaactttcccaaagacatcatgaacactgggaacaggtcatacatataccatttttatttctcagtcctcagtattagaatattgtgttcctagaggctttgtgaaaattggaatacattgccatgacctgcacaggatagaggtggttaatatggcttaccttgcttgtagatgtttactcttgatccctaagggaaactggaaggaaagcatgctgtagagaggacctgctttgagagtatgtgtcctctgggacaagtggaatgaaagagaggatagaggcaaagagaaaaaaaggtggagatggggtgagacttgctggtggacagttgcaaagaaaactcatgatgagaataacatcacatttcttgaagaagctgaactgcattgatgggaagttgaggcagagtttgaaaagaagatatactgtctgcaaaaaagaatcaacggagatgtcaggtatcttgatgcaccctgagtctatgagatgcagcttaatttaatttaatgatatgagtaggccatttcataagtggtggaaattaccataaagtgtttgcagctaatgacggcgcatgaatgatgtcataggaacctaagtctggatgagctatggattgaatttttactatgggacacccttctacatgttgctgtggaaaagaattgtcctcaagaaatgtacatcttctgcatttcctctacatctctgatatttacaaagtgcacattatttggtgatactacaactgggatttcaagtgcacatcactactatttccttcactgaagaatcaagagcagtctgggggtggggagagcttgagtgattgacaaggatgtggcagagccctggttccactatgaattatagttcttaccctgcttactgtcactcatgtagagcagctagtgtgcctcagagcactgctgttctctgagaagctgaggtctcgattgacattcttgaagttggtgtttacttctctctgaataaacaaaggttggcaactcagacatcttacaataagtactaaagatttttgaagaataggtttttaaaaaatgaaaaaacatttcactttccatagctaataaatcttattttgaggaaaatgtacttttctttaaaaaaaaaaaaagcctgtctgtcactctagaccctttggcttagaaggtaggcacactcacatagaaacagaaagtctgtccaaattaaaactgaaaaccacagttgactaattttgaatttatagctctgctgttggcttctgcgatagtattaatttcaatggcttcaattagaaaatgaaacccatagcattccatatgagaacaggtaaaaagtcagggacatttggagttttccaagaaaaagaaagacaagtcttaggaagctctctaggatggaaggaatttgccacactgagagttagacatccaaaggatagcaattggctcttctgctcatgggcactggtgaaggcattttaaaatgcgaagaatggtacctctgtaaatcaatgaggttcataataatcatgcatttaccaaatttttataagcacctgccttgtgccaggcactgagggtaaggtgatgaataagccctcatcaactgtcagactagatatttactcaataacagatgtgaaaatgccaagaaggaaaagttgagtataaagaaagccttaagttggttcagagaaataaaattgcatttttcggatagatgtttatggaatcggccttatgaggtaaacttgtcctatgcagtgaacatacattcccagttagtctcagattggcctctgtgatgacaaactcagagggtcctggtctaggaggggtgaatttgtctggaggccattttcaggaggtatggaggaagactggggcataggcctggggccatcccatgtactcctcctctgaaatggggagcaactgaattgtgttttattttagatcttcgtccaacttgaataccagaaattcgtgaaaccttctcaaattcacactatattttgagaccaggagaaggctccttgagaaattgccacactgtcttatcctagtctctggaaaaattcagtcctgtattataactgggcgtttctcataagtgctttttttttttctttttctttttataatactttaagttctgggatacatgtgcagaatgtgcaggtttgttacataggtatacacgtgccatggtggtttgctgcacccatcaacccatcatctacattaggtatttctcctaatgctaccccttccctagccccccacccctcgacaggccccagtgtttgatgttcccctccctgtgtccatgtgttctcattgttcaactcccacttatgagtgagagcatgcggtgtttggttttctgttcctgtgttagtttgctgagaatgatggtttttggcttcatccacgtccctgcaaaggacatgaactcatcctttttatggctgcatagtattccatggtgtatatgtgccacatttgctttatccagtctatcattgatgagcacttgggttggctccaagtctttgctattatgactagtactgcgataaacatgtgtatatgtgtctttatattagaatgatttataatcctttaggtctatacccagtaataggattcctgggtcaaatggtatttctggttctagatccttgaggaattgccacactgtcttccacaacggttgaactaatttacactcccaccaacagtgtaaaagcattcctatttctccacatcctctccaacatctgttgtttcctgactctttaatgacggccattctaactggcgtgaaatggtatctcattgtggttttgatttgcatttctctaatgaccaccgatgatgagctttttctcatatgtttgctggccccataaatgtcttcttttgagaaatgtctgttcatatcctttgcccactttttgatggggttgtttgcttttttcttgtaaatttgtttgagttcctggtagattctggatattagccctttgtcagatggatagactgcaaaaattttctcccattctgtaggttgcctgttcactctgatggtagtttcttttgccatgcagaagctgtttagtttaattagatccaatttgtcagttttggcttttgttgccattgcttttggtgttttagtcatgaagtctttgcccatgcctatgtcctgaattgtattgccctggttttcttctaggatttttatggttttaggtcttacatttaagtctttaatccatcttgaattaatttttgtataaggtgtaaggaaagggtccagtttcagttttctgcgtatggctagccagttttcccaacgttatttattaaatagggaatcctttccccattgcttgtttttgtcaggtttgtcaaagatcagacggttgtagatgtgtggtgttatttctgaggcctctgttctgttccattggtctgtatatctgctttgataccagtaccgtgctgttttggttactgtagccttgtagtacagtttgaagtcaggtagcgtgatgctttgttctttttgcttaggattgtcttggctatatgggctcttttttggttctatatgaaatttaaagtagttttttcatagacatctatagaactctccaccccaaatcaacagaatatacattcttctcagtatcgcatcacacttattctaaaatgaccacataattagaagtaaaacactcctcagcaaatgcaaaaaacagaaatcctaacagtctgtcagaccccagtgcaatcaaattagaactcaggattaagaaacttactgaaaaccacacaactgcatggaaactgaacaacctgctcctgaatgactactgggtaaataacaaaattaaggcagaaataaataggttctttgaaagaaatgagaacaaagacacaatataccagaatctctgggacacagctaaagcagtgtttagagggaaattgatagcactaaatgcccacaggagaaagcgggacagatctaaaatcgacaccctaatatcacaattaaaagaactagagaaacaagagcaaacaaattcaaaagctagcagaagacaagaaataactaagatcagagcagaactgaaggagatagagacacaaaaaacccttcaaaaaatcaatgaatccaggagctgtttttttttttttgaaaagattaatgaaatagactgctagccaaactaataaaggagaaaagagagaagaatcaaatagacaatagacacaataaaaagtgataaaggggatatcaccactgatcccacagaaatacaaactaccatcagagaatactataaacacctctacgcaaataaactagaaaattgggaagaaatggatacattcctgaacgcatacaccctcccaagactaaaccaggaagaagttgaatccctgaatagaccaatagcaagttctgaaattgaggcagtaattagtagcctaccaaccaaaaaaagcccaggaccagacagattcacagccgaagtctaccagaggtacaaagaggagctagtaccattccttctgaaactattccaaacaatagaaaaagaaggactcctccctaactcattttatgaggccagcatcatcctgataccaaaacctggcagagacacaacataaaggaaattcaggccaatatccctgatgaacattgatgtgaaaatcctcaataaaatactggcagcacatcaaaaagcttacctgccatgatcaagttggcttcatccctgggatgcaaggctggttcaacatacgcaaatcaataaacgtaatcaatcacatacacagaaccaatgacaaaaaccacatgattatctcaatagatgcagaaaaggccttcgataaaattcaacaccccttcaatgctaagaactctcaataaactaggtattgatgaaacatatctcaaaataataagagttatttatgacaaacccacagccagtatcatactgaatgggcaaaagctggaagcattccctttgaaaaccgccacaaggatgacttctctcaccactcctattcaacatactattggaagttctggccagggcaagcaggcaagacaaataaataaagggtattcaaataggaagagaggaagtcaaattgtctctgtttgcagatgacatgattgtatatttagaaaaccccatcatctcagcccaaaatctccttaagctgataagcaacttcagcaaagtctcaggatacaaaatcaatgtgcaaaaatcacaagcattcctatacaccaataatagacaaacagccaaatcatgagtgaactcccattcacaagtgctacaaagaataaaatacctaggaatccaacttacaagggatgtgaaggacctcttcaaggagaactacagaccactgctcaaggtaataagagaggacacaaacaaatggaaaaacattccatgctcatggataggaagaatcaatattatgaaaatggccatactgcccaaaacaatttatagattcaatgccatccccatcaagctaccactgacttccttcacagaattagaaaaaaactactttaaatttcatatggaactgaaaaaagagccggtatagccaagacgatcctaagcaaaaagaaaaaagctggaagcatcatgctacctgacttcaaactatactacaaggctacagtaacaaaaacagcatggtatagtataagtgcttttttttaaaagacaaagtaaagtaatttttttgttgttggggtaaaacaaaagctctgcataaagagcagggatgttgtaacatacactgaccaaaggtgggaaacctacagttggagcagaagctgaatgtcacattatcagctccgaacttataatggtctaaaagtactaggttaatgttggaaagatggtgccatttaaagatatcttaaattcaatatttaattattttaatttgacattatcctagagttgaatggtgtttacttaccatgtgctgttcattagaaaatctagatcctacactgcctttgcgcaaggtagttgctctaataataccaacctgtccagttttggtgggagaaataatgttactgttaagttgcacttagtggttattatgtgtaatactggtattccaaagagagaaggaaaatgtttgctacacagctgtgttcttaggttcagaaaaccacaggagtgggacaggagaaccttcaggattcaggtccgattgttgtgatggccgcaggagggagactgtgaatttgaaactgcatccattgaaaagaaaatccctccacactttaataattctctccgtgccccatggcagcaagtgcttataggccttgctactcaaagcttaataaaaaggcagacctgctgaatcataatctgcatcttaacaatatccccagatattgtctgcactttctttttttttttctttctttctttcttcttttttttgagacagagtctcgctcagtcacccaggctggagtgcagtggcgcgatctcggctcactgcaagctctgactcccgggttcacgccattctcctgccttagactcccgagtagctggcactacaggcgcccgccactacgcccggctaatttttttgtatttttagtagagatggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcgtgatccgccgcccatctgggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgcgcccggccaattgtctgcactttcaagtctaagaagcactgtcccaggaggaaaatctttttagtctgaggcttctctcttgcactctcctttttaaaaatatgctgctccttctccacctttccctcttcttccgccttttctgtctgcctttactacctcccctgaacattcaacttgtagaagagttcccctttctctgaattgcattcttcacttcattcattcttttctctctctgtctatggtttcctattttttgtcggttttccctcacctcacctccttgttattttttgccattgttcacatatcactgccctttcagacccatatctagcttctgacccatccactaatccattgccactaatttattcagcatgcccatgccatttattaatgtaaatatttgcacatacttgttctatcatgcccatttttctaccttttaaattgtatatacacagacacatgtgaatgacatatttcactatttaaaaggtagaaaaatgtatatcgtggtacaaagtgatacattgagtatctgtgcccagtttcaagatgagaataagtgagaggtgaagcctcatgagtcacgtcacctacacgctactgtctttcattccatctgcagtactgccacacatttggttagttctccaattgctgtcacattgacatcgagttggatctgaacagcgtacctggggagacgaagtattggtatctttgcttaaatggagtgatttactgagagacaaagtgacatctttaagatcagatagcaagttactgcaccaggagcgcgacctttcctgttttgttgttttccctctgtcaaatgccttctggtctccatgaatctctccttccacatatgataaaaatgcaaagtctcataagcattcacagctcaggaagcctcaggctagttggggagaaaagactgggaggtttccggaggaatgaagtcctctgagcagagaggttaattcatcttgctgtaaaacaaaatagaaaataagttcccctcaataagtgaacgtaatacaaagacaaatgtggttggtgccagaggccaggaagaagttcttgtgagaataggtgcagagaagagctaggccctggctgagtttaaaccttgacttagtcactgtgggactctgggtgagttactccatggattgatggctgggtcatggagataatagtacctaattcatacaggtactgtgagaagtaaatggaatatttcacgttaagtgtttaacggtgcgtttaaatgctaggtgctattattattaatttttaaattaactttgccatgttttgtgtcttcccctctctgtgcttcctttctttagtatgagccgcacagcctacacggtgggagccctgcttctcctcttggggaccctgctgccggctgctgaagggaaaaagaaagggtcccaaggtgccatccccccgccagacaaggcccagcacaatgactcagagcagactcagtcgccccagcagcctggctccaggaaccgggggcggggccaagggcggggcactgccatgcccggggaggaggtgctggagtccagccaagaggccctgcatgtgacggagcgcaaatacctgaagcgagactggtgcaaaacccagccgcttaagcagaccatccacgaggaaggctgcaacagtcgcaccatcatcaaccgcttctgttacggccagtgcaactctttctacatccccaggcacatccggaaggaggaaggttcctttcagtcctgctccttctgcaagcccaagaaattcactaccatgatggtcacactcaactgccctgaactacagccacctaccaagaagaagagagtcacacgtgtgaagcagtgtcgttgcatatccatcgatttggattaagccaaatccaggtgcacccagcatgtcctaggaatgcagccccaggaagtcccagacctaaaacaaccagattcttacttggcttaaacctagaggccagaagaacccccagctgcctcctggcaggagcctgcttgtgcgtagttcgtgtgcatgagtgtggatgggtgcctgtgggtgtttttagacaccagagaaaacacagtctctgctagagagcactccctattttgtaaacatatctgctttaatggggatgtaccagaaacccacctcaccccggctcacatctaaaggggcggggccgtggtctggttctgactttgtgtttttgtgccctcctggggaccagaatctcctttcggaatgaatgttcatggaagaggctcctctgagggcaagagacctgttttagtgctgcattcgacatggaaaagtccttttaacctgtgcttgcatcctcctttcctcctcctcctcacaatccatctcttcttaagttgatagtgactatgtcagtctaatctcttgtttgccaaggttcctaaattaattcacttaaccatgatgcaaatgtttttcattttgtgaagaccctccagactctgggagaggctggtgtgggcaaggacaagcaggatagtggagtgagaaagggagggtggagggtgaggccaaatcaggtccagcaaaagtcagtagggacattgcagaagcttgaaaggccaataccagaacacaggctgatgcttctgagaaagtcttttcctagtatttaacagaacccaagtgaacagaggagaaatgagattgccagaaagtgattaactttggccgttgcaatctgctcaaacctaacaccaaactgaaaacataaatactgaccactcctatgttcggacccaagcaagttagctaaaccaaaccaactcctctgctttgtccctcaggtggaaaagagaggtagtttagaactctctgcataggggtgggaattaatcaaaaaccgcagaggctgaaattcctaatacctttcctttatcgtggttatagtcagctcatttccattccactatttcccataatgcttctgagagccactaacttgattgataaagatcctgcctctgctgagtgtacctgacagtagtctaagatgagagagtttagggactactctgttttagcaagagatattttgggggtctttttgttttaactattgtcaggagattgggctaaagagaagacgacgagagtaaggaaataaagggaattgcctctggctagagagtagttaggtgttaatacctggtagagatgtaagggatatgacctccctttctttatgtgctcactgaggatctgaggggaccctgttaggagagcatagcatcatgatgtattagctgttcatctgctactggttggatggacataactattgtaactattcagtatttactggtaggcactgtcctctgattaaacttggcctactggcaatggctacttaggattgatctaagggccaaagtgcagggtgggtgaactttattgtactttggatttggttaacctgttttcttcaagcctgaggttttatatacaaactccctgaatactctttttgccttgtatcttctcagcctcctagccaagtcctatgtaatatggaaaacaaacactgcagacttgagattcagttgccgatcaaggctctggcattcagagaacccttgcaactcgagaagctgtttttatttcgtttttgttttgatccagtgctctcccatctaacaactaaacaggagccatttcaaggcgggagatattttaaacacccaaaatgttgggtctgattttcaaacttttaaactcactactgatgattctcacgctaggcgaatttgtccaaacacatagtgtgtgtgttttgtatacactgtatgaccccaccccaaatctttgtattgtccacattctccaacaataaagcacagagtggatttaattaagcacacaaatgctaaggcagaattttgagggtgggagagaagaaaagggaaagaagctgaaaatgtaaaaccacaccagggaggaaaaatgacattcagaaccagcaaacactgaatttctcttgttgttttaactctgccacaagaatgcaatttcgttaacggagatgacttaagttggcagcagtaatcttcttttaggagcttgtaccacagtcttgcacataagtgcagatttggctcaagtaaagagaatttcctcaacactaacttcactgggataatcagcagcgtaactaccctaaaagcatatcactagccaaagagggaaatatctgttcttcttactgtgcctatattaagactagtacaaatgtggtgtgtcttccaactttcattgaaaatgccatatctataccatattttattcgagtcactgatgatgtaatgatatattttttcattattatagtagaatatttttatggcaagatatttgtggtcttgatcatacctattaaaataatgccaaacaccaaatatgaattttatgatgtacactttgtgcttggcattaaaagaaaaaaacacacatcctggaagtctgtaagttgttttttgttactgtaggtcttcaaagttaagagtgtaagtgaaaaatctggaggagaggataatttccactgtgtggaatgtgaatagttaaatgaaaagttatggttatttaatgtaattattacttcaaatcctttggtcactgtgatttcaagcatgttttctttttctcctttatatgactttctctgagttgggcaaagaagaagctgacacaccgtatgttgttagagtcttttatctggtcaggggaaacaaaatcttgacccagctgaacatgtcttcctgagtcagtgcctgaatctttattttttaaattgaatgttccttaaaggttaacatttctaaagcaatattaagaaagactttaaatgttattttggaagacttacgatgcatgtatacaaacgaatagcagataatgatgactagttcacacataaagtccttttaaggagaaaatctaaaatgaaaagtggataaacagaacatttataagtgatcagttaatgcctaagagtgaaagtagttctattgacattcctcaagatatttaatatcaactgcattatgtattatgtctgcttaaatcatttaaaaacggcaaagaattatatagactatgaggtaccttgctgtgtaggaggatgaaaggggagttgatagtctcataaaactaatttggcttcaagtttcatgaatctgtaactagaatttaattttcaccccaataatgttctatatagcctttgctaaagagcaactaataaattaaacctattctttctgtg
SEQ ID NO:37(人Gremlin-1；编码序列)
atgagccgcacagcctacacggtgggagccctgcttctcctcttggggaccctgctgccggctgctgaagggaaaaagaaagggtcccaaggtgccatccccccgccagacaaggcccagcacaatgactcagagcagactcagtcgccccagcagcctggctccaggaaccgggggcggggccaagggcggggcactgccatgcccggggaggaggtgctggagtccagccaagaggccctgcatgtgacggagcgcaaatacctgaagcgagactggtgcaaaacccagccgcttaagcagaccatccacgaggaaggctgcaacagtcgcaccatcatcaaccgcttctgttacggccagtgcaactctttctacatccccaggcacatccggaaggaggaaggttcctttcagtcctgctccttctgcaagcccaagaaattcactaccatgatggtcacactcaactgccctgaactacagccacctaccaagaagaagagagtcacacgtgtgaagcagtgtcgttgcatatccatcgatttggattaa
参考文献
Attar-Schneider,O.等人，Multiple myeloma and bone marrow mesenchymalstem cells'crosstalk:Effect on translation initiation.Mol Carcinog,2015.
Azab,A.K.等人，Hypoxia promotes dissemination of multiple myelomathrough acquisition of epithelial to mesenchymal transition-likefeatures.Blood,2012.119(24):p.5782-94.
Bostrom,M.P.&Seigerman,D.A.(2005),HSS journal:The MusculoskeletalJournal of Hospital for Special Surgery 1,9-18.The clinical use ofallografts,demineralized bone matrices,synthetic bone graft substitutes andosteoinductive growth factors:a survey study.
Buza,J.A.,3rd&Einhorn,T.(2016),Clinical cases in mineral and bonemetabolism:The Official Journal of the Italian Society of Osteoporosis,Mineral Metabolism,and Skeletal Diseases 13,101-105.Bone healing in 2016.
Calon A,Lonardo E,Berenguer-Llergo A,Espinet E,Hernando-Momblona X,Iglesias M.等人，Stromal gene expression defines poor-prognosis subtypes incolorectal cancer.Nat Genet.2015；47(4):320-9.
Canalis,E.,Parker,K.&Zanotti,S.(2012),J.Cell Physiol 227,269-277.Gremlin1 is required for skeletal development and postnatal skeletalhomeostasis.
Chen,J.等人，BAFF is involved in macrophage-induced bortezomibresistance in myeloma.Cell Death Dis,2017.8(11):p.e3161.
Chen,M.H.等人，Expression of gremlin 1correlates with increasedangiogenesis and progression-free survival in patients with pancreaticneuroendocrine tumors.J Gastroenterol,2013.48(1):p.101-8.
Cheong,C.M.等人，Tetraspanin 7(TSPAN7)expression is upregulated inmultiple myeloma patients and inhibits myeloma tumour development in vivo.ExpCell Res,2015.332(1):p.24-38.
Chesi,M.,等人，Drug response in a genetically engineered mouse modelof multiple myeloma is predictive of clinical efficacy.Blood,2012.120(2):p.376-85.
Cho,T.J.,Gerstenfeld,L.C.&Einhorn,T.A.(2002),Journal of Bone andMineral Research:The Official Journal of the American Society for Bone andMineral Research 17,513-520.Differential temporal expression of members ofthe transforming growth factor beta superfamily during murine fracturehealing.
Ciuclan,L.等人，Treatment with anti-gremlin 1antibody ameliorateschronic hypoxia/SU5416-induced pulmonary arterial hypertension in mice.Am JPathol,2013.183(5):p.1461-73.
Curran,S.P.等人，Deletion of Gremlin1 increases cell proliferation andmigration responses in mouse embryonic fibroblasts.Cellular Signalling,2012.24(4):p.889-98.
Dallas,S.L.等人，Ibandronate reduces osteolytic lesions but not tumourburden in a murine model of myeloma bone disease.Blood,1999.93(5):p.1697-706.
Das,D.S.等人，A novel hypoxia-selective epigenetic agent RRx-001triggers apoptosis and overcomes drug resistance in multiple myelomacells.Leukemia,2016.30(11):p.2187-2197.
Davis H,Irshad S,Bansal M,Rafferty H,Boitsova T,Bardella C,等人，Aberrant epithelial GREM1 expression initiates colonic tumorigenesis fromcells outside the stem cell niche.Nat Med.2015；21(1):62-70.
Diamond,P.等人，Targeted disruption of the CXCL12/CXCR4 axis inhibitsosteolysis in a murine model of myeloma-associated bone loss.J Bone MinerRes,2009.24(7):p.1150-61.
Einhorn,T.A.&Gerstenfeld,L.C.(2015),Nat.Rev.Rheumatol.11,45-54.Fracture healing:mechanisms and interventions.
Ferguson,C.,Alpern,E.,Miclau,T.&Helms,J.A.(1999),Mechanisms ofdevelopment 87,57-66.Does adult fracture repair recapitulate embryonicskeletal formation？
Fowler,J.A.等人，Bone marrow stromal cells create a permissivemicroenvironment for myeloma development:a new stromal role for Wnt inhibitorDkk1.Cancer Research,2012.72(9):p.2183-9.
Gazzerro,E.等人，(2005),Endocrinology 146,655-665.Skeletaloverexpression of gremlin impairs bone formation and causes osteopenia.
Gazzerro,E.等人，(2007),J.Biol.Chem.282,31549-31557.Conditionaldeletion of gremlin causes a transient increase in bone formation and bonemass.
Ghobrial,I.M.,Myeloma as a model for the process of metastasis:implications for therapy.Blood,2012.120(1):p.20-30.
Goulet,J.A.,Senunas,L.E.,DeSilva,G.L.&Greenfield,M.L.(1997),ClinicalOrthopaedics and Related Research,76-81.Autogenous iliac crest bonegraft.Complications and functional assessment.
Guan等人，(2017).Gremlin1 promotes carcinogensis of glimona invitro.Exp Pharmacol Physiol,44(2):244-256
Hewett,D.R.等人，DNA Barcoding Reveals Habitual Clonal Dominance ofMyeloma Plasma Cells in the Bone Marrow Microenvironment.Neoplasia(New York,N.Y.),2017.19(12):p.972-981.
Hideshima,T.等人，Understanding multiple myeloma pathogenesis in thebone marrow to identify new therapeutic targets.Nature Reviews Cancer,2007.7(8):p.585-98.
Hjertner,O.等人，Bone morphogenetic protein-4inhibits proliferationand induces apoptosis of multiple myeloma cells.Blood,2001.97(2):p.516-22.
Holien,T.等人，Bone morphogenetic proteins induce apoptosis inmultiple myeloma cells by Smad-dependent repression of MYC.Leukemia,2012.26(5):p.1073-80.
Howe JR,Bair JL,Sayed MG,Anderson ME,Mitros FA,Petersen GM,等人，Germline mutations of the gene encoding bone morphogenetic protein receptor1A in juvenile polyposis.Nat Genet.2001；28(2):184-7.
Howe J,Roth S,Ringold J,Summers R,Jarvinen H,Sistonen P.等人，Mutations in the SMAD4/DPC4 gene in juvenile polyposis.Science.1998；280(5366):1086-8.
Hsu,D.R.,Economides,A.N.,Wang,X.,Eimon,P.M.&Harland,R.M.(1998),Mol.Cell 1,673-683.The Xenopus dorsalizing factor Gremlin identifies a novelfamily of secreted proteins that antagonize BMP activities.
Isella C,Terrasi A,Bellomo SE；Petti C,Galatola G,Muratore A.等人，Stromal contribution to the colorectal cancer transcriptome.Nat Genet.2015；47(4):312-9.
Irshad S,Bansal M,Guarnieri P,Davis H,Al Haj Zen A,Baran B.等人，Bonemorphogenetic protein and Notch signalling crosstalk in poor-prognosis,mesenchymal-subtype colorectal cancer.J Pathol.2017.
Jaeger E,Leedham S,Lewis A,Segditsas S,Becker M,Cuadrado PR等人，Hereditary mixed polyposis syndrome is caused by a 40-kb upstream duplicationthat leads to increased and ectopic expression of the BMP antagonistGREM1.Nat Genet.2012；Jan；45(l):2-3.
Karagiannis,G.S.等人，Bone morphogenetic protein antagonist gremlin-1regulates colon cancer progression.Biol Chem,2015.396(2):p.163-83.
Karagiannis,G.S.等人，Enrichment map profiling of the cancer invasionfront suggests regulation of colorectal cancer progression by the bonemorphogenetic protein antagonist,gremlin-1.Mol Oncol,2013.7(4):p.826-39.
Kim,M.等人，Gremlin-1induces BMP-independent tumor cell proliferation,migration,and invasion.Plos One,2012.7(4):p.e35100.
Kim,H.S.等人，GREM1 is expressed in the cancer-associatedmyofibroblasts of basal cell carcinomas.Plos One,2017.12(3):p.e0174565.
Koketsu,K.等人，Gremlin,a bone morphogenetic protein antagonist,is acrucial angiogenic factor in pituitary adenoma.Int J Endocrinol,2015.2015:p.834137.
Kyle,R.A.and S.V.Rajkumar,Multiple myeloma.N Engl J Med,2004.351(18):p.1860-73.
Laurila,R.等人，The expression patterns of gremlin 1and noggin innormal adult and tumor tissues.Int J Clin Exp Pathol,2013.6(7):p.1400-8.
Lavoz,C.等人，Gremlin regulates renal inflammation via vascularendothelial growth factor receptor 2pathway.J Pathol,2015.
Lawson,M.A.等人，Osteoclasts control reactivation of dormant myelomacells by remodelling the endosteal niche.Nat Commun,2015.6:p.8983.
Lewis A,Freeman-Mills L,de la Calle-Mustienes E,Giraldez-Perez RM,Davis H,Jaeger E等人，A polymorphic enhancer near GREM1influences bowel cancerrisk through differential CDX2 and TCF7L2binding.Cell Rep.2014；8(4):983-90.
Mitola S,Ravelli C,Moroni E,Salvi V,Leali D,Ballmer-Hofer K等人，Gremlin is a novel agonist of the major proangiogenic receptorVEGFR2.Blood.2010；116(18):3677-80.
Mulvihill,M.S.等人，Gremlin is overexpressed in lung adenocarcinomaand increases cell growth and proliferation in normal lung cells.Plos One,2012.7(8):p.e42264.
Namkoong,H.等人，The bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1isoverexpressed in human cancers and interacts with YWHAH protein.BMC Cancer,2006.6:p.74.
Neufert,C.,Becker,C.&Neurath,M.F.An inducible mouse model of coloncarcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumorprogression.Nat Protoc 2,1998-2004,(2007).
Noll,J.等人，Myeloma plasma cells alter the bone marrowmicroenvironment by stimulating the proliferation of mesenchymal stromalcells.Haematologica,2014.99(1).
Noll,J.E.等人，PTTG1 expression is associated with hyperproliferativedisease and poor prognosis in multiple myeloma.J Hematol Oncol,2015.8:p.106.
Noll,J.E.,等人，SAMSN1 Is a Tumor Suppressor Gene in MultipleMyeloma.Neoplasia,2014.16(7):p.572-85.
Plaks V,Kong N,Werb Z.The cancer stem cell niche:how essential is theniche in regulating sternness of tumor cells？Cell Stem Cell.2015；16(3):225-38.
Ponomarev,V.等人，A novel triple-modality reporter gene for whole-bodyfluorescent,bioluminescent,and nuclear noninvasive imaging.Eur J Nucl Med MolImaging,2004.31(5):p.740-51.
Sato T,Vries RG,Snippert HJ,van de Wetering M,Barker N,Stange DE等人，Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without amesenchymal niche.Nature.2009；459(7244):262-5.
Schmid,G.J.,Kobayashi,C.,Sandell,L.J.&Ornitz,D.M.(2009),DevelopmentalDynamics:An Official Publication of the American Association of Anatomists238,766-774.Fibroblast growth factor expression during skeletal fracturehealing in mice.
Scoville D,Sato T,He X,Li L.Current view:intestinal stem cells andsignaling Gastroenterology.2008；134(3):849-64.
Sethi A,Wordinger RJ,Clark AF.Gremlin utilizes canonical and non-canonical TGFbeta signaling to induce lysyl oxidase(LOX)genes in humantrabecular meshwork cells.Exp Eye Res.2013；113:117-27.
Shoshkes-Carmel,M.等人，Subepithelial telocytes are an importantsource of Wnts that supports intestinal crypts.Nature 557,242-246,(2018).
Sneddon,J.B.等人，Bone morphogenetic protein antagonist gremlin1iswidely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumorcell proliferation.Proc Natl Acad Sci U S A,2006.103(40):p.14842-7.
Tamminen,J.A.等人，Gremlin-1associates with fibrillin microfibrils invivo and regulates mesothelioma cell survival through transcription factorslug.Oncogenesis,2013.2:p.e66.
Tomlinson IP,Carvajal-Carmona LG,Dobbins SE,Tenesa A,Jones AM,HowarthK等人，Multiple Common Susceptibility Variants near BMP Pathway Loci GREM1,BMP4,and BMP2 Explain Part of the Missing Heritability of ColorectalCancer.PLoS Genet.2011；7(6):el002105.
Topol,L.Z.等人，Identification of drm,a novel gene whose expression issuppressed in transformed cells and which can inhibit growth of normal butnot transformed cells in culture.Mol Cell Biol,1997.17(8):p.4801-10.
Vande Broek,I.等人，Extravasation and homing mechanisms in multiplemyeloma.Clin Exp Metastasis,2008.25(4):p.325-34.
Verheyden,J.M.and X.Sun,An Fgf/Gremlin inhibitory feedback looptriggers termination of limb bud outgrowth.Nature,2008.454(7204):p.638-41.
Wang,D.J.等人，The bone morphogenetic protein antagonist Gremlin isoverexpressed in human malignant mesothelioma.Oncology Reports,2012.27(1):p.58-64.
Worthley,D.L.等人，Gremlin 1identifies a skeletal stem cell with bone,cartilage,and reticular stromal potential.Cell,2015.160(1-2):p.269-84.
Yin,Y.等人，Overexpression of Gremlin promotes non-small cell lungcancer progression.Tumour Biol,2015.
Yu,Y.Y.等人，(2010),Bone 46,841-851.Immunolocalization of BMPs,BMPantagonists,receptors,and effectors during fracture repair.
WO-2014159010(Priority:14 Mar,2013)Regeneron Pharmaceuticals Inc."Human antibodies to GREM 1".
WO-2013137686(Priority:15 Mar,2012)Seoul National University and Dbfoundation,Korea"Gremlinl antibody".
US 2009041757A1(Priority:16 Mar,2007)Stanford University,"Bonemorphogenetic protein antagonist and uses thereof'.
WO2007124486(Priority:21 Apr,2007)Children's Hospital Los Angeles,"BMP4 inhibitors".
W02002054940(Priority:12 Jan 2001)University of Medicine andDentistry of New Jersey,"Bone morphogenetic protein-2 in the treatment anddiagnosis of cancer".
序列表
<110> UCB Biopharma SPRL
Oxford University Innovation Limited
The University of Adelaide
<120> 用于预防和治疗癌症的GREMLIN-1拮抗剂
<130> N412703WO
<150> GB 1809946.5
<151> 2018-06-18
<150> GB 1815694.3
<151> 2018-09-26
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Pro Ala Ala Glu Gly Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala
20 25 30
Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg
50 55 60
Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala
65 70 75 80
Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr
85 90 95
Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro
115 120 125
Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys
130 135 140
Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu
145 150 155 160
Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys
165 170 175
Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
180
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213>
<220>
<223> 带有N末端标签的结晶学中使用的人截短型Gremlin-1
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly Ser Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser
20 25 30
Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp
35 40 45
Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn
50 55 60
Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe
65 70 75 80
Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys
85 90 95
Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn
100 105 110
Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val
115 120 125
Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
130 135
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合Kabat & Chothia的Ab7326 HCDR1
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 HCDR1 Kabat
<400> 4
Asp Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 HCDR2 Kabat
<400> 5
Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 HCDR3 Kabat
<400> 6
Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 LCDR1 Kabat
<400> 7
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 LCDR2 Kabat
<400> 8
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 LCDR3 Kabat
<400> 9
Gln Gln Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr
1 5
<210> 10
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 重链可变区变体1
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 轻链可变区变体1
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 重链可变区变体2
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab7326 轻链可变区变体2
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠全长IgG1 重链变体 1
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
245 250 255
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
290 295 300
Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
340 345 350
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp
385 390 395 400
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser
405 410 415
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 15
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠全长 IgG1 轻链变体 1
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 16
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人全长 IgG1 重链变体 2
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人全长 IgG1 轻链变体 2
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab 重链变体 1
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys
225
<210> 19
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab 轻链变体 1
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有N末端标签的用于结晶学的人截短型Gremlin-1
<400> 20
Ala Met Pro Gly Glu Glu Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Val Thr Glu Arg Lys Tyr Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro
20 25 30
Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile
35 40 45
Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His
50 55 60
Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro
65 70 75 80
Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln
85 90 95
Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys
100 105 110
Ile Ser Ile Asp Leu Asp
115
<210> 21
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 1 的成熟Gremlin-1序列，缺少氨基酸1-21的信号肽
<400> 21
Lys Lys Lys Gly Ser Gln Gly Ala Ile Pro Pro Pro Asp Lys Ala Gln
1 5 10 15
His Asn Asp Ser Glu Gln Thr Gln Ser Pro Gln Gln Pro Gly Ser Arg
20 25 30
Asn Arg Gly Arg Gly Gln Gly Arg Gly Thr Ala Met Pro Gly Glu Glu
35 40 45
Val Leu Glu Ser Ser Gln Glu Ala Leu His Val Thr Glu Arg Lys Tyr
50 55 60
Leu Lys Arg Asp Trp Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His
65 70 75 80
Glu Glu Gly Cys Asn Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly
85 90 95
Gln Cys Asn Ser Phe Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly
100 105 110
Ser Phe Gln Ser Cys Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met
115 120 125
Met Val Thr Leu Asn Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys
130 135 140
Arg Val Thr Arg Val Lys Gln Cys Arg Cys Ile Ser Ile Asp Leu Asp
145 150 155 160
<210> 22
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG4P 重链变体 1
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 23
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG4P 轻链变体 1
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 24
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG1 重链DNA变体 1
<400> 24
caagtgcaac tggtggaatc cggggccgaa gtgaaaaagc ccggagccac tgtgaagatc 60
tcttgcaaag tgtccggcta caccttcacc gactattaca tgcactgggt ccagcaggca 120
cctgggaagg gccttgagtg gatgggtctg gtcgatcccg aggacggcga aactatctac 180
gccgagaagt tccagggtcg cgtcaccatc accgccgaca cttccaccga caccgcgtac 240
atggagctgt ccagcttgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc cacggatgct 300
cggggaagcg gcagctacta cccgaaccac ttcgactact ggggacaggg cactctcgtg 360
actgtctcga gcgcttctac aaagggcccc tccgtgttcc cgctcgctcc atcatcgaag 420
tctaccagcg gaggcactgc ggctctcggt tgcctcgtga aggactactt cccggagccg 480
gtgaccgtgt cgtggaacag cggagccctg accagcgggg tgcacacctt tccggccgtc 540
ttgcagtcaa gcggccttta ctccctgtca tcagtggtga ctgtcccgtc cagctcattg 600
ggaacccaaa cctacatctg caatgtgaat cacaaaccta gcaacaccaa ggttgacaag 660
aaagtcgagc ccaaatcgtg tgacaagact cacacttgtc cgccgtgccc ggcacccgaa 720
ctgctgggag gtcccagcgt ctttctgttc cctccaaagc cgaaagacac gctgatgatc 780
tcccgcaccc cggaggtcac ttgcgtggtc gtggacgtgt cacatgagga cccagaggtg 840
aagttcaatt ggtacgtgga tggcgtcgaa gtccacaatg ccaaaactaa gcccagagaa 900
gaacagtaca attcgaccta ccgcgtcgtg tccgtgctca cggtgttgca tcaggattgg 960
ctgaacggga aggaatacaa gtgcaaagtg tccaacaagg cgctgccggc accgatcgag 1020
aaaactatct ccaaagcgaa gggacagcct agggaacctc aagtctacac gctgccacca 1080
tcacgggatg aactgactaa gaatcaagtc tcactgactt gtctggtgaa ggggttttac 1140
cctagcgaca ttgccgtgga gtgggaatcc aacggccagc cagagaacaa ctacaagact 1200
acccctccag tgctcgactc ggatggatcg ttcttccttt actcgaagct caccgtggat 1260
aagtcccggt ggcagcaggg aaacgtgttc tcctgctcgg tgatgcatga agccctccat 1320
aaccactata cccaaaagtc gctgtccctg tcgccgggaa ag 1362
<210> 25
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG1轻链DNA变体 1
<400> 25
gacattgtga tgacccagtc ccccgattcg cttgcggtgt ccctgggaga acgggccacc 60
attaactgca agagctcaca gtccgtcctg tattcatcga acaacaagaa ttacctcgca 120
tggtatcagc agaagcctgg acagcctccc aagctgctca tctactgggc tagcacccgc 180
gaatccgggg tgccggatag attctccgga tcgggttcgg gcactgactt cactctgact 240
atcaactcac tgcaagccga ggatgtcgcg gtgtacttct gtcagcagta ctacgacacc 300
ccgacctttg gacaaggcac cagactggag attaagcgta cggtggccgc tccctccgtg 360
ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgcctccgt cgtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
tccggcaact cccaggaatc cgtcaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657
<210> 26
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG4P 重链DNA变体 1
<400> 26
caagtgcaac tggtggaatc cggggccgaa gtgaaaaagc ccggagccac tgtgaagatc 60
tcttgcaaag tgtccggcta caccttcacc gactattaca tgcactgggt ccagcaggca 120
cctgggaagg gccttgagtg gatgggtctg gtcgatcccg aggacggcga aactatctac 180
gccgagaagt tccagggtcg cgtcaccatc accgccgaca cttccaccga caccgcgtac 240
atggagctgt ccagcttgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc cacggatgct 300
cggggaagcg gcagctacta cccgaaccac ttcgactact ggggacaggg cactctcgtg 360
actgtctcga gcgcttctac aaagggcccc tccgtgttcc ctctggcccc ttgctcccgg 420
tccacctccg agtctaccgc cgctctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgagccc 480
gtgacagtgt cctggaactc tggcgccctg acctccggcg tgcacacctt ccctgccgtg 540
ctgcagtcct ccggcctgta ctccctgtcc tccgtcgtga ccgtgccctc ctccagcctg 600
ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag 660
cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cccccctgcc ctgcccctga atttctgggc 720
ggaccttccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccaggaag atcccgaggt ccagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaat gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 900
aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccct ccagcatcga aaagaccatc 1020
tccaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc tagccaggaa 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtca agggcttcta cccctccgac 1140
attgccgtgg aatgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc cttcttcctg tactctcggc tgaccgtgga caagtcccgg 1260
tggcaggaag gcaacgtctt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgtccct gagcctgggc aag 1353
<210> 27
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG4P轻链DNA变体 1
<400> 27
gacattgtga tgacccagtc ccccgattcg cttgcggtgt ccctgggaga acgggccacc 60
attaactgca agagctcaca gtccgtcctg tattcatcga acaacaagaa ttacctcgca 120
tggtatcagc agaagcctgg acagcctccc aagctgctca tctactgggc tagcacccgc 180
gaatccgggg tgccggatag attctccgga tcgggttcgg gcactgactt cactctgact 240
atcaactcac tgcaagccga ggatgtcgcg gtgtacttct gtcagcagta ctacgacacc 300
ccgacctttg gacaaggcac cagactggag attaagcgta cggtggccgc tccctccgtg 360
ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgcctccgt cgtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
tccggcaact cccaggaatc cgtcaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657
<210> 28
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠全长 IgG1 重链变体 2
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn
130 135 140
Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val
195 200 205
Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
210 215 220
Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu
245 250 255
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val
290 295 300
Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
340 345 350
Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp
385 390 395 400
Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser
405 410 415
Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠全长 IgG1 轻链变体 2
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 30
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人全长 IgG1 重链变体 1
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 31
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人全长 IgG1 轻链变体 1
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab 重链变体 2
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys
225
<210> 33
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab 轻链变体 2
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 34
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG4P 重链变体 2
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Ala Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Pro Asn His Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 35
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG4P 轻链变体 2
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 36
<211> 16654
<212> DNA
<213> 人
<400> 36
actcggtgcg ccttccgcgg accgggcgac ccagtgcacg gccgccgcgt cactctcggt 60
cccgctgacc ccgcgccgag ccccggcggc tctggccgcg gccgcactca gcgccacgcg 120
tcgaaagcgc aggccccgag gacccgccgc actgacaggt gagcgcggac gcacccggca 180
gggatgtgag tgggcggagg gaagagggcc gcaaaccaac ccaggacccg ctcagttcca 240
cgcgcggcag ccctccgtgc gcgcaggctc gggtgcgttg ttcgcggggg tgaattgtga 300
agaaccatcg cggggtcctt cctgctgagg ccgcggacac cgtgacctcg ctgctctggg 360
tctgcaggga aacgtaggaa aaaaagttgt caggagcggg caggatgacc cccacatccc 420
gtttccacct cccggaggcc cccgaacacg ctcctggtgc tggtggcagc agcgcctggc 480
agacgcgccc gcttagcgag ggcgcgaagt ccaggccgcc agagcgcagg agcatccgga 540
cctgctagtc ggccgctgac tgcgcggcga gttgccttga gagggtccca tgtgcttggg 600
gcgccgcgct gggtctgggg gcgtcttggg gcgcccattg gagtccgcgg gttggagcat 660
ccggagaatc catgatgtgt gcatttgccg atccccgagg tgagatggag actggcaagg 720
gcagagccgc tgtgttcagc cacagcggaa aaccgaacgg tgggtaatcc gacagctgcg 780
gtgcggggcg cggccctggc cgcggggtcc agcgaacccg cagtgctcac aaggcagaca 840
ccacacgcgc tcgcggaccg gccacgcact cgcgggcgct cgcttctcta ctccagcctc 900
ttccccgccc cgcgcacgcc cgagctgaat ggtagacgtt ctggcgccgg gcagcggcca 960
ccggctggtt cccacttccg cgcgcacccc ttaaactgtg ttctagaggc cccagcctcg 1020
ccttgcagcg cctcactagc tcctgaggac tagggactgg cggctgaggc gggttggcgg 1080
ctgcaacgag ctgggcgtct ttcgttctct ctcgctgcct ggctggctcc gctggcccct 1140
ccacagcttg cggagcaagg ccatagcagg ggagtgggag gtatattggg gctgtcacct 1200
ccttgctggc cggagttatt tgtagactac agactccgga agaacagacg cgccaccgct 1260
ctcgcttggc attgccttcg gatcgcagct cctccttggg ggtgccccag cttggcgttt 1320
atttgcctgc gccaggctct ggcgacggtc accgggccag gcggggaggg acggacggca 1380
ggtgaccagc ctctgctgtg aagaaattcc tgcgcgcccg gagctgtccc taatgcattc 1440
ccgggtcgaa tccgtctact gccttcccct cctcgaccga ctccgaatct cggctcttat 1500
agacagaaat acagcctcag cgttaggggt taaaatcccc ctcttaaacg gtccgagggc 1560
agagaggtga ccaccgatag gtaattggat ctcctgctgg aaagagcaaa tctgagcggt 1620
gtgcgcgtct gtttatgttc cccttcgaga tggtgccagg acacgaactg attaaaacaa 1680
tctattgtgt taagtgggtc actagggttt taagctgtcc cagggacccc agagtagtgg 1740
cttccttctg gctgtacaca caagttaaat aaatagcgta gaagaggtta agataacccc 1800
attctagggt gaggagtcct ctttcatccc tagggcttcc ccctcccctt ttctcttttt 1860
ttggaaggag ggggagcatg agagtcttga gggggggatg tacttttcaa agcaaggagg 1920
gaaagatctt aagaaaacta tatattctca ctgcccccca agccaagtct ataacagtag 1980
gtgatttgat tactatctct ggataaatgg cactgtcaaa ttgttaatat taactatttc 2040
agggattttt agcagggtag tggcagtatg tgtgcgtgtg tgtgtgtgtg tctgtgtgtg 2100
tgtgtttaac ctccaggtca ttgtaggaat tagagtcttt tgtaaacttt gtaatttcac 2160
aggtttccta ttttcttaaa agttcatttt tagtgaaatg ttttggtaac ccacgctctg 2220
taggaaatcc aggttggcta atgcggtctt tatgtgagta gttacacagg gaaggataaa 2280
aaccttttat gtcctacatc tctgaatgag ggctgcctac cctgtctttg aaactaagcc 2340
gaagatgcct tcagtctgaa tggtcaagta ttaaaagtga taaaatgcaa agaaatttca 2400
tgccgcagac acctccccca agaactgctt gttgacagca aagctgtgga acatgttcca 2460
caacagagag taaaggacag ccaggaaata taaacctttt atgtaaagga aaggcaggtg 2520
ggggacagtg gttaggggag gtgactgcag cctctaacca aaaggcaacc atcaggcaag 2580
tgctaccagc ccgtgtcttc gatctgcaag gaattttctt tagttttaac atatgctctt 2640
agaaattcaa agtacaacag gaattcctgg gacaagagaa atctttttat tcacatgtga 2700
acatgaagat acaaaataga taattatttt atttatagca ctcttcaaat tgtattgcat 2760
tagaaaacat atccattgac ccactgttaa ggacagcact gggtgtcaat aggacagtgg 2820
ttaaggacct gtgtttgggg ctagatagaa ttgggtttaa actgctggct gggctgggca 2880
cagtggctca caccggtaat cccagcactt tgggaggcca aggaggacgg atcacctgag 2940
gtcgggagtt cgacaccagc ctgaccaaca tggaaaaatc ccgtctctac taaaaacaca 3000
aaattagcca ggcatggtgg tgcatgcctg caatcccagc tacttgggag gctgaggcag 3060
gagaattgct tgaaaccggg aggcggaggt tgtggtgagc ccagatagcg ccattgcatt 3120
ccagcctggg caacacgagt gaaaactccg tcaaaaaaac aaaacaaaac aaacaaacaa 3180
aaaaatgctg gctttcccac ttatgagctg tgtgaccttg gacaaatttc caacttttct 3240
gagtgtagat tccctgattg gtaaaaggaa gatgatatta tctacctcat attttgttat 3300
gaaaaataaa tgataaaatt gggtcagaaa tcagcataat gcctggcaca gtaagggctt 3360
caaaataaaa ggtagctctt attattagta atggtgttag gaaaagtagc aatgttatac 3420
agaaccagga tatatcacag ggcagttctg aaattaaatc ctgaatcctg gccgggtgag 3480
gtggctcacg cttgtaatcc taagcacttt cggagactga ggcaggcgga tcacgaggtc 3540
aggagtttga gaccagcctg gccaacacac tgaaatcccg tctctactaa aaatacaaaa 3600
attagctggg tgtggtggca ggcgcctata atctcagcta cttgggaggc tgaggcagga 3660
gaatcacttg agcccaggag gcggaggttg cagtgagctg atatcgtgcc agtgcactcc 3720
agcctgggtg acatctctta aaaaaaaaaa tcctgaatac cacactacgc agtgactaac 3780
acatctttca ctacagaaca gaacctgtaa cttggccgtc tctcagcagt gctgctcagt 3840
gaacatttaa taatttatta ctttctaact cgtttcttgt tgacctcaag aattgtacat 3900
agtcattaac tttcctaaga aaatctttga caaacataga gctcctgaga tatttcacaa 3960
ccaggtggtc tcctccctgt cctatgcaat gttgggcccc agcctgattt agccgacctg 4020
gtcttcagac ttgagaggct gtttagggtt cttacaacac aaaggggatg agactttatc 4080
ctctacctgt gtgccaacaa gggattcttc ttatctcctt ggtgcaactt gtctgaaaaa 4140
gaaagtcaac acaattatct tcttaaaagt taaagatcaa attaaaaata agctatagtt 4200
ttcccaaaga tttagacctg agaaaaagga atagatcttt ctaaaacctg gcctgcactt 4260
agagcatttg tagtcacttc cactatttct tatgctgaga gaataatttg atgtcatgcc 4320
tattgaatgt ctttctaaag cttgattcat caggaggaac tgaccagaag tccatgcaca 4380
gacatttggc tttcactgta attcctactc aaaactccct ttcactgatt atgagcaggt 4440
tgcttagcta aaatgagaaa tacagcaaga agagggatgg aaagagctgg cttaaacttt 4500
cccaaagaca tcatgaacac tgggaacagg tcatacatat accattttta tttctcagtc 4560
ctcagtatta gaatattgtg ttcctagagg ctttgtgaaa attggaatac attgccatga 4620
cctgcacagg atagaggtgg ttaatatggc ttaccttgct tgtagatgtt tactcttgat 4680
ccctaaggga aactggaagg aaagcatgct gtagagagga cctgctttga gagtatgtgt 4740
cctctgggac aagtggaatg aaagagagga tagaggcaaa gagaaaaaaa ggtggagatg 4800
gggtgagact tgctggtgga cagttgcaaa gaaaactcat gatgagaata acatcacatt 4860
tcttgaagaa gctgaactgc attgatggga agttgaggca gagtttgaaa agaagatata 4920
ctgtctgcaa aaaagaatca acggagatgt caggtatctt gatgcaccct gagtctatga 4980
gatgcagctt aatttaattt aatgatatga gtaggccatt tcataagtgg tggaaattac 5040
cataaagtgt ttgcagctaa tgacggcgca tgaatgatgt cataggaacc taagtctgga 5100
tgagctatgg attgaatttt tactatggga cacccttcta catgttgctg tggaaaagaa 5160
ttgtcctcaa gaaatgtaca tcttctgcat ttcctctaca tctctgatat ttacaaagtg 5220
cacattattt ggtgatacta caactgggat ttcaagtgca catcactact atttccttca 5280
ctgaagaatc aagagcagtc tgggggtggg gagagcttga gtgattgaca aggatgtggc 5340
agagccctgg ttccactatg aattatagtt cttaccctgc ttactgtcac tcatgtagag 5400
cagctagtgt gcctcagagc actgctgttc tctgagaagc tgaggtctcg attgacattc 5460
ttgaagttgg tgtttacttc tctctgaata aacaaaggtt ggcaactcag acatcttaca 5520
ataagtacta aagatttttg aagaataggt ttttaaaaaa tgaaaaaaca tttcactttc 5580
catagctaat aaatcttatt ttgaggaaaa tgtacttttc tttaaaaaaa aaaaaagcct 5640
gtctgtcact ctagaccctt tggcttagaa ggtaggcaca ctcacataga aacagaaagt 5700
ctgtccaaat taaaactgaa aaccacagtt gactaatttt gaatttatag ctctgctgtt 5760
ggcttctgcg atagtattaa tttcaatggc ttcaattaga aaatgaaacc catagcattc 5820
catatgagaa caggtaaaaa gtcagggaca tttggagttt tccaagaaaa agaaagacaa 5880
gtcttaggaa gctctctagg atggaaggaa tttgccacac tgagagttag acatccaaag 5940
gatagcaatt ggctcttctg ctcatgggca ctggtgaagg cattttaaaa tgcgaagaat 6000
ggtacctctg taaatcaatg aggttcataa taatcatgca tttaccaaat ttttataagc 6060
acctgccttg tgccaggcac tgagggtaag gtgatgaata agccctcatc aactgtcaga 6120
ctagatattt actcaataac agatgtgaaa atgccaagaa ggaaaagttg agtataaaga 6180
aagccttaag ttggttcaga gaaataaaat tgcatttttc ggatagatgt ttatggaatc 6240
ggccttatga ggtaaacttg tcctatgcag tgaacataca ttcccagtta gtctcagatt 6300
ggcctctgtg atgacaaact cagagggtcc tggtctagga ggggtgaatt tgtctggagg 6360
ccattttcag gaggtatgga ggaagactgg ggcataggcc tggggccatc ccatgtactc 6420
ctcctctgaa atggggagca actgaattgt gttttatttt agatcttcgt ccaacttgaa 6480
taccagaaat tcgtgaaacc ttctcaaatt cacactatat tttgagacca ggagaaggct 6540
ccttgagaaa ttgccacact gtcttatcct agtctctgga aaaattcagt cctgtattat 6600
aactgggcgt ttctcataag tgcttttttt ttttcttttt ctttttataa tactttaagt 6660
tctgggatac atgtgcagaa tgtgcaggtt tgttacatag gtatacacgt gccatggtgg 6720
tttgctgcac ccatcaaccc atcatctaca ttaggtattt ctcctaatgc taccccttcc 6780
ctagcccccc acccctcgac aggccccagt gtttgatgtt cccctccctg tgtccatgtg 6840
ttctcattgt tcaactccca cttatgagtg agagcatgcg gtgtttggtt ttctgttcct 6900
gtgttagttt gctgagaatg atggtttttg gcttcatcca cgtccctgca aaggacatga 6960
actcatcctt tttatggctg catagtattc catggtgtat atgtgccaca tttgctttat 7020
ccagtctatc attgatgagc acttgggttg gctccaagtc tttgctatta tgactagtac 7080
tgcgataaac atgtgtatat gtgtctttat attagaatga tttataatcc tttaggtcta 7140
tacccagtaa taggattcct gggtcaaatg gtatttctgg ttctagatcc ttgaggaatt 7200
gccacactgt cttccacaac ggttgaacta atttacactc ccaccaacag tgtaaaagca 7260
ttcctatttc tccacatcct ctccaacatc tgttgtttcc tgactcttta atgacggcca 7320
ttctaactgg cgtgaaatgg tatctcattg tggttttgat ttgcatttct ctaatgacca 7380
ccgatgatga gctttttctc atatgtttgc tggccccata aatgtcttct tttgagaaat 7440
gtctgttcat atcctttgcc cactttttga tggggttgtt tgcttttttc ttgtaaattt 7500
gtttgagttc ctggtagatt ctggatatta gccctttgtc agatggatag actgcaaaaa 7560
ttttctccca ttctgtaggt tgcctgttca ctctgatggt agtttctttt gccatgcaga 7620
agctgtttag tttaattaga tccaatttgt cagttttggc ttttgttgcc attgcttttg 7680
gtgttttagt catgaagtct ttgcccatgc ctatgtcctg aattgtattg ccctggtttt 7740
cttctaggat ttttatggtt ttaggtctta catttaagtc tttaatccat cttgaattaa 7800
tttttgtata aggtgtaagg aaagggtcca gtttcagttt tctgcgtatg gctagccagt 7860
tttcccaacg ttatttatta aatagggaat cctttcccca ttgcttgttt ttgtcaggtt 7920
tgtcaaagat cagacggttg tagatgtgtg gtgttatttc tgaggcctct gttctgttcc 7980
attggtctgt atatctgctt tgataccagt accgtgctgt tttggttact gtagccttgt 8040
agtacagttt gaagtcaggt agcgtgatgc tttgttcttt ttgcttagga ttgtcttggc 8100
tatatgggct cttttttggt tctatatgaa atttaaagta gttttttcat agacatctat 8160
agaactctcc accccaaatc aacagaatat acattcttct cagtatcgca tcacacttat 8220
tctaaaatga ccacataatt agaagtaaaa cactcctcag caaatgcaaa aaacagaaat 8280
cctaacagtc tgtcagaccc cagtgcaatc aaattagaac tcaggattaa gaaacttact 8340
gaaaaccaca caactgcatg gaaactgaac aacctgctcc tgaatgacta ctgggtaaat 8400
aacaaaatta aggcagaaat aaataggttc tttgaaagaa atgagaacaa agacacaata 8460
taccagaatc tctgggacac agctaaagca gtgtttagag ggaaattgat agcactaaat 8520
gcccacagga gaaagcggga cagatctaaa atcgacaccc taatatcaca attaaaagaa 8580
ctagagaaac aagagcaaac aaattcaaaa gctagcagaa gacaagaaat aactaagatc 8640
agagcagaac tgaaggagat agagacacaa aaaacccttc aaaaaatcaa tgaatccagg 8700
agctgttttt ttttttttga aaagattaat gaaatagact gctagccaaa ctaataaagg 8760
agaaaagaga gaagaatcaa atagacaata gacacaataa aaagtgataa aggggatatc 8820
accactgatc ccacagaaat acaaactacc atcagagaat actataaaca cctctacgca 8880
aataaactag aaaattggga agaaatggat acattcctga acgcatacac cctcccaaga 8940
ctaaaccagg aagaagttga atccctgaat agaccaatag caagttctga aattgaggca 9000
gtaattagta gcctaccaac caaaaaaagc ccaggaccag acagattcac agccgaagtc 9060
taccagaggt acaaagagga gctagtacca ttccttctga aactattcca aacaatagaa 9120
aaagaaggac tcctccctaa ctcattttat gaggccagca tcatcctgat accaaaacct 9180
ggcagagaca caacataaag gaaattcagg ccaatatccc tgatgaacat tgatgtgaaa 9240
atcctcaata aaatactggc agcacatcaa aaagcttacc tgccatgatc aagttggctt 9300
catccctggg atgcaaggct ggttcaacat acgcaaatca ataaacgtaa tcaatcacat 9360
acacagaacc aatgacaaaa accacatgat tatctcaata gatgcagaaa aggccttcga 9420
taaaattcaa caccccttca atgctaagaa ctctcaataa actaggtatt gatgaaacat 9480
atctcaaaat aataagagtt atttatgaca aacccacagc cagtatcata ctgaatgggc 9540
aaaagctgga agcattccct ttgaaaaccg ccacaaggat gacttctctc accactccta 9600
ttcaacatac tattggaagt tctggccagg gcaagcaggc aagacaaata aataaagggt 9660
attcaaatag gaagagagga agtcaaattg tctctgtttg cagatgacat gattgtatat 9720
ttagaaaacc ccatcatctc agcccaaaat ctccttaagc tgataagcaa cttcagcaaa 9780
gtctcaggat acaaaatcaa tgtgcaaaaa tcacaagcat tcctatacac caataataga 9840
caaacagcca aatcatgagt gaactcccat tcacaagtgc tacaaagaat aaaataccta 9900
ggaatccaac ttacaaggga tgtgaaggac ctcttcaagg agaactacag accactgctc 9960
aaggtaataa gagaggacac aaacaaatgg aaaaacattc catgctcatg gataggaaga 10020
atcaatatta tgaaaatggc catactgccc aaaacaattt atagattcaa tgccatcccc 10080
atcaagctac cactgacttc cttcacagaa ttagaaaaaa actactttaa atttcatatg 10140
gaactgaaaa aagagccggt atagccaaga cgatcctaag caaaaagaaa aaagctggaa 10200
gcatcatgct acctgacttc aaactatact acaaggctac agtaacaaaa acagcatggt 10260
atagtataag tgcttttttt taaaagacaa agtaaagtaa tttttttgtt gttggggtaa 10320
aacaaaagct ctgcataaag agcagggatg ttgtaacata cactgaccaa aggtgggaaa 10380
cctacagttg gagcagaagc tgaatgtcac attatcagct ccgaacttat aatggtctaa 10440
aagtactagg ttaatgttgg aaagatggtg ccatttaaag atatcttaaa ttcaatattt 10500
aattatttta atttgacatt atcctagagt tgaatggtgt ttacttacca tgtgctgttc 10560
attagaaaat ctagatccta cactgccttt gcgcaaggta gttgctctaa taataccaac 10620
ctgtccagtt ttggtgggag aaataatgtt actgttaagt tgcacttagt ggttattatg 10680
tgtaatactg gtattccaaa gagagaagga aaatgtttgc tacacagctg tgttcttagg 10740
ttcagaaaac cacaggagtg ggacaggaga accttcagga ttcaggtccg attgttgtga 10800
tggccgcagg agggagactg tgaatttgaa actgcatcca ttgaaaagaa aatccctcca 10860
cactttaata attctctccg tgccccatgg cagcaagtgc ttataggcct tgctactcaa 10920
agcttaataa aaaggcagac ctgctgaatc ataatctgca tcttaacaat atccccagat 10980
attgtctgca ctttcttttt ttttttcttt ctttctttct tctttttttt gagacagagt 11040
ctcgctcagt cacccaggct ggagtgcagt ggcgcgatct cggctcactg caagctctga 11100
ctcccgggtt cacgccattc tcctgcctta gactcccgag tagctggcac tacaggcgcc 11160
cgccactacg cccggctaat ttttttgtat ttttagtaga gatggggttt caccgtgtta 11220
gccaggatgg tctcgatctc ctgacctcgt gatccgccgc ccatctgggc ctcccaaagt 11280
gctgggatta caggcgtgag ccactgcgcc cggccaattg tctgcacttt caagtctaag 11340
aagcactgtc ccaggaggaa aatcttttta gtctgaggct tctctcttgc actctccttt 11400
ttaaaaatat gctgctcctt ctccaccttt ccctcttctt ccgccttttc tgtctgcctt 11460
tactacctcc cctgaacatt caacttgtag aagagttccc ctttctctga attgcattct 11520
tcacttcatt cattcttttc tctctctgtc tatggtttcc tattttttgt cggttttccc 11580
tcacctcacc tccttgttat tttttgccat tgttcacata tcactgccct ttcagaccca 11640
tatctagctt ctgacccatc cactaatcca ttgccactaa tttattcagc atgcccatgc 11700
catttattaa tgtaaatatt tgcacatact tgttctatca tgcccatttt tctacctttt 11760
aaattgtata tacacagaca catgtgaatg acatatttca ctatttaaaa ggtagaaaaa 11820
tgtatatcgt ggtacaaagt gatacattga gtatctgtgc ccagtttcaa gatgagaata 11880
agtgagaggt gaagcctcat gagtcacgtc acctacacgc tactgtcttt cattccatct 11940
gcagtactgc cacacatttg gttagttctc caattgctgt cacattgaca tcgagttgga 12000
tctgaacagc gtacctgggg agacgaagta ttggtatctt tgcttaaatg gagtgattta 12060
ctgagagaca aagtgacatc tttaagatca gatagcaagt tactgcacca ggagcgcgac 12120
ctttcctgtt ttgttgtttt ccctctgtca aatgccttct ggtctccatg aatctctcct 12180
tccacatatg ataaaaatgc aaagtctcat aagcattcac agctcaggaa gcctcaggct 12240
agttggggag aaaagactgg gaggtttccg gaggaatgaa gtcctctgag cagagaggtt 12300
aattcatctt gctgtaaaac aaaatagaaa ataagttccc ctcaataagt gaacgtaata 12360
caaagacaaa tgtggttggt gccagaggcc aggaagaagt tcttgtgaga ataggtgcag 12420
agaagagcta ggccctggct gagtttaaac cttgacttag tcactgtggg actctgggtg 12480
agttactcca tggattgatg gctgggtcat ggagataata gtacctaatt catacaggta 12540
ctgtgagaag taaatggaat atttcacgtt aagtgtttaa cggtgcgttt aaatgctagg 12600
tgctattatt attaattttt aaattaactt tgccatgttt tgtgtcttcc cctctctgtg 12660
cttcctttct ttagtatgag ccgcacagcc tacacggtgg gagccctgct tctcctcttg 12720
gggaccctgc tgccggctgc tgaagggaaa aagaaagggt cccaaggtgc catccccccg 12780
ccagacaagg cccagcacaa tgactcagag cagactcagt cgccccagca gcctggctcc 12840
aggaaccggg ggcggggcca agggcggggc actgccatgc ccggggagga ggtgctggag 12900
tccagccaag aggccctgca tgtgacggag cgcaaatacc tgaagcgaga ctggtgcaaa 12960
acccagccgc ttaagcagac catccacgag gaaggctgca acagtcgcac catcatcaac 13020
cgcttctgtt acggccagtg caactctttc tacatcccca ggcacatccg gaaggaggaa 13080
ggttcctttc agtcctgctc cttctgcaag cccaagaaat tcactaccat gatggtcaca 13140
ctcaactgcc ctgaactaca gccacctacc aagaagaaga gagtcacacg tgtgaagcag 13200
tgtcgttgca tatccatcga tttggattaa gccaaatcca ggtgcaccca gcatgtccta 13260
ggaatgcagc cccaggaagt cccagaccta aaacaaccag attcttactt ggcttaaacc 13320
tagaggccag aagaaccccc agctgcctcc tggcaggagc ctgcttgtgc gtagttcgtg 13380
tgcatgagtg tggatgggtg cctgtgggtg tttttagaca ccagagaaaa cacagtctct 13440
gctagagagc actccctatt ttgtaaacat atctgcttta atggggatgt accagaaacc 13500
cacctcaccc cggctcacat ctaaaggggc ggggccgtgg tctggttctg actttgtgtt 13560
tttgtgccct cctggggacc agaatctcct ttcggaatga atgttcatgg aagaggctcc 13620
tctgagggca agagacctgt tttagtgctg cattcgacat ggaaaagtcc ttttaacctg 13680
tgcttgcatc ctcctttcct cctcctcctc acaatccatc tcttcttaag ttgatagtga 13740
ctatgtcagt ctaatctctt gtttgccaag gttcctaaat taattcactt aaccatgatg 13800
caaatgtttt tcattttgtg aagaccctcc agactctggg agaggctggt gtgggcaagg 13860
acaagcagga tagtggagtg agaaagggag ggtggagggt gaggccaaat caggtccagc 13920
aaaagtcagt agggacattg cagaagcttg aaaggccaat accagaacac aggctgatgc 13980
ttctgagaaa gtcttttcct agtatttaac agaacccaag tgaacagagg agaaatgaga 14040
ttgccagaaa gtgattaact ttggccgttg caatctgctc aaacctaaca ccaaactgaa 14100
aacataaata ctgaccactc ctatgttcgg acccaagcaa gttagctaaa ccaaaccaac 14160
tcctctgctt tgtccctcag gtggaaaaga gaggtagttt agaactctct gcataggggt 14220
gggaattaat caaaaaccgc agaggctgaa attcctaata cctttccttt atcgtggtta 14280
tagtcagctc atttccattc cactatttcc cataatgctt ctgagagcca ctaacttgat 14340
tgataaagat cctgcctctg ctgagtgtac ctgacagtag tctaagatga gagagtttag 14400
ggactactct gttttagcaa gagatatttt gggggtcttt ttgttttaac tattgtcagg 14460
agattgggct aaagagaaga cgacgagagt aaggaaataa agggaattgc ctctggctag 14520
agagtagtta ggtgttaata cctggtagag atgtaaggga tatgacctcc ctttctttat 14580
gtgctcactg aggatctgag gggaccctgt taggagagca tagcatcatg atgtattagc 14640
tgttcatctg ctactggttg gatggacata actattgtaa ctattcagta tttactggta 14700
ggcactgtcc tctgattaaa cttggcctac tggcaatggc tacttaggat tgatctaagg 14760
gccaaagtgc agggtgggtg aactttattg tactttggat ttggttaacc tgttttcttc 14820
aagcctgagg ttttatatac aaactccctg aatactcttt ttgccttgta tcttctcagc 14880
ctcctagcca agtcctatgt aatatggaaa acaaacactg cagacttgag attcagttgc 14940
cgatcaaggc tctggcattc agagaaccct tgcaactcga gaagctgttt ttatttcgtt 15000
tttgttttga tccagtgctc tcccatctaa caactaaaca ggagccattt caaggcggga 15060
gatattttaa acacccaaaa tgttgggtct gattttcaaa cttttaaact cactactgat 15120
gattctcacg ctaggcgaat ttgtccaaac acatagtgtg tgtgttttgt atacactgta 15180
tgaccccacc ccaaatcttt gtattgtcca cattctccaa caataaagca cagagtggat 15240
ttaattaagc acacaaatgc taaggcagaa ttttgagggt gggagagaag aaaagggaaa 15300
gaagctgaaa atgtaaaacc acaccaggga ggaaaaatga cattcagaac cagcaaacac 15360
tgaatttctc ttgttgtttt aactctgcca caagaatgca atttcgttaa cggagatgac 15420
ttaagttggc agcagtaatc ttcttttagg agcttgtacc acagtcttgc acataagtgc 15480
agatttggct caagtaaaga gaatttcctc aacactaact tcactgggat aatcagcagc 15540
gtaactaccc taaaagcata tcactagcca aagagggaaa tatctgttct tcttactgtg 15600
cctatattaa gactagtaca aatgtggtgt gtcttccaac tttcattgaa aatgccatat 15660
ctataccata ttttattcga gtcactgatg atgtaatgat atattttttc attattatag 15720
tagaatattt ttatggcaag atatttgtgg tcttgatcat acctattaaa ataatgccaa 15780
acaccaaata tgaattttat gatgtacact ttgtgcttgg cattaaaaga aaaaaacaca 15840
catcctggaa gtctgtaagt tgttttttgt tactgtaggt cttcaaagtt aagagtgtaa 15900
gtgaaaaatc tggaggagag gataatttcc actgtgtgga atgtgaatag ttaaatgaaa 15960
agttatggtt atttaatgta attattactt caaatccttt ggtcactgtg atttcaagca 16020
tgttttcttt ttctccttta tatgactttc tctgagttgg gcaaagaaga agctgacaca 16080
ccgtatgttg ttagagtctt ttatctggtc aggggaaaca aaatcttgac ccagctgaac 16140
atgtcttcct gagtcagtgc ctgaatcttt attttttaaa ttgaatgttc cttaaaggtt 16200
aacatttcta aagcaatatt aagaaagact ttaaatgtta ttttggaaga cttacgatgc 16260
atgtatacaa acgaatagca gataatgatg actagttcac acataaagtc cttttaagga 16320
gaaaatctaa aatgaaaagt ggataaacag aacatttata agtgatcagt taatgcctaa 16380
gagtgaaagt agttctattg acattcctca agatatttaa tatcaactgc attatgtatt 16440
atgtctgctt aaatcattta aaaacggcaa agaattatat agactatgag gtaccttgct 16500
gtgtaggagg atgaaagggg agttgatagt ctcataaaac taatttggct tcaagtttca 16560
tgaatctgta actagaattt aattttcacc ccaataatgt tctatatagc ctttgctaaa 16620
gagcaactaa taaattaaac ctattctttc tgtg 16654
<210> 37
<211> 555
<212> DNA
<213> 人
<400> 37
atgagccgca cagcctacac ggtgggagcc ctgcttctcc tcttggggac cctgctgccg 60
gctgctgaag ggaaaaagaa agggtcccaa ggtgccatcc ccccgccaga caaggcccag 120
cacaatgact cagagcagac tcagtcgccc cagcagcctg gctccaggaa ccgggggcgg 180
ggccaagggc ggggcactgc catgcccggg gaggaggtgc tggagtccag ccaagaggcc 240
ctgcatgtga cggagcgcaa atacctgaag cgagactggt gcaaaaccca gccgcttaag 300
cagaccatcc acgaggaagg ctgcaacagt cgcaccatca tcaaccgctt ctgttacggc 360
cagtgcaact ctttctacat ccccaggcac atccggaagg aggaaggttc ctttcagtcc 420
tgctccttct gcaagcccaa gaaattcact accatgatgg tcacactcaa ctgccctgaa 480
ctacagccac ctaccaagaa gaagagagtc acacgtgtga agcagtgtcg ttgcatatcc 540
atcgatttgg attaa 555
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Grem1正向引物
<400> 38
gcgcaagtat ctgaagcgag 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Grem1反向引物
<400> 39
cggttgatga tagtgcggct 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 Grem1正向引物
<400> 40
aggcccagca caatgactca g 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 Grem1反向引物
<400> 41
gtctcgcttc aggtatttgc g 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白正向引物
<400> 42
gatcattgct cctcctgagc 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白反向引物
<400> 43
gtcatagtcc gcctagaagc at 22

Claims (50)

1.用于治疗或预防癌症的方法中的抗GREM1拮抗剂。
2.根据权利要求1所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是实体癌。
3.根据权利要求1或2所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症具有基质GREM1过表达。
4.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症选自结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、肝癌、脾癌、骨癌和骨肉瘤。
5.根据权利要求4所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是结肠直肠癌。
6.根据权利要求5所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述结肠直肠癌是间充质亚型结肠直肠癌。
7.根据权利要求4所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
8.根据权利要求4所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是乳腺癌。
9.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症具有上皮GREM1过表达。
10.根据权利要求9所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是GREM1引发的癌症。
11.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是扩散性癌症。
12.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述癌症是已确立的癌症，任选地，其中所述已确立的癌症是已确立的结肠直肠癌。
13.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂是肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、小分子抑制剂或小发夹RNA(shRNA)。
14.根据权利要求13所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂是结合Gremlin-1上的表位的抗体，所述表位包含选自Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175的至少一个残基，其中所述残基编号根据SEQ ID NO:1。
15.根据权利要求14所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗体结合包含Ile131、Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175的所有残基的表位。
16.根据权利要求14或15所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中Lys147、Lys148、Phe149、Thr150、Thr151、Arg169、Lys174和Gln175位于同一个Gremlin-1单体上，Ile131位于第二个Gremlin-1单体上。
17.根据权利要求13所述使用的抗GREML 1拮抗剂，其中所述拮抗剂是抗Gremlin-1抗体，其包含在SEQ ID NO:10或12的重链可变区(HCVR)内含有的重链互补决定区(HCDR)序列和/或在SEQ ID NO:11或13的轻链可变区(LCVR)内含有的轻链互补决定区(LCDR)序列。
18.根据权利要求13所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂是抗Gremlin-1抗体，其包含选自SEQ ID NO:3、4、5和6的至少一个HCDR序列和/或选自SEQ ID NO:7、8和9的至少一个LCDR序列。
19.根据权利要求18所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含SEQID NO:6的HCDR3序列。
20.根据权利要求18或19所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含选自SEQ ID NO:4/5/6/或选自SEQ ID NO:3/5/6的HCDR1/HCDR2/HCDR3序列组合和/或选自SEQ ID NO:7/8/9的LCDR1/LCDR2/LCDR3序列组合。
21.根据权利要求18至20中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含SEQ ID NO:4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO:3/5/6/7/8/9的HCDR 1/HCDR 2/HCDR 3/LCDR 1/LCDR 2/LCDR3序列组合。
22.根据权利要求18至21中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含SEQ ID NO:10或12的重链可变区(HCVR)序列和/或SEQ ID NO:11或13的轻链可变区(LCVR)序列，或与其至少95％相同的序列。
23.根据权利要求22所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含SEQID NO:10/11或12/13的HCVR和LCVR序列对或与其至少95％相同的序列。
24.根据权利要求23所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含由SEQID NO:4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO:3/5/6/7/8/9组成的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列，HCVR和LCVR的其余序列分别与SEQ ID NO:10、11、12和/或13具有至少95％的同一性。
25.根据权利要求22-24中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含SEQ ID NO:14、16、18、22、28、30、32或34的重链和/或SEQ ID NO:15、17、19、23、29、31、33或35的轻链，或与其至少95％相同的序列。
26.根据权利要求25所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗Gremlin-1抗体包含SEQID NO:14/15、16/17、18/19、22/23、28/29或30/31、32/33、34/35的重链和轻链对，或与其至少95％相同的序列。
27.根据权利要求26所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述抗体的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3序列由SEQ ID NO:4/5/6/7/8/9或SEQ ID NO:3/5/6/7/8/9组成，重链和轻链的其余部分分别与SEQ ID NO:14、15、16和/或17具有至少95％的同一性。
28.根据权利要求13所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂是与权利要求15-25中任一项所限定的抗体竞争结合Gremlin-1的抗体。
29.根据权利要求13所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂是与权利要求15-25中任一项所限定的抗体结合Gremlin-1上的相同表位的抗体。
30.根据权利要求13-29中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂抗体是嵌合的、人的或人源化的抗体。
31.根据权利要求13-30中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂抗体是Fab、修饰的Fab、Fab’、修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体或scFv。
32.根据权利要求13所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂是编码如权利要求14-31中任一项所限定的抗体的多核苷酸，或携带所述多核苷酸的表达载体。
33.根据权利要求13-31中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述拮抗剂抗体包含在进一步含有药学上可接受的佐剂和/或运载体的药物组合物中。
34.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述方法包括分别、顺序或同时施用另外的抗癌剂。
35.根据权利要求34所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述另外的抗癌剂是化学治疗剂。
36.根据前述权利要求中任一项所述使用的抗GREM1拮抗剂，其中所述方法包括分别、顺序或同时放射治疗。
37.一种在治疗癌症的方法中使用的抗癌剂，其中所述方法包括分别、顺序或同时施用抗GREM1拮抗剂。
38.根据权利要求37所述使用的抗癌剂，其中所述抗癌剂是化学治疗剂。
39.根据权利要求37或38所述使用的抗癌剂，其中所述癌症、所述拮抗剂和/或所述方法如权利要求1-34中任一项所限定。
40.治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗GREM1拮抗剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述癌症、所述拮抗剂和/或所述方法如权利要求1-35中任一项所限定。
42.包含抗GREM1拮抗剂和另外的抗癌剂的组合物或试剂盒。
43.根据权利要求42所述的组合物或试剂盒，其中抗GREM1拮抗剂是如权利要求13-32中任一项所限定的。
44.根据权利要求42或43所述的组合物或试剂盒，其中所述另外的抗癌剂是化学治疗剂。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述抗癌剂或化学治疗剂适于结肠直肠癌的治疗，任选地选自5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、亚叶酸、西妥昔单抗、纳武利尤单抗或贝伐单抗。
46.根据权利要求42至44中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述抗癌剂或化学治疗剂适于多发性骨髓瘤的治疗，任选地选自抗CD38抗体(如达雷木单抗)、抗SLAMF7抗体(如艾洛珠单抗)、抗IL-6抗体(如司妥昔单抗)、或硼替佐米或iMID(来那度胺/pomalenomide)或其类似物。
47.用于检测患者中癌症的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，其中GREM1的基质过表达表明患者患有癌症。
48.用于预测患者中癌症预后的方法，该方法包括确定所述癌症是否包含GREM1的基质过表达，其中所述癌症中GREM1的基质过表达表明相比于GREM1的正常基质表达的情况，患者的预后更差。
49.用于确定患有癌症或疑似患有癌症或处于患癌症风险中的患者是否可能对化学治疗剂的治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，从而预测患者是否可能对化学治疗剂的治疗有应答。
50.用于确定患有癌症或疑似患有癌症或处于患癌症风险中的患者是否可能对GREM1拮抗剂的治疗有应答的方法，该方法包括测量患者中GREM1的基质表达，从而预测患者是否可能对GREM1拮抗剂的治疗有应答。
CN201980041089.7A 2018-06-18 2019-06-18 用于预防和治疗癌症的gremlin-1拮抗剂 Pending CN112533632A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1809946.5 2018-06-18
GBGB1809946.5A GB201809946D0 (en) 2018-06-18 2018-06-18 Prevention and treatment of cancer
GBGB1815694.3A GB201815694D0 (en) 2018-09-26 2018-09-26 Prevention and treatment of cancer
GB1815694.3 2018-09-26
PCT/GB2019/051699 WO2019243801A1 (en) 2018-06-18 2019-06-18 Gremlin-1 antagonist for the prevention and treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112533632A true CN112533632A (zh) 2021-03-19

Family

ID=67107908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980041089.7A Pending CN112533632A (zh) 2018-06-18 2019-06-18 用于预防和治疗癌症的gremlin-1拮抗剂

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20210253688A1 (zh)
EP (1) EP3806898A1 (zh)
JP (1) JP2021528400A (zh)
KR (1) KR20210028191A (zh)
CN (1) CN112533632A (zh)
AU (1) AU2019289176A1 (zh)
BR (1) BR112020025661A2 (zh)
CA (1) CA3102743A1 (zh)
CL (1) CL2020003249A1 (zh)
CO (1) CO2020015923A2 (zh)
IL (1) IL279347A (zh)
MX (1) MX2020013808A (zh)
SG (1) SG11202012312UA (zh)
WO (1) WO2019243801A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201621635D0 (en) 2016-12-19 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Crystal structure
GB201802486D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Ucb Biopharma Sprl Methods
EP4232475A1 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
CA3208455A1 (en) * 2021-01-18 2022-07-21 Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. Novel anti-gremlin1 antibodies
CA3213121A1 (en) * 2021-03-11 2022-09-15 Shanghai Jiao Tong University Method of treating diseases using gremlin1 antagonists
GB202205200D0 (en) 2022-04-08 2022-05-25 Ucb Biopharma Sprl Combination with chemotherapy
GB202205203D0 (en) 2022-04-08 2022-05-25 UCB Biopharma SRL Combination with inhibitor
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090041757A1 (en) * 2007-03-16 2009-02-12 Hanson Zhen Bone morphogenetic protein antagonist and uses thereof
CN104321342A (zh) * 2012-03-15 2015-01-28 首尔大学校产学协力团 Gremlin-1抗体
CN105085489A (zh) * 2014-11-05 2015-11-25 上海页岩科技有限公司 嘧啶或吡啶类化合物、其制备方法和医药用途
CN105189548A (zh) * 2013-03-14 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 Grem1的人抗体
CN106687454A (zh) * 2014-07-24 2017-05-17 贝达医药公司 作为细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)抑制剂的2h‑吲唑衍生物及其医疗用途
CN108024993A (zh) * 2014-12-11 2018-05-11 贝达医药公司 取代的2-苯胺基嘧啶衍生物及其作为表皮生长因子受体调节剂
WO2018232235A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 Beta Pharma, Inc. Pharmaceutical formulations of n-(2-(2-(dimethylamino)ethoxy)-4-methoxy-5-((4-(1-methyl-1h-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)phenyl)acrylamide and salts thereof
WO2019148161A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 Beta Pharma, Inc. 2h-indazole derivatives as cdk4 and cdk6 inhibitors and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1541682A3 (en) 1988-09-02 2005-07-06 Dyax Corp. Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
GB9113120D0 (en) 1991-06-18 1991-08-07 Kodak Ltd Photographic processing apparatus
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU696293B2 (en) 1993-12-08 1998-09-03 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
AU2002243495A1 (en) 2001-01-12 2002-07-24 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US7993864B2 (en) 2002-12-03 2011-08-09 Ucb Pharma S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
PL1644412T5 (pl) 2003-07-01 2019-01-31 Ucb Biopharma Sprl Modyfikowane fragmenty Fab przeciwciała
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
US20090203041A1 (en) 2006-04-21 2009-08-13 Wei Shi Bmp4 inhibitors
ES2622460T3 (es) 2007-09-26 2017-07-06 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
GB201621635D0 (en) * 2016-12-19 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Crystal structure

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090041757A1 (en) * 2007-03-16 2009-02-12 Hanson Zhen Bone morphogenetic protein antagonist and uses thereof
CN104321342A (zh) * 2012-03-15 2015-01-28 首尔大学校产学协力团 Gremlin-1抗体
CN105189548A (zh) * 2013-03-14 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 Grem1的人抗体
CN106687454A (zh) * 2014-07-24 2017-05-17 贝达医药公司 作为细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)抑制剂的2h‑吲唑衍生物及其医疗用途
CN105085489A (zh) * 2014-11-05 2015-11-25 上海页岩科技有限公司 嘧啶或吡啶类化合物、其制备方法和医药用途
CN108024993A (zh) * 2014-12-11 2018-05-11 贝达医药公司 取代的2-苯胺基嘧啶衍生物及其作为表皮生长因子受体调节剂
WO2018232235A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 Beta Pharma, Inc. Pharmaceutical formulations of n-(2-(2-(dimethylamino)ethoxy)-4-methoxy-5-((4-(1-methyl-1h-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)phenyl)acrylamide and salts thereof
WO2019148161A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 Beta Pharma, Inc. 2h-indazole derivatives as cdk4 and cdk6 inhibitors and therapeutic uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX2020013808A (es) 2021-05-27
EP3806898A1 (en) 2021-04-21
IL279347A (en) 2021-01-31
CO2020015923A2 (es) 2021-05-10
SG11202012312UA (en) 2021-01-28
CA3102743A1 (en) 2019-12-26
WO2019243801A1 (en) 2019-12-26
KR20210028191A (ko) 2021-03-11
US20210253688A1 (en) 2021-08-19
AU2019289176A1 (en) 2020-12-24
BR112020025661A2 (pt) 2021-03-23
JP2021528400A (ja) 2021-10-21
CL2020003249A1 (es) 2021-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112533632A (zh) 用于预防和治疗癌症的gremlin-1拮抗剂
JP7256127B2 (ja) がんのための診断及び治療方法
US8044179B2 (en) Methods and compositions for modulating tumor cell activity
JP7410211B2 (ja) 望ましくない細胞増殖に関係する疾患の処置のための薬剤
US11485787B2 (en) Agents that modulate RGMb-neogenin-BMP signaling and methods of use thereof
KR20190015408A (ko) 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-pd-1 항체
US20150362496A1 (en) Methods and products for in vitro diagnosis, in vitro prognosis and the development of drugs against invasive carcinomas
US11859006B2 (en) Method of treating ectopic ossification or diffuse intrinsic pontine glioma in a subject by administering an anti-ALK2 antibody
KR20170005016A (ko) MiT 바이오마커 및 그의 사용 방법
KR20210079311A (ko) 육종성 신장암에 대한 진단과 치료 방법
US20230272098A1 (en) Methods, systems, and kits for treatment of inflammatory diseases targeting tl1a
KR20180085723A (ko) 인간화 항-dkk2 항체 및 이의 용도
US11623951B2 (en) Antibodies to R-spondin 3
WO2023194584A1 (en) Combination of a gremlin-1 antagonist with a cytidine analogue or deoxycytidine analogue
US20140363448A1 (en) Cdcp1 and breast cancer
WO2023194583A1 (en) Combination of a gremlin-1 antagonist with an inhibitor of ras-raf-mek-erk signalling
US11254739B2 (en) Anti-human migration stimulating factor (MSF) and uses thereof
WO2024079074A1 (en) ANTI-sCD146 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2022241297A2 (en) Combination therapy for treatment of tumors comprising cancer-associated fibroblasts
JP2023510270A (ja) 進行性骨化性線維異形成症の治療
WO2014043331A2 (en) Specific phospho-forms of elk-1 as biomarkers and therapeutic targets for cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination