EA013470B1 - Терапевтические агенты на основе токсичных пептидов - Google Patents

Терапевтические агенты на основе токсичных пептидов Download PDF

Info

Publication number
EA013470B1
EA013470B1 EA200702313A EA200702313A EA013470B1 EA 013470 B1 EA013470 B1 EA 013470B1 EA 200702313 A EA200702313 A EA 200702313A EA 200702313 A EA200702313 A EA 200702313A EA 013470 B1 EA013470 B1 EA 013470B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
amino acid
composition according
domain
cells
Prior art date
Application number
EA200702313A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200702313A1 (ru
Inventor
Джон К. Салливан
Джозеф Дж. Макгиверн
Лесли П. Миранда
Хунг Кью. Нгуэн
Кеннет В. Уокер
Шоу-Фен Силвия Хью
Колин В. мл. Гегг
Стефан Л. Макдоноу
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA200702313A1 publication Critical patent/EA200702313A1/ru
Publication of EA013470B1 publication Critical patent/EA013470B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Раскрывается состав формулы (I)и его мультимеры, в которых Fи Fобозначают частицы, продлевающие период полужизни, a d и е, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из d и е обозначает 1; X, Xи X, каждый независимо, обозначает -(L)-P-(L)-, a f и g, каждый независимо, обозначают 0 или 1; Р обозначает токсичный пептид протяженностью не более примерно 80 аминокислотных остатков, содержащий по меньшей мере две внутрипептидные дисульфидные связи; L обозначает необязательный линкер; a a, b и с, каждый независимо, обозначает 0 или 1, при условии, что a, b и с обозначают 1. Связывание с частицей (или с частицами), продлевающей (или продлевающими) период полужизни, повышает in vivo период полужизни токсичного пептида, который в противном случае быстро разрушился бы. Фармацевтическая композиция содержит состав и фармацевтически приемлемый носитель. Также раскрывается ДНК, кодирующая состав по изобретению, экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, и клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор. Также раскрываются способы лечения аутоиммунного заболевания, такого, но без ограничения, как рассеянный склероз, типа 1 диабет, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астма, аллергия, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермия, гломерулонефрит, синдром Шегрена, воспалительная резорбция кости, отторжение трансплантата, болезнь трансплантат-против-хозяина и волчанка, и предупреждения или подавления рецидива симптома рассеянного склероза.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биохимии, в частности к терапевтическим пептидам и конъюгатам.
Уровень техники
Ионные каналы представляют собой группу молекул, которые содействуют обмену малых неорганических ионов при прохождении через мембраны. Всем клеткам для функционирования требуются ионные каналы, но это особенно справедливо для возбудимых клеток, таких как клетки нервной системы и сердца. Электрические сигналы, управляемые ионньми каналами, контролируют процесс мышления, сердечные сокращения и сокращение мышц. Ионные каналы участвуют в регуляции клеточного объема и контролируют разнообразные процессы передачи сигнала.
Семейство ионных каналов включает катионные каналы Να'. К+ и Са2+ и анионные каналы С1-. В целом ионные каналы различаются на лигандзависимые (лигандуправляемые) или потенциалзависимые (потенциалуправляемые) каналы. Лигандзависимые каналы включают как внеклеточные, так и внутриклеточные лигандзависимые каналы. Внеклеточные лигандзависимые каналы включают никотиновый ацетилхолиновый рецептор (пАСИВ), рецепторы серотонина (5-гидрокситриптамин, 5-НТ), рецепторы глицина и γ-аминомасляной кислоты (САБА, ГАМК) и активируемые глутаматом каналы, включая капаю, а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовые рецепторы (АМРА) и Ν-метил-Эаспартатные (ΝΜΌΛ) рецепторы. (Найе апй ϋιιζοιιηίδ (2002), ГЕВБ Ьей. 514: 129-34). Внеклеточные лигандзависимые каналы включают каналы, активируемые циклическими нуклеотидами (например, сАМР, сСМР), Са2+ и С-белками. (Найе апй ϋιιζοιιηίδ (2002), ГЕВБ Ьей. 514: 129-34). Потенциалзависимые ионные каналы классифицируют по их селективности по отношению к неорганическим ионам, включая натриевые, калиевые, кальциевые и хлорионные каналы (Найе апй ϋιιζοιιηίδ (2002), ГЕВБ Ьей. 514: 129-34).
Недавно была представлена унифицированная номенклатура для классификации потенциалзависимые каналов (Сайегай е! а1. (2000), РИагшасок Веу. 55: 573-4; Си1шап е! а1. (2000), РИагшасок Веу. 55, 5836; Сайегай е! а1. (2000), РИагшасок Веу. 55: 579-81; Сайегай е! а1. (2000), РИагшасок Веу. 55: 575-8; Ноктапп е! а1. (2000), РИагтасок Веу. 55: 587-9; С1арИат е! а1. (2000), Рйагтасо1 Веу. 55: 591-6; Сйаийу (1991), №!иге 352: 26; Со1бш е! а1. (2000), ΝΝίιιόιι 28: 365-8; Ейе1 е! а1. (2000), №игоп 25: 533-5).
К' каналы составляют самое большое и лучше всего охарактеризованное семейство ионных каналов, описанное до настоящего времени. Калиевые каналы подразделяются на три основные группы: 6 трансмембранных (6ТМ) К+ каналов, 2ТМ-2ТМ/1еак (проницаемые) К+ каналы и 2ТМ/КЙ каналы, пропускающие ионы внутрь клетки (Тапд е! а1. (2004), Апп. Веу. Рйу8ю1. 66, 131-159). Эти три группы подразделяются далее на семейства на основании подобия последовательностей. Потенциалзависимые К+ каналы, включая (Ку 1-6, Ку8-9), ЕАС, КЦТ и Б1о (ВКСа), являются членами семейства 6ТМ группы. Группа 2ТМ-2ТМ включает ТХУПС ТВЕК, ТАБК, ТВААК и ТН1К, тогда как группа 2ТМ/КЙ состоит из КМ-7. Два дополнительных класса ионных каналов включают калиевые каналы, пропускающие ионы внутрь клетки (1ВК, аномально выпрямляющие), и АТР-зависимые пуринергические (Р2Х) каналы. (Найе аий О^оишз (2002), ГЕВБ Ьей. 514: 129-34).
Токсичные пептиды, продуцируемые различными организмами, выделяются в намеченные (целевые) ионные каналы. Змеи, скорпионы, пауки, пчелы, улитки и актинии представляют собой немногие примеры организмов, которые вырабатывают яд, который может служить в виде источника, богатого малыми биоактивными токсичными пептидами, или токсинами, которые активно и селективно нацелены на ионные каналы и рецепторы. В большинстве случаев эти токсичные пептиды проявляют себя как мощные антагонисты или ингибиторы ионных каналов, связываясь с порой канала и физически блокируя путь ионной проводимости. В некоторых других случаях, как в случае пептидов токсина тарантула, найдено, что пептид противодействует функции канала, связываясь с областью вне поры (например, с сенсорным доменом потенциалзависимого канала).
Токсичные пептиды обычно расположены, примерно, между 20 и 80 аминокислотами в длину, содержат 2-5 дисульфидных связей и образуют очень компактную структуру (см., например, фиг. 10). Токсичные пептиды (например, яда скорпионов, актиний и улиток с колпачковидной раковиной) были выделены и охарактеризованы по их воздействию на ионные каналы. Очевидно, такие пептиды выделяются из относительно малого числа структурных скелетов (остовов), которые особенно подходят для решения важных вопросов активности (эффективности) и стабильности. Большинство токсичных пептидов токсинов скорпиона и улиток с колпачковидной раковиной (Соииз) содержат, например, 10-40 аминокислот и до пяти дисульфидных связей, образующих чрезвычайно компактную и напряженную структуру (микропротеины), часто устойчивые к протеолизу. Пептиды конотоксина и токсинов скорпиона можно разделить на ряд суперсемейств на основании их дисульфидных связей и пептидных складок. Разрешение структуры многих из них сделано методом ЯМР-спектроскопии, этот метод иллюстрирует их компактную структуру и подтверждает сохранение их семейной складки (например, Тийог е! а1., 1ош8айои Ьейауюиг апй зо1и!юп ргорегйез ок !Ие ро!а88шт-сйаппе1 Ь1оскег БИК !охш, Еиг. 1. Вюсйет. 251(1-2): 133-41 (1998); РепшпЦоп е! а1., Во1е ок Фзийгйе Ьопйз т 1йе 8йис!иге апй ро!а88шт сИаппе1 Ыоскйщ асйуйу ок БИК !ох1п, Вюсйет. 38(44): 14549-58 (1999); 1агауше е! а1., Тйгее-й1теи8юпа1 8йис!иге ок !охт ОБК1 кгот
- 1 013470
ОйНосННик ксгоЫси1окик ксогрюп уепот, ВюсНет. 36(6): 1223-32 (1997); йе1 Вю-РойШо е( а1.; ΝΜΚ. ко1иИоп к(гис(иге οί Сп12, а поте1 рерОйе Ггот (Не Мехкап ксогрюп Сейгтшйек похшк \νί(1ι а (урка1 Ье(а-(охт кес.|иепсе Ни! \νί(1ι а1рНа-Нке рНукю1одка1 асйуйу, Еиг. 1. ВюсНет. 271(12): 2504-16 (2004); РгосНпккаСНа1иГоиг е( а1.. 8о1и!1оп к(гис(иге оГ йксгерт. а пе\\' К+-сНаппе1 Ь1оск1пд рерНйе Ггот (Не а1рНа- КТх15 киЬГатПу. ВюсНет. 45(6): 1795-1804 (2006)).
Консервативные дисульфидные структуры могут также отражать индивидуальную фармакологическую активность семейства токсинов (№ске е( а1. (2004). Еиг. 1. ВюсНет. 271: 2305-19. табл. 1; Айатк (1999). Эгид Эете1ор. Век. 46: 219-34). Например. α-конотоксины имеют отчетливые структуры: четыре остатка цистеина/две петли. образуемые дисульфидными связями (БопдНпап. 2004). ингибируют никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. Напротив. ω-конотоксины имеют консенсусные структуры: шесть остатков цистеина/три петли. образуемые дисульфидными связями (№е1кеп. 2000). блокируют кальциевые каналы. На фиг. 9 показано. что ограниченное число консервативных дисульфидных структур. являющееся общим для разнообразных ядовитых животных от пчелы до улитки и от скорпиона до змеи. нацелено на ионные каналы. На фиг. 7А-В показано выравнивание альфа-токсина семейства скорпионов и демонстрируется. что консервативный структурный остов (скелет. каркас) используется для образования токсинов. нацеленных на множество калиевых каналов.
Благодаря своей эффективной и селективной блокаде специфических ионных каналов токсичные пептиды в течение многих лет использовались в качестве инструмента для исследования фармакологии ионных каналов. Ионные каналы клеток и тканей. отличных от возбудимых клеток и тканей. таких как клетки сердца. мышц и мозга. также важны для невозбудимых клеток. таких как иммунные клетки. Поэтому рассматривалась возможная терапевтическая полезность токсичных пептидов для лечения различных иммунных заболеваний. в частности. с помощью ингибирования калиевых каналов. таких как Κν1.3 и 1КСа1. так как эти каналы опосредованно регулируют путь передачи сигнала кальция в лимфоцитах [например. Кет е( а1.. 8НК ίοχίπ сотрокйюпк апй те(Нойк οί ике. патент США Νο. 6077680; ЬеЬгип е( а1.. №игорерНйек опдтаОпд ш ксогрюп. патент США Νο. 6689749; Вее(оп е( а1.. Тагдейпд еГГес(ог тетогу Т се11к \νί(1ι а кексНте рерОйе шЫЬйог οί Βν1.3 сНаппе1к Гог (Негару οί аи(ойппшпе йкеакек. Мо1ес. РНагтасо1. 67(4): 1369-81 (2005); МоиНа( е( а1.. К+ сНаппе1 (урек (агде(ей Ьу куп(Не(к О8К1. а (охт Ггот Ог(1юсННак ксгоЫси1окик ксогрюп νеποт. ВюсНет. 1. 385: 95-104 (2005); МоиНа( е( а1.. РНагтасо1одка1 ргоГШпд оГ Ог(Носкгик ксгоЫси1окик 1охш 1 апа1одк \νί(1ι а (пттей №(егтта1 йотат. Мо1ес. РНагтасо1. 69:354-62 (2006); МоиНа( е( а1.. ОкК1 йептаНтек. Международная заявка на патент АО 2006/002850 А2; В.8. 1епкеп е( а1. ТНе Са2'-ас(1та(ей К+ СНаппе1 оГ 1п(егтей1а(е Сопйис(апсе: А Мо1еси1аг Тагде( Гог №те1 Тгеа(теп(к? Сиггеп( Эгад Тагде(к 2: 401-422 (2001); Ваиег е( а1.. 8(гис(т'е-дшйей ТгапкГогтаРоп оГ СНагуЬйоФхт У1е1йк ап Апа1од ТНа( 8е1ес(1те1у Тагде(к Са:'-асОта(ей отег Уо1(аде-да(ей К+ СНаппе1к. 1. Вю1. СНет. 275: 12011208 (2000); Сак(1е е( а1.. Маиго(охт: А Ро(еп( 1пЫЬйог оГ 1п(егтей1а(е Сопйис(апсе Са:'-Ас(1та(ей Ро(аккшт СНаппе1к. Мо1еси1аг РНагтасо1. 63: 409-418 (2003); СНапйу е( а1.. К+ сНаппе1к ак (агде(к Гог креаПс 1ттипотойи1а(юп. Тгепйк т РНагтасо1. 8с1епсек 25: 280-289 (2004); Бетак & Сагаа. ТНегареийс Ро(епРа1 оГ Уепот РерОйек. №1. Вет. Эгид Э1ксот. 2: 790-802 (2003)].
Были также созданы низкомолекулярные ингибиторы калиевых каналов Βν1.3 и 1КСа1 и входа кальция в основной кальциевый канал в Т клетках. СВАС. для лечения иммунных нарушений [А. 8сНтНх е! а1. (2005) Мо1еси1. РНагтасо1. 68. 1254; К.С. СНапйу е! а1. (2004) Т1Р8 25. 280; Н. Аи1ГГ е! а1. (2001) 1. Вю1. СНет. 276. 32040; С ΖΗ1 е( а1. (2004) 1. Вю1. СНет. 279. 12427]. но затруднительно получить малые молекулы с селективностью к некоторым из этих мишеней.
Известно. что мобилизация кальция в лимфоцитах является важным метаболическим путем при активации воспалительных реакций [М.А. Атк1о\у е( а1. (2003) Сштеп1 Ор1шоп 1ттипо1. 15. 299]. По сравнению с другими клетками Т клетки проявляют уникальную чувствительность к повышенным уровням внутриклеточного кальция. и ионные каналы. как непосредственно. так и опосредованно. контролируют этот процесс. Инозиттрифосфат (ΙΡ3) представляет собой природный вторичный мессенджер. который активирует пути передачи кальциевого сигнала. ΙΡ3 продуцируется после лиганд-индуцированной активации Т клеточного рецептора (ТСВ) и при связывании со своим внеклеточным рецептором (канал) вызывает разгрузку запасов внутриклеточного кальция. Эндоплазматический ретикулум обеспечивает один важнейший запас кальция. Тапсигаргин. ингибитор кальций-АТРазы саркоплазматическогоэндоплазматического ретикулума (8ЕВСА) также вызывает разгрузку внутриклеточных запасов и активацию пути передачи кальциевого сигнала в лимфоцитах. Следовательно. тапсигаргин можно использовать в качестве специфического раздражителя пути передачи кальциевого сигнала в Т клетках. Известно. что разгрузка (выгрузка) запасов внутриклеточного кальция в Т клетках вызывает активацию кальциевого канала на клеточной поверхности. что способствует поступлению кальция извне клетки. Этот управляемый запасом кальция кальциевый канал (8ОСС) на Т клетках называется СВАС (канал. активируемый высвобождением кальция). и известно. что пролонгированное поступление (инфлюкс. вброс) кальция через этот канал является важным для полной активации Т клеток [8. Бекке е( а1. (2005) 1. Ехр. Мей. 202. 651 и Ν. Уепка(екН е( а1. (2004) ΡNА8 101. 8969]. В течение многих лет полагали. что для того. чтобы поддерживать непрерывное поступление (инфлюкс) кальция в Т клетки. клеточная мембрана должна
- 2 013470 оставаться в гиперполяризованном состоянии за счет эффлюкса (истечения) ионов калия. В Т клетках эффлюкс калия осуществляется через потенциалзависимый калиевый канал Κν1.3 апб 1Нс са1сштас(|уа1сб ро1а881ит скаппе1 1КСа1 [К.С. Скапбу с1 а1. (2004), ΤΙΡ8 25, 280]. Таким образом, эти калиевые каналы опосредованно контролируют путь передачи кальциевого сигнала, способствуя необходимому эффлюксу калия, который содействует непрерывному инфлюксу (поступлению) кальция через СВАС.
Постоянное увеличение внутриклеточного кальция активирует различные пути в Т клетках, включая те, которые приводят к активации ΝΒΑΤ, ΝΕ-кВ и АР-1 |Ошп1апа-А (2005) РДидегк Агск. - Еиг. 1. Рку8ю1. 450, 1]. Эти события приводят к различным Т клеточным ответам, включая изменение размера клетки и организацию мембраны, активацию эффекторных молекул клеточной поверхности, продуцирование и пролиферацию цитокинов. Некоторые молекулы, воспринимающие кальций, передают кальциевый сигнал и управляют клеточным ответом. Кальмодулин представляет собой одно из соединений, которое связывает кальций, но идентифицировано много других соединений (М.1. Вегпбде е1 а1. (2003), Ναι. Ре\'. Мо1. Се11. Вю1. 4, 517). Кальций-кальмодулинзависимая кальциневрин-фосфатаза активируется при непрерывном увеличении внутриклеточного кальция и дефосфорилирует ΝΕΑΤ в цитозоле. Дефосфорилированный ΝΕΑΤ быстро транслоцируется в ядро и широко применяется как важнейший фактор транскрипции для активации Т клеток (Е. Маааи (2005), Ναι. Дет. 1ттипо1. 5, 472 и Ν. Уеика1ебк е1 а1. (2004), ΡΝΑ8 101, 8969). Ингибиторы кальциневрина, такие как циклоспорин А (Неорал, Сандиммун) и ЕК506 (Такролимус) являются основными средствами для лечения тяжелых иммунных нарушений, таких, которые вызывают отторжение после трансплантации плотного органа (Ι.Μ. Сопха1ех-Р1п1о е1 а1. (2005), ΤίΒ^ρ^ί. Ргос. 37, 1713 и Э.В.1. Киурега (2005) ^ап^рИт 1п1егпа11опа1 18, 140). Неорал одобрен для лечения отторжения трансплантата, тяжелого ревматоидного артрита (Ό.Ε. Уосит е1 а1. (2000), Вкеита1о1. 39, 156) и тяжелого псориаза (1. Коо (1998) Βπΐίκΐι 1. ЭегтаЮк 139, 88). Недавно полученные преклинические и клинические данные наводят на мысль, что ингибиторы кальциневрина могут найти применение при лечении воспалительного кишечного заболевания (ΙΒΌ; Ваитдай ИС (2006) Ат. 1. Сак1гоеп1его1. Маг 30; Ерик акеаб о! рг1п1). рассеянного склероза (Апп. №иго1. (1990) 27, 591) и астмы (8. Вока1ад1 е1 а1. (2000), 1. Скп. Ркагтасо1. 40, 1211). Волчанка является другим нарушением, при котором могут помочь агенты, блокирующие активацию хелперных Т клеток. Несмотря на важную роль кальциневрина в регуляции ΝΕΆΤ в Т клетках, кальциневрин также экспрессируется в других тканях (например, в почке), а циклоспорин А и ЕК506 имеет узкую границу безопасности вследствие механизма основной токтичности. Почечная токсичность и гипертензия являются обычными побочными эффектами, которые ограничивают перспетивы применения циклоспорина и ЕК506. Вследствие токсичности ингибиторы кальциневрина применяются, главным образом, только для лечения тяжелого иммунного заболевания (ВЬкоппеДе-В е1 а1. (2006), 1. Ат. Асаб. ЭегтаЮк 54, 472). Ингибиторы Βν1.3 представляют собой более безопасную альтернативу ингибиторам кальциневрина для лечения иммунных заболеваний. Это объясняется тем, что Βν1.3 также действует, контролируя путь передачи кальциевого сигнала в Т клетках, но осуществляет это по другому механизму, нежели ингибиторы кальциневрина, а данные по экспрессии и функции Βν1.3 показывают, что Ην1.3 играет более ограниченную роль в биологии Т клеток по сравнению с кальциневрином, который функционирует также в различных нелимфоидных клетках и тканях.
Мобилизация кальция в иммунных клетках также активирует продуцирование в цитокинах интерлейкина 2 (1Ь-2) и интерферона гамма (ШЫд), которые являются важнейшими медиаторами воспаления. 1Ь-2 индуцирует различные биологические реакции от размножения и дифференцировки СЭ4' и СЭ8' Τ клеток до активации пролиферации и секреции антитела В клетками, до активации ИК клеток [8.Ь. СаГГеп & К.Э. Ьш (2004) Су1окше 28, 109]. Секреция 1Ь-2 происходит вскоре после активации Т клеток, а Т клетки являются главным источником этого цитокина. Вскоре после активации высокоаффинный 1Ь-2 рецептор (1Ь2-В) активируется (позитивно модулируется) на Т клетках, наделяя их способностью пролиферировать в ответ на 1Ь-2. Т клетки, НК клетки, В клетки и профессиональные антигенпрезентирующие клетки (АРС), все, могут секретировать ШЫд при активации. Т клетки являются главным источником продукции ГЕ^д при опосредовании специфического (адаптивного) иммунного ответа, тогда как натуральные киллерные (НК) клетки и АРС, по-видимому, являются важным источником в период защиты хозяина от инфекции [К. 8скгобег е1 а1. (2004), 1. Ьеикос. Вю1. 75, 163]. ШЫд, первоначально названный макрофаг-активирующим фактором, позитивно регулирует (активирует) процессирование антигенов и презентирование их моноцитами, макрофагами и дендритными клетками. ШЫд опосредует различные биологические активности во многих типах клеток [и. Воект е1 а1. (1997) Аппи. Веν. 1ттипо1. 15, 749], включая рост и дифференцировку, усиление активности ΝΚ клеток и регуляцию продукции и переключение класса иммуноглобулинов в В клетках.
СО40Б представляет собой другой цитокин, экспрессируемый на Т клетках, и после мобилизации кальция при связывании со своим рецептором на В клетках он обеспечивает важный хелперный сигнал, способствующий образованию В клеток в терминальном центре, дифференцировке В клеток и переключению изотипа антитела. Опосредуемая СО40Б активация СЭ40 на В клетках может индуцировать полную дифференцировку и клональную экспансию В клеток, продуцирующих иммуноглобулин (1д) [8. Оиехаба е1 а1. (2004) Аппи. Веν. 1ттипо1. 22, 307]. Рецептор СЭ40 можно также обнаружить в дендритных клетках, а передача сигнала СО40Б может также опосредовать активацию и дифференцировку дендрит
- 3 013470 ных клеток. Антиген-презентирующая способность В клеток и дендритных клеток промотируется 0401, связыванием, это также показывает заметную роль, которую играет этот цитокин в адаптивном иммунитете. Учитывая существенную роль СЭ40 передачи сигнала в биологии В клетки, СЭ40Р изучали в преклинических и клинических исследованиях с целью применения при лечении системной красной волчанки (8ЬЕ) - нарушение, характеризующееся отложением комплексов антител в тканях, воспалением и поражением органов [I. Уа/бапу апб I Эаущ (2004) Еириэ 13, 377].
Продуцирование токсичных пептидов является сложным процессом в ядовитых организмах и еще более сложным синтетическим процессом. Вследствие наличия консервативных дисульфидных структур и необходимости в эффективном окислительном рефолдинге токсичные пептиды представляют сложную задачу для синтеза. Хотя токсичные пептиды годами использовались в качестве высокоселективных фармакологических ингибиторов ионных каналов, высокая стоимость синтеза и рефолдинга токсичных пептидов и их короткий период полужизни ΐπ νίνο затрудняли применение этих пептидов в качестве терапевтических средств. Значительно больше усилий затрачено для того, чтобы идентифицировать низкомолекулярные ингибиторы в качестве терапевтических антагонистов ионных каналов, чем на сами токсичные пептиды. Одним исключением является одобренный недавно для лечения непроходящей боли малый пептид ω-конотоксина МУПА (Зиконотид™). Однако способ синтеза и рефолдинга Зикотинида™ дорог и дает малый пептидный продукт с очень коротким периодом полужизни ΐπ νίνο (около 4 ч).
Экономически эффективный способ получения терапевтических средств, таких как, но без ограничения, ингибиторы ионных каналов, является нерешенной задачей, которая решается настоящим изобретением, включающим токсичные пептиды, слитые или иным образом ковалентно конъюгированные с носителем.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к составу формулы (х\-(рМх2К(Р2)е-(х3)с (I) и его мультимерам, где
Е1 и Е2 обозначают фрагменты, продлевающие период полужизни, а б и е, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из б и е обозначает 1;
X1, X2 и X3, каждый независимо, обозначают -(к)1-Р-(Р)8-, и £ и д, каждый независимо, обозначают 0 или 1;
Р обозначает токсичный пептид протяженностью не более примерно 80 аминокислотных остатков, содержащий по меньшей мере две внутрипептидные дисульфидные связи;
И обозначает необязательный линкер (присутствует, когда £=1 и/или д=1); и а, Ь и с, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а, Ь и с обозначает 1.
Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим формулы, являющиеся вариантами формулы I, такими как формулы (II) Р-(Е)8-Е1 (т.е. Ь, с и е равны 0);
(III) Е1-(Е)1-Р (т.е. а, с и е равны 0);
(IV) Р-(Е)8-Е1-(Е)^Р или (Х1)а-Е1-(Х2)ь (т.е. с и е равны 0);
(V) Е1-(Е)^Р-(Е)8-Е2 (т.е. а и с равны 0);
(VI) Е1-(Е)^Р-(Е)д-Е2-(Е)^Р (т.е. а равно 0);
(VII) Е1-Е2-(И)^Р (т.е. а и Ь равны 0);
(VIII) Р-(Е)д-Е1-Е2 (т.е. Ь и с равны 0);
(IX) Р-(Е)д-Е1-Е2-(Е)^Р (т.е. Ь равно 0);
или к любым мультимерам любого из них, традиционно стоящим Ν-концом пептида (пептидов) слева. Все такие соединения формул П-К охватываются структурной формулой I. Формула I обозначает, что если присутствует более одного токсического пептида (Р), эти токсичные пептиды, присутствующие в композиции по изобретению, могут быть одинаковыми или отличными друг от друга токсичными пептидами, а линкерная частица ((Е)£ и/или (Ь)8), если она присутствует, может быть независимо такой же, как любой другой линкер или как любые другие линкеры, который(е) может(могут) присутствовать в композиции по изобретению. Конъюгация токсичного(токсичных) пептида(пептидов) с фрагментом или с фрагментами, продлевающим(и) период полужизни, может происходить по Ν-концу и/или С-концу токсичного пептида или может происходить в виде включения в основную аминокислотную последовательность, причем Е1 связывается ближе к Ν-концу токсичного пептида, чем Е2. Примеры подходящих фрагментов, продлевающих период полужизни (Е1 или Е2), включают Ес домен иммуноглобулина, человеческий сывороточный альбумин (И8А) или полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕО). Эти и другие фрагменты (частицы) по данному описанию, продлевающие период полужизни, применяются либо отдельно, либо в комбинации.
Настоящее изобретение относится также к составу, который включает конъюгированный или неконъюгированный токсичный пептидный аналог 811К, О8К1, СРТх или мауротоксина (шаигоФхт)
- 4 013470 (МТХ), модифицированный по одному или более аминокислотных остатков по сравнению с нативными последовательностями, обладающий более высокой антагонистической активностью и/или целевой селективностью в отношении Κν1.3 или 1КСа1 по сравнению с пептидами 811К. 08Κ1 или мауротоксина (МТХ), имеющими нативную последовательность. Токсичные пептидные аналоги содержат любую аминокислотную последовательность. выбранную из последовательностей, приведенных ниже:
8ЕО ΙΌ N0: 88, 89, 92, 148-200, 548-561, 884-949 или 1295-1300, представленные в табл. 2; или
8Е0 ΙΌ N0: 980-1274, 1303 или 1308, представленные в табл. 7; или
8ЕО Ш N0: 330-337, 341, 1301, 1302, 1304-1307, 1309, 1311, 1312 и 1315-1336, представленные в табл. 13; или
8Е0 ΙΌ N0: 36, 59, 344-346 или 1369-1390, представленные в табл. 14.
Настоящее изобретение также относится к другим токсичным пептидным аналогам, которые содержат любую аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных ниже:
8Е0 ΙΌ N0: 201-225, представленные в табл. 3; или
8Е0 ΙΌ N0: 242-248 или 250-260, представленные в табл. 4; или
8Е0 ΙΌ N0: 261-275, представленные в табл. 5; или
8Е0 ΙΌ N0: 276-293, представленные в табл. 6; или
8Е0 ΙΌ N0: 299-315, представленные в табл. 8; или
8Е0 ΙΌ N0: 316-318, представленные в табл. 9; или
8Е0 ΙΌ N0: 319, представленная в табл. 10; или
8Е0 ΙΌ N0: 327 или 328, представленные в табл. 11; или
8ЕО ΙΌ N0: 330-337, 341, 1301, 1302, 1304-1307, 1309, 1311, 1312 или 1315-1336, представленные в табл. 13;
8Е0 ΙΌ N0: 1369-1390, представленные в табл. 14; или
8Е0 ΙΌ N0: 348-353, представленные в табл. 16; или
8Е0 ΙΌ N0: 357-362, 364-368, 370, 372-385 или 387-398, представленные в табл. 19; или
8Е0 ΙΌ N0: 399-408, представленные в табл. 20; или
8Е0 ΙΌ N0: 410-421, представленные в табл. 22; или
8Е0 ΙΌ N0: 422, 424, 426 или 428, представленные в табл. 23; или
8Е0 ΙΌ N0: 430-437, представленные в таблице 24; или
8Е0 ΙΌ N0: 438-445, представленные в табл. 25; или
8Е0 ΙΌ N0: 447, 449, 451, 453, 455 или 457, представленные в табл. 26; или
8Е0 ΙΌ N0: 470-482 или 484-493, представленные в табл. 28; или
8Е0 ΙΌ N0: 495-506, представленные в табл. 29; или
8Е0 ΙΌ N0: 507-518, представленные в табл. 30.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая включает состав по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Составы по настоящему изобретению можно получать традиционными синтетическими методами, методами рекомбинантной ДНК или любыми другими методами получения пептидов и слитых белков, общеизвестными в уровне техники. Составы по данному изобретению, которые содержат непептидные участки, можно синтезировать традиционными методами органической химии помимо традиционных методов пептидной химии, если они применимы.
Основное рассматриваемое применение представляет собой применение в виде терапевтических и/или профилактических агентов. Составы по изобретению, включающие токсичный пептид, могут обладать активностью и/или целевой селективностью в отношении ионного канала, сравнимой с активностью и/или целевой селективностью неконъюгированного пептида, или даже превышающей ее.
Соответственно, настоящее изобретение включает способ лечения аутоиммунного нарушения, который включает введение пациенту, у которого диагностировано аутоиммунное нарушение, такое как рассеянный склероз, типа 1 диабет, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астма, аллергия, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермия, гломерулонефрит, синдром Шегрена, воспалительная резорбция кости, отторжение трансплантата, болезнь трансплантат-против-хозяина или волчанка, терапевтически эффективного состава по изобретению (предпочтительно содержащего Κν1.3 антагонистический пептид или БКСа1 антагонистический пептид), при этом у пациента частично снимается по меньшей мере один симптом заболевания.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу предупреждения или подавления рецидива симптома рассеянного склероза, причем этот способ включает введение пациенту, у которого ранее был по меньшей мере один симптом рассеянного склероза, профилактически эффективное количество состава по изобретению (предпочтительно содержащего Κν1.3 антагонистический пептид или БКСа1 антагонистический пептид), так что предупреждается или подавляется рецидив по меньшей мере одного симптома рассеянного склероза.
Хотя составы по данному изобретению в основном рассматриваются как терапевтические агенты, они могут также применяться при скрининге на терапевтические или диагностические агенты. Например,
- 5 013470
Ес-пептид можно применять в анализе с использованием планшетов, покрытых пленкой с антителами к Ес. Фрагмент, продлевающий период полужизни, такой как Ес, может превратить нерастворимые пептиды в растворимые и, следовательно, применимые в ряде анализов.
Многочисленные дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными при рассмотрении фигур и подробного описания изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 схематически показаны структуры некоторых типичных Ес димеров, которые могут быть получены из 1дС1 антитела. Ес на фигуре обозначает любой из Ес вариантов, входящих в значение термина Ес домен по данному описанию. XI и Х2 представляют собой пептиды или линкерпептидные комбинации по определению, приведенному ниже в данном описании. Далее приводятся конкретные димеры:
фиг. 1А и 1Ό: димеры с одной дисульфидной связью;
фиг. 1В и 1Е: димеры с двумя дисульфидными связями;
фиг. 1С и 1Е: димеры с нековалентной связью.
На фиг. 2 схематически показаны структуры некоторых вариантов состава по изобретению, которые изображают единичный элемент фармакологически активного токсичного пептида. На фиг. 2А изображена одноцепочечная молекула, фиг. 2А также может изображать конструкцию ДНК молекулы (соединения). На фиг. 2С показан димер с пептидным участком на обеих цепях. Димер, показанный на фиг. 2С, образуется спонтанно в некоторых клетках-хозяевах при экспрессии конструкции ДНК, кодирующей единичную цепь, показанную на фиг. 2А. В случае других клеток-хозяев клетки можно поместить в условия, благоприятствующие образованию димеров, или димеры могут образовываться ίη νίίτο.
На фиг. 3А-В показаны типичные нуклеотидная и аминокислотная последовательности (8ЕО ГО N0: 1 и 2 соответственно) человеческого 1дС1 Ес, которые оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих и могут применяться в данном изобретении.
На фиг. 4А-В показаны типичные нуклеотидная и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 3 и 4 соответственно) человеческого 1дС1 Ес, которые оптимизированы для экспрессии в бактериальных клетках и могут применяться в данном изобретении.
На фиг. 5А показана аминокислотная последовательность зрелого 81К пептида (8Е0 ГО N0: 5), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в клетках млекопитающих, бактериальных клетках и клетках дрожжей.
На фиг. 5В показаны три дисульфидные связи (--8-8--), образованные шестью цистеиновыми остатками в 81К пептиде (8Е0 ΙΌ N0: 10).
На фиг. 6 показано выравнивание ингибитора потенциалзависимого калиевого канала 8йс1юбас1у1а 1ιο1ίαη11ιιΐ5 (811К) с последовательностями других близкородственных членов семейства токсинов актиний. Показано выравнивание последовательности зрелого 81К токсина из 35 аминокислот (регистрационный номер #Р29187), выделенной из яда 8НсНоНас1у1а Ьейап1Ьи8, с последовательностями других близкородственных членов семейства токсинов актиний. Показаны консенсусная последовательность и прогнозируемые дисульфидные связи, высококонсервативные остатки закрашены. Показанная последовательность НтК пептидного токсина (8\\'188-Рго1ет регистрационный № 097436) является последовательностью незрелого предшественника из актинии великолепной (КаФапНиб тадшДса; Не1егасй8 тадшГюа), а предполагаемый сигнальный пептид подчеркнут. Прогнозируется, что зрелый НтК пептидный токсин должен иметь протяженность 35 аминокислот и охватывать остатки от 40 по 74. АеК является зрелым пептидным токсином, выделенным из яда актинии Асйша ес.|шпе (Актиния лошадиная, регистрационный № Р81897). Также показаны последовательности зрелого пептидного токсина АбК8 (регистрационный № 09Т\УС1) и ВдК (регистрационный № Р29186), выделенные из Апетоша 8и1са1а и Випобозота дгапийГега соответственно. На фиг. 6А показано выравнивание аминокислотной последовательности (8Е0 ГО N0: 10) 81К с последовательностями других членов токсинов семейства актиний, НтК (8Е0 ГО N0: 6 (зрелый пептид), (8Е0 ΙΌ N0: 542, участки сигнального и зрелого пептидов)), АеК (8Е0 ΙΌ N0: 7), АбКб (8Е0 ΙΌ N0: 8) и ВдК (8Е0 ΙΌ N0: 9). Показаны прогнозируемые дисульфидные связи, а консервативные остатки выделены. (НтК, 8ЕО ГО N0: 543; 81К, 8ЕО ГО N0: 10; АеК, 8ЕО ГО N0: 544; АбК8, 8ЕО ГО N0: 545). На фиг. 6В показано картирование дисульфидного связывания для этого семейства, содержащего 3 дисульфидные связи (С1-С6, С2-С4, С3-С5).
На фиг. 7А-В показано выравнивание аминокислотной последовательности альфа-токсинов семейства скорпионов, ингибиторов калиевых каналов. (ВтКК1, 8Е0 ГО N0: 11; ВтКК4, 8Е0 ГО N0: 12; РВТх1, 8ЕО ГО N0: 14; Тс32, 8ЕО ГО N0: 13; ВтКК6, 8ЕО ГО N0: 15; Р01, 8ЕО ГО N0: 16; Р12, 8ЕО ГО N0: 17; Р13, 8ЕО ГО N0: 18; Р14, 8ЕО ГО N0: 19; МТХ, 8ЕО ГО N0: 20; РН, 8ЕО ГО N0: 21; НбТх1, 8ЕО ГО N0: 61; АдТх2, 8ЕО ГО N0: 23; КТХ1, 8ЕО ГО N0: 24; 08К1, 8ЕО ГО N0: 25; ВтКТХ, 8ЕО ГО N0: 22; НдТХ1, 8ЕО ГО N0: 27; МдТх, 8ЕО ГО N0: 28; С11Тх1, 8ЕО ГО N0: 29; ЭТХ, 8ЕО ГО N0: 30; Тс30, 8ЕО ГО N0: 31; ТбТХ-Ка, 8ЕО ГО N0: 32; РВТх3, 8ЕО ГО N0: 33; Е(]11 15-1, 8ЕО ГО N0: 34; МайепТх, 8ЕС) ГО N0: 37; С1Тх, 8ЕО ГО N0:36; СНТ.\-Е(]2. 8ЕО ГО N0: 42; ЬТх, 8ЕО ГО N0: 38; 81оТх, 8ЕО ГО N0: 39; ВтТх1; 8ЕО ГО N0: 43; ВиТх, 8ЕО ГО N0: 41; АттТх3, 8ЕО ГО N0: 44; АаТХ1, 8ЕО ГО N0: 45; ВтТХ3, 8ЕО ГО N0: 46; Тс1, 8ЕО ГО N0: 48; 08К2, 8ЕО ГО N0: 49; ТбК, 8ЕО ГО N0: 54; СоТх1, 8ЕО ГО
- 6 013470
N0:55; СоТх2. 8ЕЕ) ΙΌ N0: 871; ВтРо5. 8Ер ГО N0: 60; 8суТх. 8Ер ГО N0: 51; Р05. 8ЕЕ) ГО N0: 52; тамапин (Татарш). 8Е0 ГО N0: 53 и ТтТx, 8Е0 ГО N0: 691. Высококонсервативные остатки заштрихованы, а консенсусная последовательность дана в списке. Подсемейства α-КТх перечислены и взяты из Вобпдисх бе 1а Усда. В.С. е1 а1. (2003) Т1Р8 24: 222-227. Перечень некоторых ионных каналов. известных как вызывающие антагонизм. приводится (1К=1КСа, ВК=ВКСа, 8К=8КСа. Ку=потенциалзависимые К+ каналы). Хотя большинство членов семейства в этом выравнивании являются зрелыми пептидами. некоторые из них представляют собой незрелые или модифицированные формы пептида. они включают ВтКК1. ВтКК4. ВтКК6. ВтКТХ. МабепТх. СНТх. С11Т.х-1.(]2. ВтТх1. АаТх1. ВтТХЗ. ТкК. СоТх1. ВтР05.
На фиг. 8 показано выравнивание токсичных пептидов. превращенных в пептидные антитела (рербЬобу. рерббе апбЬобу) (Апамин. 8Е0 ГО N0: 68; НаТх1. 8Е0 ГО N0: 494; РгоТх1. 8Е0 ГО N0: 56; РаТх2. 8ЕЕ) ГО N0: 57; 8НК[2-35]. 8ЕЕ) ГО N0: 92; 8НК[1-35]. 8ЕЕ) ГО N0: 5; НтК. 8ЕЕ) ГО N0: 6; СНТх (К32Е). 8ЕЕ) ГО N0: 59; СНТх. 8ЕЕ) ГО N0: 36; 1ЬТх. 8ЕЕ) ГО N0: 38; 08К1 (Е16К. К20Э). 8ЕЕ) ГО N0: 296; 08К1. 8ЕЕ) ГО N0: 25; АдТх2. 8ЕЕ) ГО N0: 23; КТХ1. 8ЕЕ) ГО N0: 24; МдТх. 8ЕЕ) ГО N0: 28; ЭТХ. 8ЕЕ) ГО N0: 30; МТХ. 8ЕО ГО N0: 20; Р12. 8ЕО ГО N0: 17; НкТх1. 8ЕЕ) ГО N0: 61; Ануроктоксин [АпТх]. 8ЕЕ) ГО N0: 62; ВеКт1. 8ЕЕ) ГО N0: 63; 8суТх. 8ЕЕ) ГО N0: 51; шОУ1А. 8ЕЕ) ГО N0: 64; шМУПа. 8ЕЕ) ГО N0: 65; Р1и1. 8Е0 ГО N0: 66; и СТХ. 8Е0 ГО N0: 67). Указаны оригинальные источники токсинов. так же как число цистеинов в каждом. Перечислены важнейшие нацеленные ионные каналы. Выравнивание показывает разделение токсичных пептидов на группы в зависимости от их источника и воздействия на целевой ионный канал.
На фиг. 9 показано распределение дисульфидных групп в семействе токсинов. Указано число дисульфидных групп и порядок дисульфидных связей для каждого подсемейства. Представлен частичный перечень токсинов. которые подпадают под каждую категорию дисульфидного связывания.
На фиг. 10 показано. что разрешенные структуры токсинов выявляют компактную структуру. Разрешенные структуры нативных токсинов актинии (8НК). скорпиона (МдТх. МТХ. НкТх1). морской улитки с конусообразной раковиной (\\'СУ1А) и тарантула (НаТх1) показывают. что все пептиды из 28-39 аминокислот образуют компактную структуру. Указанные токсины содержат 3 или 4 дисульфидных связи и подпадают под 4 из 6 подсемейств. показанных на фиг. 9. Решенные (разрешенные) структуры нативных токсинов актинии (8НК). скорпиона (МдТх. МТХ. НкТх1). морской улитки с конусообразной раковиной (\\'СУ1А) и тарантула (НаТх1) взяты из Банка Данных о Белках (Рго1е1п Эа1а Вапк. РОВ). регистрационные №№ 1В00 (ттбЬ1б: 5247). 1МТХ (ттбЬ1б: 4064). 1ТХМ (ттбЬ1б: 6201). 10υΖ (ттбЬ1б: 36904). 10МΖ (ттбЬ1б: 1816) и 1Э1Н (ттбЬ1б: 14344) с помощью базы данных трехмерных структур ММЭВ Еп1гех 3Э-51гис1иге [1. СНеп е1 а1. (2003) ШсШс Ашбк Век. 31. 474] и визуализатора.
На фиг. 11А-С показаны нуклеотидные (8Е0 ГО N0: 69 и 8Е0 ГО N0: 1358) и кодированные аминокислотные (8Е0 ГО N0: 70. 8Е0 ГО N0: 1359 и 8Е0 ГО N0: 1360) последовательности остатков 51316660 рАМ621ашрВ-Рс-рер. В последовательностях Рс домена (8Е0 ГО N0: 71 и 72) исключены пять Сконцевых глициновых остатков. Этот вектор позволяет продуцировать пептидные антитела. в которых пептид-линкерный участок находится на С-конце Рс домена.
На фиг. 11Ό показана круговая диаграмма вектора для бактериальной экспрессии пептидного антитела рАМ621ашрΚ-Рс-рер. содержащего ген хлорамфениколацетилтрансферазы (са1; СтВ сайт). который заменяется на пептид-линкерную последовательность.
На фиг. 12А-С показаны нуклеотидные (8Е0 ГО N0: 73 и 8Е0 ГО N0: 1361) и кодированные аминокислотные (8Е0 ГО N0: 74. 8Е0 ГО N0: 1362 и 8Е0 ГО N0: 1363) последовательности остатков 51316319 рЛМС21ашрВ-Ρер-Εс. В последовательностях Рс домена (8Е0 ГО N0: 75 и 76) исключены пять N концевых глициновых остатков. Этот вектор позволяет продуцировать пептидные антитела. в которых пептид-линкерный участок находится на Мконце Рс домена.
На фиг. 12Ό показана круговая диаграмма вектора для бактериальной экспрессии пептидного антитела. в котором сайт устойчивости к зеоцину (Ь1е; '^еоВ) заменяется на пептид-линкерную последовательность.
На фиг. 12Е-0 показана нуклеотидная (8Е0 ГО N0: 1339) и кодированные аминокислотные последовательности рАМС21атрВ-Рер-Ес (8Е0 ГО N0: 1340. 8Е0 ГО N0: 1341 и 8Е0 ГО N0: 1342). В последовательностях Рс домена (8Е0 ГО N0: 75 и 76) исключены пять Мконцевых глициновых остатков. Этот вектор позволяет продуцировать пептидные антитела. в которых пептид-линкерный участок находится на Мконце Рс домена.
На фиг. 13А изображена круговая диаграмма вектора для экспрессии в клетках млекопитающих РСЭХА3.1 (+) СМХ1.
На фиг. 13В изображена круговая диаграмма вектора экспрессии в клетках млекопитающих рС^NА3.1(+)СМV^-Рс-2x648-Асбν^η КНЬ. который содержит Рс область человеческого 1дО1. линкер из 10 аминокислот и активин В11Ь ген.
На фиг. 13С изображена круговая диаграмма СНО экспрессирующего вектора рЭ8Ва22. содержащего кодирующую последовательность Рс-Ь10-8НК[2-35].
- 7 013470
На фиг. 14 А-В показаны нуклеотидная и кодированная аминокислотная последовательности (8ЕЭ 10 N0: 77 и 78 соответственно) молекулы соединения, идентифицированного ниже, в примере 1, как ЕсЬ10-8ЬК[1-35]. Аминокислотная последовательность линкера Ь10 (8ЕЭ ГО N0: 79) подчеркнута.
На фиг. 15 А-В показаны нуклеотидная и кодированная аминокислотная последовательности (8ЕЭ ГО N0: 80 и 81 соответственно) молекулы соединения, идентифицированного ниже, в примере 2, как ЕсЬ10-8ЬК[2-35]. Та же самая аминокислотная последовательность линкера Ь10 (8ЕЭ ГО N0: 79), которая используется в Ес-Ь10-8йК[1-35] (фиг. 14А-В), подчеркнута.
На фиг. 16А-В показаны нуклеотидная и кодированная аминокислотная последовательности (8ЕЭ ГО N0: 82 и 83 соответственно) молекулы соединения, идентифицированного ниже, в примере 2 как ЕсЬ25-8ЬК[2-35]. Аминокислотная последовательность линкера Ь25 (8ЕЭ ГО N0: 84) подчеркнута.
На фиг. 17 дана схема №концевого пэгилирования 8йК пептида (8ЕЭ ГО N0: 5 и 8ЕЭ ГО N0: 10) восстановительным аминированием, описанным также далее, в примере 32.
На фиг. 18 дана схема №концевого пэгилирования; 8йК пептида (8ЕЭ ГО N0: 5 и 8ЕЭ ГО N0: 10) через образование амида, описанная также далее, в примере 34.
На фиг. 19 дана схема №концевого пэгилирования 8йК пептида (8ЕЭ ГО N0: 5 и 8ЕЭ ГО N0: 10) хемоселективным методом через оксимирование, описанное также далее, в примере 33.
На фиг. 20А показаны результаты обращенно-фазовой ВЭЖХ при 214 нм, а на фиг. 20В показаны результаты масс-спектрометрии с электрораспылением 8йК[2-35], также описанного как складчатый (скрученный) Пе5-Агд1-8ЬК (пептид 2).
На фиг. 21 показаны результаты обращенно-фазовой ВЭЖХ при 214 нм пэгилированного по N концу 8йК[2-35], также называемого как пэгилированный по №концу Пе5-Агд1-8ЬК.
На фиг. 22А показаны результаты обращенно-фазовой ВЭЖХ при 214 нм скрученного 8йК[ 1-35], также называемого 8йК.
На фиг. 22В показаны результаты масс-спектрометрии с электрораспылением 811К|1-35|. также называемого 8йК.
На фиг. 23 иллюстрируется схема №концевого пэгилирования 8йК[2-35] (8ЕЭ ГО N0: 92 и 8ЕЭ ГО N0: 58, также называемого 'ГОе5-Лгд1-8ЬК или 811К 61) восстановительным аминированием, описанным также далее, в примере 31.
На фиг. 24А показан вестерн-блоттинг кондиционированной среды НЕК 293 клеток, транзиторно трансфецированных с помощью Ес-Ь10-8йК[1-35]. Дорожка 1: маркеры молекулярной массы; дорожка 2: 15 мкл Ес-Ь10-8ЬК; дорожка 3: 10 мкл Ес-Ь10-8йК; дорожка 4: 5 мкл Ес-Ь10-8йК; дорожка 5; маркеры молекулярной массы; дорожка 6: контроль; дорожка 7: 15 мкл нет ДНК контроля; дорожка 8: 10 мкл нет ДНК контроля; дорожка 9: 5 мкл нет ДНК контроля; дорожка 10; маркеры молекулярной массы.
На фиг. 24В показан вестерн-блоттинг кондиционированной среды клонов клеток яичников китайского хомячка (СНО), стабильно трансфецированных с помощью Ес-Ь-8ЬК[1-35]. Дорожки 1-15 нагружают следующим образом: контроль, ВВ6, маркеры молекулярной массы, ВВ5, ВВ4, ВВ3, ВВ2, ВВ1, контроль, ΒΌ6, ΒΌ5, маркеры молекулярной массы, ΒΌ4, ΒΌ3, ΒΌ2.
На фиг. 25А показан вестерн-блоттинг невосстановленного 8Э8-РАСЕ геля, содержащего кондиционированную среду 293Т клеток, транзиторно трансфецированных при использовании Ес-Ь-ЗшША.
На фиг. 25В показан вестерн-блоттинг восстановленного 8Э8-РАСЕ геля, содержащего кондиционированную среду 293Т клеток, транзиторно трансфецированных при использовании Ес-Ь-ЗшША.
На фиг. 26А показано спектральное сканирование 10 мкл очищенного Ес-Ь10-8йК[1-35] продукта при использовании стабильно трансфецированных СНО клеток, разведенного в 700 мкл ΡΒ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 26В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ конечного Ес-Ь10-8йК[1-35] продукта. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Жсех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Жсех Магк12, 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 26С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 20 мкг конечного Ес-Ь10-8йК[1351 продукта, вводимого в колонку Рйепошепех Β^ο8еρ 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ NаН2Ρ04, 250 мМ №101 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 26Ό показаны результаты анализа методом ΜΑΕΌΙ масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-8йК[1-35] на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΒΡ, снабженном азотным лазером: (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 27А показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ конечного очищенного Ес-Ь10-8йК[2-35] продукта стабильно трансфецированных СНО клеток. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Жсех Магк12, 0,5 мкг не
- 8 013470 восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Νονοχ Магк12, 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль и 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 27В показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг очищенного Ес-Ь108ЬК[2-35], вводимого в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ №С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 27С показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РЛСЕ Ес-Ь5-8ЬК[2-35], очищенного от стабильно трансфецированных СНО клеток. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Νο\όχ Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Νο\όχ Магк12, 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль и 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 27Ό показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РЛСЕ Ес-Ь25-8ЬК[2-35], очищенного от стабильно трансфецированных СНО клеток. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 27Е показано спектральное сканирование 10 мкл Ес-Ь10-8ЬК[2-35] продукта, разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 27Е показаны результаты анализа методом МЛЬП1 масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-8ЬК[2-35] на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΒΡ, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 276 показано спектральное сканирование 10 мкл Ес-Ь5-8ЬК[2-35] продукта в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 27Н показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг конечного Ес-Ь5-8ЬК[235] продукта, вводимого в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 271 показаны результаты анализа методом МЛЬО1 масс-спектрометрии конечного образца Ес-Ь5-8ЬК[2-35] на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 271 показано спектральное сканирование 20 мкл продукта в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 27К показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг конечного Ес-Ь25-8ЬК[235] продукта, вводимого в колонку РЬеиотеиех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 27Ь показаны результаты анализа методом МЛЬП1 масс-спектрометрии конечного образца Ес-Ь25-8ЬК[2-35] на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ВР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 28А показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% δΌδ-РЛбЕ Ес-Ь10-КТХ1, после очистки от бактериальных клеток и рефолдинга. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12, 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 28В показаны результаты эксклюзионной хроматографии 45 мкг очищенного Ес-Ь10-КТХ1, вводимого в колонку РЬеиотеиех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 28С показаны результаты спектрального сканирования 20 мкл Ес-Ь10-КТХ1 продукта, разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\1е11 Раскагб 8453 в кварцевой
- 9 013470 кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 28Ό показаны результаты анализа методом ΜΑΕΌΙ масс-спектрометрии конечного образца Ес-Ь10-КТХ1 на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΒΡ, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 29А показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Ό8-ΡΑΟΕ Ес-Ь-АдТх2 после очистки от бактериальных клеток и рефолдинга. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 29В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Ό8-ΡΑΟΕ Ес-Ь10-НаТх1 после очистки от бактериальных клеток и рефолдинга. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 29С показаны результаты спектрального сканирования 20 мкл Ес-Ь10-АдТх2 продукта, разведенного в 700 мкл ΡΒ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 29Ό показаны результаты эксклюзионной хроматографии 20 мкг очищенного Ес-Ь10АдТх2 продукта, вводимого в колонку Ρйеηотеηеx Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ NаН2ΡΟ4, 250 мМ ЫаС1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 29Е показаны результаты анализа методом ΜΑΌΌΙ масс-спектрометрии конечного образца Ес-Ь10-АдТх2 на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΒΡ, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 29Е показаны результаты спектрального сканирования 20 мкл Ес-Ь10-НаТх1 продукта, разведенного в 700 мкл ΡΒ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\'1е11 Ρаска^ά 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 29С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 20 мкг очищенного Ес-Ь10-НаТх1 продукта, вводимого в колонку Ρйеηотеηеx Вю8ер 8ΕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ΝβΗ2ΡΟ4, 250 мМ №С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 29Н показаны результаты анализа методом ΜΑΕΌΙ масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-НаТх1 на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΚΡ, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 30А показано, что Ес-Ь10-8йК[1-35], очищенный от СНО клеток, вызывает зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в НΕК293 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Κν1.3 канал.
На фиг. 30В показано время действия блокады калиевых токов с помощью Ес-Е10-8йК[1-35] при различных концентрациях. По оценкам, величина 1С50 составляет 15±2 пМ (п = 4 клетки).
На фиг. 30С показано, что синтетический 811К|1-35| (также называемый просто 811К) вызывает зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в ΠΕΚ293 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Κν1.3 канал.
На фиг. 30Ό показано время действия блокады с помощью 8йК[1-35] при различных концентрациях. По оценкам, величина 1С50 для 811К составляет 12±1 пМ (п =4 клетки).
На фиг. 31А показано, что синтетический пептидный аналог 8йК[2-35] вызывает зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в ΌΕ^93 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Ку1.3 канал с 1С50 49±5 пМ (п = 3 клетки).
На фиг. 31В показано, что образованное при использовании СНО-клеток пептидное антитело (рерйЬобу) Ес-Ь10-8йК[2-35] вызывает зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в ΌΕ^93 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Ку1.3 канал с 1С50 115±18 пМ (п = 3 клетки).
На фиг. 31С показано, что пептидное антитело Ес-Ь5-8йК[2-35] вызывает зависимую от концентра
- 10 013470 ции блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в НЕК293 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Κν1.3 канал с 1С50 100 пМ (п = 3 клетки).
На фиг. 32А показано, что Ес-Ь-КТХ1, очищенный от бактериальных клеток, вызывает зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в НЕК293 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Κν1.3 канал.
На фиг. 32В показано время действия блокады калиевого тока с помощью Ес-Ь10-КТХ1 при различных концентрациях.
На фиг. 33 изображено, что методами иммунохимии: показано, что полученное при использовании СНО пептидное антитело Ес-Ь10-8йК[1-35] окрашивает НЕК293 клетки, стабильно трансфецированные человеческим Χν1.3 (фиг. 33А), тогда как нетрансфецированные НЕК293 клетки не окрашиваются пептидным антителом (фиг. 33В).
На фиг. 34 показаны результаты ферментного иммуноанализа с использованием фиксированных НЕК293 клеток, стабильно трансфецированных человеческим Χν1.3. На фиг. 34А видно, что образованное при использовании СНО пептидное антитело Ес-Ь10-8йК[1-35] (называемое в данном описании просто Ес-Ь10-8йК) вызывает зависимое от дозы усиление ответа, тогда как контролыюе СНО-Ес (Ес соп1го1, Ес контроль) не вызывает этого. На фиг. 34В показано, что пептидное антитело Ес-Ь10-8йК[1-35] (называемое в данном описании Ес-8йК) не выявляет ответ в нетрансфецированных НЕК293 клетках в аналогичных условиях и также проявляет другие свойства негативного контроля.
На фиг. 35 видно, что СНО-образованное пептидное антитело Ес-Ь10-8йК[1-35] вызывает зависимое от дозы ингибирование продуцирования 1Ь-2 (фиг. 35А) и ΙΡΝγ (фиг. 35В) при использовании человеческих РВМС, стимулированных РМА и антителами к αΠΌ3. Пептидное антитело проявляет новое фармакологическое действие, а именно полное ингибирование ответа, тогда как один синтетический пептид 811К|1-35| вызывает лишь частичное ингибирование.
На фиг. 36 показано, что полученное при использовании клеток млекопитающих пептидное антитело Ес-Ь10-8йК[1-35] ингибирует пролиферацию Т клеток (включение 3Н-тимидина) в человеческих РВМС от двух здоровых доноров, стимулированных антителами к С'П3 и С.П28. На фиг. 36А показан ответ в клетках донора 1, а на фиг. 36В показан ответ в клетках донора 2. Преинкубация блокирующим антителом против С'П32 (ЕсдКП) не изменяет чувствительности к пептидному антителу.
На фиг. 37 видно, что СНО-образованное пептидное антитело Ес-Ь10-8йК[1-35] вызывает зависимое от дозы ингибирование продуцирования 1Ь-2 (фиг. 37А) и ΙΡΝγ (фиг. 37В) при использовании человеческих РВМС, стимулированных антителами к αΠΌ3 и аСЭ28.
На фиг. 38А показано, что пэгилированный 8йК[2-35] вызывает зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока, регистрируемого в НЕК293 клетках, стабильно экспрессирующих человеческий Χν1.3 канал, а время действия блокады калиевого канала при различных концентрациях показано на фиг. 38В.
На фиг. 39А показаны результаты спектрального сканирования 50 мкл продукта Ес-Ь10-8йК(1-35), разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Нс\\1с11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 39В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ продукта Ес-Ь10-8йК(1-35). Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Nоνеx Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Nоνеx Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 39С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг продукта Ес-Ь10-8ЬК(135), вводимого в колонку Рйепошепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ NаН2РΟ4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 40А показаны результаты спектрального сканирования 20 мкл продукта Ес-Ь10-8йК(2-35), разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 40В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РЛСЕ конечного продукта Ес-Ь10-8йК(2-35). Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Nоνеx Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Nоνеx Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 40С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг конечного продукта ЕсЬ10-8йК(2-35), вводимого в колонку Рйепошепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ NаН2РΟ4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 40Ό показаны результаты анализа методом МАЕП1 масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-8йК(2-35) на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ОЕ-РР. снабженном азотным
- 11 013470 лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 41А показаны результаты спектрального сканирования 50 мкл продукта Ес-Ь10-О8К1, разведенного в 700 мкл РВ8 (буфер для состава), на спектрофотометре Нс\\'1с11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 41В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ конечного продукта Ес-Ь10-О8К1. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Νονοχ Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Νονοχ Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 41С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 123 мкг конечного продукта ЕсЫ0-О8К1, вводимого в колонку РПеиошеиех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ NаΗ2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 41Ό показаны результаты анализа методом жидкостной хроматографии-массспектрометрии, примерно, 4 мкг образца конечного продукта Ес-Ь10-О8К1 на колонке Уубас С4 с частью элюата, направляющегося в масс-спектрометр с ионной ловушкой БСО. Развертка масс-спектра производится с помощью программы Вютеогкк, предоставляемой производителем масс-спектрометра.
На фиг. 42А-В показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности (8ЕЦ ПЭ N3: 1040 и 8ЕЦ Ш NО: 1041 соответственно) Ес-Ь10-О8К1.
На фиг. 43А-В показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности (8ЕЦ ПЭ N3: 1042 и 8ЕО Ш ΝΘ: 1043 соответственно) Ес- Ь10-О8К1[К78].
На фиг. 44А-В показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности (8ЕЦ Ш №О: 1044 и 8ЕО Ш ΝΘ: 1045 соответственно) Ес-Ь10-О8К1[Е16К,К20П].
На фиг. 45А-В показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности (8ЕЦ ПЭ №О: 1046 и 8ЕО Ш ΝΘ: 1047 соответственно) Ес- Ь10-О8К1[К78,Е16К,К20П].
На фиг. 46 показан Вестерн-блоттинг (при использовании трис-глицин 4- 20% δΌδ-РАСЕ) с антителами против человеческого Ес. Дорожки 1-6 нагружают следующим образом: 15 мкл Ес-Ь10О8К1[К78,Е16К,К20О]; 15 мкл Ес-Ь10-О8К1[Е16К,К20П]; 15 мкл Ес-Ь10-08К1[К78]; 15 мкл Ес-Ь10О8К1; 15 мкл контроля отсутствие ДНК (Νο ΌΝΑ); маркеры молекулярной массы.
На фиг. 47 показан Вестерн-блоттинг (при использовании трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ) с антителами против человеческого Ес. Дорожки 1-5 нагружают следующим образом: 2 мкл Ес-Ь10-О8К1; 5 мкл Ес-Ь10-О8К1; 10 мкл Ес-Ь10-О8К1; 20 нг стандарта человеческого 1дС; маркеры молекулярной массы.
На фиг. 48 показан Вестерн-блоттинг (при использовании трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ) с антителами против человеческого Ес. Дорожки 1-13 нагружают следующим образом: 20 нг стандарта человеческого 1дС; Ό1; С3; С2; В6; В5; В2; В1; А6; А5; А4; А3; А2 (5 мкл кондиционированной для клона среды наносят на дорожки 2-13).
На фиг. 49А показаны результаты спектрального сканирования 50 мкл продукта Ес-Ь10-О8К1, разведенного в 700 мкл РВδ (контрольного буфера), на спектрофотометре Нете1еП Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 49В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ конечного продукта Ес-Ь10-О8К1. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Νο\Ό.χ Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Νο\Ό.χ Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 49С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 149 мкг конечного продукта ЕсЫ0-О8К1, вводимого в колонку РПеиошеиех В^ер δЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ NаΗ2РО4, 250 мМ №С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 49Ό показаны результаты анализа методом МАЕЭ1 масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-О8К1 на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ЭЕ-ВР. снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 50А показаны результаты спектрального сканирования 50 мкл продукта Ес-Ь10-О8К1(К^), разведенного в 700 мкл РВδ (контрольного буфера), на спектрофотометре Нете1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 50В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ
- 12 013470 конечного продукта Ес-Ь10-О5К1(К78). Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Νονοχ Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Νονοχ Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 50С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг конечного продукта ЕсЬ10-О8К1(К78), вводимого в колонву Ркепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ Ναί'Ί и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 50Ό показаны результаты анализа методом ΜΆΣΌΙ масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-О5К1(К78) на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΚΡ, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 51А показаны результаты спектрального сканирования 50 мкл продукта Ес-Ь10ОкК1(Е16К, К20Э). разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольного буфера), на спектрофотометре НеМей Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 51В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ конечного продукта Ес-Ь10-О8К1(Е16К, К20Э). Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 51С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг конечного продукта ЕсЬ10-О8К1(Е16К, К20О), вводимого в колонку Ркепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ Ν;·ιί.Ί и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 51Ό показаны результаты анализа методом МАЬЭ1 масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-О8К1(Е16К, К20Э) на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ОЕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 52А показаны результаты спектрального сканирования 50 мкл продукта Ес-Ь10-О5К1(К78, Е16К, К20О), разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольного буфера), на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 52В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% δΌδ-РАСЕ конечного продукта Ес-Ь10-О5К1(К78, Е16К, К20Э). Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 52С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 50 мкг конечного продукта ЕсЬ10-О5К1(К78, Е16К, К20О), вводимого в колонку Ркепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ МаН2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, с наблюдением за оптической плотностью при 280 нм.
На фиг. 52Ό показаны результаты анализа методом МАЬЭ1 масс-спектрометрии образца конечного продукта Ес-Ь10-О5К1(К78, Е16К, К20Э) на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ОЕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
На фиг. 53 показано ингибирование внешнего калиевого тока, регистрируемого при стабильной экспрессии в клетках НЕК293 человеческого Ку1.3 канала, синтетическим Окк1, токсичным пептидом из 38 остатков яда азиатского скорпиона Ойкоск1ги8 8сгоЫси1о8И8.
На фиг. 53А показана зависимая от концентрации блокада внешнего калиевого тока, регистрируемого при стабильной экспрессии в клетках НЕК293 человеческого Ку1.3 канала синтетическим Окк1 токсичным пептидом. На фиг. 53В время действия блокады синтетическим Окк1 токсичного пептида при различных концентрациях. По оценкам, величина 1С50 синтетического Окк1 составляет 39±12 пМ (п =4 клетки).
На фиг. 54 показано, что при модификации синтетического О8К1 токсичного пептида путем слия
- 13 013470 ния с Ес-фрагментом антитела (08<1-пептидного антитела) сохраняется его ингибирующая активность в отношении человеческого Κν1.3 канала. На фиг. 54А показана зависимая от концентрации блокада внешнего калиевого тока, регистрируемого при стабильной экспрессии в клетках НЕ1<293 человеческого Κν1.3 канала, синтетическим 08Κ1, связанным с Ес-фрагментом человеческого !дС1 линкерной цепью протяженностью 10 аминокислотных остатков (Ес-Е10-081<1). Слитая конструкция стабильно экспрессируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО). На фиг. 54В показано время действия блокады Ес-Е10-081<1 при различных концентрациях. По оценкам, величина Ιί.’50 Ес-Ь10- 08Κ1 составляет 198± 35 пМ (п = 6 клеток), примерно в 5 сильнее, чем у синтетического 08Κ1 токсичного пептида.
На фиг. 55 показано, что при замене единичного аминокислотного остатка пептидное антитело 08Κ1 сохраняет ингибирующую активность против человеческого Κν1.3 канала. На фиг. 55А показана зависимая от концентрации блокада внешнего калиевого тока, регистрируемого при стабильной экспрессии в клетках НЕ1<293 человеческого Κν1.3 канала пептидным антителом 08Κ1 с единичной аминокислотной заменой (лизин на серии в 7 положении от №конца, [Κ78]) и связанным с Ес-фрагментом человеческого Ι§01 линкерной цепью протяженностью 10 аминокислотных остатков (Ес-Е10-081<1|1<78|). Слитая конструкция стабильно экспрессируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО). На фиг. 55В показано время действия блокады Ес-Е10-081<1|1<78| при различных концентрациях. По оценкам, величина Ι050 Ес-Е10-081<1 составляет 372±71 пМ (п = 4 клетки), примерно в 10 сильнее, чем у синтетического 08Κ1 токсичного пептида.
На фиг. 56 показано, что при замене двух аминокислотных остатков пептидное антитело 08Κ1 сохраняет ингибирующую активность против человеческого Κν1.3 канала. На фиг. 56А показана зависимая от концентрации блокада внешнего калиевого тока, регистрируемого при стабильной экспрессии в клетках НЕ1<293 человеческого Κν1.3 канала, пептидным антителом 08Κ1 с заменой двух аминокислот (глутаминовой кислоты на лизин и лизина на аспарагиновую кислоту в 16 и 20 положении от №конца соответственно [Β16ΚΚ20Ό]) и связанным с Ес-фрагментом человеческого Ι§01 линкерной цепью протяженностью 10 аминокислотных остатков ^0-00-08^^16^200]). Слитая конструкция стабильно экспрессируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО). На фиг. 56В показано время действия блокады калиевого тока с помощью Εс-^10-08Κ1[Β16ΚΚ20^] при различных концентрациях. По оценкам, величина составляет 248±63 пМ (п = 3 клетки), примерно в 6 сильнее, чем у синтетического 08Κ1 токсичного пептида.
На фиг. 57 показано, что при замене трех аминокислотных остатков пептидное антитело 08Κ1 сохраняет ингибирующую активность против человеческого Κν1.3 канала. На фиг. 57А показана зависимая от концентрации блокада внешнего калиевого тока, регистрируемого при стабильной экспрессии в клетках №<293 человеческого Κν1.3 канала, пептидным антителом 08Κ1 с заменой трех аминокислот (лизина на серин, глутаминовой кислоты на лизин и лизина на аспарагиновую кислоту в 7, 16 и 20 положении от №конца соответственно [Κ78Β16ΚΚ20^]) и связанным с Ес-фрагментом человеческого Ι§01 линкерной цепью протяженностью 10 аминокислотных остатков (Εс-^10-08Κ1[Κ78Β16ΚΚ20^]). Слитая конструкция стабильно экспрессируется в клетках яичников китайского хомячка (СНО). На фиг. 57В показано время действия блокады калиевого тока с помощью Εс-^10-08Κ1[Κ78Β16ΚΚ20^] при различных концентрациях. По оценкам, величина составляет 812±84 пМ (п = 3 клетки), примерно в 21 слабее, чем у синтетического 08Κ1 токсичного пептида.
На фиг. 58 показаны стандартные кривые для 811Κ (фиг. 58А) и 20Κ ΡΒ6(ПЭГ)-8йΚ[ 1-35] (фиг. 58В), содержащие участки, отвечающие уравнениям линейной регрессии для каждого стандарта при данном процентном содержании сыворотки.
На фиг. 59 показан фармакокинетический профиль у крыс соединения 20Κ РЕС/ПЭГ) 81ιΚ|1-35| после инъекции Ιν.
На фиг. 60 показана Κν1.3 ингибирующая активность в сывороточных образцах (5%) крыс, получающих единичную эквимолярную Ιν инъекцию ингибиторов Κν1.3, 811Κ по сравнению с 20Κ РΒ6(ПЭГ)-8йΚ[1-35].
На фиг. 61 иллюстрируется экспериментальный дизайн модели ЕАЕ адоптивного переноса (п = 5 крыс на экспериментальную группу). Величины доз в микрограммах на килограмм (мкг/кг) даны в расчете на содержание пептидов.
На фиг. 62 показано, что лечение с помощью РЕС^Ок ослабляет заболевание у крыс на ЕАЕ модели адоптивного переноса. Оценка по клиническим критериям: 0 = признаки отсутствуют, 0,5 = вялый конец хвоста, 1,0 = вялый хвост, 2,0 = легкий парапарез, атаксия, 3,0 = умеренный парапарез, 3,5 = паралич одной задней лапы, 4,0 = полный паралич задних лап, 5,0 = полный паралич задних лап и недержание, 5,5 = паралич всех четырех конечностей, 6,0 = агония или смерть. Крысы, состояние которых оценивается как 5,5-6 баллов, умирали или их умерщвляли. Показаны значения среднее±кет (стандартная ошибка среднего), (п = 5 крыс в экспериментальной группе.)
На фиг. 63 показано, что лечение с помощью РΒ^(ПЭГ)-8йΚ предупреждает потерю массы тела у ЕАЕ модели адоптивного переноса. Крыс взвешивают в дни -1, 4, 6 и 8 (для выживших крыс). Показаны значения среднее ± кет.
- 14 013470
На фиг. 64 показано, что индуцированное тапсигаргином продуцирование ]Ъ-2 в клетках человеческой цельной крови подавляется ингибиторами Κν1.3 каналов 8ЬК[1-35] и Ес-Ь10-8йК[2-35]. Ингибитор кальциневрина циклоспорин А также блокирует ответ. Ингибитор ВКС канала ибериотоксин (ШТх) не проявляет заметной активности. Ответ клеток цельной крови двух разных доноров показан на фиг. 64А и 64В.
На фиг. 65 показано, что индуцированное тапсигаргином продуцирование ΣΕΝ-8 в клетках человеческой цельной крови подавляется ингибиторами Κν1.3 каналов 8ЬК[1-35] и Ес-Ь10-8йК[2-35]. Ингибитор кальциневрина циклоспорин А также блокирует ответ. Ингибитор ВКС канала ибериотоксин (ШТх) не проявляет заметной активности. Ответ клеток цельной крови двух разных доноров показан на фиг. 65А и 65В.
На фиг. 66 показано, что индуцированная тапсигаргином позитивная регуляция (активация) СИ40Ь на Т клетках в человеческой цельной крови подавляется ингибиторами Ку1.3 каналов 8ЬК[1-35] и ЕсЬ10-8кК[2-35] (Ес-8ЕК). Ингибитор кальциневрина циклоспорин А (СзА) также блокирует ответ. На фиг. 66А показаны результаты эксперимента, в котором изучается ответ СЭ4+ Т клеток в целом, а также СЭ4+ СИ45+ и СИ4+ СИ45- Т клеток. На фиг. 66В ингибитор ВКС канала ибериотоксин (ШТх) и ингибитор Ку1.3 каналов дендротоксин-К (ЭТА-К) не проявляют заметной активности.
На фиг. 67 показано, что индуцированная тапсигаргином позитивная регуляция (активация) ΣΕ-2Κ на Т клетках в человеческой цельной крови подавляется ингибиторами Ку1.3 каналов 8ЬК[1-35] и Ес-Ь10 811К|2-35| (Ес-8ЕК). Ингибитор кальциневрина циклоспорин А (СзА) также блокирует ответ. На фиг. 67 А показаны результаты эксперимента, в котором изучается ответ СЭ4+ Т клеток в целом, а также СЭ4+ СЭ45+ и СЭ4+ СЭ45- Т клеток. На Фигуре 67В ингибитор ВКС канала ибериотоксин (ШТх) и ингибитор Ку1.3 каналов дендротоксин- К (^ТX-Κ) не проявляют заметной активности.
На фиг. 68 показаны хроматограммы, полученные при очистке методом катионообменной хроматографии ПЭГ-пептида на колонках с 8Р Сефарозой НР для очистки РЕО (ПЭГ)-811к (фиг. 68А) и РЕО (ПЭГ)-О8К-1 (фиг. 68В).
На фиг. 69 показаны хроматограммы, полученные методом КР (обращенно-фазовой) ВЭЖХ конечных пулов ПЭГ-пептид, чтобы продемонстрировать, что чистота РЕС-811Р >99% (фиг. 69А), а чистота РЕС-Озк1 >97% (фиг. 69В).
На фиг. 70 показана аминокислотная последовательность (8ЕО ΣΌ N0: 976) типичного ЕсЬоор-Ь2О8К1-Ь2, имеющего три связанных домена: Ес Ν-концевой домен (аминокислотные остатки 1-139); ОзК1 (подчеркнутые аминокислотные остатки 142-179); и Ес С-концевой домен (аминокислотные остатки 182270).
На фиг. 71 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΣΌ NО: 977) типичного ЕсЬоор-Ь2811К-Й2. имеющего три связанных домена: Ес Ν-концевой домен (аминокислотные остатки 1-139); 811К (подчеркнутые аминокислотные остатки 142-176); и Ес С-концевой домен (аминокислотные остатки 179267).
На фиг. 72 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΣΌ NО: 978) типичного ЕсЬоор-Ь28ЬК-Ь4, имеющего три связанных домена: Ес Ν-концевой домен (аминокислотные остатки 1-139); 811К (подчеркнутые аминокислотные остатки 142-176); и Ес С-концевой домен (аминокислотные остатки 181267).
На фиг. 73 показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΣΌ NО: 979) типичного ЕсЬоор-Ь4О8К1-Ь2, имеющего три связанных домена: Ес Ν-концевой домен (аминокислотные остатки 1-139); ОзК1 ((подчеркнутые аминокислотные остатки 144-181); и Ес С-концевой домен (аминокислотные остатки 184-272).
На фиг. 74 показано, что 20К пэгилированный 8ЬК[1-35] обеспечивает эффективную блокаду человеческого Ку1.3, как определено электрофизиологическими экспериментами на фиксированной пробе цельных клеток на НЕК293/Ку1.3 клетках. Данные представляют блокаду максимального (пик) тока.
На Фигуре 75 схематически показаны структуры некоторых других типичных вариантов состава по изобретению. X2 и X3 обозначают токсичные пептиды или комбинации линкер-токсичный пептид (т.е. - (Ь)г Р- (Ъ)8-) по данному описанию. Как представлено в данном описании, но не показано на фиг. 75, дополнительный X1 домен и одна или более ПЭГ частиц также охватываются в других вариантах изобретения. Конкретные показанные варианты указаны ниже:
На фиг. 75С, 75Ό, 75О и 75Н показана одноцепочечная молекула, которая также может представлять конструкцию ДНК молекулы.
На фиг. 75 А, 75В, 75Е и 75Е: показаны Ес димеры, связанные двумя дисульфидными связями (в положении Е2); На фиг. 75А и 75В показан димер, имеющий участок токсичного пептида на обеих цепях в положении X1; на фиг. 75Е и 75Е показан димер, имеющий участок токсичного пептида на обеих цепях в положении X2.
На фиг. 76А показано спектральное сканирование 50 мкл продукта 8ЬК[2-35]-Ес, разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Нс\\'1с11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 76В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ
- 15 013470 конечного продукта 8ЬК[2-35]-Ес. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 76С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 70 мкг конечного продукта 8ЬК[2-35]-Ес, вводимого в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 76Ό показаны результата ЬС (ЖХ)-М8 анализа образца конечного продукта 8ЬК[2-35]-Ес с помощью проточной обращенно-фазовой ВЭЖХ на Ад11еп1 1100, причем элюент из колонки непосредственно поступает в источник электрораспыления масс-спектрометра ТЬегто Етпщап с ионной ловушкой ЬС.'О. Релевантные спектры суммируют и развертку масс-спектра получают с помощью программы Вютеогкк.
На фиг. 77А показано спектральное сканирование 20 мкл продукта те1-8ЬК[1-35]-Ес, разведенного в 700 мкл РВ8 (контрольный буфер), на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 в кварцевой кювете с длиной пробега луча 1 см.
На фиг. 77В показан окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ конечного продукта те1-8ЬК|1-35|-Ес. Дорожки 1-12 нагружены следующим образом: стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг невосстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг невосстановленного продукта, контроль, 10 мкг невосстановленного продукта, стандарты белков в широком интервале Ыоуех Магк12 0,5 мкг восстановленного продукта, контроль, 2,0 мкг восстановленного продукта, контроль, 10 мкг восстановленного продукта.
На фиг. 77С показаны результаты эксклюзионной хроматографии 93 мкг конечного продукта те18ЬК[1-35]-Ес, вводимого в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм), в 50 мМ ЫаН2РО4, 250 мМ №1С1 и рН 6,9, при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм.
На фиг. 76Ό показаны результаты анализа методом МАЬО1 масс-спектрометрии образца конечного продукта те!-8ЬК[1-35]-Ес на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ЭЕ-ИР. снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Анализируют положительные ионы в линейном режиме с ускоряющим напряжением 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку для измерения масс осуществляют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
Подробное описание вариантов изобретения
Определение терминов
Термины, применяемые по ходу описания, определяются ниже, если не указано иначе в конкретных примерах.
Выражение фрагмент (частица), продлевающий период полужизни (т.е. Е1 и Е2 в формуле I), относится к фармацевтически активному фрагменту (частице), домену или носителю, ковалентно связанному или конъюгированному с токсичным пептидом, который предупреждает или уменьшает т νίνο протеолитическое расщепление или обеспечивает уменьшающую другую активность химическую модификацию токсичного пептида, повышает период полужизни или другие фармакокинетические свойства, такие, но без ограничения, как повышение скорости всасывания, уменьшает токсичность, повышает растворимость, повышает биологическую активность и/или целевую селективность токсичного пептида по отношению к представляющему интерес целевому ионному каналу, повышает технологичность и/или снижает иммуногенность токсичного пептида по сравнению с неконъюгированной формой токсичного пептида.
Под пэгилированным пептидом понимают пептид или белок, содержащий фрагмент (частицу) полиэтиленгилколя, ковалентно связанный с аминокислотным остатком самого пептида или с пептидильным или с непептидильным линкером (включая, но без ограничения, ароматические линкеры), который ковалентной связью связан с остатком пептида.
Под полиэтиленгликолем или ПЭГ понимают полиалкиленгликоль или его производное, со связывающими агентами или с дериватизацией (или без них) сшивающими или активирующими фрагментами (частицами) (например, альдегидным, гидроксисукцинимидильным, гидразидным, тиольным, трифлатным, трезилатным, азиридиновым, оксирановым, ортопиридилдисульфидным, винилсульфоновым или малеинимидным фрагментом (частицей)). Согласно данному изобретению применимый ПЭГ включает практически линейный ПЭГ, разветвленный ПЭГ или дендритный ПЭГ. (См., например, МеггШ, патент США № 5171264; Натк е1 а1., МиШагтеб, топоГипсЬопак ро1утег Гог соирЬпд ΐο то1еси1ек апб кшГасек, патент США 5932462; 8Ьеп, №та1епшбу1 ро1утег белтаИте^ патент США № 6602498).
Термин пептидное антитело (рерЬЬобу) относится к соединению формулы I, в которой Е1 и/или Е2 обозначает Ес домен иммуноглобулина или его часть (участок) такой как СН2 домен Ес, или в которой токсичный пептид встроен в петлю Ес домена человеческого 1д61, так что Е1 и Е2, каждый, обозначают
- 16 013470 участок (часть) Ес домена, при этом токсичный пептид встроен между ними (см., например, фиг. 70-73 и пример 49 в данном описании). Пептидные антитела по настоящему изобретению могут также быть пэгилированными по данному описанию, см. ниже, либо в Ес домене или на его участке, либо на участке токсичного (токсичных) пептида (пептидов) состава по изобретению, либо и там, и там.
Термин нативный Ес относится к молекуле (фрагменту), или к последовательности, содержащей последовательность неантигенсвязывающего фрагмента, полученную при расщеплении (гидролизе) целого антитела, либо в мономерной, либо в мультимерной форме. Исходный иммуноглобулиновый источник нативного Ес, предпочтительно человеческого происхождения, и может представлять собой любой из иммуноглобулинов, хотя предпочтительными являются 1дС1 или 1дС2. Нативные Ес аге составлены из мономерных полипептидов, которые могут быть связаны в димерные или мультимерные формы ковалентной (например, дисульфидными связями) или нековалентной связью. Число внутримолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами молекул нативного Ес равно от 1 до 4 в зависимости от класса (например, ΙβΟ, ΙβΑ. Ι§Ε) или подкласса (например, Ι§01, Ι§02, Ι§03, Ι§Α1, ΙβΟΑ2). примером нативного Ес является связанный дисульфидной связью димер, полученный при гидролизе ΙβΟ с помощью папаина (см. Ε11^κоη е1 а1. (1982), №с1ею Ααάκ Кек. 10: 4071-9). Термин нативный Ес по данному описанию является родовым для мономерных, димерных и мультимерных форм.
Термин Ес вариант относится к молекуле (фрагмента) или к последовательности, полученной при модификации нативного Ес, но все еще содержащей сайт связывания с рецептором-мусорщиком (утилизатором), ЕсКп. В нескольких опубликованных патентных документах описаны примеры Ес вариантов, а также взаимодействие с рецептором-утилизатором. См. международные заявки ΧνΟ 97/34631 (опубликована 25 сентября 1997 г.); \УО 96/32478, соответствующая патенту США № 6096891, выданному 1 августа 2000 г., вводимые ссылкой в данное описание во всей полноте; и XVО 04/110472. Так, термин Ес вариант включает молекулу (фрагмент) или последовательность, являющейся гуманизированной последовательностью нативного Ес нечеловеческого происхождения. Кроме того, нативный Ес содержит сайты, которые можно удалять, так как они сообщают структурные признаки или биологическую активность, не требующиеся для слитых соединений (молекул) по настоящему изобретению. Так, термин Ес вариант включает фрагмент (молекулу) или последовательность, в которой отсутствует один или более сайтов или остатков нативного Ес, которые влияют на (1) образование, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) Ν-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Ес рецептором, отличным от рецептора-мусорщика, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (Α^СС), или участвуют в них. Подробнее Ес представлены далее в данном описании.
Термин Ес домен охватывает молекулы (фрагменты) и последовательности Ес и Ес вариантов, описанные выше. Что касается Ес вариантов и нативных Ес, термин Ес домен включает молекулы (фрагменты) в мономерной или мультимерной форме, вне зависимости от того, получены они гидролизом (расщеплением) целого антитела или другими способами.
Термин мультимер в приложении к Ес доменам или соединениям, содержащим Ес домены, относится к соединениям, молекулы которых имеют две или более полипептидных цепи, связанные за счет ковалентных, нековалентных или как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий. Молекулы ΙβΟ обычно образуют димеры; ΙβΜ, пентамеры; ΙβΌ, димеры; а ΙβΑ, мультимеры, используя последовательность и результирующую активность нативного Ιβ источника Ес, или дериватизацию (описанную ниже) такого нативного Ес.
Термин димер в применении к Ес доменам или соединениям, содержащим Ес домены, относится к соединениям, молекулы которых имеют две полипептидных цепи, связанные ковалентной или нековалентной связью. Так, примеры димеров, входящих в объем настоящего изобретения, показаны на фиг. 2.
Термины дериватизирующий и производное или дериватизированный включают процессы и полученные соединения, соответственно, в которых: (1) соединение содержит циклический фрагмент; например сшивание цистеинильных остатков в соединении; (2) соединение сшито или имеет сайт для сшивания (перекрестного связывания); например соединение содержит цистеинильные остатки и, следовательно, образует сшитые (перекрестно-связанные) димеры в культуре ш νί\Ό; (3) одна или более пептидильная связь замещена на непептидильную связь; (4) Ν-конец замещен на -ΝΚΚ1, ΝΚ^Ο)Κ\ ^КС(О)ОК\ -ΝΚ8(Ο)2Κ1, -Ν^^ΝΕ^ сукцинимидную группу, или замещенную или незамещенную бензилоксикарбонил-NН-, где К и К1 и заместители в цикле имеют значение по определению ниже; (5) С2 3 4 2 3 4 конец заменен на -С(О)К или -ΝΚ К , где К , К и К имеют значение по определению ниже; и (6) соединения, в которых отдельные аминокислотные фрагменты модифицированы с помощью агентов, способных реагировать с выбранными побочными цепями или концевыми остатками.
Термин пептид относится к соединениям, молекулы которых содержат от 2 примерно до 80 аминокислотных остатков, причем предпочтительными являются соединения, молекулы которых содержат примерно 10-60 аминокислотных остатков, а наиболее предпочтительными являются соединения, молекулы которых содержат примерно 30-50 аминокислотных остатков. Примеры пептидов можно получать произвольно любым известным способом, переносить в пептидную библиотеку (например, библиотеку фагового дисплея) или получать расщеплением белков. В любом пептидном участке составов по изобре
- 17 013470 тению, например во фрагменте токсичного пептида или пептидного линкера по данному описанию, дополнительные аминокислоты можно включать по любому из концов Ν- или С-, или по обоим концам данной последовательности. Конечно, эти дополнительные аминокислотные остатки не должны заметно мешать функциональной активности состава. Токсичные пептиды включают пептиды, имеющие такую же аминокислотную последовательность, что и природный фармакологически активный пептид, который можно выделить из яда, а также включают модифицированные пептидные аналоги таких природных соединений. Примеры токсичных пептидов для применения на практике настоящего изобретения перечислены в табл. 1-32. Токсичный пептид (Р или, равнозначно, Р1 на фиг. 2) содержит по меньшей мере две внутрипептидных дисульфидных связи, как показано, например, на фиг. 9. Следовательно, данное изобретение относится к соединениям, молекулы которых содержат:
а) С'-С'.’3’ и С2-С4 дисульфидное связывание, где С1, С2, С3 и С4 представляют порядок, в котором остатки цистеина присутствуют в первичной последовательности токсичного пептида, традиционно установленный с Ν-конца пептида слева, причем первый и третий цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь и второй и четвертый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь. Примеры токсичных пептидов с таким С1-С3, С2-С4 паттерном дисульфидного связывания включают, но без ограничения, α-конопептиды, Рп1А пептиды, Рп1В пептиды и ΜΙΙ пептиды и аналоги любых из вышеперечисленных пептидов.
б) С!-С6, С2-С4 и С3-С5 дисульфидное связывание, в котором, как описано выше, С1, С2, С3, С4, С5 и С6 представляют порядок, в котором остатки цистеина присутствуют в первичной последовательности токсичного пептида, традиционно установленный с Ν-конца пептида(ов) слева, причем первый и шестой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, второй и четвертый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь и третий и пятый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь. Примеры токсичных пептидов с таким С1-С6, С2-С4, С3-С5 паттерном дисульфидного связывания включают, но без ограничения, БИК, ВдК, НтК, АеКБ, АзК и ЭТХ1 и аналоги любых из вышеперечис ленных пептидов.
в) С!-С4, С2-С5 и С3-С6 дисульфидное связывание, в котором, как описано выше, С1, С2, С3, С4, С5 и С6 представляют порядок, в котором остатки цистеина присутствуют в первичной последовательности токсичного пептида, традиционно установленный с Ν-конца пептида(ов) слева, причем первый и четвертый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, второй и пятый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь и третий и шестой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь. Примеры токсичных пептидов с таким С1-С4, С2-С5, С3-С6 паттерном дисульфидного связывания включают, но без ограничения, СИТх, МдТх, ОБК1, КТХ1, АдТх2, Р12, Р13, ΝΊΧ, НдТх1, ВеКМ1, ВтКТХ, Р01, ВтКК6, Тс32, Те1, ВтТх1, ВтТХ3, 1ЬТх, Р05, БсуТх, ТзК, НаТх1, РгоТХ1, РаТХ2, Р!и1, оСУ1А, оМУНА и БтШа и аналоги любых из вышеперечисленных пептидов.
г) С1-С5, С2-С6, С3-С7 и С4-С8 дисульфидное связывание, в котором С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 и С8 представляют порядок, в котором остатки цистеина присутствуют в первичной последовательности токсичного пептида, традиционно установленный с Ν-конца пептида(ов) слева, причем первый и пятый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, второй и шестой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, третий и седьмой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь и четвертый и восьмой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь. Примеры токсичных пептидов с таким С1-С5, С2-С6, С3-С7, С4-С8 паттерном дисульфидного связывания включают, но без ограничения, Аииогос!охт (АпТх), Р11, НзТх1, МТХ (Р12А, Р20А) и Р14 и аналоги любых из вышеперечисленных пептидов.
д) С1-С4, С2-С6, С3-С7 и С5-С8 дисульфидное связывание, в котором С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 и С8 представляют порядок, в котором остатки цистеина присутствуют в первичной последовательности токсичного пептида, традиционно установленный с Ν-конца пептида(ов) слева, причем первый и четвертый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, второй и шестой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, третий и седьмой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь и пятый и восьмой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь. Примеры токсичных пептидов с таким С!-С4, С2-С6, С3-С7, С5-С8 паттерном дисульфидного связывания включают, но без ограничения, хлоротоксин, Вт-12Ь и аналоги любого из них.
е) С1-С5, С2-С6, С3-С4 и С7-С8 дисульфидное связывание, в котором С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7 и С8 представляют порядок, в котором остатки цистеина присутствуют в первичной последовательности токсичного пептида, традиционно установленный с Ν-конца пептида(ов) слева, причем первый и пятый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, второй и шестой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь, третий и четвертый цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь
- 18 013470 и седьмой и восьмой цистеиновые остатки в аминокислотной последовательности образуют дисульфидную связь. Примеры токсичных пептидов с таким С1-С5, С2-С6, С3-С4, С7-С8 паттерном дисульфидного связывания включают, но без ограничения, пептиды мауротоксина (Маиго1охт) и его аналоги.
Термин рандомизированный по данному описанию относится к полностью случайным последовательностям (например, выбранных методом фагового дисплея) и последовательностям, в которых один или более остатков в молекуле природного соединения заменен на аминокислотный остаток, не присутствующий в этом положении в молекуле природного соединения. Типичные методы идентификации пептидных последовательностей включают фаговый дисплей, Е. сой дисплей, рибосомный дисплей, скрининг дрожжей, РНК-пептидный скрининг, химический скрининг, рациональный дизайн, структурный анализ белков и т.п.
Выражение физиологически активный означает, что описанное таким образом вещество, как определено, обладает активностью, которая влияет на медицинский показатель (например, кровяное давление, количество лейкоцитов, уровень холестерина) или болезненное состояние (например, рак, аутоиммунные нарушения). Так, фармакологически активные пептиды представляют собой агонистические пептиды, или миметики, и антагонистические пептиды, определяемые ниже.
Термины -пептид-миметик и -пептид-агонист (пептидный агонист) относятся к пептиду, обладающему биологической активностью, сравнимой с активностью природного токсичного пептида, например природного 8кК токсичного пептида. Кроме того, эти термины включают пептиды, которые непрямо имитируют активность природного токсичного пептида, например, усиливая эффект природного соединения.
Термин -антагонистический пептид (пептид-антагонист) или ингибирующий пептид относится к пептиду, который блокирует биологическую активность представляющего интерес рецептора или каким-то образом препятствует ее осуществлению, или обладает биологической активностью, сравнимой с биологической активностью известного антагониста или ингибитора представляющего интерес рецептора (такого, но без ограничения, как ионный канал).
Термин кислый остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, содержащие кислотные группы. Примеры кислых остатков включают Ό и Е.
Термин амидный остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, содержащие амидные производные кислот. Примеры остатков включают Ν и О.
Термин ароматический остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, содержащие ароматические группы. Примеры ароматических остатков включают Е, Υ и У.
Термин основной остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, содержащие основные группы. Примеры основных остатков включают остатки Н, К, В, Ν-метиларгинина, ω-аминоаргинина, ω-метиларгинина, 1-метилгистидина, 3-метилгистидина и гомоаргинина (кВ).
Термин гидрофильный остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, содержащие полярные группы. Примеры гидрофильных остатков включают остатки С, 8, Τ, Ν, О. Ό, Е, К и цитриллина (Сй).
Термин нефункциональный остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, в которых отсутствуют кислые, основные или ароматические группы. Примеры нефункциональных аминокислотных остатков включают М, С, А, V, I, Ь и норлейцин (ΝΒ).
Термин нейтральный полярный остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, в которых отсутствуют кислые, основные или полярные группы. Примеры нейтральных полярных остатков включают А, V, Ь, I, Р, У, М и Е.
Термин полярный гидрофобный остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ьформе, имеющим побочные цепи, содержащие полярные группы. Примеры полярных гидрофобных остатков включают Т, С, 8, Υ, С, О и Ν.
Термин гидрофобный остаток относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, имеющим побочные цепи, не содержащие основных или кислых групп. Примеры гидрофобных остатков включают А, V, Ь, I, Р, У, М, Е, Τ, С, 8, Υ, С, О и Ν.
В некоторых применимых вариантах составов по изобретению аминокислотная последовательность токсичного пептида модифицируется одним или более способов по сравнению с представляющей интерес последовательностью нативного токсичного пептида, такого, но без ограничения, как последовательность нативного 8кК или О8К1 их пептидных аналогов или любых других токсичных пептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в любой из табл. 1-32. Одна или более применимых модификаций может включать аминокислотные добавления или инсерции, аминокислотные делеции, усечения (процессинг) пептидов, аминокислотные замены и/или химическую дериватизацию аминокислотных остатков, осуществляемую известными химическими методами. Такие модификации можно осуществлять, например, с целью повышения эффективности, селективности и/или протеолитической стабильности или т.п. Специалистам в данной области техники известны методы дизайна пептидных аналогов с такими улучшенными свойствами, такие как аланиновый сканирующий мутагенез, ра
- 19 013470 циональный дизайн с учетом опосредованного выравниванием мутагенеза с применением последовательностей известных токсичных пептидов и/или молекулярное моделирование. Например, аналоги 8кК можно создавать таким образом, чтобы удалить сайты расщепления протеазами (например, сайты расщепления трипсином в остатках К или Р и/или сайты расщепления химотрипсином в остатках Е, Υ или в составе по изобретению, содержащем 8кК пептид или 8кК аналог, частично с помощью мутагенеза на основании выравнивания последовательностей с применением НтК (см., например, фиг. 6) и молекулярного моделирования (см., например, Ка1тап е! а1., 8кК-Оар22, а ро1еп1 Ку1.3-8ресбю ттипокирргеккгуе ро1урерббе, I. Вю1. Скет. 273(49): 32697-707 (1998); Кет е! а1., патент США № 6077680; Мойка! е! а1., ОзК1 белтайте^ международная патентная заявка \¥О 2006/002850 А2)).
Термин протеаза является синонимом пептидазы. Протеазы представляют собой ферменты двух групп: эндопептидазы, которые расщепляют пептидные связи внутри белка, и экзопептидазы, которые удаляют одну или более аминокислот в Ν- или С-конце соответственно. Термин протеиназа также используют в качестве синонима эндопептидазы. В зависимости от механизма протеиназы делятся на четыре класса: сериновые протеиназы, цистеиновые протеиназы, аспарагиновые протеиназы и металлопротеиназы. Помимо этих классов в номенклатуре ферментов существует раздел протеаз, которые относятся к протеазам с неидентифицированным каталитическим механизмом. Это указывает, что каталитический механизм не определен.
Номенклатура субсайтов расщепления традиционно берется из схемы, созданной 8скеск!ег апб Вегдег (8скеск!ег I. & Вегдег А., Оп !ке δί/е о£ !ке ас!ке §йе ш рго!еа§е8. I. Рарат, Вюскетюа1 апб Вюркуыса1 Рехеагск Соттишсакоп, 27: 157 (1967); 8скеск!ег I. & Вегдег А., Оп !ке ас!ке 8Йе о£ рго!еа§е8. 3. Марртд !ке ас!ке §йе о£ рарат; зресШс 1пк1Ьйог рерббез о£ рарат, Вюскетюа1 апб Вюрку81са1 Кезеагск Соттишсакоп, 32: 898 (1968)). Согласно этой модели аминокислотные остатки в субстрате, подвергающемся расщеплению, обозначаются Р1, Р2, Р3, Р4 и т.д. в направлении к Ν-концу от сайта расщепления. Аналогично, остатки в направлении к С-концу обозначают Р1', Р2', Р3', Р4' и т.д.
Опытному специалисту известны разнообразные вспомогательные программы для идентификации представляющих интерес сайтов связывания или расщепления протеазами. Например, программа РерббеСийег доступна через сервер ЕхРА8у (Ехрей Рго!ет Апа1у818 8уз!ет) рго!еотю8 Швейцарского института биоинформатики (8\νίδδ 1п§!йи!е о£ Вю1п£огтабс8, (81В; тетете.ехраку.огдйоок/рерббесийег)). Программа РерйбеСийег позволяет искать белковую последовательность в базах данных 8ХУ188-РРОТ и/или ТгЕМВЬ или проводить поиск сайтов расщепления протеазами в белковой последовательности пользователя. Можно использовать единичные протеазы и химические реагенты, селекцию или целый перечень протеаз и химических реагентов. Имеются различные виды результат-параметров: таблицы сайтов расщепления, либо сгруппированных в алфавитном порядке по названиям ферментов, либо последовательно, по числу аминокислот. Третий вариант для результат-параметров представляет собой карту сайтов расщепления. Последовательность и сайты расщепления, картированные на ней, группируются в блоки, размер которых выбирается пользователем. Также известны другие программы для определения сайтов расщепления протеазами (например, Тигк, В. е! а1., Эе!егттайюп о£ рго!еа§е с1еауаде §йе той£§ иыпд т1х!иге-Ьа8еб олегНеб рерйбе ИЬгапез, №1Шге Вю!ескпо1оду, 19: 661-667 (2001); Ваггей А. е! а1., НапбЬоок о£ рго!ео1уйс еи/утех, Асабетю Рге§8 (1998)).
Сериновые протеазы включают семейство химотрипсина, которое включает протеазы млекопитающих, такие как химотрипсин, трипсин, или эластазу, или калликреин. Сериновые протеиназы проявляют различные специфичности в отношении субстратов, которые связаны с аминокислотными заменами в различных субсайтах ферментов, взаимодействующих с остатками субстратов. Некоторые ферменты содержат протяженный сайт, взаимодействующий с субстратом, тогда как другие имеют специфичность, ограниченную остатком субстрата Р1.
Трипсин предпочтительно расщепляет по Р или К в положении Р1. В статистическом исследовании, проведенном Кеб (1992), описывается негативное влияние остатков, окружающих Агд- и Ьуз-связи (т.е. положения Р2 и Р1' соответственно) в процессе расщепления трипсином. (Кеб, В., 8ресбюйу о£ рго!ео1у818, 8ргтдег-Уег1ад Вег1т-Не1бе1Ьегд-№те Υо^к, 335 (1992)). Остаток пролина в положении Р1' обычно оказывает мощное негативное влияние на расщепление трипсином. Аналогично, позиционирование Р и К в Р1' приводит к ингибированию, так же как отрицательно заряженные остатки в положениях Р2 и Р1'.
Химиотрипсин предпочтительно расщепляет по ^, Υ или Е в положении Р1 (высокая специфичность) и, в меньшей степени, по Ь, М, Н остатку в положении Р1. (Кеб, 1992). Далее приводятся исключения из этого правила: когда находится в положении Р1, расщепление блокируется, когда одновременно М или Р находятся в положении Р1'. Кроме того, остаток пролина в положении Р1' почти полностью блокирует расщепление вне зависимости от того, какая аминокислота находится в положении Р1. Когда остаток М находится в положении Р1, расщепление блокируется в присутствии остатка Υ в положении Р1'. Наконец, когда Н локализован в положении Р1, присутствие Ό, М или остатка также блокирует расщепление.
Мембранная металлоэндопептидаза (ΝΈΒ; нейтральная эндопептидаза, нейтральная протеиназа щеточной каймы, энкефалиназа, ЕС 3.4.24.11) расщепляет пептиды по аминоконцу гидрофобных аминокис
- 20 013470 лотных остатков (Соиие11у, ГС. е! а1., №и!га1 Еийорерййа8е 24.11 ίη Нитаи №и1горЫ18: С1еауаде оГ Сйето1асйс Рерййе, РNΑδ, 82(24): 8737-8741 (1985)).
Тромбин предпочтительно расщепляется по В остатку в положении Р1 (Кей, 1992). Нейтральный субстрат тромбина представляет собой фибриноген.
Оптимальными сайтами расщепления являются сайты, когда остаток К находятся в положении Р1, а О1у находится в положении Р2 и положении Р1'. То же самое относится к варианту, когда гидрофобные остатки аминокислот находятся в положении Р4 и положении Р3, остаток пролина в положении Р2, остаток К в положении Р1 и некислый аминокислотный остаток находится в положении Р1' и положении Р2'. Очень важным остатком для его (трипсина) природного субстрата фибриногена является остаток Ό в Р10.
Каспазы представляют собой семейство цистеиновых протеиназ, несущих активный сайт с консервативно аминокислотной последовательностью и расщепляющих пептиды специфически после остатков О (Еаги8Йа\ ^.С. е! а1., Маттайаи сазразез: δΐΐ’ΐιοίιιΐΐ, асйуайои, 8иЬ81га1е8, аид Гиисйоиз йипид арор1о818, Аиииа1 Кеу1е\ оГ Вюсйет181гу, 68: 383-424 (1999)).
Агд-С протеиназы предпочтительно расщепляют по К остатку в положении Р1. На поведение при расщеплении, по-видимому, лишь умеренно влияют остатки в положении Р1' (Кей, 1992). ТЬе Азр-Ν еийорерййа8е с1еауе8 8рес1йса11у Ьоий8 \ΐΐΗ а Ό ге81йие ш ро8йюи Р1' (Кей, 1992).
Вышеприведенное является лишь примерным, но ни в коем случае не исчерпывающим изложением сведений, доступных специалисту в данной области техники, относительно сайтов связывания и/или расщепления протеазами, которые могут быть интересны специалисту при практическом применении изобретения.
В других примерах аминокислотная последовательность токсичного пептида, полученная модификацией аминокислотной последовательности природного токсичного пептида, включает по меньшей мере один аминокислотный остаток, введенный в виде инсерции или замены, по сравнению с представляющей интерес нативной аминокислотной последовательностью токсичного пептида, в которой аминокислотный остаток, введенный в виде инсерции или замены, имеет боковую цепь, содержащую нуклеофильную или электрофильную реакционноспособную (реактивную) функциональную группу, с помощью которой пептид конъюгируется с линкером или с частицей, продлевающей период полужизни. Согласно изобретению применимые примеры таких нуклеофильных или электрофильных реактивных функциональных групп включают, но без ограничения, тиольную, первичную амино-, селено, гидразидную, альдегидную, карбоновой кислоты, кето-, аминоокси-, замаскированную (защищенную) альдегидную или замаскированную (защищенную) кето-функциональную группу. Примеры аминокислотных остатков с боковой цепью, содержащей нуклеофильную реактивную функциональную группу, включают, но без ограничения, остаток лизина, остаток α,β-диаминопропионовой кислоты, остаток α,γдиаминомасляной кислоты, орнитин, цистеин, гомоцистеин, остаток глутаминовой кислоты, остаток аспарагиновой кислоты, остаток селеноцистеиновой кислоты.
В представленных подробно в данном описании токсичных пептидах однобуквенная система сокращения часто применяется для обозначения двадцати канонических аминокислотных остатков, обычно входящих в состав природных пептидов и белков (табл. 1А). Такие однобуквенные сокращения совершенно идентичны (взаимозаменяемы) по значению трехбуквенным сокращениям или несокращенным названиям аминокислот. В однобуквенной системе сокращения, применяемой в данном описании, заглавная буква указывает на й-аминокислоту, а строчная указывает на Ό-аминокислоту, если в данном описании не указано иначе. Например, сокращение К обозначает й-аргинин, а сокращение г обозначает Ό-аргинин.
Таблица 1 А Однобуквенные сокращения для канонических аминокислот
Трехбуквенные сокращения даны в скобках
Аланин (А1а)А
Глутамин (О1п)О
Лейцин (Ееи)Ь
Серин (8ег)8
Аргинин (Агд)В.
Глутаминовая кислота (Сг1и)Е
Лизин (Ьуз)К
Треонин (Тйг)Т
Аспарагин (Азп)N
- 21 013470
Глицин (С1у) О
Метионин (Мер М
Триптофан (Тгр)
Аспарагиновая кислота (Азр) ϋ
Гистидин (Ηίδ) Η
Фенилаланин (РЬе) Р
Тирозин (Туг) Υ
Цистеин (Суз) с
Изолейцин (Не) I
Пролин (Рго) Р
Валин (Уа1) V
Аминокислотная замена в аминокислотной последовательности обычно в данном описании обозначается следующим образом: однобуквенное сокращение для аминокислотного остатка в конкретном положении, затем номер положения аминокислоты относительно интересующей последовательности нативного токсичного пептида, а затем однобуквенный символ замещающего аминокислотного остатка. Например, Т30Э символизирует замену остатка треонина на аспартат в аминокислотном положении 30 относительно гипотетической нативной последовательности токсичного пептида. Еще пример, К18ЕК или К18С1Г' указывает на замену остатка аргинина на остаток гомоаргинина или цитруллина, соответственно, в аминокислотном положении 18 относительно гипотетического нативного токсичного пептида. Положение аминокислоты в аминокислотной последовательности любого конкретного токсичного пептида (или пептидного аналога) по данному описанию может отличаться от его положения в нативной последовательности, т.е. определяемом при выравнивании \-концевой или С-концевой аминокислотной последовательности пептида с \-концевой или С-концевой, если она подходит, нативной последовательностью токсичного пептида. Например, положение аминокислоты 1 в последовательности 8СГОТ]РК8КСТАЕрСКН8МКУКЬ8ГСККТСОТС (8ЕК(2-35); 8ЕА ΙΌ N0: 92), усечение (процессирование) по \-концу нативной 8ЕК последовательности, выравниваемой поэтому с С-концом нативного 8ЕК(1-35) (81X) ΙΌ N0: 5), соответствует положению аминокислоты 2 относительно нативной последовательности, а положение аминокислоты 34 в 8ЕО ΙΌ N0: 92 соответствует положению аминокислоты 35 относительно нативной последовательности (8ЕР ΙΌ N0: 5).
В некоторых вариантах настоящего изобретения аминокислотные замены охватывают неканонические аминокислотные остатки, которые могут включать природные редкие (в пептидах или белках) аминокислотные остатки или неприродные аминокислотные остатки. Неканонические аминокислотные остатки скорее можно вводить в пептид химическим пептидным синтезом, нежели синтезом в биологических системах, таким как экспрессия генов в рекомбинантных клетках, или же специалист в данной области техники может использовать известные методы генной инженерии, в которых применяется экспрессия генов в рекомбинантных клетках (см., например, Ь1пк ей а1., \о11-сапошса1 атшо ас1бз т рго(ет епдтееппд, Сиггеп! 0ртюп т Вю(есЕпо1оду, 14(6): 603-609 (2003)). Термин неканоническая аминокислота относится к аминокислотным остаткам в Ό- или Ь-форме, которые отсутствуют среди 20 канонических аминокислот, обычно входящих в состав природных белков, к остаткам β-аминокислот, гомоаминокислот, циклических аминокислот и аминокислот с дериватизированными боковыми цепями. Примеры включают (в Ь-форме или Ό-форме) цитруллин (С11), гомоцитруллин (НС11), ^метилцитруллин (ХМеСй), ^метилгомоцитруллин (\МеНоС11), орнитин (0гп или О), Х-мечилорнитин (ХМе0гп), саркозин (8аг), гомолизин (ЕК или 1 Пуз), гомоаргинин (ЕК или ЕАгд), гомоглутамин (ПО), N-метиларгинин (NΜеК), IVметиллейцин ^МеЬ), N-метилгомолизин ^МеНоК), ^метилглутамин е<)), норлейцин (Ме), норвалин (№а), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин (Т1с), нитрофенилаланин (пЕторЕе), аминофенилаланин (атторЕе), бензилфенилаланин (Ьеп:гу1рЕе), γ-карбоксиглутаминовую кислоту (у-сагЬоху§1и), гидроксипролин (Еубгохурго), п-карбоксил-фенилаланин (Сра), α-аминоадипиновую кислоту (Ааб), ацетиларгинин (асе1у1агд), α,β-диаминопропионовую кислоту (Орг), α,γ-диаминомасляную кислоту (ЭаЬ), диаминопропионовую кислоту (Пар), в-(1-нафтил)аланин (1№1), в-(2-нафтил)аланин (2№1), циклогексилаланин (СЕа), 4-метил-фенилаланин (МеРЕе), β,β-дифенилаланин (В1РЕА), аминомасляную кислоту (АЬи), 4фенил-фенилаланин (4В1р), α-аминоизомасляную кислоту (А1Ь) и дериватизированные формы любого из этих остатков по данному описанию. Номенклатура и символы для обозначения аминокислот и пептидов объединенной комиссии по биохимической номенклатуре иР АС-П.’В (Зо1'п1 Сотпиззтп оп ВюсЕет1са1 ^тепс^ите (ЗСВ^) опубликованы в следующих документах: ВюсЕет. I., 1984, 219, 345-373; Еиг. I. ВюсЕет., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; ШетаЕ I. РерЕ РгоЕ Кез., 1984, 24, после р 84; I. Вю1. СЕет., 1985, 260, 14-42; Риге Арр1. СЕет., 1984, 56, 595-624; Атто Ас1бз апб РерЕбез, 1985, 16, 387-410; ВюсЕетгоа1 Штепс^ше апб Ке1а1еб ПоситепГз, 2пб еб1Еоп, РогЕапб Ргезз, 1992, радез 39-69.
Как заявляется в данном описании, в соответствии с настоящим изобретением пептидные участки составов по изобретению, такие как токсичный пептид или пептидный линкер, можно также дериватизи
- 22 013470 ровать химическими методами по одному из аминокислотных остатков. Пептиды. которые содержат дериватизированные аминокислотные остатки. можно синтезировать известными методами органического синтеза. Химическое производное или химически дериватизированный по отношению к пептиду относится к пептиду по изобретению. содержащему один или более остаток. дериватизированный по химической реакции функциональной боковой группы. Такие дериватизированные соединения (молекулы) включают. например. соединения. в которых аминогруппы дериватизированы с образованием гидрохлоридов аминов. п-толуолсульфонильных групп. карбобензоксигрупп. трет-бутилоксикарбонильных групп. хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбонильные группы можно дериватизировать с образованием солей. сложных метиловых и этиловых эфиров или других сложных эфиров и гидразидов. Свободные гидроксильные группы можно дериватизировать с образованием О-ацильных или Оалкильных производных. Имидазольный азот в гистидине можно дериватизировать с образованием Иш(имидазол)бензилгистидина. Также в виде химических производных включены те пептиды. которые содержат одно или более производных двадцати канонических природных аминокислот либо в Ь-. либо в Ό-форме. Например. 4-гидроксипролин можно использовать вместо пролина; 5-гидроксилизин можно использовать вместо лизина; 3-метилгистидин можно использовать вместо гистидина; гомосерин можно использовать вместо серина и орнитин можно использовать вместо лизина.
В некоторых вариантах настоящего изобретения основные остатки (например. лизин) представляющего интерес токсичного пептида можно заменить на другие остатки (предпочтительны нефункциональные остатки). Такие соединения менее основны. чем соединения. из которых они образованы. и иным образом сохраняют активность соединений. из которых они образованы. что в результате может дать лучшие показатели стабильности и иммуногенности; однако. настоящее изобретение не следует ограничивать этой теорией.
Кроме того. физиологически приемлемые соли составов по изобретению также охватываются настоящим изобретением. включая те случаи. когда составы по изобретению называются в данном описании молекулы или соединения. Под физиологически приемлемыми солями понимают любые соли. о которых известно. или позже найдено. что они являются фармацевтически приемлемыми. Некоторые примеры представляют собой ацетаты; трифторацетаты; гидрогалогениды. такие как гидрохлориды или гидробромиды; сульфаты; цитраты малеаты; тартраты; гликоляты; глюконаты; сукцинаты; мезилаты; безилаты и оксалаты.
Структура соединений
В целом. Рекомбинантные белки в качестве терапевтических агентов получают. наряду с другими методами. ковалентным связыванием с фрагментами (частицами). продлевающими период полужизни. Такие фрагменты включают Рс домен антитела. используемый в энбреле (ЕпЬге1® (этанерцепт)).а также биологически подходящие полимеры (например. полиэтиленгликоль или ПЭГ). применяемый в №и1а§1а® (пегфилграстим). Бефе е1 а1. описали применение таких продлевателей периода полужизни в патента США № 6660843. выданном 9 декабря 2003 г. (вводится в данное описание ссылкой во всей полноте).
Авторы настоящего изобретения установили. что соединения по данному изобретению - пептиды. состоящие примерно из 80 аминокислот или менее и содержащие по меньшей мере две внутрипептидных дисульфидных связи. становятся терапевтически более предпочтительными. когда они связываются ковалентной связью с фрагментами. продлевающими период полужизни. Кроме того. соединения по настоящему изобретению могут содержать дополнительный фармакологически активный ковалентно связанный пептид. который может быть связан с фрагментом. продлевающим период полужизни (Р1 и/или Р2). или с пептидным участком (Р). Варианты составов по изобретению. содержащие более одного фрагмента. продлевающего период полужизни (Р1 и Р2). включают такие составы. в которых Р1 и Р2 представляют собой одинаковые или различные фрагменты. продлевающие период полужизни. Примеры (содержащие или не содержащие линкер между каждым доменом) включают структуры. показанные на фиг. 75. а также следующие варианты изобретения (и другие по данному описанию и в других представленных примерах).
20КРЕС-токсичный пептид-Рс домен. соответствующий формуле |(Н1)1-(Х2)|-(Г2)||; 20КРЕС-токсичный пептид-Рс СН2 домен. соответствующий формуле [<Г1)1-(Х2)1-(Р2)1]; 20КРЕС-токсичный пептид-Н8А. соответствующий формуле [(Р1)2(Х2)1-(Р2)1];
20КРЕС-Рс домен-токсичный пептид. соответствующий формуле [(Р1)1-(Р2)1-(Х3)1];
20КРЕС-Рс СН2 домен-токсичный пептид. соответствующий формуле [(Р1)1-(Р2)1-(Х3)1]; И 20КРЕС-НА8-токсичный пептид. соответствующий формуле [(Р1)1-(Р2)1-(Х3)1].
Токсичные пептиды. По данному изобретению можно использовать любое число токсичных пептидов (т.е. Р или эквивалентное ему Р1 на фиг. 2). Особый интерес представляют токсичные пептиды 8НК. НтК. МдТх. АдТх2. 0кК1 (также называемые 08К1). агатоксины и НкТх1. а также их модифицированные аналоги и другие пептиды. которые имитируют активность таких токсичных пептидов. Как заявляется выше в данном описании. если в составе по изобретению присутствует более одного токсичного пептида Р. Р может независимо быть одинаковым или от другого (других) токсичного (токсичных) пеп- 23 013470 тида (пептидов), также присутствующего (присутствующих) в составе по изобретению. Например, в составе, имеющем формулу Р-(Е)§-Е1-(Ь)^-Р, оба токсичных пептида Р могут быть одинаковыми пептидными аналогами 8йК, различными пептидными аналогами 8йК или один может быть пептидным аналогом 8йК, а другой может быть пептидным аналогом 08К1.
В некоторых вариантах изобретения другие важные пептиды особенно применимы в соединениях, имеющих дополнительные признаки по сравнению с соединениями структурной формулы I. В таких соединениях молекула формулы I включает, кроме того, дополнительный фармакологически активный ковалентно связанный пептид, являющийся агонистическим пептидом, антагонистическим пептидом или нацеливающим пептидом; эти пептиды могут быть конъюгированы с Е1, или Е2, или Р. Такие агонистические пептиды обладают активностью, агонистической к токсичному пептиду, но не обязательной, такая активность проявляется по тому же механизму, что и у токсичного пептида. Пептидные антагонисты также применимы в вариантах изобретения, причем предпочтительными являются пептидные антагонисты, обладающей активностью, которая может быть комплементарной активности токсичного пептида. Нацеливающие пептиды также представляют интерес как пептиды, направляющие соединение к конкретным типам клеток, конкретным органам и т.п. Эти классы пептидов можно обнаружить методами, представленными ссылочными материалами, цитируемыми в данном описании, и в других ссылочных материалах. В частности, фаговый дисплей применим в данном описании для получения токсичных пептидов. Аффинную селекцию при использовании библиотек случайных пептидов можно применять для идентификации пептидных лигандов для любого сайта любого генного продукта. Иейтап е! а1. (1993), 3. Βΐο1. Сйет. 268: 23025-30. Фаговый дисплей особенно пригоден для идентификации пептидов, которые связываются с такими представляющими интерес белками, как рецепторы клеточной поверхности или любые белки, имеющие линейные эпитопы. ХУПзоп е! а1. (1998), Сап. I. М1сгоЪю1. 44: 313-29; Кау е! а1. (1998), Огиу И18с. Тобау 3: 370-8. Подробный обзор таких белков см. в Нек е! а1. (1997), I. Кесер!ог апб 81§па1 Тгапзйисйоп Кез. 17(5): 671-776, который вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Такие представляющие интерес белки являются предпочтительными для применения в данном изобретении.
Особенно предпочтительные пептиды представлены в нижеприведенных таблицах. Эти пептиды можно приготовить методами, раскрываемыми в уровне техники или далее в данном описании. Используются однобуквенные сокращения аминокислот. Если не указано иначе, каждый X обозначает независимо нефункциональный остаток.
Таблица 1
Пептидные последовательности ингибиторов Ку1.3
Последовательность/структура Краткое обозначен» е 8ЕО Π)ΝΟ:
ЕУКСКбТЗОСОКРСОООТОСРХЗКСШКМСКСУОС ΡΪ1 21
Т18СТИРКрСУРНСККЕТОУРКАКСМЯККСКСРОК ΡΪ2 17
ткстхекосуз^нсккетсурхакслшексксрок ΡΪ3 18
1ЕА1КСО<38КОСУКРСОККТССРХАКС1ХКТСКСУС}С8 ΡΪ4 19
АЗСКТРКОСАОРСЕКЕТОСРУСКСМЖКСКО'ЖС НзТх1 61
аУРШУЗСТОЗРрСГКРСКОАСМКРСКСМНЕКСНСТРК А§Тх2 23
СУРШУКСТСЗРОСЕКРСКОАОМКРаКСШОКСНСТРК А§Тх1 85
ОУ1ШУКСК18К9СЕЕРСККАСМКРОКСМХ6КСНСТРК О8К1 25
гКЕСТОРОНСТХРСККИКСТНОКСМКЕКСКСРХСК АпигосГохт 62
ТПХУКСТЗРК^СЗКРСКЕЬУОЗ δΑΟΑΚΟΜΝΟΚΟΚΟΥΝΝ ΝΤΧ 30
ТУГОУКСТ8РК0СЬРРСКА9РО1КА6АКСМЫ(ЗКСКСУРН НёТх1 . 27
9РТХУ8СТТ8КЕС\¥8УСРК.ЕНЫТ8КС;КСМЫККСКСУ8 СЬТх 36
УРШАКСКбЗРЕСЬРКСКЕАЮКААСтКСММОКСКСУР ΤίΐγδΐοχίηКа 86
УСКОХУРКЕТАСКНАКЗЕОКСКТЗРКУКАЫСАКТСЕЕС вёк 9
УОШУКСКИЗООСЬКРСКОАСМКРСКСШСКСОСТРКО ВтКТХ 26
0ГТОУКСТС8К0СХУРУСК0МР(ЖРХОКСМХЖСКСУ8 ВтТх1 40
УРГМУКСЕСгЗКЕСЕРАСКААУСгКААСгКСМХОКСКСУР ТсЗО 87
ΤСΡ^ΤΤС^ΑΑΜСΕΑΟСΚ(^^θΚ8ΜΕ8С^σ^ΤСΚСΚΑ Тс32 13
- 24 013470
Таблица 2
Последовательности 8кК пептида и аналогов 8кК пептида
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е(2 ΙΟΝΟ:
К8СГОТ1РК8КСТАРОСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8ЪК 5
К8СГОТ1РК8КСТАРр8КН8МКУКЕ8РСККТ8ОТС 8ЪК-817/832 88
К88ШТ1РК8КСТАРРСКЕ[8МКУК1^8РСККТСОТ8 8РК-83/835 89
88СГОТ1РК8КСТАРРСКН8МК¥КЬ8РСККТССТС 8РК-81 90
(Ν-ацетилагд) ЗСГОТГРКЗКСТАРрСКНЗМКУКЬЗРСККТССТС 8ЬК-Я-асе1у1аг§1 91
8СЮТ1РК8КСТА1^СКН8МКУК1,8РСкКТССТС 8ЬК-Л 92
СШТ1РК8КСТАРОСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8РК-62 93
А8СГОТ1РК8В.СТАРрСКН8МКУКЕ8РСККТССТС 8НК-А1 94
КЗСАОТВРКЗКСТАРрСКНЗМКУШАРСККТССТС 8ИК-А4 95
К8САОТ1РК8КСТААрСКН8МКУКЪ8РСККТСОТС 8РК-А4/А15 96
КЗСАОТШКЗЕСТААРСКНЗМКУКАЗРСККТССТС 8ЙК-А4/А15/А25 97
К8США1РК8КСТАРрСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8РК-А6 98
К8СШТАРК8КСТАРрСКН8МКУКР8РСККТСОТС 8ИК-А7 99
К8СШТ1АК8К.СТАРрСКН8МКУКЬ8РСВКТССгТС 8ИК-А8 100
К8СЮТ1РА8КСТАР0СКН8МК¥К1,8РСККТСОТС 8РК-А9 101
К8СШТ1РЕ8КСТАРрСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8ЙК-Е9 102
Κ8СI^ΤIΡ^8ΚСΤΑΡ^СΚΗ8ΜΚΥΚ^8ΡСΚΚΤСΟΤС ЗЬК-09 103
К8СГОТ1РКАКСТАР9СБСН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8РК-А10 104
К8СШТ1РК8АСТАРРСКН8МКУКЬ8РСККТССТС ЗЬК-АП 105
Е8СГОТ1РК8ЕСТАР9СКН8МК¥КЬ8РСККТСОТС 8НК-Е11 106
К8СГОТП)К8рСТАРрСКН8МКУ1Ш8РСККТСетС 8РК-011 107
Е8СШТ1РК8КСААР9СКН8МКУкЕ8РСККТСаТС 8РК-А13 108
К8СГОТПЖ8КСТААОСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8ЙК-А15 109
К8СЮТ1РК8КСТАЛ¥рСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС К8СШТ1РК8КСТАХ5|5рСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8ЪКАУ15 8РК-Х15 110 111
Е8СШТ1РК8ЕСТААОСКН8МКУКА8РСККТССТС 8РК-А15/А25 112
К8СГОТ1РК8КСТАРАСКН8МКУКЕ8РСККТС6ТС 8ЙК-А16 113
КЗСЮТШКЗКСТАРЕСКНЗМКУЕЬЗРСШСТССТС 8ЪК-Е16 114
КЗСГОТГРКЗКСТАРОСАНЗМКУКЬЗРСККТССТС 8ЕК-А18 115
К8СГОТ1РК8КСТАРОСЕН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8РК-Е18 116 .
К8СГОТ1РК8КСТАР'0СКА8МКУКЕ8РСККТС6ТС 8ЙК-А19 117
К8СШТ1РК8ЕСТАР9СКК8МКУЕЬ8РСККТСаТС 8ВК-К19 118
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКНАМКУКЕ8РСККТСОТС 8ЙК-А20 119
К8СШТ1РК8КСТАРрСКН8АКУКЕ8РСККТС6ТС 8РК-А21 120
^ЗСШгёКЗКСТАРОСКНЗХ^ТУБЁ^РСЁКТСОТС 8РК-Х21 121
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8(пог1еи)КУКЬ8РСККТСС}ТС 8ЬК-Ме21 122
К8СЮТ1РК8РСТАРрСКН8МАУКЬ8РСККТСОТС 8РК-А22 123
КЗСГОТГРКЗКСТАРОСКНЗМЕУКЬЗРСККТССТС 8РК-Е22 124
К8СГОТ1РК8КСТАРОСКН8МКУКЕ8РСККТССТС 8НК-К22 125
К8СГОТ1РК8КСТАРРСКН8МХ522УКЕ8РСККТСОТС 8РК-Х22 126
К8СГОТ1РК8КСТАР9СКН8М(пог1еи)УКЬ8РСККТСОТС 8ЬК-Ме22 127
К8СШТ1РК8КСТАРрСКН8М(от)УКЕ8РСККТС<ЭТС 8ЬК- Огп22 128
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКЕ18М(11отосй)УКЬ8РСККТСОТС 8ЬК- Нотосй22 129
К8СШТП>К8КСТАР9СКН8М(остаток диаминопропионовой 811К- Катто- 130
кислоты)УКЬ8РСККТССТС ргорюшс22
К5СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКАКЕ8РСККТСОТС 8РК-А23 131
К8СЮТР3К8КСТАР9СКН8МК8К1АРСККТСОТС 8ЫС-823 132
Е8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКРШАРСККТССТС 8ЙК-Р23 133
К.8СГОТ1РК8В.СТАРРСКН8МКХ523КЬ8РСККТСОТС 811К-Х23 134
- 25 013470
Κ.8СГОΤIΡΚ8ΚСΤΑΡ^СΚΗ8ΜΚ(ниτρορ11е)Κ^8ΡСΚΚΤСΟΤС 8ЪК-ЫйгорЬе23 135
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МК(аминорЬе)КЬ8РСККТСОТС 8ЬК-АтторЬе23 136
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МК(бензилрЬе)КЬ8РСККТСОТС 8ЬК-Вешу1рЬе23 137
К8СГОТ1РК8В.СТАРрСКН8МК¥АЬ8РСВКТССТС 8ВК-А24 138
К8СГОТ1РК8КСТАРРСКН8МКУЕЬ8РСЕКТСОТС 8РК-Е24 139
К8СГОТ1РК8КСТАРОСКН8МКУКА8РС1ЖТСОТС 8ЙК-А25 140
К8СГОТ1РК8КСТАР9СКН8МКУЖАРСККТСОТС 8НК-А26 141
К8СГОТ1РК8КСТАР9СКН8МК¥КЬ8АСККТСОТС 8ЙК-А27 142
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬ8Х5ЭТСККТСОТС 8БК-Х27 143
Е8СШТ1РК8КСТАРрСКН8МКУК1ЯРСАКТСаТС 8НК-А29 144
Κ8СШΤIΡΚ8ΚСΤΑΡ^СΚΗ8ΜΚΥΚ^8ΡСΚΑΤС^ΤС ЗЬК-АЗО 145
К8СШТП>К8К.СТАРрСКН8МКУКЬ8РСККАСОТС 8БК-А31 146
К8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МК¥КЬ8РСККТССАС 8БК-А34 147
8САПТП>К8КСТАР9СКН8МК¥КЬ8РСККТСОТС 8ЫС-А441 148
ЗСАОТБРКЗКСТААРСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8КК-А4/А1541 149
8САОТ1РК8КСТАА9СКН8МК¥КА8РСККТСОТС 8ИК-А4/А15/А25 41 150
ЗСГОАБРКЗКСТАРОСКНБМКУКЬЗРСККТСОТС 8РК-А6 41 151
8СП)ТАРК8КСТАРРСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8БК-А7 41 152
8СЮТ1АК8КСТАР9СКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8НК-А8 Л 153
ЗСГОТГРАЗВСТАРОСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8НК-А9 Л 154
8СГОТ1РЕ8КСТАРРСКЛ8МК¥КЬ8РСККТССТС 8НК-Е9 Л 155
8СГОΤIΡ^8ΚСΤΑΡ^СΚΗ8ΜΚΥΚ^8ΡСΚΚΤСσΤС 8ЪК-(29 <11 156
8СШТ1РКАКСТАРрСБСН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8БК-А10 Л 157
8СШТ1РК8АСТАРрСКН8МК¥КЬ8РСККТССТС 8ИК-А11 Л 158
8СГОТ1РК8ЕСТАР9СКН8МК¥КЬ8РСККТСОТС 8БК-Е11 41 159
8СШТ1РК80СТАРрСКН8МК¥КЕ8РСККТСОТС 8ЬК-(2П <11 160
8СГОТ1РК8КСААРрСКН8МК¥Ж8РСККТС6ТС 8РК-А13 <11 161
ЗСГОТТРКЗКСТААОСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8РК-А15 <11 162
ЗСЮТБРКЗКСТАЭДрСКНЗМКУКЬЗРСККТССТС 8ЬК-ЭД15 Л 163
8СШТ1РК8КСТАХ5!5рСКН8МК¥КЕ8РСККТССТС 8БК-Х15 <11 164
8СШТ1РК8КСТААРСКН8МК¥КЛ8РСККТСОТС 8РК-А15/А25 41 165
8СШТ1РК8КСТАРАСКН8МК¥КЕ8РСККТСОТС 8БК-А16 41 166
ЗСГОТБРКЗКСТАРЕСКНЗМКУВЪЗРСККТСаТС 8БК-Е16 41 167
ЗСГОТБРКЗКСТАРрСАНЗМКУЖЗРОЖТССТС 8БК-А18 41 168
ЗСЮТГРКЗКСТАРРСЕНЗМКУКЬЗРСККТССТС 8ЙК-Е18 41 169
8СГОТ1РК8КСТАРРСКА8МК¥КЕ8РСККТСОТС 8ИК-А19 41 170 .
8СЕОТ1РК8К.СТАРрСКК8МК¥КЕ8РСККТСС-ТС 8ВК-К19 41 171
8СЮТ1РК8К.СТАРрСКНАМК¥КЕ8РСККТССгТС 8ИК-А20 41 172
ЗСШТБРКЖСТАРРСКНЗАКУЖЗРСККТСОТС 8ВК-А21 41 173
8СЮТ1РК8К.СТАРРСБСН8Х821К¥КЕ8РСККТССгТС 8БК-Х21 41 174
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8(пог1еи)К¥КЕ8РСККТССТС 8ЪК-Ме21 41 175
ЗСШТБРКЗВСТАР’рСКНЗМАУКЬЗРСККТССТС 8БК-А22 41 176
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МЕ¥Ж8РСККТССТС 8БК-Е22 41 177
ЗСГОТШКЗКСТАРрСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8БК-К22 41 178
8СЮТ1РК8КСТАРрСКН8МХ522¥ВЕ8РСККТСаТС 8БК-Х22 41 179
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8М(пог1еи)¥КЕ8РСККТСОТС 8ΡΚ-Ν1ε22 41 180
- 26 013470
8СГОТ1РК8КСТАРЦСКН8М(от)УКЪ8РСККТСОТС 8ИК- Огп22 61 181
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8М(Ьотосй)УКЬ8РСВКТСаТС 811КНотосй22 61 182
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8М(остаток диаминопропионовой 8ЬК- 183
кислоты)УКЬ8РСККТССТС ϋϊβιηΐηοргорюшс22 61
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКАКЕ8РС1ЖТСОТС 8ЙК-А23 61 184
8СГОТ1РК8КСТАР0СКН8МК8КЬ8РСККТСОТС 8ЫС-823 61 185
8СЮТ1РК8ВСТАРРСКН8МКРКЬ8РСККТСОТС 8ЙК-Р23 61 186
8СЮТ1РК8ВСТАРрСКН8МКХ823КЬ8РСККТСОТС 8ЫС-Х23 61 187
8СГОТ1РК8К.СТАРрСКН8МК(ни1рорЬе)КЬ8РСВКТССгТС 8ЙК- 188
ΝίΐΓορΡε23 61
8СШТ1РК8ВСТАРрСКН8МК(аминорЬе)КЬ8РСККТСОТС и.± 8ЬК- 189
Аттор11е2 3 61
8СЮТ1РК8КСТАР9СКН8МК(бензилрЬе)КЬ8РСККТСС5ТС 8ЪК- 190
Вепгу1р11е2 3 61
ЗСГОТШКЗКСТАРЦСКНЗМКУАЬЗРСККТСОТС 8ЙК-А24 61 191
8СГОТ1РК8ВСТАРРСКН8МКУЕЬ8РСВКТСОТС 8ЙК-Е24 61 192
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКА8РСККТСОТС 8ИК-А25 61 193
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬАРСККТСОТС 8ИК-А26 61 194
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬ8АСВКТСОТС 8ЙК-А27 61 195
8СЮТ1РК8ВСТАРЦСКН8МКУКЬ8ХЙ 'СККТСОТС 8НК-Х27 61 196
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬ8РСАКТСОТС 8РК-А29 61 197
8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬ8РСВАТСОТС 8РК-А30 61 198
8СГОТ1РК8КСТАРЦСКН8МКУВЬ8РСККАСОТС 8ЙК-А31 61 199
ЗСГОТГРКЗВСТАГЦСКНЗМКУКЬЗРСККТССАС 811К-А34 61 200
У8СГОТ1РК8ВСТАРОСКН8МКУВЬ8РСККТС6ТС 8ЙК-У1 548
К8СГОТ1РК8В.СТАР9СКН8МКУВЪ8РСККТСОТС 8ЙК-К1 549
Н8СЮТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬ8РСВКТССТС 8РК-Н1 550
08СГОТ1РК8КСТАРРСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС 8ЬК-Ц1 551
РРКЗСГОТГРКЗКСТАРЦСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС РР-8ЪК 552
МВ8СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС Μ- 8ЬК 553
ОК8СГОТ1РК8ВСТАРрСКН8МКУКЬ8РСККТСОТС О- 8ЪК 554
У8СШТ1РК8КСТАРрСБСН8МАУКЬ8РСККТСОТС 8ЬКΥ1/Α22 555
К8СГОТ1РК8КСТАРОСКН8МАУВЪ8РСШСТССгТС 8ЬК- К1/А22 556
Н8СГОТ1РК8ВСТАРОСКН8МАУКЬ8РСККТСОТС 8ЬКН1/А22 557
08СГОТ1РК8КСТАРрСКН8МАУКЬ8РСККТСОТС 8ЬК(21/А22 558
РРВ8СГОТ1РК8КСТАРРСКН8МАУКЬ8РСККТСОТС РР-8РК- А22 559
МК8СШТ1РК8КСТАРРСКН8МАУКЬ8РСККТС6ТС М-8РК-А22 560
ОКЗСГОТГРКЗКСТАРЦСКНЗМАРШЬЗРСККТССТС О-8ЙК-А22 561
В8СГОТ1РА8КСТАРРСКН8МАУКЬ8РСККТССТС 8ЪК- А9/А22 884
8СГОТ1РА8ВСТАРрСКН8МАУКЬ8РСККТССТС 8ЬК- 885
- 27 013470
А9/А22 61
К8СШТ1РУ8КСТАРОСКН8МКУЙЕ8РСККТСОТС 8РК-У9 886
КЗСГОТЕРУЗКСТАРрСКНЗМАУКЬ’ЗРСККТСОТС 8ИК- У9/А22 887
ЗСГОТГРУЗКСТАРрСКНЗМКУКЬЗРСККТССТС 8РК-У9 61 888
8СШТ№У8КСТАРрСКН8МАУКЬ8РСККТС6ТС 8ЬК- У9/А22 61 889
К8СГОТ1РЕ8КСТАР9СКН8МАУКЬ8РСККТССТС 8ЪК- Е9/А22 890
ЗСГОТШЕЗКСТАРОСКНЗМАУКЬЗРСККТСбТС 8ЬК- Е9/А22 61 891
КЗСГОТГРКЗАСТАРОСКНЗМАУКЪЗРСККТСОТС 8ЬК- А11/А22 892
8СШТ1РК8АСТАРРСКН8МАУКЕ8РСККТССТС 8ЬК-А11/22 61 893
К8СГОТ1РК8ЕСТАРОСКН8МАУКЕ8РСККТССТС 8РКЕ11/А22 894
8СШТ1РК8ЕСТАРрСКН8МАУКЕ8РСККТССгТС 8ЬК- Е11/А22 61 895
К8СГОТ1РК8КСТПРрСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8ΡΚ-ϋ14 896
К.8СГОТ1РК8КСТОРрСКН8МАУКЕ8РСККТС6ТС 8ЬКО14/А22 897
ЗСГОТШКЗКСТОРРСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8ΡΚ-Ώ14 61 898
8СГОΤIΡΚ8ΕСΤ^Ρ^СΚΗ8ΜΑΥΚ^8ΡСΚΚΤСΟΤС 811КЕ14/А22 61 899
К8СГОТП’К8КСТААРСКН8МАУ1Ш8ГС1ЖТСОТС ЗЬК- А15А/22 900
8СЮТ1РК8КСТААРСКН8МАУКЕ8РСККТССТС 8ЬК- А15/А22 61 901
К8СЮТ1РК8ЕСТА1рСК1Т8МКУКЕ8РСККТССТС 8ΗΚ-Ι15 902
Е8СЮТ1РК8КСТА1РСКН8МАУКЕ8РСВКТС6ТС 8ЬК- 115/А22 903
8СЮТ1РК8КСТА1рСКН8МКУЕЕ8РСЕКТС(ЗТС 8ΡΚ-Ι15 61 904
8СЮТ1РК8КСТА^СКН8МАУЕЬ8РСЕКТС6ТС 8ЬК- Ι15/Α22 61 905
Е8СЮТ1РК8КСТАУ0СКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8РК-У15 906
К8СШТ1РК8КСТАУрСКН8МАУКЕ8РСККТСОТС 8ЪКУ15/А22 907
ЗСЮТХРКЗКСТАУРСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8РК-У15 61 908
8СГОТ1РК8ЕСТАУрСКН8МАУКЕ8РСККТС6ТС 8ЬК- У15/А22 61 909
К8СЮТ1РК8КСТАРКСКН8МКУКР8РСККТССгТС 8РК-К16 910
К8СГОТ1РК8ЕСТАРКСКН8МАУКЕ8РСККТСОТС 8ЬКК16/А22 911
ЗСГОТВРКЗКСТАРКСКНЗМКУКЬЗРСККТСОТС 8РК-К16 61 912
8СГОТ1РК8КСТАРКСКН8МАУКЕ8РСККТСОТС 8ЬК- К.16/А22 61 913
КЗСГОТШКЗКСТАРКСКНЗМКУКЬЗЕСККТСОТС 8РК-К16 914
К8СШТ1РК8КСТАРКСКЛ8МАУКЕ8РСККТСОТС 8ЫС- К16/А22 915
8СГОТ1РК8КСТАРКСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8ИК-К16 61 916
8СН)Т1РК8КСТАРКСКН8МАУКЕ8РСККТССТС 8ЬК- К16/А22 61 917
К8СГОТ1РА8ЕСТАРрСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8Ж-А9/Е11 918
- 28 013470
К8СГОТ1РЛ8ЕСТАБрСКН8МАУКЬ8РСККТСОТС зък- А9/Е11/А22 919
8СГОТ1РЛ8ЕСТАРрСКН8МКУКЬ8РСВКТСОТС 8РК-А9/Е11 61 920
8СЮТ1РА8ЕСТАРОС1СН8МАУКЕ8РСККТССТС зьк- А9/Е11/А22 61 921
В8СГОТ1РУ8ЕСТАРрСКН8МК¥КЕ8РС1ЖТСОТС 8ЪК-У9/Е11 922
ВЗСГОТГРУЗЕСТАРОСБСНЗМАУКЕЗРСККТСОТС ЗЬК- У9/Е11/А22 923
8СЮТ1РУ8ЕСТАРРСК1-18МКУВЕ8РСККТСОТС 8ЬК-У9/Е11 61 924
8СГОΤIΡV8ΕСΤΑΡ^СΚΗ8ΜΑΥΒ^8ΡСΚΚΤСΟΤС ЗЪК- У9/Е11/А22 61 925
В8СЮТ1РУ8АСТАРрСКН8МКУКЕ8ГСККТСОТС 8ИК-У9/А11 926
КЗСЮТГРУЗАСТАРрСКНЗМАУКЕЗРСККТССТС ЗЪК- У9/А11/А22 927
8СГОТ1РУ8АСТАРРСКН8МКУКЕ8РСККТССТС 8ЬК-У9/А11 61 928
ЗСГОЛРУЗАСТАРрСКНЗМАУКЬЗРСККТСОТС ЗЪК- У9/А11/А22 61 929
К8СГОТ1РА8АСТАР9СКН8МКУРЕ8РСККТСОТС 8ИК-А9/А11 930
ВЗСГОТГРАЗАСТАРрСКНЗМАУЕЬЗРСККТСОТС ЗЪК- А9/А11/А22 931
8СГОТ1РА8АСТАРрСКН8МКУКЕ8РСВКТСОТС 8РК-А9/А11 61 932
ЗСГОТГРАЗАСТАРрСКНЗМАУВЬЗРСККТСОТС зьк- А9/А11/А22 61 933
В8СГОТ1РК8ЕСТО1кСКНЗМКУКЕ8РСВКТСС}ТС зьк- Е11/014/115 /К16 934
К8СГОТ1РК8ЕСТО1КСКН8МА¥КЕ8РСВКТС0ТС зьк- Е11/014/115 /К.16/А22 935
ЗСШТ1РК8ЕСТЕ1КСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС ЗЬК- Е11/014/115 /К16 61 936
8СГОТ1РК8ЕСТО1ЕСКН8МАУКЕ8РСККТССТС зьк- Е11/014/115 //В16А22 61 937
КЗСЮТГСУЗЕСТОЖСКНЗМКУКЬЗРСККТСаТС ЗЪК- У9/Е11/014/1 15/К.16 938
КЗСЮТГРУЗЕСТЫВСКНЗМАУКЬЗРСВКТСОТС ЗЬК- У9/Е11/014/1 15/К16/А22 939
ЗСШТТРУЗЕСТОШСКНЗМКУКЪЗРСККТСаТС ЗЬК- У9/Е11/014/1 15/К.16 61 . 940
зсготерузестошскнзмаукезрскктсотс зък- У9/Е11/014/1 15/К.16/А22 941
- 29 013470
61
К8С1ОТ1РУ8ЕСТО10СКН8МКУКЕ8РСЕКТСОТС 8ЬК- У9/Е11/014/1 15 942
К8СЮТ1РУ8ЕСТО19СКН8МАУКЬ8РСККТС(ЗТС 8ИК- У9/Е11/014/1 15/А22 943
ЗСШТЕРУЗЕСТО^СКНЗМКУЕЬЗРСККТСОТС 8ЬКУ9/Е11/Ο14/Ι 15 61 944
зсгопрузестшцскнзмаувьзрскктсстс 8ЬК- У9/Е11/О14Л15/ А22 41 945
КТСКЦЫРУ8ЕСТШКСКН8МКУКЕ8РСККТССТС 8ЬК- Т2/К4/Е6/У9/Е1 1/Ц14/115/К.16 946
КТСКТ>ЫРУ8ЕСТО1К.СКН8МАУКЬ8РСККТССТС 8ЬК- Т2/К4/Ь6/У9/Е1 1/ϋ14/Ι15/Κ16/ А22 947
ТСКОЫРУ8ЕСТШК.СКН8МКУКЬ8РСККТС6ТС 8РК- Т2/К4/Ь6/У9/Е1 1/Ο14/Ι15/Κ.16 41 948
ТСКВЫРУ8ЕСТО1КСКН8МАУКЬ8РСККТС6ТС 8ЬКТ2/К4/Ь6/У9/Е1 1/Ц14/115/К.16/ А22 41 949
(Ь- Фосфотирозин)- АЕЕАЕ8СШТ1РК8КСТАРРСКН8МКУКЕ8РСЕКТС6ТС 8ЪК(Ь5) 950
98САОТ1РК8КСТААРСКН8МКУКЕ8РСККТСОТС 8ЬК ςΐ/Α4/Α15 1295
р8САОТ1РК8КСТААрСКЙ8МАУКЕ8РСККТСаТС 8ЬК Р1/А4/А15/А 22 1296
^8СΑ^ΤIΡΚ8ΚСΤΑΑ^СΚΗ8Μ(^аρ)ΥΚ^8ΡСΚΚΤСΟΤС 8ЪК (21/А4/А15/О ар22 1297
^8СΑ^ΤIΡΚ8ΚСΤΑΑ^СΚΗ8ΜΚΥΚΑ8ΡСΚΚΤСΟΤС 8ЬК ()1/А4/А15/А 25 1298
р8САОТ1РК8КСТААрСКН8МА¥КА8РСККТСОТС 8ЪК ζ)1/Α4/Α15/Α 22/А25 1299
^8СΑ^ΤIΡΚ8Β.СΤΑΑ^СΚΗ8Μ(^аρ)ΥΚΑ8ΡСΚΚΤСΟΤС 8ЪК ςΐ/Α4/Α15/Ο ар22/А25 1300
Многие пептиды, описанные в табл. 2, можно получать как описано в патенте США № 6077680, выданном 20 июня 2000 г. Кет е! а1., который тем самым вводится в данное описание ссыпкой во всей полноте. Другие пептиды в табл. 2 можно получать методами, известными в уровне техники. Например, 8ЬК(Ь5) (^ЕО II) КО: 950) можно получать как описано в статье Вее!оп е! а1., ТагуеОпд еП'есЮг тетогу Т се118 \νίΐΕ а 8с1сс11\'с рерйбе 1пН1Ь11ог оГ Ку1.3 сЬаппеК Гог 1Ьегару оГ аикчттипс б18еа§е8, Мо1ес. РЬагтасо1. 67(4): 1369-81 (2005), которая тем самым вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. В табл. 2 и везде в описании X815, X821, X822, X823 и X827, каждый независимо, обозначает нефункциональные аминокислотные остатки.
- 30 013470
Таблица 3
Последовательности НтК, ВдК, АеК и АзК8 пептидов и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначена е 8Е(} Π)ΝΟ:
КТСКПЫРУ8ЕСТОП<СКТ8МКУКЬЖСЕКТСО8С НтК 6
АТСИЭЫРУ8ЕСТО1КСК.Т8МКУКЬЖСККТСО8С НтК-А1 201
ЗТСЕФЫРУЗЕСТШКСКТЗМКУКЫЖСККТССЗС НтК-81 202
ТСКОиРУЗЕСТОЖСКТЗМКУКЬЖСККТССЗС НтК-сИ 203
8СКОЬ1РУ8ЕСТО1КСКТ8МКУКЕЖСККТСО8С НтК-а1/82 204
ТСГОЕ1РУ8ЕСТОП<СКТ8МКУЖЖ.СККТС68С НтК-сН/14 205
ТСКОТЕРУЗЕСТОЖСКТЗМКУКЕЖСККТСОЗС НтК-άΙ/Τό 206
ТСБСОЫРКЗЕСТОЖСКТЗМКУКЬЖСККТСОЗС НтК-а1/К9 207
ТСКВЫРУЗКСТОЖСКТЗМКУКЬЖСККТСОЗС НтК-άΙ/ΕΙΙ 208
ТСКВЫРУЗЕСТАЖСКТЗМКУКЬЖСККТСОЗС НтК-й1/А14 209
ТСКВЫРУЗЕСТОРЕСКТЗМКУКЬЖСЮСТСОЗС НтК-а1/Г15 210
ТСКВЕ1РУ8ЕСТО1РСКТ8МКУКЕЖСККТСО8С НтК-й1/р16 211
ТСКОЕ1РУ8ЕСТОП<СКТ8МКУЕЕЖСККТСО8С НтК-й1/К18 212
ТСКОЫРУЗЕСТОГКСКНЗМКУКЬЖСККТСОЗС НтК-й1/Н19 213
ТСКОЫРУЗЕСТОГЕСКТЗМКУКЕЗЕСВКТСбЗС НтК-Л/826 214
ТСКОЫРУЗЕСТОШСКТЗМКУКЕЖСККТССЗС НтК-с11/Г27 215
ТСКОЬ1РУ8ЕСТО]КСЕТ8МКУКЕЖС1ЖТСОТС НтК-41/Т34 216
ТСКЖ1РУ8ЕСТО1КСКТ8МКУЖЖСЕКТСа8С НтК- ά1/Κ.11/Γ27 217
АТСКОЬ1РУ8ЕСТЕЖСКТ8МКУЖЖС1ЖТСС}8С НтК- А1/К11/Е27 218
ТСГОТГРКЗКСТАЕОСКНЗМКУКЬЗЕСЕКТССЗС НтК-сП/ΖΙ 219
ТСГОТГРКЗКСТАЕрСКТЗМКУЕЬЖСККТССЗС ΗιηΚ-ά1/Ζ2 220
ТСАОЫРАЗКСТАГАСКТЗМКУКЕЖСККТСОЗС ΗηιΚ-ά1/Ζ3 221
ТСАПЬ1РА8ЕСТА1АСКН8МКУЖЖСЕКТСО8С ΗπιΚ-ά1/Ζ4 222
ТСАОЫРА8КСТА1АСАН8МКУКЬ№СККТСО8С ΗιηΚ-ά1/Ζ5 223
КТСКОЫРУЗЕСТОЖСКТЗМХ^УКЬЖСККТСОЗС НтК-Х22 224
АТСЗФЕХЬ6РУ8В.СТО1КСЗВ.Т8МКХЬ22КЬ]ЧХьгбСККТС О8С НтК-Х6, 22, 26 225
- 31 013470
УСКП^УБКЕТАСКНАКЗЬОКСКТЗрКУКАНСАК ТСЕЬС ВдК 9
АСВПУ/Р1СЕТАСКЛАК8ЬОМСКТ8рКУКАЯСАК ТСЕЬС ВдК-А1 226
УСАЬ^УЕКЕТАСКНАКЗЬСКСВТЗОКУКАЯСАК ТСЕЬС ВдК-АЗ 227
νΟΒΟΑΓΚΕΤΑΟΚΗΑΚδΕΟΝΟΒΤδϋΚΥΚΑΝΟΑΚ ТСЕЬС ВдК-А5 228
νθΒΟ\νΐ7ΚΑΤΑΟΒΗΑΚ8ΕθΝΟΚΤ8ρΚΥΚΑΝΟΑΚ ТСЕЬС ВдК-А8 229
УСКО^КЕААСВНАКЗЬСЫСКТЗрКУКАНСАК ТСЕЬС ВдК-А9 230
νΟΚΟλνΕΚΕΤΑΟΑΗΑΚδΕΟΝΟΒΤδϋΚΥΚΑΝΟΑΚ ТСЕЬС ВдК-А12 231
VСΒΤ)V/ΡΚΕΤΑСΚΗΑΑδ^ΟNСΒΤδ^ΚΥΚΑNСΑΚ ТСЕЬС ВдК-А15 232
УСВП^УГКЕТАСБШАКАЬСЫСВТЗрКУКАЫСАК ТСЕЬС В§К-А16 233
УСКОУТКЕТАСВНАКЗАОПСКТЗрКУКАЫСАК ТСЕЬС В&К-А17 234
УСКПАУЕКЕТАСКНАКЗЬСНСАТЗОКУКАЯСАК ТСЕЬС ВдК-А21 235
УСКПУ/ЕКЕТАСВНАКЗЬОЫСКАЗРКУКАКСАК ТСЕЬС ВдК-А22 236
УСКОУ/ГКЕТАСВНАКЗЬОЫСК-ТЗСКУААКСАК ТСЕЬС ВдК-А27 237
УСКПЛУЕКЕТАСВНАК8ЬСЯСКТ80КУКАЯСАА ТСЕЬС ВдК-А32 238
УСЮАУРКЕТАС1ШАК8ЬСЯСКТ8рКУКАКСАК АСЕЬС ВдК-АЗ 3 239
УСКО\УЕКБТАСКНАК8ЬСЫСКТ8рКУКАКСАК ТСАЬС В&К-А35 240
УСКОАУГКЕТАСВНАКЗЬОЯСКТЗрКУКАКСАК ТСЕАС ВдК-А37 241
ΟΟΚΏΝΕδΑΝΤΟΚΗνΚΑΝΝΝΟΟδρΚΥΑΤΝΟΑΚΤ секс АеК 7
ΑΟΚΟΝΕΑΑΑΤΟΚΗνΚΕΝΚΝΟΟδϋΚΥΑΤΝΟΑΚΤ секс ΑδΚδ 8
В табл. 3 и везде в описании ХЬб. ХН22. ХН26. каждый независимо. обозначают нефункциональные остатки.
Таблица 4
Последовательности МдТх пептида и МдТх пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е(2 Π)ΝΟ:
ТПЫУКСТЗРКОСЬРРСКАрРССЗАСАКСМНОКСКСУРН МдТх 28
ΤΙΙΝνΑΟΤδΡΚΟΟΕΡΡΟΚΑΟΡΟρδΑΟΑΚΟΜΝΟΚΟΚΟΥΡΗ МдТх-Аб 242
ΤIINVδСΤδΡΚ^С^ΡΡСΚΑ^ΕΟ^δΑΟΑΚСΜNΟΚСΚСΥΡΗ МдТх-δό 243
ΤΠΝνΚΟΤδΡΑρΟΕΡΡΟΚΑϋΓΟςδΑΟΑΚΟΜΝΟΚΟΚΟΥΡΗ МдТх-ΑΙ 1 244
ΤΙΙΝνΚΟΤδΡΚΟΟΕΡΡΟΑΑρΡΟΟδΑΟΑΚΟΜΝσΚΟΚΟΥΡΗ МдТх-А18 245
ΤIINVΚСΤδΡΚ^С^ΡΡСΚΑ^Ρσ^δΑСΑΑСΜNСΚСΚСΥΡΗ МдТх-А28 246
- 32 013470
ТПКУКСТЗРКОСЬРРСКАОЕСрЗАСАКСМКОАСКСУРН МдТх-АЗЗ 247
ТЦКУКСТЗРКОСЬРРСКАОРСОЗАОАКСМЫОКСАСУРН МдТх-А35 248
ТПКУКСТЗРКрСЕРРСКАОРбрЗАОАКСМЫОКСКСУРХ . Μ§Τχ-Η39Ν 249
ТЦНУАСТЗРКОСЬРРСКАОРОрЗАСАКСМЫОКСКСУРН Μ§Τχ-Α6/Η39Ν 250
ТПНУЗСТЗРКОСЬРРСКАОРбОЗАОАКСМЛОКСКСУЗ М§Тх-86/38/й39 251
ТПТКСТЗРКрСЬРРСКАЭРОрЗАаАКСМЫСЖСКСУРН М§Тх-Т4/15/86 252
Т18СТ8РКОСЬРРСКАОРСО8АСАКСМЫСКСКСУРН МдТх-йЗ/Т4/15/86 253
Т18СТ8РК0СЬРРСКА0РО08АСАКСМХСКСКСРСК МдТх-Р12 254
ЫУАСТЗРКОСЬРРСКАОРОРЗАОАКСМЛОКСКСУРН МдТх-бЗ/А6 255
ОРТКУЗСТЗРКОСЬРРСКАОРОрЗАОАКСММОКСКСУЗ МдТх-СЬТх 256
ОРТОУОСТЗРКОСЬРРСКАрРООЗАОАКСМЖЖСКСУО М§Тх-1ЬТх 257
ЦМУЗСТЗРКЭСЬРРСКАОРСрЗАОАКСМЫСКСКСУРН МдТх-ΖΙ 258
Ш18СТ8РК0СЬРРСКА0РС08АОАКСММСКСКСУРН Μ§Τχ-Ζ2 259
бУПЛУЗСТЗРКОСЬРРСКАОРбОЗАОАКСМКОКСКСУРН Μ§Τχ-Ζ3 260
Многие пептиды, описанные в табл. 4, можно получить как описано в международной заявке 95/03065, опубликованной 2 февраля 1995 г., заявителем является Мегск & Со., 1ис. Эта заявка соответствует патенту США № 07/096942, поданному 22 июля 1993 г., который тем самым вводится в данное описание ссылкой во всей полноте.
Таблица 5
Последовательности АдТх2 пептида и АдТх2 пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8ЕО Π)ΝΟ:
ОУИМУЗСТСЗРрСКРСКОАСМКРСКСМКККСНСТРК А§Тх2 23
(ЗУРРАУЗСТСЗРРСПСРСКВАСМИРСКСМЫЕКСНСТРК А§Тх2-А5 261
ОУРБХУ8СТС8РрС1АРСК1ЭА6МКРСКСМНККСНСТРК АдТх2-А16 262
е\Ф1ЫУ8СТ68РЭС1КРСАОАОМКРСКСММККСНСТРК А§Тх2-А19 263
СгУР1ЫУ8СТ68РрС1КРСКПАСМАРОКСМПККСНСТРК А§Тх2-А24 264
ОУРШУЗСТбЗРЭСПСРСКОАОМКР'САСММККСНСТРК АдТх2-А27 265
σVΡINV8СΤΟ8Ρ^СIΚΡСΚ^ΑΟΜΚΡΟΚСΜNΑΚСΗСΤΡΚ А§Тх2-А31 266
ОУРтУЗСТОЗРОСШТ^СКОАОМКР'СКСММВАСНСТРК А§Тх2-А32 267
ОУРЕЯУЗСТбЗРОСКРСКОАОМКРОКСМЫККСНСТРА А§Тх2-А38 268
ОУР1АУ8СТСг8РрС1КРСКОАСМКРОКСМРЖКСНСТРА А§Тх2- А5/А38 269
ОУР1КУ8СТС8РрС1К1эСКПАСМКР<ЗКСМЫОКСНСТРК А§Тх2-О31 270
ОУР11У8СКС8КрС1КРСКПАОМКРСКСМЯСКСНСТРК А§Тх2- Ο8Κ ζ1 271
ОУРПУ8СК18^С1КРСКОАОМКРОКСМЯСКСНСТРК АдТх2- О8К ζ2 272
ΘVΡПVΚСΚΟ8Κ^СIΚΡСΚ^ΑδмΚΡΟΚСΜNΟΚСΗСΤΡΚ А§Тх2- О8К ζ3 273
ОУРПУКСКТЗКрСКРСКОАОМКРСКСМЫСгКСНСТРК АдТх2- О8К ζ4 274
ОУР11УКСК18КрС1КРСКОАОМКР6КСМКОКСНСТРК А§Тх2- О8К ζ5 275
- 33 013470
Таблица 6
Последовательности пептида Не1егош11гик кршшГег (НкТх1) и НкТх1 пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8ЕО Ю ΝΟ:
АЗСКТРКОСАОРСЕКЕТССРУОКСМШКСКСХКС НзТх1 61
АЗСХТРКВСАОРСККЕТОСРУОКСМХККСКСККС НзТх1-Х4 276
АЗСАТРКОСАВРСККЕТССРУСтКСМЫРКСКСХКС НзТх1-А4 277
А8СКТРХПСАПРСККЕТОСРУ<лКСМК[ККСКСХКС НзТх1-Х7 278
АЗСКТРАОСАОРСККЕТССРУСКСМШКСКСЫКС НзТх1-А7 279
Л8СКТРКОСЛОРСХК1П'ССР¥С;КСМХГ<КСКСУЕС НзТх1-Х14 280
АЗСКГРКОСАОРСАКВТОСРУС^КСМХККСКСККС НзТх1-А14 281
А8СК;1Ч’КОСАОРС1<ХЕ'ТХК:РУС}КСМКНКСКСУ1<С НзТх1-Х15 282
а8Скг1’ко(:аг)РСл<ае:г(1с:рус}КСМК’ЯКСКСХн(; НзТх1-А15 283
АЗСКТРКОСАОРСККЕТОСРУОХСМХЕКСКСЫКС НзТх1-Х23 284
АЗСКТРКОСАОРСККЕТССРУОАСМХККСКСНКС НзТх1-А23 285
АЗСКТРКОСАЛРСККЕТОСРУОКСММХКСКСХКС НзТх1-Х27 286
АЗСКТРКОСАБРСККЕТОСРУОКСММАКСКСХКС НзТх1-А27 287
1 АЗСКТРКПСАПРСРКЕТОСРУОКСМЫКХСКСХКС НзТх1-Х28 288
АЗСКТРКПСАСРСККЕТОСРУОКСМККАСКСЯКС НзТх1-А28 289
АЗСКТРКОСАЛРСККЕТОСРУОКСММкКСХСМкС НзТхЬХЗО 290
АЗСКТРКЛСАОРСККЕТССРУОКСММККСАС^С НзТх1-А30 291
А8СК'Г'РКОСАПРСЕКЕТ6СРУС1КСМХККСКСНХС ΗδΤχΙ-ХЗЗ 292
АЗСКТРКОСАОРСККЕТССРУСКСМХККСКСХАС НзТхЬАЗЗ 293
Пептиды. описанные в табл. 5. можно получать как описано в патенте США № 6689749. выданном 10 февраля 2004 г. ЬеЬгип е1 а1.. который тем самым вводится в данное описание ссылкой во всей полноте.
Таблица 7 Последовательности пептида Ог(йосЫгик ксго1Ыси1окик (О8К1) и О8К1 пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначении 8ΕΟ Π)ΝΟ:
СУПХУКСК18^СЬЕРСККАОМКРСКСМКОКСНСТРК О8К1 25
СУПХУЗСККЕрСЬЕРСККАОМКГЖСМХОКСНСТРК О8К1-87 1303
ОУ1ШУКСК18^СЬКРСККАОМКГОКСММОКСНСТРК О8К1-К16 294
6У11ХУКСК1Ж0СЬЕРСКВАСМЕГОКСМХОКСНСТРК Ο8Κ1-Ώ20 295
ОУ1Е^УКСК18КрСЕКРСКОАСМКРОКСМХСКСНСТРК Ο8Κ1-Κ16,ϋ20 296
аУПЬтСШЖОСЕКРСКВАСМВБОКСМХОКСНСТРК Ο8Κ1-87,Κ16,ϋ20 1308
СУ1ШУКСК18РОСЕКРСКТ)АОМВРОКСМХОКСНСТРК Ο8Κ1-Ρ12,Κ16,ϋ20 297
6У1тУКСК1ЖрСЕКРСКОАОМКГОКСМХ6КСНСУРК Ο8Κ1-Κ16,ϋ20,Υ36 298
Ас-СУПХУКСКДЗРрСЬКРСКОАОМКРСКСМХОКСНСТРК Ас-О8К1-Р12, Κ16, ϋ20 562
6У1тУКСК18РрСЕКРСКОА6МКБОКСМЫОКСНСТРК-ХН2 Ο8Κ1-Ρ12,Κ16, Ό20- νη2 563
Ас-ОУПХУКСККРОСЬКРСКОАОМВРОКСМКОКСНСТРК- νή2 Ас-О8К1-Р12, ΚΙ 6, ϋ20-ΝΗ2 564
6У11ХАКСК18КрСЕКРСКПА6М1Ш6КСМ¥СКСНСУРК-ХН2 Ο8Κ1-Κ16, ϋ20, Υ36νη2 565
- 34 013470
Ас-СУЦНУКСЫЗ^СЬКРСКПАОМКГОКСМНОКСНСУРК Ас-О8К1-К16, Ώ20, ¥36 566
Ас-ОУ11ЫУКСК18КРСЬКРСКОАОМКРОКСМКСКСНСУРК- νη2 Ас-О8К1-К16, Ώ20, Υ36-ΝΗ2 567
ОУ11КТУКСК18КРСЬКРСКК.УОМКРОКСМЦОКСНСТРК-КН2 Ο8Κ1-Κ16-ΝΗ2 568
Ас-СУПт^СШЗкрСЬКРСККАОМКРОКСМКСКСНСТРК АС-О8К1-К16 569
Ас-ОУШЧУКСК18КрСЬКРСККАОМКРОКСМЯОКСНСТРК- νη2 Αο-08Κ1-Κ16-ΝΗ2 570
Ас-СУЦЫУКСКККРСЬЕРСКЮАОМКРСКСМЫОКСНСТРК Ас-О8К1-Ц20 571
6У1ШУКСК18К.рСЬЕРСКОАСМКРаКСМЫСКСНСТРК-№2 Ο8Κ1-ϋ20-ΝΗ2 572
Ас-ОУ11ХУКСК18КРСЬЕРСКОАСМКРОКСММСКСНСТРК- νη2 Αο-Ο8Κ1-ϋ20-ΝΗ2 573
бУГШУКСКККОСЬЕРСККАОМКГбКСММаКСНСТРК-ВД Ο8Κ1-ΝΗ2 574
Ас-ОУПКУКСЫЗкрСЬЕРСККАСМКЕОКСММСКСНСТРК Ас-О8К1 575
Ас-аУЕЯУКСЫЗКрСЬЕРСККАОМКГОКСМЯСКСНСТРК- νη2 Ас-О8К1-№2 576
С}У1ШУКСК18КрСЕКРСКОАОМКЕСКСММОКСНСТРК-КН2 Ο8Κ1-Κ16, ϋ20-ΝΗ2 577
Ас-ОУПКУКСИЗКрСЬКРСКБАОМКГОКСМКСКСНСТРК АС-О8К1-К16, ϋ20 578
Ас-ОУПКУКСЫЗКрСЬКРСКПАОМКЕбКСМЯСКСНСТРК- νη2 АС-О8К1-К16, Ώ20νη2 579
У1ШУКСК18К9СЕЕРСККА6МКраКСМН<ЗКСНСТРК Δ1-Ο8Κ1 580
Ас- УПМУКСКККОСЕЕРСККАОМКРОКСМНОКСНСТРК Ас-ΔΙ-ΟδΚΙ 581
УПКУКСК18КрСЬЕРСККАОМКЕСКСММОКСНСТРК-ЦН2 Δ1-Ο8Κ1-ΝΗ2 582
Ас-УПКУКСК18^СЬЕРСККАОМКРСКСМНОКСНСТРК-та Ас-ΔΙ-ΟδΚΙ-ΝΗ2 583
ОУШ4УКСК18КрСЕЕРСККАОМКЕОКСМЫОКСАСТРК Ο8Κ1-Α34 584
Ас-бУШЧУКСШЗКрСЬЕРСККАОМКГОКСМЫОКСАСТРК АС-О8К1-А34 585
6У1ЕхА7КСК18КрСЕЕРСККАС?у1КГСКСУ»;С-КСАСТРК-Ж2 Ο8Κ1-Α34-ΝΗ2 586
Ас-ОУПЯУКСК18КрСЬЕРСККАОМКГСКСМКОКСАСТРК- νη2 ΑαΟ8Κ1-Α34-ΝΗ2 587
УПНУКСКККрСЕКРСКПАОМКГОКСМЫСКСНСТРК Δ1-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20 588
Ас- УПЫУКСК18КРСЕКРСКЕ)АСМКЕСКСММОКСНСТРК Ас-Л1-О8К1-К16, ϋ20 589
УПКУКСК18КрСЕКРСКПАОМКГОКСМНОКСНСТРК-14Н2 Δ1-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20- νη2 590
Ас-УПЫУКСК18КрСЕКРСКОАОМВГаКСММОКСНСТРК-Е4Н2 Ас-А1-О8К1-К16, Ώ20-ΝΗ2 591
ХГУКСКДЗКРСЕКРСКОАСМКЕОКСММОКСНСТРК (Δ1-4)-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20 592
Ас- КУКСК18КрСЕКРСКЛАОМКГОКСМЫОКСНСТРК Αο-(Δ1-4)-ΟδΚ1-Κ16, ϋ20 593
Ж<КСК18^СЕКРСКПАОМКЕОКСММОКСНСТРК-ЕШ2 (Δ1-4)-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20-ΝΗ2 594
Ас- КУКСК18КрСЕКРСКОАОМКЕОКСМЫОКСНСТРК-МН2 Αο-(Δ1-4)-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20-ΝΗ2 595
КСКДЗКрСЪКРСКОАСгМКРСгКСМЫСгКСНСТРК (Δ1-6)-Ο8Κ1-Κ16, Ό20 596
Ас- КСК18К.рСЕКРСКПАОМКЕаКСМЫОКСНСТРК Αο-(Δ1-6)-08Κ1-Κ16, Ό20 597
КСК18КрСЕКРСЮЭАОМКРСгКСМЫСКСНСТРК-МЕ12 (Δ1-6)-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20-ΝΗ2 598
Ас-КСК18КрСЕКРСКГАСМКЕОКСМЫаКСНСТРК-КН2 Ас-(А1-6)-О8К1-К16, ϋ20-ΝΗ2 599
СКККрСЬКРСЫЭАОМКРОКСМНСКСНСТРК (Δ1-7)-Ο8Κ1-Κ16, 600
- 35 013470
Ас- СКТЗ^СЬКРСБЖАОМКРОКСМЯОКСНСТРК
601
СК18КрСЬКРСКОАОМКРОКСМЫ<ЗКСНСТРК-КН2
602
603
Ас-СКККрСЬКРСБООАСМКРСКСМЫЖСНСТРК-ХНг
ОУПХУКСК18КдСЬКРСКРАОМКНОКСМКСКСНСТРК аУ1тукск18кдськрскоАОмкяоксммскснстрк-хн2
Ас-ОУ1ПУУКСК18К.дСЕКРС1СРАСМКХСКСАРЮКСНСТРК
Ас-СУ1ШУКСК18КдСЬКРСКОАСМКХ6КСМНОКСНСТРКνη2____________________________________________
СУ1ШУКСК18КдСЕКРСКРАОМКЕОКСМЖКСНСТРК
ОУ1ШУКСК18К.дСЬКРСКРАОМКРОКСМКККСНСТРК-ЫН2
Ас-ОУ1ШУКСК18КдСЬКРСКОАСМКБОКСМКККСНСТРК
Ас-ОУ11ЫУКСК18КдСЬКРСКОА6МКРОКСМК[ККСНСТРКΝΗ2____________________________________________ сунмуксктзкдськрскоАомкрсксмхакснстрк
Ас-ОУ1ШУКСК18КдСЬКРСКОАОМЕБСКСМХОКСНСТРК
СУ1ШУКСК18КдСЬКРСКПАОМКР'ОКСМХОКСНСТРК-К[Н2
Ас-СУПНУКСК18КдСЬКРСКРАСМКРСКСМХОКСНСТРКνη2____________________________________________
ТПХУКСКККдСЬКРСКРАСМКРСКСМНОКСНСТРК
Ас-Т№УКСК18К.дСЬКРСКРАСМКЕСКСМ^КСНСТРК
Т11ЫУКСК18КдСЬКТСКОАСМКР6КСМНСКСНСТРК-ХН2
Ас-Т11НУКСК18КдСЬКРСКОАСтМКРСКСМН6КСНСТРК-ХН2
ОУК1ЫУКСК18КдСЬЕРСККАСМКГОКСМХОКСНСТРК
Ас-6УК1ИУКСК18КдСЬЕРСККАСМКРСКСММОКСНСТРК
ОУК1ЫУКСК18КдСЕЕРСККАОМКГОКСМХОКСНСТРК-Р(Н2
Ас-ОУК1МУКСК18КдСЕЕРСККАОМВГОКСМХОКСНСТРКνη2____________________________________________
СУК1ЫУКСК18КдСЕЕРСККАСМКЕОКСМЫС}КСАСТРК
ОУКЕЧУКСК18К.дСЕКРСКРАОМКЕОКСМРОКСНСТРК
ОУКЖУКСКККдСЕКРСКРАСМКРСКСМНСКСАСТРК
Ас-ОУК1ЫУКСК18КдСЕЕРСККАОМРЕСКСМХС1КСАСТРК ОУКЖУКСКККдСЕЕРСБСКАОМКГСКСМЫСКСАСТРК-ЫНг Ас-СУКЕЙУКСК18К.дСЕЕРСККАСМКГОКСМЫОКСАСТРКνη2____________________________________________
Ас-СУКШУКСК18ЕдСЕКРСКЕ)АОМРГСКСМХОКСАСТРК
СУКШУКСК18КдСЕКРСКРАОМКЕ6КСМ^КСАСТРК-кШ2
Р20_____________
Ас-(А1-7)-О8К1-К16, Р20_____________ (Δ1-7)-Ο8Κ1-Κ16,
Ρ20-ΝΗ2__________
Ас-(А1-7)-О8К1-К16, Ρ20-ΝΗ2__________
О8К1-К16, Р20, N25
О8К1-К16, Р20, Ν25-ΝΗ2__________
Ас-О8К1-К16, Ρ20,
N25_____________
Ас-О8К1-К16, Ρ20,
Ν25-ΝΗ;__________
Ο8Κ1-Κ16, Ρ20, Κ31
Ο8Κ1-Κ16, Ρ20, Κ.31νη2_____________
АС-О8К1-К16, Ρ20,
Κ31_______________
Ас-О8К1-К16, Ρ20, Κ31-ΝΗ2__________
Ο8Κ1-Κ12, Κ16, Κ.19, Ρ20_____________
Ас-О8К1-К12, Κ16,
Κ.19, Ρ20____________
Ο8Κ1-Κ12, Κ16, Κ.19, Ρ20-ΝΗ2__________
Ас-О8К1-К12, ΚΙ 6,
Κ.19, Ρ20-ΝΗ2
Δ1-Ο8Κ1-Τ2, ΚΙ 6, Ρ20_____________
Ас-ΔΙ-Ο8Κ1-Τ2,
Κ16, Ρ20__________
Δ1-Ο8Κ1-Τ2, Κ16, Ρ20-ΝΗ2__________
Ас-ΔΙ-Ο8Κ1-Τ2,
ΚΙ 6, Ρ20-ΝΗ2
О8К1-КЗ_________
АС-О8К1-КЗ_______
Ο8Κ1-Κ3-ΝΗ2
Αο-Ο8Κ1-Κ3-ΝΗ2
604
605
606
607
608
609
610
611
612
613
614
615
616
617
618
619
620
621
622
623
О8К1-КЗ, А34
О8К1-КЗ, К16, Р20
О8К1-КЗ, К16, Р20,
А34____________
Ас-О8К1-КЗ, А34
О8К1-КЗ, Α34-ΝΉ2
Ас-О8К1-КЗ, А34νη2
624
625
626
627
628
629
АС-О8К1-КЗ, К16,
Р20, А34_________
О8К1-КЗ, К16, Р20,
Α34-ΝΗ2
630
631
- 36 013470
Ас-СУК1Ы¥КСКЛ8КрСЬКРСКОАОМКРСКСМЫОКСАСТРКνη2 Ас-СУК1ЫУКСК18^СЬКРСКОАОМКРОКСМКОКСНСТРК Ас-О8К1-КЗ, К16, 020, Α34-ΝΗ2 АС-О8К1-КЗ, К16, 020 О8К1-КЗ, К16, ϋ20νη2 Ас-О8К1-КЗ, ΚΙ б, ϋ20-ΝΗ2 632 633
СУК1РГУКСК18К.рСЬКРСКОАСМКРОКСМКОКСНСТРК-ВД 634
Ас-ОУК1КУКСК18^СЬКРСКОАОМКРЖСМЪЮКСНСТРК- νη2 635
СУЦМУКСКККрСЬКРСКЦАОМКЕбКСММОКСНСТ Δ36-38-Ο8Κ1-Κ16, ϋ20 Ο8Κ1-016,020 636
ОУ1ШУКСК18КрСЬОРСКОАСМКРОКСМН6КСНСТРК < 980
СгУ1ШУКСК18К9СЬ[йЬу8]РСКОАСМКРОКСММОКСНСТРК О8К1-ЬЬу8 16,ϋ20 981
СУ1ШУКСК18К0СЬ[11Агё1РСКОА6МКРОКСМ№КСНСТРК О8К1-ЪАг£ 16,ϋ20 982
<ЗУ1тУКСК18КрСЬ[Сй]РСКОАОМКРОКСМЫОКСНСТРК О8К1-СЙ 16,020 983
σνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθΣ[Βαϊί]ΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚεΜΝΟΚ€ΗεΤΡΚ 08К1-ЬСй 16,020 984
СУ1ШУКСК18Е0СЬ[Орг]РСКПАаМКРОКСМЫСКСНСТРК ΟδΚΙ-ϋρι 16,020 985
6У11КУКСК18КрСЬ[ОаЬ]РСКОАОМК17ОКСМЫОКСНСТРК О8К1-ОаЪ 16,ϋ20 986
СУ1ШУКСК18КОСЬОРСКОАОМКРОКСМНОКСНС¥РК 08Κ1-016.020.Υ36 987
СУ11ЫУКСК18КрСЬ[ИЬу8]РСКОАСМКРОКСМЫ(ЗКСНС¥РК ОЗКЬЬЬуз 16,ϋ20,Υ36 988
СУПЫУКСК18К.0СЬ[ЬАг§]РСКОАОМКГОКСМКОКСНС¥РК О8К1-ЬАг§ 16,ϋ20,Υ36 989
СУт<УКСК18К9СЬ[Сй]РСКПАСМКЕОКСМЫОКСНСУРК О8К1-СЙ 16,ϋ20,Υ36 990
6У11ЫУКСК18КРСЬ[ЬСЙ]РСКОАСМКГ6КСМКЮКСНС¥РК О8К1-ИСЙ 16,ϋ20,Υ36 991
6У1ШУКСК18^СЬ[Орг]РСКОАОМКРОКСМЫ<ЗКСНС¥РК ΟδΚΙ-ϋρΓ 16,ϋ20,Υ36 992
6У1ШУКСК18К9СЬ[ОаЪ]РСКТ)АСМКБОКСМНСКСНСУРК О8К1-ОаЬ 16,ϋ20,Υ36 993
ОУИХУКСК18К9С1ХРСКОАСМКРОКСМКОКСАС¥РК Ο8Κ1- Κ16,ϋ20,Α34,Υ36 994
ОУ11ХУКСК18КрСЬКРСКОАОМКРОКСМЯОКСОСУРК Ο8Κ1-Κ16, ϋ20,Ο34,Υ36 995
СУИНУКСК18КРСЬКРСКСАОМКБОКСММОКСАСРРК Ο8Κ1-Κ16, Ο20,Α34,Ε36 996
С}УШЧУКСК18К9СЬКРСКОАОМКРОКСМКОКСАС\УРК Ο8Κ1-Κ16, ϋ20,Α34,\ν36 997
ОУ1ШУКСК18крСЬКРСКЕАОМКБ6КСМ¥<ЗКСАС¥РК Ο8Κ1-Κ16, Ε20,Α34,Υ36 998
ОУ1ШУКСК18К0СЬОРСКОАаМКР’ОКСММОКСАСТРК Ο8Κ1-Ο16, ϋ20,Α34 999
ОУ11¥УКСКР8К0СЬ[ЬЬу8]РС№АОМЕБОКСМ^КСАСТРК О8К1-йЬу8 16,ϋ20,Α34 1000
ОУИКУКСК18К.рСЬ[11Агё]РСКОАС}МКРОКСМКОКСАСТРК Ο8Κ1-1ιΑγ§ 16,ϋ20,Α34 1001
аУИКУКСК18К0СЬ[Сй]РСКОАОМКБСКСМЫСКСАСТРК О8К1-СЙ 16,ϋ20,Α34 1002
ОУ11ЦУКСК18КрСЬ[ЬСй]РСКОАОМКРОКСММОКСНСТРК 08К1-ЕСЙ 16,ϋ20,Α34 1003
θνΠΝνΚ€ΚΙ8^0Σ[ΟρΓ]ΡΟΚΟΑσΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚ€ΑΟΤΡΚ ΟδΚΙ-ϋρΓ 16,ϋ20,Α34 1004
ОУ1№ГУКСК18КрСЬ[ОаЪ]РСКОАОМКРаКСМКОКСАСТРК О8К1-ОаЪ 16,ϋ20,Α34 1005
ОУ1ШУКСКККрСШРСКОАСМКРОКСМТ\ОКСНС Δ36-38, Ο8Κ1- Ο16,ϋ20, 1006
ОУ1ШУКСК18ЕрСЬ[ЬЬу8]РСКТ>АОМКРСКСММОКСНС Δ36-38, О8К1-ЬЬу8 1007
- 37 013470
ОУПКУКСК18КрСЬ[11Агё]РСКРАОМКРОКСМЫОКСНС
1008
6У11КУКСК18КрСЦСй]РСКРАОМКРОКСМКСКСНС
1009
1010
1011
ОУ11НУКСК18КрСЦЪСй]РСКРАОМКРСКСММЖСНС бУПЫУКСКККрСЦРр^РСКРАОМКРОКСМКОКСНС
СУ1ЖУКСК18К9СР[РаЪ]РСКРАС1МКРСКСМНСЖСНС
ОУИЯУКСКККрСЬОРСКПАОМКРОКСМНСКСАС
ОУ1ЖУКСК18КрСЬ[КЬу8]РСКСАОМКБЖСММОКСАС
ОУ1ЖУКСК18К9СЬ[ЬАгё]РСКРАСМКРСКСМЫСКСАС
СА71Ж1/КСК18КрСЬ[С11]РСКРАаМКРС’КСММСКСАС
ОУт4УКСК18КрСЬ[ЬСй]РСКОА6МКРаКСМК6КСНС
6У1]КУКСК18К9СЬ[Орг]РСКПА6МКЕОКСМГЮКСАС аУИМУКСК18КрСЬ[РаЬ]РСКРАОМНРОКСМЫОКСАС
ОУПКУКСК18^СЬКРСКОАОМКР6КСММОКС6СУОО
ОУ1ШУКСК18К.рСЬОРСКРАСМКРОКСМЫОКСНС¥6О
ОУ11НУКСК18КрСЬ[ЫЕу8]РСК1)АОМКРОКСММОКСНС¥ОС
ОУ1ЖУКСК18К.рСЬ[11Аг§]РСКОАОМКР6КСММОКСНС¥60 ОУ1тУКСК18К9СЬ[Сй]РСКРАОМИРСКСМНОКСНС¥О6
ОУПКУКСК18КРСЬ[11С11]РСКОАОМКРОКСМНОКСНСУО(3
СУ1ЖУКСЮ8^СЬ[Орг]РСКПАС}МЖСКСМН<ЗКСНС¥СО
ОУ1тУКСК18КрСЬКРСКОАОМкРОКСМКСКСАС¥СО
СУШ^СШЗК^СГПРСКРАСМКРОКСМЁ^ЖСАСУбо
СVIINVΚСΚI8Κ^С^[Ъ^у8]ΡСΚ^ΑσΜΚΡСΚСΜNΟΚСΑСΥΟσ
ОУП1Х[УКСК18К.рСЪ[йАг§]РСКРА(лМКР<ЗКСМКСгКСАСУО(3
СУПКУКСК18КрСЪ[Сй]РСКРАаМКРОКСМНОКСАСУОа
ОУПКУКСИ8^СЬ[кС11]РСКРАаМКРОКСМХОКСНСУОа
16,Р20____________
Δ36-38, О8К1-ЬАг§ 16,Р20_____________ /136-38, О8К1-СЙ 16,Р20_____________
Δ36-38, 08К1-Ю! 16,Р20_____________
Δ36-38, О8К1-Ррг 16,Р20_____________
Δ36-38, О8К1РаЫ6,Р20_______
Δ36-38, О8К1О16,Р20,А34 Δ36-38, ОЗЮ-ЕЬуз 16,Р20,А34________ _Δ36-38, О8К1-11Аг§
16, Р20, А34________
Δ36-38, О8К1-С11 16,Р20,А34________
Δ36-38, О8К1-11С1! 16,Р20,А34________
Δ36-38, О8К1-Ррг 16,Р20,А34________
Δ36-38, О8К1-РаЪ 16,Р20,А34________
О8К1-К16, Р20, С34,У36,С37,С38 О8К1-О16, Р20, У36,О37,О38 _
О8К1-ЬЬуз 16, Ρ20,Υ36,Ο37,Ο38 08К1-ЬАг§ 16,Р20,У36,С37,О38 О8К1-С11 16,Ρ20,Υ36,Ο37,Ο38 О8К1-ЬСй 16, Ρ20,Υ36,Ο37,Ο38 О8К1-Ррг 16, Ρ20,Υ36,037,038 О8К1-К16Р20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38 О8К1-О16, Р20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38 О8К1-ЪЪу8 16, Ρ20.Α34.Υ36,037,03 _8_________________________
08К1-ЬАг§ 16, Ρ20,Α34,Υ36,Ο37,Ο3 _8___________________________
08К1-СЙ 16, Ρ20,Α34,Υ36,Ο37,Ο3 _8___________________________
08К1-ЬСй 16, Р20, Α34,Υ3,Ο37,Ο38
1012
1013
1014
1015
1016
1017
1018
1019
1020
1021
1022
1023
1024
1025
1026
1027
1028
1029
1030
1031
1032
- 38 013470
аУ11ЪГУКСК1ЖССЬ[Орг]РСКОАСМБШОКСММ}КСАСУ<ЗС ΟδΚΙ-ϋρτ 16, Ώ20, Α34,Υ36,<337,ϋ38 1033
6УП№КСК18К0СЬ[ОаЪ]РСЮЭАСМКГОКСМ^ОКСАС¥О(3 О8К149аЬ 16, ϋ20, Α34,Υ36,037,038 1034
ОУПКУКСИЗКССЬКРСКОАСМКРОКСМЫОКСАСУО Δ38, О8К1-К16, 1920,Α34,Υ36,037 1035
ОУЦЫУКСКККрСЬОРСКЮАОМКРОКСМЫОКСНСОСО Ο8Κ1-Ο16, ϋ20,Ο36- 38 1036
ОУтТУКСК18КОСЬ[ЬЬу8]РСКПАСМКРОКСМКЖСНСООО О8К1-ЬЬуз 16, 1920,036-38 1037
СУ11КУКСК18КрСЕ[кАг§]РСКОАОМКРСКСМЫОКСНССаО О8К1-ЬАгё 16, 1920,036-38 1038
ОУ1ШУКСК18К9СЬ[Ск]РСКТ)АОМКГОКСМНОКСНСООО Ο8Κ1-Οίΐ 16, 1920,036-38 1039
ОУ11^КСК18КрСЬ[ЬСй]РСКОАОМКГОКСМЫОКСНСООО О8К1-ЬСй 16, 1920,036-38 1040
ОУП№УКСК18^СЬ[Орг]РСКОА6МКРЖСМ№КСНСОСС ΟδΚΙ-ϋρτ 16, 1920,036-38 1041
СУШ4УКСК18КОСЬКРСКОАОМКРСКСМЫОКСАСРОО Ο8Κ1-Κ16, ϋ20, Α34,Ρ36,Ο37,Ο38 1042
ОУЦНУКСККИрСЬОРСКОАСМКРСКСММОКСАСООО Ο8Κ1-Ο16, 1920,Α34,036-38 1043
СУПЫУКСК18КрСЬ[11Ьу8]РСКОАОМКРОКСМКОКСАСОС}О . О8К1-ЪЬу8 16,Ό20,Α34,036-38 1044
ОУ1тУКСК18КрСЬ[11Агё]РСКПАОМКРОКСМ№ОКСАССОа ΟδΚΙ-ЪАгё 16, 020,Α34,036-38 1045 -·-
ОУ1ШУКСК18КРСЬ[СЙ]РСКОАОМКРОКСММОКСАСОО6 О8К1-СЙ 16, 020,Α34,036-38 1046
ОУ1ПЯУКСК18КрСЬ[11СЛ]РСКПАСМКРОКСММСКСАСООС} ΟδΚΙ-ΕΟϊί 16, 020, Α34,036-3 8 1047
СУПНУКСК18КрСЬ[Орг]РСКОАСМКРОКСМН6КСАСООО ΟδΚΙ-ϋρΓ 16, 020,Α34,036-38 1048
ОУПКУКСК18К.ССЬ[ОаЬ]РСКОАОМКРОКСМЫОКСАСООО О8К149аЪ 16, 020, Α34,036-3 8 1049
ОУИЫУКСК18КРСЬКРСКВАОМКРСКСМ^ОКСАСО6 □38, Ο8Κ1-Κ16, Ώ20,Α34,036-37 1050
СУ1тУКСК18К9СЬКРСКОАОМКРОКСМКОКСАСУ6 □ 38, Ο8Κ1-Κ16, ϋ20,Α35,Υ36,Ο37 1051
ОУ1ШУКСК18К9СЬОРСКТ)АС}МКРаКСММОКСАСаО □ 38, Ο8Κ1-Ο16, ϋ20, Α35,Υ36, 037 1052
СУИКУКСК18КрСЬ[11Ьу5]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНСТРК О8К1-ЬЬуз 16,Ε20 1053
СУ1РЫУКСК18КрСЬ[ЬАг§]РСКЕАСМКРОКСМЯиКСНСТРК ΟδΚΙ-ЬАге 16,Ε20 1054
ОУ1ГМУКСК18КрСЕ[Сп]РСКЕАОМКРСКСМНСКСНСТРК О8К1-СЙ 16,Ε20 1055
<ЗУПЫУКСК18КрСЕ[ЕСп]РСКЕАОМКРОКСМАЮКСНСТРК ΟδΚΙ-ΕΟίί 16,Ε20 1056
ОУПКУКСК18К0СЬ[Орг]РСКЕАОМКРОКСММОКСНСТРК ΟδΚΙ-Орг 16,Ε20 1057
ОУШХУКСК18КрСЕ[ОаЪ]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНСТРК О8К149аЪ 16,Ε20 1058
6УПЖКСК18К.0СЕОРСКЕАОМКРСКСМЫОКСНС¥РК Ο8Κ1-Ο16, Ε20,Υ36 1059
6УПКУКСК18КрСЕ[11Еуз]РСКЕАОМКРОКСМЕ[ОКСНС¥РК О8К1-ЬЬу8 16, Ε20,Υ36 1060
ОУПКЖСКТЗКрСЬЕЬАгйРСКЕАОМКРОКСММЖСНСУРК О8К1-ЬАг§16, Ε20,Υ36 1061
СУПКУКСК18КРСЕ[С1!]РСКЕАСМКРОКСМКОКСНС¥РК 08Κ1-0ίΐ 16, Ε20,Υ36 1062
- 39 013470
ОУ1МУКСШ8КОСЕ[ЬСй]РСКЕАОМКБСКСМНОКСНСУРК ΟδΚΙ-ΕΟΐΐ 16, Е20,У36 1063
ОУП1У7КСК18КрСЕ[Орг]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНСУРК ΟδΚΙ-ϋρτ 16, Е20,У36 1064
еУ11тЧССК18К0СЕ[ПаЪ]РСКЕАОМКБОКСМ14ОКСНСУРК О8К1-ВаЪ 16, Е20,У36 1065
еУПЫУКСК18^СЬОРСКЕАеМКРОКСМЫОКСАС1РК О8К1-О16, Е20,А34 1066
СУ11ХУКСК18КОСЕ[11Еу8]РСКЕАОМКРеКСМНОКСАСТРК ОЗКЕЪЬуз 16, Е20,А34 1067 .
еУПКУКСК18КрСЕ[ЬАге]РСКЕАОМКЕеКСМЫСКСАСТРК О8К1-ЬАг§ 16, Е20,А34 1068
ОУПКУКСК18К.рСЕ[Сй]РСКЕАОМКРОКСМХОКСАСТРК О8К1-СЙ 16, Е20,А34 1069
ОУ11КУКСК18КОСЕ[11Сй]РСКЕАОМКЕОКСМНОКСНСТРК ΟδΚΙ-ΡΟίΐ 16, Е20,А34 1070
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κ90Ε[Ορι-]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΤΡΚ ΟδΚΙ-ϋρΓ 16, Е20,А34 1071
ОУ1ШУКСК18КрСЕ[ВаЪ]РСКЕАОМКРОКСМКОКСАСТРК О8К1-ВаЪ 16, Е20,А34 1072
ОУГШУКСККЕрСЬОРСКЕАСМКРеКСК/ШеКСНС Δ36-38, О8К1-О16, Е20, 1073
ОУ11НУКСК18КрСЕ[РЬу8]РСКЕАОМКРОКСМКСКСНС Δ36-38, О8К1-ЬЬу8 16,Е20 1074
ОУ1ШУКСК18Е.рСЕ[йАг§]РСКЕАОМКРОКСМНОКСНС Δ36-38, О8К1-11Агд 16,Е20 1075
СУ1Е4УКСК18КССЕ[СЙ]РСКЕАСМЕРСКСММСКСНС Δ36-38, О8К1-СЙ 16,Е20 1076
СУ1ШУКСК18КрСЦЬСй]РСКЕАОМКРОКСМНОКСНС Δ36-38, О8К1- ЬСй16,Е20 1077
ОУт4УКСК18К.9СЕ[Врг]РСКЕАОМКРОКСМНОКСНС Δ36-38, О8К1-Врг 16,Е20 1078
ОУ1Е4УКСК18КрСЬОРСКЕАОМКГОКСММОКСАС Δ36-38, О8К1- О16,Е20,А34 1079
ОУ11ЫУКСК18КрСЕ[ЬЕу8]РСКЕА6МКРСКСМКтСКСАС Δ36-38, ОЗКВЪЬуз 16,Е20,А34 1080
ОУ1ЕхГУКСК18КОСЕ[11Агд]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСАС Δ36-38, О8К1-ЪАг§ 16,Е20,А34 1081
ОУПЫУК(Ж18^СЕ[С11]РСКЕАОМКГСКСМЫеКСАС Δ36-38, О8К1-СЙ 16,Е20,А34 1082
ОУПУУКСК181<рСЬ[11С11]РСКЕАОМКРОКСМНОКСНС Δ36-38, О8К1-ЬС11 16,Е20,А34 1083
ОУПК7КСК18КрСЕ[Врг]РСКЕАОМКРОКСММОКСАС Δ36-38, ΟδΚΙ-ϋρτ 16,Е20,А34 1084
ОУПКУКСК18КрСЕ|РаЬ]РСКЕАОМКГОКСМЫОКСАС Δ36-38, О8К1-ОаЪ 16,Е20,А34 1085
ОУПМУКСК18КрСЬКРСКЕАОМКЕОКСМКОКСНСУОО О8К1-К16, Е20,У36,О37,О38 1086
ΟνΠΝνΚΟΚΙδΚΟΟΕΟΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ О8К1-О16, Е20,У36,037,038 1087
ΟνΕΝνΚΟΚΙδΚρΟΕΚΡΟΚΕΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟ Δ38 О8К1-К16, Е20,У36,О37 1088
СУ11ЫУКСК18КрСЬКРСКЕАОМКРСКСМНОКСАСУО Δ38 О8К1-К16, Е20,А34, У36,О37 1089
ОУ1ШУКСК18К9СЕ[ЬЕу8]РСКЕАОМКРОКСМ180КСНСУОС ОЗКВЬЬуз 16, 1090
- 40 013470
1091
1092
1093
1094
ОУПКУКСК18КрСЕ[ЬАгё]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНСУОО
ОУПКУКСК18КрСЬ[С11]РСКЕАОМКРОКСМКОКСНСУОО θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕ[ΕΟίί]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ
ОУПКУКСК18К9СЬ[ОРг]РСКЕАСМКЕ6КСМКОКСНСУОО
ОУШЧУКСК18К9СЕ[ОаЬ]РСКЕАОМКРОКСМКОКСНСУОО
ОУ1ШУКСК18К0СЕКРСКЕАОМКРОКСМНОКСАСУО
ОУШУУКСК18КрСЬОРСКЕАСМКЕОКСММОКСАСУОО
ΟνίΙΝνΚΟΚΙδ^ΟΕΟΡΟΚΕΑΟΜΚΓΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟ
ОУ1ЖУКСК18Е9СЬ[11Еу5]РСЮ5АОМ№ОКСМКОКСАС
ОУПРГУКСК18К0СЕ[11Аг§]РСКЕАОМКГОКСМЯОКСАС
ОУ1ШУКСК18К9СЬ[С11]РСК1ЕАОМКРОКСМЫОКСАС
ОУПЕГУКСК18КрСЕ[ЪС11]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНС
ОУШ4УКСК18КрСЕ[Т>рг]РСКЕАОМКРОКСМКОКСАС
6УШУУКСК18КрСЕ[ОаЬ]РСКЕАОМКРОКСМРЮКСАС
ОУПКУКСК18КРСЕКРСКЕАОМКГОКСМЫОКСНСУОО
ΟνΠΝνΚΟΚΙδΕρΟΕΟΡΟΚΕΑΟΜΚΓΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ
6УШ4УКСК18КРСЕКРСКЕАОМКРОКСМНОКСНСУ(3
ΟνίΙΝνΚΟΏδΚΟΟΕΚΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟ θνΐΙΝνΚΟΚ18ΚΟΟΕ[ΕΡγ8]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕ[1ιΑτ§]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ ОУПКУКСК18К9СЕ[Сй]РСКЕАОМШ?ОКСМЫОКСНСУОО
ОУ1тУКСК18КрСЕ[ЬС11]РСКЕАСМКРОКСМЦ6КСНСУОО
ОУП№ЖСК18КрСЕ[Орг]РСКЕА6МКГОКСМКОКСНСУОО
ОУПКУКСК18КрСЬ[ОаЪ]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНСУОО
СУПМУКСКККрСЕКРСКЕАСМКРОКСМЫОКСАСУа
СУЦЫУКСКККрСЬОРСКЕАОМКРОКСМЫСКСАСУСО
Е20,У36,О37,О38
О8К1-ЬАгё 16,
Е20,У36,О37,О38
О8К1-С1116,
Е2Р,У36,О37,О38
Δ37-38, О8К1-ΙιΟίί
16, Е20, У36,О37,О38
ΟδΚΙ-ϋρτ 16,
Е20,У36,С37,О38
О8К14)аЪ 16,
Е20,У36,С37,О38 '□38, О8К1-К16,
Е20,А34,У36,О37
О8К1-О16, Е20,
А34,У36,О37,О38
Δ36-38, О8К1О16,Е20,А34
1095
1096
1097
1079
Δ36-38, О8К1-ЬЬу8
16,Е20,А34_______
Δ36-38, О8К1-ЪАг§
16,Е20,А34_______
Δ36-38, О8К1-С11
16,Е20,А34_______
Δ36-38, О8К1-ЬСИ
16,Е20,А34
1080
1081
1082
1083
Δ36-38, О8К1-Орг
16,Е20,А34
Δ36-38, О8К1-ОаЪ
16,Е20,А34
О8К1-К16,
Е20,У36,О37,О38
О8К1-О16,
Е20,У36,037,038
Δ38 О8К1К16,Е20,У36,О37
Δ38 О8К1-К16,
Е20,А34, У36,О37
1084
1085
1086
1087
1088
1089
О8К1-ЪЬу8
16,Е20,У36,О37,С38
О8К1-ЬАг§
16,Е20,У36,С37,О38
О8К1-С11
16,Е20,У36,О37,С38 Δ37-38, О8К1-ΙιΟίί 16,Е20,У36,С37,О38 ΟδΚΙ-ϋρτ
1б,Е20,У36,О37,О38
О8К140аЪ
16,Е20,У36,О37,О38 □ 38, О8К1-К16, Е20,А34,У36,С37 О8К1-О16, Е20, А34,У36,О37,О38
1090
1091
1092
1093
1094
1095
1096
1097
- 41 013470
СУПКУКСККВОСЦЬЬузрСКЕАОМКВОКСМЫОКСАСУОО О8К1-ЪЬуз 16, Е20, А34,У36,О37,О38 1098
ОУПЫУКСК18К9СЕ[ЬАг§]РСКЕАОМКРОКСМКОКСАСУОО О8К1-ИАг§ 16, Е20, А34,У36,О37,О38 1099
ОУ1тУКСК18КрСЬ[Сй]РСКЕАОМКРОКСМНОКСАСУОО О8К1-СЙ 16, Е20, Α34,Υ36,037,038 1100
ОУИМУКСК18КрСЬ[11Сй]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНСУОО 08К1-ЬСй 16,Е20, Α34,Υ3,Ο37,Ο38 1101
ОУПКУКСК18КрСЕ[Орг]РСКЕАОМКРОКСМКСКСАСУОО ΟδΚΙ-ϋρι 16,Е20, А34,У36,О37,О38 1102
ОУПКУКСК18КрСЬ[ОаЬ]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСАСУОО О8К14)аЬ 16,Е20, А34,У36,О37,О38 1103
0νΠΝνΚ0ΚΙ8Β90ΕΚΡ0ΚΕΑ0ΜΒΡ0Κ0ΜΝΟΚ0Α0Ρα0 Ο8Κ1-Κ16,ϋ20, А34,Р36,О37,О38 1104 ;
ОУПЫУКСШЗКРСЬОРСКЕАОМКЕОКСМЫОКСНСООО О8К1-О16, Е20,036-38 1105
ОУ1ШУКСК18К9СЦЪЕу8]РСКЕАОМКРОКСМКОКСНСООО ОЗКЕИЬуз 16,Е20,О36-38 1106
СУ1ШУКСК18КрСЕ[11Ати]РСКЕАОМВЕСКСМНСЖСНСООО 08К1-ЬАг§ 16,Е20,О36-38 1107
ОУ11ЫУКСК18ВрСЦСй]РСКЕАОМКРОКСМКОКСНСООО 08К1-СЙ 16,Е20,036-38 1108
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΒΟΟΕ[1ιΟίΐ]ΡΟΚΕΑΟΜΒΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΟΟΟ 08К1-ЬСй 16,Е20,С36-38 1109
<ЗУП]УУКСК18ВрСЕ[Орг]РСКЕАОМКЕОКСММОКСНССОО 08К1-Эрг 16,Е20,О36-38 1110
СУ11?СУКСШ8КрС1ЛРСКЕАСМКЕаКСМКСКСАС<Эаа О8К1-О16, Е20,А34,036-38 1111
ОУ1тУКСК18ВрСЕ[Ы.У5]РСКЕАОМКЕОКСМНОКСАСООО ОЗКЕЪЬуз 16,Е20,А34,О36-38 1112
ОУ11ЫУКСК18В0СЕ[11Аг§]РСК]1АОМКРОКСМНОКСАСООО О8К1-ЬАг§ 16,Е20,А34,036-38 1ПЗ ;
ОУПНУКСК18КрСЕ[Сй]РСКЕАОМВРОКСМЦОКСАСООО О8К1-СЙ 16,Е20,А34,036-38 1114
ОУ11КУКСК18ВрСЕ[ЬСй]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСАСТР 08К1-ЬСй 16,Е20,А34,036-38 1115
ОУПЫУКСБС18ВрСЕ[Орг]РСКЕАОМВР6КСМКаКСАСТР 08К1-Эрг 16, Е20,А34,036-38 1116
ОУ1Е4УКСК18КрСЕ[ОаЬ]РСКЕАОМКРОКСМКОКСАСТР 08К1-ОаЬ 16, Е20,А34,036-38 1117
ΟVIINVΚСΚI8Β^С^ΟΡСΚ^ΑΟΜΚΡ^ΚСΜNΟΚСΗСΤΡΚ-NΗ2 Ο8Κ1-Ο16,ϋ20атИе 1118
6У1ШУКСК18КрСЕ[ЬЕу8]РСКОА6МКРОКСМКСКСНСТРК- ΝΗ2 О8К1-ЬЬу8 16,ϋ20апйбе 1119
ОУПХУКСК18КрСЕ[ЬАг§]РСКОАОМКРОКСМЫОКСНСТРК- ΝΗ2 О8К1-ЬАг§ 16,020-апйбе 1120
θνΠΝνΚΟΚΙ8^0Ε[Οΐί]ΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΤΡΚ-ΝΗ2 08К1-СЙ 16,020-агшбе 1121
ОУПМУКСК18КрСЬ[ЬСй]РСКОАОМКРОКСМКОКСНСТРК- ΝΗ2 08К1-ЬСй 16ДЭ20-ат16е 1122
ОУПМУКСК18КрСЕ[1)рг]РСКПАОМКРОКСМНОКСНСТРК-УН2 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,О20-апй6е 1123
ОУ1тУКСК18ВрСЬ[ОаЪ]РСКОАОМКРОКСМЫОКСНСТРК- ΝΗ2 О8К1-ОаЪ 16,ϋ20 1124
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕΟΡΟΚΏΑΟΜΒΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΡΚ-ΝΗ2 О8К1-О16, Ό20, 1125
- 42 013470
УЗб-атИе
ОУ1ШУКСК18КрСЦЬРу3]РСКОАОМКРОКСМНОКСНСУРК- ΝΗ2 ОЗКОЬЬуз 16Д920, УЗб-атМе 1126
ОУПЫУКСК18ВОСЬ[11Агд]РСКОАОМВРОКСМЫОКСНСУРК- ΝΉ2 О8К1-ЬАгё 16,ϋ20, УЗб-агшбе 1127
ОУ№УКСК18ВрСЬ[Сп]РСКОАСМВРОКСМЫОКСНСУРК-КН2 ΟδΚΙ-Οϊΐ 16,020, УЗб-агшйе 1128
ОУИЫУКСК18КОСЬ[11С11]РСКОАСМКРОКСМЫОКСНСУРК- ΝΗ2 О8К1-ЬС11 16,ϋ20, УЗб-атМе 1129
ОУПИУКСК18К0СЬ[Орг]РСКОАОМКРОКСМНОКСНСУРК- ΝΗ2 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,ϋ20, УЗб-агтйе ИЗО
ОУ1ШУКСК18КрСЬ[ОаЬ]РСКОАОМКРОКСМКОКСНСУРК- ΝΗ2 О8К1-ОаЪ 16ДЭ20, УЗб-атМе 1131
ОУПИУКСК18К0СЬОРСКОАОМКРОКСМЫОКСАСТРК-ИН2 О8К1-016,020, А34-атШе 1132
6У11КУКСК18К0СЬ[ЬЬу8]РСКПАСМКРЖСМКОКСАСТРК- ΝΗ2 ОЗКОЬЬуз 16,020, А34-апйбе 1133
ОУПЫУКСК18К0СЬ[ЬАгё]РСКОАОМВРОКСМНОКСАСТРК- ΝΗ2 О8К1-ЬАг§ 16ДЭ20, А34-агшбе 1134
ОУ1ШУКСК18КОСЬ[С11]РСКОАС}МКГСКСМКОКСАСТРК-ХН2 Ο8Κ1-0ΐΐ 16,ϋ20, А34-атшбе 1135
ОУ1ШУКСК18КрСЬ[ЬСй]РСКОА6МКРОКСМКОКСАСТРК- ΝΗ2 О8К1-ЬСй 16,020, А34-аппйе 1136
ОУ1ШУКСК18ВрСЬ[Орг]РСКОАСМВРОКСМНОКСАСТРК-№12 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,020, А34-агшбе 1137
СУ11КУКСК18К0СЬ[ОаЪ]РСКОА6МКРОКСМЯЖСАСТРК- ΝΗ2 О8К1-ОаЪ 16,020 А34-апибе 1138
ОУП№7КСК18КрСЪОРСКОА6МКРОКСМКС-КСНС-МН2 Δ36-38, О8К1016, 020, -аппйе 1139
ОУПЯУКСК18КрСЬ[ЬЬу8]РСКОАСМКРОКСММОКСНС-НН2 Δ36-38, О8К1ЬЬуз 16,020-атИе 1140
ОУ1ШУКСК18КрСЬ[ЬАгйРСКОАОМКРОКСМЫОКСНС-КЕ12 Δ36-38, О8К1- ЬАгд 16,О20-атк1е 1141
ОУПИУКСК18КОСЬ[Сй]РСКОАОМКРОКСМИОКСНС-КН2 Δ36-38, О8К1-СИ 16,О20-агшйе 1142
6УПМУКСК18КРСЬ[ЬСЙ]РСКОАСМКРОКСМНСКСНС-КН2 Δ36-38, О8К1- ЬСй 16,О20-апййе 1143 '
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΒΟΟΡ[Ορτ]ΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟ-ΝΗ2 Δ36-38, ΟδΚΙ-ϋρτ 16,О20-атк1е 1144
ОУПЫУКСК18ВрСЬОРСКОАОМКРОКСМУОКСАС-КН2 Δ36-38, О8К1Ο16,ϋ20,Α34агшйе 1145
ОУПИУКСК18КОСЬ[ЪЬу8]РСКОАОМКРОКСМНОКСАС-ИН2 Δ36-38, О8К1- ЬЬуз 16,ϋ20,Α34ахшбе 1146
ОУБКУКСК18КрСЬ[]1Агд]РСКОАОМКРСгКСММСгКСАС-Р1Н2 Δ36-38, О8К1- ЬАгд 16,ϋ20,Α34апййе 1147
ОУ1ШУКСК18ВОСР[Сй]РСКОАОМВРОКСММОКСАС-ГШ2 Δ36-38, ΟδΚΙ-Οίΐ 16,О20,А34-апп(1е 1148
СУ1ШУКСК18КОСЦЬСй]РСКОАОМКРОКСМУ6КСНС-НН2 Δ36-38, 08К1- ΡΟίί16,020, А34 1149
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κρθϋ[Ορτ]ΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟ-ΝΗ2 Δ36-38, ΟδΚΙ-ϋρτ 1 б,О20,А34-агш<1е 1150
- 43 013470
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8Κρθϋ[ϋΒ6]ΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟ-ΝΗ2 Δ36-38, О8К1-ОаЬ 16,ϋ20,Α34-Βτηΐάε 1151
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κ90ΡΚΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-О16ДЭ20, Υ36,037,038атМе 1152
ΟνΠΝνΚΟΚΙδΚΟΟϋΟΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ-ΝΙΠ Ο8Κ1-Ο16,ϋ20, Υ36,Ο37,Ο38 1153
ОУ1ШУКСК18КрСЬ[ЬЬу8]РСКОАОМКРОКСМЫОКСНС¥ОС- ΝΗ2 О8К1-ЪЬуз 16, ϋ20,Υ36,Ο37,Ο38атМе 1154
θνΠΝνΚΟΏ8ΚρθΕ[1ιΑΓΒ]ΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ- ΝΉ2 08К1-йАг§ 16, ϋ20,Υ36,Ο37,Ο38агшйе 1155
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κρθϋ[Οίΐ]ΡΟΚϋΑΟΜΚΓΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-СЙ 16,ϋ20, Υ36,Ο37,Ο38атМе 1156
ОУПЫУКСК18КрСЬ[ЬСй]РСК1>АаМКРОКСМНОКСНС¥О<3- ΝΗ2 . ' О8К1-ЬС1116, ϋ20,Υ36,Ο37,Ο38агтс1е 1157
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κρθϋ[ϋρΓ]ΡΟΚϋΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟΟ- ΝΗ2 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,ϋ20, Υ36,Ο37,Ο38атИе 1158
ОУ11КУКСК18К.рСЬКРСКОАОМКРОКСМЫОКСНСРОО-КН2 Ο8Κ1-Κ16,ϋ20, Г36,О37,О38агшйе 1159
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚρθϋΚΡΟΚϋΑΟΜΙΟΌΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟ-ΝΗ2 □ 38-О8К1-К16, ϋ20,Υ36,Ο37атМе 1160
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚΟΟΡΚΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟ-ΝΗ2 □ 38-О8К1-К16, ϋ20,Α34, Υ36,Ο37агшйе 1161
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθϋΟΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚΟχΜΝΟΚΟΑΟΥΟΟ-ΝΗ2 Ο8Κ1-Ο16,ϋ20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38апп<1е 1162
ОУПКУКСК18КрСЬ|ЪЬу8]РСКОАОМКРОКСММОКСАС¥0(3- ΝΗ2 ОЗКЕЬЕуз 16, ϋ20, Α34,Υ36,Ο37, О38-атк1е 1163
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κ90Ε[1ιΑΓ§]ΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟΟ- ΝΗ2 08К1-йАгё 16, ϋ20,Α34,Υ36,Ο37, О38-апнае 1164
ανΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕ[Οίΐ]ΡΟΚϋΑΟΜΒΕΌΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟΟ-ΝΗ2 08Κ1-0ίΐ 16,ϋ20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38 1165
ОУтОУКСК18К9СЬ[11Сй]РСКОАСМКРОКСМЫОКСАС¥СО- ΝΗ2 Ο8Κ1-1ιΟίΐ16,ϋ20, Α34,Υ3,Ο37,Ο38атшйе 1166
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚΟΟΕ[ϋρτ]ΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟΟ- ΝΗ2 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,ϋ20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38атИе 1167
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕ[ϋπ6]ΡΟΚ1ϋΑΟΜΚΡσΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟΟ- ΝΗ2 ОЗКМЭаЬ 16, ϋ20,Α34,Υ36,Ο37, О38-ат1с1е 1168
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕΚΡΟΚΟΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟΟ-ΝΗ2 Ο8Κ1-Κ16,ϋ20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38атИе 1169
1 θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕΟΡΟΚϋΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝαΚΟΗΟΟΟΟ-ΝΗ2 Ο8Κ1-Ο16,ϋ20, 1170
- 44 013470
О36-38-ат16е
6У1ШУКСК18К.0СЬ[11Ьу8]РСКОЛОМКРОКСМЫОКСНСООО- ΝΗ2 О8К1-ЪЪуз 16, О20,О36-38-ат16е 1171
СУ1тУКСК18КОСЬ[кАгё]РСКОАОМ1ШСЖСМКСЖСНСООО- ΝΗ2 О8К1-11Аг§ 16, О20,О36-38-агт6е 1172
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕ[Οίί]ΡΟΚΟΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΟΟΟ-ΝΗ2 О8К1-СЙ 16, 020,036-38-апнбе 1173
ОУП1^УКСК18^СЬ[ЬСй]РСКПА6МКРОКСМЫ6КСНСООО- ΝΗ2 О8К1-ЕСЕ16, 020,036-38-атйе 1174
ОУПНУКСК18К.рСЕ[Орг]РСКОАОМКРОКСКШОКСНСООО- ΝΗ2 Ο8Κ1-ϋρΓ 16, О20,О36-38-атк1е 1175
ΟνίΙΝνΚΟΚΙδΚρΟΕΚΡΟΚΟΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΟΟΟ-ΝΗΤ О8К1-К16, ϋ20, А34,О36-38-агш6е 1176
θνΠΝνΚΟΚΙ8^0ΕΟΡΟΚΟΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΡΟΟ-ΝΗ2 Ο8Κ1-Ο16,ϋ20, А34,Г36, 037-38атИе 1177
ОУ11т7КСК18К.рСЕОРСКОАОМКРОКСХШОКСАСаОО-М12 О8К1-016,020, А34,О36-38-атк1е 1178
ОУПЫУКСК18КрСЬ[ЬЬу8]РСКОАаМКРСКСМЫСКСАСС}ОО- ΝΗ2 ОЗКОЬЬуз 16, Ώ20, А34,036-38атМе 1179
ОУПЫУКСК18КрСЕ[11Агё]РСКОАОМКГОКСМНОКСАСООО- ΝΗ2 08К1-ЪАг§ 16, ϋ20,Α34,Ο36-38апнбе 1180 . ,
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚΟΟΕ[Οίΐ]ΡΟΚΟΑΟΜΚΓΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΟθα-ΝΗ2 О8К1-СЕ 16, Ώ20,Α34,036-38агшбе 1181
(ЗУ1ШУКСК18КрСЬ[ЬСй]РСКОАОМКР6КСМ^6КСАСООО- ΝΗ2 О8К1-ЬСП16, ϋ20, А34,036-38аппбе 1182
ОУПЫУКСК18К0СЪ[Орг]РСКОАОМ1ШОКСМУ6КСАСООО- ΝΗ2 08К1-Орг 16, Ώ20, А34,036-38-апж1е 1183
ОУ1ПЧУКСК18КрСЕ[ОаЬ]РСКОАОМКГОКСММОКСАСООО- ΝΗ2 О8К1-ОаЪ 16, 020, А34,036-3 8-ат16е 1184
6У1ШУКСК18КРСЬОРСКЕАОМКРСЖСМЫОКСНСТРК-КН2 О8К1-О16,Е20атМе 1185
СУ1ШУКСК18КрСЬ[Ы,у8]РСКЕАОМКЮКСМНОКСНСТРК- ΝΗ2 ОЗКОИЬуз 16,Е20-апй6е 1186
ОУ1ГЫУКСК18КрСЕ[11Аг§]РСКЕАОМКЕ(ЖСМУСКСНСТРК- ΝΉ2 08К1-ЬАг§ 16,Е20-атк1е 1187
ОУПЫУКСК18КрСЕ[Ск]РСКЕАОМКГОКСМЫОКСНСТРК-ИН2 08К1-СЕ 16,Е20агшбе 1188
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚΟΟΕ[ΗΟίί]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΤΡΚ- ΝΗ2 О8К1- ЬСЙ16,Е2Оагшбе 1189
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΚΟΟΕ[ΟρΓ]ΡΟΚΕΑΟΜΕΙ7ΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΤΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,Е20агшбе 1190
ОУЖтУКСК18КОСО[ОаЪ]РСКЕАОМКЕОКСМУОКСНСТРК-КН2 08К1-0аЪ 16,Е20атИе 1191
ОУ1ЖУКСК18КОСЕОРСКЕАОМКЕОКСМ^ОКСНСУРК-ЫН2 О8К1-О16, Е20,У36-апй6е 1192
- 45 013470
ОУПНУКСККВЦСЬ[ЬЬу8]РСКЕАОМВРОКСМЫОКСН СУРК-ЫН2 О8К1-ЬЬу8 16, Е20,У36-ат16е 1193
ОУННУКСК18ВЦСЬ[11Агд]РСКЕАОМКРОКСМХОКСН СУРК-МН2 О8К1-ЬАг§ 16, Е20,У36-агт6е 1194
ОУПМУКСК18КрСЕ[Ск]РСКЕАОМКГОКСМЫОКСНС ΥΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-Сй 16, Е20,У36-апн6е 1195
ОУ1ШУКСК18КРСЕ[ЬС11]РСКЕАОМВРОКСМХ6КСНС ΥΡΚ-ΝΉ2 ΟδΚΙ-ЙСП16, Е20,У36-а1ш6е 1196
ОУПНУКСК18ВЦСЕ[Орг]РСКЕАОМКРОКСМЫОКСНС ΥΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-ϋρΓ 16,Е20, УЗб-апибе 1197
ОУШ^УКСК18КрСЕ[ОаЪ]РСКЕАОМКРОКСМКСКСНС ΥΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-ОаЪ 16,Е20,У36-апж1е 1198
аУИЫУКСККВЦСЕОРСКЕАаМВРбКСМЫбКСАСТР Κ-ΝΗ2 О8К1-О16,Е20, А34- ахшбе 1199
ОУИМУКСК18К.9СЕ[ЪЬу8]РСКЕАСгМКРОКСМНСгКСА 0ΓΡΚ-ΝΗ2 ОЗКЕЪЬув 16, Е20,А34-а1ш6е 1200
СУПРГУКСК18КрСЕ[ЬАгё]РСКЕАОМКЕСКСММОКСА СТРК-ЫН2 ΟδΚΙ-ЬАгд 16, Е20,А34-апп6е 1201
СУПХУКСК18ВрСЕ[СД]РСКЕАОМВРСКСМНОКСАСТ ΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-СИ16, Е20,А34-ат1с1е 1202
аУ11КУКСК1Ж0СЕ[ЬСй]РСКЕАаМКРС}КСММСКСАС ΤΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-Й.СЙ16, Е20,А34-ат16е 1203
ОУПЫУКСК18КрСЕ[Орг]РСКЕАСМКРОКСМЯСгКСАС ΤΡΚ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-Орг 16, Е20,А34-а1ш6е 1204
СУПКУКСК18ВрСЕ[ОаЬ]РСКЕАСМКРСКСМЖЖСАС ΤΡΚ-ΝΗ2 О8К1-ОаЪ 16, Е20,А34-ат16е 1205
ОУПНУКСЫЗКрСЬОРСКЕАСМКРСКСМНСКСНС- ΝΗ2 Δ36-38, О8К1- О16,Е20, -апйае 1206
ОУ11ЯУКСК18ВЦСЕ[11Еу8]РСКЕА6МКРОКСМКОКСН ΟΝΗ2 Δ36-38, О8К1-ЬЬу8 16,Е20-агш6е 1207
ОУПЫУКСК18ВрСЬ[11Агй]РСКЕАОМКРОКСМХОКСН 0-ΝΗ2 Δ36-38, О8К1-ЬАге 16,Е20-ат16е 1208
ОУПЫУКСК18ВрСЕ[СП]РСКЕАОМКРСКСМЫОКСНС- ΝΗ2 Δ36-38, О8К1-СИ 16,Е20-апн6е 1209
ОУП?ТУКСК18КРСЕ[ЬСЙ]РСКЕАСМКРОКСМЫОКСНС -ΝΗ2 Δ36-38, О8К1- ЬСй16,Е20-а1ш6е 1210
СУПМУКСК18КрСЬ[Орг]РСКЕАСМКРОКСМЫОКСНС- ΝΗ2 Δ36-38, ΟδΚΙ-ϋρι 16,Е20-апйс1е 1211
ОУПЫУКСК18КРСЬОРСКЕАОМКР(ЗКСММ6КСАС- ΝΗ2 Δ36-38, О8К1-О16, Е20,А34-ат16е 1212
СУПЫУКСК18ВрСЕ[Ыуз]РСКЕАОМВРОКСМК6КСА ΟΝΗ2 Δ36-38, О8К1- ЬЬуз 16,Е20, А34-агш6е 1213
ОУПЫУКСКККрСЬ[11Агд]РСКЕАОМКРОКСМХСЖСА 0-ΝΗ2 Δ36-38, О8К1- 1ιΑγ§1 6,Е20, А34-а1ш6е 1214
ОУПКУКСК18К9СЬ[Ск]РСКЕАаМКРСКСМЫОКСАС- ΝΗ2 Δ36-38, О8К1-СИ 16,Е20,А34-апп6е 1215
СУП№УКСК18КРСЕ[ЬС6]РСКЕАСМКР(ЗКСМНСКСНС -ΝΗ2 Δ36-38, О8К1- 11С1116,Е20,А34-ат1с1е 1216
ОУШЧУКСК18В.рСЕ[Орг]РСКЕАаМКРОКСМЫОКСАС- ΝΗ2 Δ36-38, ΟδΚΙ-ϋρτ 16,Е20,А34-агш6е 1217
ОУПМУКСК18КЦСЕ[ЕаЪ]РСКЕАОМКРСКСМЫ6КСАС -ΝΗ2 Δ36-38, ΟδΚΙ-ОаЪ 16,Е20,А34-апп6е 1218
ОУ1ШУКСК18К0СЫСРСКЕАОМКР6КСМКСКСНСУа Ο-ΝΗ2 О8К1-О16,Е20, \У36,О37,О38-атк1е 1219
- 46 013470
ΟΥΠΝνΚΟΚΙδΕρΟΕΟΡΟΚΕΑΟΜΚΓαΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟ Ο-ΝΗ2 О8К1-О16,Е20, У36,Сг37,Сг38-а1шйе 1220
σ¥ΙΙΝ¥ΚΟΚΙ8Β90Ε[ΕΕγ8]ΡΟΚΕΑΟΜΒΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗ ΟΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ЬЬу5 16, Е20, У36,Ст37,Сг38-атк1е 1221
0¥ΠΝ¥ΚΟΚΙ8ΒΡΟΕ[1ιΑγ§]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗ ΟΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ЬАг§ 16, Е20, У36,С37,С38-апйае 1222
0¥ΙΙΝ¥ΚΟΚΙ8Β90Ε[Οιί]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟ ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-СЙ 16, Е20, У36,637,С38-атк1е 1223
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8ΚρθΕ[ΕΟΐΐ]ΡΟΚΕΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟ ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ЕСЙ 16,Е20, У36,О37,О38-ат1ае 1224
О¥11ЫУКСК18ВрСЕ[Орг]РСКЕАОМКЕОКСМХОКСНС ΥΟΟ-ΝΗ2 ОЗКЫЭрг 16,Е20, У36,О37,О38-апйае 1225
а¥1Ш¥КСК18К9СЕ[ОаЬ]РСКЕАОМКЕОКСММОКСНС ΥΟΟ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-Ώρτ 16,Е20, Υ36,Ο37,Ο38-3πύάβ 1226
ΟΥΙΙΝΥΚΟΚΙδΒρΟΕΚΡΟΚΕΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟ Ο-ΝΗ2 О8К1-К16,Е20, А34, У36,О37,О38-апйае 1227
ΟΥΠΝΥΚΟΚΙδΚρΟΕΟΡΟΚΕΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟΥΟ Ο-ΝΗ2 О8К1-О16,Е20, А34, У36,637,О38-апш1е 1228
О¥ПЕР/КСК18КрСЬ[11Еу8]РСКЕЛОМКРОКСММ<ЗКСА ΟΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ЬЬу8 16,Е20, А34, Υ36,Ο37,Ο38атМе 1229
О¥1Ш¥КСК18^СЬ[11Аг§]РСКЕА<ЗМКРС}КСМНСЖСА ΟΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ЪАгё 16,Е20, А34,¥36,037,038агшйе 1230
θνΠΝνΚΟΚΙ8ΒΟΟΕ[Οϋ]ΡΟΚΕΑΟΜΚΓΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟ ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-СЙ 16,Е20, А34, У36,С37,О38-аппс1е 1231
О¥ПКУКСК18^СЕ[11С11]РСКЕАОМКЕОКСМКОКСНС ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1- ЬСй 16,Е20, Α34,Υ3,Ο37,Ο38апийе 1232
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κ90Ε[ϋρΓ]ΡΟΚΕΑΟΜΚΓΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟ ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-Орг 16,Е20, А34, Υ36,Ο37,Ο38апцйе 1233
θνΐΙΝνΚΟΚΙ8^0Ε[ϋ36]ΡΟΚΕΑΟΜΚΡΟΚΟΜΝΟΚΟΑΟ ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ПаЬ 16,Е20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38атк1е 1234
ΟνΠΝνΚΟΚΙδΙίρΟΕΟΡΟΚΕΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΟΟ Ο-ΝΗ2 08К1-016,Е20,036- 38-ат! йе 1235
СУ11¥¥КСК18КрСЕ[ЪЕу8]РСКЕАОМКЕОКСМАОКСН ΟΟΟΟ-ΝΉ2 О8К1-ЪЬу8 16,Е20, О36-38-апнс1е 1236
ОУПКУКСКККрСЕ[11Агё]РС1СЕАОМКРОКСМЪЮКСН οοοο-ΝΗ2 О8К1-ИАг§ 16,Е20, О36-38-апп(1е 1237
ОУПНУКСК18КрСЬ[С11]РСКЕАОМКРОКСМЫСКСНС 000-ΝΗ2 О8К1-СИ 16,Е20,О3638-ат1с1е 1238
ОУПНУКСК18КрСЕ[ЬСй]РСКЕАОМВГОКСМНОКСНС ΟΟΟ-ΝΗ2 08К1-ЕСЙ 16,Е20, О36-38-аппс1е 1239
ОУШ<УКСК18КрСЕ[Орг]РСКЕАОМКРОКСМНОКСНС ΟΟΟ-ΝΗ2 ΟδΚΙ-ϋρτ 16,Е20, 036-3 8-атЫе 1240
ОУ11Ж<КСК18КрСЕОРСКЕАОМКРОКСМЖ1КСАСОО Ο-ΝΗ2 О8К1-О16,Е20, А34,О36-38-апйс1е 1241
ОУПКУКСК18^СЕ[ЬЬу8]РСКЕАОМКГОКСМХОКСА ΟθΟΟ-ΝΗ2 ОЗКЕЪЬуз 16,Е20, А34,О36-38-апйае 1242
θνΠΝνΚΟΚΙ8Κ.ρθΕ[1ιΑτ§]ΡΟΚΕΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝαΚΟΑ СОСЮ-К'Н2 08К1-кАг§ 16,Е20, АЗ4,036-3 8-апйае 1243
ОУПМУКСК18ВрСЕ[С11]РСКЕАОМКЕОКСМАОКСАС ΟΟ6-ΝΗ2 ΟδΚΙ-Сй 16,Е20, А34,О36-38-ат1ае 1244
- 47 013470
ОУПКУКСК18ВрСЬ[11СЙ]РСКЕАОМКРаКСМКОКСАС ΤΡ-ΝΗ2 □ □□О8К1-ЬСй 16, Е20,А34-апй4е 1245
ОУ1ШУКСК18КрСЬ[Прг]РСКЕАОМКРСКСМЫОКСАС ΟΟΟ-ΝΗ2 08К1-Орг 16,Е20, А34,О36-38-ат1с1е 1246
ОУПЫУКСК18К9СЕ[ОаЬ]РСКЕАаМКЕОКСММОКСАС ΟΟΟ-ΝΗ2 О8К1-ОаЬ 16.Е20, А34,С36-38-аппс1е 1247
СУ11УУКСККК.9СЕКРСК[Сра]АОМКРЖСМЫОКСАС ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16,СРА20, Α34,Υ36,Ο37,Ο38ат14е 1248
СУПКУКСК18КрСЕКРСК[Сра]АОМКРОКСМЫСКСАС ΟΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16,СРА20, А34,С36-38-апйс1е 1249
ОУ11т^КСК1Ж0СЕКРСК[Сра]АаМКРСЖСМЪЮКСАС Υ-ΝΗ2 Δ37-38Ο8Κ1-Κ 16, ΟΡΑ20,Α34,Υ36аппс1е 1250
Ас- ОУПКУКСК18КрСЬКРСКОАОМКРОКСМЯОКСАСУО Ο-ΝΗ2 Асе1у1-О8К1-К 16, ϋ20, А34, У36,С37,<л38-атк1е 1251
ОУШ4УКСК18КрСЬКРСК[Аа4]АОМКЕОКСМЫОКСАС ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16, Аа420,А34, Υ36,Ο37,Ο38-Ηπύάε 1252
ОУПЫУКСК18КрСЬБСРСК[Аас1]АОМКЕОКСМЫОКСНС ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16, Ααά20,Υ36,Ο37,Ο38- атМе 1253
ОУ1ШУКСК18КрСЬКРСК[Ааа]АОМКГОКСМЫОКСАС ΥΟΟ О8К1-К 16, Аа020,А34,У36,О37, 038 1254
ОУШЧУКСК18КРСЕНРСКОАОМКЕОКСМНОКСАСУО Ο-ΝΉ2 О8К1-Н 16,ϋ20, А34, У36,О37,О38-атк1е 1255
оупмуксмз^сьнрскоаомкгоксммоксасуо <3 О8К1-Н 16,020, Α34,Υ36,Ο37,Ο38 1256
ОУВИУКСККВДСЕНРСКОАОМКЕОКСМЫОКСАСУ- ΝΗ2 □ □□□□-О8К1-Н 16, ϋ20,Α34,Υ36-3πύάε 1257
ОУПМУКСЫЗКрСЬЕГРСКОАОМКЕОКСМКОКСНСУО Ο-ΝΗ2 О8К1-Н 16,Ό20, А34, У36,О37,О38-атк1е 1258
ΟνίΙΝνΚΟΚΙδ^ΟΕΗΡΟΚΟΑΟΜΚΕΟΚΟΜΝΟΚΟΗΟΥΟ о О8К1-Н 16,020, Α34,Υ36,Ο37,Ο38 1259
ОУПМУКСККЕрСЬНРСКОАОМКГОКСМУОКСНСУР к О8К1-Н 16,020, Α34,Υ36, 1260
ОУПХУКСК18К.рСЬНРСКОАОМКРОКСММОКСАС □ 36-38 Ο8Κ1-Η 16,ϋ20,Α34,Υ36, 1261
ОУ1ШУКСК18ВрСЬКРСКОА6МКЕ6КСМНОКСАС[Ш &ΐ]σα-ΝΗ2 Ο8Κ1-Κ 16,020, А34,1Ыа136,О37,О38атМе 1262
ОУ1ЖУКСК18КрСЬКШСКОАОМКЕОКСМКОКСАС[т η1]ΡΚ-ΝΗ2 Ο8Κ1-Κ 16,ϋ20, А34,Ша136-ат14е 1263
ОУПМУКСК18КрСЕКРСКОАОМВЕОКСМНОКСАС[2Ы 31]ΟΟ-ΝΗ2 Ο8Κ1-Κ 16,020, А34,2Ыа136,О37,О38апп4е 1264
ОУ1тУКСК18К0СЕКРСКОАОМКЕОКСМЫОКСАС[СЪ η]ΟΟ-ΝΗ2 08К1-К 16,020, А34,СЪа36,О37,О38- агтс!е 1265
ОУПНУКСК18^СЕКРСКОАОМКЕОКСМЫОКСАС[Ме ΡΕε]ΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16,О20,А34, МеРЬе36,О37,О38апйбе 1266
ОУ1тУКСК18К0СЕКРСКОАОМКГОКСМНОКСАС[В1 ΡΕΑ]ΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16,О20,А34, ΒίΡ1ιΑ36,Ο37,Ο38агшйе 1267
ОУПКУКСК18КрСЬКРСКОАОМКРОКСМНОКС[А1Ъ]С ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16,020, ΑΐΒ34,Υ36,037,038- агш4е 1268
ОУ1П4УКСК18КрСЬКРСКОАОМКЕОКСМНОКС[АЬи]С ΥΟΟ-ΝΗ2 О8К1-К 16,ϋ20, АЬи34, Υ36,Ο37,Ο38атИе 1269
ОУПК7КСК18ВрСЕКРСКОАОМКГОКСМКаКСАС[Ш а1] □ 37-38 О8К1-Н 16,О20,А34,Ша136, атИе 1270
ОУ1ШУКСК18К9СЕНРСКОАОМКРОКСМХОКСАС[Ш а1]ОО-14Н2 О8К1-Н 16,ϋ20,Α34, 1Ыа136,О37,О38атМе 1271
ОУПЫУКСК18КрСЕКРСКОАОМКРОКСМЫОКСАС[4В ίρ]-ΝΗ2 □ 37-38 О8К1-Н 16,ϋ20,Α34, 4Βΐρ 36,аггцйе 1272
ОУПКУКСК18К0СЕНРСКОАОМКГОКСМЯОКСАС[4В ίρ]ΟΟ-ΝΗ2 О8К1-Н 16,ϋ20,Α34, 4Βίρ 36,037,038атМе 1273
СУ1ШУКСК1ЖрСЕКЕСК0А6МЖЖСММ}КСНСС(} о О8К1-К16,Е20,О36- 38 1274
Любую последовательность, представленную в табл. 7, можно также дериватизировать либо по Ыконцу, либо по С-концу, с помощью жирной кислоты, содержащей 4-10 углеродных атомов и 0-2 угле
- 48 013470 род-углеродных двойных связи, или с помощью ее производного, такого как ω-амино-жирная кислота (например, МоиКа! е! а1., международная заявка Ш) 2006/002850 А2, которая вводится ссылкой во всей полноте). Примеры таких жирных кислот включают валериановую кислоту или (для С-конца) ωаминовалериановую кислоту.
Таблица 8
Последовательности пептида Р12 и Р1Р2 пептидных аналогов
Последовательность/структура
ПЗСТЪУКдСУРНСККЕТСУРКАКСМНККСКСРПК·
ТКСТЫРХдСУРНСККЕТОУРНАКСММККСКСРСК
Т15СТРЛ?АдСАТНСККЕТ6УРМ\КСМШКСКСРОК ТКСТИРКдСУРНСХКЕТОУРХАКСММККСКСРОК Т18СТКРКдСУРНСАКЕТОУРКАКСМЫККСКСРдК ТКСТЫРКдСУРНСКХЕТСУРИАКСММККСКСРОК Т18СтаРКдСУРНСКАЕТОУРКАКСМ№ЖСКСРСЖ ТКСтаРКдСУРНСККЕТОУРХАХСМРЖКСКСРОК ТКСТМРКдСУРНСККЕТСУРКААСМХККСКСРСЖ ТКСТИРКдСУРНСККЕТОУРНАКСМИХКСКСРСтК ТКСТХРКдСУРНСККЕТОУРНАКСММАКСКСРСК ткстаркдсурнсккЕтаурнАКсмыюссксгок ТКСТТ^РКдСУРНСККЕТОУРЫАКСМРЖАСКСРОК ТКСТНРКдСУРНСККЕТОУРЫАКСМКККСХСРСК ТКСтаРКдСУРНСККЕТОУРКАКСМКККСАСРСК ТКСТ^ОРКдСУРНСККЕТОУРКАКСМКККСКСРОХ Т18СТХРКдСУРНСККЕТОУРЫАКСМЫККСКСРОА ТКСЛ^РКдСУРНСККЕТдУРЫАКСМКККСКСРО
Краткое обозначение
Ρί2
ΡΪ2-Χ8
ΡΪ2-Α8
ΡΪ2-Χ15 ' ΡΪ2-Α15
ΡΪ2-Χ16 ' Р12-А16 ' Р12-Х24 ' ΡΪ2-Α24 ' Р12-Х28 ’ Р12-А28
Р12-Х29
ΡΪ2-Α29
Р12-Х31 ~ΡΪ2-Α31
Р12-Х35
Р12-А35
Ρΐ2-ά35
8Е<2
ΙΡΧΟ:
299
300
301
302
303
304
305
306
307
308
309~
310
311 ~ЗР2
313
314
315
Таблица 9 Последовательности пептида ануроктоксина (Апигос1охт (АпТх)) и его пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначение $Е(2 Π)ΝΟ:
гКЕСТОРОНСТЫРСККККСТНСЖСМЖКСКСРМСК Апигос1охш (АпТх) 62
КЕСТОРдНСЮТСКК№.СТНСКСМ1ЖКСКСРМСК АпТх-сП 316
ХЕСТОРдНСтаРСБЖМССТНСКСММИССКСРМСК АпТх-<11,Х2 317
АЕСТОРдНСтаРСККККСТНОКСМЫВКСКСРЯСК ΑηΤχ-ά1,Α2 318
Таблица 10
Последовательности пептида ноксиустоксина (ХохшзГОхт (ΝΤΧ)) и аналогов ΝΤ X пептида
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Ε(} Π)ΝΟ:
ΤΙΙΝνΚΟΤδΡΚΟΟδΚΙ’ΟΚΕΕΥΟδδΑΟΑΚΟΜΝΟΚΟΚΟΥΝΝ ΝΤΧ 30
Т11№АСТ8РКдС8КРСКЕЬУО88АСАКСМКОКСКСУЯМ ΝΤΧ-Α6 319
Т1ШУКСТ8РКдС8КРСКЕЬУа8 δΚΟΑΚΟΜΝΟΚΟΚΟΥΝΝ ΝΤΧ-Κ25 320
ТПМУКСТ88КдС8КРСКЕЬУО88АОАКСМКОКСКСУКН ΝΤΧ-810 321
ТПЫУКСТЗРКдСАУКРСКЕЬУСгЗЗАОАКСМНСгКСКСУРПЧ ΝΤΧ-Υ/14 322
ТПМУКСТ8РКдС8КРСКЕЬУО88ОАКСМНСКСКСУКН ΝΤΧ-Α256 323
ΤΠΝνΚΟΤδΡΚΟΟδΚΡΟΚΕΕΡΟνΏΚΟΚϋΜΝΟΚϋΚαΥΝΝ ΝΤΧ-ΙΒΤχΙ 324
ТИНУКСТ8РКдСЛУКРСКЕЬРОУР1ЮКСМКОКСКСУХ ΝΤΧ-ΙΒΤΧ2 325
Таблица 11 Последовательности пептида калиотоксина1 (Ка1ю1охт1 (КТХ1)) и аналогов КТХ1 пептида
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е<2 Π)ΝΟ:
ОУЕШУКСЗСЗРдСЬКРСКОАОМКРОКСМНККСНСТРК КТХ1 24
УГША'ЗСКТКСгдСГ.КРСКПАбМКГСЖСМХСтКСПС'ГРК КТХ2 326
ОУЕПУУ8С8О8РдСЬКРСКПАСгМКЕСКСМЬ1ККСНСТРК КТХ1-87 327
ОУЕ1МУАС808РдСЕКРСКОАСМКГОКСМ№ККСНСТРК КТХ1-А7 328
Таблица 12
Пептидные последовательности ингибиторов 1КСа1
Последовательность/структура Краткое обозначение 8ЕО ГО ΝΟ:
У8СТС8КОСУАРСЕКдТ6СРХАКС1ХКЗСКСУОС мтх 20
дРТХУ8СТТ8КЕСУл8УСдЩНХТЖОКСМЖКСКСУ8 СЪТх 36
дРТдЕ8СТА8ХдСУ/81СКЕЕНХТОКСКСМ7ЖКСРСУ8 С11Тх-Ед2 329
- 49 013470
Таблица 13 Последовательности пептида мауротоксина (Маиго1ох1п (МТх)) и пептидных аналогов МТх
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е(2 Π)ΝΟ:
УЗСТСгЗКВСУАРСККОТСтСРХАКСШКЗСКСУОС МТХ 20
У8СА<38КЦСУАРСККОТССРХАКСШК8СКСУОС МТХ-А4 330
УЗСТОАКОСУАРСМСОТЦСРХАКСЖКЗСКСУОС МТХ-А6 331
УЗСТОЗАОСУАРСККрТССРХАКСГМКЗСКСУОС МТХ-А7 332
У8СТО8КОСААРСККрТОСРХАКС1КК8СКСУОС МТХ-А10 333
У8СТО8КОСУАРСрК0ТССРЫАКС1ЫК8СКСУОС МТХ-(Ц4 334
У8СТС8КПСУАРСКрОТССРЦАКС1МК8СКСУОС МТХ-(}15 335
У8СТС8КЦСУАРСОООТОСРХАКС1УК8СКСУОС МТХ<)14,15 336
УЗСТСЗКОСУАРСККРТОСРХАКСПЖЗСКСУАС МТХ-АЗЗ 337
У8СТО8КЦСУАРС1Ж0ТОСРУСКСММЖСКС№С МТХ-НзТх1 338
У8СТ68КОСУААС]^ТССАЯАКС]МС8СКСУОС МТХ-А12,20 339
У8СТО8КОСУАРСКК0ТОХМ19РЫАКС1ЫК8СКС¥ОХМ34 МТХ-Х19, 34 340
УЗСТСЗКОСУАРСРКртаЗРХАКСИЖЗСКСУОЗ МТХ-819,34 341
УЗСТОЗАЕЮУАРСКЭДТОСРЫАКСМКЗСКСУОС МТХ-А7 342
ννιοοκατο8ΚϋθΥΑΡϋ№θτοοΡΝΑκαΐΝΚ8(2κσγσο ТзК-МТХ 343
УЗСКОЗКОСУАРСИ^ТССРЫАКСПЧКЗСКСУСгС МТХ-К4 1301
УЗСОСЗБСОСУАРСККОТОСРХАКСПЧКЗСКСУОС МТХ-О4 1302 ,
УЗСТТЗКОСУАРСЮ^ТОСРХАКСТККЗСКСУОС МТХ-Т5 1304
У8СТА8КЦСУАРСКК0ТССРНАКС1Ж8СКСУЦС МТХ-А5 1305
УЗСТОТКОСУАРСККОТбСРЦАКСШКЗСКСУОС МТХ-Т6 1306
УЗСТОРКОСУАРСККрТЦСРХАКСШКЗСКСУСС МТХ-Р6 1307
У8СТС8КОСОАРСККрТОСРЫАКС1МК8СКСУОС МТХ-610 1309
УЗСТОЗКОСУКРСККрТОСРЦАКСЕЖЗСКСУОС МТХ-К11 ИИ
УЗСТОЗКОСУОРСККРТОСРХАКСЕЖЗСКСУОС ΜΤΧ-ϋΠ 1312
У8СТО8КОСУАРСКККТ0СРНАКС1Ж8СКСУОС МТХ-К16 1315
УЗСТСЗКОСУАРСККЕТОСРХАКСПЧКЗСКСУОС МТХ-Е16 1316
УЗСТСЗКОСУ.УРСККрТОСРУАКСТМКЗСКСУОС ΜΤΧ-Υ21 1317
УЗСТСЗКОСУАРСК^ТССРНЗКСГЖЗСКСУОС МТХ-822 1318
УЗСТСЗКОСУАРСККрТОСРХОКСПЖЗСКСУОС МТХ-О22 1319
УЗСТСЗКПСУАРСККОТОСРХАКСШКЗСКСУОС МТХ-К27 1320
УЗСТСЗКПСУАРСККРТОСРХАКСШКТСКСУСС МТХ-Т28 1321
УЗСТОЗКГОСУАРСККрТССРХАКСИЖМСКСУОС МТХ-М28 1322
УЗСТОЗКОСУАРСККРТОСРЫАКСПЖКСКСУОС МТХ-К28 1323
νδΟΤΟδΚΟΟΥΑΡΟΚ^ΤαΟΡΝΑΚαΝΚδΟΚΟΝΟΟ ΜΤΧ-Ν32 1324
У8СТО8КПСУАРСДК0ТОСРХАКСЖК8СКСУКС мтх-кзз 1325
У8СТС8КОСУАРСЕКрТОСРХАКС1ХК8СКСУОС8 МТХ-835 1326
8СТО8КОСУАРСКК0Т(лСРХАКС1Ж8СКС¥ОС МТХ-61 132”
8СТ08КВСУАРС1Ц^ТССРКАКС1Ж8СКС¥ОС8 МТХ-835 61 1328 ..
УЗСТОЗКГОСУАРСАКОТОСРЦАКСШКЗСКСУОС МТХ-А14 1329
УЗСТОЗКОСУАРСКАрТОСРКАКСПЖЗСКСУОС МТХ-А15 1330
УЗСТОЗКОСУАРСККОТОСРХААСОЖЗСКСУОС МТХ-А23 1331 ·
У8СТС8К1ЭСУАРСЦКОТСгСРЫАКС1ХА8СКСУаС МТХ-А27 1332 '
УЗСТСЗКГОСУАРСНКрТОСРХАКСПЖЗСАСУОС МТХ-АЗО 1333
УЗСТСЗКЦСУАРСРХОТССРХАКСШКЗСКСАСС МТХ-А32 1334
АЗСТСЗКПСУАРСЕКОТСгСРЦАКСШКЗСКСУОС МТХ-А1 1335
М8СТС8КОСУАРС1ЦСОТССРХАКС1ЦК8СКСУ0С МТХ-М1 1336
В табл. 13 и везде в описании Хт19 и Хт34, каждый независимо, обозначают нефункциональные остатки.
- 50 013470
Таблица 14
Последовательности пептида харибдотоксина (СЕагуЬбо1охт (СЕТх)) и пептидных аналогов СЕТх и пептидных аналогов СЕТх
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е() Π)ΝΟ:
дрТХУ8СТТ8КЕСУУ8УСдКЬННТ8К.ЖСМНККСКСУ8 СЕТх 36
дрТКУ8СТТ8КЕС\У8УСдКЬНМТ8КЖСМККЕСКСУ8 СЕТх-Е32 59
дртмузсттзкЕс^зусдкьнытзкжсмжрсксуз СЬТх-Р32 344
СТТ8КЕС\¥8УСдКЕНОТ8КЖСМЖКСКСУ8 СЕТх-сП-бб 345
дЕтау8С1ТЖЕС¥/8УсдкЕраужсксмжксвсуд СЕТх-1ЬТх 346
ррТНУЗСТТЗКЕС^ЗУСрКЬНШ’ЗКСКСМКОКСКСУЗ СЕТх-631 1369
дрТЫУ8СТТ8КЕСЬ8УСдКЕНШ'8КОКСМФЖКСКСУ8 СЕТх-Ы4 1370
дрТКУ8СТТ8КЕСА8УСдКЕНМТ8КСКСМ1ЧККСКСУ8 СЕТх-А14 1371
дрТКУ8СТТ8КЕС^АУСдКЕНКГ8КЖСМЖКСКСУ8 СЕТх-ΑΙ 5 1372
дрТМУ8СТТ8КЕС\УРУСдКЬННТ8КОКСМКККСКСУ8 СЕТХ-Р15 1373
дрТЫУ8СТТ8КЕСУ/8АСдКЕНКТ8К(ЗКСМ1ЖКСКСУ8 СЕТх-ΑΙ 6 1374
дР1Ж78СТТ8КЕСШРСд1ШШТ8КЖСМЖКСКСУ8 СЕТХ-Р16 1375
дрТМУ8СТТ8КЕС\У8УСдКЕННТ8АЖСМЖКСЕСУ8 СЕТх-А25 1376
дР1КУАСТТ8КЕС\У8УСдКЬНЕГГ8КЖСМЖКСКСУ8 СЕТх-Аб 1377
дР1^УКС1Г8КЕС\У8УСдКЬНМТ8КЖСМРЖКСКСУ8 СЕТх-Кб 1378
дР1КУ8СТТАКБСХ¥8УСдКЬНКГ8КОКСММККСКСУ8 СЕТх-ΑΙ 0 1379
дРТКУ8СТТРКЕС\У8УСдКЕНЫТ8КСКСМТЖКСКСУ8 СЕТх-РЮ 1380
дР1ЫУ8СТТ8КАС\¥8УСдКЕНЫТ8КОКСМ]ЖКСБ1СУ8 СЕТх-А12 1381
дртр^зсттзкдсу/зусдкЕРШТзкжсмжксксуз СЪТх-()12 1382
АР1ЪГУ8СТТ8КЕС\У8УСдКЕНЯТ8КСгКСМЫККСКСУ8 СЕТх-А1 1383
ТРТКУ8СТТ8КЕС\У8УСрКЕНЫТ8КЖСМРЖКСКСУ8 СЕТх-ΤΙ 1384
дАТЫУ8СТТ8КЕСУ78УСдКЕНШЖ6КСМЖКСЕСУ8 СЕТХ-А2 1385
д1таУ8СТТ8КЕСУ/8УСдКЬНЫТ8КЖСМКККЖСУ8 СЕТх-12 1386
дрА^8СТТ8КЕС\¥8УСдКЕНЫТ8КЖСМФЖКСКСУ8 СЕТх-АЗ 1387
дрШУ8СТТ8КЕС7У8УСдК1.НХТ8ЕОКСМЖХСКСУ8 СЕТх-13 1388
Т1ШУКСТ8РКдСЕРРСКАдРОТ8ВЖСМЖКЖСУ8Р СЕТх-МеТх 1389
Т11ЫУ8СТ8РКдСЕРРСКАдрОТ8ЕЖСМЖКСКСУ8Р СЕТх-МдТх-Ъ 1390
Таблица 15
Пептидные последовательности ингибиторов 8КСа
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8Е() Π) ΝΟ:
СМСКАРЕТАЕСАЖСрдНб Арапйп 68
АРСЯЬКМСРЬЗСКЗЕСЬЬОКСЮПКСЕСУКН 8суТх 51
АУСКЬККСдЬ8СК8ЬОЬЬОКСЮПКСЕСУКНС ВтР05 50
ТУСУТ.КХСАЕЕСКЗТ.СЛ.ЕСгКСТбУКСЕСУКП Р05 52
АГСЯЕККСЕЕЗСКЗЕОЬЕСКСЮЕЕСКСУРУ Татарт 53
У8СЕОСРЕНС8ТдКА0АКСВМ)КСУСЕР1 Р01 16
УУ1ОдКСУК8РПСУ8АСККЕУ6КАТёкСТКСКСОС ТзК 47
- 51 013470
Таблица 16
Последовательности ингибиторов пептида апамина и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8ЕО Π)ΝΟ:
СЫСКАРЕТАЬСАККСррНа Араппп (Ар) 68
СМСХАРЕТАЬСАККСррНО Ар-Х4 348
СХСААРЕТАЬСАККСРОНО Ар-А4 349
СИСКАРЕТАЕСАХКСррНС Ар-Х13 350
СХСКАРЕТАЬСААКСС^НО Ар-А13 351
СХСКАРЕТАЬСАКХСС^НО Ар-Х14 352
СХСКАРЕТАЬСАКАСОО>НЮ Ар-А14 353
Таблица 17 Ингибирующие последовательности сциллатоксина (8су11а1ох1п (8суТх)), ВтР05, Р05, тамапина (Ташарт), Р01 пептида и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8Е<2 Π)ΝΟ:
АГСКЬКМСрЬЗСКЗЬСЬШКСЮОКСЕСУКН ЗсуТх 51
АРСМЬВКСОЬЗСКЗШЕШКСЮОКСЕСУКН 8суТх-К7 354
АЕСЖЕМСрЬБСкЗЕСЬЕСЖСМСККСКСУКН 8суТх- 1ЬТх 355
АРЗМЬКМСрЬЗСКЗЬСЬЬОКЗЮВКСЕСУКН ЗсуТх- С/8 356
АРСМЬККСЕЬЗСКЗШЕШКаОЕЕСКСУРУ Татарш 53
Таблица 18
Пептидные последовательности ингибиторов ВКСа
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е<2 Π>ΝΟ:
СРТЛУПСЗУЗКЕС^ЗУСКЛЬРОУОКОКСМОКК СКСУО 1ЪТх 38
ТРШУОСТУЗКЕСУУАРСКААРОУОКОКСМОККС КСУУ δίοίοχϊη (81оТх) 39
ρΡΤϋνΚΟΤΟδΚρΟνΤΡνΟΚρΜΡΟΚΡΝΟΚΟΜΝθΚ /ТТТ ПХ ТГХ υκυ 1 о ВшТх1 40
У/С8ТСЕПЕАСОА8КЕС¥ПРСРКАРСКАН<ЗКСМХ ΝΚϋΚΚΥΤΝ ВиТх 41
РОЫОУКСРА88ЕСЖГАСККУТО8ОРОКСР№^П СКСУ МагХепТх 35
1Т1ЫУКСТ8РОрСЬКРСЫЖРОрНАОСКС1Х6КС КСУР С11Тх1 29
Таблица 19 Ингибирующие последовательности пептидов 1ЪТх, слотоксина (81о1охт),
ВтТх1 и ВиТХ (семейство слотоксина) и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8Ε(} Π)ΝΟ:
рРТОУОСЗУЗКЕСЗУЗУСКЛЬРОУОКОКСМОКК сксу<з 1ЬТх 38
рРТВУОС8У8ХЕСАУ8УСКЛЬРОУОКОКСМОКК сксуо 1ЬТх-Х11 357
ОРТОУОСЗУЗАЕСУ/ЗУСКПЕРСУВКОКСМСКК СКСУО 1ЬТх-А11 358
СРТВУОС8У8КЕСУ/8УСХОЬР6УОКОКСМОКК СКСУО 1ЬТх-Х18 359
рРТОУОСЗУЗКЕСУуЪУСАПЕРОУОКОКСМСтКК СКСУО 1ЪТх-А18 360
рРТОУОС8У8КЕС\У8УСКОЕРОУОХОКСМОКК 1ЪТх-Х25 361
ррТОУВСЗУЗКЕСШЗУСКВЬРСУОАОКСМОКК 1ЬТх-А25 362
- 52 013470
сксуо
РРТОЛЮС8У8КЕСАУ8УСКЛРРОУОКОХСМОКК ск.су(} 1ЬТх-Х27 363
9ГТОУЕЮ8У8КЕСУ^УСКОЕЕОУОКСАСМСЖК СКСУС) 1ЬТх-А27 364
рРТОУОС8У8КЕС\У8УСКОЬРОУВКОКСМСХК сксуо 1ЬТх-Х31 365
рЕТОУЕ>С8У8КЕСЗУ8УСКОЬГОУЕ)КОКСМОАК сксур 1ЬТх-А31 366
рРТОУОСЗУЗКЕСУУЗУСКВЕРОУОКСКСМОКХ СКСУр 1ЬТх-Х32 367
рРТОУОСЗУЗКЕСШУСКВЕЕОУПКОКСМОКА СКСУ(2 1ЬТх-А32 368
рРТОУОСЗУЗКЕС^УЗУСКВЕРОУВКОКСМОКК схсу<2 1ЬТх-Х34 369
рРТПУОСЗУЗКЕСЛУЗУСКОЬРОУОКаКСМОКК САСУО Й>Тх-А34 370
ρΡΤϋνΚΟΤΟδΚρϋλνΡνσΚϋΜΡΟΚΡΝΟΚΟΜΝΟΚ СКСУ8 ВтТх1 371
рРТОУХСТОЗКрСШ’УСКрМРОКРМОКСМРЮК СКСУ8 ВтТх1- Х6 372
ρΡΤϋνΑΟΤΟδΚρον/ΡνϋΚϋΜΡΟΚΡΝΟΚΟΜΝΟΚ СКСУ8 ВтТх1- А6 373
ϋΡΤϋνΚΟΤΟδΧϋΟλνΡνΟΚϋΜΡΟΚΡΝθΚΟΜΝΟΚ СКСУ8 ВтТх1- XII 374
рРТОУКСТ68АСС\УРУСКрМРОКРХаКСМТ\ЮК СКСУ8 ВтТх1- А11 375
рРТПУКСТОЗКОСУ/РУСХрМРОКРКОКСММЗК СКСУ8 ВтТх1- Х18 376
9РТОУКСТО8К9С\УРУСА9МРОКРНСКСММ}К СК.СУ8 ВтТх1- А18 377
ррТОУКСТОЗКрС^УРУСКрМРаХРЯОКСМЫОК СКСУ8 ВтТх1- Х23 378
ρΡΤϋνΚΟΤΟδΚρΟν^ΡνΟΚϋΜΡΟΑΡΝαΚΟΜΝΟΚ СКСУ8 ВшТх1- А23 379
ρρτϋνκοτο8Κ9σ\νρνοκ9ΜΡσκΡΝαχοΜΝοκ СКСУ8 ΒπϊΓχΙ- Х27 380
РРТОУКСТО8КРС97РУСКРМРОКРЖ;АСМНСК СКСУ8 ВтТх1- А27 381
^ΡΤ^VΚСΤσ8Κ^С^VΡVСΚ^ΜΡΟΚΡN^ΚСΜNΟX СКСУ8 ВшТх1- Х32 382
ΟΡΤϋνΚΟΤΟδΚρΟλνΡνϋΚρΜΡσΚΡΝΟΚΟΜΝΟΑ КСУ8 ВтТх1- А32 383
ρΡΤΟνΚΟΤΟδΚρΟν/ΡνΟΚϋΜΡΟΚΡΝΟΚΟΜΝσΚ СХУ8 ΒπϊΤχΙ- Х34 384
ррТОУКСТО8^СУ/РУСКрМР6КРНОКСМ1\ЮК САУ8 ВшТх1- А34 385
\УС8ТСЕОЬАСОА8КЕСУЕ>РСРКАРСКАНСКСММ ΝΚΟΚΟΥΤΝ ВиТх 386
^УС8ТСЬОЕАСОА8ХСУОРСРКАЕОКАНСКСММ ЖСКСУТЫ ВиТх-Х14 387
У7С8ТСЕОЕАСОА8АСУОРСРКАРСЖАНСКСМН ΝΚΟΚΟΥΤΝ ВиТх-А14 388
\¥С8ТСЕОЕАСОА8КЕСУОРСРХРОКАНОКСМКК ВиТх-Х22 389
- 53 013470
КСКСУТЫ .
ХУСЗТСЬРЬАССАЗКЕСУРРСРАСКАНОКСМУЫ ΚϋΚϋΥΤΝ ВиТх-А22 390
Х¥С8ТСЬРЬАССА8КЕСУРРСРКАГСХНОКСМГЖ ΚΟΚΟΥΤΝ ВиТх-Х26 391
\¥С8ТСЬРЬАСОА8КЕСУРРСРКАЕОАНОКСМКЯ КСКСУТЫ ВиТх-А26 392
\УС8ТСЬРЬАСОА8КЕСУРРСРКАРОКАНСХМКЯ КСКСУТИ ВиТх-ХЗО 393
ХУСЗТСЬРЬАССАЗКЕСУРРСРКАРОКАНОАМРЖ КСКСУТЫ ВиТх-АЗО 394
ХУС8ТСЬРЬАСОА8КЕСУРРСРКАРОКАНОКСМЯ ΝΧΚΟΥΤΝ ВиТх-Х35 395
ХУСЗТСЬРЬАСОАЗКЕСУРРСРКАРОКАНСКСМН ΝΑΚϋΥΤΝ ВиТх-А35 396
ХУСЗТСЬРЬАСОАЗКЕСУРРСРКАРбКАНСКСМХ ΝΚσΧΥΤΝ ВиТх-Х37 397
\¥С8ТСЕРЬАСОА8КЕСУРРСРКАР6КАНСКСМХ ΝΚΟΑΥΤΝ ВиТх-А37 398
Таблица 20
Ингибирующие последовательности пептида мартентоксина (Маг1еп1ох1и) и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е(? Π)ΝΟ:
ГОЬГОУКСЕА88ЕС\УТАСККУТС8СрОКС(ЖНС СКСУ МаНепТх 35
РОЬГОУХСРА88ЕСУПАСККУТС8СрСКС(Ж1р СКСУ МайепТх-Х7 399
ГСЕГОУАСРА88ЕСУ/ТАСКХУТС8СОСКСР?ЖС СКСУ Маг!епТх-А7 400
РСЬ1РУКСРА88ЕСХУТАСХКУТО8араКСр1Жр СКСУ МабепТх-Х19 401
РСШГОУКСРАЗЗЕСЖГАСАКУТСЗСОСКСрРЖЗ СКСУ Маг!епТх-А19 402
ΡС^^ГОVΚСΡΑ88ΕС^VΤΑСΚXVΤС^8Сг^С^ΚС^NN^ СКСУ Маг1епТх-Х20 403
РСЕГОУКСЕАЗЗЕСХУТАСКАУТСЗССОКСОРЖС СКСУ Маг1епТх-А20 404
ГОЬГОУКСРА88ЕС1¥ТАСККУТС8СрОХС<2ХХО ΟΚΟΥ МайепТх-Х28 405
РОЬГОУКСГА88ЕСХ¥ТАСККУТа8О()САСрХХр СКСУ Маг1епТх-А28 406
РОЕГОУКСРА8 8ЕО¥ТАСККУТ08С(2СКСр14К(2 СХСУ МайепТх-Х35 407
РСЫРУКСРА88ЕСУПГАСККУТО8СрСКС9ХЯр САСУ Маг1епТх-А35 408
Пептидные последовательности ингибиторов Са2+ каналов N типа
Последовательность/структура
СКОКОАКС8КЕМУРССТС8СК8СКС СК8РО88С8РТ8УХССК8СКРУТККСУ СК8КСАКС8КЕМУРССТС8С8ОТУОКС ΓΉΖΤ 0П17П <ζχνχ_αν\^оνζίνινх о х
Краткое обозначение
МУПА
ОУ1А СУ1А сп тт о ν ио
Р1и1
СУШ ___СУ1С __СУЮ ТУГА
8Е0
ΙΡΝΟ:
409
О АП □ *+/
1364
1365
1366
1367
Таблица 21
- 54 013470
Таблица 22 Ингибирующие последовательности ωΜΥΏΆ пептида и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8Е() ГОРЮ:
СКОК6АКС8КЪМТОССТО8СК8ОКС МУПА 65
СХОКОАКСЗКЬМУПССТОЗСКЗаКС ΜΥΠΑ-Χ2 410
САОКОАКСЗВЬМУОССТОЗСКЗОКС МУПА-А2 411
СКОХОАКС8КЕМУОССТ08СКЗОКС МУПА-Х4 412
СКОАСАКСЗКТМУЛССТОЗСКЗОКС МУПА-А4 413
СКОКСАХС8КЬМУТ)ССТ6г8СК.86КС МУПА-Х7 414
СКОКОААС8КЬМУПССТО8СК8ОКС МУПА-А7 415
СКОКОАКС8ХЬМУОССТО8СК.86КС МУПА- Х10 416
СКОКОАКСЗАЬМТОССТаЗСВЗОКС МУПА- А10 417
СКОКОАКС8КЬМУЛССТО8СХ86КС МУПА- Х21 418
СКОКОАКС8КЬМУПССТО8СА8ОКС МУПА- А21 419
СКОКОАКС8КЬМУПССТО8СВ86ХС МУПА- Х24 420
СКСгКСгАКС8КЬМУОССТСг8СК8СгАС МУПА- А24 421
Таблица 23
Ингибирующие последовательности оСУРА пептида и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е<) Π) ΝΟ:
СК8РО88С8РТ8УКССК8СКРУТККСУ СУ1А 64
СХ8РС88С8РТ8УРГССК8СКРУТККСУ ОУ1А-Х2 422
СА8РО88С8РТ8УМССК8СМРУТККСУ ОУ1А-А2 423
СК8РСг88С8РТ8УЫССХ8СНРУТКК.СУ ОУ1А-Х17 424
СК8РО88С8РТ8УМССА8СХРУТКК.СУ ОУ1А-А17 425
СК8РО88С8РТ8УКССК8СХРУТХК.СУ ОУ1А-Х24 426
СК8РО88С8РТ8УХССК8СХРУТАК.СУ ОУ1А-А24 427
СК8РО88С8РТ8УЯССК8СКРУТКХСУ ОУ1А-Х25 428
СК8РС88С8РТ8УХССК8СХРУТКАСУ ОУ1А-А25 429
Таблица 24
Ингибирующие последовательности Р!и1 пептида и пептидных аналогов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е(2 Π)ΝΟ:
АЕКЛС1АР<лАРСРОТПКРСС1МРКАУ7С88УАМКСЬ Ρΐιιΐ 66
АЕХЛС1АРСАРСРОТОКРССХРКАУ/С88УАККСЬ РШ1-ХЗ 430
ΑΕΑϋΟΙΑΡΟΑΡΟΡΟΤΟΚΡΟΟΝΡΚΑΨΟδδΥΑΝΚίΧ РШ1-АЗ 431
АЕКОС1АРОАРСРОТОХРСС1МРКА^С8 8 ΥΑΝΚΟΡ, РШ1-Х17 432
АЕКТ>С1АРОАРСРОТПАРССКРКАДУС88УАМКСЬ РШ1-А17 433
АЕКЛС1АРОАРСРОТОКРССЫРХАУ/С88УА1ЖСЬ РШ1-Х23 434
АЕКТ>С1АРОАРСРСТОКРССКРАААУС88УАЖСЬ РШ1-А23 435
ΑΕΚϋΟΙΑΡΟΑΡΟΡΟΤϋΚΡΟΟΝΡΚΑΥ/ΟδδΥΑΝΧίΧ РШ1-Х32 436
АЕКЛС1АРОАРСР6ТОКРСС№КА\УС88УАЯАСЬ РШ1-А32 437
- 55 013470
Таблица 25
Пептидные последовательности Ткпхоре1та ргипепз (РгоТх1) и аналогов пептида РгоТх1 и других ингибиторов Са2+ каналов Т типа
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е(2 Ш ΝΟ:
ΕСΚΥ^V^ΟΟС8ΑΟ^ΤССΚΗ^VС8ΚΚΗΟλVСVЗV^ ОТР8 РгоТх1 56
ЕСХУЖЯССЗАОрТССКШАСЗМШСУ^УЧУП ОТР8 РгоТх1-ХЗ 438
ЕСАУУЪОСС8АОрТССКНЕУС8ККНС\УСУТО СТР8 РгоТх1-АЗ 439
ЕСКУУТССС8АОрТССХНЕУС8КВНСУ/СУУЛЭ στΓ8 РгоТх1-Х17 440
ЕСКУ^УЕСЮСЗАбОТССАНЬУСЗККНОХУСУТО ОТР8 РгоТх1-А17 441
ЕСКУУТОСС8АСрТССКНЬУС8ХВНСУ/СУУТ> ОГР8 РгоТх1-Х23 442
ЕСКУЖ,С(Ю8А6рТССКНЕУС8АКНО\УСУТО СгТР8 РгоТх1-А23 443
ЕСКУУПЛЗОСЗАОРТССКНЬУСЗКХНСАУСУШ) ОТР8 РгоТх1-Х24 444
ЕСКУУТОСС8АОрТССКНЕУС8КАНОУ/СУЛ¥Е> СТР8 РгоТх1-А24 445
КГООУРУОУАУ ΝΟΚΚΙΟΨΥΝΝ КУСЖ>ЬСК<ЗЕ КАБ8(лУСУ/ОУ/ ТЬ8СУС0<ЗЬР ϋΝΑΚΙΚΚδσΚ СКА Κατΐοχΐη 1276
Таблица 26
Последовательности ВеКМ1, пептида, ингибирующего М ток, и аналогов пептида ВеКМ1
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е<2 Π)ΝΟ:
КРТОЖСЗЕЗУРСРРУСКЗКРСКТКСКСУИСРСОСР ВеКМ1 63
РТО1КС8Е8УрСРРУСК8КРОКТЫСКСУА(ЗРСОСР ΒεΚΜΙ-άΙ 446
ХРТЭ1КС8Е8УРСРРУСК8КРСКТЯОКСУМСРСОСР ВеКМ1-Х1 447
АРТО1КС8Е8УрСРРУСК8КР6КТМЭКСУКСРСОСР ВеКМ1-А1 448
КРТЫХС8Е8У9СРРУСК8КРОКТАОКСУА6РСВСР ВеКМ1-Х6 449
КРТО1АС8Е8УРСРРУСК8КРСКТХСКСУХОРСОСР ВеКМЕАб 450
КРТП1КС8Е8УрСРРУСХ8КРаКТЫОКСУЫСРСОСР ВеКМ1-Х18 451
ΚΡΤ^IΚС8Ε8Υ^СΡΡVСΑ8ΚΡСΚΤNΟΚСVN6ΡС^СΡ ВеКМ1-А18 452
КРТО1КС8Е8У9СГРУСК8ХРСКтаСЖСУК6РСОСР ВеКМ1-Х20 453
КРТО1КС8Е8У9СРРУСК8АРОКТМСКСУМ}РСОСР ВеКМ1-А20 454
КРТЫКСЗЕЗУОСРРУСКЗЕРСХТНСКСУХСРСОСР ВеКМ1-Х23 455
Ю>ТО1КС8Е8УрСРРУСК8КРОАтаОКСУКСРСПСР ВеКМ1-А23 456
КРТЫКС8Е8У0СРРУСК8КРСКТКСХСУА6РСОСР ВеКМ1-Х27 457
КРТО1КС8Е8У0СРРУСК8КРСКТ7ЮАСУРЮРСОСГ ВеКМ1-А27 458
Таблица 27
Пептидные последовательности ингибиторов ΝίΡ каналов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Ε<2 Π)ΝΟ:
РКССМОККОС88КХУСКЛН8КСС 8тП1а 459
КВССТООККСКОКрСКОрКССА μ-СгША 460
КОССТООККСКЛККСКОМКССА μ-СШВ 461
гкьссорокзскз^сконксс μ-ΡΙΠΑ 462
2КССКСККСС8 8КУ/СРЛЖ8КСС 1-ЧтПТА 463,
АСКККУТУСАТПар^ССРСПССРГУСУ μΟ-ΜΑΊΑ 464
АСЗККХУЕУСГУРПОРГУССРОЕГССРРУСУ рО-МгУГВ 465
ЕАСУАОСПРСОКОбЬССЗЕРСЕРОУСРО 5-РУ1А 466
ОСС88ОСТРС(лШООЕСС8ЕРСРЕ\УСГГРШ δ- 8УЕЕ 467
\νακρ)8ΟΕΜϋΝΡΡΙ)(}ΝΡ'ϋΟΡί¥ί’ΐνΡναΊ' б-ТхУ1А 468
УКРСККЕСрЕСОР1Рр1ЧССКаААС:У1,ЕСУ б-6тУ1А 469
- 56 013470
Таблица 28
Пептидные последовательности ингибиторов С1- каналов
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е0 Π>ΝΟ:
МСМРСРТТОНОМАККСООССОСКСКСКСУСР осьск СТХ 67
МСМРСРТТОНрМАХКСООССОбКОКОКСУОР осьск СТХ-Х14 470
МСМРСРТТОНОМААКСООССООКОКОКСУОР осьск. СТХ-А14 471
МСМРСРТТОНрМАКХСООССбОКбКОКСУОР осьск. СТХ-Х15 472
МСМРСРТГОНОМАКАСООССООКОКОКСУОР рсьск СТХ-А15 473
МСМРСРТТЭНрМАККСООССОСтХОКОКСУОР рсьск СТХ-Х23 474
МСМРСРТТОЕ^МАККСООССОСАбКОКСУОР ОСЬСК СТХ-А23 475
МСМРСРТТОПОМАККСВОССОСКОХОКСУОР ОСЬСК СТХ-Х25 476
МСМРСРТТОНОМАККСОПССООКОАОКСУСР ОСЬСК СТХ-А25 477
МСМРСРТТОНОМАККСООСССОКСЕСХСУСР СТХ-Х27 478
ОСЬСК. МСМРСРУГОН9МАККСООССССгКОКОАСУОР осьсж МСМРСРТТПНОМАККСЭПССООКОКОКСУОР осьсх МСМРСРТТОНОМАККСООССООКОКОКСУОР ОСЬСА МСМРСРТТОНОМАККСООССССКСКСКСУСР ОСЬС ОТООСОРСРТТОАКМАККСКЕССООЫаКСРОР ОСЬСЖЕ ОТВОШРСРТТВАКМАХКСКЕССООРЮКСРОР ОСЬСЖЕ ОТООСОРСРТТОАКМААКСКЕСССОКОКСРОР ОСЬСШЕ ОТООССРСРТТОАЫМАКХСКЕССООКОКСРОР ОСЬСЖЕ ОТОСССРСРТТОАКМАКАСКЕСССОХСКСРСР ОСЬСЖЕ ΟΤϋΟΟΟΡσΡΤΤϋΑΝΜΑΚΚΟΧΕΟΟΟΟΝΟΚΟΕΟΡ ОСЬСМКЕ СТХ-А27 СТХ-Х36 СТХ-А36 СТХ-636 Вт-12Ъ Вт-12Ь-Х17 Вт-12Ь-А17 Вт-12Ь-Х18 Вт-12Ъ-А18 Вт-12Ь-Х20 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488
ОТООСОРСЕТТОАКМАККСАЕССООНОКСРОР ОСЬСЫКЕ Вт-12Ъ-А20 489
ОТООССРСЕТТОАКМАККСКЕССООКОХСГОР ОСЬСЖЕ Вт-12Ь-Х28 490
ОТООСОРСРТТОАММАККСКЕССООКОАСРОР ОСЬСЖЕ Вт-12Ь-А28 491
ОТООССРСРТТОАКМАККСКЕСССОРЮКСРОР ОСЬСЫХЕ Вт-12Ъ-Х38 492
ОТООСОРСРТТОАКМАККСКЕССООХОКСРОР ОСЬСКАЕ Вт-12Ъ-А38 493
- 57 013470
Таблица 29
Пептидные последовательности ингибиторов Ку2.1
Последовательность/структура Краткое обозначен не 8Е(} ΙΒΝΟ:
ЕСКУЪР6ОСКТТ8ПССКНЕОСКРК1)КУСАТОРТР8 НаТх1 494
ЕСХУРР0С1СКТТ8ОССКНРОСКРХ0КУСАШ)РТРЗ НаТх1-ХЗ 495
ЕСАУЬРООСКТТЗОССКНЕОСКРКПКУСАТОРТРЗ НаТх1-АЗ 496
ЕСКУЬРСОСХТТЗВССКНЕОСКЕКВКУСАУ/ОРТРЗ НаТх1-Х10 497
ЕСКУЬРОССАТТЗОССКПЬССКРКОКУСАУУОРТРЗ НаТх1-А10 498
ЕСКУЬРСОСКТТЗПССХНЕОСКРКОКУСАТОРТРЗ НаТх1-Х17 499
ЕСКУЬРООСКТТЗОССАНЬОСКРКПКУСАУГОРТРЗ НаТх1-А17 500
ЕСКУЬРООСКТТЗПССКНЬОСХРКОКУСААЮРТРЗ НаТх1-Х22 501
ЕСКУЬРООСКТТЗОССКНШСАРКОКУСАТОРТРЗ НаТх1-А22 502
ЕСКУЬРОаСКТТ8ОССКНЕ6СКРХОКУСААЕ>РТР8 НаТх1-Х24 503
ЕСК.УЬРООСКТТ8ПССКНЕОСКРАОКУСАХ\Т>РТР8 НаТх1-А24 504
ЕСКУЕРСССКТТ8ОССКНЕОСКРМЭХУСАТОРТР8 НаТх1-Х26 505
ЕСКУЬРООСКТТ8ОССКНЬаСКРКГ>АУСАУТ)РТР8 НаТх1-А2б 506
Таблица 30
Пептидные последовательности ингибиторов Ку4.3 и Ку4.2
Последовательность/структура Краткое обозначение 8Е<2 ΙϋΝΟ:
УСрК\¥М\УТСОЕЕККССЕОЬУСКЬ\УСККПХМ РаТх2 57
ΥΟρΧΧνΜΨΤΟϋΕΕΚΚΟΟΕΟΕνΟΚΕλνΟΚίυΐΝΜ РаТх2~Х4 507
ΥС^Α^VΜλVΤС^ΕΕΚΚССΕ6^VСΚ^^VСΚΚIINΜ РаТх2-А4 508
УСрКАУМУУСОЕЕХКССЕОЕУСКЕАУСККНХМ РаТх2-Х13 509
УСРКАУМ^УТСОЕЕАКССЕОЕУСКЬХУСККИММ РаТх2-А13 510
УСРКАУМ^ТСОЕЕКХССЕОЕУСКЫУСККПММ РаТх2-Х14 511
УСРКУ/М^ТСОЕЕКАССЕОЕУСКЕАУСКЮШМ РаТх2-А14 512
УСРКУУМАУТСПЕЕККССЕОЬУСХЬУУСККПММ РаТх2-Х22 513
УСРКАУМЛУТСОЕЕККССЕОЕУСАЫУСККПЫМ РаТх2-А22 514
УСрКАУМАУТСОЕЕККССЕОЬУСЖЧУСХКПХМ РаТх2-Х26 515
ΥΟρΚν/Μν/ΤΟϋΕΕΚΚΟΟΕΟΕνΟΚΕλνΟΑΚΙΙΝΜ РаТх2-А26 516
УС9К\¥М\УТСОЕЕККССЕОЕУСКЕУ/СКХПХМ РаТх2-Х27 517
УСрК^УМУУТСОЕЕККССЕОЕУСКЕХУСКАПХМ РаТх2-А27 518
Таблица 31
Пептидные последовательности ингибиторов пАСНК канала
Последовательность/структура Краткое обозначение 8ΕΟ Π)ΝΟ:
ΟΟΟδΕΡΡΟΑΑΝΝΡϋΥΟ ΡηΙΑ 519
ОССЗЬРРСАЦЧХРОУС ΡηΙΑ-ЫО 520
СССЗЬРРСААЗКРОУС ΡηΙΑ-811 521
ОСС8ЬРРСАЬ8ХРОУС ΡηΙΒ 522
ССС8ЬРРСАА8ЫРОУС ΡηΙΒ-ΑΙΟ 523
ΟΟΟδΕΡΡΟΑΕΝΝΡϋΥΟ ΡηΙΒ-ΝΙΙ 524
ОСС8ХРУСНЬЕН8МЬС МП 525
ΟΚΟΟΗΡΑΟΟΚΝΥδΟ α-ΜΙ 526
ΚΟ(γηλροκοηργο)ΟΟΥΗΡΤΟΝΜ8ΝΡ9ΙΟ α-ΕΙ 527
ΟΟΟδΥΡΡΟΕΑΤΝΡϋΟ α-ΑιΠΒ 528
ΚϋΡΟΟδΝΡνΟΤνΗΝΡί^ΙΟ α-ΡΙΑ 529
ОСС8ОРКСААУКС α-ΐιιιΐ 530
АСС8ОККСК\УКС α-ΙτηΙΙ 531
ЕССЖАССЖНУЗС α-ΟΙ 532
ОССС8У(гидроксирго)ХААСН(гидроксирго)С8СК ВК(гидро-ксирго)8 Υ ССР αΑ-ΡΓΥΑ 533
СгССРУ (гидроксирго)ХААСН(гидроксирго)С(ЗСКУ СК(гидроксирго)( гидроксирго) Υ СОК(гидроксирго) 8СгС аА-ЕГУА 534
Н(гидроксирго)(гидроксирго)ССЬУ ОКСККУ (гидро ксирго) ОС88А8ССОК. ψ-ΡΠΙΕ 535
ΟΟΟδϋΡΚΟΝΜΝΝΡϋΥΟ ΕρΙ 536
ΟΟΟδΗΡΑΟΑθΝΝΟΗΙΟ О1С 537
1КО(у-карбокси§1и) ΟΟδΝΡΑΟΚνΝΝ (гидроксирго)НУС ОГО 538
ΟΟΟΟδΗΡΑΟΑΑΝΝρϋΥΟ ΑηΙΒ 539
ΟΟΟδΥΡΡΟΓΑΊΉδϋΥΟ ΑιϊΙΑ 540
ΟΟΟδΥΡΡΟΡΑΤΝδΟΥΟ Аи1С 541
- 58 013470
Таблица 32 Токсичные пептиды и пептидные аналоги Αде1еηор8^8 ареПа (агатоксина, Λда1о\ιп) и другие пептиды-ингибиторы Са2+ каналов
Последовательность/ структура
ΚΚΚΟΙΑΚΡΥΟ КСКХУООТРСС КОКОС1С81М С1ЪГСЕСКРКЬЕМЕОЬОЬА_________________
ΕΡΝΟΙΑΕΡΥΟ КСПУООТКСС КОКРСКС8М1 ОТХСЕСТРКЬ1МЕОЬ8РА_________________
8СГОЮОРСР ОЕКООСрССККЯОУС8СУ8Ь РОУЬК8ОСКС УУОТ8АЕР0О ΙΟΚΚΚΑΚζ)ΟΥ Ν8ΡΡΡΚΟΕ8Η ΝΚΡΚΚΚ_________________
8С1РЮОРСР ОЕКРРСОССК КЫОУС8СУ8Ь РОУЬК8ОСКС УУОТЗАЕРРО1СКККАКТСУ Ν8ΡΡΡΚΟΕ8Η ΝΚΡΚΚΚ_________________
8СЮРООРСР ОЕКРРС()ССК 8М1УС8СУ8Ь РОУЬКЗОСКС ЕУОТ8АЕРКК1СКККАК0СУ Ν8ΡΡΡΚΟΥ8ν ΥΚΡΚΚΚ_________________
8С1РРООРСР ОЕКРРС()ССК δΝΟΥΟδΟΥΝΣ РОУЬКЗОСКС ЕУОТ5АЕРКК ΙΟΚΚΚΑΚΟΟΥΝδΡΡΡΚΟνδν ΥΚΡΚΚΚ_______
8С1РРООРСР ОЕКРРСрССК 8ΝΟΥΟ8ΟΥΝΕ РОУЬКЗОСКС ЕУОТ8АЕРКК1СКККАК0СУ Ν8ΡΡΡΚΟΥ8Υ ΥΚΡΚΚΚ_________________
ЖТРРООРСР ОЕКРРС9ССХ ΚΝΟΥΟδΟΥΝΕ РОУЬККОСКХ ЕУО___________________
8СПСЮЕРСР ОРКРРСОССК ТИОУСЗХУХЬ РОУЬКЗО___________________________
ОС1Е1ООРСР ОУ0ЕК8УСрС ΟΚΝΝΟΡΟδ
АКАЬ РРОЗУСРОИЕ 8РСКСУОКУ/Н КСКСРХУКХУНР ТОЕОРСТСЕК ОМКНТСГГКЬ ΗΟΡΝΚΑΕν/ΟΕ РАУ_____________________
ЕСУРЕИОНСК РУ/УРЕССЕОР УС8СКС»РРКС ΙΟΚΝΝΝΧ___________________________
РСУОЕ80РСА РУ/АОРНССРО ΥΥΟΊΟΚΥΡΡΚ ΟΙΟΥΝΝΝ___________________________
АСУОБЫКОСА РХУАОРНССРО УУСТСКУРРК ΟΙΟΚΝΝΝ____________________________
АСУОЕХРОСА РУ/АОРНССРО УУСТСКУРРК ΟΙΟΚΝΝΝ____________________________
АРСУОРООКС АВУ7АОРУСС8 ОУУС8СК8МР УСКСК8Р8__________________________
ΕΟΑΤΚΝΚΚΟΑ Р\УАОР\¥ССРО ЬУС8СК8¥РО СМСКР88___________________________
ЕСУРЕХОНСК РУ/УРЕССЕОР УС8СКОРРКС ΙΟΚΝΝΝ____________________________
АЕЬТ8СРРУОНЕСРОРА8НСНССОРРУУСОСС ν/ΟΚν/ΝΟΚΟΚνΑΡΟδΥΑΥΟΙΟΚΡΚνΝϋΡΝΚΗΕ У/РАКУСККРСККЕС___________________
ΟΟΑΝΑΥΚδΟΝΟΡΗΤΟΟΧνΟΥΝΟΥΚΚΑΟΙΟδΟΧΝ У/К____________________________________
8ΟΙΝνθΡΡΟΡαΚΚΡΟΟ0ΟΡΚΡΝΑΡΟ8Ο8νΐΡΟΥ ΚΤΝΟΚΟΈ__________________________ δΟΙΝνΟΡΡΟΡΟΚΚΡΡΟρΟΟΚΡΝΑΡΟδΟδνίΡΟΥ КТМСКСЕУОТТАТ8УО1СМАКНКСОКрТТСТКР сь8кксккин______________________
АЕСЬМЮВТ8СУРКЬОККССУОАУ/СУСРС)0Е8С ККУОКККЕСОУ/УЕУНСКСОУ/8У/80К1РРУ/КА РУ8СКСРЕР0_______________________
СОСЬРНМКРСХАЬ8ОРКСС8ОЬКСКЕЕ8ЦУР8КС Ь РСУКЕ\УОКС8(7Г8РССРНЬАСК8КУУРК]Ч1СУ\У РО8У____________________________
ОСЬЕУРУРСО ΙΡΡΑΝΝΟΕΟΟ ЗОИСУРУСТР р
ΡΡΡΟΕΡΡΟΝΡ СОМЖ.1ОРРС СЗОХУСРРАСА
УССОУКЬСНР с
МКСЬРУЬПЬ ЬЬЬТА8 АРОУ УУЬРКТЕРРУ ΡΜ88ΥΥΟΝΟΚ 8ΙΕΚΟΙΕΚΝΟ УССОУКЬСНР С
КГООУРУРУАУ ΝΟΚΚΙΟλΥΥΝΝ КУСЖ>ЬСКОЬ
КАР8ОУС\УОУУ ТЬЗСУСрОЬР ΡΝΑΚΙΚΚ8ΟΚ СКА____________________________
СКОКОАРСККТМУРСС8С8СОККСКС
Краткое обозначение со-А§а-1УА оэ-А§а-1УВ со-А§а-ША со-А§а-ШАТ58 ш-А^а-ШВ со-А§а-ШВN29 (о-А§а-ШВΝ29/Κ35 го-А§а-ШС <а-А§а-ШР о-А^а-ПА го-А§а-1А (основная цепь) ц-А§а μ-А^а-б р-А§а-5 р-А§а-4 ц-А,§а-3 р-А§а-2 ц-А§а-1
Тх-1
ТхЗ-З
ТхЗ-4 ω-ΡΐΧΙΙΑ
Ρχν13.3
А§е1етп (агеленин) ω-ΟΤχ-8ΙΑ ω-οοηοΐοχϊη (конотоксин)
РпУГА__ ω-οοηοίοχίη РпУШ
ЬатЪбаοοηοίοχΐη
СМгУ1А__
ЬатЪбаοοηοΐοχίη (лямбдаконотоксин) СМгУ1В
Кийохт (куртоксин)
МУПС
8ЕО
ΙΡΝΟ:
959
960
961
962
963
964
965
966
967
968
969
970
971
972
973
1275
974
975
1277
1278
1279
1280
1281
1282
1283
1284
1285
1286
1368
1287
1276
- 59 013470
Согласно данному изобретению соединения, в которых по меньшей мере один из участков токсичного пептида (Р) в молекуле содержит Ку 1.3 антагонистический пептид. Предпочтительными являются аминокислотные последовательности токсичных пептидов, выбранные из δ1ιΙ<, НтК, МдТх, АдТх1, АдТх2, Не1еготе1га8 8р1иш£ег (Н8Тх1), ОδК1, ануроктоксина (АиигосЮхт (АиТх)), ноксиустоксина (ΝΤΧ), КТХ1, хонготоксина, СйТх, титистоксина (Т11у81:охт), ВдК, ВтКТХ, ВтТх, АеК, А8^ Тс30, Тс32, Р11, Р12 и/или Р13 и пептидных аналогов любого из них. Примеры подходящих пептидных последовательностей антагонистов Ку 1.3 включают антагонисты с любой пептидной последовательностью, представленной выше, в табл. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и/или 11 в данном описании.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный антагонист 1КСа1. Подходящие пептидные антагонисты 1КСа1 включают пептиды мауротоксин (Машкохш (МТх)), СНТ.х и пептидные аналоги любого из них, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 12, 13 и/или 14.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид, ингибирующий δКСа. Подходящие пептидные ингибиторы δКСа включают апамин (Аратщ), δсуТχ, ВтР05, Р01, Р05, тамапин (Татарш), Т8К и пептидные аналоги любого из них, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 15.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид апамин и пептидные аналоги апамина, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 16.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид семейства δсу11οΐοχ^η, и пептидные аналоги любого из них, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 17.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид, ингибирующий ВКСа, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 18.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид семейства δ1οΐοχ^η, и пептидные аналоги любого из них, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 19.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид МаПекохш, и его пептидные аналоги, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 20.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный ингибитор Са2+ каналов Ν-типа, имеющий любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 21.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид шМУПА, и его пептидные аналоги, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 22.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид шСУПА, и его пептидные аналоги, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 23.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид Р!и1, и его пептидные аналоги, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 24.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид РгоТх1, и его пептидные аналоги, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 25.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид ВеКМ1, и его пептидные аналоги, примерами которых являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 26.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный ингибитор №' каналов, примерами которого являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 27.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный ингибитор С1- каналов, примерами которого являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 28.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный ингибитор Ку2.1, примерами которого являются пептиды,
- 60 013470 имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 29.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный ингибитор ^4.2/^4.3, примерами которого являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 30.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептидный ингибитор пАСНК, примерами которого являются пептиды, имеющие любую аминокислотную последовательность, представленную в табл. 31.
Другие варианты состава по изобретению включают по меньшей мере один токсичный пептид (Р), который представляет собой пептид агатоксин, его пептидный аналог или другой пепидный ингибитор кальциевых каналов, примерами которого являются пептиды, имеющие любую аминокислотную» последовательность, представленную в табл. 32.
Фрагменты, продлевающие период полужизни. Данное изобретение включает присутствие по меньшей мере одного фрагмента, продлевающего период полужизни (Е1 и/или Е2 в формуле Ι), связанного с пептидом по Оконцу, С-концу или через боковую цепь одного из внутренних аминокислотных остатков. Можно также использовать несколько фрагментов, продлевающих период полужизни; например Ес на каждом конце или Ес на одном конце, а ПЭГ-группа на другом конце или в боковой цепи. В других вариантах изобретения Ес домен может быть пэгилированным (например, в соответствии с формулами Е1-Е2-(Ь)г-Р; Р-(Ь)6-Е1-Е2 или Р-(Ь)6-Е1-Е2-(Ь)г-Р).
Фрагмент, продлевающий период полужизни, можно выбрать таким образом, чтобы состав по изобретению достигал достаточного гидродинамического размера для того, чтобы предупредить почечный клиренс 1п νί\Ό. Например, фрагмент, продлевающий период полужизни, можно выбрать таким образом, чтобы это была полимерная макромолекула практически линейной, разветвленной или дендритной формы. Или же фрагмент, продлевающий период полужизни, можно выбрать таким образом, чтобы, ш νίνΌ, состав по изобретению связывался с сывороточным белком с образованием комплекса во избежание заметного почечного клиренса образовавшегося при этом комплекса. Фрагмент, продлевающий период полужизни, может представлять собой, например, липид; группу холестерина (стероид); углевод или олигосахарид или любой природный или синтетический белок, полипептид или пептид, который связывается с рецептором-мусорщиком.
Примеры фрагментов, продлевающих период полужизни, которые можно применять по данному изобретению, включают Ес домен иммуноглобулинов или его участок, или биологически пригодный полимер или сополимер, например полиалкиленгликоль, такой как полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. Другие подходящие полиалкиленгликоли включают, но без ограничения, заряженные или нейтральные полимеры следующих типов: декстран, полилизин, коломиновые кислоты или другие углеводные полимеры, полимеры аминокислот и производные биотина.
Другие примеры фрагментов, продлевающих период полужизни, по данному изобретению, включают сополимер этиленгликоля, сополимер пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этиленгликоля/малеинового ангидрида, гомополимер пропиленгликоля, полимер пропиленоксида, полимер этиленоксида, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, линейную или разветвленную гликозилированную цепь, полиацеталь, длинноцепную жирную кислоту, длинноцепную гидрофобную алифатическую группу, домен Ес иммуноглобулина или его участок (см., например, Ее1де е1 а1., МобШеб рерббез аз Шегареибс адеп!з, патент США № 6660843), СН2 область домена Ес, альбумин (например, человеческий сывороточный альбумин (Н8А)); см., например, Козеп е1 а1., А1Ьитт Гизюп рго!етз, патент США № 6926898 и патент США 2005/0054051; Впбоп е1 а1., Рго1ес1юп оГ епбодепоиз Легареибс рерббез Ггот рерббазе ас1^ν^1у 1ЕгоидЕ сопщдабоп 1о Ь1ооб сотропеШз, патент США 6887470), транстиретин (ТТК; см., например, ^а1кег е1 а1., Изе оГ 1гапз!Еугебп рерббе/рго1ет Гизюпз 1о тсгеазе 1Ее зегит Еа1Г-11Ге оГ рЕагтасо1одюа11у асбте рер1|без/рго1е1пз, патентные заявки США 2003/0195154 А1; 2003/0191056 А1), или тироксинсвязывающий глобулин (ТВС). Так, типичные варианты составов по изобретению включают слитые конструкции НА8, такие, но без ограничения, как слияния Н8А с 8ЕК, 08К1, или модифицированными аналогами этих токсичных пептидов. Примеры включают Н8А-Ь10-8ЕК(2-35); Н8А-Ь10-0зК1(1-38); Н8АЬ10-8ЕК(2-35) и Н8А-Ь10-0зК1(1-38).
Другие варианты фрагментов, продлевающих период полужизни, по данному изобретению, включают пептидные лиганды или низкомолекулярные органические лиганды, обладающие аффинностью связывания с сывороточным белком с продолжительным периодом полужизни в условиях физиологических температур, значений рН и ионной силы. Примеры включают альбуминсвязывающий пептид или низкомолекулярный лиганд, транстиретинсвязывающий пептид или низкомолекулярный лиганд, тироксинсвязывающий глобулинсвязывающий пептид или низкомолекулярный лиганд, антителосвязывающий пептид или низкомолекулярный лиганд, или другой пептид или низкомолекулярное соединение с аффинностью к сывороточному белку с продолжительным периодом полужизни (см., например, В1апеу е1 а1., Ме1Еоб апб сотрозШопз Гог тсгеазтд 1Ее зегит Еа1Г-11Ге оГ рЕагтасо1одюа11у ас1ке адеп1з Ьу Ьтбтд 1о Ц'апзбц'гебп-зеЬаб'е Ндапбз, патент США № 5714142; 8а1о е1 а1., 8егит а1Ьитт Ьтбтд то1ебез, патентная заявка США 2003/0069395 А1; 1опез е1 а1., РЕагтасеибса1 асбте соп)ида1ез, патент США № 6342225).
- 61 013470
Сывороточный белок с продолжительным периодом полужизни представляет собой один из сотен различных белков, растворенных в плазме крови млекопитающих, включая так называемые белкиносители (такие как альбумин, трансферрин и гаптоглобин), фибриноген и другие факторы свертывания крови, компоненты комплемента, иммуноглобулины, ингибиторы ферментов, предшественники веществ, таких как ангиотензин и брадикинин, и многих других типов белков. Изобретение охватывает применение любого единичного вида фармацевтически приемлемого фрагмента, продлевающего период полужизни, такого, но без ограничения, как представленные в данном описании, или применение двух или более различных фрагментов, продлевающих период полужизни, таких как ПЭГ и Ес домен иммуноглобулина или СН2 домен Ес, альбумин (например, НА8), альбуминсвязывающий белок, транстиретин или ГВС.
В некоторых вариантах изобретения Ес домен или его участок, такой как СН2 домен Ес, используется в качестве фрагмента, продлевающего период полужизни. Ес домен может быть слит по Ν-концу (например, в соответствии с формулой Е1-(Ь)Г-Р) или по С-концу (например, в соответствии с формулой Р-(Ъ)6-Е1) токсичных пептидов, или как по Ν-, так и по С-концу (например, в соответствии с формулами Е1-(Ь)Г-Р-(Ь)6-Е2 или Р-(Ь)6-Е1-(Ь)Г-Р). Последовательность пептидного линкера, необязательно, может быть включена между доменом Ес и токсичным пептидом по данному описанию. Примеры составов формулы Е1-(Ь)Г-Р включают Ес-Ь10-8кК(К22А)[2-35]; Ес-Ь10-8кК(В1К/К22А)[1-35]; Ес-Ь108кК(В1Н/К22А)[1-35]; Ес-Ь10-8кК(В1О/К22А)[1-35]; Ес-Ь10-8кК(В^/К22А)[1-35]; Ес-Ь10-РР8кК(К22А)[1-35] и любые другие демонстрационные примеры по данному описанию. Примеры составов формулы Р-(Ь)6-Е1 включают 8кК(1-35)-Ь10-Ес; О§К1(1-38)-Ь10-Ес; Ме1-8кК(1-35)-Ь10-Ес; 8кК(2-35)Ь10-Ес; С1у-8кК(1-35)-Ь10-Ес; Озк1(1-38)-Б10-Ес и любые другие демонстрационные примеры по данному описанию.
Ес варианты представляют собой подходящие фрагменты, продлевающие период полужизни, в объеме данного изобретения. Нативный Ес можно очень сильно модифицировать с образованием Ес варианта в соответствии с данным изобретением, при условии, что связывание с рецептором-мусорщиком сохранится; см., например, международные заявки УО 97/34631, УО 96/32478 и УО 04/110472. В таких Ес вариантах можно удалить один или более сайтов нативного Ес, которые обеспечивают структурные признаки или функциональную активность, не нужную для слитых молекул по данному изобретению. Эти сайты можно удалять, например, заменяя или удаляя остатки, вводя остатки в сайты или отсекая (процессинг) участки, содержащие сайт. Включенные или замененные остатки могут также представлять собой измененные аминокислоты, такие как пептидомиметики или Ό-аминокислоты. Ес варианты могут быть желательны по множеству причин, некоторые из них описаны ниже. Типичные Ес варианты включают молекулы и последовательности, в которых
1) сайты, участвующие в образовании дисульфидных связей, удаляют. Такое удаление позволяет избежать реакции с другими цистеинсодержащими белками, присутствующими в клетке-хозяине, применяемой для продуцирования соединений по изобретению. Для этой цели цистеинсодержащий сегмент на Ν-конце может быть усечен, или цистеиновые остатки могут быть удалены в виде делеций или заменены другими аминокислотами (например, остатками аланина, серина). В частности, можно отсечь Νконцевой сегмент из 20 аминокислот 8ЕО ΙΌ NО: 2 или удалить или заменить цистеиновые остатки в положениях 7 и 10 8ЕО ΙΌ NО: 2. Даже после удаления цистеиновых остатков одноцепочечные домены Ес все еще могут образовывать димерный Ес домен, удерживаясь вместе за счет нековалентных взаимодействий;
2) нативный Ес модифицируют таким образом, чтобы сделать его более совместимым с выбранной клеткой-хозяином. Например, можно удалить РА последовательность близ Ν-конца типичного нативного Ес, который может распознаваться гидролизующим ферментом в Е. сой, таким как пролиновая иминопептидаза. Можно также добавлять Ν-концевой остаток метионина, особенно, когда молекулу (состав) получают экспрессией при использовании методов рекомбинантной ДНК в бактериальных клетках, таких как Е. сой. Ес домен 8ЕО ΙΌ NО: 2 (фиг. 4А-В) является одним таким Ес вариантом;
3) участок Ν-конца нативного Ес удаляют, чтобы предотвратить Ν-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине. Для этой цели можно удалить любой из 20 аминокислотных остатков на Ν-конце, в частности аминокислотные остатки в положениях 1, 2, 3, 4 и 5;
4) удаляют один или более сайтов гликозилирования. Остатки, которые обычно гликозилируются (например, аспарагин), могут сообщить цитолитическую реакцию. Такие остатки можно удалить или заменить на негликозилирующиеся остатки (например, аланин);
5) сайты, участвующие во взаимодействии с комплементом, такой как сайт связывания С1с.|. удаляют. Например, можно удалить или заменить последовательность ЕКК человеческого ЦСЕ Обновление (пополнение) комплемента может быть неблагоприятным для соединений по данному изобретению и поэтому его можно избежать с таким Ес вариантом;
6) удаляют сайты, которые влияют на связывание с Ес рецепторами, отличными от рецепторамусорщика. В нативном Ес могут быть сайты для взаимодействия с некоторыми лейкоцитами, которые не требуются для слитых молекул (соединений) по настоящему изобретению и поэтому могут быть удалены;
- 62 013470
7) удаляют сайт АЭСС. Сайты АЭСС известны в уровне техники; относительно сайтов АЭСС в 1дС1 см., например, Мо1ес. 1ттиио1. 29 (5): 633-9 (1992). Эти сайты также не требуются для слитых молекул (соединений) по настоящему изобретению и поэтому могут быть удалены;
8) если нативный Ес домен получен из антитела нечеловеческого происхождения, нативный Ес можно гуманизировать. Обычно для гуманизации нативного Ес заменяют выбранные остатки в нативном Ес нечеловеческого происхождения на остатки, которые обычно находятся в человеческом нативном Ес. Методы гуманизации антител хорошо известны в уровне техники.
Предпочтительные Ес варианты выключают следующее. В δερ ГО NО: 2 лейцин в положении 15 можно заместить на глутамат; глутамат в положении 99 можно заместить на аланин и лизиновые остатки в положениях 101 и 103 можно заместить на остатки аланина. Кроме того, остатки фенилаланина могут заместить один или более остатков тирозина.
Альтернативным фрагментом, продлевающим период полужизни, является белок, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела или низкомолекулярное соединение (например, пептидомиметик), способный(ое) связываться с рецептором-мусорщиком. Например, в качестве фрагмента (частицы), продлевающего период полужизни, можно использовать полипептид, описанный в патенте США № 5739277, выданный 14 апреля 1998 г. Рге81а е! а1. Пептиды можно также выбирать методом фагового дисплея по связыванию с ЕсКи рецептором-мусорщиком. Такие соединения, связывающие рецептормусорщик, также охватываются понятием фрагмент(частица), продлевающий(ая) период полужизни и входят в объем данного изобретения. Такие частицы, продлевающие период полужизни, следует выбирать, обращая внимание на повышенный период полужизни (например, избегая последовательности, узнаваемые протеазами) и пониженную иммуногенность (например, предпочитая неиммуногенные последовательности, раскрываемые при гуманизации антител).
Как отмечается выше, полимерные частицы, продлевающие период полужизни, можно использовать также для Е1 и Е2. В настоящее время имеются различные методы связывания химических частиц, пригодных в качестве фрагментов, продлевающих период полужизни, см., например опубликованную международную заявку РСТ (Договор о патентной кооперации) XVО 96/11953, озаглавленную ΝТегттайу С1ет1са11у МодШед Рго1ет Сотро8Йюи8 аид Ме1йод8, вводимую в данное описание ссылкой во всей полноте. В этой опубликованной заявке РСТ, наряду с прочим, раскрывается селективное связывание водорастворимых полимеров с Ν-концом белков.
В некоторых вариантах составов по изобретению продлевающая период полужизни полимерная частица представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ, РЕС), в качестве Е1 и/или Е2, но следует понимать, что состав по изобретению, помимо Е1 и/или Е2, может также включать один или более ПЭГ, конъюгированных по другим сайтам в молекуле, таким как один или более сайтов на токсичном пептиде. Соответственно, некоторые варианты состава по изобретению могут дополнительно включать один или более ПЭГ-фрагментов, конъюгированных с не-ПЭГ-фрагментом, продлевающим период полужизни, который представляет собой Е1 и/или Е2, или с токсичным(и) пептидом(пептидами) (Р), или с какой-либо комбинацией любого из них. Например, Ес домен или его участок (такой как Е1 и/или Е2) в составе по изобретению с помощью восстановительного алкилирования можно сделать монопэгилированным, дипэгилированным или иным мульти(поли)пэгилированным.
Ковалентная конъюгация белков и пептидов с полиэтиленгликолем (ПЭГ) широко известна как способ, значительно продлевающий ш у1уо период полужизни белков в циркулирующей крови. Пэгилирование позволяет достичь этого эффекта преимущественно за счет замедления почечного клиренса, так как частица ПЭГ значительно увеличивает гидродинамический радиус белка (2а11р8ку, δ., е! а1., И8е оГ (иисйоиа^ед ро1у(е!йу1еие д1усо1)8 Гог тодШсайои оГ ро1урерйде8., в Ро1у(е!йу1еие д1усо1) сйет18йу: Вю1ес1ннса1 аид Ыотеб1са1 аррйсайощ., ГМ. Нат8, Ед., Р1еиит Рге88: Νο\ν Уогк., 347-370 (1992)). Дополнительные преимущества, часто наблюдаемые в результате пэгилирования белков и пептидов, включают повышенную растворимость, устойчивость к протеолитическому расщеплению и пониженная иммуногенность терапевтического полипептида. Преимущества пэгилирования белков подтверждаются массовой проверкой некоторых пэгилированных белков, включая ПЭГ-аденозина деаминазу (Адаген (Ададеи™)/Е^ои Согр.), ПЭГ-Ь-аспарагиназу (Онкаспар™/Е^ои Согр.), ПЭГ-Интерферон а-2Ь (ПэгроНтм^сйегтд/Е^ои), ПЭГ-Интерферон а-2а (Пегасис (РЕСΑδΥδ™)/Вοсйе) и ПЭГ-С-СδЕ (Неуласта (Nеи1а8ΐа™)/Αтдеη), а также многих других в клинических испытаниях.
Коротко говоря, ПЭГ-группы обычно связываются с пептидным участком состава по изобретению с помощью ацилирования или восстановительного алкилирования за счет реакции реакционноспособной (реактивной) группы на частице ПЭГ (например, альдегидной, амино, тиольной или сложноэфирной группы) с реакционноспособной группой на соединении по изобретению (например, альдегидной, амино или сложноэфирной группой).
Подходящая стратегия пэгилирования синтетических пептидов включает объединение за счет образования конъюгированной связи в растворе пептида и частицы ПЭГ, причем каждый из партнеров несет определенную функциональность, реактивную в отношении другой. Пептиды можно легко получить традиционным твердофазным синтезом (см., например, фиг. 5 и 6 и сопровождающий их текст). Пептиды
- 63 013470 преактивируют с помощью подходящей функциональной группы в конкретном сайте. Предшественники очищают и полностью характеризуют перед реакцией с частицей ПЭГ. Лигирование пептида с ПЭГ обычно происходит в водной фазе и за ним можно легко следить с помощью обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ. Пэгилированные пептиды легко очищаются методом препаративной ВЭЖХ и характеризуются методами аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной массспектрометрии.
ПЭГ представляет собой хорошо известный водорастворимый полимер, выпускаемый промышленностью, или его можно получать полимеризацией этиленгликоля с раскрытием цикла методами, общеизвестными в уровне техники (8апб1ег апб Каго, Ро1утег 8уп!Рез1з, Асабетю Ргезз, Χο\ν Уогк, Уо1. 3, радез 138-161). В настоящей заявке термин ПЭГ используется в широком смысле, охватывая любую молекулу (соединение) полиэтиленгликоля в моно-, би- или полифункциональной форме, вне зависимости от размера или модификации на конце ПЭГ, и может быть представлен формулой
X- О(СН2СН2О)П.1СН2СН2ОН, (X) где п обозначает от 20 до 2300, а X обозначает Н или концевую модификацию, например С1-4 алкил.
В некоторых применимых вариантах изобретения ПЭГ, применяемый в изобретении, заканчивается на одном конце гидрокси- или метоксигруппой, т.е. X обозначает Н или СН3 (метокси ПЭГ). Следует отметить, что другой конец ПЭГ, показанный в формуле (II), оканчивающийся ОН, ковалентно связывается с активирующим фрагментом через атом кислорода простой эфирной группы, с помощью аминоили амидной группы. При использовании в химической структуре термин ПЭГ включает соединение вышеприведенной формулы (II), но без атома водорода изображенной гидроксильной группы, в результате атом кислорода может реагировать со свободным атомом углерода линкера с образованием простой эфирной связи. Более конкретно, чтобы произошла конъюгация ПЭГ с пептидом, пептид должен реагировать с ПЭГ в активированной (активной) форме. Активированный ПЭГ можно изобразить формулой (ПЭГ, РЕО)- (А) (XI) где ПЭГ (по определению выше) ковалентно связан с углеродным атомом активированного (активного) фрагмента (А) с образованием простой эфирной связи, аминной связи или амидной связи, а (А) содержит реакционноспособную группу, которая может реагировать с амино, имино или тиольной группой в аминокислотном остатке пептида или линкерной частицы, ковалентно связанной с пептидом.
Методы получения активированного ПЭГ и его конъюгации с биологически активными пептидами общеизвестны в уровне техники (см., например, патенты США №№ 5643575, 5919455, 5932462 и 5990237; ТРотрзоп е! а1., РЕОу1аРоп о£ ро1урер!1без, европейский патент ЕР 0575545 В1; Ре£й, 81!е зрес1£1с рго!еш тоб1йсаРоп, патенты США №№ 6451986 и 6548644; 8. Негтап е! а1., Ро1у(е!Ру1епе д1усо1) \\нЬ геасруе епбдгоирз: I. Моб1йсаРоп о£ рго!етз, 1. ВюасРуе СотраРЫе Ро1утегз, 10: 145-187 (1995); Υ. 1,и е! а1., Реду1а!еб рерРбез III: 8о11б-рРазе зуп!Рез1з \\'ПЬ РЕОу1аРпд геадеп!з о£ уагутд то1еси1аг \е1д£1: зуп!Рез1з о£ ти1Рр1у РЕОу1а!еб рерРбез, КеасРуе Ро1утегз, 22: 221-229 (1994); А.М. Рейх е! а1., РЕОу1а!еб Рер!1без IV: ЕпРапсеб Ыо1од1са1 ас!1У1!у о£ З1!е-б1гес!еб РЕОу1а!еб ОКЕ апа1одз, Щ1. 1. Рер!1бе Рго!ет Кез., 46: 253-264 (1995); А.М. Рейх, 81!е-зрес£1с ро1у(е!Ру1епе д1усо1)у1аРоп о£ рерРбез, АС8 8утрозшт 8епез 680 (ро1у(е!Ру1епе д1усо1)): 218-238 (1997); Υ. ^еба е! а1., Ро1уе!Ру1епе д1усо1 бепуаруез, !РеР тоб£!еб рерРбез, те!Робз £ог ргобистд !Рет апб изе о£ !Ре тоб£1еб рерРбез, европейский патент ЕР 0473084 В1; О.Е. Меапз е! а1., 8е1ес!еб !есРтциез £ог !Ре тобШсаРоп о£ рго!ет з1бе сРатз, т: СЬепнса! тоб1йсаРоп о£ рго!етз, Но1беп Эау, Ыс., 219 (1971)).
Активированные ПЭГ, такие как ПЭГ-альдегиды или гидраты ПЭГ-альдегидов, можно синтезировать известными методами или получать из промышленных источников, например 8Реаг\а!ег Ро1утегз, (Нип!зу111е, А1) или Еп7оп, Ыс. (Р1зса!а\ау, N.1.).
Примером активированного ПЭГ, применимого для целей настоящего изобретения, является соединение ПЭГ-альдегид (например, метокси ПЭГ-альдегид), такой как ПЭГ-пропиональдегид, серийно выпускаемый 8Реаг\а!ег Ро1утегз (Нип!зуб1е, А1). ПЭГ-пропиональдегид можно изобразить формулой ПЭГ-СН2СН2СНО (см., например, патент США № 5252714). Другими примерами применимого активированного ПЭГ являются гидрат ПЭГ ацетальдегида и гидрат ПЭГ бис-альдегида, который далее дает бифункционально активное соединение (см., Веп!1еу е! а1., Ро1у(е!Ру1епе д1усо1) а1беРубе Рубга!ез апб ге1а!еб ро1утегз апб аррРсаРопз т тобйутд аттез, патент США № 5990237).
Другим активированным ПЭГ, применимым для получения ПЭГ-конъюгированных пептидов по настоящему изобретению, является ПЭГ-малеинимид, такой как, но без ограничения, метокси ПЭГмалеинимид, например малеинимидо монометокси ПЭГ, особенно применим для получения ПЭГконъюгированных пептидов по настоящему изобретению (например, 8Реп, \'-та!е1т1бу1 ро1утег бепуаруез, патент США № 6602498; С. Эе1дабо е! а1., ТРе изез апб ргорегРез о£ РЕО-Рпкеб рго!ешз., Сп!. Кеу. ТРегар. Эгид Сагпег 8уз!етз, 9: 249-304 (1992); 8. 2аРрзку е! а1., Изе о£ £ипсРопаЙ7еб ро1у(е!Ру1епе д1усо1)з £ог тоб1йсаРоп о£ ро1урер!1без, в Ро1у(е!Ру1епе д1усо1) сРет1з!гу: Вю!есРтса1 апб Ыотеб1са1 аррйсаРопз (ГМ. Натз, ЕбРог, Р1епит Ргезз: Νβ\ Уогк, 347-370 (1992); 8. Негтап е! а1., Ро1у(е!Ру1епе д1усо1) \1!Р геасруе епбдгоирз: I. МобгйсаРоп о£ рго!етз, 1. ВюасРуе СотраРЫе Ро1утегз, 10: 145-187 (1995); Р.1. 8Раб1е е! а1., СопщдаРоп о£ ро1утег !о со1опу зРти1аРпд £ас!ог-1, патент США № 4847325; О. 8Ра\ е! а1.,
- 64 013470
Субете аббеб уапап1к Ι6-3 апб сНет1са1 тоббгсабопк (НегеоГ. патент США № 5166322 и европейский патент ЕР 0469074 В1; 6. 8На\у е( а1.. Су бете аббеб уапапб оГ ЕР0 апб с11еписа1 тобШсабопк (Негео Г. европейская патентная заявка ЕР 0668353 А1; 6. 8На\у е( а1.. Сук1еше аббеб уапапб 6-С8Р апб с11еписа1 тобШсабопк (НегеоГ. европейская патентная заявка ЕР 0668354 А1; КУ. Кабе е( а1.. 1п(ег1еик1п-2 тЫешк апб ро1утег сопщдабоп (НегеоГ. патент США № 5206344; К.Л. бообкоп апб КУ. Кабе. 8|(е-б1гес(еб реду1абоп оГ гесотЬтап! т1ег1еикт-2 а( ί(8 д1усоку1абоп кбе. Вю1есНпо1оду. 8: 343-346 (1990)).
Другим примером активированного ПЭГ. применимого для получения ПЭГ-конъюгированных пептидов по настоящему изобретению конъюгацией по тиольным группам аминокислотных остатков. например по С-концам. является полиэтиленгликольвинилсульфон (например. М. Могригдо е( а1.. Ргерагабоп апб сНагас(епха(юп оГ ро1у(е(Ну1епе д1усо1) У1пу1 ки1Гопе. В1осоп). СНет.. 7: 363-368 (1996); см. также Натк. Рипсбопаб/абоп оГ ро1уе(Ну1епе д1усо1 Гог Гогтабоп оГ асбуе ки1Гопе-(еппта(еб РЕ6 бепуабуек Гог Ьтбшд (о рго!етк апб Ь1о1од1са11у сотрабЫе тайпаК патенты США № 5446090; 5739208; 5900461; 6610281 и 6894025; и Натк. \Уа(ег ко1иЬ1е асбуе ки1Гопек оГ ро1у(е(Ну1епе д1усо1). международная патентная заявка \¥0 95/13312 А1).
Другим примером активного ПЭГ. применимого по настоящему изобретению. является сложный эфир ПЭГ-Кгидроксисукцинимида. например метокси-ПЭГ-Кгидроксисукцинимидиловый (N48) эфир.
Также применимы гетеробифункционально активированные формы ПЭГ (см.. например. ТНотркоп е( а1.. РЕ6у1абоп геадеШк апб Ь1о1од1са11у асбуе сотроипбк Гогтеб (Неге\у|(к патент США № 6552170).
Обычно реакцию токсичного пептида или слитого белка. содержащего токсичный пептид. проводят известными химическими способами с активным ПЭГ-соединением. таким. но без ограничения. как тиолактивированный ПЭГ. диолактивированный ПЭГ. ПЭГ-гидразид. ПЭГ-оксиамин или ПЭГ-бромацетил (см.. например. 8. Негтап. Ро1у(е(Ну1епе д1усо1) \уНН Веасбуе Епбдгоирк: I. МобШсабоп оГ Рго1етк. Г Вюасбуе апб СотрабЫе Ро1утегк. 10: 145-187 (1995); 8. Ζа1^ркку. СНеттгу оГ Ро1уе(Ну1епе 61усо1 Соп)ида(ек \уИН Вю1од1са11у Асбуе Мо1еси1ек. Абуапсеб Эгид ОеЫ'егу К^еук. 16: 157-182 (1995); В. 6геепуа1б е( а1.. Ро1у(е(Ну1епе д1усо1) сопщда(еб бгидк апб ргобгидк: а сотргеНепбуе 1^еу. Спбса1 Ксу1с\ук ш ТНегареибс Эгид Сатег 8ук1етк. 17: 101-161 (2000)).
Методы Кконцевого пэгилирования проиллюстрированы в данном описании в примерах 31-34. 45 и 47-48. но они ни в коей мере не ограничивают методы пэгилирования. которые может применять специалист в данной области техники.
Можно применять ПЭГ с любой желаемой на практике молекулярной массой. например от около 1000 или 2000 Дальтон (Да) до около 100000 Да (п обозначает 20-2300). Предпочтительно объединенная или общая молекулярная масса ПЭГ. используемая в ПЭГ-конъюгированном пептиде по настоящему изобретению. составляет примерно от 3000 или от 5000 Да примерно до 50000 или 60000 Да (суммарная величина п равна 70-1400). более предпочтительно около 10000-40000 Да (суммарная величина п равна около 230-910). Наиболее предпочтительная объединенная масса ПЭГ составляет около 20000-30000 Да (суммарная величина п равна около 450-680). Число звеньев п в ПЭГ соответствует молекулярной массе. выраженной в Да. Предпочтительно. чтобы объединенная (общая) молекулярная масса ПЭГ на активированном линкере была пригодна для фармацевтического применения. Поэтому общая молекулярная масса ПЭГ не должна превышать примерно 100000 Да.
Полисахаридные полимеры представляют собой другой тип водорастворимого полимера. который можно использовать для модификации белка. Декстраны представляют полисахаридные полимеры. которые можно использовать для модификации белков. Декстраны представляют полисахаридные полимеры. состоящие из отдельных субъединиц глюкозы. связанных преимущественно α1-6 связями. Сам декстран выпускают различной молекулярной массы. легко доступен декстран с молекулярной массой примерно от 1 до 70 кДа. Декстран является подходящим водорастворимым полимером для применения в настоящем изобретении в качестве частицы. продлевающей период полужизни. самостоятельно или в комбинации с другой частицей (фрагментом). продлевающей период полужизни (например. Рс). См.. например. международные заявки XV0 96/11953 и ХУ0 96/05309. Сообщалось о применении декстрана. конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами; см.. например. публикацию европейского патента № 0315456. вводимого в данное описание ссылкой во всей полноте. Декстран с молекулярной массой около 1-20 кДа является предпочтительным. когда декстран применяют в качестве частицы. продлевающей период полужизни. по настоящему изобретению.
Линкеры. Любая линкерная группа или частица (т.е. -(Ь)г или -(Ь)6- в формулах 1-1Х) является необязательной. В случае ее наличия ее химическая структура не важна. так как она служит. прежде всего. в качестве спейсера. Как заявляется выше в данном описании. линкерная частица (-(Ь)г и/или -(Ь)6-). если она присутствует. может быть такой же. как любой другой линкер или линкеры. которые могут присутствовать в составе по изобретению. или может отличаться от них. Например. (Ь)Г может представлять собой ту же самую частицу. что и любой другой (Ь)Г или любой (Ъ)6 по настоящему изобретению или может отличаться от них. Предпочтительно линкер состоит из аминокислот. связанных друг с другом пептидными связями. Так. в некоторых вариантах изобретения линкер состоит примерно из 1-30 аминокислот. связанных пептидными связями. причем аминокислоты выбирают из 20 природных аминокислот. Некоторые из этих аминокислот могут быть гликозилированными. как хорошо понимают специалисты в
- 65 013470 данной области техники. Например, подходящей линкерной последовательностью, представляющей собой сайт сиалилирования (получения производного сиаловой кислоты), является ΧιΧ2ΝΧ4Χ^ (8Е^ ΙΌ NО: 637), где Х1, Х2, Х4 и Х5, каждый независимо, обозначает любой аминокислотный остаток.
В некоторых вариантах изобретения от 1 до 20 аминокислот выбирают из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Еще более предпочтительно линкер состоит в основном из пространственно незатрудненных аминокислот, таких как глицин и аланин. Так, предпочтительные линкеры включают полиглицины (в частности, (С1у)4, (С1у)5), полису-А1а) и полиаланины. Другими предпочтительными линкерами являются линкеры, которые определяются в данном описании как Ь5 (СССС8; 81-О ГО КО: 638), Ь10 (СССС8СССС8; 8ЕО ГО ЫО: 79), Ь25 СССС8СССС8СССС8СССС8СССС8; 8Е^ ΙΏ NО: 84), и любые линкеры, используемые далее в данном описании в иллюстрирующих примерах. Однако линкеры по данному описанию являются примерными; линкеры, входящие в объем данного изобретения, могут быть значительно длиннее и могут включать другие остатки.
В некоторых вариантах составов по данному изобретению, которые содержат пептидные линкерные частицы (Ь), в аминокислотную последовательность линкерной частицы (Ь) помещают кислые остатки, например глутамат или аспартат. Примеры включают следующие пептидные линкерные последовательности:
ООЕООС (8ЕЦ ГО ΝΟ: 639);
ООЕЕЕООО (8Е0 ГО N0: 640);
СгЕЕЕСг (8ЕЦ ГО ΝΟ: 641);
СЕБЕ (8Е<2 ГО ΝΟ: 642);
ΟΟϋΟΟσ (8Е0 ГО ΝΟ: 643);
0600000 (8Е<2 ГО ΝΟ: 644);
αϋϋοσ (8ЕЦ ГО N0: 645);
Οϋϋϋ (8ЕЦ ГО N0: 646);
ΟΟΟΟ8ΟΟ8ΟΕ68ΟΟΕϋΟΟΟ68 (8Е0 ГО ΝΟ: 647);
λΥΕλΥΕλν (8ЕЦ ГО N0: 648);
ГЕЕЕР (8Е0 ГО ΝΟ: 649);
ЕЕЕУ/АУУ/ (8Е<2 ГО N0: 650);
ЕЕЕРРР (8ЕЦ ГО N0: 651);
УДУЕЕЕУ/У/ (8ЕЦ ГО N0: 652); или
РРЕЕЕРР (8ЕЦ ГО ΝΟ: 653).
В других вариантах изобретения линкер представляет собой сайт фосфорилирования, например ΧιΧ2ΥΧ3Χ^ (8Е^ ΙΌ NО: 654), где Х1, Х2, Х3 и Χ4, каждый независимо, обозначает любой аминокислотный остаток; ΧιΧ28Χ3Χ^ (8Е^ ΙΌ NО: 655), где Х1, Х2, Х3 и Χ4, каждый независимо, обозначает любой аминокислотный остаток; или ΧιΧ2ΤΧ3Χ^ (8Е^ ΙΌ NО: 656), где Х1, Х2, Х3 и Χ4, каждый независимо, обозначает любой аминокислотный остаток.
Также возможны непептидные линкеры. Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как -ХН-(СН2)8-С(О)-, где 8=2-20. Эти алкильные линкеры могут дополнительно иметь любую незатрудненную пространственную группу, такую как низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), СЫ, ΝΗ2, фенил и т.д.. Примером непептидного линкера является ПЭГ линкер.
(ΧΙΙ)
где п имеет такое значение, что линкер имеет молекулярную массу 100-5000 кДа, предпочтительно 100500 кДа. Пептидные линкеры можно изменять с получением производных описанным выше способом.
Производные. Авторы изобретения также рассматривают дериватизацию пептидного участка и/или продлевающего период полужизни участка соединений. Такие производные могут повышать растворимость, всасывание, биологический период полужизни или ослаблять любой нежелательный побочный эффект соединений и т.п.. Типичные производные включают соединения, в которых:
1) соединение или некоторый его участок является циклическим. Например, пептидный участок можно модифицировать таким образом, чтобы он содержал один или более остатков Суз (например, в линкере), которые могут циклизоваться с образованием дисульфидной связи;
2) в соединении имеются сшивки (перекрестные связи) или соединению придают способность образовывать сшивки между молекулами. Например, пептидный участок можно модифицировать таким образом, чтобы он содержал один остаток Суз и тем самым был способен образовывать межмолекуляр- 66 013470 ную дисульфидную связь с подобной молекулой. Соединение может также быть сшито по С-концу, как в молекуле, изображенной ниже (ХШ)
3) непептидные связи заменяют одну или более пептидильных [-С(0)ЫК.-] связей. Примерами пептидильных связей являются -СН2-карбамат [-СН2-0С(0)NК-], фосфонат, -СН2-сульфонамид [-СН28(0)2ЫВ.-], мочевино [-NНС(0)NН-], -СН2-вторичный амин и алкилированный пептид [-С(0)ЫК6-, где К6 обозначает низший алкил];
4) вконец дериватизируют химическими методами. Обычно вконец может быть ацилирован или модифицирован в замещенный амин. Типичные группы Н-концевых производных включают -ЫКВ.1 (отличные от -ЫН2), -N^.0(0)^, -N^.0(0)0^, -N^.8(0)^, -NНС(0)NНК1, сукцинимид или бензилоксикарбонил-NН-(СВΖ-NН-), где К и К1, каждый независимо, обозначают водород или низший алкил и где фенильное кольцо может иметь 1-3 заместителя, выбранных из группы, состоящей из С1-С4 алкила, С1-С4 алкокси, хлора и брома;
5) свободный С-конец дериватизирован. Обычно С-конец превращен в сложноэфирную или амидную группу. Например, можно использовать описанные в уровне техники методы присоединения (ЫНСН^СН^ЫН^ к соединениям по данному изобретению, имеющим на С-конце любую из 8Е0 Ш N08: 504-508. Аналогично, можно использовать описанные в уровне техники методы присоединения -НН2 к соединениям по данному изобретению, имеющим на С-конце любую из 8Е0 Ш N08: 924-955, 963-972, 1005-1013 или 1018-1023. Типичные группы С-концевых производных включают, например, -С(0)К2, где К2 обозначает низший -НК3К4, где К3 и К4, независимо, обозначают С1-С8 алкил (предпочтительно С1-С4 алкил);
6) дисульфидную связь заменяют другим, предпочтительно более стабильным, сшивающим фрагментом (например, алкиленом). См., например, ВЕа1падаг е1 а1. (1996), Е Меб. СЕет. 39: 3814-9; А1Ьег1з е1 а1. (1993) ТЕ1г1ееп1Е Ат. Рер. 8утр., 357-9;
7) один или более отдельных аминокислотных остатков модифицированы. Известно, что различные дериватизирующие агенты реагируют конкретно с выбранными боковыми цепями или с концевыми остатками, как подробно описано ниже.
Лизиновые остатки и аминоконцевые остатки могут реагировать с ангидридами янтарной кислоты или других карбоновых кислот с обращением знака заряда лизиновых остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации α-аминосодержащих остатков включают сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксаль фосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; О-метилизомочевину; 2,4-пентандион; и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксала том.
Остатки аргинина (аргинил) можно модифицировать по реакции с любым или с комбинацией нескольких традиционных реагентов, включая фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для дериватизации аргининовых остатков требуется проводить реакцию в щелочной среде вследствие высокой рКа функциональной группы гуанидина. Кроме того, эти реагенты могут реагировать с группами лизина, а также с ε-аминогруппой аргинина.
Специфическая модификация тирозильных остатков тщательно изучалась, особенно введение спектральных меток в тирзильные (тирозиновые) остатки по реакции с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. Наиболее часто используют N-ацетилимидазол и тетранитрометан для образования О-ацетилтирозильных соединений и 3-нитропроизводных соответственно.
Карбоксильные боковые группы (аспартил (аспарагил) или глутамил) можно селективно модифицировать по реакции с карбодиимидами (К'^^=^^), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азонил-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартил (аспарагил) и глутамил можно превратить в остатки аспарагинил и глутаминил по реакции с аммониевыми ионами.
Остатки глутаминил и аспарагинил можно дезамидировать, получая соответствующие остатки глутамил и аспартил. Или же эти остатки дезамидируют в слабокислой среде. Любая форма этих остатков входит в объем данного изобретения.
Цистеинильные остатки можно заменить аминокислотными остатками или другими фрагментами либо для исключения дисульфидной связи, либо, наоборот, для стабилизации сшивки. См., например, ВЕа1падаг е1 а1. (1996), б. Меб. СЕет. 39: 3814-9.
Дериватизация с помощью бифункциональных агентов применяется для сшивания пептидов или их функциональных производных с не растворимой в воде матрицей подложки, либо с другими макромолекулярными частицами, продлевающими период полужизни. Обычные сшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида,
- 67 013470 например сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеинимиды, такие как бис-№малеинимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дает фотоактивируемые интермедиаты, способные образовывать поперечные связи (сшивки) на свету. Или же для иммобилизации белка применяют не растворимые в воде матрицы, такие как углеводы, активируемые цианогенбромидом, и реактивные субстраты, описанные в патентах США №№ 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440.
Углеводные (олигосахаридные) группы можно обычным способом связать с сайтами, известными как сайты гликозилирования в белках. Обычно О-связанные олигосахариды соединяют с остатками серина ^ег) или треонина (Тйг), тогда как Ν-связанные олигосахариды соединяют с остатками аспарагина (А8и), когда они являются частью последовательности А8и-Х^ег/Тйг, где Х может представлять собой остаток любой аминокислоты, кроме пролина. Предпочтительно Х является одной из 19 природных аминокислот, отличных от пролина. Структуры Ν-связанных и О-связанных олигосахаридов и остатков сахаров в каждом типе различны. Один тип сахара, обычно находящийся в Ν-связанных и О-связанных олигосахаридах, представляет собой Ν-ацетилнейраминовую кислоту (называемую сиаловой кислотой).
Сиаловая кислота обычно является концевой кислотой как Ν-связанных, так и О-связанных олигосахаридов и благодаря своему отрицательному заряду может сообщить кислые свойства гликозилированному соединению. Такой (такие) сайт (сайты) может (могут) быть включен (включены) в линкер соединений по данному изобретению и предпочтительно такие сайты гликозилируются с помощью клетки в процессе получения рекомбинантных полипептидных соединений (например, в клетках млекопитающих, таких как СНО, ВНК, СОδ). Однако такие сайты можно дополнительно гликозилировать синтетическими или полусинтетическими методами, известными в уровне техники.
Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, окисление атома серы в Су8, метилирование αаминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина. Сге1дй!ои, Рго!еш8: δΙπκΙιιΐΌ аид Мо1еси1е Ргорегйе8 (№.Н. Егеетаи аид Со., δаη Егаис18со), рр. 79-86 (1983).
Соединения по настоящему изобретению можно также изменять на уровне ДНК. Последовательность ДНК любого участка соединения можно изменить на кодоны, более совместимые с выбранной клеткой-хозяином. Для Е. сой, являющейся предпочтительной клеткой-хозяином, оптимизированные кодоны известны в уровне техники. Кодоны можно заменять таким образом, чтобы исключить сайты рестрикции или включить молчащие сайты рестрикции, которые могут содействовать процессингу ДНК в выбранной клетке-хозяине. Последовательности фрагмента, продлевающего период полужизни, линкера и ДНК пептида можно модифицировать, включив любое из вышеприведенных изменений в последовательность.
Также рассматривается способ получения конъюгированных производных. Например, опухолевые клетки обнаруживают эпитопы, которые отсутствуют в их нормальных аналогах. Такие эпитопы включают, например, различные посттрансляционные модификации, возникающие в результате их быстрой пролиферации. Так, один аспект данного изобретения представляет собой процесс, включающий:
а) отбор по меньшей мере одного случайного пептида, который специфически связывается с целевым эпитопом; и
б) получение фармакологического агента, содержащего (ί) по меньшей мере один фрагмент, продлевающий период полужизни (предпочтительным является Ес домен), (й) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность выбранного(ых) пептида или пептидов и (ш) эффекторную молекулу.
Целевой эпитоп предпочтительно представляет собой опухоль-специфический эпитоп или эпитоп, специфический к патогенному организму. Эффекторная молекула может представлять собой любой из вышеуказанных партнеров для конъюгации и предпочтительно является радиоизотопом.
Способы получения
Настоящее изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, векторам экспрессии и клеткамхозяевам, применимым для продуцирования полипептидов по настоящему изобретению. Клетки-хозяева могут представлять собой эукариотические клетки, причем предпочтительными являются клетки млекопитающих, а наиболее предпочтительны СНО клетки. Клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки, причем наиболее предпочтительными являются клетки Е. сой.
Соединения по данному изобретению преимущественно можно получать в трансформированных клетках-хозяевах с применением методов рекомбинантной ДНК. Для этого получают рекомбинантную ДНК, кодирующую пептид. Методы получения таких ДНК общеизвестны в уровне техники. Например, последовательности, кодирующие пептиды, можно вырезать из ДНК с применением подходящих рестриктаз. Или же ДНК можно синтезировать методами химического синтеза, таким как фосфорамидатный метод. Также можно использовать комбинацию этих методов.
Изобретение также включает вектор, способный экспрессировать пептиды в подходящем хозяине. Вектор содержит ДНК, которая кодирует пептиды, функционально связанные с подходящими последовательностями контроля экспрессии. Методы осуществления такого функционального связывания, либо до, либо после инсерции ДНК в вектор, общеизвестны. Последовательности контроля экспрессии вклю
- 68 013470 чают промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания рибосом, стартовые кодоны, стоп-кодоны, сигналы кэширования (кэп), сигналы аденилирования и другие сигналы, участвующие в контроле транскрипции или трансляции.
Результирующий вектор, содержащий в своем составе ДНК, используют для трансформации подходящего хозяина. Эту трансформацию можно осуществлять общеизвестными в уровне техники методами.
Для применения этого изобретения на практике можно использовать любую из большого числа хорошо известных клеток-хозяев. Выбор конкретной клетки-хозяина зависит от ряда факторов, известных в уровне техники. Эти факторы включают, например, совместимость с выбранным вектором экспрессии, токсичность пептидов, кодируемых ДНК, скорость трансформации, простоту регенерации пептидов, характеристики экспрессии, биологическую безопасность и стоимость. При рассмотрении соотношения следует понимать, что не все хозяева могут быть одинаково эффективны для экспрессии конкретной последовательности ДНК. С учетом этих общих принципов подходящие хозяева-микроорганизмы включают бактериальные клетки (такие как Е. сой кр.), клетки дрожжей (такие как Засскаготусек кр.) и другие клетки грибов, насекомых, растений, млекопитающих (включая человека) в культуре или других хозяев, известных в уровне техники.
Затем трансформированную клетку-хозяина культивируют и очищают. Клетки-хозяева можно культивировать в традиционных условиях ферментации так, чтобы экспрессировались заданные соединения. Такие условия ферментации общеизвестны в уровне техники. Наконец, пептиды очищают от культуры хорошо известными в уровне техники методами.
Соединения можно также получать синтетическими методами. Твердофазный синтез является предпочтительным методом получения индивидуальных пептидов, так как он является наиболее экономически эффективным методом получения малых (низкомолекулярных) пептидов. Например, хорошо известные методы твердофазного синтеза включают применение защитных групп, линкеров и твердофазных носителей (подложек), а также конкретные условия реакций защиты и депротекции (снятия защитных групп), условия отщепления линкеров, применение утилизаторов (поглотителей, мусорщиков) и другие аспекты твердофазного пептидного синтеза. Подходящие методы хорошо известны в уровне техники (например, Метйе1б (1973), Скет. Ро1урерйбек, рр. 335-61 (Каккоуаптк апб Рапауойк ебк.); Мегпйе1б (1963), I. Ат. Скет. Зос. 85: 2149; Эау1к ек а1. (1985), Вюскет. 1пЙ. 10: 394-414; 8(е\уаг1 апб Уоипд (1969), 8ойб Ркаке Рерйбе 8упккек1к: патент США. № 3941763; Ешп ек а1. (1976), Тке Ргокетк (3гб еб.) 2: 105-253; и Епсккоп ек а1. (1976), Тке Ргокетк (3гб еб.) 2: 257-527; Ргокесйпд Сгоирк ш Огдашс 8упГкек1к, 3гб Ебйюп, Т.^. Сгеепе апб Р.С.М. Жак, Ебк., коки \Убеу & Зопк, 1пс., 1999; ЫоуаВюскет Сак-бод, 2000; Зупккейс Рерйбек, А Икег'к Сшбе, С. А. Сгапк, Еб., XV.Н. Егеетап & Сотрапу, Νο\ν Уогк, Ν.Υ., 1992; Абуапсеб Скеткеск Напбкоок ок СотЫпакопа1 & 8оНб Ркаке Огдатс Скет1кйу, ν.Ό. Веппек, к XV. Скпккепкеп, Ь.К. Натакег, М.Ь. Рекегкоп, М.К. Ккобек, апб Н.Н. Запей, Ебк., Абуапсеб Скеткеск, 1998; Рппс1р1ек ок Рерйбе ЗупГкекк, 2пб еб. , М. Вобапк/ку, Еб., 8рйпдег-Уег1ад, 1993; Тке Ргасйсе ок Рерйбе 8упккек1к, 2пб еб. , М. Вобапкхку апб А. Вобапкхку, Ебк., 8рппдег-Уег1ад, 1994; Ргокесйпд Сгоирк, Р.к Кос1епкк1, Еб., Сеогд ТЫете Уег1ад, Зкийдай, Сегтапу, 1994; Етос 8ойб Ркаке Рерйбе 8упккек1к, А Ргасйса1 Арргоаск, XV.С. Скап апб Р.Э. Χνΐιί^, Ебк., Охкогб Ргекк, 2000, С.В. Е1е1бк ек а1., Зупккейс Рерйбек: А Икег'к Сшбе, 1990, 77-183).
Вне зависимости от того, получают составы по изобретению синтетическими методами или методами рекомбинантной ДНК, можно, где это применимо, использовать подходящие методы очистки. В некоторых вариантах составов по изобретению можно получать такой участок токсичного пептида и/или участок, продлевающий период полужизни, или другой участок, чтобы он включал подходящую изотопную метку (например, 125Ι, 14С, 13С, 353, 3Н, 2Н, 13Ν, 15Ν, 18О, 17О и т.д.), для того чтобы упростить количественное определение или обнаружение.
Соединения, которые содержат дериватизированные пептиды, или которые содержат непептидные группы, можно синтезировать хорошо известными методами органической химии.
Применение соединений
В целом. Соединения по данному изобретению обладают фармакологической активностью вследствие их способности связываться с белками, представляющими интерес, в качестве агонистов, миметиков или антагонистов нативных лигандов таких представляющих интерес белков.
Наследственные заболевания, связанные с ионными каналами (каналопатии), относятся к различным областям медицины, некоторые из них включают неврологию, нефрологию, миологию и кардиологию. Перечень врожденных нарушений, относящихся к ионным каналам, включает муковисцидоз (С1- канал; СЕТК), болезнь Дента (протеинурия и гиперкальциурия; С1- канал; СЕСЫ5), остеопороз (С1- канал; СЬСЮ), семейная гиперинсулинемия (ЗиК1; КСЮ11; К канал), диабет (КАТр/зИК канал), синдром Андерсена (КСМ2, КЙ2.1 К канал), синдром Барттера (КСЫЛ; КЙ1.1/КОМК; К канал),
- 69 013470 наследственное выпадение волос (КСНО4; К канал), наследственная гипертензия (синдром Лиддла; δΟΉ^; эпителиальный канал), дилатационная кардиомиопатия (§иК2, К канал), синдром удлиненного ОТ или сердечные аритмии (калиевые и натриевые каналы сердца), синдром Тимоти (САСNА1С, Сау1.2), миастенические синдромы (СНКNА,СНКNΒ,СNКNЕ; пАСЬК), и ряд других миопатий, гиперкалиемический периодический паралич (№а и К каналы), эпилепсия (МГ и К+ каналы), гемиплегическая мигрень (САСNА1А, Сау2.1 Са2+ сЬаппе1 апб АТР1А2), врожденная миопатия с поражением мышечных волокон (ΚΥΚ1, КуК1; Са2+ канал) и парамиотония и миотония (№Г, С1- каналы).
См. Ьб. Р!асек апб Υ-Н Ей (2004), АгсЬ. №иго1. 61: 166-8; ΒΑ. Метеуег е! а1. (2001), ΕΜΒ0 герогб 21: 568-73; Е. ЬеЬтапп-Ногп апб К. бигка1-КоП (1999), Р11убо1. Кеу. 79: 1317-72. Хотя вышеприведенный перечень относится к врожденным заболеваниям, молекулы (соединения), нацеленные на каналы, приведенные в этих нарушениях, могут также применяться при лечении родственных заболеваний другого или неясного происхождения.
Помимо вышеуказанных нарушений, получены также данные, подтверждающие, что ионные каналы являются мишенями для лечения серповидно-клеточной анемии (1КСа1) - при серповидно-клеточной анемии потеря воды из эритроцитов приводит к полимеризации гемоглобина и последующему гемолизу и закупорке сосудов. Потеря воды является результатом эффлюкса калия через так называемый канал Гардоса (Сагбок), т.е. 1КСа1. Следовательно, блокада 1КСа1 представляет собой возможное терапевтическое лечение для серповидноклеточной анемии;
глаукомы (БКСа) - при глаукоме внутриглазное давление слишком велико, что приводит к поражению нерва, аномальной глазной функции и возможной слепоте. Блокирование ΒКСа калиевых каналов может понизить секрецию внутриглазной жидкости и увеличить сокращение гладких мышц, что, возможно, приводит к снижению внутриглазного давления и к нейропротекции глаза;
рассеянного склероза (Ку, КСа), псориаза (Ку, КСа), артрита (Ку, КСа), астмы (КСа, Ку), аллергии (КСа, Ку),
С0РР (КСа, Ку, Са), аллергического ринита (КСа, Ку), легочного фиброза, волчанки (1КСа1, Ку), трансплантации, СуНР (КСа, Ку), воспалительной резорбции костей (КСа, Ку), периодонтоза (КСа, Ку), диабета типа I (Ку) - типа I диабет представляет собой аутоиммунное заболевание, которое характеризуется аномальным глюкозным, белковым и липидным метаболизмом и ассоциируется с дефицитом инсулина или резистентностью к инсулину. При этом заболевании Ку 1.3-экспрессирующие Тлимфоциты атакуют и разрушают панкреатические островки, что ведет к утрате β-клеток. Блокада Ку1.3 уменьшает количество воспалительных цитокинов. Кроме того, блокада Ку1.3 облегчает транслокацию 6ЬИТ4 в плазматическую мембрану, тем самым повышается чувствительность к инсулину, ожирения (Ку) - по-видимому, Ку1.3 играет очень важную роль в контроле гомеостаза и в защите против вызванного диетой ожирения. Таким образом, блокаторы Ку1.3 могут повышать уровень метаболизма, что ведет к более эффективной утилизации энергии и к снижению массы тела, рестеноза (КСа, Са2+) - пролиферация и миграция клеток гладких мышц сосудов может привести к неоинтимальному утолщению сосудов и рестенозу сосудов. Избыточная неоинтимальная пролиферация клеток гладких мышц сосудов связана с повышенной экспрессией 1КСа1. Поэтому блокада 1КСа1 может являться терапевтическим методом предупреждения рестеноза после ангиопластики, ишемии (КСа, Са2+) - при ишемии нейронов или сердца деполяризация клеточных мембран ведет к открытию потенциалзависимых натриевых и кальциевых каналов. Это, в свою очередь, может привести к перегрузке кальцием, которая является цитотоксической. Блокада потенциалзависимых натриевых и/или кальциевых каналов может снизить перегрузку кальцием и обеспечить цитопротективный эффект. Кроме того, благодаря своей решающей роли в контроле и стабилизации потенциала клеточных мембран модуляторы потенциал- и кальций-активируемых калиевых каналов могут также снижать перегрузку кальцием и защищать клетки, недержания мочи (КСа) - недержание мочи связано со сверхактивными клетками гладких мышц мочевого пузыря. Кальций-активируемые кальциевые каналы экспрессируются в клетках гладких мышц мочевого пузыря, где они контролируют потенциал мембран и опосредованно контролируют силу и час
- 70 013470 тоту сокращения клеток. Поэтому активаторы (открыватели) кальций-активируемых калиевых каналов обеспечивают механизм гашения электрической и сократительной активности в мочевом пузыре, что приводит к ослаблению позыва к мочеиспусканию, остеопороза (Κν), боли, включая мигрень (№у, ТРР Цгашаеп! гесер!ог ροϊοηΐίαΐ каналы], Р2Х, Са2+) - потенциалзависимые кальциевые каналы Ν-типа являются наиболее важными регуляторами ноцицептивной нейротрансмиссии в спинном мозге и одобрены во всем мире в качестве симптоматического средства для облегчения тяжелой хронической боли у людей. Зиконотид, пептидный блокатор Ν-типа кальциевых каналов, снижает ноцицептивную нейротрансмиссию и одобрен во всем мире в качестве симптоматического средства для облегчения тяжелой хронической боли у людей. Новые блокаторы ноцицепторспецифических кальциевых каналов Ν-типа явились бы улучшенными анальгетиками с пониженными побочными эффектами, гипертензии (Са2+) - потенциалзависимые кальциевые каналы Ь-типа и Т-типа экспрессируются в клетках гладких мышц сосудов, где они контролируют сопряжение возбуждение-сокращение сосудов и клеточную пролиферацию. В частности, активность кальциевых каналов связана с образованием неоинтимы при гипертензии. Блокаторы кальциевых каналов Ь-типа и Т-типа применимы для клинического лечения гипертензии, так как они снижают инфлюкс кальция и ингибируют сокращение клеток гладких мышц, заживления ран - миграция клеток играет решающую роль в заживлении ран. Градиенты внутриклеточного кальция играют роль важных регуляторов механизмов клеточной миграции в киратиноцитах и фибробластах. Кроме того, ионный поток через клеточные мембраны связан с изменениями объема клетки. Контролируя объем клетки, ионные каналы вносят вклад во внутриклеточную среду, которая необходима для действия механизмов клеточной миграции. В частности, по-видимому, для клеточной миграции всегда требуется 1КСа1. Кроме того, Κν1.3, Κν3.1, ΝΜΌΆ рецепторы и кальциевые каналы Νтипа связаны с миграцией лимфоцитов и нейронов, удара, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона (пАСНР, Ναν) биполярного расстройства (Ναν, Саν), рака, многие гены, кодирующие калиевые каналы, амплифицируются и белковые субъединицы позитивно регулируются при многих раковых состояниях. Показано, что в соответствии с патофизиологической ролью в позитивной регуляции (активации) калиевых каналов блокаторы калиевых каналов подавляют пролиферацию клеток рака матки и клеток гепатокарциномы, по-видимому, за счет ингибирования инфлюкса (трансмембранного перемещения) кальция, и влияют на кальцийзависимую экспрессию генов, различных неврологических, сердечно-сосудистых, метаболических и аутоиммунных заболеваний.
Как агонисты, так и антагонисты ионных каналов могут обеспечить положительные результаты лечения. Положительные результаты лечения могут быть вызваны, например, антагонистическим действием в отношении Κν1.3, 1КСа1, 8КСа, ВКСа, Ν-типа или Т-типа Са2+ каналов и т.п. Полезность низкомолекулярных и пептидных антагонистов этих каналов показана ίη νίίτο и ίη νίνο. Однако недостаточная эффективность производства и сложности фармакокинетики в значительной степени затрудняют клиническое исследование пептидных ингибиторов ионных каналов.
Составы по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты потенциалзависимого калиевого канала Κν1.3, применимы в качестве иммунодепрессантов, проявляющих терапевтическую эффективность в отношении аутоиммунных заболеваний. Например, такие молекулы применимы при лечении рассеянного склероза, диабета типа 1, воспалительного заболевания кишечника и ревматоидного артрита (см., например, Н. \Уи1ГГ е! а1. (2003) 1. С1ш. Ιηνβδΐ. 111, 1703-1713 и Н. Рик е! а1. (2005) ΡΝΑ8 102, 11094-11099; Вее!оп е! а1., ТагдеИпд еГГес!ог тетогу Т се11к \νί!1ι а 8е1ес!пге тЫЬбог рерббе оГ Κν1.3 сЬапнек Гог !Негару оГ аШопитипе 618еаке8, Мо1ес. РНагтасо1. 67(4): 1369-81 (2005); ВееЮп е! а1. (2006), Κν1.3: Шегареибс 1агде1 Гог се11-теб1а!еб аШонппшпе 618еаке, электронная версия препринта на сайте //\\'еЬП1е8.исгеби/ху!1ю8\\Г8/\\'еЬш/ 2670029.1). Ингибиторы потенциалзависимого калиевого канала Κν1.3 изучались в преклинических испытаниях на различных животных моделях воспаления. Показано, что низкомолекулярные и пептидные ингибиторы Κν1.3 блокируют продолжительную гиперчувствительность в ответ на овальбумин [С. ВееЮп е! а1. (2005) Мо1. РНаппасоГ 67, 1369] и на столбнячный токсин |С.С. 1<оо е! а1. (1999) С1ш. 1ттипо1. 197, 99]. Помимо подавления кожного воспаления, ингибиторы также снижали продуцирование антител |С.С. 1<оо е! а1. (1997) Г 1ттипо1. 158, 5120]. Антагонисты Κν1.3 проявили эффективность в отношении крысиной модели рассеянного склероза (М8) с адоптивным переносом экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (АТ-ЕАЕ). Канал Κν1.3 сверхэкспрессируется на миелин-специфических Т клетках М8 пациентов, дополнительно увеличивая полезность Κν1.3 ингибиторов при лечении М8. Воспалительная резорбция кости также подавляется ингибиторами Κν1.3 на преклинической модели адаптивного переноса болезни периодонта [Р. УаКегбе е! а1. (2004) Г Вопе Мшега1 Рек. 19, 155]. В этом исследовании ингибиторы дополнительно блокировали продуцирова
- 71 013470 ние антител к белку наружной бактериальной мембраны - одному компоненту бактерий, используемому для индукции воспаления десен. Недавно на преклинических крысиных моделях была показана эффективность ингибиторов Ку1.3 при лечении индуцированного пристанном (рп8!те) артрита и диабета [С. ВееЮп е! а1. (2006) препринт доступен на сайте //теЬД1е8.иа.еби/ху!Ьо8М8/тееЬш/_ху-2670029_1.]. Ку1.3 канал экспрессируется на всех субпопуляциях Т клеток и В клеток, но Т клетки эффекторной памяти и В клетки памяти, отвечающие за переключение класса, особенно зависят от Ку1.3 [Н. \νιι1ίΤ е! а1. (2004) 1. 1ттипо1. 173, 776]. 6аб5/инсулин-специфические Т клетки пациентов, впервые заболевших диабетом типа 1, миелин-специфические Т клетки больных РС (М8) и Т клетки синовиальной мембраны больных ревматоидным артритом - все они сверхэкспрессируют Ку1.3 [С. ВееЮп е! а1. (2006) препринт на сайте //теЬД1е8.иа.еби/ху!Ьо8М'8/теЬш/_ху-2670029_1.]. Поскольку мыши, дефицитные по Ку1.3, меньше прибавляют в весе, получая пищу с высоким содержанием жира [1. Xи е! а1. (2003) Нитап Мо1. Сепе1. 12, 551], и у них наблюдается изменение потребления глюкозы [1. Xи е! а1. (2004) Ргос. №111. Асаб. 8а. 101, 3112], Ку1.3 также исследовали на предмет лечения ожирения и диабета. Также было показано, что препараты рака молочной железы [М. АЬби1 е! а1. (2003) Аийсаисег Ве8. 23, 3347] и клеточные линии рака предстательной железы [8.Р. Ега8ег е! а1. (2003) РДидег8 АгсЬ. 446, 559] также экспрессируют Ку1.3, и блокада Ку1.3 может использоваться для лечения рака. Нарушения, которые можно лечить в соответствии с методом лечения аутоиммунного нарушения по изобретению, включающие токсичный(е) пешидный(е) ингибитор(ы) Ку 1.3, охватывают рассеянный склероз, диабет типа 1, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астму, аллергию, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермию, гломерулонефрит, синдром Сегрена (Шегрена), воспалительную резорбцию кости, отторжение трансплантата, болезнь трансплантат-противхозяина и системную красную волчанку (8ЬЕ) и другие формы волчанки.
Некоторые из клеток, которые экспрессируют кальций-активируемую калиевую промежуточную проводимость 1КСа1, включают Т клетки, В клетки, тучные клетки и эритроциты (ВВС). В Т клетках и ВВС мышей, дефицитных по 1КСа1, наблюдаются дефекты регуляции объема [Т. Ведеп181сЬ е! а1. (2004) 1. Вю1. СЬет. 279, 47681]. Преклинические и клинические исследования показали применимость ингибиторов 1КСа1 при лечении серповидно-клеточной анемии [IV. 8!оскег е! а1. (2003) В1ооб 101, 2412; \ν\ν\ν.^саβеη.сот|. Было показано, что блокаторы 1КСа1 также блокируют ЕАЕ, следовательно, они могут найти применение при лечении РС (М8) [Е.Р. ВеюЬ е! а1. (2005) Еиг. 1. Iттиио1. 35, 1027]. Опосредуемое 1дЕ продуцирование гистамина тучными клетками также блокируется ингибиторами 1КСа1 [8. Магк ЭпГГу е! а1. (2004) 1. А11егду С1ш. Iттиио1. 114, 66], следовательно, они могут также быть полезны при лечении астмы. Канал 1КСа1 сверхэкспрессируется также на активированных Т и В лимфоцитах [Н. \νιι1ίΤ е! а1. (2004) 1. Iттиио1. 173, 776] и, таким образом, его ингибиторы могут применяться при лечении широкого ряда иммунных нарушений. Помимо иммунной системы ингибиторы 1КСа1 также проявили эффективность на крысиной модели рестеноза сосудов и, таким образом, появляется новая стратегия предупреждения рестеноза после ангиопластики [В. КоЬ1ег е! а1. (2003) ОгсикЮоп 108, 1119]. Полагают также, что антагонисты 1КСа1 применимы при лечении ангиогенеза опухолей, так как ингибиторы подавляют пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенеза ш νίνο [I. Сгщс е! а1. (2005) Аг1епо8с1ег. ТЬготЬ. Уа8с. Вю1. 25, 704]. Канал 1КСа1 позитивно регулируется в опухолях поджелудочной железы, а ингибиторы блокируют пролиферацию панкреатических опухолевых клеточных линий [Н. 1адет е! а1. (2004) Мо1 РЬагтасо1. 65, 630]. Антагонисты 1КСа1 могут также предоставить способ ослабления, вызванного травмой острого поражения головного мозга [Е. Маи1ег (2004) Еиг. 1. №ито8а. 20, 1761]. Нарушения, которые можно лечить с помощью ингибиторов 1КСа, включают рассеянный склероз, астму, псориаз, контактный дерматит, ревматоидный и псориатический артрит, воспалительное заболевание кишечника, отторжение трансплантата, болезнь трансплантат-против-хозяина, волчанку, рестеноз, рак поджелудочной железы, ангиогенез опухолей и травматическое поражение мозга.
Соответственно, соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты кальций-активируемого калиевого канала промежуточной проводимости, 1КСа можно использовать для лечения иммунной дисфункции, рассеянного склероза, диабета типа 1, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, контактного дерматита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, астмы, аллергии, рестеноза, системного склероза, фиброза, склеродермии, гломерулонефрита, синдрома Сегрена (Шегрена), воспалительной резорбции кости, отторжения трансплантата, болезни трансплантат-противхозяина и волчанки.
Соответственно, настоящее изобретение включает способ лечения аутоиммунного нарушения, который заключается во введении пациенту, у которого диагностировано аутоиммунное нарушение, такое как рассеянный склероз, диабет типа 1, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астма, аллергия, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермия, гломерулонефрит, синдром Сегрена (Шегрена), воспалительная резорбция кости, отторжение трансплантата, болезнь трансплантат-против-хозяина или волчанка, терапевтически эффективного количества состава по изобретению, при этом у пациента частично снимается (ослабляется) по меньшей мере один симптом нарушения. Частично снимается (ослабляется) означает уменьшается, облегчается, снижается, смягчается, подавляется (т.е. становится более слабым и легким), успокаивается,
- 72 013470 умиротворяется, отпускает, стихает, исчезает или утоляется, вне зависимости от того, исчезает ли полностью, устраняется, отменяется или предупреждается представляющий интерес симптом у конкретного пациента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу предупреждения или ослабления рецидива симптома рассеянного склероза, этот способ включает введение пациенту, у которого ранее наблюдался по меньшей мере один симптом рассеянного склероза, профилактически эффективного количества состава по изобретению, так что предупреждается или ослабляется рецидив по меньшей мере одного симптома рассеянного склероза.
Составы по изобретению, предпочтительные для применения на практике способа лечения аутоиммунного нарушения по изобретению и способа предупреждения или ослабления рецидива симптома рассеянного склероза по изобретению включают в качестве Р (конъюгированного как в формуле I) пептидный антагонист Κν1.3 или ГКСа1, такой как 8РК пептид, О8К1 пептид, СРТх пептид и/или пептид Мауротоксин (МТх), или пептидные аналоги любого из них.
Например, конъюгированный 8РК пептид или пептидный аналог 8РК может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:
8ЕО ГО N0: 5, 88-200, 548-561, 884-950 или 1295-1300, представленных в табл. 2.
Конъюгированный О8К1 пептид или пептидный аналог О8К1 может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:
ЕС) ГО N0: 25, 294-298, 562-636, 980-1274, 6VIINV8СΚI8К^С^ЕРСΚΚА6МКР6ΚСМN6ΚСНСТРК (О8К1-87) (8 ЕС) ГО N0: 1303) или 6VIINV8СΚI8К^С^ΚРСΚ^А6МКР6ΚСМN6ΚСНСТРΚ (О8К1-87,К16,О20) (8Е0 ГО NО: 1308), представленных в табл. 7.
Также, например, конъюгированный МТХ пептид, МТХ пептидный аналог, СРТх пептид или СРТх пептидный аналог может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ГО NО: 20, 330-343, 1301, 1302, 1304-1307, 1309, 1311, 1312 или 1315-1336, представленных в табл. 13; или 8ЕС) ГО NО: 36, 59, 344-346 или 1369-1390, представленных в табл. 14.
Также в этих методах применим конъюгированный или неконъюгированный аналог токсичного пептидного ингибитора &ν1.3 или ГКСа1, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
8Е0 ГО NО: 88, 89, 92, 148-200, 548-561, 884-949 или 1295-1300, представленных в табл. 2; или
8ЕС) ГО ^: 980-1274, 6VIINV8СΚI8К^С^ЕРСΚΚА6МКР6ΚСМN6ΚСНСТРΚ (О8К1-87) (8ЕО ГО ^: 1303); или
6VIINV8СΚI8К^С^ΚРСΚ^А6МКР6ΚСМN6ΚСНСТРΚ (О8К1-8ЕК16.1)20) (8ЕО ГО 1308), представленных в табл. 7; или
8ЕС) ГО ^: 330-337, 341, 1301, 1302, 1304-1307, 1309, 1311, 1312 и 1315-1336, представленных в табл. 13.
В соответствии с этими способами по изобретению пациента, у которого диагностировано аутоиммунное нарушение, такое как, но без ограничения, рассеянный склероз, диабет типа 1, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астма, аллергия, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермия, гломерулонефрит, синдром Сегрена (Шегрена), воспалительная резорбция кости, отторжение трансплантата, болезнь трансплантатпротив-хозяина или волчанка, или пациента, у которого ранее был по меньшей мере один симптом рассеянного склероза, специалист-практик, такой как врач, знакомый с аутоиммунными нарушениями и их симптомами, может легко определить и поставить ему диагноз.
Например, симптомы рассеянного склероза могут включать следующие:
визуальные симптомы, такие как ретробульбарный неврит (неясное зрение, глазная боль, потеря цветного зрения, слепота); диплопия (двоение в глазах); нистагм (толчкообразные движения глаз); дисметрия (постоянные движения глаз с избыточной или недостаточной амплитудой); межъядерная офтальмоплегия (отсутствие координации между двумя глазами, нистагм, диплопия); двигательные и звуковые фосфены (вспышки света при движении глаз или в ответ на неожиданный шум); афферентный зрачковый дефект (аномальные реакции зрачка);
двигательные симптомы, такие как парез, монопарез, парапарез, гемипарез, квадрапарез (мышечная слабость - частичный или легкий паралич); плегия, параплегия, гемиплегия, тетраплегия, квадраплегия (паралич - полная или почти полная потеря силы мышц); спастичность (потеря мышечного тонуса, вызывающая тугоподвижность (ригидность), боль и ограниченную свободу движения пораженных конечностей);
дизартрия (замедленность речи и родственные затруднения речи); мышечная атрофия (атрофия мышц вследствие отсутствия их использования); спазмы, судороги (непроизвольное сокращение мышц); гипотония, клонус (затруднения с положением тела); миоклонус, миокимия (подергивание, судорожное сокращение мышц, тик); синдром беспокойных ног (непроизвольное движение ног, особенно мешающее ночью); отвислая стопа (при ходьбе нога волочится по полу); дисфункциональные рефлексы (М8К, Бабински, Гофмана, Чеддока);
сенсорные симптомы, такие как парестезия (ощущения частичного онемения, покалывания, жуж
- 73 013470 жания и вибрации); анестезия (полное онемение/потеря чувствительности); невралгия, нейропатическая и нейрогенная боль (боль без видимой причины, ощущения жжения, зуда и электрического шока); симптом Лермитта (ощущение удара электрическим током и шум при движениях головой); проприоцептивная дисфункция (утрата уверенности в расположении частей тела); невралгия тройничного нерва (лицевая боль);
симптомы, связанные с координацией движений и равновесием, такие как атаксия (потеря координации); интенционный тремор (дрожание при совершении точных движений); дисметрия (избыточная или недостаточная амплитуда движений конечностей); вестибулярная атаксия (аномальная функция равновесия во внутреннем ухе); головокружение (тошнота/рвота/морская болезнь вследствие вестибулярной атаксии); речевая атаксия (проблемы координации речи, заикание); дистония (замедленная позиционная обратная связь конечностей); дисдиадохокинез (потеря способности совершать быстро меняющиеся движения, например ритмичные движения);
симптомы со стороны кишечника, мочевого пузыря, сексуальные симптомы, такие как частое мочеиспускание, спазмы мочевого пузыря (неотложные позывы к мочеиспусканию); вялый мочевой пузырь, дисфункция сжимателей-сфинктеров (задержка и удерживание мочи); эректильная дисфункция (женская и мужская импотенция); аноргазмия (неспособность к достижению оргазма); ретроградная эякуляция (эякуляция в мочевой пузырь); фригидность (неспособность к сексуальному возбуждению); констипация (нечастые или нерегулярные опорожнения кишечника); недержание кала (недержание кишечника); энкопрез (непроизвольный стул);
когнитивные симптомы, такие как депрессия; когнитивная дисфункция (проблемы с кратковременной и долговременной памятью, забывчивость, медленное вспоминание слов); деменция; перемены настроения, эмоциональная лабильность, эйфория; биполярный синдром; беспокойство; афазия, дисфазия (нарушение восприятия речи и способности говорить); и другие симптомы, такие как усталость; симптом Утхоффа (нарастание симптоматики при повышении температуры окружающей среды); гастроэзофагеальный рефлюкс (рефлюкс кислоты); нарушены вкус и обоняние; эпилептические припадки, проблемы с дыханием и нарушение сна.
Симптомы рассеянного склероза, перечисленные выше, даны лишь в качестве иллюстрации и не претендуют на полное описание всех возможных симптомов, испытываемых отдельным пациентом или несколькими больными в целом, и к которым относится настоящее изобретение. Специалисты в данной области техники знакомы с различными клиническими симптомами и констелляцией симптомов аутоиммунных нарушений, которыми страдают отдельные пациенты, и к этим симптомам также относятся способы по данному изобретению для лечения аутоиммунного нарушения или предупреждения или смягчения рецидива симптома рассеянного склероза.
Терапевтически эффективное количество, профилактически эффективное количество и схема приема лекарственного средства по способам по изобретению для лечения аутоиммунного нарушения или предупреждения или смягчения рецидива симптома рассеянного склероза определяются лечащим врачом с учетом различных факторов, которые модифицируют действие терапевтических агентов, таких как возраст, состояние, масса тела, пол и диета пациента, тяжесть состояния, которое следует лечить, время введения и другие клинические факторы. В целом, ежедневное количество или схема составляет интервал примерно от 1 до 10000 мкг конъюгированного с носителем пептида на килограмм (кг) массы тела, предпочтительно около 1-5000 мкг на килограмм массы тела и наиболее предпочтительно около 1-1000 мкг на килограмм массы тела.
Соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты потенциалзависимого калиевого канала Ку2.1, можно применять для лечения диабета типа II.
Соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты М тока (например, ВеКт-1), можно использовать для лечения болезни Альцгеймера и улучшения процесса познания.
Соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты потенциалзависимого калиевого канала Ку4.3, можно применять для лечения болезни Альцгеймера.
Соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты кальцийактивируемого калиевого канала малой проводимости, δКСа, можно применять для лечения эпилепсии, нарушения памяти, нарушения обучаемости, нейропсихиатрических, неврологических, нейромышечных и иммунологических нарушений, шизофрении, биполярного нарушения, апноэ во сне, нейродегенерации и нарушений гладких мышц.
Соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты кальциевых каналов Ν-типа, применимы для ослабления боли. Пептиды с такой активностью (например, Зиконотид™, ωконотоксин-МУПА) одобрены для клинического применения.
Соединения по данному изобретению, включающие пептидные антагонисты кальциевых каналов Ттипа, применимы для ослабления боли. Различного рода данные указывают на то, что ингибирование Сау3.2 в ганглиях дорсальных корешков может облегчить хроническую боль. Чрезвычайно высокие уровни кальциевых каналов Т-типа обнаружены в клеточных тельцах субпопуляции нейронов в ЭКС; по-видимому, они являются механорецепторами, адаптированными для обнаружения медленных раздражителей (δΐιίπ е! а1., №11иге №иго8с1еисе 6: 724-730, 2003), а активность каналов Т-типа, по-видимому,
- 74 013470 ответственна за пик выброса (№1коп е( а1.. I №игокс1 25: 8766- 8775. 2005). Ингибирование каналов Ттипа либо мибефрадилом. либо этосуксимидом реверсирует механическую аллодинию у животных. вызванную повреждением нерва (Эодги1 е( а1.. Раш 105: 159-168. 2003) или химиотерапией (Б1а((егк апй Веппе((. Раш 109: 150-161. 2004). Антисмысловая последовательность (апйкепке) к Сат3.2. но не к Сат3.1 или к Сат3.3. повышает болевой порог у животных. а также снижает экспрессию белка Сат3.2 в ΌΒΟ (Воигше! е( а1.. ЕМВО I 24: 315-324. 2005). Аналогично. местная инъекция восстановителей вызывает боль и увеличивает Сат3.2 токи. окислители снижают боль и ингибируют Сат3.2 токи. а периферическое введение нейростероидов является обезболивающим и ингибирует токи Т-типа в ΌΒ6 (Тойоготю е( а1.. Ра1п 109: 328-339. 2004; Ра(1нга(11па е( а1.. Рат 114: 429-443. 2005). Поэтому полагают. что ингибирование Сат3.2 в клеточных телах ЭВС нейронах может ингибировать периодические выбросы (пики) этих нейронов. ассоциированные с хроническими болевыми состояниями.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты кальциевых каналов Ьтипа. применимы для лечения гипертензии. Низкомолекулярные соединения с такой активностью (например. ПНР) одобрены для клинического применения.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты канала №-,-1 (ТТХ8типа). применимы для ослабления боли. Местные анестетики и трициклические антидепрессанты с такой активностью одобрены для клинического применения. В частности. такие соединения по изобретению могут применяться в качестве мышечных релаксантов.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты канала №1-,-1 (ТТХ8типа). можно применять для ослабления боли. вызванной повреждением нерва и/или ткани.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты Са2+-активируемого хлоридного канала. можно применять для лечения рака и диабета.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты NМ^А рецепторов. можно применять для лечения боли. эпилепсии. травмы головного и спинного мозга.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты никотиновых рецепторов. можно применять в качестве мышечных релаксантов. Такие соединения можно применять для лечения боли. нарушений двигательной функции желудка. недержания мочи. привыкания к никотину и аффективных расстройств.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты 5НТ3 рецептора. можно применять для лечения приступов тошноты. боли и беспокойства.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты переносчика норэпинефрина. можно применять для лечения боли. в качестве антидепрессанта. для лечения нарушений обучаемости. памяти и недержания мочи.
Соединения по данному изобретению. включающие пептидные антагонисты рецептора нейротензина. можно применять для лечения боли.
Помимо терапевтического применения соединения по настоящему изобретению можно применять при диагностике заболеваний. характеризующихся дисфункцией ассоциированного с ними представляющего интерес белка. В одном варианте изобретения способ обнаружения в биологическом образце представляющего интерес белка (например. рецептора). способного активироваться. включает стадии: (а) контактирование образца с соединением по данному изобретению; и (б) обнаружение активации белка. представляющего интерес. с помощью данного соединения. Биологические образцы включают образцы ткани. интактные клетки или их экстракты. Соединения по данному изобретению можно применять как часть диагностического набора для обнаружения присутствия ассоциированных представляющих интерес белков в биологическом образце. В таких наборах применяются соединения по изобретению со связанной меткой. способствующей обнаружению. Соединения применимы для идентификации нормальных и аномальных представляющих интерес белков.
Терапевтические методы. составы и соединения по настоящему изобретению можно также применять. самостоятельно или в комбинации с другими соединениями. при лечении заболевания.
Фармацевтические композиции
В целом. Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции. содержащие состав по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции могут быть приготовлены для введения пациенту с применением разнообразных способов доставки. например. способ внутрисосудистого введения. такой как с помощью инъекции или инфузии. подкожный. внутримышечный. интраперитонеальный. эпидуральный или интратекальный способы доставки. или для перорального. энтерального. легочного (например. ингалятор). интраназального. трансмукозного (например. подъязычного. сублингвального введения). трансдермального или других путей доставки и/или форм введения. известных в уровне техники. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены в жидкой форме. или они могут быть в виде сухого порошка. например. в лиофилизированной форме. Для перорального или энтерального применения фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде таблеток. пастилок. лепешек. водных или масляных растворов. диспергируемых порошков или гранул. эмульсий. твердых или мягких капсул. сиропов. эликсиров или энтеральных составов.
- 75 013470
При практическом применении настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель представляет собой любое физиологически переносимое вещество, известное рядовому специалисту в данной области техники, применимое для приготовления фармацевтических композиций, любые фармацевтически приемлемые разбавители, эксципиенты, диспергирующие агенты, связующие, наполнители, вещества, способствующие проглатыванию, антифрикционные агенты, добавки для прессования, агенты, способствующие измельчению таблеток (вещества, вызывающие дезинтеграцию), суспендирующие агенты, смазки, вкусовые добавки, ароматизаторы, подсластители, энхансеры проницаемости или проникновения, консерванты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, эмульгаторы, вещества, повышающие вязкость, адъюванты, красители, покрытия, материал(ы) для инкапсулирования и/или другие добавки, самостоятельно или в комбинации. Такие фармацевтические композиции могут включать разбавители, содержащие буферы различного состава (например, Трис-НС1, ацетатный, фосфатный), рН и ионной силы; добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, Твин® 80, Полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия), консерванты (например, Тимерсол®, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактозу, маннит); введение материала в дисперсные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Можно также применять гиалуроновую кислоту, это промотирует продолжительное пребывание в кровотоке. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш νί\Ό и скорость клиренса ш νί\Ό белков и производных по настоящему изобретению. См., например, в книге ВетЫдоп'з Ркагтасеийса1 8с1епсез, 181к Еб. (1990, Маск РиЬНзЫпд Со., ЕаМоп, РА 18042) радез 1435-1712, которая вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Композиции можно приготовить в жидкой форме или они могут быть в виде сухого порошка, например, в лиофилизированной форме. Также применяются имплантируемые препараты пролонгированного действия, такие как трансдермальные или трансмукозные препараты. Наряду с этим (или вместо этого) настоящее изобретение предусматривает композиции для применения в препаратах замедленного или пролонгированного действия или в препаратах в виде микрочастиц, известных специалистам в данной области техники, например, препараты в виде микрочастиц пролонгированного действия, которые можно вводить через легкие, интраназально или подкожно.
Можно развести составы по изобретению или увеличить объем фармацевтических композиций по изобретению с помощью инертного материала. Такие разбавители могут включать углеводы, особенно манит, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Некоторые неорганические соли также можно использовать в качестве наполнителей, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Разбавителями, имеющимися в продаже, являются ЕаМЕ1о, Етбех, 8ΤΑ-Вx 1500, Етсотргезз и А\зсе11.
В фармацевтических композициях по данному изобретению в виде кремов, мазей и гелей могут применяться различные традиционные загустители, такие как, но без ограничения, альгинат, камедь ксантана или петролатум. Можно также использовать эхансеры проницаемости, такие как полиэтиленгликоля монолаурат, диметилсульфоксид, ^винил^-пирролидон, N-(2-гидроксиэтил)пирролидон или 3гидрокси-М-метил-2-пирролидон. Известны подходящие методы получения гидрогелевых матриц (например, Ееуеп, ВюбедгабаЫе кубгоде1 тайгсез Гог 1ке соп(го11еб ге1еазе оГ ркагтасо1одка11у асЖе адепД, патент США № 4925677; 8как е1 а1., ВюбедгабаЫе рН/ЫегтозепыЖе кубгодек Гог мМатеб бе1кегу оГ Ыо1одка11у асЫ'е адепй, международная заявка УО 00/38651 А1). Такие биоразлагающиеся гелевые матрицы можно получать, например, сшиванием белкового компонента и полисахаридного или мукополисахаридного компонента, затем их нагружают составом по изобретению для доставки.
Жидкие фармацевтические композиции по настоящему изобретению, представляющие собой стерильные растворы или суспензии, можно вводить пациенту инъекцией, например внутримышечно, интратекально, эпидурально, интраваскулярно (например, внутривенно или внутриартериально), интраперитонеально (внутрибрюшинно) или подкожно (см., например, Со1бепЬегд е1 а1., 8и5реп8юп8 Гог 1ке зиз1атеб ге1еазе оГ рго1ет8, патент США № 6245740 и международная заявка УО 00/38652 А1). Стерильные растворы можно также вводить внутривенной инфузией. Состав по изобретению можно вводить в стерильную твердую фармацевтическую композицию, такую как лиофилизированный порошок, которую можно растворять или суспендировать в нужное время перед введением пациенту в стерильной воде, физиологическом солевом растворе, забуференном солевом растворе или в другой подходящей стерильной среде для инъекций.
Имплантируемые препараты пролонгированного действия также являются подходящими вариантами фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Например, фармацевтически приемлемый носитель, биоразрушающаяся матрица, имплантированная внутрь тела или под кожу человека или другого позвоночного, может представлять собой гидрогель, аналогичный описанным выше. Или же, он может быть образован из пол-а-аминокислотного компонента (81бтап, ВюбедгабаЫе, ипр1ап1аЬ1е бгид беЫ'егу бе^зсе, апб ргосезз Гог ргераппд апб изтд зате, патент США № 4351337). Известны также и применимы по данному изобретению другие методы приготовления имплантатов для доставки лекарств.
В порошковой форме фармацевтически приемлемый носитель представляет собой тонкоизмельчен
- 76 013470 ное твердое вещество, применяемое в смеси с тонкоизмельченным(и) активным(и) ингредиентом(ами), включающим(и) состав по изобретению. Например, в некоторых вариантах изобретения применяют порошки, когда фармацевтическая композиция готовится в виде средства для ингаляции (см., например, 2епд е! а1., МеФой ок ргерагФд йгу ро\\'йег ФкакЮоп сотрозйюпз, международная заявка XVО 2004/017918; Тгипк е! а1., Ба1!з ок !Ие сСвР ап1адошз1 В1ВЫ4096 апй т11а1аЬ1е ро\\'йегей теФсатегИз соп1атФд Фет, патент США № 6900317).
Можно развести соединение по изобретению или увеличить его объем с помощью инертного материала. Эти разбавители могут включать углеводы, в особенности маннит, α-лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Некоторые неорганические соли можно также использовать в качестве наполнителей, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Продажными разбавителями являются Еаз!-Е1о™, Етйех™, БТА-Вх™ 1500, Етсотргезз™ и Ау1се11™.
Вещества, способствующие измельчению (дезинтегрирующие агенты), можно включать в состав фармацевтической композиции в виде твердой лекарственной формы. Материалы, применяемые в качестве дезинтегрирующих агентов, включают, но без ограничения, крахмал, в том числе промышленный дезинтегрирующий агент на основе крахмала, Ехр1о!аЬ™. Крахмал натрия гликолят, АтЬегФе™, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, ультраамилопектин, натуральная губка и бентонит - все они также могут применяться. Нерастворимая катионообменная смола представляет собой другую форму дезинтегрирующего агента. Смолы в виде порошков можно применять в качестве дезинтегрирующих агентов и в качестве связующих, они могут включать порошкообразные смолы, такие как агар, камедь карайи или трагаканта. Также в качестве дезинтегрирующих веществ применима альгиновая кислота и ее натриевая соль.
Связующие можно использовать для того, чтобы удерживать вместе терапевтический агент, образующий твердую таблетку, они (связующие) включают материалы из природных продуктов, такие как аравийская камедь, трагакант, крахмал и желатин. Другие связующие включают метилцеллюлозу (МЦ), этилцеллюлозу (ЭЦ) и карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Поливинилпирролидон (ПВП) и гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ) можно применять в виде спиртовых растворов для грануляции лекарств.
Для предупреждения слипания в процессе изготовления препарата в лекарственный препарат можно добавлять антифрикционный агент. Между лекарством и стенкой матрицы можно использовать слой смазки, эти смазки могут включать, но без ограничения: стеариновую кислоту, в том числе ее магниевую и кальциевую соли, политетрафторэтилен (ПТФЭ), жидкий парафин, растительные масла и воски. Можно применять также растворимые смазки, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, Карбовакс 4000 и 6000.
Можно добавлять вещества, способствующие скольжению, проглатыванию (глиданты), которые могли бы улучшить свойства текучести лекарства в процессе приготовления препарата и способствовать перераспределению его в процессе прессования. Вещества, способствующие скольжению (глиданты), могут включать крахмал, тальк, пирогенный оксид кремния и гидратированный силикоалюминат.
В качестве смачивающего агента, способствующего растворению соединения по изобретению, в водную среду можно добавлять поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия. Можно применять катионные детергенты, такие как бензалкония хлорид или бензэтония хлорид. В перечень потенциальных неионных детергентов, которые можно включить в состав препарата в качестве поверхностно-активных веществ, входит лауромакрогол 400, полиоксил-40стеарат, касторовое масло, гидрогенизированное полиоксиэтиленом 10, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 40, 60, 65 и 80, сложный эфир жирной кислоты с сахарозой, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Эти поверхностно-активные вещества могут присутствовать в препарате белка или производного либо самостоятельно, либо в виде смеси в различных соотношениях.
Пероральные лекарственные формы. Также применяются пероральные лекарственные формы составов по изобретению. При необходимости композицию можно модифицировать химическими методами таким образом, чтобы пероральная доставка была эффективной. В большинстве случаев рассматриваемая химическая модификация представляет собой связывание по меньшей мере одного фрагмента (частицы) к самой молекуле, где указанный фрагмент обеспечивает: (а) ингибирование протеолиза и (б) ввод в кровоток из желудка или кишечника. Также желательно повышение общей устойчивости соединения и увеличение времени циркуляции в организме. Частицы, применимые в качестве ковалентно связывающихся продлевающих период полужизни частиц в данном изобретении, также можно использовать для этой цели. Примеры таких частиц включают ПЭГ, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин. См., например, АЬисйо^зк1 апй Эау13 (1981), Бо1иЬ1е Ро1утег-Епгуте Аййис!з, Епгутез аз Эгидз (НосепЬегд апй ВоЬейз, ейз.), V^1еу-Iи!е^зс^еисе, Ыете Уогк, ΝΥ, рр 367-83; Ые^тагк, е! а1. (1982), 1. Арр1. Вюскет. 4:185-9. Другие полимеры, которые можно использовать, представляют собой поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан (йохосапе). Для фармацевтического применения, указанного выше, предпочтительными являются частицы ПЭГ.
- 77 013470
Для пероральной доставки лекарственных форм можно также использовать соль модифицированной алифатической аминокислоты, такой как натрия N-(8-[2-гидроксибензоил]амино)каприлат (8КАС), в качестве носителя для повышения всасывания терапевтических соединений по изобретению. Клиническая эффективность препарата гепарина с применением 8NАС была продемонстрирована в фазе ΙΙ испытаний, проводимых Ет1зрЕеге ТесЕпо1од1ез. См. патент США № 5792451, 0га1 бгид бектегу сотрозйюп апб те1Еобз.
В одном варианте изобретения фармацевтически приемлемый носитель может быть жидким, а фармацевтическую композицию готовят в виде раствора, суспензии, эмульсии сиропа, эликсира или препарата под давлением (герметично закрытого). Активный(ые) ингредиент(ы) (например, состав по изобретению) можно растворять, разводить или суспендировать в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода, органический растворитель, их смесь, или фармацевтически приемлемые масла или жиры. Жидкий носитель может содержать другие подходящие фармацевтические добавки, такие как детергенты и/или солюбилизирующие вещества (например, Твин 80, Полисорбат 80), эмульгаторы, буферы с подходящим значением рН (например, Трис-НС1, ацетат, фосфат), адьюванты, антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт), подсластители, вещества, придающие вкус и запах, суспендирующие агенты, загустители, наполнители (например, лактоза, маннит), красители, регуляторы вязкости, стабилизаторы, электролиты, осмолют (озто1и!е, осмотически активный раствор) или осморегуляторы. В препарат можно также включить добавки для повышения всасывания состава по изобретению. Добавками, потенциально обладающими этим свойством, являются, например, жирные кислоты, олеиновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота.
Применяются твердые лекарственные формы, в целом описанные в Кеттд1оп'з РЕагтасеийса1 8аепсез (1990), см. выше, в главе 89, которая вводится ссылкой в данное описание во всей полноте. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, пастилки, лепешки, крахмальные облатки или гранулы. Также композиции по данному изобретению могут быть в виде липосомных или белковых капсул (например, белковые микросферы, о которых сообщается в патенте США № 4925673). Можно использовать инкапсулирование в липосомы, а липосомы можно дериватизировать с помощью различных полимеров (например, патент США № 5013556). Описание возможных твердых лекарственных форм дается в книге МагзЕа11, К., Мобегп РЕагтасеийсз (1979), ебйеб Ьу С.8. Вапкег апб С.Т. КЕобез, в главе 10, которая вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Обычно препарат включает соединение по изобретению и инертные ингредиенты, которые способствуют защите от среды желудка и высвобождению биологически активного материала в кишечнике.
Композиция по изобретению может входить в состав препарата в качестве мультичастиц в виде гранул или шариков с размером частиц около 1 мм. Препарат материала для введения в виде капсул может быть также в виде порошка, слегка прессованных кусочков или даже таблеток. Лекарство можно приготовить прессованием.
Можно также включать красители и вещества, придающие вкус и запах. Например, белок (или производное) можно приготовить (например, инкапсулированием в липосомы или микросферы), а затем добавить пищевой продукт, такой как замороженный напиток, содержащий красители и вещества, придающие вкус и запах.
В виде таблеток активный(е) ингредиент(ы) смешивается(ются) с фармацевтически приемлемым носителем, обладающим необходимыми компрессионными свойствами, в соответствующих пропорциях и прессуют в виде препарата нужной формы и размера.
Порошки и таблетки предпочтительно содержат до 99% активного(ых) ингредиента(ов). Применимые твердые носители включают, например, фосфат кальция, стеарат магния, тальк, сахара, лактозу, декстрин, крахмал, желатин, целлюлозу, поливинилпирролидон, низкоплавкие воски и ионообменные смолы.
Может быть желателен препарат с контролируемым высвобождением. Состав по данному изобретению может быть включен в инертную матрицу, которая допускает высвобождение либо по диффузионному механизму, либо за счет выщелачивания, например, камеди (смолы). Также можно вводить в препарат медленно вырождающиеся, например, альгинаты, полисахариды. Другие составы по данному изобретению с контролируемым высвобождением основаны на 0гоз™ терапевтической системе (А1ха Согр.), т.е. лекарство заключают в полупроницаемую мембрану, которая позволяет, чтобы поступала вода и вымывала лекарство через единственное малое отверстие вследствие осмотического эффекта. Некоторые энтеросолюбильные покрытия также проявляют эффект пролонгированного действия.
Для препарата можно применять другие покрытия. Эти покрытия включают различные сахара, которые можно наносить на покрытия. Терапевтический агент может также быть в виде таблетки, покрытой пленкой, и используемые при этом материалы делятся на 2 группы. В первую группу входят неэнтеросолюбильные материалы: метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, повидон и полиэтиленгликоли. Вторую группу составляют энтеросолюбильные материалы, обычно это сложные эфиры или фталевая кислота.
- 78 013470
Для получения оптимального пленочного покрытия можно использовать смесь материалов. Пленочное покрытие можно наносить в ванне, или в псевдоожиженном слое, или прессованием.
Формы доставки в легкие. Применяется также легочная доставка составов по изобретению. Белок (или производное) доставляется в легкие млекопитающего при вдыхании и проходит через эпителиальную выстилку в легких в кровоток (другие сообщения об этом включают Аб_)е1 е! а1., Рйагта. Кек. (1990) 7: 565-9; Аб)е1 е! а1. (1990), 1ш!етаИ. I Рйагтасеибск 63: 135-44 (лейпролид ацетат); Βι-адие! е! а1. (1989), I. Сагбюуакс. Рйагтасо1. 13 (кирр1.5): к. 143-146 (эндотелии-1); НиЬЬагб е! а1. (1989), Аппа1к 1п!. Меб. 3: 206-12 (1-антитрипсин); 8ιηί11ι е! а1. (1989), 1. С1т. 1пуек!. 84: 1145-6 (1-протеиназа); 0к\\'е1п е! а1. (Магсй 1990), АегокоПхайоп оГ Рго!ешк, Ргос. 8утр. Кекр. бгад беНуегу II, Кеук!опе, Со1огабо (рекомбинантный человеческий гормон роста); ЭеЬк е! а1. (1988), 1. Iттиηο1. 140: 3482-8 (интерферон- и фактор некроза опухолей) и Р1а1х е! а1., патент США № 5284656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор).
При практическом применении данного изобретения используется широкий ряд механических устройств, созданных для легочной доставки терапевтических продуктов, включая, но без ограничения, небулайзеры, дозирующие ингаляторы и порошковые ингаляторы, все они знакомы специалистам в данной области техники. Некоторые конкретные примеры продажных приборов, применимых при практическом использовании данного изобретения, включают небулайзер и1!гауеп!, производимый МаШпскгоб!, Шс., 8!. Ьошк, М1ккоип; небулайзер Асогп II, выпускаемый Мащиек! Мебюа1 Ргобис!к, Епд1е^ооб, Со1огабо; дозирующий ингалятор Уеп!о1т, выпускаемый С1ахо Шс., Кекеагсй Тпапд1е Рагк, №г111 СагоНпа; и порошковый ингалятор 8р1пйа1ег, выпускаемый Е1копк Согр., БебГогб, МаккасЬике!!к (см., например, Не1деккоп е! а1., ПйикШоп беуюе, патент США № 6892728; МсРегтеп! е! а1., Ргу ро\\'бег 1пйа1ег, международная патентная заявка ¥0 02/11801 А1; 01116 е! а1., IηЬа1аη! тебюа!ог, патент США № 6273086).
Все такие приборы требуют применения препаратов, пригодных для диспергирования соединения по изобретению. Обычно каждый препарат специфичен в отношении применяемого прибора и включает в состав, помимо разбавителей, адъювантов и/или носителей, применимых в терапии, подходящий диспергатор.
Наиболее предпочтительно соединение по изобретению готовить в виде микрочастиц со средним размером менее 10 мкм, наиболее предпочтительно 0,5-5 мкм для более эффективной доставки в дистальное легкое.
Фармацевтически приемлемые носители включают углеводы, такие как трегалоза, манит, ксилит, сахароза, лактоза и сорбит. Другие ингредиенты для применения в препаратах могут включать РРРС, Р0РЕ, Р8РС и Р0РС. Можно применять природные или синтетические поверхностно-активные вещества. Можно применять ПЭГ (даже помимо его применения для дериватизации белка или аналога). Можно применять декстраны, такие как циклодекстран. Можно использовать желчные кислоты и другие родственные энхансеры. Можно использовать целлюлозу и производные целлюлозы. Можно использовать аминокислоты, такие как в буферном препарате.
Также рассматривается применение липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включения или других типов носителей.
Препараты, пригодные для применения в небулайзере, либо струйном, либо ультразвуковом, обычно содержат соединение по изобретению, растворенное в воде с концентрацией около 0,1-25 мг биологически активного белка на 1 мл раствора. Препарат может также включать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и регуляции осмотического давления). Препарат для небулайзера может также содержать поверхностно-активное вещество для снижения или предупреждения агрегации белка за счет сил поверхностного натяжения, вызванной распылением раствора с образованием аэрозоля.
Препараты для применения в дозирующем ингаляторе обычно содержат тонкоизмельченный порошок, включающий соединение по изобретению, суспендированное в диспергаторе с помощью поверхностно-активного вещества. Диспергатор может представлять собой любой материал, традиционно применяемый для этой цели, такой как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод, или углеводород, включая трихлофторметан, дихлордифторметан, дихлотетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан или их комбинации. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сорбитана триолеат и лецитин сои. Также в качестве поверхностно-активного вещества может применяться олеиновая кислота (см., например, Еаскк1гот е! а1., Аегоко1 бгид Гогти1а!юпк согИаттд ЬубгоГ1иогоа1капек апб а1ку1 кассЬапбек, патент США № 6932962).
Препараты для диспергирования в порошковых ингаляторах содержат тонкоизмельченный сухой порошок, включающий соединение по изобретению, они могут содержать также наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза, манит, трегалоза или ксилит в количествах, которые облегчают диспергирование порошка из прибора, например 50-90 вес.% от веса препарата.
Назальные формы доставки. Согласно настоящему изобретению также применима интраназальная доставка состава по изобретению и/или фармацевтических композиций, это способствует их переносу в кровоток непосредственно после введения в нос, не требуя депонирования продукта в легком. Препараты, пригодные для интраназального введения, включают препараты с декстраном или циклодекстрином, а приборы для интраназальной доставки известны (см., например, Егеехег, IηЬа1е^, патент США № 4083368).
- 79 013470
Трансдермальная и трансмукозная (например, трансбуккальная) формы доставки. В некоторых вариантах изобретения состав по изобретению готовят как часть фармацевтически приемлемых трансдермальных или чресслизистых (трансмукозных) пластырей или пастилок. Трансдермальные системы доставки лекарства в виде пластыря, например трансдермальные пластыри матриксного типа, известны и пригодны при практическом применении некоторых вариантов фармацевтических композиций по данному изобретению (например, СЫеп е1 а1., ТгапкБегта1 екйодеп/ргодекйп Бокаде ипй, куйет апБ ргосекк, патенты США № 4906169 и 5023084; С1еагу е1 а1., Эгйикюп та1п.х Бог 1гапкБегта1 Бгид аБтйийгаРоп апБ 1гапкБегта1 Бгид БеКхегу Бехюек тс1иБтд кате, патент США № 4911916; ТеШаиБ е1 а1., ΒVΑ-ЬакеБ йапкБегта1 тайтх кук1ет Бог [Не аБттккайоп оБ ап екйодеп апБ/ог а ргодекЛдеп, патент США № 5605702; Vеηкаΐекйха^ап е1 а1., ТгапкБегта1 Бгид Бейхегу тайтх Бог соаБтиикЮппд екйаБю1 апБ апоЛег йего1Б, патент США № 5783208; ЕБей е1 а1., МеБюБк Бог ргох|Бтд 1ек1ок1егопе апБ орйопа11у ек1годеп гер1асетеп1 Легару 1о хотеп, патент США № 5460820). Различные фармацевтические системы для чресслизистой (трансмукозной) доставки терапевтических агентов также известно в уровне техники и совместимы с практикой применения настоящего изобретения (например, НеЛег е1 а1., Тгапктисока1 Бейхегу оБ тасгото1еси1аг Бгидк, патенты США № 5346701 и 5516523; Ьопдепескег е1 а1., ТгапктетЬгапе ГогтЫайопк Бог Бгад аБт1шкйайоп, патент США № 4994439).
Также применима трансбуккальная доставка составов по изобретению. Препараты для трансбуккальной доставки известны в уровне техники, относящемуся к пептидам. Например, известные системы в виде таблеток или пластырей, созданных для доставки лекарства через слизистую оболочку полости рта (например, через сублингвальную слизистую оболочку), включают некоторые варианты, которые состоят из внутреннего слоя, содержащего лекарство, энхансер проницаемости, такой как соль желчной кислоты или фузидат, и гидрофильного полимера, такого как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, декстран, пептин, поливинилпирролидон, крахмал, желатин или ряд других полимеров, о которых известно, что они применяются для этой цели. Этот внутренний слой может иметь одну поверхность, адаптированную к контакту с влажной тканью слизистой полости рта и прилипанию к ней, и может иметь противоположную поверхность, прилипающую к вышележащему неадгезивному инертному слою. Необязательно, такая система трансмукозной доставки может быть в виде бислойной таблетки, в которой внутренний слой также содержит дополнительные связующие, вещества, придающие вкус и запах, или наполнители. В некоторых применяемых системах используют неионный детергент наряду с энхансером проницаемости. Устройства для трансмукозной доставки могут быть произвольной формы, такой как крем, гель или мазь, или могут иметь определенную форму, такую как таблетка, пластырь или пастилка. Например, доставку состава по изобретению можно осуществлять с помощью системы трансмукозной доставки, включающей ламинированный (слоистый) композит, например, из адгезивного слоя, защитного слоя, проницаемой мембраны, защищающей резервуар с составом по изобретению, внешнего герметизирующего диска под мембраной, одного или более термоплавких покрытий и удаляемого защитного покрытия (например, ЕБей е1 а1., ТгапкБегта1 Бейхегу кук1ет χίΛ аБНейхе охег1ау апБ рее1 кеа1 Б1кс, патент США № 5662925; СНапд е1 а1., Эехюе Бог аБтййкЮппд ап асйхе адеп11о Ле ккт ог тисока, патенты США № 4849224 и 4983395).
Дозировка. Схему введения лекарства по методу лечения вышеописанных состояний определяется лечащим врачом с учетом различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, возраста, состояния, массы тела, пола и диеты пациента, тяжести какой-либо инфекции, времени введения и других клинических факторов. Обычно суточный прием составляет 0,1-1000 мкг состава по изобретению на килограмм массы тела, предпочтительно 0,1-150 мкг на 1 кг.
Иллюстративные примеры
Вышеописанные составы можно получать, как описано далее. Эти примеры даются ни в коей мере не для того, чтобы ограничить объем настоящего изобретения.
Пример 1. Экспрессия Ес-Е10-8111<|1-35| в клетках млекопитающих.
Εс-^10-811I<|1-35|. также называемый 'Έο-2χΕ-8ΗΚ[ 1-35], ингибитор Κν1.3. Последовательность ДНК, кодирующую Ес область человеческого ^01, слитую в рамке считывания с линкерной последовательностью и мономером Κν1.3 пептидного ингибитора 8ΗΚ[ 1-35], конструируют, как описано ниже. Способы экспрессии и очистки пептидных антител (рерйЬоБу, рер!1Бе апйЬоБу) от клеток млекопитающих (НЕ< 293 и клеток яичников китайского хомячка) раскрываются в данном описании.
Экспрессирующий вектор рс^NА3.1(+)СМV^ (пкДНК3.1(+)СМV^) (фиг. 13А) конструируют, заменяя СМV промотор между ΜΛΙ и НшБШ в рсОНА3.1(+) (пкДНК3.1(+)) на СМV промотор плюс интрон (ТпуИгодеп). Экспрессирующий вектор рс^NА3.1(+)СМV^-йΕс-Асι^ν^ηΚIIΒ (фиг. 13В) получают клонированием расщепленного с помощью НшБШ-КоЙ ПЦР продукта, содержащего 5' последовательность Козака, сигнальный пептид и слитый пептид человеческого Ес-линкер-АсБтущКНВ с большим фрагментом расщепленного с помощью НюБШ-ЛоЙ рсЭНА3.1(+)СМ^ (пкДНК3.1(+)СМ^). Нуклеотидная и аминокислотная последовательность Ес области человеческого Ι§01 в рсОНА3.1 (+)СМ νί-НЕсАсБМпйПВ показана на фиг. 3А-В. Этот вектор также содержит линкер СССС8СССС8 (Ь10; 8ЕО ΙΌ N0: 79), расщепляемый по ВатШ сайту, что позволяет с представленным ниже олигонуклеотидом образовывать линкер из 10 аминокислот между Ес и пептидом 8ΗΚ[1-35] (см. фиг. 14) для конечной Ес-Ь10
- 80 013470 δЬК[1-35] нуклеотидной и аминокислотной последовательности (фиг. 14 и δЕ^ ΙΌ ΝΘ: 77 и δЕ^ ГО ΝΘ: 78).
Экспрессирующий вектор Ес-Ь10^йК[1-35] создают, используя стратегию ПЦР для получения полноразмерного гена δΗΙ<, связанного с аминокислотным линкером из четырех остатков глицина и одного остатка серина (представленные ниже строчные буквы показывают линкерную последовательность аминокислотных остатков в 1,-форме) с двумя стоп-кодонами и фланкированного сайтами рестрикции с помощью ВатН1 и показанными ниже.
ВатН1
ССАТССС<ЗАССА<ЗСА6СААСССССАССТССАТССАСАССАТССССАА6АСССССТССАСССССТТССАС ддддвКЗС1ОТ1РКЗКСТАР0
ТеСААССАСАССАТСААСТАСССССТСАССТТСТ6ССОСААСАССТССО6САССТОСТААТСАССС1ОСССС//ЗЕ0 Ю N0:657
СКНЗМКУВЬЗРСККТССТС ΝΟΤΙ //ЗЕ(2 Ιϋ N0:658
Два олигонуклеотида с изображённой ниже последовательностью используют в
ПЦР реакции с НегсЫазе™ полимеразой (81га1ацепе) при 94°С- 30 сек, 50° С-30 сек и
72°С- 1 мин 30 циклов.
саЕ дда есс дда дда дда дда аде еде аде Еде аЕс дас асе аЕс ссс аад
аде еде Еде асе дсс еес сад Еде аад сас //5Е0 Ю N0:659
саЕ дед дсс дсЕ саЕ Сад сад дЕд ссд сад дЕс ЕЕд едд сад аад сЕс адд
едд Рас ЕЕс аЕд сЕд Еде ЕЕд сас Едд аад д //ЗЕО ΙΌ N0:650
Полученные продукты ПЦР разрешают как полосы 150 п.о. на однопроцентном агарозном геле. ПЦР продукт из 150 п.о. расщепляют рестриктазами ВатН1 и \об (Косйе), а агарозный гель очищают с помощью набора для очистки Се1 Рипйсайои К1! (Сйацеи). Одновременно вектор рсЧ)\А3.1()С\1\м-111;сАсйушКПВ (фиг. 13В) расщепляют рестриктазами ВатН1 и \об и большой фрагмент очищают с помощью набора Се1 Рипйсайои Кй. Гель-очищенный ПЦР-фрагмент лигируют с очищенным большим фрагментом и переносят в ΧΙ.-1 синие бактерии ^!га!адеие). ДНК трансформированных бактериальных колоний выделяют, расщепляют с помощью рестриктаз ВатН1 и \о11 и разрешают на однопроцентном агарозном геле. ДНК, полученные ожидаемым способом, подвергают секвенированию. Хотя анализ нескольких последовательностей клонов дает 100%-ное совпадение с вышеуказанной последовательностью, только один клон выбирают для очистки плазмиды в крупных масштабах. ДНК, полученную при использовании Ес-2хй^йК в клоне рс^NΑ3.1(+)СМV^, повторно секвенируют (ресеквенируют) для подтверждения Ес и линкерных областей, последовательность на 100% идентична предсказанной кодирующей последовательности, показанной на фиг. 14А-В.
НЕК-293 клетки, используемые при транзиторной трансфекции с экспрессией Ес-2хй^йК[1-35] в рс[)\А3.1()С\1\м белке, культивируют в питательной среде, содержащей ОМЕМ с высоким содержанием глюкозы (С1Ъсо), 10% фетальной бычьей сыворотки (ЕВδ от С1Ъсо) и ΙΧ заменимой аминокислоты ^ЕАА от С1Ъсо). 5,6 мкг Ес-2хй^йК[1-35] в плазмиде рс^NΑ3.1(+)СМV^, экстрагированной смесью фенол/хлороформ, трансфецируют в клетки НЕК-293 с применением Еидеие 6 (Косйе). Клетки регенерируют в течение 24 ч, а затем помещают в среду ОМЕМ с высоким содержанием глюкозы и 1х NЕΑΑ на 48 ч. Кондиционированную среду концентрируют 50Х, пропуская 30 мл через фильтр Сеи!лргер УМ-10 (Ат1сои), а далее концентрируют на фильтре Сеи!лсои УМ-10 (Аписон). Различные количества концентрированной среды смешивают с собственной разработки 4х буфером для нанесения образца (без Вмеркаптоэтанола) и подвергают электрофорезу на геле с 4-20% трис-глицина (Иоуех) на приборе \омех Хсе11 II при 101 В/46 мА в течение 2 ч в рабочем буферном растворе 5х (0,123 Трис основания, 0,96 М глицина) вместе с 10 мкл ВеисйМагк предварительно окрашенного Рго!ет 1аддег (стандарта молекулярной массы белка) Циуйгодеи). Затем гель в течение 30 мин выдерживают в буфере для электроблоттинга (35 мМ Трис основания, 20% метанола, 192 мМ глицина) в течение 30 мин. Мембрану РУПЕ от \омех (Са!. ^. ЙС2002, размер пор 0,2 мкм) выдерживают в метаноле в течение 30 с для активации РУПЕ, промывают деионизированной водой и выдерживают в буфере для электроблоттинга. Предварительно замоченный гель переносят на мембрану РУПЕ, используя модуль ХСе11 II В1о! согласно инструкциям производителя ^оуех) при 40 мА в течение 2 ч. Затем блот сначала выдерживают в 5% молоке (Сагиайои) в забуференном Трис физиологическом растворе рН 7,5 (ТВδ) в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубируют в разведении 1:500 в ТВδ с 0,1% Твин-20 (ТВδТ δίριηη) и 1% молочном буфере конъюгированного с НКР мышиного антитела против человеческого Ес (/утсч! ЬаЪога!оге8 Са!. ио. 05
- 81 013470
3320), встряхивая в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем блот отмывают три раза по 15 мин в ТВ8Т при комнатной температуре. Первичное антитело обнаруживают с помощью реагентов АтегзРат Рйагтааа Вю!есй'з ЕСЬ \ез!егп Ъ1о!йпд бе!ес!юп геадеп! в соответствии с инструкциями производителя. В процессе ЕСЬ обнаружения вестерн-блоттинг показывает расчетную величину 66 кДа в геле в невосстанавливающих условиях (фиг. 24А).
Клетки АМ1 СНОб- (Атдеп Ргорпе!агу), используемые для стабильной экспрессии белка Ес-Ь108РК[1-35], культивируют в среде для выращивания АМ1 СНОб-, включающей ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1х гипоксантина/тимидина (НТ от О1Ъсо) и 1Х NЕАА. 6,5 мкг плазмиды рс^NА3.1(+)СМV^-Ес-8РΚ также трансфецируют в клетки АМ1 СНОб- , используя Еидепе 6. На следующий день трансфецированные клетки засевают в 20 плашек диаметром 15 см и проводят отбор, используя среду ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% ЕВ8, 1х НТ, 1х №АА и генетицин (800 мкг/мл О418 от О1Ъсо) в течение 13 дней. Сорок восемь выживших колоний помещают в два 24-луночных планшета. Планшеты оставляют для выращивания в течение недели, а затем реплицируют для замораживания. Один набор из каждого планшета переносят в питательную среду для выращивания АМ! СНОб- , не содержащую 10% ЕВ8, на 48 ч и собирают на кондиционированных средах. Вестерн-блоттинг, аналогичный Вестерн-блоттингу для обнаружения того же самого антитела к человеческому Ес, используют для скрининга 15 мкл кондиционированной среды для экспрессии стабильных клонов СНО. Из 48 стабильных клонов более 50% показывают 8РК экспрессию белка ожидаемого размера 66 кДа. Отбирают клоны ВВ6, ВЭ5 и ВО6, причем клоны ΕΌ5 и ΕΌ6 в качестве дублеров, запасных вариантов для главного клона ВВ6 (фиг. 24В).
Клон ВВ6 выращивают в увеличенных масштабах в 10 роллер-флаконах (Согшпд), используя среду для выращивания АМ1 СНОб-, и выращивают до достижения монослоя, наблюдая под микроскопом. Затем среду заменяют на бессывороточную среду, содержащую до 50% ОМЕМ с высоким содержанием глюкозы и 50% среды Хэма Е12 (О1Ъсо) с 1хНТ и 1xNЕАА и оставляют для инкубации в течение недели. Кондиционированную среду собирают после инкубации в течение одной недели, фильтруют через фильтр 0,45 мкм (Соттд) и замораживают. Добавляют свежую среду и инкубируют еще в течение одной недели. Кондиционированную бессывороточную среду собирают как в первый раз и замораживают.
Примерно 4 л кондиционированной среды размораживают на водяной бане при комнатной температуре. Среду концентрируют до 450 мл, применяя кассету для тангенциальной проточной ультрафильтрации 8аЮгтз 8аг!осоп Ро1узи1£оп 10 (0,1 м2) при комнатной температуре. Ретентат затем фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм с префильтром. Затем ретентат наносят на колонку 5 мл Атегзйаш Н1Тгар Рго!ет А при скорости потока 5 мл/мин, при температуре 7°С и колонку промывают фосфатно-солевым буферным раствором без двухвалентных катионов (РВ8) по Дульбекко в количестве, равном нескольким объемам колонки, и образец элюируют, постепенно увеличивая количество глицина рН 3,0 до 100 мМ. Элюированный пул белка А (около 9 мл) разводят до 50 мл водой и наносят на колонку 5 мл АтегзРат НГГгар 8Р-НР в 8-буфере А (20 мМ NаН2РО4, рН 7,0) при скорости потока 5 мл/мин и при температуре 7°С. Затем колонку промывают несколькими объемами колонки 8-буфером А и элюируют в линейном градиенте от 25 до 75% 8-буфера В (20 мМ NаН2РО4, 1 М №С1, рН 7,0) при скорости потока 5 мл/мин, затем постепенно до 100% 8-буфера В при 7°С. Фракции затем анализируют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим 8Э8-РАСЕ с 4-20% трис-глицина, и фракции, содержащие заданный продукт, собирают, исходя из этих данных. Собранный материал затем концентрируют, примерно, до 3,4 мл на центрифужном ультрафильтре Ра11 Ь£е 8с1епсез Масгозер 10К Отеда, а затем фильтруют через целлюлозно-ацетатный шприцевой фильтр Соз!аг 0,22 мкм.
Затем проводят спектральное сканирование на 10 мкл отфильтрованного материала, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре Не\1еИ Раскагб 8453 (фиг. 26А). Концентрация отфильтрованного материала равна 5,4 мг/мл, как определено с учетом вычисленной молекулярной массы 32420 г/моль и коэффициента экстинкции 47900 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ (фиг. 26В). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы СРаг1ез Кщег ЬаЪогаФпез Епбоза£е-РТ8 зуз!еш (чувствительность 0,05-5 Еи/мл) при 108-кратном разведении образца в РВ8, в результате получают <1 ЕИ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу продукта, используя эксклюзионную хроматографию 20 мкг продукта, который вводят в колонку РРепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2РО4, 250 мМ №С1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 26С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на 1 мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МАРШ плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на времяпролетном масс-спектрометре ^уадег ОЕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных: импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 26Ό) и подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят
- 82 013470 при -80°С.
Очищенный Ес-Ь10-8кК[1-35] эффективно блокирует человеческий Ку1.3 (фиг. 30А и 30В), как определено электрофизиологическими методами (см. пример 36). Очищенный Ес-Ь10-8кК[1-35] также блокирует пролиферацию Т клеток (фиг. 36А и 36В) и продуцирование цитокинов Ш-2 (фиг. 35А и 37А) и ΙΕΝ-д (фиг. 35В и 37В).
Пример 2. Экспрессия Ес-Ь-8кК[1-35] в клетках млекопитающих.
Последовательность ДНК, кодирующая область Ес человеческого 1дО1, слитого в рамке считывания с мономером Ку1.3 ингибирующего пептида 8кК[2-35], конструируют стандартным методом ПЦР. 8кК[2-35] и линкерный участок молекулы из 5, 10 или 25 аминокислот получают по реакции ПЦР, используя исходный Ес-2хЬ-8кК[1-35] в рсИЦА3.1(+)СМУ1 в качестве матрицы (пример 1, фиг. 14). Все 8кК конструкции должны иметь следующую аминокислотную последовательность:
8СШТ1РК8КСТАР0СКН8МКУКЬ8РСВКТС6ТС (8Е0 Ю N0: 92) где первая аминокислота последовательности дикого типа удалена. Последовательности праймеров, применяемых для создания Ес-Ь5-8кК[2-35], также называемого Ес-1хЬ-8кК[2-35], показаны ниже сак дда Рее аде Еде айс дас асе аЪс//5Е(2 ГО N0:661;
саЬ дед дес дсЬ саЬ Еад с// 3Εζ) ГО N0:662;
Последовательности праймеров, применяемых для создания Ес-Ь10-8кК[2-35], также называемого Ес-2хЕ-8кК[2-35], показаны ниже сай дда Дес дда дда дда дда аде аде Еде а //8Е0 ГО N0:663;
сай дед дес дсЬ саЬ Рад сад дйд с //5Е£) ГО N0:664;
Последовательности праймеров, применяемых для создания Ес-Ь25-8кК[2-35], также называемого Ес-5хЬ-8кК[2-35], показаны ниже
сай дда ьсс ддд ддй ддд ддь Сей ддд ддй ддд ддь Есь дда дда дда
дда аде дда дда дда дда аде аде Рде а//8Е0 ГО N0:665;
сай дед дес дсЬ сай Сад сад дед е//ЗЕ<2 ГО N0:666;
Продукты ПЦР расщепляют рестриктазами ВатН1 и Цок1 (Коске) и агарозный гель очищают с помощью набора для очистки геля, Се1 Рипйсакюп К1к. Одновременно вектор рсИЦА3.1(+)СМУ1-кЕсАсЦутКИВ (фиг. 13В ) расщепляют рестриктазами ВатН1 и Хо1! и большой фрагмент очищают с помощью набора Се1 Рипйсакюп К1к. Каждый очищенный продукт ПЦР лигируют в большой фрагмент и переносят в ХЬ-1 синие бактерии. ДНК трансформированных бактериальных колоний выделяют, расщепляют с помощью рестриктаз ВатН1 и Цок1 и разрешают на однопроцентном агарозном геле. ДНК, полученные ожидаемым способом, подвергают секвенированию. Хотя анализ нескольких последовательностей клонов дает 100%-ное совпадение с вышеуказанной последовательностью, только один клон выбирают для очистки плазмиды в крупных масштабах. ДНК этого клона повторно секвенируют (ресеквенируют) для подтверждения Ес и линкерных областей, и последовательность на 100% идентична предсказанной последовательности.
Плазмиды, содержащие инсерты (вставки) Ес-1хЬ-8кк[2-35], Ес-2хЬ-8кк[2-35] и Ес-5хЬ-8кк[2-35] в векторе рсО\А3.1(-)СМУ|, расщепляют рестриктазами ХЬа1 и Хко1 (Коске) и очищают в геле. Инсерты (вставки, включения) по отдельности лигируют в расщепляемый с помощью Цок1 и 8а11 (Коске) экспрессирующий вектор рИ8Ка-22 (Атдеп Ргорпекагу). Целостность полученных конструкций подтверждают секвенированием ДНК. Конечные конструкции векторов экспрессии плазмидной ДНК представляют собой рБ8Ка-22-Ес-1хЬ-8кк[2-35], рО8Ка-22-Ес-2хЬ-8кк[2-35] (фиг. 13С и 15) и рО8Ка-22-Ес-5хЬ-8кк[235] (фиг. 16) и содержат линкеры из 5, 10 и 25 аминокислот соответственно.
За 24 ч до трансфекции 1.2е7 АМ-1/Ό СНОб- (Атдеп Ргорпекагу) клетки помещают в Т-175 см стерильную колбу для тканевых культур до достижения 70-80% монослоя в день трансфекции. Клетки выдерживают в АМ-1/Ό СНОб- культуральной среде, включающей ИМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 5% ЕВ8, 1Х глутамин Реп/8кгер (Пен/Стреп) (О1ксо), 1Х НТ, 1Х ХЕАА и 1Х натрия пируват (С1ксо). На следующий день 18 мкг каждой из линеаринизованных плазмид рО8Ка22:Ес-1хЕ-8кК[2-35], рО8Ка22:Ес-2хЬ-8кК[2-35] и рО8Ка22:Ес-5хЬ-8кК[2-35] (КО8 # 20050037685, 20050053709,
20050073295) смешивают с 72 мкг линеаризованной плазмиды 8е1ех1к МАК и рРАСО1 (КО8 20042009896) и разводят в 6 мл ОрйМЕМ в конической пробирке на 50 мл и инкубируют 5 мин. ЙЕ2000 (210 мкл) добавляют к 6 мл ОрйМЕМ и инкубируют 5 мин. Разведенные ДНК и ЙЕ2000 смешивают и инкубируют 20 мин при комнатной температуре. В это же время клетки отмывают один раз РВз, а затем к клеткам добавляют 30 мл ОрйМЕМ без антибиотиков. ОрйМЕМ отсасывают и клетки инкубируют с 12 мл смеси ДНК/ЙЕ2000 в течение 6 ч или ночи при 37°С при встряхивании. Через 24 ч после трансфекции клетки делят 1:5 в АМ-1/Ό СНОб- культуральной среде и при различных разведениях для отбора колоний. Через 72 ч после трансфекции культуральную среду заменяют на среду ИНЕК для селекции, содер
- 83 013470 жащую 10% диализированной БВ8 (С1Ьсо) в ОМЕМ с высоким содержанием глюкозы. плюс 1Х глутамин Реп/8(гер (Пен/Стреп). 1Х ΝΞΆΛ и 1Х Νι Руг. чтобы способствовать экспрессии и секреции белка в среду клеток. Среду для селекции заменяют два раза в неделю до тех пор. пока колонии достаточно велики для отбора. Экспрессирующий вектор рО8Ва22 содержит кассету экспрессии ОНБВ. которая позволяет выращивать трансфецированные клетки в отсутствие гипоксантина и тимидина. Для получения в больших масштабах 5 пулов полученных в Т-175 колоний помещают в роллер-флаконы и культивируют в бессывороточной среде. Кондиционированные среды собирают и заменяют с интервалами одна неделя. Полученные 3 л кондиционированной среды фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0.45 мкм (Согшпд. Ас(оп. МА) и переносят на колонку Рго!ет СНетЫгу для очистки. В качестве резерва выбирают 12 колоний из плашек по 10 см после выдерживания в течение 10-14 дней на среде ОНБВ для селекции и уровни экспрессии оценивают Вестерн-блоттингом. используя в качестве зонда конъюгированное с НВР антитело к человеческому 1дСБс. Размножают три лучших клона. экспрессирующие наивысшие уровни каждого из слитых белков Бс-Ь-8НК[2-35] с линкерами различной длины. и замораживают для применения в дальнейшем.
Очистка Бс-Ь10-8НК(2-35). Около 1 л кондиционированной среды размораживают на водяной бане при комнатной температуре. Среду наносят на колонку объемом 5 мл АшсгкИиш Н1Тгар Рго!ет А при скорости потока 5 мл/мин при 7°С и колонку промывают несколькими объемами колонки солевым фосфатным буфером без двухвалентных катионов (РВ8) по Дульбекко в количестве. равном нескольким объемам колонки. и образец элюируют. постепенно увеличивая глицин рН 3.0 до 100 мМ. Элюированный пул белка А (около 8.5 мл) смешивают с 71 мкл 3 М ацетатом натрия. а затем разводят до 50 мл водой. Разведенный материал затем наносят на колонку 5 мл Ате^Иат НГГгар 8Р-НР в 8-буфере А (20 мМ NаН2ΡΟ4. рН 7.0) при скорости потока 5 мл/мин и при температуре 7°С. Затем колонку промывают 8буфером А в количестве. равном нескольким объемам колонки. и проявляют в линейном градиенте от 0 до 75% 8-буфера В (20 мМ NаН2ΡΟ4. 1 М №С1. рН 7.0) при скорости потока 5 мл/мин. затем постепенно до 100% 8-буфера В при 7°С. Фракции затем анализируют с помощью 8П8-РАОЕ с 4-20% трис-глицина. окрашенного Кумасси бриллиантовым синим. и фракции. содержащие заданный продукт. собирают. исходя из этих данных. Собранный материал затем фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0.22 мкм и концентрируют примерно до 3.9 мл на центрифужном ультрафильтре Ра11 ЫГе 8с1епсек Масгокер 10К Отеда. Концентрированный материал затем фильтруют через Ра11 ЫГе 8с1епсек АсгоФкс с мембраной 0.22 мкм. 25 мм Мик(апд Е при скорости потока 2 мл/мин при комнатной температуре. Затем проводят спектральное сканирование на 10 мкл отфильтрованного материала. разведенного в 700 мкл РВ8. на спектрофотометре Не\\'1е(( Раскагй 8453 (фиг. 27Е). Концентрация отфильтрованного материала равна 2.76 мг/мл. как определено с учетом вычисленной молекулярной массы 30008 г/моль и коэффициента экстинкции 36900 М-1 ст-1. Так как обнаруживают. что материал проходит (через мембрану) (пермеат). проводят повторную стадию его концентрации с применением нового картриджа Масгокер. Затем новую партию концентрированного материала фильтруют через Ра11 ЫГе 8с1епсек АсгоФкс с мембраной 0.22 мкм. 25 мм Мик(апд Е при скорости потока 2 мл/мин при комнатной температуре. Обе партии концентрированного материала объединяют в один пул.
Затем проводят спектральное сканирование на 10 мкл объединенного пула. разведенного в 700 мкл РВ8. на спектрофотометре Не\\'1е(( Раскагй 8453. Концентрация отфильтрованного материала равна 3.33 мг/мл. как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30008 г/моль и коэффициента экстинкции 36900 М-1 сш-1.Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8О8-РАОЕ (фиг. 27 А). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы С11аг1ек Вйег ЬаЬога(опек ЕпйокаГе-РТ8 кук(ет (чувствительность 0.05-5 Еи/мл) при 67-кратном разведении образца в РВ8. в результате получают <1 ЕИ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярное состояние) продукта. используя эксклюзионную хроматографию 50 мкг продукта. который вводят в колонку РНепотепех Вю 8ер 8ЕС 3000 (7.8x300 мм) В 50 мМ NаН2ΡΟ4. 250 мМ №С1. рН 6.9 при скорости потока 1 мл/мин. наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 27В). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0.05% трифторуксусной кислоты. 50% ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МАЕП1 плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть. а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег ЭЕ- ВР. снабженном азотным лазером (337 нм. 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют. используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 27Б) и экспериментально подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят при -80°С.
На фиг. 31В показано. что очищенный Бс-Ь10-8НК[2-35] эффективно блокирует ток в человеческом Кт1.3 (электрофизиологические исследования проводят. как описано в примере 36). Очищенный Бс-Ь108НК[2-35] также блокирует продуцирование 1Ь-2 (фиг. 64А и 64В) и 1Б№д (фиг. 65А и 65В) в человеческих клетках цельной крови. а также позитивную регуляцию СО40Б (фиг. 66А и 66В)и 1Б-2В (фиг. 67А и
- 84 013470
67В) на Т клетках.
Очистка Ес-Ь5-8ЕК(2-35).
Примерно 1 л кондиционированной среды наносят на колонку 5 мл АтегзЕат Н1Тгар Рго1ет А при скорости потока 5 мл/мин, при температуре 7°С и колонку промывают фосфатно-солевым буферным раствором без двухвалентных катионов (РВ8) по Дульбекко в количестве, равном нескольким объемам колонки, и образец элюируют, постепенно увеличивая количество глицина рН 3,0 до 100 мМ. Элюированный пул белка А (около 9 мл) объединяют с 450 мкл 1 М трис НС1 рН 8,5, а затем с 230 мкл 2 М уксусной кислоты и разводят до 50 мл водой. Материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр и наносят на колонку 5 мл АтегзЕат Н1Тгар 8Р-НР в 8-буфере А (20 мМ N84^0^ рН 7,0) при скорости потока 5 мл/мин и при температуре 7°С. Затем колонку промывают несколькими объемами колонки 8-буфером А и проявляют, используя линейный градиент от 0 до 75% 8буфера В (20 мМ N34^0^ 1 М рН 7,0) при скорости потока 5 мл/мин, затем постепенно доводят до 100% 8-буфера В при 7°С. Фракции затем анализируют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим 8Э8-РАСЕ с 4-20% трис-глицина, и фракции, содержащие заданный продукт, собирают, исходя из этих данных. Собранный материал затем концентрируют примерно до 5,5 мл на центрифужном ультрафильтре Ра11 ЫГе 8с1епсез Масгозер 10К 0теда. Концентрированный материал затем фильтруют через Ра11 ЫГе 8с1епсез Асгоб1зс с мембраной 0,22 мкм, 25 мм Миз1апд Е при скорости потока 2 мл/мин при комнатной температуре.
Затем проводят спектральное сканирование на 10 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 (фиг. 27С). Концентрация отфильтрованного материала равна 4,59 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 29750 г/моль и коэффициента экстинкции 36900 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ (фиг. 27С). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы СЕаг1ез К1уег ЬаЬогаФпез ЕпбозаГе-РТ8 зуз1ет (чувствительность 0.05-5 Еи/мл) при 92-кратном разведении образца в эндотоксин-специфическом буфере СЕаг1ез К1уег ЕпбоФхт 8рес|Пс ВиГГег ВС120, в результате получают <1 ЕИ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярное состояние) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 50 мкг продукта, который вводят в колонку РЕепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2Р04, 250 мМ №□, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 27Н). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МАЕШ плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре ^уадег ИЕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 271) и подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят при -80°С.
На фиг. 31С показано, что очищенный Ес-Ь5-8ЕК[2-35] является очень активным и блокирует человеческий Ку1.3, как определено электрофизиологическими методами с применением фиксированного пластыря с клетками цельной крови (см. пример 36).
Очистка Ес-Ь25-8ЕК(2-35). Примерно 1 л кондиционированной среды нагружают на колонку 5 мл АтегзЕат Н1Тгар Рго1ет А при скорости потока 5 мл/мин, при температуре 7°С и колонку промывают фосфатно-солевым буферным раствором без двухвалентных катионов (РВ8) по Дульбекко в количестве, равном нескольким объемам колонки, и образец элюируют, постепенно увеличивая количество глицина рН 3,0 до 100 мМ. Элюированный пул белка А (около 9,5 мл) объединяют со 119 мкл 3 М ацетата натрия, а затем разводят до 50 мл водой. Материал с корректированным рН наносят на колонку 5 мл АтегзЕат Н1Тгар 8Р-НР в 8-буфере А (20 мМ NаН2Р04, рН 7,0) при скорости потока 5 мл/мин и при температуре 7°С. Затем колонку промывают несколькими объемами колонки 8-буфером А и проявляют, используя линейный градиент от 0 до 75% 8-буфера В (20 мМ NаН2Р04, 1 М №С1, рН 7,0) при скорости потока 5 мл/мин, затем постепенно доводят до 100% 8-буфера В при 7°С. Фракции, содержащие продукт, соответствующий основному пику на хроматограмме, собирают и фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм.
Затем проводят спектральное сканирование на 20 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 (фиг. 271). Концентрация отфильтрованного материала равна 1,40 мг/мл, как определено с учетом вычисленной молекулярной массы 31011 г/моль и коэффициента экстинкции 36900 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ (фиг. 27Ό). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы СЕаг1ез К1уег ЬаЬогаФпез ЕпбозаГе-РТ8 зуз1ет (чувствительность 0,05-5 Еи/мл) при 28-кратном разведении образца в эндотоксин- специфическом буфере СЕаг1ез К1уег ЕпбоФхт 8ресШс ВиГГег ВС120, в результате получают <1 ЕИ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярное состояние) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 50 мкг
- 85 013470 продукта, который вводят в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ КаН2РО4, 250 мМ КаС1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 27К). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МАЬО1 плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег 1)Е- ВР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 27Ь) и подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят при -80°С.
Очищенный Рс-Ь25-8ЬК[2-35] ингибирует человеческий Ку1.3 с 1С50 ~150 пМ, как показывают электрофизиологические исследования с использованием электрофизиологического метода пэтч-кламп (открытия-закрытия, ра!сЬ с1атр) на цельных клетках НЕК293/Ку1.3 (пример 36).
Пример 3. Бактериальная экспрессия Рс-Ь-8ЬК[1-35].
Описание бактериальных векторов экспрессии пептидного антитела и методов клонирования и экспрессии пептидных антител. Клонирующий вектор, используемый для бактериальной экспрессии (примеры 3-30), основан на рАМО21 (впервые описан в патента США 2004/0044188). Его модифицируют таким образом, что компонент устойчивости к канамицину заменяют на компонент устойчивости к ампициллину, вырезая ДНК между уникальными В8!В1 и N811 сайтами вектора и заменяя соответствующим образом расщепленным ПЦР фрагментом, несущим ген β-лактамазы, с применением ПЦР праймеров ССА АСА САС ТТС ОАА АОА СОТ ТОА ТСО ОСА С (8Ε^ ΙΌ КО: 667) и САС ССА АСА АТО САТ ССТ ТАА ААА ААТ ТАС ОСС С (8Ε^ ΙΌ КО: 668) с рИС19 ДНК в качестве матричного источника гена β - лактамазы , сообщающего устойчивость к ампициллину . Новый вариант назван рАМО21атрВ.
Описание клонирующего вектора рАМО21атрВ-Ес-Рер, используемого в примерах 3-30, за исключением примеров 15 и 16. На фиг. 11А-С и 11Ό (схематическая диаграмма) показана дн(двухнитевая, двухцепочечная) ДНК, добавленная к основному вектору рАМО21атрВ, чтобы содействовать клонированию пептидных слияний по С-концу Рс гена. ДНК вводят между сайтами Ше1 и ВатН1 в векторе рАМО21атрВ. Эта целая область ДНК показана на фиг. 11А-С. Область, кодирующая Ес, тянется от нуклеотида (п!) 5134 до 5817, а белковая последовательность показана ниже ДНК последовательности. За ней в рамке считывания следует линкер 5^X5 (нуклеотиды (п!) 5818-5832). Сайт В8тВ1 (ОАОАСО) охватывает нуклеотиды (п!) 5834-5839. Расщепление ДНК происходит между нуклеотидами (п!) 5828 и 5829 на верхней цепи ДНК и между нуклеотидами 5832 и 5833 на нижней цепи ДНК. Расщепление создает показанные здесь липкие концы из 4 п.о. Подчеркнут сайт В8тВ1.
АООТСО ТССТТОАОАСО 5ΕΙ2 ΙΏ N0:683
ТССАССАССА АСТСТОС 5Е0 ΙΏ N0:684
Второй В8тВ1 сайт находится в области нуклеотидов (п!) 6643-6648; а именно СОТСТС. Расщепление ДНК происходит между п! 6650 и 6651 на верхней нити ДНК и между п! 6654 и 6655 на нижней нити.
СОТСТСТ ТААООАТССО 5Е<2 Ιϋ N0:685
ОСАСАСэААТТС СТАСОС
5Е0 ΙΟ N0:686
Между двумя сайтами В8тВ1 находится необязательная кассета устойчивости к хлорамфениколу, конститутивно экспрессирующая хлорамфеникол трансферазу (ген са!). Последовательность белка са!
1 ΜΕΚΚΙΤΟΥΤΤ УЭ130ИНККЕ НРЕАРОЗУАО СТУИОТУОЫ) 1ТАРЬКТУКК
51 ΝΚΗΚΡΥΡΑΡΙ ΗΙΕΑΚΕΜΝΑΗ ΡΕΡΚΜΑΜΚϋΘ ЕЬУЦлГОЗУНР СУТУГНЕфТЕ
101 ТРЗЗЬМЗЕУН ϋΏΡΚ.ζ)ΡΕΗΙΥ 3<2ПУАСУ<ЗЕЫ ΙΑΥΡΡΚΟΡΙΕ ИМРРУЗАИРМ
151 УЗЕТЗЕББИУ ΑΝΜϋΝΕΡΑΡν ΡΤΜΘΚΥΥΤζ)(3 ОКУБМРБАЮ УННАУСБОРН
201 УбКМШЕЬСО УСБЕМОССА //ЗЕО Ю N0:1337
показана на фиг. 11А-С и тянется от п! 5954 до 6610. Кодирующие пептид дуплексы в каждом примере (за исключением примеров 15 и 16) несут липкие концы, комплементарные концам, присутствующим в векторе.
Описание клонирующего вектора рАМО21атрВ-Рер-Ес, используемого в примерах 15 и 16. На фиг. 12А-С и схематической диаграмме на фиг. 12Ό показана последовательность б8(дн)-ДНК, которая добавлена к основному вектору рАМО21атрВ, чтобы способствовать клонированию слияний пептида по Νконцу Ес гена. ДНК вводят между уникальными сайтами Кбе1 и ВатН1 в векторе рАМО21атрВ. Область, кодирующая Ес, тянется от п! 5640 до 6309, а белковая последовательность показана ниже ДНК последовательности. Перед ней в рамке считывания следует линкер 5^X5 (нуклеотиды (п!) 5614-5628). Сайт В8тВ1 охватывает нуклеотиды (п!) 5138-5143: а именно ОАОАСО. Разрезание происходит между нуклеотидами (п!) 5132 и 5133 на верхней цепи ДНК и между нуклеотидами 5136 и 5137 на нижней цепи ДНК.
Расщепление создает показанные здесь липкие концы из 4 п.о. Подчеркнут сайт В8тВ1.
- 86 013470
ААТААСА ТАТСССАОАСО 3Εβ Ιϋ N0:687
ТТАТТСТАТАС ОСТСТОС
ЗЕ<2 Ю N0:688
Второй ВктВ1 сайт находится в области нуклеотидов (п!) 5607-5612; а именно СОТСТС. Разрезание ДНК происходит между п! 5613 и 5614 на верхней нити ДНК и между п! 5617 и 5618 на нижней нити.
сстстса сстсстсст
ССАСАСТССАС САССА
3Ε<2 ΙΌ N0:689
Между двумя сайтами ВктВ1 находится необязательная кассета устойчивости к зеоцину, конститутивно экспрессирующая белок 8Ыде11а Ые. Последовательность белка Ые
МАКЕТЗАУРУ ЕТАРГОУАСАУ ЕРЖЧЖЬСЕЗ ΚϋΓνΕΏϋΓΑΟ ννΚΌΏνΤΕΓΙ βΑνΟΌΟννΡΟ ЫТЬАШЖУКС ЕОЕЬУАЕВДЗЕ УУЗТИГКОАЗ ΟΡΑΜΤΕΙΟΕζ)
101 ΡΝΟΚΕΡΑΕΚΌ РАСЫСУНГУА ΕΕζ)ϋ //δΕζ> ΙΏ N0:1338 показана на фиг. 12А-С и тянется от п! 5217 до 5588. Кодирующие пептид дуплексы в примерах 15 и 16 несут липкие концы, комплементарные концам, присутствующим в векторе.
Описание клонирующего вектора рАМО21атрК-Рер-Рс, используемого в примерах 52 и 53. На фиг. 12Е-О показана последовательность бДднДДНК, которая добавлена к основному вектору рАМО21атрК, чтобы способствовать клонированию пептидных слияний по Ν-концу Рс гена, в котором первые два кодона пептида должны быть кодонами для те!-Ду. ДНК вводят между уникальными сайтами Хс1е1 и ВатН1 в векторе рАМО21атрР. Область, кодирующая Рс, тянется от п! 5632 до 6312, а белковая последовательность показана ниже ДНК последовательности. Перед ней в рамке считывания следует линкер д1уХ5 (нуклеотиды (п!) 5617-5631). Сайт ВктВ1 охватывает нуклеотиды (п!) 5141-5146, а именно ОАОАСО. Разрезание происходит между нуклеотидами (п!) 5135 и 5136 на верхней цепи ДНК и между нуклеотидами 5139 и 5140 на нижней цепи ДНК.
Расщепление создает показанные здесь липкие концы из 4 п.о. Подчеркнут сайт ВктВ1.
ААТААСАТАТ 666ТС6А6АС6 8ΕΩ Ю N0:1344
5Е<2 Ю N0:1343
ТТАТТбТАТАСССА 6СТСТ6С
5Е<2 Ю N0:1345
Второй сайт ВзшВ1 находится от п! 5607 до 5612; а именно СОТСТС. Разрезание происходит между п! 5613 и 5614 на верхней нити и между 5617 и 5618 на нижней нити.
СбТСТСА ббТббТббТ
6СА6А6ТССАС САССА
ЗЕО ΙΏ N0:1346
Между сайтами ВктВ1 находится необязательная кассета устойчивости к зеоцину, конститутивно экспрессирующая белок 8Ыде11а Ые. Показана последовательность белка Ые, описанная выше, от п! 52205591. Дуплексы, кодирующие пептиды в примерах 52 и 53, ниже в данном описании, несут липкие концы, комплементарные концам, представленным вектором.
В примерах 3-30, в которых все векторы являются векторами для бактериальной экспрессии, все клонированные пептидные последовательности получают в результате отжига оликонуклеотидов с образованием ДНК дуплекса, который непосредственно лигируют в подходящий вектор. Два олигонуклеотида достаточно для примера 20, во всех других примерах требуется четыре олигонуклеотида. Когда дуплекс нужно вводить по Ν-концу Рс (см. примеры 15, 16, 52 и 53 в данном описании), дизайн конструкции следующий, причем порядковые номера соответствуют перечисленным олиго в каждом примере
ΡίΓδί ОН до Зесопб ОНдо
ΤΑΤΘ-------------------------------------------------ССАС
ЕоигГП ОНдо ΤίιίΓά ОНдо
Подписи: первый олиго(нуклеотид), второй олиго(нуклеотид), четвертый олиго, третий олиго
Когда дуплекс нужно вводить по С-концу Рс (примеры 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13 и 30), дизайн следующий:
ΡίΓδΐ ОНдо Зесопс! ОНдо тест--------—---аттс
РоигГЬОНдо ΤίιίΜ ОНдо
Во всех остальных примерах дуплекс встраивают по С-концу Рс и применяют следующий дизайн:
- 87 013470
ΡίΓ5ί ОПдо Зесопс! ОПдо тест------------------------------------------------АТТС Εοιιγϊϊι ОНдо ТМгс101)до
Ни одному из олигонуклеотидов для фосфорилирования не требуется стадия обработки киназами. Успешная инсерция дуплекса приводит к замене необязательной кассеты устойчивости к антибиотику (устойчивости к зеоцину для рАМО21атрК-Рер-Бс и устойчивости к хлорамфениколу для рАМО21атрК-Ес-Рер). Результирующее изменение фенотипа используется для того, чтобы отличать рекомбинантный клон от нерекомбинантных клонов.
Ниже дается описание единого метода осуществления клонирования всех 30 экспрессируемых в бактериальных клетках рекомбинантных белков, приведенных в качестве примеров в данном описании. Только один набор олигонуклеотидов и вектор варьируется. Эти подробности приводятся ниже в каждом примере.
Олигонуклеотидный дуплекс, содержащий кодирующую область для данного пептида, образующийся отжигом олигонуклеотидов, перечисляемых в каждом примере. Десять пикомолей каждого олигонуклеотида смешивают в конечном объеме 10 мкл, содержащем 1Х буфера для лигирования вместе с 0,3 мкг соответствующего вектора, который заранее расщепляют рестриктазой В§шВ1. Смесь нагревают до 80°С и оставляют охлаждаться до комнатной температуры со скоростью 0,1°/с. Добавляют к этой смеси 10 мкл лигазного буфера 1Х плюс 400 единиц Т4 ДНК лигазы. Образец инкубируют при 14°С в течение 20 мин. Лигазу инактивируют, нагревая до 65°С в течение 10 мин. Добавляют 10 единиц рестриктазы В§шБ1, затем инкубируют при 55°С в течение 1 ч для расщепления реформированного исходного вектора. Добавляют 50 мкл химически компетентных клеток Е. сой и выдерживают при 2°С в течение 20 мин с последующим тепловым шоком 42°С в течение 5 с. Весь объем выращивают в планшетах на агаре Адаг в бульоне Луриа, дополненном карбенициллином 200 мкг/мл и инкубируют в течение ночи при 37 °С. Колонии проверяют на утрату устойчивости к заменяемому маркеру устойчивости к антибиотику. Для подтверждения предполагаемого размера инсерции дуплекса проводят стандартный ПЦР тест. Получают плазмидные препараты и рекомбинантную инсерцию (вставку) проверяют секвенированием ДНК. Поллитра культур конструкции с подтвержденной последовательностью выращивают в бульоне Террифик (Тегпйс), экспрессию пептидного антитела индуцируют, добавляя Ы-(3-оксогексаноил)гомосерин лактона в количестве 50 нг/мл, встряхивают в течение 4-6 ч при 37°С, клетки центрифугируют и клеточную пасту хранят при -20°С.
Ниже для каждого примера дается клонирующий вектор и набор олигонуклеотидов, применяемых для конструирования каждого слитого белка. Также показана карта ДНК/белок.
Бактериальная экспрессия Бс-й-8йК[1-35] ингибитора Ку1.3.
Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны выше. Вектор рАМО21атрК-Бс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Гс-Ь-8ЬК[1-35].
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса:
ТССТТССООТОСТСОТСОТТСССОТТССТОСАТСОАСАССАТ //ЗЕ<2 ΙΏ N0:669;
...
СТТАОСАССТАССОСАССТТТТАСООСАОААСОАСАОАСООТ / / ЗЕ<2 Ю N0:671;
АТТТСАТеОАСТСТТТССАСТССАААОСССТССААССОСАТТТССОСАТОСТеТССЗАТеСАОСААССЮ (ЗААССАССАССАССОСА //ЗЕ<2 Ιϋ N0:672;
Олигонуклеотидный дуплекс показан ниже
- 88 013470
ТССТТССОСТССТССТООТТССССТТССТССАТСОАСАССАТССССАААТССССТТОСАС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АСОССАССАССАССААСОССААСОАССТАОСТСТСОТАОООСТТТАСОССААСОТО
Θ 5ΘΟΟ<33Κ50ΙϋΤΙΡΚ3ΚΟΤСССТТТССАОТОСАААСАСТССАТОАААТАССбТСТСТССТТСТбССОТААААССТСССС
61---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 120 (ЗССАААССТСАССТТТСТСА6(ЗТАСТТТАТС<ЗСА6АСА6СААСАС66САТТТТС6АСССС
АРОСКНЗМКУКЬЗРСВКТССТАССТОС //5Εζ) ΙΌ N0:673
121------АТООАСОАТТС //3Εζ) ΙΌ N0:675
ТС - //ЗЕО Ю N0:674
Бактериальная экспрессия пептидного антитела описана в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии. Очистка экспрессируемого в бактериальных клетках Гс-Ь10-БИК(1-35) подробнее описана ниже в примере 38.
Пример 4. Бактериальная экспрессия Гс-Ь-БИК[2-35].
Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрВ-Гс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Гс-Ь-БИК[2-35].
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
ТСОТТССООТОбТССТеСТТССТССАТСОАСАССАТССССАААТСССОТТССАССССТТТССАСТССА ААСАСТССАТСАААТ //ЗЕО ΙΏ N0:676;
АССОТСТСТССТТСТССССТААААССтеСООТАССтеС //ЗЕО Ιϋ N0:677;
СТТАССАОСТАССОСАСеТТТТАСОбСАСААССАСАСАСССТАТТТСАТСОАОТОТТТССАСТеСААА ССОСТССААСООСА //ЗЕО Ιϋ N0:678;
ТТТССССАТССТСТССАТССАООААССАССАССАСССОА //5Εζ) Ιϋ N0:679;
Полученный олигонуклеотидный дуплекс показан ниже
ТССТТССОСТССТСОТССТТССТССАТССАСАССАТССССАААТСССОТТССАССССТТТ
1----------1----------н----------н----------н-----------1-----------н 60
АООССАССАССАССААССАСОТАССТСТСОТАСОССТТТАССОСААССТООССААА <330(3Ο(330ΙΌΤΙΡΚ3Β0ΤΑΕССАСТеСАААСАСТССАТСАААТАССОТСТеТССТТСТОСССТААААССТОСССТАССТС
61---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 120
ССТСАС<ЗТТТСТОАС6ТАСТТТАТеОСА(ЗАСАС6АА(ЗАССССАТТТтеСАСеССАТССАС
ССКНЗМКУВЬЗЕСВКТСОТС//ЗЕО Ιϋ N0:681
С //ЗЕО ΙΏ N0:680
121 СгАТТС //ЗЕО Ιϋ N0:682
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии. Очистка экспрессируемого в бактериальных клетках Гс-Ь10-БЬК(2-35) подробнее описана ниже в примере 39.
Пример 5. Бактериальная экспрессия Гс-Ь-НтК.
Бактериальная экспрессия Гс-Ь-НтК. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрВ-Гс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Гс-Ь-НтК.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 89 013470
СССООТТТССОААтеСАСССАСАТСССТТСССОТАССТССАТСАААТАССОТСТСААССТСТСССОТА
АААССТОСООТТССТСС 5Εζ) ΙΏ N0:692;
СТТАОСАООААССССАССТТТТАССССАСАСОТТСАОАССОТ //5Е<2 Ю N0:693;
4142-94
АТТТСАТООАООТАСОССААСООАТОТСООТОСАТТСООАААССБООАТСАОСТСТТТОСАСО
ТАСОСОААССАССАССАССОСА //ЗЕ<2 Ю N0:694
Полученный олигонуклеотидный дуплекс показан ниже
ТССТТССОСтеОТСбТССТТСССОТАССТССАААСАССТСАТСССББТТТССОААТССАС |-----------1-----------1----------4-----------+---------+ θθ
АБОССАССАССАССААССОСАТСОАСОТТТСТССАСТАСОСССАААОССТТАССТС
ОЗСОСОЗКТСКОЬТРУЗЕСТССАСАТСССТТССССТАССТССАТСАААТАСССТСТСААССтеТСССОТААААССТСССО
61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
ОСТеТАОССААСОССАТССАОеТАСТТТАТСССАбАСТТССАСАСООСАТТТТССАСОСС
ΟΙΒΟΒΤ3ΜΚΥΒΕΝΕΟΚΚΤΟΟ//8Εζ) ТО N0:696
ТТССТСС //ЗЕО ΙΏ N0:695
121------ААССАССАТТС //ЗЕ<2 Ю N0:697
С Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят. как описано в примере 3. а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 6. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-КТХ1.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-КТХ1. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рЛМΟ21ашрΚ-Εс-Ρер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Ес-Ь-КТХ1.
Олигонуклеотиды. применяемые для получения дуплекса. показаны ниже
ТООТТССССТСОТСОТСОТТСССОТОТТСАААТСААСОТТАААТОСТ //ЗЕ<2 ТО N0:698;
ССООТТССССОСАСТБССТОАААСССТССАААОАСеСТООТАТСССТТТСеОТАААТеСАТСААССОТ
АААТСССАСТССАСССССААА //5Е<2 Ю N0:699;
СТТАТТТССОООТССАОТСССАТТТАСООТТСАТССАТТТАССОААА / / 3Εζ) ΙΏ N0:700;
СОСАТАССАОСБТСТТТбСАСбСТТТСАОССАСТСЗСОСЗСЮААСССЮАССАТТТААССТТбАТТТСААС
АСССОААССАССАССАСССбА //3Εζ2 Ю N0:701;
Ниже показан полученный олигонуклеотидный дуплекс
ТОетТССОетОСТСОТаСТТССССТОТТОАААТСААСОТТАААТССТССОСТТССССОСА +---------+---------+.
АССССАССАССАССААССССАСААСТТТАСТТССААТТТАССАСеССААССбССеТ + 60
Θ3·6Θ003θνΕΙΝνΚ0303ΡΟ
121
СТОССТСАААСССТССАААСАСССТеСТАТбССТТТСССТАААТССАТСААСССТАААТС ---------+---------+---------+---------+----------+--------Г7 Γ'Γ'Γΐ’Λ ггпгпгпг’ст гчг’ттгпгчтг’гчлчтх /чг<7\ гггл пгч/-ч7< ά т гуг^г^т·. ттт-л лч/лптл пптт-л , , ахлпс ххх х х хсх ооолссп1пск7опллиссп.х х 1ЛС х х УлУлУ-АУ 1 х την + 120
ΟΕΚΡΟΚΟΑΟΜΒΕΟΚΟΜΝΒΚΟ
ССАСТССАСССССААА //ЗЕО ΙΏ N0:702
СОТОАССТССООСТТТАТТС //ЗЕ<2 ΙΌ N0:7 04 //ЗЕО Ιϋ N0:703
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят. как описано в примере 3. а паста хранится в замороженном состоянии.
Очистка и рефолдинг Ес-Ь-КТХ1. экспрессированного в бактериях.
Замороженную пасту Е. сой (28 г) смешивают с 210 мл комнатной температуры 50 мМ трис НС1. 5 мМ ЕНГА. рН 8.0 и вносят примерно в 0.1 мг/мл лизоцима куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12.000 Р81 (82.73 кПа). Затем
- 90 013470 клеточный лизат центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Затем пеллеты (4,8 г) растворяют в 48 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем растворенные пеллеты восстанавливают, добавляя 30 мкл 1 М дитиотреитола к 3 мл раствора и инкубируя при 37°С в течение 30 мин. Восстановленный раствор пеллет затем центрифугируют при 14000 д в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят 2,5 мл супернатанта в 250 буфера для рефолдинга (2 М мочевины, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 5 мМ ЕОЧА, 1 мМ цистамин НС1, 4 мМ цистеина, рН 8,5) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 2 дней при 4°С. Раствор после рефолдинга фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и хранят при 4°С в течение 3 дней.
Хранящийся рефолд (раствор после рефолдинга) разводят 1 л воды и рН доводят до 7,5 с помощью 1 М Н3РО4. Материал с корректированным рН нагружают на колонку 10 мл Атегзкат 8Р-НР Н1Чгар при скорости потока 10 мл/мин в 8-буфере А (20 мМ ^Н^РО^ рН 7,3) при 7°С. Затем колонку промывают 8-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют в линейном градиенте от 0 до 60% 8-буфера В (20 мМ ^ЩРО^ 1 М КаС1, рН 7,3), постепенно доводя до 100% 8буфера В при скорости потока 5 мл/мин при 7°С. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Н8-РАСЕ, и фракции, содержащие заданный продукт, собирают в соответствии с этими результатами (45 мл). Затем пул нагружают на колонку 1 мл Атегзкат тРто1ет А НИгер в РВ8 при скорости потока 2 мл/мин и температуре 7°С. Затем колонку промывают РВ8 в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют 100 мМ глицина рН 3,0. К элюенту с максимальным пиком (2,5 т1) добавляют 62,5 мкл 2 М трис основания, а затем материал с корректированным рН фильтруют через Ра11 Б1Ге 8с1епсез Асгоб1зс с мембраной 0,22 мкм, 25 мм Миз1апд Е при скорости потока 2 мл/мин и комнатной температуре.
Затем проводят спектральное сканирование на 20 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре 11е\\1еи Раскагб 8453 (фиг. 28С). Концентрация отфильтрованного материала равна 2,49 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30504 г/моль и коэффициента экстинкции 35410 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8О8-РАСЕ (фиг. 28А). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы Скаг1ез Втует ИаЬогаЮпез Еηбо8аГе-ΡΤ8 зуз!ет (чувствительность 0,05-5 Еи/мл) при 50-кратном разведении образца в эндотоксин-специфическом буфере Скаг1ез Втуетз Епбо1охт 8ресГтс ВиГГег ВС120, в результате получают <1 Еи/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 45 мкг продукта, который вводят в колонку Ркепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ ЖЩРО^ 250 мМ КаС1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 28В). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на 1 мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МА 1,1)1 плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Сохацег ОЕ-ВР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 281)), и результаты подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят при -80°С.
Очищенный Бс-^-ΚΤXί блокирует ток человеческого Ку1.3 в зависимости от дозы (фиг. 32А и 32В), как определено электрофизиологическими методами (метод описан в примере 36).
Пример 7. Бактериальная экспрессия Ρ^Π^δΊ^ί.
Бактериальная экспрессия Бс-^-НзΤxί. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрВ-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Бс-^-НзΤxί.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТООТТССООТООТССТССТТССССТТССТОССОТАССССОАААСАС //3Εβ ΙΌ N0:705;
ТССССТСАСССОТСССОТАААОА?АССОСТТССССОТАСО(ЗТАААТОСАтеААСССТАААТОСАААТС СААСССТТОС //ЗЕО ΙΏ N0:706;
СТТАССААССОТТОСАТТТССАТТТАСОбТТСАТОСАТТТАССеТАСО //ЗЕО ΙΌ N0:707; ОССААССеСТТТСТТТАСОССАСОСОТСАеСССАСТСТТТСОСОбТАСООСАООААССООААССАССА ССАССООА //3Εζ) Ιϋ N0:708;
Ниже показан полученный олигонуклеотидный дуплекс
- 91 013470
ТебТТССССТСОТСаТССТТССССТТССТЕСССТАССССеАААСАСТСС’ССТбАССССТС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АООССАССАССАССААОССОААООАСОССАТСОООСТТТСТОАСОСОАСТООССАС ОЗОСООЗАЗСК ТРК ОСАПРССССТАААОАААСССОТТОСССОТАСССТАААТОСАТОААССОТАААТОСАААТОСААССО —— -------1----------—ί--------- —I------------1------------ί----—------ί- 120
ОССАТТТСТТТСОССААСООССАТСССАТТТАССТАСТТСССАТТТАССТТТАСОТТООС ККЕТССРУСКСМЫККСКСЫКТТСС 5Εζ) Ю N0:709
121.----124
ААССАТТС 3Εζ) ГО N0:711
С - 5Е<2 ΙΌ N0:710
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 8. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-МдТх.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-МдТх. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Ес-Ь-МдТх.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТОСТТССООТОСТСОТООТТССАССАТСАТСААССТТАААТССАССТС / / 3Εζ) ГО N0:712;
СССОАААСАСТСССТСССССССТССАААОСТСАбТТСОеТСАСТССССТеСТбСТАААТОСАТОААСС СТАААТОСАААТССТАСССССАС //ЗЕО ΙΏ N0:713;
СТТАОТССОООТАССАТТТОСАТТТАССОТТСАтеСАТТТАССАССАО //5Е<2 ГО N0:714;
СССАСТСАСССААСТСАОСТТТССАСООСООСАСЮСАСТСТТТСОССОАООТОСАТТТААССТТСАТО АТООТООААССАССАССАССООА //ЗЕО ГО N0:715;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования приведенного ниже дуплекса
ТСОТТСССетОСТССТООТТССАССАТСАТСААСОТТАААТОСАССТСССССАААСАОТС
1---------+---------+------:---+---------+---------+---------+ 60
АОСССАССАССАССААООТООТАОТАеТТССААТТТАССТССАООООСТТТСТСАС
Ο3ΟΟΟΟ5ΤΙΙΝνΚΟΤ3ΡΚ00ССТСССОСССТССАААОСТСАОТТСОСТСАОТССОСТООТОСТАААТОСАТСААСООТАА
61---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 120
ООАСбОСбОСАСОТТТССАОТСААОССАОТСАООССАССАСОАТТТАСОТАСТТСССАТТ
Ι/ΡΡ0 ΚΑζ)Γ(3ζ)8ΑΟΑΚΟΜΝ(3ΚАТССАААТССТАСССОСАС 5Е0 ТО N0:716
121---------+--------ТАСОТТТАСОАТООЗССТОАТТС ЗЕО ГО N0:718
С К С Υ Р Н - 5Е<2 ТО N0:717
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 9. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-АдТх2.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-АдТх2. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3, Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Ес-Ь-АдТх2.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 92 013470
ТССТТССССТССТОСТООТТСССОТОТТССОАТСААСОТТТССТССАССССТ //3Εζ) ТО
N0:719;
ТССССОСАОТОСАТСАААССОТССАААСАСССТООТАТОССТТТСООТАААТССАТОААССОТАААТО ССАСТОСАСССССААА //ЗЕО ТО N0:720;
СТТАТТТССООСТССАСТСССАТТТАСССТТСАТССАТТТАССОАААСОСАТА //5Е0 ТО N0:721;
ССАСССТСТТТССАСОСТТТбАТОСАСТбСесеОААСССОТССАеОАААСОТТСАТСООААСАССеСА
АССАССАССАССОСА //ЗЕО ТО N0:722;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования приведенного ниже дуплекса
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Рефолдинг и очистка Рс-Ь-АдТх2, экспрессированного в бактериях. Замороженную пасту Е. со11 (15 г) смешивают со 120 мл раствора комнатной температуры, содержащего 50 мМ трис НС1, 5 мМ РОТА, рН 8,0, и вносят примерно в 0,1 мг/мл лизоцима куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12000 Р8Х (82,73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Затем пеллеты (4,6 г) растворяют в 48 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем растворенные пеллеты восстанавливают, добавляя 30 мкл 1 М дитиотреитола к 3 мл раствора и инкубируя при 37°С в течение 30 мин. Восстановленный раствор пеллет затем центрифугируют при 14000 д в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят 2,5 мл супернатанта в 250 буфера для рефолдинга (2 М мочевины, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 5 мМ РОТА, 1 мМ цистамин НС1, 4 мМ цистеина, рН 9,5 (8,5)) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 2 дней при 4°С. Раствор после рефолдинга фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и хранят при -70°С.
Хранящийся рефолд (раствор после рефолдинга) размораживают, а затем разводят 1 л воды и рН доводят до 7,5 с помощью 1 М Н3РО4. Материал с корректированным рН нагружают на колонку 10 мл АтегзИат 8Р-НР Н1Тгар при скорости потока 10 мл/мин в 8-буфере А (20 мМ №Н2РО4, рН 7,3) при 7°С. Затем колонку промывают 8-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют в линейном градиенте от 0 до 60% 8-буфера В (20 мМ №Н2РО4, 1 М №С1, рН 7,3), постепенно доводя до 100% 8-буфера В при скорости потока 5 мл/мин при 7°С. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8О8-РАОЕ, и фракции, содержащие заданный продукт, собирают в соответствии с этими результатами (15 мл). Затем пул нагружают на колонку 1 мл АтегзИат гРго!еш А Н1Тгар в РВ8 при скорости потока 2 мл/мин и температуре 7°С. Затем колонку промывают 20 мМ NаН2РО4 рН 6,5, 1 М NаС1 в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют 100 мМ глицина рН 3,0. К элюенту с максимальным пиком (1,5 т1) добавляют 70 мкл 1 М трис НС1 рН 8,5, а затем материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм.
Затем проводят спектральное сканирование на 20 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре 11е\\-|еИ Раскагб 8453 (фиг. 29С). Концентрация отфильтрованного материала равна 1,65 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30446 г/моль и коэффициента
- 93 013470 экстинкции 35410 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 808-РАСЕ (фиг. 29А). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы СЕаг1ез К1уег БаЬогаГойез ЕпбозаГе-РТ8 зузГеш (чувствительность 0,05-5 Еи/мл) при 33-кратном разведении образца в эндотоксин-специфическом буфере СЕаг1ез К!уегз ЕпбоГохш 8рес1йс ВиГГег ВС120, в результате получают <4 Еи/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 20 мкг продукта, который вводят в колонку РЕепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2Р04, 250 мМ МС!, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 290). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на 1 мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МЕЛ 1,0! плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег ОЕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 29Е), и результаты подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят при -80°С.
Пример 10. Бактериальная экспрессия Рс-Ь-08К1.
Бактериальная экспрессия 1’с-1,-08К1. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Рс-Б-08К1.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
ТСбТТССССТеСТССТССТТССССТСЛЧАТСАТСААССТТАААТОСААААТСТССССТСАОТОССТСС ААСССТССААААААС //ЗЕ<2 ТО N0:726;
СТСОТАТОССТТТСООТАААТОСАТСААССОТАААТСССАСТОСАССССОААА //3Εζ) ТО N0:727;
СТТАТТТССЮСЮТССАСТСОСАТТТАССОТТСАТОСАТТТАССОАААСОСАТАССАОСТТТТТТбСАС ССТТССАОССАСТОА //3Εζ) ТО N0:728;
СОССАСАТТТТССАТТТААССТТСАТОАТААСАССОСААССАССАССАСССеА //5Ε^ ТО N0:729;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТбСТТССебТеСТбСТОеТТССбОТСТТАТСАТСААССТТАААТССААААТСТСССОТСА
----------1-----------1-----------1-----------1------------1------------1- §0
АССССАССАССАССААСеССАСААТАОТАОТТеСААТТТАСеТТТТАбАОСССАСТ <33ΟΟΟΟ3θνΐΙΝνΚ0ΚΙ3Β.0СТСССТССААССаТССААААААССТеСТАТСССТТТСССТАААТеСАТСААСССТАААТС
У ---------1-----------1-----------1------------ -|-----------1-------------)- 120
САССОАССТТОССАССТТТТТТССАССАТАСССАААСССАТТТАССТАСТТСССАТТТАС
СЬЕРСККАСМКГОКСМЫСКСССАСТССАСССССААА ЗЕ<2 ТО N0:73 0
121---------+-----СОТСАССТСОСССТТТАТТС ЗЕО ТО N0:732
Н С Т Р К - ЗЕО ТО N0:731
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии. Очистка 1'с-1,10-08К1 из пасты Е. со11 подробнее описана ниже в примере 40.
Пример 11. Бактериальная экспрессия Рс-Б-08К1(Е16К, К20О).
Бактериальная экспрессия Рс-Б-08К1(Е16К, К20О). Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях Ес-Б-08К1(Е16К, Ε20Ώ).
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 94 013470
ТОСТТСССОТССТСОТОСТТСССОТСТТАТСАТСААСОТТАААТССААААТСТССССТСАОТОССТОА ААССОТССАААОАСО / /5Εζ} ГО N0:733;
СТСОТАТеССТТТСССТАААТССАТ&ААСОаТАААТСССАСТССАССССОААА //ЗЕО ГО
N0:734;
СТТАТТТССОООТССАОТСОСАТТТАСССТТСАТОСАТТТАССОАААСОСАТАССАОСОТСТТТОСАС ООТТТСАООСАСТСА //ЗЕО ГО N0:735;
СОСЮАСАТТТТССАТТТААСбТТСАТеАТААСАССССААССАССАССАССССА //ЗЕ(2 ГО N0:736;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТССТТСССОТСОтеСТССТТСССОТОТТАТСАТСААССТТАААТССААААТСТСССОТСА
1----------1-----------1-----------1-----------1------------1-----------1- 60
АССССАССАССАССААССССАСААТАСТАСТТОСААТТТАССТТТТАбАеоеСАбТ (33ΟΟ(3Ο3θνΐΙΝνΚΟΚΙ3Κ0бТСССТеАААСССТССАААСАСССТбСТАТСССТТТСССТАААТОСАТСААСОСТАААТС
61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
САССОАСТТТООСАСОТТТСТОСеАССАТАСОСАААСССАТТТАСОТАСТТСССАТТТАС
СЬКРСКЦАОМКГОКСМЫСКС ССАСТССАССССОААА ЗЕ<2 ГО N0:737
121---------+-----ОСТОАСОТСОСОСТТТАТТС 3Εζ) ГО N0:739
Н С Т Р К - 3Εζ) ΙΌ N0:738
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 12. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-ануротоксина.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-ануротоксина. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Ьануротоксина в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
ТССТТССССТССТаСТССТТССАААСААТССАССССТССССАССАСТеСАССААСТТСТОСССТАААААСАААТССАСССАСС //ЗЕО ГО N0:740;
СТАААТССАТОААССОТАААТОСАААТССТТСААСТССААА / / ЗЕ<2 ГО N0:741;
СТТАТТТОСАСТТеААССАТТТССАТТТАСССТТСАТССАТТТАСССТССеТССАТТТСТТТТТАССС САСААОТТОСТОСАС //ЗЕф ГО N0:742;
ТССТССООАССООТССАТТСТТТОСААССАССАССАССООА //ЗЕО ГО N0:743;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТОСТТССССТССТССТООТТССАААОААТССАСССОТССОСАОСАСТССАССААСТТСТС
1---------+---------+---------+---------+---------++ 60
АСЮССАССАССАССААОСТТТСТТАССТСОССАеСССТССТОАСОТОСТТСААСАС
СЗОСОСЗКЕСТОРОНСТЦРССССТАААААСАААТССАСССАСССТАААТССАТСААСССТАААТбСАААТбСТТСААСТС
61----------1------—----1-----------1--------------1------------1ь 120
СССАТТТТТОТТТАСеТООСТОССАТТТАСеТАСТтеССАТТТАССТТТАССААСТтеАС
ΚΚΝΚΟΤΗΟΚΟΜΝΚΚΟΚΟΕΝΟСААА ЗЕ<2 ГО N0:744
121---ОТТТАТТС 5Е<2 ГО N0:746
К - ЗЕ<2 ГО N0:745
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 13. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-ноксиустоксина.
- 95 013470
Бактериальная экспрессия Бс-Ь-ноксиустоксина или Бс-1,-\ ГХ. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМОЗЫтрВ-Бс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Бс-Ь^ТХ в бактериях.
Олигонуклеотиды. применяемые для получения дуплекса. показаны ниже
ТОСТТСССаТОСТОСТСОТТССАССАТСАТСААСОТТАААТССАССТСССССАААСАОТОСТССАААС ССТОСАААОААСТОТ //5Εζ) ΙΌ N0:747;
АСОСТТССТССССТСОТССТАААТОСАТСААСССТАААТОСАААТССТАСААСААС //ЗЕ<2 ΙΌ
N0:748;
СТТАСТТСТТОТАОСАТТТССАТТТАСССТТСАТССАТТТАОСАССАСССЮАСЮААСССТАСАОТТСТ ТТССАССОТТТОСАС //5Εβ ΙΏ N0:749;
САСТСТТТСССЮСАООТОСАТТТААСОТТОАТОАТОСТССААССАССАССАССССА / / 5Εζ) Ιϋ N0:750;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТСЮТТССССТОСТОСТСЮТТССАССАТСАТСААСбТТАААТССАССТССССОАААСАСТС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 50
АССССАССАССАССААОСТООТАОТАСТТОСААТТТАСОТССАСОСОСТТТСТСАС
Ο3ΟΟΟ63ΤΙΙΝνΚ0Τ3ΡΚ00СТССАААСССтеСАААСААСТСТАСОСТТССТССССТССТОСТАААТССАТСААСССТАА
----------1-----------1-----------1-----------1----------—I------------1- 120
ОАСОТТТСССАССТТТСТТОАСАТСССААСОАОССОАССАССАТТТАССТАСТТОССАТТ
ЗКРСКЕЬУОЗЗАОАКСМИОКАТССАААТОСТАСААСААС ЗЕ<2 Ιϋ N0:751
121---------+--------ТАССТТТАССАТбТтеТТОАТТС ЗЕ<2 ΙΏ N0:753
С К С Υ N N - 5Е<2 ГО N0:752
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят. как описано в примере 3. а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 14. Бактериальная экспрессия Бс-Ь-Р12.
Бактериальная экспрессия Бс-Ь-Р12. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор ρАМΟ21ашρΒ-Бс-Ρеρ и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Бс-Ь-Р12 в бактериях.
Олигонуклеотиды. применяемые для получения дуплекса. показаны ниже ТССТТССССТССТССТССТТССАССАТСТССТССАССААСССС //ЗЕО ГО N0:754;
АААСАСТССТАСССССАСТ6САААААА(ЗАААССеСТТАСССеААСеСТАААТ6САТ6ААСССТАААТС САААТОСТТСССТССТ //5Е0 ГО N0:755;
СТТААССАСССААОСАТТТССАТТТАСОСТТСАТОСАТТТАССО //5Е<2 Ιϋ N0:756;
ТТССССТААССООТТТСТТТТТТОСАОТССОССТАССАСТСТТТСОССТТОаТССАООАаАТСОТСОА АССАССАССАССОСА / / 3Εζ) Ιϋ N0:757;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
- 96 013470
ТССТТСССОТССТСОТСЮТТССАССАТСТССтеСАССААСССОАААСАОТССТАСССОСА
1---------+---------+---------+---------+---------+
АООССАССАССАССААССТССТАСАОСАССТССТТССССТТТОТСАССАТСООСеТ
СЗОССОЗТ13СТЫРК0СУРНСТССААААААОАААССССТТАСССОААСССТАААТССАТОААССОТАААТОСАААТССТТ
61---------+---------+---------+---------+----------++ 120
ОАСОТТТТТТСТТТСОССААТОСОСТТСССАТТТАСОТАСТТСОСАТТТАССТТТАСОАА
СККЕТСУРЫАКСМЫККСКСЕССОТСОТ 3Εβ ΙΌ N0:758
121 '
СССАССААТТС ЗЕ<0 Ш N0:760 <3 К - ЗЕ<2 ΙΏ N0:759
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 15. Бактериальная экспрессия 8кК[1-35]-Ь-Ес.
Бактериальная экспрессия 8кК[1-35]-Ь-Ес. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии 8кК[1-35]-Ь-Ес в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТАТССОТТСТТОТАТТОАТАСТАТТССААААТСТСОТТОТАСТОСТТТТСААТСТАААСАТТСТАТОА ААТАТСОТСТТТСТТ //ГО N0:761;
ТТТОТСОТААААСТТСТеСТАСТТОТТСтееТООТСОтеОТТСТ //5Εζ) ГО N0:762;
САССАОААССАССАССАССАОААСААОТАССАСААСТТТТАССАСАААААОАААСАСОАТАТТТСАТА ОААТОТТТАСАТТОА //ЗЕО ГО N0:763;.
АААОСАСТАСААСОАОАТТТТОСААТАОТАТСААТАСААСААСО //ЗЕО ГО N0:764;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТАТОСОТТСТТСТАТТОАТАСТАТТССААААТСТССТТОТАСТОСТТТТСААТОТАААСА у---------+---------+---------+---------+----------+
ОСААСААСАТААСТАТбАТААСЗСЗТТТТАОАОСААСАТСАССААААСТТАСАТТТСТ
МК8С1ОТ1РКЗКСТАЕ0СКНТТСТАТОАААТАТСОТСТТТСТТТТТСТСОТААААСТТСТОСТАСТТОТТСТСетООТеО
61---------+----------1----------+---------+----------+
120
ААОАТАСТТТАТАОСАСАААОАААААСАОСАТТТТСААСАССАТСААСААОАССАССАСС
ЗМКУКЬЗЕСККТСОТСЗОССТСОТТСТ ЗЕО Ιϋ N0:765
121-------127
АССААСАССАС 8Εζ) ГО N0:767
С 3 - 8Εζ) ГО N0:766
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии. Очистку тек-8кК[1-35]-Ес проводят, как описано ниже в примере 51.
Пример 16. Бактериальная экспрессия 8кК[2-35]-Ь-Ес.
Бактериальная экспрессия 8кК[2-35]-Ь-Ес. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии 8кК[2-35]-Ь-Ес в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 97 013470
ТАТОТСТТСТАТТСАТАСТАТТССААААТСТССТТОТАСТОСТТТТС.ААТОТАААСАТТСТАТОАААТ АТССТСТТТСТТ //ЗЕО ГО N0:768;
ТТТОТССТААААСТТСТООТАСТТОТТСТОСТООТООТОеТТСТ //ЗЕО ГО N0:769;
САССАСААССАССАССАССАОААСААОТАССАСААСТТТТАСОАСАААААСАААОАСОАТАТТТСАТА ОААТСТТТАСАТТСА //ЗЕО ГО N0:770;
АААОСАОТАСААСОАОАТТТТОСААТАОТАТСААТАСААОА ЗЕО ГО N0:771;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса ТАТСТСТТОТАТТОАТАСТАТТССААААТСТСОТТОТАСТОСТТТТСААТОТАААСАТТС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АОААСАТААСТАТСАТААООТТТТАОАОСААСАТОАСОААААОТТАСАТТТСТААО
МЗС1ОТ1РКЗКСТАР0СКНЗТАТОАААТАТСОТСТТТСТТТТТСТСОТААААСТТОТООТАСТТОТТСТССТСОТООТСО
61---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 120
АТАСТТТАТАССАСАААОАААААСАОСАТТТТСААСАССАТСААСААаАССАССАССАСС
МКУНЬЗРСККТСОТСЗСОООТТСТ ЗЕО ГО N0:772
121---ААОАССАС ЗЕО ГО N0:774
- ЗЕО ГО N0:773
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии. Очистку δ1ιΐ4|2-35|-1Α проводят, как описано ниже в примере 50.
Пример 17. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-СЬТх.
Бактериальная экспрессия Ес-Е-СИТх. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Е-СИТх в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
ТООТТССООТООТООТООТТСССАОТТСАССААСОТТ //ЗЕО ГО N0:775;
•ТССТССАССАССТССАААОААТОСТООТССОТТТСССАОСОТСтеСАСААСАССТСССОТООТАААТС САТСААСААААААТСССОТТССТАСТСС //ЗЕО ГО N0:776;
СТТАООАОТАОСААСООСАТТТТТтеТТСАТОСАТТТА //ЗЕО ГО N0:777;
ССАССССАССТОТТОТОСАСАСССТООСАААСОСАССАССАТТСТТТООАОСТССТССАСОАААССТТ СОТСААСТСООААССАССАССАССССА //ЗЕО ГО N0:778;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТСОТТССООТООТООТОСТТСССАСТТСАССААССТТТССТ(ЗСАССАССТССАААОААТС
1---------+---------+---------+---------+---------++ 60
АСОССАССАССАССААОООТСААОТССТТОСАААООАСОТООТООАООТТТСТТАС
ОЗООСОЗОГТЦУЗСТТЗКЕССТООТСССТТТеССАСССТСТССАСААСАССТССССТОСТАААТССАТСААСААААААТС
61---------+---------+---------+---------+---------+
ОАССАООСАААСОСТСОСАСАСОТСТТОТСОАООССАССАТТТАСОТАСТТСТТТТТТАС
МЗУСОКЬНЫТЗКСКСМЫККСССОТТССТАСТСС ЗЕО Ιϋ N0:779
121+- —
ООСААССАТОАООАТТС ЗЕО ГО N0:781
К С Υ 3 - ЗЕО ГО N0:780
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 18. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-МТХ.
Бактериальная экспрессия Ес-Е-МТХ. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМС21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Ь-МТХ в бактериях.
- 98 013470
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТОСТТССОСТССТООТОСТТССОТТТССТОСАССОСТ //ЗЕО ГО N0:782;
ТССАААОАСТОСТАСОСТССОТСССОТАААСАСАСССЗСТТОСССОААСССТАААТОСАТСААСАААТС СТССАААТОСТАССОТТОС //БЕ<2 ГО N0:783; .
СТТАОСААССОТАОСАТТТССАСОАТТТБТТСАТССАТ //ЗЕО ΙΏ N0:784;
ТТАСССТТСССССААССССТСТОТТТАСООСАСООАеСОТАОСАеТСТТТОСААССООТОСАОСАААС СОААССАССАССАССООА //8Е0 ГО N0:785;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса:
ТССТТССССТОСТССТССТТССОТТТССТССАССОСТТССАААОАСТОСТАСССТСССТС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АОСС САС САС ОАО СЛАБОСАААСОАСОТСОССААООТТТСТОАССАТОСОАСССАС
О5,ООООЗУ5СТО5КОСУАРССССТАААСАСАССССТТСССССААСССТАААТССАТСААСАААТССТОСАААТССТАССС
61---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 120
ООСАТТТСТСТООССААСОСОСТТОСОАТТТАСОТАОТТСТТТАСОАСОТТТАССАТОСС
КК0ТОСРЫАКС1ЫКБСКС УОТТОС 5Е<2 ГО N0:78 6
121---ААСОАТТС БЕ<2 ГО N0:788
С - 2Εζ) ГО N0:787
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 19. Бактериальная экспрессия Ес-к-С11Тх(1<321·').
Бактериальная экспрессия Εс-^-СИТx(Κ32Β). Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21ашрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Εс-^-СИТx(Κ32Β) в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
ТООТТСССОТОСтеОТСОТТСССАСТТСАССААСОТТТССТС //5Εζ) ГО N0:789;
САССАССТССАААОААТеСТееТССОТТтеССАССОТСТОСАСААСАССТСССОТСЮТАААТОСАТСА АСАААЗААТОССОТТОСТАСТСС //3Εζ) ГО N0:790;
СТТАССАОТАССААСООСАТТСТТТОТТСАТОСАТТТАССАСО //БЕО ГО N0:791;
ОеАООтеТТСТССАОАСССТОССАААСССАССАССАТТСТТТССАбОтеОТОСАОеАААСеттеОТОА АСТСООААССАССАССАССОСА //БЕО ГО N0:792;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТСбТТССООТСОТеСТССТТСССАаТТСАССААССТТТССТССАССАССТССАААСААТО
1---------+---------+---------+---------+---------++ 60
АССССАССАССАССААООСТСААСТООТТССАААООАСОТООТСОАСОТТТСТТАС
ОЗСОСОЗСЕТЫУЗСТТЗКЕССТСОТССОТТТОССАССОТСТССАСААСАССТССССТееТАААТССАТОААСАААСААТО
51---------+---------+---------+---------+----------++ 120
САССАСССАААСеСТСОСАОАСОТСТТСТССАССССАССАТТТАССТАСТТСТТТСТТАС
ЭДЗУСОКЬНМТЗКОКСМЫКЕССС0ТТ6СТАСТСС ЗЕ£) ТО N0:793
121+ —
ООСААССАТОАООАТТС ЗЕ<2 ТО N0:795
К С Υ 3 - 3Εζ) ТО N0:794
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 20. Бактериальная экспрессия Ес-Б-апамина.
- 99 013470
Бактериальная экспрессия Ес-Б-апамина. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Б-апамина в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТОСТТССОСТООТСОТООТТССТССААСТОСАААОСТССОСАААССССТСТОТОСССТСОТССТТОСС АОСАОСАССОТ //ЗЕО ΙΟ N0:796;
СТТААССОТОСТССТООСААСОАСОАОСОСАСАОАОСОЗТТТССООАОСТТТССАОТТОСАОЗААССА ССАССАССООА //ЗЕО Ю N0:797;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса ТООТТССОСТООТООТОСТТССТЗСААСТОСАААОСТССООАААССОСТСТОТОСОСТСО
1---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 60
АОСССАССАССАССААОСАСОТТОАССТТТСОАООССТТТООСОАОАСАСеСОАОС
ОЗООООЗСЫСКАРЕТАЬСАКТСОТТОССАОСАОСАСООТ ΟΕζ) Ю N0:798
61---------+--------АССААСООТСОТСОТОССААТТС 3Ες ΙΟ N0:800
К С 0 0 Η С - ΞΕζ) ΙΌ N0:799 .
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 21. Бактериальная экспрессия Ес-Б-сциллатоксина.
Бактериальная экспрессия Ес-Б-сциллатоксина или Рс-Б-8суТх. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМΘ21ашрΚ-Бс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Рс-Б-8суТх в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже теОТТСССОТООТеОТООТТССОСТТТСТОСААССтесе //3Εζ) ΙΏ N0:801;
ТАТОТОССАССТОТССТССССТТСССТОСОТСТССТОаОТАААТОСАТСООТСАСАААТОСОААТОСО ТТАААСАС //3Εζ) ΙΏ N0:802;
СТТАОТОТТТААСОСАТТСССАТТТСТСАСССАТССАТТТ //ЗЕ<2 ΙΌ N0:803;
АСССАССАСАСССАСОСААССОСАООАСАОСТСОСАСАТАСОСАООТТОСАСАААОСОСААССАССАС САССООА //ЗЕО ТО N0:804;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТССТТСССОТООТОСТЗОТТССЗСТТТСТССААССТОССТАТОТОССАССТСТССТОССС |-----------|- —----------1-----------1-----------1 - —---------1- 20
АОЗССАССАССАССААООСОАААСАСОТТССАСОСАТАСАСЗСТССАСАаОАСООС
05000. О5АРСИЬКМС0ЬЗСЕТТСССТОООТСТОСТОСОТАААТОСАТССОТОАСАААТОСОААТОССТТАААСАС 5Εζ) ΙΏ
N0:805
ААСООАСССАОАССАСССАТТТАСОТАОССАСТОТТТАСОСТТАСОСААТТТОТОАТТС 8Εζ)
ΙΏ N0:807
5ЬОЬЬОКС1ССКСЕСУКН - 5Е0 Ю N0:806
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 22. Бактериальная экспрессия Рс-Б-1ЬТх.
Бактериальная экспрессия Ес-БЛЬТх. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Ве1сгор рАМΘ21ашрΚ-Рс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-БЛЬТх в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 100 013470
ТООТТССОСТОСТОСТООТТСССАОТТСАССОАСОТТОАСТССТСССТ //ЗЕО ΤΌ N0:808;
ТТССАААОААТОСТОСТСССТТТОСАААОАССТОТТСССТСТТСАСССТССТАААТССАТССОТАААА
ААТССССТТОСТАССАС / / 5Е& ТО N0:809;
СТТАСТООТАССААСОССАТТТТТТАСССАТОСАТТТАССАСООТСАА //3Εζ) ΙΌ N0:810;
САССОААСАООТСТТТОСАААСООАССАОСАТТСТТТООАААССОАССАСТСААСОТССОТСААСТСО
СААССАССАССАССОСА //ЗЕО ТО N0:811;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТССТТССССтеСТветССТТСССАСТТСАССОАСОТТеАСТеСТСССТТТССАААСАА.ТС
- — 4-----------1-----------1-----------4-----------4-----------μ 50
АООССАССАССАССААОеСТСААОТеОСТбСААСТСАСеАСХЗСАААССТТТСТТАС
СЗССООЗОГТОУОСЗУЗКЕССТСОТСССТТТОСАААОАССТОТТСОСТбТТСАСССТССТАААТОСАТОООТААААААТС
61----------1-----------1-----------1-----------1-----------1----------- +
120
САССАСССАААССТТТСТеСАСААСССАСААСТСССАССАТТТАССТАСССАТТТТТТАС
МЗУСКПЬЕбУПКОКСМСККСССОТТОСТАССАС 5Εζ) Ιϋ N0:812
121 ----------+ -СССААССАТССТСАТТС ΞΕζ) Ю N0:814
К С Υ 0 - 5Е<2 ΙΌ N0:813
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 23. Бактериальная экспрессия Рс-Ь-НаТх1.
Бактериальная экспрессия Рс-Ь-НаТх1. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрК-Рс-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Рс-Ь-НаТх1 в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТООТТССООТСОТООТООТТССОААТСССОТТАССТОТТСООТСОТТС //ЗЕО ТО N0:815;
СААААССАССТСССАСТОСТССАААСАССТСООТТОСАААТТСССТОАСАААТАСТОСОСТТССОАСТ ТСАССТТСТСС //3ΕΩ ТО N0:816;
СТТАООАОААОСТОААОТСССААОСОСАОТАТТТОТСАСОСААТТтеС //ЗЕО ТО N0:817;
- ААСССАООТОТТТССАССАОТССОАОСТОСТТТТОСААССАССОААСАОСТААСООСАТТСООААССА ССАССАССООА //5Εζ) Ιϋ N0:818;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТООТТССООТОСТОСТСОТТССОААТОССОТТАССТСТТССОТСОТТОСААААССАССТС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АССССАССАССАССААООСТТАССОСААТОСАСААОССАССААСОТТТТСОТСОАО
СЗОСОСЗЕСКУЬЕООСКТТБСбАСТССТССАААСАССТСООТТССАААТТСССтеАСАААТАСТССОСТТСЮСАСТТСАС
61---------+---------4----------4----------+----------4---------4120
ОСТОАСОАСОТТТОТеСАСССААСОТТТААеОСАСТСТТТАТСАСССОААСССТОААСТС
ПССКНЬССКГКПКУСАМПРТСТТСТСС ЗЕО Ιϋ N0:819
121------СААОАСОАТТС 5Εζ) Ιϋ N0:821
Е 3 - ЗЕО ΙΏ N0:820
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
- 101 013470
Рефолдинг и очистка Ес-Ь-НаТх1, экспрессированного в бактериях. Замороженную пасту Е. со11 (13 г) смешивают со 100 мл раствора комнатной температуры, содержащего 50 мМ трис НС1, 5 мМ ЕОТА, рН 8,0, и вносят примерно в 0,1 мг/мл лизоцима куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12000 Р81 (82,73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 22000 д в течение 20 мин при 4°С. Затем пеллеты (2,6 г) растворяют в 26 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем растворенные пеллеты восстанавливают, добавляя 30 мкл 1 М дитиотреитола к 3 мл раствора и инкубируя при 37°С в течение 30 мин. Восстановленный раствор пеллет затем центрифугируют при 14000 д в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят 2,5 мл супернатанта в 250 буфера для рефолдинга (2 М мочевины, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 5 мМ ЕОТА, 1 мМ цистамин НС1, 4 мМ цистеина, рН 8,5) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 2 дней при 4°С. Раствор после рефолдинга фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и хранят при -70°С.
Хранящийся рефолд (раствор после рефолдинга) размораживают, а затем разводят 1 л воды и рН доводят до 7,5 с помощью 1 М Н3РО4. Материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозноацетатный фильтр и нагружают на колонку 10 мл АтегаЬат 8Р-НР НГГгар при скорости потока 10 мл/мин в 8-буфере А (20 мМ КаН2РО4, рН 7,3) при температуре 7°С. Затем колонку промывают 8буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют в линейном градиенте от 0 до 60% 8-буфера В (20 мМ КаН2РО4, 1 М КаС1, рН 7,3), постепенно доводя до 100% 8-буфера В при скорости потока 5 мл/мин и температуре 7°С. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8О8-РАОЕ, и фракции, содержащие заданный продукт, собирают в соответствии с этими результатами (15 мл). Затем пул нагружают на колонку 1 мл АтегаЬат гРго!еш А НГГгар в РВ8 при скорости потока 2 мл/мин и температуре 7°С. Затем колонку промывают 20 мМ КаН2РО4 рН 6,5, 1 М КаС1 в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют 100 мМ глицина рН 3,0. К элюенту с максимальным пиком (1,4 т1) добавляют 70 мкл 1 М трис НС1 рН 8,5, а затем материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм.
Затем проводят спектральное сканирование на 20 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре НеМе!! Раскагб 8453 (фиг. 29Е). Концентрация отфильтрованного материала равна 1,44 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30469 г/моль и коэффициента экстинкции 43890 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ (фиг. 29В). Уровень эндотоксинов определяют с помощью системы СЬаг1е8 Вгаег ЬаЬога!опе8 Εибо8аГе-ΡТ8 8у8!ет (чувствительность 0,05-5 Еи/мл) при 33-кратном разведении образца в эндотоксин-специфическом буфере СЬаг1е8 Вгаега Епбо!охш 8ресГДс ВиГГег ВО120, в результате получают <4 ЕИ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 20 мкг продукта, который вводят в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ КаН2РО4, 250 мМ КаС1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 29О). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 μ1 синаповой кислоты (10 мг на 1 мл в растворе 0,05%. трифторуксусной кислоты, 50%) ацетонитрила). Полученный раствор (1 мкл) наносят на МЛЬП1 плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег ОЕ-ВР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 29Н), и результаты подтверждают (в пределах ошибки опыта) целостность очищенного пептидного антитела. Затем продукт хранят при -80°С.
Пример 24. Бактериальная экспрессия Ес-Г-РаТх2.
Бактериальная экспрессия Ес-Г-РаТх2. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрВ-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Г-РаТх2 в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 102 013470
ТОСТТССССТОСТСОТСОТТССТАСТСССАОАААТССА //ЗЕО ГО N0:822;
ТСТОСАССТеССАССААОААСОТАААТеСТОССААССТСТСОТТТСССОТСТСТССТССАААССТАТС АТСААСАТО //ЗЕО Ю N0:823;
СТТАСАТОТТСАТОАТАСОТТТОСАССАСАОАССбСААА / / 3Εζ> ТО N0:824;
ССАОАССТТСОСАбСАТТТАССТТСТТССТСеСАССТССАСАТССАТТТСТОеСАОТАООААССАССА ССАССООА //ЗЕО ТО N0:825;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТОСТТСССОТСОТССТССТТССТАСТСССАОАААтеСАТОТССАССТОСОАССААОААСО
----------1-----------— —------1------------1---------— — 4-----------I- 50
АеОССАССАССАССААСЮАТСАСОСТСТТТАССТАСАССТОСАСеСТССТТСТТеС
СЗббСОЗУСОКИММТСОЕЕКТАААТОСТСССААОСТСТОСТТТСССОТСТОТОСТССАААССТАТСАТСААСАТС 3Εζ) ТО
N0:826
61----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----АТТТАСОАСОСТТССАОАССАААССССАСАСАССАСОТТТОСАТАОТАСТТОТАСАТТС ЗЕ<2
ТО N0:828
КССЕСЬУСНЬ^СКК11НМ - ЗЕО ТО
N0:827
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 25. Бактериальная экспрессия 1;с-1,-\\С1\'1А.
Бактериальная экспрессия Ι;οΙ,-\ν(.ι\·Ί/\. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрВ-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Р-\СУ1А в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТОСТТСССОТбСТбСТООТТССТОСАААТССССОООТТ //ЗЕО ТО N0:829;
ССТССТОСТСССССАССТССТАСААСТОСТССССТТССТОСААСССОТАСАССАААСОТТССТАССОТ
5Εζ) ТО N0:830;
СТТААССОТАОСААССТТТСОТСТОСОООТТОСАООАА //ЗЕО ТО N0:831;
СОССАССАСТТОТАССАССТСССССАеСАССАССААСССССЮСАТТТОСАССААССАССАССАССССА //ЗЕО ТО N0:832;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТССТТСССеТССТССТСЮТТССТССАААТСССССОСТТССТССТаСТСССССАССТССТА у---------+---------+---------+----------+---------+---------+ 60
АеСССАССАССАССААСОАССТТТАОСЮеСССАА&САССАССЗАСебОСТССА&САТ
СЗСОССЗСКЗРСЗЗСЗРТЗУСААСТССТССССТТССТССААСССОТАСАССАААСетТОСТАСеСТ 5Е0 ΙΌ N0:833
61---------+---------+---------+---------+------СТТСАСОАСООСААОбАСОТТСООСАТОТеОТТТССААСОАТСССААТТС 5Е<2 ГО N0:835
Ν00Κ30ΝΡΥΤΚΚ0Υ0 5Εζ) ГО N0:834
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 26. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-юМУПА.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-юМУПА. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрВ-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Ь-юМУПА в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 103 013470
ООТОСТАААТеСТСССОТСТСАТСТАСОАСТССТССАССОСТТССТССССТТССОСТАААТОСОСТ //ЗЕО ΙΏ N0:837;
СТТААССОСАТТТАССООААССОСАООААССССТ //3Εζ) ΙΌ N0:838;
ОСАОСАОТССТАСАТСАОАСООСАССАТТТАОСАССТТТАССТТТОСАООААССАССАССАССОСА //ЗЕО ΙΏ N0:839;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТОСТТССООТООТООТОСТТССТОСАААООТАААСОТОСТАААТОСТСССОТСТОАТОТА у---------+---------+---------+---------+---------+---------+
АООССАССАССАССААООАССТТТССАТТТССАССАТТТАСОАООеСАОАСТАСАТ озосоозскоксаксзкьмуСОАСТОСТОСАССООТТССТСССОТТССООТАААТССОСТ ЗЕ<2 ΙΌ N0:840
---------1-----------1-----------1---------— +
ССТСАСОАСОтеОССААООАСОССААССССАТТТАСОССААТТС ЗЕ<2 Ю N0:842
ОССТОЗСКЗОКСО - БЕ£) Ю N0:841
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 27. Бактериальная экспрессия Γο-Ε-ΡίυΕ
Бактериальная экспрессия Γο-Ε-ΡίυΕ Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рΑΜΘ21атрК-Бс-Ρер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Εο-Ε-Ρΐπ1 в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТООТТССООТООТОСТООТТССОСТСАААААСАСТОСАТС //ЗЕ<2 Ю N0:843;
ЗСТССОООТОСТССОТССТТСОСТАСССАСАААССОТОСТОСААСССССОТОСТтеОТОСТССТССТА СОСТААСАААТОССТО //БЕ<2 ΙΏ N0:844;
СТТАСАСОСАТТТОТТАОССТАСОАССАССАССААОСАСС //5Εζ) Ιϋ N0:845; СОООТТОСАОСАСОСТТТСТСООТАССОААОСАСООАОСАСССООАСССАТОСАОТСТТТТТСАССОО ААССАССАССАССООА //3Εζ) Ιϋ N0:846;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса ТССТТСССОТССТССТОСТТССССТСАААААСАСТССАТСССТСССССТССТССеТССТТ 1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ б0
АОСССАССАССАССААСеССАСТТТТТСтеАСОТАОСОАООСССАССАООСАСОАА
Ο3Ο3ΟΟ5ΑΕΚΏ0ΙΑΡΟΑΡ0ΕССОТАССОАСАААССОТОСТССААСССОСОТССТТООТОСТССТССТАСССТААСАААТО
61---------+---------+---------+---------+----------+---------+
120 ' СССАТОССТОТТтООСАСОАСОТТОеОСеСАСОААССАСОАООАООАТОСОАТТСТТТАС
ΟΤΏΚΡ00ΝΡΚΑΝ053ΥΑΝΚ0ССТО 3Εζ) ΙΏ N0:847
121---СКЗАСАТТС 5Ξ0 1Б N0:849
Ь - 3Εζ) ΙΌ N0:848
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 28. Бактериальная экспрессия Бс-^-Ρ^оТx1.
Бактериальная экспрессия 1-^-1,-1^()1^41. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рΑΜΘ21атрК-Бс-Ρер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Бс-^-Ρ^оТx1 в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 104 013470
ТООТТССООТССТООТООТТССОААТОССОТТАСТООСТСО //ЗЕ<2 Ιϋ N0:850;
бТБСттбстссостеетсАеАССтсстесАААСАССтеетттбстсссетсстсАсссттсстссстт ТОЗСАСССТАССТТСТСС //ЗЕ<2 ГО N0:851;
СТТАОаАСААССТАСССТСССАААСССАССААССОТСАССА //3Εβ ГО N0:852;
ССОСАеСАААССАССтеТТТбСАОСАООТСТОАССАСССОАОСААССАСССАОССАСТААСеОСАТТС 06ААССАССАССАССССА / /5Е<2 ГО N0:853;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса тссттссолтсстоотооттссоаатсссоттастоостссотосттостсссстоотса
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АООССАССАССАССААООСТТАСООСААТОАССОАСССАССААСОАООСОАССАОТ
СЗОО&ОЗЕСНУМЬО&СЗАОООАССТЗСТОСАААСАССТООТТТССТСССОТСОТСАСООТТОСтеССТТТСООАСОСТАС
61----------+---------+---------+----------1—----------1----------+
120 ' СТООАСОАСОТТТСТССАССАААСОАОООСАОСАОТОССААССАСОСАААСССТОССАТО
ΤΟΟΚΗβν'ς 3ΗΚΗΟΝ0νν\ΓϋΟΤСТТСТСС ЗЕ(2 ΙΏ N0:854
121------- .
ОААОАООАТТС ЗЕО Ιϋ N0:856
Г 3 - ЗЕО ΙΏ N0:855
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 29. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-ВеКМ1.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-ВеКМ1. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Ь-ВеКМ1 в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже ТООТТССООТООТООТООТТСССОТССОАСССАСАТСАААТО //5Εΰ Ю N0:857;
СТССОААТССТАССАОтеСТТСССООТТтеСАААТССССТТТСООТАА2\АССААСООТСОТТОССТТА АСООТТТСТОСОАСТОСТТС //ЗЕО 10 N0:858;
СТТАОААОСАОТСССАОАААССОТТААСОСААСОАССОТТОО //3ΕΏ Ю N0:859;
ТТТТАСССАААСеСО-АТТТССАААСССОСААССАСТССТАСОАТТССОАССАТТТеАТОТСОСТСООА СОООААССАССАССАССООА //ЗЕО Ю N0:860;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТООТТССООТОСТСеТОСТТССССТССОАССОАСАТСАААТССТ'ССОААТССТАССАСТС
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
АОСССАССАССАССААООССАСОСТООСТОТАОТТТАСОАООСТТАООАТООТСАС <336ΟΟΟ3ΚΡΤΌΙΚΟ3Ε3Υ0ΟСТТСССООТТТССАААТССССТТТСОСТААААССААСООТСОТТОСОТТААСОСТТТСТС
61----------ΐ----------н——------1-----------1-----------4—---------ь 12 0
ОААЗОСССАААСОТТТАОСОСАААОССАТТТТООТТОССАОСААСОСААТТОССАААОАС ΡΡνΟΚΒΚΕΟΚΤΝΟΚΟνΝΟΕΟСОАСТОСТТС 5Е0 ΙΏ N0:861
121---------+
ОСТОАСОААОАТТС 8Е<2 ΙΏ N0:863
ОСЕ - 3Εβ ΙΏ N0:862
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 30. Бактериальная экспрессия Ес-Ь-СТХ.
Бактериальная экспрессия Ес-Ь-СТХ. Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рАМО21атрК-Ес-Рер и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии Ес-Ь-СТХ в бактериях.
Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса, показаны ниже
- 105 013470
ТССТТССЗСТСОТССТССТТССАТСТССАТССССТССТТСАС //ЗЕЦ ГО N0:864 ;
САСССАССАССАОАТОССТСОТАААТОССАСОАСТОСТбСООТСОТАААССТСОТССТАААТССТАСС ОТССОСАСТСССТСТОССОТ //5Е0 ГО N0:865;
СТТААССССАСАСОСАСТССССАССОТАОСАТТТАССАССАС //ЗЕО ГО N0:866;
СТТТАССАССеСАССАеТСОТСеСАТТТАСОАеССАТСТСОТОСТСеС'ГССТОААССАСОССАТССАС АТСОААССАССАССАССОСА //3Εζ) ГО N0:867;
Вышеприведенные олигонуклеотиды используют для образования показанного ниже дуплекса
ТССТТСССбТСОТССТСОТТССАТСТОСАТССССТССТТСАССАСССАССАССАСАТееС
1---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 60
АСОССАССАССАССААСКЗТАСАСОТАССОСАСОААСТеСТООСТССтеОТСТАССС
ОЗСССОЗМСМРСГТТОНОМАТССТАААТОСОАССАСТССТОСОСТООТАААООТСОТОСТАААТССТАСОСТССОСАСТО
51---------+---------+---------+---------+---------+---------+
120 АОСАТТТАСССТОСТОАССАСОССАССАТТТССАОСАССАТТТАСОАТОССАСССОТСАС
ΒΚΟΏϋΟΟΟΟΚΟΚΟΚΟΥΟΡΟΟССТОТОССОТ ЗЕО ГО N0:868
121---------+
ООАСАССОСАССАС 5Εζ) ГО N0:870
Ь С Η - ЗЕО ГО N0:869
Бактериальную экспрессию пептидного антитела проводят, как описано в примере 3, а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 31. Пэгилированный по К-конпу-Ре8-Ага1-8ЬК.
Пептидный синтез восстановленного Ре8-Агд1-8ЬК. Ве8-Агд1-8ЬК, имеющий последовательность 5С1БТ1РКЗКСТАЕ0СКНЗМКУКЬЗЕСККТССТС (Пептид 1, 8Е0 ΙΏ ΝΟ: 92), синтезируют постадийно на синтезаторе полипептидов 8утрЬопу™ твердофазным пептидным синтезом (8РР8) с применением реакций соединения в присутствии 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (НВТи)Ж-метилморфолина (КММ)ЖЖ-диметилформамида (ДМФА, ОМЕ) в масштабах 0,1 ммол.экв. смолы на Теп!аде1™-8 РНВ Ешос-Су8(Тг!)-смоле. К-а-(9-флуоренилметилоксикарбонил)- и защищенные в боковой цепи аминокислоты получают от М1б^е8! Вю!есЬ 1псогрога!еб. 1зиос-Су8(Тг1)-Те111аде11X1 смолу получают от фирмы Е1ика. Применяют следующую стратегию защиты боковой цепи: Авр(О!Ви), Агд(РЬ£), Су8(Тг1), О1п(Тг!), Н18(Тг1), Ьу8(№-Вос), 8ег(О!Ви), ТЬг(О!Ви) и Туг(О!Ви). Два оксазолидиндипептида, Ешос-О^-Пг^^’М^о^ОН и Ршос-^еи-8е^(ψМе,МеΡ^о)-ОН, используют для сборки цепи, их получают от NоνаВ^осЬеш и используют в синтезе последовательности. Защищенные аминокислотные производные (20 ммоль) растворяют в 100 мл 20% диметилсульфоксида (ДМСО, ЭМ8О) в ДМФА (ОМЕ) (об./об.). Защищенные аминокислоты активируют с помощью 20 мМ НВТи, 400 мМ N ММ в 20% ДмСо (ОМ8О) в ДМФА (ОМЕ), и присоединение проводят с помощью двукратной обработки, используя 0,5 ммоль защищенной аминокислоты, 0,5 ммоль НВТи, 1 ммоль Ν\·1\·1 в 20% ВМЕ/ВМ8О в течение 25 мин, а затем 40 мин. Реакции Ешос депротекции проводят, дважды обрабатывая с применением 20% раствора пиперидина в ДМФА (ОМЕ) (об/об) в течение 10 мин, а затем 15 мин. После синтеза смолу дренируют и промывают ОСМ, ОМЕ, ОСМ, а затем сушат в вакууме. Депротекционируют пептид-смолу и пептид освобождают от смолы, обрабатывая раствором ТЕА/ЕВТ/ТК/Н^ (92,5:2,5:2,5:2,5 (об/об)) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем током азота удаляют легколетучие вещества, сырой пептид дважды осаждают холодным диэтиловым эфиром и собирают центрифугированием. Затем сырой пептид анализируют на аналитической системе ОФ(ВР)-ВЭЖХ Vа!е^8 2795 в линейном градиенте (0-60% буфера В в течение 12 мин, А: 0,1% ТФК (ТЕА) в воде, В: 0,1% ТФК в ацетонитриле) на колонке 1ир1!ег 4 мкм Рго!ео™ 90 А. Для подтверждения корректных масс пептидных продуктов применяют масс-спектрометр с электрораспылением РЕ-8с1ех™ АР1 Е1ес1го-8ргау. Сырой пептид получают с выходом 143 мг с чистотой около 70% по данным анализа ОФ-ВЭЖХ. Время удерживания восстановленного Ое8-Агд1-8ЬК (Пептид 1) (В!) = 5,31 мин, вычисленная молекулярная масса = 3904,6917 Да (средняя); найденная экспериментально молекулярная масса 3907,0 Да.
Фолдинг (образование складок) Ве8-Агд1-8ЬК (Образование дисульфидной связи). После расщепления с помощью ТФК и осаждения пептида восстановленный Ве8-Агд1-8ЬК окисляют на воздухе, получают скрученный пептид. Сырой отщепленный пептид экстрагируют 20% АсОН в воде (об./об.), а затем разводят водой до концентрации около 0,15 мг восстановленного Ое8-Агд1-8ЬК на 1 мл, рН доводят примерно до 8,0 с помощью КН4ОН (28-30%) и осторожно перемешивают при комнатной температуре в те
- 106 013470 чение 36 ч. Процесс фолдинга контролируют с помощью ЬС-МБ. После этого скрученный Пез-Агд1-БИК пептид очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке 1 Еииа 5 мкм С18 100 А Рго!ео™ в линейном градиенте 0-40% буфера В за 120 мин (А=0,1% ТФК в воде, В=0,1% ТФК в ацетонитриле). Скрученный Эез-Агд1-БИК сырой пептид элюируется (выходит) раньше (по сравнению со временем элюции в восстановленной форме) при примерно 25% буфера В. Скрученный Пез-Агд1-БИК (пептид 2) получают с выходом 23,2 мг с чистотой >97% по определению с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ (фиг. 20). Вычисленная молекулярная масса = 3895,7693 Да (моноизотопная), найденная экспериментально молекулярная масса = 3896,5 Да (на приборе '№а!егз ЕСТ Ргет1ег Мюготазз МБ ТесИпо1од1ез). Дисульфидное связывание в Пез-Агд1-БИК суть С1-С6, С2-С4, С3-С5.
5С1ПТ1РК5КСТАЕ0СКН5МКУКЬЗРСККТССТС (пептид 2, БЕР Ш \О: 58)
Пэгилирование по Ν-концу скрученного Эез-Агд1-БИК. Скрученный Пез-Агд1-БИК (пептид 2) растворяют в воде с концентрацией 1 мг/мл. 2М МеО-ПЭГ-альдегида, СН3О-[СН2СН2О]п-СН2СН2СНО (средняя молекулярная масса 20 кДа), раствор в 50 мМ ХаОАс, рН 4,5 и отдельный 1М раствор №СХВН3 являются свежеприготовленными. Затем раствор пептида прибавляют к раствору, содержащему МеО-ПЭГ-альдегид, а затем прибавляют раствор NаСNВΗ3. Стехиометрическое соотношение реагентов пептид:ПЭГ:NаСNВΗ3 (1:2:0,02) соответственно. Реакционную смесь оставляют на 48 ч и анализируют на ОФ-ВЭЖХ системе Адйеп! 1100 ВР-НРЬС на колонке ХогЬах™ 300БВ-С8 5 мкм при 40°С в линейном градиенте (6-60% В за 16 мин, А: 0,1% ТФК в воде, В: 0,1% ТФК/90% ΆСN в воде). По данным аналитической ОФ-ВЭЖХ, монопэгилированный скрученный Эез-Агд1-БИК составляет около 58% сырого продукта. Затем монопэгилированный Эез-Агд1-БИК выделяют на катионообменной колонке Н1Тгар™ 5 мл БР НР на системе АКТА ЕРЕС при 4°С при скорости потока 1 мл/мин в градиенте 0-50% В в 25 объемах колонки (буферы: А = 20 мМ ацетата натрия рН 4,0, В = 1М КаС1, 20 мМ ацетата натрия, рН 4,0). Фракции анализируют, используя 4-20 трис-С1у БЭБ-РАСЕ гель и ОФ-ВЭЖХ (как описано для сырого). Характеристики электрофореза в геле БЭБ-РАСЕ продолжительность 1,5 ч, 125 В, 35 мА, 5 Вт. Затем собранный продукт подвергают диализу при 4°С с 3-кратной заменой 1 л буфера А4Б (10 мМ №ОАс, 5% сорбитола, рН 4,0). Затем диализированный продукт концентрируют в 10 К микроцентрифужном фильтре до объема 2 мл и фильтруют в стерильных условиях с помощью 0,2 мкМ шприцевого фильтра. Пэгилированный по N-концу-^ез-Ά^д1-БИК (пептид 3) выделяют с выходом 1,7 мг с чистотой 85%, по данным аналитической ОФ-ВЭЖХ (фиг. 23).
Пэгилированный по N-концу-^ез-Ά^д1-БИК, также называемый РЕС-БИК[2-35], активно блокирует Ку1.3 (фиг. 38А и 38В), по электрофизиологическим данным пэтч-кламп (открытия-закрытия, ра!сИ с1атр) (пример 36).
Пример 32. Пэгилированный по Ν-концу БИК.
Методы эксперимента данного иллюстрирующего примера соответствуют результатам, показанным на фиг. 17.
Пептидный синтез восстановленного БИК. БИК, имеющий аминокислотную последовательность
К5С1СТ1РКЗКСТАГ0СКНЗМК¥КЬЗГСККТССТС синтезируют постадийно на синтезаторе полипептидов БутрИопу™ твердофазным пептидным синтезом (БРРБ) с применением реакций соединения в присутствии 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (НЗТи^-метилморфолина (NММ)/N,N-диметилформамида (ДМФА, ЭМГ) в масштабах 0,1 ммол. экв. смолы на Теп!аде1™-Б РНВ Гтос-Суз(Тг!)-смоле. N-α-(9-Флуоренилметилоксикарбонил)- и защищенные в боковой цепи аминокислоты получают от М16^ез! Вю!есИ 1псогрога!ей. Гтос-Суз(Т'г1)-Те1Иаде1 ™ смолу получают от фирмы Г1ика. Применяют следующую стратегию защиты боковой цепи: Азр(О!Ви), Агд(РЬк), Суз(Тг1), Ст1п(Т'г1), Ыз(Тг!), Ьуз(№-Вос), Бег(О!Ви), ТИг(О!Ви) и Туг(О!Ви). Два оксазолидиндипептида, Е’пюс-Ст1у-Т'11г( ψλ 1е,х 1еРго)-О11 и Гшοс-^еи-Бе^(ψМе’МеР^ο)-ОН, используют для сборки цепи, их получают от УоуаВюсЬет и используют в синтезе последовательности. Защищенные аминокислотные производные (20 ммоль) растворяют в 100 мл 20% раствора диметилсульфоксида (ДМСО, ЭМБО) в ДМФА (ОМЕ) (об./об.). Защищенные аминокислоты активируют с помощью 200 мМ НВТИ, 400 мМ МММ в 20% ДМСО (ЭМБО) в ДМФА (ОМЕ) и присоединение проводят с помощью двукратной обработки, используя 0,5 ммоль защищенной аминокислоты, 0,5 ммоль НВТи, 1 ммоль \\1\1 в 20% ЭМЕ/ОМБО в течение 25 мин, а затем в течение 40 мин. Реакции Гшос депротекции проводят, дважды обрабатывая с применением 20% раствора пиперидина в ДМФА (ОМЕ) (об./об.) в течение 10 мин, а затем 15 мин. После синтеза смолу дренируют и промывают ЭСМ, ОМЕ, ЭСМ, а затем сушат в вакууме. Депротекционируют пептид-смолу и пептид выделяют из смолы, обрабатывая раствором ТТА/ЕОТ'/ТЗБ/НХ) (92,5:2,5:2,5:2,5 (об./об.)) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем током газо
- 107 013470 образного азота удаляют легколетучие вещества, сырой пептид дважды осаждают холодным диэтиловым эфиром и собирают центрифугированием. Затем сырой пептид анализируют на аналитической системе ОФ(КР)-ВЭЖХ ^аГегз 2795 в линейном градиенте (0-60% буфера В в течение 12 мин, А: 0,1%) ТФК (ТЕА) в воде, В: 0,1% ТФК в ацетонитриле на колонке ЗнрЦег 4 мкм Рго1ео™ 90А. Для подтверждения корректности масс пептидных продуктов применяют масс-спектрометр с электрораспылением РЕ8с1ех™ АИ Е1ес1го-зргау. Сырой пептид получают с выходом около 170 мг с чистотой около 45% по данным анализа ОФ-ВЭЖХ. Время удерживания восстановленного 8ЕК (пептид 4) (К1) = 5,054 мин, вычисленная молекулярная масса = 4060,8793 Да (средняя); найденная экспериментально молекулярная масса 4063,0 Да.
Фолдинг (образование складок) 8ЕК (образование дисулъфидных связей). После расщепления с помощью ТФК и осаждения пептида восстановленный 8ЕК окисляют на воздухе, получают скрученный пептид. Сырой отщепленный пептид экстрагируют 20% АсОН в воде (об./об.), а затем разводят водой до концентрации около 0,15 мг восстановленного 8ЕК на 1 мл, рН доводят примерно до 8,0 с помощью NН40Н (28-30%) и осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение 36 ч. Процесс фолдинга контролируют с помощью ЕС-М8. После этого скрученный 8ЕК пептид очищают обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке 1 Енпа 5 мкм С18 100 А Рго1ео™ в линейном градиенте 0-40% буфера В за 120 мин (А=0,1% ТФК в воде, В=0,1% ТФК в ацетонитриле). Скрученный 8ЕК сырой пептид элюируется (выходит) раньше (по сравнению со временем элюции в восстановленной форме) при примерно 25% буфера В. Скрученный 8ЕК (пептид 2) получают с выходом 25,5 мг с чистотой >97% по определению с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ. См. фиг. 60. Вычисленная молекулярная масса = 4051,8764 Да (моноизотопная); найденная экспериментально молекулярная масса = 4052,5 Да (на приборе А'а1егз ЕСТ Ргет1ег Мюготазз М8 ТесЕпо1од1ез). Дисульфидное связывание в 8ЕК суть С1-С6, С2-С4 и С3-С5.
КЗС1ОТ1РКБКСТАГ0СКНЗМК¥КЬЗЕСККТСОТС (Пептид 5, 8Е0 ГО ΝΟ: 10)
Пэгилирование по N-концу скрученного 8ЕК. Скрученный 8ЕК, имеющий аминокислотную последовательность
КЗС1ЮТ1РКЗКСТАЕ0СКНЗМКУКЬЗГСККТС6ТС (8Е() ГО N0:5), можно растворять в воде с концентрацией 1 мг/мл. 2 М МеО-ПЭГ-альдегида, СН3О-[СН2СН20]пСН2СН2СНО (средняя молекулярная масса 20 кДа), раствор в 50 мМ Nа0Ас, рН 4,5 и отдельный 1 М раствор NаСNВН3 являются свежеприготовленными. Затем раствор пептида прибавляют к раствору, содержащему МеО-ПЭГ-альдегид, а затем можно прибавлять раствор NаСNВН3. Стехиометрическое соотношение реагентов пептид: ПЭГ :NаСNВН3 (1:2:0,02) соответственно. Реакционную смесь можно оставить на 48 ч и анализировать на ОФ-ВЭЖХ системе Ац11еп1 1100 КР-НРЬС на колонке /огЬах™ 3008ВС8 5 мкм при 40°С в линейном градиенте (6-60% В за 16 мин, А: 0,1% ТФК в воде, В: 0,1% ТФК/90% АСN в воде). Затем монопэгилированный 8ЕК можно выделять на катионообменной колонке Н1Тгар™ 5 мл 8Р НР на системе АКТА ЕРЕС при 4°С при скорости потока 1 мл/мин в градиенте 0-50% В в 25 объемах колонки (буферы: А = 20 мМ ацетата натрия рН 4,0, В = 1М КаС1, 20 мМ ацетата натрия, рН 4,0). Фракции можно анализировать, используя 4-20 трис-С1у 808-РАСЕ гель и ОФ-ВЭЖХ. Характеристики электрофореза в геле 8П8-РАСЕ продолжительность 1,5 ч, 125 В, 35 мА, 5 Вт. Затем собранный продукт можно подвергнуть диализу при 4°С с 3-кратной заменой 1 л буфера А48 (10 мМ ацетата натрия, 5% сорбитола, рН 4,0). Затем диализированный продукт можно концентрировать в 10 К микроцентрифужном фильтре до объема 2 мл и фильтровать в стерильных условиях с помощью 0,2 мкМ шприцевого фильтра, получая конечный продукт.
Пример 33. Пэгилированный по Оконцу 8ЕК (оксимирование).
Пептидный синтез восстановленного 8ЕК. 8ЕК, имеющий последовательность
КЗС1ОТ1РКЗ&СТАЕ0СКНЗМК¥ЕЬЗЕСККТССТС (8Е() ΙΟ ΝΟ: 5), синтезируют постадийно на синтезаторе полипептидов 8утрЕопу™ твердофазным пептидным синтезом (8РР8) с применением реакций соединения в присутствии 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (НВТυ)/Х-метилморфолина (NΜΜ)/Х,N-диметилформамида (ДМФА, ОМЕ) в масштабах 0,1 ммол. экв. смолы на Теп1аде1™-8 РНВ Етос-Суз(Тг1)-смоле. N-α-(9-Флуоренилметилоксикарбонил)- и защищенные в боковой цепи аминокислоты получают от МнЕсез! Вю1есЕ Епсогрога1еб. Етос-Суз(Тг1)-Теп1аде1 ™ смолу получают от фирмы Е1ика. Можно применять следующую стратегию защиты боковой цепи: Азр(01Ви), Агд(РЬГ), Суз(Тг1), С1п(Тп), Н1з(Тг1), Буз(№-Вос), 8ег(01Ви), ТЕг(01Ви) и Туг(01Ви). Два оксазолидиндипептида, Ртοс-С1у-ТЕ^(ψМе,МеР^ο)-ОН и Етос-Беи
- 108 013470
8ег(жМе,МеРго)-ОН, можно применять для сборки цепи, их получают от NονаΒ^οсЬет и используют в синтезе последовательности. Защищенные аминокислотные производные (20 ммоль) растворяют в 100 мл 20% раствора диметилсульфоксида (ДМСО, БМ80) в ДМФА (БМЕ) (об/об). Защищенные аминокислоты можно активировать с помощью 200 мМ НЕТБ, 400 мМ КММ в 20% ДМСО (БМ80) в ДМФА (БМЕ) и присоединение можно проводить с помощью двукратной обработки, используя 0,5 ммоль защищенной аминокислоты, 0,5 ммоль НΒТυ, 1 ммоль КММ в 20% ВМЕ/ОМ80 в течение 25 мин, а затем в течение 40 мин. Реакции Етос депротекции проводят, дважды обрабатывая 20% раствором пиперидина в ДМФА (БМЕ) (об./об.) в течение 10 мин, а затем 15 мин. После сборки цепи 8Ьк пептида Βοс-аминооксиуксусную кислоту (1,2 экв.) можно присоединять по К-концу, используя 0,5М НЕТИ в ДМФА (БМЕ) 4 экв. коллидина в течение 5 мин. После синтеза смолу можно дренировать и промыть БСМ, БМЕ, БСМ, а затем сушить в вакууме. Пептид-смолу можно депротекционировать и выделять пептид из смолы, обрабатывая раствором ТЕА/аминооксиуксусная кислота/ТК/ЕБТ/Н20 (90:2,5:2,5:2,5:2,5) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем током газообразного азота можно удалять легколетучие вещества, сырой пептид можно дважды осаждать холодным диэтиловым эфиром и собирать центрифугированием. Затем пептид аминоокси-81к (пептид 7) можно анализировать на аналитической системе ОФ(КР)-ВЭЖХ Аа!егк 2795 в линейном градиенте (0-60% буфера В в течение 12 мин, А: 0,1% ТФК (ТЕА) в воде, содержащей также 0,1% аминоуксусной кислоты, В: 0,1% ТФК в ацетонитриле) на колонке ДирИег 4 мкм Рго1ео™ 90А.
Очистка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Препаративную обращенно-фазовую жидкостную хроматографию можно проводить на колонке С18, 5 мкм, 2,2 см х 25 см). Хроматографического разделения можно достичь в линейном градиенте буфера В в А (А = 0,1% водная ТФК; В = 90% водн. САН, содержащий 0,09% ТФК и 0,1% аминооксиуксусной кислоты), обычно 5-95% за 90 мин при скорости потока 15 мл/мин. Фракции, полученные при препаративной ВЭЖХ, характеризуют с помощью Е8М8 и ВЭЖХ детектора с фотодиодной матрицей (РОА), объединяют и лиофилизируют.
^Концевое пэгилирование 8Ьк с помощью оксимирования. Лиофилизированный аминоокси-8Ьк (пептид 7) можно растворить в 50% буфере для ВЭЖХ А/В (5 мг/мл) и добавить к двукратному молярному избытку МеО-ПЭГ-альдегида, СН30-[СН2СН20]п-СН2СН2СН0 (средняя молекулярная масса 20 кДа). Реакционную смесь можно оставить на 24 ч, а затем анализировать с помощью системы АдПеп™1 1100 ОФ-ВЭЖХ на колонке /огЬах™ 3008Β-Ε8 5 мкм при 40°С в линейном градиенте (6-60% В за 16 мин, А: 0,1% ТФК в воде, В: 0,1% ТФК/90% АСN в воде). По данным ОФ-ВЭЖХ монопэгилированный восстановленный 8ЬК составляет около 58% сырого продукта. Монопэгилированный (оксимированный) 8ЬК (пептид 8) можно выделять на катионообменной колонке Н1Тгар™ 5 мл 8Р НР на системе АКТА ЕРБС при 4°С при скорости потока 1 мл/мин в градиенте 0-50% В в 25 объемах колонки (буферы: А = 20 мМ ацетата натрия рН 4,0, В = 1 М ЫаС1, 20 мМ ацетата натрия, рН 4,0). Фракции можно анализировать, используя 4-20 трис-С1у 8Б8-РАОЕ гель и ОФ-ВЭЖХ. Характеристики электрофореза в геле 8Б8-РАОЕ продолжительность 1,5 ч, 125 В, 35 мА, 5 Вт. Затем собранный продукт можно подвергнуть диализу при 4°С с 3-кратной заменой 1 л буфера А48 (10 мМ №0Ас, 5% сорбитола, рН 4,0). Затем диализированный продукт можно концентрировать в 10 К микроцентрифужном фильтре до объема 2 мл и фильтровать в стерильных условиях с помощью 0,2 мкМ шприцевого фильтра, получая конечный продукт.
Фолдинг (скручивание) 8ЬК (образование дисульфидных связей). Монопэгилированный (оксимированный) 8ЬК можно растворить в 20% АсОН в воде (об/об), затем можно разбавить водой до концентрации примерно 0,15 мг пептида/мл, рН доводят примерно до 8,0 с помощью КН40Н (28-30%) и осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение 36 ч. Процесс фолдинга контролируют с помощью БС-М8. После этого скрученный монопэгилированный (оксимированный) 8ЬК (пептид 9) можно очищать обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке 1 Бипа 5 мкм С18 100 А Рго1ео™ в линейном градиенте 0-40% буфера В за 120 мин (А=0,1% ТФК в воде, В=0,1% ТФК в ацетонитриле). Дисульфидное связывание в монопэгилированном (оксимированном) 8ЬК суть С1-С6, С2-С4 и С3-С5.
МеО-РЕС-СНгСНгСНгЫНОСНгСО-КЗСГОТХРКЗКСТАРОСКНЗМКУКЬЗЕСККТССТС (Пептид 9, 8ЕО ГО N0: 10)
Пример 34. Пэгилированный по Ы-концу 8ЬК (амидирование).
Экспериментальные методы данного иллюстративного примера соответствуют результатам, показанным на фиг. 18.
Н-Концевое пэгилирование 8Ьк с помощью амидирования. Раствор 10 мг/мл скрученного 8Ьк (пептид 5) в 100 мМ бицина (Ысте) рН 8,0 можно добавлять к твердому сукцинимидиловому эфиру 20 кДа ПЭГ пропионовой кислоты (шРЕО-8РА; СН3Ο-[СН2СН2Ο]η-СН2СН2СΟ-NН8) при комнатной температуре при 1,5 молярном избытке шРЕС-8РА относительно 8Ьк. Осторожно перемешивают 1 ч и смесь разбавляют водой до концентрации 2 мг/мл и рН можно довести до 4,0 разбавленной НС1. Протяженность (размер) монопэгилированного 8Ьк (пептид 10), некоторых дипэгилированных 8Ьк или трипэгилирован
- 109 013470 ных 8Нк. немодифицированного 8Нк и степень гидролиза сукцинимидилового сложного эфира можно определить с помощью 8ЕС ВЭЖХ на колонке 8ирегйех™ 75 НВ 10/30 (Аше^кΡаш). элюция с помощью 0.05 М №112РО.|. 0.05 М №211РО2. 0.15 М КаС1. 0.01 М ΝιΝ3. рН 6.8. при скорости потока 1 мл/мин. Фракции можно анализировать с помощью 4-20 трис-О1у 8Б8-РАОЕ геля и ОФ-ВЭЖХ. Электрофорез в 8Б8-РАОЕ гелях можно проводить в течение 1.5 ч при 125 В. 35 мА. 5 Вт. Объединенный продукт можно подвергать диализу при 4°С. трижды заменяя 1 л буфера А48 (10 мМ ШОАс. 5% сорбитола. рН 4.0). Диализированный пэгилированный по Ν-концу (амидированный) 8НК (пептид 10) можно затем концентрировать на микроцентрифужном фильтре 10 К до объема 2 мл и фильтровать в стерильных условиях с помощью 0.2 мкМ шприцевого фильтра. получая конечный продукт.
Ме0-РЕ6-СН2СН2С0-ЯН-КЗС1ПТ1РК5ЕСТАРаСКНЗМК¥НЬЗРСНКТССТС (Пептид 10. 8ЕО ΙΌ КО: 10)
Пример 35. Рс-Ь-8шША.
Вектор для экспрессии Рс-8ш111А. Фрагмент ВатН1-КоП из 104 п.о.. содержащий частичную линкерную последовательность. и 8ш111А пептид. кодированный человеческими кодонами. встречающимися с высокой частотой. собирают. используя ПЦР с помощью перекрывающихся праймеров 3654-50 и 365451 и клонируют в основной каркас 7.1 т.н.о. ΝοίΙ-ВатН!. получают вектор пкДНК(рсВКА)3.1(+)СМУ1НБс-8ш111А. описанный в примере 1.
ВашН1
5'ССАТСССеАбОАССАССААССТбСТОСААССССССССОССОСТССАОСАСССОСТСС ссиокеосззни ТОССОСОАССАСАОССОСТССТОСТОАОСООССОСЗ' //ЗЕ<2 ГО N0:872 СКОНЗКСС ΝοΐΙ
3Εζ) ГО N0:873
Прямой 5'-3 ' : ССАСОАСОАТСССОАССАСОАСОААССТССТССААСССССССССССОСТССАССАОС ССС //3Εζ) ГО N0:874
Обратный 5'-3 ' : АТТАТТССеОССССТСАССАОСАОССеСТСтеСТСОСООСАССАОСеОСТОСТССАО СССС ЗЕ<2 ГО N0:875
Последовательности фрагментов ВатИ-КоП проверяют секвенированием.
Транзиторная экспрессия Рс-Р-8тШа. 7.5 мкг слитой конструкции Рс токсичного пептида рсВКА3.1(+)СМУ1-РРс-8шША трансфецируют в 293-Т клетки в плашке 10 см для тканевых культур с помощью РиСЕ/КЕ 6 в качестве реагента для трансфекции. Культуральную среду заменяют бессывороточной средой через 24 ч после трансфекции и кондиционированную среду собирают на 5 день после трансфекции. Транзиторную экспрессию Рс-8ш111А при использовании 293-Т клеток анализируют с применением Вестерн-блоттинга с антителом против НБс (фиг. 25А и 25В). Как в восстановленном. так и в не восстановленном образце наблюдается единственная полоса экспрессированного белка с вычисленным МА. Уровень транзиторной экспрессии Рс-8ш111А составляет 73.4 мкг/мл. как установлено методом ЕЫ8А.
Пример 36. Электрофизиологические эксперименты.
Культура клеток. Клеточную линию. стабильно экспрессирующую Кт1.3 канал. получают по разрешению ВюГосик. Клетки хранят при 37°С в среде с 5% СО2. Культуральная среда содержит БМЕМ с О1и(аМах™ (1пт11годеп). 1Х заменимой аминокислоты. 10% фетальной бычьей сыворотки и 500 мкг/мл генетицина. Перед электрофизиологическими экспериментами клетки засевают и выращивают при низкой конфлюентности на культуральных плашках 35 мм по меньшей мере в течение 24 ч.
Электрофизиологические данные. регистрируемые методом пэтч-кламп (открытия-закрытия. Ра!сН Сктртд) (методом оценки проницаемости ионных каналов с применением пэтч-пипеток). Токи цельных клеток регистрируют на единичных клетках. используя герметичные условия метода пэтчклэмп (открытия-закрытия). Культуральную плашку 35 мм переносят в ячейку для регистрации после
- 110 013470 промывания и замены культуральной среды буфером для регистрации, содержащим 135 мМ №С1, 5 мМ КС1, 1,8 мМ СаС12, 10 мМ НЕРЕ8 и 5 мМ глюкозы. рН доводят до 7,4 с помощью №1ОН и устанавливают осмолярность 300 мОсм/л. Клетки непрерывно перетекают вместе с буфером для регистрации через один из стеклянных капилляров, расположенных параллельно и соединенных с автоматическим стержнем, который помещает стеклянный капилляр непосредственно на верх регистрируемой клетки. Раствор в пипетке для регистрации содержит 90 мМ К-глюконата, 20 мМ КЕ, 10 мМ №С1, 1 мМ МдС12-6Н2О, 10 мМ ЕСТА, 5 мМ К2-АТР и 10 мМ НЕРЕ8. рН Внутреннего раствора доводят до 7,4 с помощью КОН, а осмолярность устанавливают при 280 мОсм/л. Эксперименты проводят при комнатной температуре (2022°С) и данные записывают, используя усилитель Ми1йс1атр™ 700А (Мо1еси1аг Эеуюек 1пс.), сопротивление пипетки обычно составляет 2-3 МО (МОм).
Определение эффективности белкового токсина в отношении Ку 1.3 тока. Фиксация потенциала в клетках НЕК293, стабильно экспрессирующих человеческий Ку1.3 канал, происходит при удерживающем потенциале -80 мВ. С помощью стадий деполяризации продолжительностью 200 мс внешние Ку1.3 токи активируются до +30 мВ по сравнению с удерживающим потенциалом -80 мВ и фильтруются при 3 кГц. Каждая стадия деполяризации разделяется с последующей стадии интервалом 10 с. Сигналы из аналоговой формы в цифровую переводятся с помощью П1д1бака™ 1322А преобразователя (Мо1еси1аг ЭеУ1сек) и затем хранятся на компьютерном диске для анализа в автономном режиме с помощью С1атрДк™ 9 (Мо1еси1аг Эеуюек 1пс.). Во всех исследованиях амплитуды стабильного основного тока Ку1.3 установлены 4 мин перед началом перфузии белкового токсина при возрастающих концентрациях. Перед началом перфузии последующей концентрации белкового токсина всегда достигают равновесного состояния блока.
Анализ данных. Процент контроля (РОС) рассчитывают по следующему уравнению: (Ку1.3 ток после добавления белкового токсина/Ку1.3 тока в контроле)· 100. По меньшей мере 5 белкового токсина (например, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 100 нМ) используют для расчета величины 1С50. Определение значения 1С50 и вычерчивание кривой проводят, используя программу ХЬйк (Мюгококк Согр.) построения логистической кривой (кривой насыщения) по четырем параметрам. Величины 1С50 выражены как средние значения ± к.е.т. (стандартная ошибка среднего).
Лекарственные препараты. Белковые токсины (обычно 10-100 мкМ) растворяют в дистиллированной воде и хранят в замороженном состоянии при -80°С. Серийные разведения исходных белковых токсинов смешивают с буфером для регистрации, содержащим 0,1% альбумина бычьей сыворотки (В8А), а затем переносят в стеклянные емкости для перфузии. Электронные запорные клапаны контролируют ток белкового токсина из емкостей в регистрируемую клетку.
Пример 37. Иммунобиология и связывание каналов.
Ингибирование продуцирования цитокинов Т клетками после стимуляции РВМС с помощью РМА и антитела против С'П3. РВМС сначала выделяют из наборов, полученных при лейкофорезе крови здоровых доноров, очищают центрифугированием в градиенте плотности (Исо11 Нурадне), замораживают в полной среде для СР2 замораживания (ЕЛСЕГО, МСР2Е-100 + 10% ДМСО в конце). РВМС оттаивают (выживаемость 95%), отмывают и засевают в культуральной среде при плотности 2х105 на лунку (среда КРМ1 1640; С1ВСО), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 2 мМ Ь-глутамина, 100 мкМ заменимых аминокислот и 20 мкМ 2-МЕ) в 96луночных плоскодонных планшетах для тканевых культур. Культуры предварительно инкубируют при серийном разведении (100-0,001 нМ в конце) 8кК[1-35], Ес-Ь10-8кК[1-35] или кс контроля в течение 90 мин, а затем стимулируют в течение 48 ч с помощью РМА/антитела против С'П3 (1 нг/мл и 50 нг/мл соответственно) в конечном анализируемом объеме 200 мкл. Анализ аналитических образцов проводят, используя установку для визуализации Меко 8са1е О1ксоуегу (М8Э) 8ЕСТОК™ 1тадег 6000 (Меко 8са1е П1ксоуегу, Са1ккегкЬигу, МО) для измерения уровней белков 1Ь-2 и 1ЕЛд электролюминесценцией (ЕСЬ). Кондиционированную среду (50 мкл) добавляют в М8Э Ми1й-крок 96-луночные планшеты (каждая лунка содержит три иммобилизованных антитела; 1Ь-2, ТБЕ, ΙΡΝγ). Планшеты герметизируют, заворачивают в фольгу и инкубируют при комнатной температуре на планшетном шейкере в течение 2 ч. Лунки отмывают 1Х 200 мкл РВ8Т (ВЮТЕК, Е1х405 Аико Р1аке Уаккег). В каждую лунку добавляют 20 мкл меченных рутением антител для детекции (1 мкг/мл в конце буфера для разведения антител; Ш-1, Т№, ΙΡΝγ) и 130 мкл 2Х М8Э буфера для считывания, конечный объем 150 мкл. Планшеты герметизируют, заворачивают в фольгу и инкубируют при комнатной температуре на планшетном шейкере в течение 1 ч. Затем планшеты считывают на 8ЕСТОК™ йпадег 6000. На фиг. 35А и 35В показано полученное при использовании СНО Ес-Е10-8кК|1-35| пептидное антитело эффективно ингибирует продуцирование Ш-2 и ШЛд при использовании Т клеток в зависимости от дозы. По сравнению с нативным 8кК[1-35] пептидом пептидное антитело продуцирует более значительное ингибирование (РОС = процент контроля ответа в отсутствие ингибитора).
Ингибирование продуцирования цитокинов Т клетками после стимуляции РВМС антитело к СЭ3 и к С'П28. Сначала РВМС выделяют РВМС сначала выделяют из наборов, полученных при лейкофорезе крови здоровых доноров, очищают центрифугированием в градиенте плотности (Еюо11 Нурадие), замо
- 111 013470 раживают в среде для замораживания ШСЕЬЬ. РВМС оттаивают (выживаемость 95%) при плотности 2х105 на лунку, отмывают и засевают (в полной среде РРМ1, содержащей замену сыворотки, Р8С) в 96луночных плоскодонных планшетах для тканевых культур. Культуры предварительно инкубируют при серийном разведении (100-0,003 нМ в конце) 8кК[1-35], Ес-Ь10-8йК[1-35] или Ес контроля в течение 1 ч а затем добавляют </Χ'.Ό3 и аСЭ28 (2,5 нг/мл и 100 нг/мл соответственно) в конечном анализируемом объеме 200 мкл. Супернатанты собирают через 48 ч и анализируют, используя установку для визуализации Мезо 8са1е О1зсотегу (М8Э) 8ЕСТОР™ 1тадег 6000 (Мезо 8са1е О1зсотегу, СайкегзЬигу, МО) для измерения уровней белков 1Ь-2 и 1ЕЫд электролюминесценцией (ЕСЬ). 20 мл супернатанта добавляют в М8Э Ми1!1-зро! 96-луночные планшеты (каждая лунка содержит иммобилизованные антитела; 1Ь-2, Т№, Ι^Νγ). Планшеты герметизируют, заворачивают в фольгу и инкубируют при комнатной температуре на планшетном шейкере в течение 1 ч. Лунки отмывают 1Х 200 мкл РВ8Т (В1ОТЕК, Е1х405 Аи!о Р1а!е ХУазйег). В каждую лунку добавляют 20 мкл меченных рутением антител для детекции (1 мкг/мл в конце буфера для разведения антител; 1Ь-1, Т№а, ΨΝγ) и 110 мкл 2Х М8Э буфера для считывания. Планшеты герметизируют, заворачивают в фольгу и инкубируют при комнатной температуре на планшетном шейкере в течение 1 ч. Затем планшеты считывают на 8ЕСТОР™ 1тадег 6000. На фиг. 37А и 37В показано полученное при использовании СНО Ес-Ь10-8йК[1-35] пептидное антитело эффективно ингибирует продуцирование 1Ь-2 и ^Ν§ при использовании Т клеток в зависимости от дозы. По сравнению с нативным 8кК[1-35] пептидом, который проявляет только частичное ингибирование, пептидное антитело продуцирует почти полное ингибирование воспалительного ответа цитокинов (РОС = процент контроля ответа в отсутствие ингибитора).
Ингибирование Т клеточной пролиферации после стимуляции РВМС антителом против СЭ3 и СЭ28. РВМС сначала выделяют из наборов, полученных при лейкофорезе крови здоровых доноров, очищают центрифугированием в градиенте плотности (Е1со11 Нурасще), замораживают в полной среде для СР2 замораживания (ШСЕЬЬ, МСР2Е-100 плюс 10% ДМСО в конце). РВМС оттаивают (выживаемость 95%), отмывают и засевают в культуральной среде при плотности 2х105 на лунку (среда РРМ1 1640; С1ВСО), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 2 мМ Ь-глутамина, 100 мкМ заменимых аминокислот и 20 мкМ 2-МЕ) в 96-луночных плоскодонных планшетах для тканевых культур. Культуры предварительно инкубируют при серийном разведении либо блокирующим антителом против человеческого СЭ32 (ЕсуР11) (по инструкции производителя набора для селекции ЕА8Υ 8ЕР Нитап Вюкп 8е1ес!юп К1! #18553, 8!етСе11 Тесйпо1од1ез Уапсоитег, ВС), либо Ес-Ь10-8йК (100 нМ-0,001 нМ в конце) в течение 45 мин. Затем к клеткам, содержащим блокирующее антитело против человеческого СЭ32, прибавляют Ес-Ь10-8йК (100 нМ-0,001 нМ в конце), тогда как к клеткам, содержащим Ес-Ь10-8йК, добавляют среду. Оба набора инкубируют в течение 45 мин, а затем в течение 48 ч стимулируют с помощью аСЭ3/аСЭ28 (0,2 нг/мл и 100 нг/мл соответственно). Конечный аналитический объем составляет 200 мкл. Добавляют [3Н]ТбР (1 мкКи на лунку) и планшеты инкубируют еще в течение 16 ч. Клетки затем собирают на фильтрах из стекловолокна и определяют радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика для измерения β-излучения. На фиг. 36А и 36В показано, что полученное при использовании СНО Ес-Ь10-8йК[1-35] пептидное антитело эффективно ингибирует пролиферацию Т клеток в зависимости от дозы. Предварительное блокирование блокирующим антителом против СЭ32 (ЕсР) оказывает слабое действие на способность антител ингибировать пролиферацию Т клеток, это наводит на мысль, что ингибирование Χν1.3, а не связывание ЕсР является механизмом наблюдаемого ингибирования (РОС = Регсеп! ОГ Соп!го1 оГ гезропзе ш !ке аЬзепсе оГ шЫЬйог). (РОС = процент контроля ответа в отсутствие ингибитора).
Иммуногистохимический анализ связывания Ес-Ь10-8йК[1-35] с клетками НЕК 293, сверхэкспрессирующими человеческий Кт 1.3. Клетки НЕК 293, сверхэкспрессирующие (избыточно экспрессирующие) 1<ν1.3 (НЕК Кт1.3), получают от ВюЕосиз р1с (СатЬпбде, ИК) и сохраняют в соответствии с рекомендациями изготовителя. Исходную клеточную линию НЕК 293 используют в качестве контрольной, клетки засевают на поли-Э-лизин в 24-луночные планшеты (#35-4414; Вес!оп-Оюктзоп, ВебГогб, МА) и оставляют расти примерно до 70% конфлюентности. НЕК КУ1.3 засевают при плотности 0,5х10е5 клеток/лунка в 1 мл/лунка среды. Клетки НЕК 293 засевают при плотности 1,5х10е5 клеток/лунка в 1 мл/лунка среды. Перед окрашиванием клетки фиксируют в формалине (81дта НТ50-1-1 раствор формалина, перед употреблением разведенный 1:1 РВ8/0,5% В8А), удаляя питательную среду для роста клеток, добавляя 0,2 мл/мл/лунка раствора формалина и инкубируя при комнатной температуре в течение 10 мин. Клетки окрашивают, инкубируя с 0,2 мл/лунка 5 мкг/мл Ес-Е10-8йК[1-35] в РВ8/В8А в течение 30' при комнатной температуре. Ес-Е10-8йК[1-35] отсасывают, а затем клетки отмывают один раз с помощью РВ8/0,5% В8А. В лунки добавляют антитела для детекции (антитело козы Е(аЬ)2 против человеческого 1дС-фикозритрина; 8ои!кегп Вю!еск Аззос1а!ез, Вхгтхпдкат, АЬ) при плотности 5 мкг/мл в РВ8/0,5% В8А и инкубируют 30' при комнатной температуре. Клетки отмывают один раз с помощью РВ8/0,5% В8А и изучают под конфокальным микроскопом (Ь8М 510 Ме!а СопГоса1 Мюгозсоре; Саг1 2е1зз АС, Сегтапу). На фиг. 33В показано, что Ес-Е10-8йК[1-35] сохраняет связывание с клетками НЕК 293, сверхэкспрессирующими Кт 1.3, но проявляет слабое связывание с нетрансфецированными клетка
- 112 013470 ми (фиг. 33А), это показывает, что Рс-Ь10-БИК[1-35] пептидное антитело можно использовать в качестве реагента для детекции клеток, сверхэкспрессирующих Ку1.3 канал. В случае заболеваний, при которых, как сообщалось, активированные Т клетки эффекторной памяти избыточно продуцируют (сверхпродуцируют) Ку1.3, этот реагент может найти применение как для нацеливания на эти клетки, так и для их детекции (обнаружения).
Анализ ЕЬ1БА, демонстрирующий связывание Рс-Ь10-БИК[1-35] с фиксированными клетками НЕК 293, сверхэкспрессирующими Ку1.3. На фиг. 34А показано зависящее от дозы увеличение связывания пептидного антитела с фиксированными клетками, которые сверхэкспрессируют Ку 1.3, демонстрируя, что пептидное антитело обладает высокой аффинностью связывания со своей мишенью, и полезность ГсЬ10-БИК[1-35] для детекции клеток, экспрессирующих канал. Обнаружение сверхэкспрессии Ку1.3 в антиген-специфических Т клетках, которые вызывают заболевание у больных рассеянным склерозом, электрофизиологическим методом пэтч-кламп (открытия-закрытия, ра!сИ с1атр) на цельных клетках, трудоемкий процесс. Наш реагент - пептидное антитело, может быть полезным и удобным инструментом для мониторинга экспрессии Ку1.3 канала у пациентов и иметь применение в диагностике. Метод показан далее на фиг. 34А и 34В.
Фиг. 34А. Иммуноанализ цельных клеток проводят для того, чтобы показать связывание интактного Рс-Ь10-БИК[1-35] с Ку1.3 трансфецированными НЕК 293 клетками (ВюРосиз р1с, СатЬпйде, ИК). Исходные НЕК 293 клетки или НЕК Ку1.3 клетки засевают при плотности 3х10е4 клеток/лунка в 96луночных планшетах, покрытых поли-Э-лизином (#35-4461; Вес!οи-^^ск^изοи, Вейкогй, МА), клетки фиксируют формалином (Б1дта НТ50-1-1 раствор формалина, перед употреблением разведенный 1:1 РВБ/0,5% ВБА) удалением среды для выращивания клеток, добавлением раствора формалина 0,2 мл/лунка и инкубацией при комнатной температуре в течение 25 мин, а затем однократным отмыванием с помощью РВБ/0,5% ВБА с концентрацией 100 мкл/лунка. Лунки блокируют, добавляя 0,3 мл/лунка блокатора ВБА (50-61-00; КРЬ 10% ВБА разбавителя/блокирующего раствора, разведенного 1:1 с помощью РВБ; КРЬ, СайИегзЬигд, МО) с последующей инкубацией при комнатной температуре при встряхивании в течение 3 ч. Планшеты отмывают 2 раза буфером для отмывания 1хКР (50-63-00; КРЬ). Образцы разводят в буфере для разведения (РВБ/0,5% Твин-20) или буфером для разведения плюс 1% сывороткой самцов крыс Льюиса (Ма1е Ьетаз Ва! Бегит) (РуАТБВМ-М; Вюгес1ата1юп 1пс., НюкзуШе, ΝΥ) и добавляют в блокированные планшеты при плотности 0,1 мл/лунка, инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Планшеты отмывают 3 раза буфером для отмывания 1хКР ¥аз11 Виккег, а затем инкубируют с конъюгированным с НВР антителом козы к человеческому 1дС Рс (#31416; Р1егсе, ВоскРогй, 1Ь), разведенным 1:5000 в РВБ/0,1% Твин-20, в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Планшеты отмывают 3 раза буфером для отмывания 1хКР ¥аз11 Вцйег, а затем добавляют 0,1 мл/лунка ТМВ субстрат (52-00-01; КРЬ). Реакции прекращают, добавляя 0,1 мл/лунка 2 Ν серную кислоту, оптическую плотность читают при 450 нм на Мо1еси1аг Эеуюез БресйоМах 340 (Битууак, СА).
Фиг. 34В. Иммуноанализ цельных клеток проводят как описано выше с нижеприведенными модификациями. Клетки НЕК 293 засевают при плотности 1х10е5 клеток/лунка, а клетки НЕК Ку1.3 засевают при плотности 6х10е4 клеток/лунка в 96-луночные планшеты с иммобилизованным поли-Э-лизином. Рс Контроль добавляют в концентрации 500 нг/мл в объеме 0,05 мл/лунка. Конъюгированное с НВР антитело козы к человеческому 1дС Рс (#31416; Р1егсе, ВоскРогй, 1Ь) разводят 1:10000 в РВБ/0,1% Твин-20. АВТБ (50-66-00, КРЬ) используют в качестве субстрата. Оптическое поглощение читают при 405 нм после прекращения реакции при добавлении 1% БОБ по 0,1 мл/лунка.
Пример 38. Очистка Рс-Ь10-БИК(1-35).
Экспрессию Рс-Ь10-БИК[1-35] проводят, как описано выше в данном описании в примере 3. Замороженную пасту Е. со11 (18 г) смешивают с 200 мл раствора комнатной температуры, содержащего 50 мМ трис НС1, 5 мМ ЕОТА, рН 8,0. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12000 РБ1 (82,73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 22000 д в течение 15 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 22000 д в течение 15 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 22000 д в течение 15 мин при 4°С. Затем пеллеты (3,2 г) растворяют в 32 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем растворенные пеллеты центрифугируют при 27000 д в течение 15 мин при комнатной температуре и 5 мл супернатанта переносят в 500 мл буфера для рефолдинга (3 М мочевины, 20% глицерина, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 5 мМ ЕОТА, 1 мМ цистамин НС1, 4 мМ цистеина, рН 9,5) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 2 дней при 4°С. Раствор после рефолдинга хранят при -70°С.
Хранящийся рефолд (раствор после рефолдинга) размораживают, а затем разводят в 2 л воды и рН доводят до 7,3 с помощью 1 М Н3РО4. Материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и нагружают на колонку 60 мл АтегзИат БР-РР (2,6 см внутренний диаметр Ι.Ό.) при скорости потока 20 мл/мин в Б-буфере А (20 мМ НаН2РО4, рН 7,3) при температуре 7°С. Затем колонку промывают Б-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют
- 113 013470 в линейном градиенте от 0 до 60% 8-буфера В (20 мМ NаН2Ρ04. 1 М №С1. рН 7.3). постепенно доводя до 100% 8-буфера В при скорости потока 10 мл/мин и температуре 7°С. Затем анализируют фракции. используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8П8-РАСЕ. и фракции. содержащие заданный продукт. собирают в соответствии с этими результатами. Затем пул нагружают на колонку 1 мл АтеШи-цп гРго!еш А Н|Тгар в РВ8 при скорости потока 1 мл/мин и температуре 7°С. Затем колонку промывают 20 мМ NаН2Ρ04 рН 6.5. 1 М №С1 в количестве. равном нескольким объемам колонки. и элюируют 100 мМ раствором глицина рН 3.0. К элюенту с максимальным пиком добавляют 0.0125 объемов (25 мл) 3 М ацетата натрия.
Затем проводят спектральное сканирование на 50 мкл объединенного пула. разведенного в 700 мкл воды. на спектрофотометре Неу1е(( Раскагб 8453 (фиг. 46А). Концентрация отфильтрованного материала равна 2.56 мг/мл. как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30410 г/моль и коэффициента экстинкции 36900 М-1 ст-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 808-РАСЕ (фиг. 46В). Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта. используя эксклюзионную хроматографию 20 мкг продукта. который вводят в колонку РНепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7.8x300 мм) в 50 мМ NаН2Ρ04. 250 мМ №С1. рН 6.9 при скорости потока 1 мл/мин. наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 46С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 мкл синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0.05% трифторуксусной кислоты. 50% ацетонитрила). Один миллилитр полученного раствора наносят на МАЬО1 плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть. а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег ЭЕ-ВР. снабженном азотным лазером (337 нм. 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют. используя очищенные белки с известными молекулярными массами. Затем продукт хранят при -80°С.
Величина 1С50 для блокады Ку1.3 очищенным полученным при использовании Е.соб Рс-Ь10-8НК[135]. также называемым Рс-Ь-8НК[1-35]. показана в табл. 35 (в примере 50. см. ниже в данном описании).
Пример 39. Очистка бактериально экспрессированного Рс-Ь10-8НК(2-35).
Экспрессию Рс-Ь10-8НК[2-35] проводят как описано выше в примере 4. Замороженную пасту Е. сок (16.5 г) смешивают с 200 мл раствора комнатной температуры. содержащего 50 мМ трис НС1. 5 мМ ЕЭТА. рН 8.0. и добавляют примерно к 0.1 мг/мл лизоцима белка куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12000 Р81 (82.73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 22000 д в течение 15 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 22000 д в течение 15 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 200 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 22000 д в течение 15 мин при 4°С. Затем пеллеты (3.9 г) растворяют в 39 мл 8 М раствора гуанидин НС1. 50 мМ трис НС1. рН 8.0. Затем раствор пеллет центрифугируют при 27000д в течение 15 мин при комнатной температуре и 5 мл супернатанта переносят в 500 мл буфера для рефолдинга (3 М мочевины. 20% глицерина. 50 мМ трис. 160 мМ аргинин НС1. 5 мМ ЕЭТА. 1 мМ цистамина НС1. 4 мМ цистеина. рН 9.5) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 2 дней при 4°С. Раствор после рефолдинга хранят при -70°С.
Хранящийся рефолд (раствор после рефолдинга) размораживают. а затем разводят в 2 л воды и рН доводят до 7.3 с помощью 1 М Н3РО4. Материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0.22 мкм и нагружают на колонку 60 мл АтеШи-ци 8Р-РР (2.6 см внутренний диаметр. Ι.Ό.) при скорости потока 20 мл/мин в 8-буфере А (20 мМ NаН2Ρ04. рН 7.3) при температуре 7°С. Затем колонку промывают 8-буфером А в количестве. равном нескольким объемам колонки. и элюируют в линейном градиенте от 0 до 60% 8-буфера В (20 мМ NаН2Ρ04. 1 М №С1. рН 7.3). постепенно доводя до 100% 8-буфера В при скорости потока 10 мл/мин и температуре 7°С. Фракции. содержащие заданный продукт. объединяют и фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0.22 мкм. Затем пул нагружают на колонку 1 мл Ашсгк^-ш гРго(еш А Н|Тгар в РВ8 при скорости потока 2 мл/мин и температуре 7°С. Затем колонку промывают 20 мМ NаН2Ρ04 рН 6.5. 1 М №1С1 в количестве. равном нескольким объемам колонки. и элюируют 100 мМ раствором глицина рН 3.0. К элюенту с максимальным пиком добавляют 0.0125 объемов (25 мл) 3 М ацетата натрия и образец фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0.22 мкм.
Затем проводят спектральное сканирование на 20 мкл объединенного пула. разведенного в 700 мкл воды. на спектрофотометре Неу1е(( Раскагб 8453 (фиг. 40А). Концентрация отфильтрованного материала равна 3.20 мг/мл. как определено с учетом расчетной молекулярной массы 29282 г/моль и коэффициента экстинкции 36900 М-1 см-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 808-РАСЕ (фиг. 46В). Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта. используя эксклюзионную хроматографию
- 114 013470 мкг продукта, который вводят в колонку РЕепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2Р04, 250 мМ №С1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 40С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 мкл синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Один миллилитр полученного раствора наносят на МАЬЭ[ плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег ЭЕ-КР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами. Затем продукт хранят при -80°С.
Величина Κ.'50 для блокады Ку1.3 очищенным полученным при использовании Е.со11 Ес-Ь10-8ЕК[235], также называемым Ес-Ь-8ЕК[2-35], показана в табл. 35 (в примере 50, см. ниже в данном описании).
Пример 40. Очистка бактериально экспрессированного Ес-Ь10-0зК1.
Замороженную пасту Е. со11 (129 г, см. пример 10) смешивают с 1290 мл раствора комнатной температуры, содержащего 50 мМ трис НС1, 5 мМ ЕЭТА. рН 8,0, и добавляют примерно к 0,1 мг/мл лизоцима белка куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12000 Р8I (82,73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 17700 д в течение 15 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 1290 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 17700 д в течение 15 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 1290 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 17700 д в течение 15 мин при 4°С. Затем 8 г пеллет (всего 16,3 г) растворяют в 160 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем раствор пеллет инкубируют с 1 мл ЭТТ в течение 60 мин при 37°С. Восстановленный материал переносят в 5000 мл буфера для рефолдинга (1 М мочевины, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 2,5 мМ ЕЭТА, 1,2 мМ цистамина НС1, 4 мМ цистеина, рН 10,5) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 3 дней при 4°С.
рН раствора после рефолдинга доводят до 8,0 с помощью уксусной кислоты. Материал с корректированным рН фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и нагружают на колонку 50 мл АтегзЕат О 8ерЕагозе-ЕЕ (2,6 см вн. диаметр) при скорости потока 10 мл/мин в 0-буфере А (20 мМ Трис, рН 8,5) при температуре 8°С с встроенной колонкой 50 АтегзЕат Рго1ет А (2,6 см вн. диаметр). После загрузки колонку О 8ерЕагозе удаляют и в дальнейшем хроматографию проводят на колонке с белком А (Рго!еш А). Затем колонку промывают 0-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют постепенно доводя до 100 мМ глицина рН 3,0. Фракции, содержащие заданный продукт, объединяют и сразу же нагружают на колонку 50 мл АтегзЕат 8Р-8ерЕагозе НР (2,6 см вн. диаметр) при скорости потока 20 мл/мин в 8-буфере А (20 мМ NаН2Р04, рН 7,3) при температуре 8°С. Затем колонку промывают 8-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют в линейном градиенте от 5 до 60% 8-буфера В (20 мМ NаН2Р04, 1 М рН 7,3), постепенно доводя до 100% 8-буфера В. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ. Фракции, содержащие в основном заданный продукт, объединяют, а затем наносят на колонку 75 мл МЕР Нурегсе1 (2,6 см Ι.Ό.) при скорости потока 5 мл/мин в МЕР буфере А (20 мМ трис, 200 мМ рН 8,0) при температуре 8°С. Продукт из колонки элюируют в линейном градиенте от 5 до 50% МЕР буфера В (50 мМ цитрата натрия рН 4,0), а затем постепенно доводят до 100% МЕР буфера В. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ, и фракции, содержащие в основном заданный продукт, объединяют.
Пул в МЕР буфере затем концентрируют примерно до 20 мл на центрифужном ультрафильтрационном устройстве Ра11 1итЬо-8ер с мембраной 10 кДа с последующим буферным обменом с буфером для препарата (20 мМ NаН2Р04, 200 мМ ΜΠ, рН 7,0) с применением той же мембраны. Затем проводят спектральное сканирование на 50 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл буфера для препарата, на спектрофотометре Нес1е11 Раскагб 8453 (фиг. 41 А). Концентрация отфильтрованного материала равна 4,12 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30558 г/моль и коэффициента экстинкции 36720 М-1 см-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ (фиг. 41В). Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 123 мкг продукта, который вводят в колонку РЕепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2Р04, 250 мМ №□, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 41С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ, хроматографируя около 4 мкг образца на колонке для ОФ-ВЭЖХ (Уубас С4, 1x150 мм). Растворитель А представляет собой 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в воде, а растворитель В представляет собой 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в 90% ацетонитрила, 10% воды. Колонку предварительно уравновешивают в 10% растворителя В при скорости потока 80 мкл в мин. Белок элюируют в линейном градиента от 10 до 90% растворителя В за 30
- 115 013470 мин. Часть эффлюента направляют в ^С^ масс-спектрометр с ионной ловушкой. Масс-спектр расшифровывают с помощью программы Вю\огкз, предоставленной производителем масс-спектрометра (фиг. 41Ό). Продукт фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и затем продукт хранят при -80°С.
Выход экспрессируемого в Е. сой Ес-Ь10-О8К1 составляет 81 мг из 40 г клеточной пасты (129 г х (8 г/16,3 г) х (100 мл/160 мл) = 39,6 г, округляют до 40 г), чистота составляет 80%, судя по 8Б8-РАОЕ, он выходит в виде димера, по данным 8ЕС-ВЭЖХ, а молекулярная масса, полученная методом М8, находится в пределах ожидаемой молекулярной массы.
Величина Κ'\0 для блокады Κν1.3 очищенным полученным при использовании Е.соН Ес-Ь10-О8К1, также называемым Ес-Ь-О8К1, показана в табл. 35 (в примере 50, см. ниже в данном описании).
Пример 41. Ес-Ь10-О8К1, Ес-Ь10-О8К1[К78], Ес-Ь10-О8К1[Е16К,К20В] и Ес-Ь10-О8К1 [К78,Е16К,К20В], экспрессируемые клетками млекопитающих Ес-Ь10-О8К1, Ес-Ь10-О8К1[К78], ЕсЬ10-О8К1[Е16К,К20В] и Ес-Ь10-О8К1 (К78,Е16К,К20Э], ингибиторы Κν1.3, экспрессируют в клетках млекопитающих. Последовательность ДНК, кодирующую область Ес человеческого ТдО1, сливают в рамке считывания с линкерной последовательностью, а мономер Κν1.3 ингибирующего пептида О8К1, О8К1[К78], О8К1[Е16К,К20Б] или О8К1[К78,Е16К,К20Б] конструируют, как описано ниже. Методы экспрессии и очистки пептидного антитела от клеток млекопитающих (клеток НЕК 293 и клеток яичников китайского хомячка) раскрываются в данном описании.
Для конструкции векторов для экспрессии Ес-Ь10-О8К1, Ес-Ь10-О8К1[К78], Ес-Ь10О8К1[Е16К,К20Б] и Ес-Ь10-О8К1[К78,Е16К,к20В] используют метод ПЦР для получения полноразмерных генов О8К1, О8К1[К78], О8К1[Е16К,К20Б] и О8К1(К78,Е16К,К20Э], каждый из которых связан с линкером из четырех глициновых аминокислотных остатков и одного остатка серика, с двумя стопкодонами и фланкирован сайтами рестрикции Ват1 II и как показано ниже.
Два олигонуклеотида для каждого из О8К1, О8К1[К78], О8К1[Е16К,К20Б] И [К78,Е16К,К20Б]О8К1 с показанными ниже последовательностями используют в ПЦР с ДНК полимеразой с горячим стартом Р£иТигЪо Но!8!аг! (8!га!адепе) при 95°С - 30 с, 55°С - 30 с, 75°С - 45 с 35 циклов; сайты рестрикции Ват1 II (дда!сс) и ЖП (дсддссдс) подчеркнуты.
О8К1:
Прямой праймер: са! еяа 1сс дда дда дда дда аде ддс д1д а!с а!с аас аад !дс аад а!с аде сдс сад 1дс с1д дад ссс !дс аад аад дсс д (8ЕО ГО ΝΟ: 876);
Обратный праймер: са! дсе дсс ее! 1ас !ас йд ддд д1д сад 1дд сас йд ссд йс а!д сас йд ссд аад сдс а!д ссд дсс йс йд сад ддс !сс а (8Εζ) ГО N0:877);
О8К1[К78]:
Прямой праймер: са! яда 1сс дда дда дда дда аде ддс д!д а!с а£с аас д1д аде 1дс аад а!с аде сдс сад 1дс с!д дад ссс 1дс аад аад дсс д (8Εζ) ГО ΝΟ: 878);
Обратный праймер: са! дед дсс дс) 1ас 1ас йд ддд д!д сад 1дд сас йд ссд йс а1д сас йд ссд аад сдс а)д ссд дсс йс йд сад ддс 1сс а (8Е<) ГО N0: 879);
Ο8Κ1[Ε16Κ,Κ20ϋ]:
Прямой праймер: са! ддайсс дда дда дда дда аде ддс д1д а!с а(с аас д)д аад 1дс аад а! с аде сдс сад 1дс с!д аад ссс 1дс аад дас дсс д (8Е(2 ГО N0:880);
Обратный праймер: са1 дед дсс яс! 1ас (ас йд ддд д1д сад 1дд сас йд ссд йс а!д сас йд ссд аад сдс а1д ссд дед 1сс йд сад ддс йс а (8Е(2 ГО N0:881);
Ο8Κ1[Κ78,Ε16Κ,Κ20ϋ]:
Прямой праймер: са! дда 1сс дда дда дда дда аде ддс д1д а!с а1с аас д1д аде 1дс аад а!с аде сдс сад 1дс с!д аад ссс 1дс аад дас дсс д (8Е(^ ГО N0:882);
Обратный праймер: са1 дед дсс дс! 1ас 1ас йд ддд д1д сад 1дд сас йд ссд йс а1д сас йд ссд аад сдс а1д ссд дед 1сс йд сад ддс Йс а (8Ер ГО N0:883).
Полученные продукты ПЦР разрешаются в виде полос 155 п.о. на четырехпроцентном агарозном геле. ПЦР продукт 155 п.о. очищают, используя набор РСК Риг£1са!юп Κι! ^1адеп), затем расщепляют рестриктазами ВатН и (КосРе) и агарозный гель очищают, используя набор Ое1 Ех!гас!юп Κι!
- 116 013470
Оадеп). Одновременно вектор рс^NА3.1(+)СΜУ^-йЕс-8йк[2-35] расщепляют рестриктазами ΒашНI и №б и большой фрагмент очищают, используя набор для экстракции Се1 Ехбасбоп К1!. Очищенный от геля ПЦР фрагмент лигируют к очищенному большому фрагменту и трансформируют в 0пе 8Ьо!® Тор10Е' Цпуйгодеп). ДНК трансформированных бактериальных колоний выделяют и расщепляют рестриктазами ΒашНI и №б и разрешают на двухпроцентном агарозном геле. ДНК, дающие желаемый рисунок (паттерн), подвергают секвенированию. Хотя анализ некоторых последовательностей клонов дает 100%-ное совпадение с вышеприведенными последовательностями, только один клон каждого гена выбирают для крупномасштабной очистки плазмидной ДНК. ДНК слитых пептидов Ес-Ь10-08К1, Ес-Ь1008К1[К78], Ес-Ь10-08К1[Е16К,К20П] и Ес-Ь10-08К1[К78,Е16К,К20П] в векторе рСМУ1 и повторно секвенируют для подтверждения Ес и линкерной областей, и последовательность на 100% идентична вышеуказанным последовательностям. Последовательности и наглядное изображение Ес-Ь10-08К1, ЕсЬ10-08К1[К78], Ес-Ь10-08К1[Е16К,К200] и Ес-Ь10-08К1[К78,Е16К,К20П] представлены на фиг. 42АВ, 43 А-В, 44А-В и 45А-В соответственно.
Клетки НЕК-293, используемые для транзиторной трансфекции с экспрессией Ес-Ь10-08К1, ЕсЬ10-08К1[К78], Ес-Ь10-08К1[Е16К,К20П] и Ес-Ь10-08К1[К78,Е16К,К20П] в рСМУ1 белке, культивируют в питательной среде, содержащей ОМЕМ Н1дЬ С1исоке (с высоким содержанием глюкозы) (С1Ьсо), 10% фетальной бычьей сыворотки (ΒΒ8 от С1Ьсо), 1Х заменимой аминокислоты (КЕЛА от С1Ьсо) и 1Х пенициллина/стрептомицина/глутамина (Реп/8бер/С1ц от С1Ьсо). 5,6 мкг каждого из Ес-Ь10-08К1, ЕсЬ10-08К1[К78], Ес-Ь10-08К1[Е16К,К20П] и Ес-Ь10-08К1[К78,Е16К,К20П] в рСМУ1 плазмиде, экстрагированной раствором фенол/хлороформ, трансфецируют в клетки НЕК-293, используя ЕиСЕNЕ 6 (КосЬе). Клетки восстанавливают в течение 24 ч, а затем помещают в среду, содержащую ЭМЕМ Н1дЬ С1исоке (с высоким содержанием глюкозы), 1х NЕАА и 1Х Реп/8бер/С1ц на 48 ч. Ес-Ь10-08К1[К78], ЕсЬ10-08К1[Е16К,К200] и Ес-Ь10-08К1[К78,Е16К,К20П] очищают от среды, кондиционированной этими трансфецированными НЕК-293 клетками, используя протокол, описанный ниже, в примере 50.
мкл кондиционированной среды смешивают с приготовленным нами 4х лодинг-буфером (утяжеляющим буфером) (не содержащим β-меркаптоэтанол) и подвергают электрофорезу на №хех 4-20% трис-геле на приборе №хех Хсе11 II при 101 В/46 мА в течение 2 ч в 1х рабочем растворе для геля Се1 Кцпшпд (25 мМ Трис основания, 192 мМ глицина, 3,5 мМ 8Ό8) наряду с 20 мкл предварительно окрашенного стандарта молекулярной массы белка ЕепсЬМагк Рге-8!ашеб Рго!ет 1аббег Цпуйгодеп). Затем гель замачивают в буфере для электроблоттинга (25 мМ Трис основания, 192 мМ глицина, 20% метанол,) в течение 5 мин. Нитроцеллюлозную мембрану от Ыуйгодеп (Са!. №. ЬС200, размер пор 0,2 мкм) замачивают в буфере для электроблоттинга. Реплику предварительно замоченного геля наносят на нитроцеллюлозную мембрану, используя модуль М1ш Тгапк-Ыо! Се11 в соответствии с инструкциями производителя (Ъю-Каб ЬаЬога!ог1ек) при 300 мА в течение 2 ч. Реплику (отпечаток) промывают солевым раствором, забуференным Трис, рН 7,5, с 0,1% Твин 20 (ТΒ8Т). Затем блот сначала замачивают в 5% молока (Сагпабоп) в ТΒ8Т в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего трижды отмывают в ТΒ8Т, каждый раз по 10 мин. Затем инкубируют с конъюгированным с НКР антителом козы к человеческому (Есу) антителом в разведении 1:1000 (Р1егесе Β^ο!есйηο1οду Са!. по. 31413) в ТΒ8Т буфере с 5% молока в течение 1 ч, встряхивая при комнатной температуре. Затем блот трижды отмывают в ТΒ8Т при комнатной температуре, каждый раз по 15 мин. Первичное антитело детектируют, используя реагенты для Вестерн-блоттинга АтегкЬат РЬагташа Β^ο!есЬ'к ЕСЬ в соответствии с инструкциями производителя. При ЕСЬ детекции Вестерн-блоттингом анализ показывает ожидаемый размер 66 кДа на невосстанавливающем геле (фиг. 46).
Плазмиды, содержащие инсерции Ес-Ь10-08К1, Ес-Ь10-08К1[К78], Ес-Ь10-08К1[Е16К,К20П] и Ес-Ь10-08К1[К78,Е16К,К20П] в векторе рСМУ1, расщепляют рестриктазами XЬаI и №б (КосЬе) и очищают в геле. Инсерции по отдельности лигируют в расщепляемый с помощью 8реI и №б (КосЬе) экспрессирующий вектор рЬ8К/.24 (Атдеп Ргорбе!агу). Целостность полученных конструкций подтверждают секвенированием ДНК. Хотя анализ некоторых последовательностей клонов дает 100%-ное совпадение с вышеприведенной последовательностью, только один клон каждого гена выбирают для крупномасштабной очистки плазмидной ДНК.
Клетки АМ1 СН0б- (Атдеп Ргорбе!агу), используемые для стабильной экспрессии белка Ес-Ь1008К1, культивируют в питательной среде для выращивания клеток АМ1 СН0б-, содержащей ОМЕМ Н1дЬ С1исоке (с высоким содержанием глюкозы), 10% фетальной бычьей сыворотки, 1х гипоксантин/тимидина (НТ от С1Ьсо), 1Х NЕАА м 1Х Реп/8бер/С1и. 5,6 мкг плазмиды рП8Ка-24-Ес-Ь10-08К1 трансфецируют в АМ1 СН0б-клетки, используя ЕиСепе 6. Через 24 ч после трансфекции клетки разделяют 1:11 в ОНЕК среду для селекции (ОМЕМ Н1дЬ С1исоке плюс 10% диализированной фетальной бычьей сыворотки (бЕΒ8), 1х NЕАА и 1Х Реп/8бер/С1и) и в разведении 1:50 для отбора колоний. Селекцию клеток проводят в среде для селекции ОНЕК в течение 13 дней. Десять пулов, полученных в результате колоний по 10 см2, размножают до десяти колб Т-175, затем увеличивают до десяти роллерфлаконов и культивируют в среде для АМ1 СН0б-продукции (ОМЕМ/Е12 (1:1), 1Х NЕАА, 1Х пирувата натрия (№ Ругцуа!е), 1Х Реп/8бер/С1ц и 1,5% ДМСО). Кондиционированную среду собирают и заменя
- 117 013470 ют с интервалом одна неделя. Полученные в результате шесть литров кондиционированной среды фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,45 мкм (Согшпд, Ас1оп, МА) и характеризуют 8Ό8РАСЕ анализом, как показано на фиг. 47. Затем очищают, как методами химии белков.
После 13 дней на среде для селекции ОНЕВ отбирают двенадцать колоний и помещают в 24луночный планшет. Выращивают в планшете в течение одной недели, а затем переносят в среду для АМ1 СНОб-продукции на 48-72 ч и кондиционированную среду собирают. Уровни экспрессии оценивают Вестерн-блоттингом, аналогичным транзиторному Вестерн-блоттингу, с обнаружением того же самого конъюгированного с НВР антитела козы к человеческому Ι§0, (Есу) антитела для скрининга 5 мкл кондиционированной среды. У всех 12 стабильных клонов наблюдается экспрессия белка ожидаемой длины 66 кДа. Выбирают два клона, А3 и С2, и размножают до Т175 колбы для замораживания с А3 в качестве дублера первичного клона С2 (фиг. 48).
Клон С2 размножают до 50 роллер-флаконов (Согшпд), используя среду для селекции, и выращивают до монослоя. Затем среду заменяют средой для продуцирования и оставляют на одну неделю. Кондиционированную среду собирают и заменяют с интервалом в одну неделю. Полученные в результате 50 л кондиционированной среды фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,45 мкм (Согшпд, АсЮп, МА) и характеризуют с помощью 8Э8-РАСЕ (данные не показаны). Дальнейшую очистку проводят, как описано ниже в примере 42.
Пример 42. Очистка Ес-Ь10-О8К1, Ес-Ь10-О8К1(К78), Ес-Ь10-О8К1(Е16К,К20П) и Ес-Ь10О8К1(К78,Е16К,К20П), экспрессируемых в клетках млекопитающих.
Очистка Ес-Ь10-О8К1. Около 6 л среды, кондиционированной с помощью СНО (АМ1 СНОб-) клеток (см. выше пример 41), загружают на колонку 35 мл МАЬ 8е1ес1 (СЕ НеаИксаге) при скорости потока 10 мл/мин при 7°С, и колонку промывают несколькими объемами фосфатно-буферного раствора без двухвалентных катионов по Дульбекко (РВ8), и образец элюируют, постепенно доводя до 100 мМ глицина рН 3,0. МАЬ для элюции с селекции наносят непосредственно на встроенную колонку 65 мл 8Р-НР (СЕ НеаИксаге) в 8-буфере А (20 мМ NаН2ΡО4, рН 7,0) при скорости потока 10 мл/мин при 7°С. После отсоединения колонки для отбора МАЬ колонку 8Р-НР промывают несколькими объемами колонки 8буфером А, а затем проявляют в линейном градиенте от 5 до 60% 8-буфера В (20 мМ NаН2ΡО4, 1 М №С1, рН 7,0) при 10 мл/мин, а затем постепенно доводят до 100% 8-буфера В при 7°С. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 808-РАСЕ, и фракции, содержащие заданный продукт, собирают в соответствии с этими результатами. Затем собранный материал концентрируют примерно до 20 мл на центрифужном ультрафильтрационном устройстве Ра11 Ь1Ге 8с1епсез КнпЬозер 10К Отеда. Затем проводят буферный обмен, разбавляя 20 мл 20 мМ NаН2ΡО4, рН 7,0, и повторно концентрируют до 20 мл на фильтре ЛцпЬозер 10К Отеда. Затем материал разводят в 20 мл 20 мМ NаН2ΡО4, 200 мМ №С1, рН 7,0 и снова концентрируют до 22 мл. Затем материал, полученный в результате буферного обмена, фильтруют через Ра11 Ь1Ге 8с1епсез Асгоб1зс с фильтром 0,22 мкм, мембраной 25 мм Миз1апд Е при скорости потока, 1 мл/мин при комнатной температуре. Затем проводят спектральное сканирование на 50 мкл отфильтрованного материала, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре Не\\'1е11 Раскагб 8453 (фиг. 49 А, сплошная кривая). Концентрация отфильтрованного материала равна 4,96 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30371 г/моль и коэффициента экстинкции 35410 М-1 см-1. Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Э8-РАСЕ (фиг. 49В). Уровень эндотоксинов определяют, используя систему Скаг1ез В1уег БаЬогаЮпез ЕηбозаГе-ΡΤ8 (чувствительность 0,05-5 Еи/мл), при 30-кратном разведении образца в эндотоксин-специфическом буфере Скаг1ез В1уегз ЬаЬога1ог1ез, получают в результате 1,8 ЕИ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 149 мкг продукта, который вводят в колонку Ркепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2ΡО4, 250 мМ №С1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 49С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 мкл синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила) . Один миллилитр полученного раствора наносят на МАЙШ плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на времяпролетном масс-спектрометре Уоуадег ОЕ-ВР, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами (фиг. 49Ό). Затем продукт хранят при -80°С.
Выход Ес-Ь10-О8К1 ргер, экспрессированного в клетках млекопитающих, составляет 115 мг из 6 л, чистота составляет >90%, если судить по 8Э8-РАСЕ; Ес-Ь10-О8К1 выходит как предполагаемый димер, по данным 8ЕС-ВЭЖХ, а по данным М8 масса находится в ожидаемом интервале.
Активность очищенного Ес-Ь10-О8К1 при блокировании человеческого Ку1.3 и человеческого Ку1.1 описана ниже в примере 43.
Очистка Ес-Ь10-О8К1(К78), ЕС-Ь10-О8К1(Е16К,К20О) и Ес-Ь10-О8К1 (К78, Е16К, К20О). Около
- 118 013470
500 мл среды, кондиционированной трансфецированными клетками НΕΚ 293 (пример 41, см. выше) смешивают с 65% суспензии смолы для селекции ΜΑЬ 8е1ес1 (1,5 мл) (6Ε НеаЛйсаге) и 500 мкл 20% ΝηΝ3. Затем смолу осторожно перемешивают 3 дня при температуре 4°С с последующим центрифугированием при 1000 д в течение 5 мин при 4°С без торможения. Затем основную часть супернатанта отсасывают, а остаток суспензии в виде осадка (пеллет) переносят в пробирку с коническим дном на 14 мл и смешивают с 12 мл фосфатно-буферного раствора без двухвалентных катионов по Дульбекко (ΡΒ8). Суспензию центрифугируют при 2000 д в течение 1 мин при 4°С с мягким торможением и супернатант отсасывают. Цикл отмывания с помощью ΡΒ8 повторяют еще 3 раза. Затем связанный белок элюируют, добавляя 1 мл раствора глицина 100 мМ рН 3,0 и осторожно перемешивая 5 мин при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугируют при 2000 д в течение 1 мин при 4°С с мягким торможением и супернатант отсасывают, как при первой элюции. Цикл элюции повторяют еще 2 раза и все 3 супернатанта объединяют в один пул. К пулу, полученному после элюции, для повышения рН прибавляют ацетат натрия (37,5 мкл 3 М раствора), и затем его диализируют против 10 мМ уксусной кислоты, 5% сорбитола, рН 5,0 в течение 2 ч при комнатной температуре, используя 10 кДа 81^άеΑ1уζе^ (йегсе). Буфер для диализа заменяют и диализ продолжают в течение ночи при 4°С. Затем диализированный материал фильтруют через целлюлозно-ацетатный шприцевой фильтр 0,22 μιη. Концентрация отфильтрованного материала равна 1,27 мг/мл, как определено с учетом величин вычисленной молекулярной массы 30330 и коэффициента экстинкции 35410 М-1 см-1 (фиг. 50А). Чистоту отфильтрованного материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим триоглицин 4-20% 8Ό8-ΡΑΟΕ (фиг. 50В). Уровень эндотоксинов определяют, используя систему Сйаг1ез Ктег ЬаЬогаЮпек Εηάо5аίе-ΡТ8 (чувствительность 0,05-5 Ευ/мл), при 25-кратном разведении образца в эндотоксин-специфическом буфере Сйаг1ез Ктегз ЬаЬогаЮпез, получают в результате <1 Ευ/мг белка. Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 50 мкг продукта, который вводят в колонку Июнов-юнех Β^о8ер 8ΕС 3000 (7,8x300 мм) в 50 мМ NаН2ΡО4, 250 мМ №С1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 50С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ при разведении 1 мкл образца в 10 мкл синаповой кислоты (10 мг на мл в растворе 0,05% трифторуксусной кислоты, 50% ацетонитрила). Один миллилитр полученного раствора наносят на ΜΑί-ΌΙ плашку для образцов. Образец оставляют сохнуть, а затем анализируют на время-пролетном масс-спектрометре Уоуадег ΌΕ-ΡΡ, снабженном азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов. Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами. (фиг. 50Ό). Затем продукт хранят при -80°С.
На фиг. 51Α-Ό показаны результаты очистки и анализа Ес-^10-О8Κ1(Ε16Κ,Κ20^), которые проводят по протокол) для Ес-Ь10-ОзК1(К78) (описанному выше) за следующими исключениями: концентрация равна 1,59 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30357 г/моль и расчетного коэффициента экстинкции 35410; найденный в 3,2-кратном разведении уровень пирогенов <1 Ευ/мг.
На фиг. 52Λ-Ό показаны результаты очистки и анализа Ес-^10-О8Κ1(Κ78,Ε16Κ,Κ20^), которые проводят по протоколу для Ес-Ь10-ОзК1(К78) (описанному выше) за следующими исключениями: концентрация равна 0,81 мг/мл как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30316 г/моль и расчетного коэффициента экстинкции 35,410; найденный в 16-кратном разведении уровень пирогенов <1 Ευ/мг.
Активность очищенных Ес-Ь10-О8К1[К78], Ес-^10-О8Κ1[Ε16Κ,Κ20^] и Ес-^10-О8Κ1[Κ78,Ε16Κ, К20Э] при блокировании человеческого Νν1.3 и человеческого Νν1.1 описана ниже в примере 43.
Пример 43. Электрофизиологические исследования О8К1 и О8К1 аналогов пептидных антител.
Содержащий 38 остатков пептидный токсин яда азиатского скорпиона ОгЙюсЫгиз 8сгоЫси1о8и8 (О8К1) синтезируют (см. пример 41) с целью оценки его воздействия на Νν1.1 и Νν1.3 каналы, подтипы из семейства калиевых каналов. Эффективность и селективность синтетического О8К1 при ингибировании человеческого Νν1.1 и Νν1.3 каналов оценивают, используя систему экспрессии в клетках НΕΚ293 и электрофизиологические методы (фиг. 53). Регистрация стабильно экспрессируемых в цельных клетках Χν1.3 каналов методом пэтч-кламп (открытия-закрытия, Ρаΐсй С1ашршд) (методом оценки проницаемости ионных каналов с применением пэтч-пипеток) показывает, что синтетический О8К1 пептид более активно ингибирует человеческий Νν1.3 по сравнению с Νν1.1 (табл. 33).
Слияние О8К1 пептидного токсина с антителом с целью получения О8К1 пептидного антитела. Для увеличения периода полужизни и предупреждения проникновения О8К1 пептидного токсина в ЦНС (ΟΝδ) О8К1 пептидный токсин связывают с Ес-фрагментом человеческого ΙβΟ1 через линкерную цепь длиной 10 аминокислотных остатков (Ес-Ь10-О8К1), как описано выше в примере 41. Это слияние приводит к снижению активности в отношении Νν1.3 в 5 раз по сравнению с синтетическим О8К1 пептидом. Однако значительно повышает селективность О8К1 по отношению к Νν1.1 в 210 раз по сравнению с селективностью одного синтетического пептида (4-кратная; табл. 33 и фиг. 54).
Модификация О8К1-пептидного антитела (Ес-Ь10-О8К1). Последовательность О8К1 на 60-80%
- 119 013470 гомологична последовательностям других токсинов семейства скорпиона, которые вместе называются аКТх3. Выравнивание последовательности О8К1 с последовательностями других членов семейства аКТх3 выявляет 4 определенных структурных различия в положениях 12, 16, 20 и 36. Предполагают, что эти структурные отличия О8К1 играют важную роль в широком интервале его активностей в отношении других калиевых каналов, которые не наблюдаются у других членов семейства а-КТх3. Поэтому два аминокислотных остатка в положении 16 и 20 возвращены к более консервативным аминокислотным остаткам в последовательности О8К1, чтобы оценить их воздействие на селективность в отношении калиевых каналов, таких как Ку 1.1, который в С№ находится преимущественно в виде гетеродимера с Ку1.2. При замене консервативных остатков лизина и аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту в положении 16 и на лизин в положении 20 соответственно (т.е. Ес-Ь10-О8К1[Е16К,К20В]) мы не наблюдаем заметного изменения эффективности по сравнению с эффективностью Ес-Ь10-О8К1 (разница в 1,3 раза; фиг. 56 и табл. 33). Однако двойная мутация приводит к потере блокирующей активности в отношении Ку1.1. Отношение селективностей Ку1.1/Ку1.3 равно 403, что значительно выше отношения селективностей для Ес-Ь10-О8К1 (210). Единичная аминокислотная мутация в положении 7, замена лизина на серии (Ес-Ь10-О8К1[К78]) вызывает слабое изменение эффективности и селективности в 2 и в 1,3 раза соответственно по сравнению с этими характеристиками для Ес-Ь10-О8К1 (фиг. 55 и табл. 33). Когда мутируют все три остатка с образованием Ес-Ы0-О8К1[К78,Е16К,К20В] (фиг. 57 и табл. 33), наблюдается заметное снижение эффективности, а также селективности.
Как следует из результатов в табл. 33, мы резко повысили селективность в отношении Ку1.1 путем слияния О8К1 пептидного токсина с Ес-фрагментом человеческого антитела ^С1, но понизили эффективность в отношении Ку 1.3. Селективность в отношении Ку1.1 дополнительно повышается, когда 2 остатка в двух ключевых положениях возвращены к консервативным остаткам, находящимся в последовательностях других членов а-КТх3 семейства.
В табл. 33 показаны величины ^50 для О8К1 и О8К1 аналогов по отношению к кКу1.3 и кКу1.1 каналам. Все аналоги расположены в соответствии с их эффективностью против кКу1.3. Также в таблице показано отношение селективностей кКу1.1/ЬКу1.3 для всех О8К1 аналогов.
Таблица 33
Пример 44. Фармакокинетическое исследование РЕС(ПЭГ) 8кК[1-35] на крысах.
Фармакокинетический профиль после внутривенного (в.в., ГУ) введения пептида 20К РЕС-8кК[135] протяженностью примерно 24 кДа и малого нативного пептида 8кК протяженностью примерно 4 кДа определяют на крысах 8ргацие 1)а\с1еу. В.в. доза нативного 8кК пептида и нашего нового пептида 20К РЕС-8кК[1-35] составляет 1 мг/кг. Эта доза содержит равные молярные количества этих двух соединений. Средний вес крыс составляет около 0,3 кг и для каждой дозы и каждого соединения берут по две крысы. В разное время после в.в. инъекции отбирают пробу крови и около 0,1 мл сыворотки. Образцы сыворотки хранят замороженными при ~80°С до момента анализа.
Подготовка аналитических планшетов к электрофизиологическому исследованию. Образцы крысиной сыворотки, содержащие 20К РЕС-8кК[1-35] или нативный 8кК пептид из фармакокинетических исследований получают в замороженном состоянии. Перед экспериментами каждый образец размораживают при комнатной температуре и аликвоту (70-80 мкл) переносят в лунку 96-луночного полипропиленового планшета. Для приготовления аналитического планшета делают несколько разведений сывороточных образцов из фармакокинетических исследований, получая тест-растворы (испытуемые растворы). Разведение сывороточных образцов из фармакокинетических исследований проводят в 10% фосфатнобуферном растворе (РВ8, с Са2+ и Мд2+). При определении количества нашего нового 20К РЕС-8кК[1-35] соединения в сывороточных образцах из фармакокинетического исследования конечные сывороточные концентрации в тест-растворах равны 90%, 30%, 10%, 3,3% и 1,1%. Очищенный 20К РЕС-8кк[1-35] для стандартных кривых ингибирования также готовят в аналитическом планшете. Для этого по 8 точкам методом серийных разведений очищенного 20К РЕС-8кК[1-35] (8капбагб) готовят растворы в 90%, 30%, 10%, 3,3% или 1,1% крысиной сыворотке, а конечная концентрация стандарта равна 50, 16,7, 5,5, 1,85, 0,62, 0,21, 0,068 и 0,023 нМ.
Подготовка клеток к электрофизиологическому исследованию. Клетки СНО, стабильно экспрессирующие потенциал-активируемый К канал, Ку1.3, помещают в колбы Т-175 для тканевых культур (при плотности 5х106) за 2 дня до эксперимента и оставляют расти примерно до 95% конфлюентности (моно
- 120 013470 слоя). Непосредственно перед экспериментом клетки отмывают РВ8. а затем расщепляют. используя 2 мл смеси (объемное соотношение 1:1) трипсина (0.25%) и версена (1:5000) при 37°С (в течение 3 мин). Затем клетки ресуспендируют в колбе в 10 среды для тканевых культур (НАМ Б-12 с глютамаксом (С1и(атах). 1пУйгодеп. Са(#31765) с 10% БВ8. 1х КЕАА и 750 мкг/мл С418) и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1'/2 мин. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в РВ8 при плотности 3-5 х106 клеток/мл.
Электрофизиологическая система 1опАогкк и анализ данных. Способность тест-растворов или стандартов в сыворотке ингибировать К+ токи в СНО-Кт1.3 клетки исследуют на автоматической электрофизиологической системе 1опАогкк Она((го. Ресуспендированные клетки. аналитический планшет и субстрат Рорц1а!юп Ра(сН С1атр (РРС) Ра(сНР1а(е. а также подходящий внутриклеточный (90 мМ Кглюконата. 20 мМ КР. 2 мМ Мао. 1 мМ МдС12. 10 мМ ЕСТА. 10 мМ НЕРЕ8. рН 7.35) и внеклеточный (РВ8. с Са2+ и Мд2+) буферы располагают на 1опАогкк Она((го. Электрофизиологические данные регистрируют при использовании СНО-Кт1.3 клеток методом перфорированного пэтч-кламп (ра(сН-с1атр) с амфотерицином. Используя потенциал-фиксированную схему 1опАогкк Она((го. клетки выдерживают при мембранном потенциале -80 мВ. и потенциал-активируемые К+ токи инициируются при постепенном повышении мембранного потенциала до +30 мВ в течение 400 мс. К+ токи инициируются в контрольных условиях. т. е. в отсутствие ингибитора. в начале эксперимента и после 10 инкубации в присутствии тест-раствора или стандарта. Среднюю амплитуду К+ тока измеряют между 430 и 440 мс и данные экспортируют в программу электронных таблиц Мюгокой Ехсе1 кргеайкНее(. Амплитуду К+ тока при каждой концентрации тест-раствора или стандарта выражают в процентах от К тока в контрольных условиях в той же лунке.
Стандартные кривые ингибирования получают для каждого стандарта при различных уровнях крысиной сыворотки и выражают как зависимость тока в процентах от контроля (РОС) от 1од концентрации в нМ. Процент от контроля (РОС) находится в обратной зависимости от ингибирования. причем 100 РОС обозначает отсутствие ингибирования. а 0 РОС обозначает 100%-ное ингибирование. Линейную регрессию в выбранной области кривой используют для получения уравнения. позволяющего рассчитать концентрацию лекарств в тес-растворах. Для расчета концентрации лекарства в тест-растворах используют только величины тока на линейном участке стандартной кривой. При расчете уровня лекарства соответствующую стандартную кривую при данном уровне сыворотки всегда сравнивают с тем же уровнем сыворотки тест-раствора. Стандартные кривые для 8НК и 20К РЕС-8НК[1-35] показаны на фиг. 58А и 58В соответственно. и каждая фигура содержит уравнения линейной регрессии для каждого стандарта при данном процентном содержании сыворотки. В случае стандартной кривой для 20К РЕС-8НК[1-35] линейный участок стандартной кривой тянется от 20 до 70 РОС и только величины тока от тест-раствора. попадающие в этот интервал. используют для расчета концентрации лекарства в тест-растворе.
Фармакокинетический профиль нашего нового соединения 20К РЕС-8НК[1-35] после в.в. (IV) инъекции показан на фиг. 59. Конечный период его полужизни (ί1/2 Ь). установленный по этой кривой. составляет 6-12 ч. После 48 ч уровень лекарства находится вне линейного интервала стандартной кривой и не рассчитывается. Вычисленная продолжительность периода полужизни 6-12 ч нашего нового пептида 20К РЕС-8НК[1-35] значительно больше. чем примерно 0.33 ч (или 20 мин). период полужизни нативного 8НК. указанный ранее С. Вее(оп е( а1. [С. Вее(оп е( а1. (2001) Ргос. Кай Асай. 8сг 98. 13942-13947]. и является желательным признаком терапевтического соединения. Сравнение относительных уровней ингибитора Кт 1.3 после в.в. инъекции эквимольного количества 8НК относительно 20К РЕС-8НК[ 1-35] показано на фиг. 60. Как можно видеть на этой фигуре. где показано исследование на 5% сывороточных тест-растворах. 20К РЕС-8НК[1-35] значительной степени подавляет ток Кт1.3 (<70 РОС) в течение более 24 ч. тогда как в случае нативного 8НК пептида заметный уровень ингибирования тока Кт1.3 наблюдается в течение первого часа. а после 1 никакой заметной блокады не видно. Эти результаты снова демонстрируют желаемый признак 20К РЕО 8НК[1-35] как лекарственного вещества для лечения аутоиммунного заболевания.
Пример 45. Пэгилированный токсичный пептид подавляет тяжелый аутоиммунный энцефаломиелит на животной модели.
20КРЕС-8НК ингибитор Кт1.3 проявляет повышенную эффективность при подавлении тяжелого аутоиммунного энцефаломиелита у крыс. Используя модель рассеянного склероза с адоптивным переносом экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (АТ-ЕАЕ). описанную ранее [С. Вее(оп е( а1. (2001) I. 1шшцпо1. 166. 936]. мы изучали активность 1п тАо нашего нового 20К РЕС-8НК и сравнили с его эффективность с эффективностью одного 8НК токсина. Дизайн исследования иллюстрируется на фиг. 61. Результаты этого 1п тйо исследования приводятся на фиг. 62 и 63. Пептид 20К РЕС-8НК. доставляемый подкожно (8С) в дозе 10 мкг/кг в сутки. начиная со дня -1 до дня 3. значительно снижает тяжесть заболевания и повышает выживаемость. тогда как у животных. получавших эквимольную дозу (10 мкг/кг) малого пептида 8НК. развивалось тяжелое заболевание. и они умирали.
Токсичный пептид 8НК из 35 аминокислот (нейротоксин 8(1сНойас(у1а НеЕапЙшк) получают от ВасНет Вюкаепсе 1пс. и электрофизиологическими методами подтверждают его способность эффективно блокировать Кт1.3 (см. пример 36 в данном описании). Синтез. пэгилирование и очистку 20К РЕС
- 121 013470
8ΗΚ проводят, как указано выше в данном описании. Энцефаломиелогенную СЭ4+ Т-клеточную линию крыс, РА8, специфическую к основному белку миелина (МВР), получают от Όγ. Ενе1уηе Вегаиб. Сохранение этих клеток ш νί!ΐΌ и их применение на АТ-ЕАЕ модели описано ранее [С. Вее!оп е! а1. (2001) ΡNА8 98, 13942]. РА8 Т клетки поддерживают ш νίΐΐΌ, чередуя циклы антигенной стимуляции или активации МВР и облученными тимоцитами (2 дня) и размножения с помощью факторов роста Т клеток (5 дней). Активация РА8 Т клеток (3х105/мл) включает инкубацию клеток в течение 2 дней с 10 мкг/мл МВР и 15х106/мл сингенных облученных (3500 рад) тимоцитов. На 2 день после ш νί!ΐΌ активации 1015х 106 жизнеспособных РА8 Т клеток инъецируют 6-12-недельным самкам крыс Льюиса (Ее\\зк) (СНаг1ек Е|уег ЬаЬога!опек) в.в. (IV) в хвост. Ежедневные подкожные инъекции носителя (2% сыворотки крыс Льюиса в РВ8), 20Κ РЕС-8Н< или 811Κ делают в дни с -1 до 3 (фиг. 61), где день -1 обозначает за 1 день до инъекции РА8 Т клеток (день 0). У крыс, которым вводят носитель, острый ЕАЕ развивается на 4-5 день после инъекции РА8 Т клеток (фиг. 62). Сыворотку собирают пункцией ретробульбарного синуса на 4 день и пункцией сердца на 8 день (окончание исследования) для анализа уровней ингибитора. Крыс взвешивают в -1, 4, 6 и 8 день. Крыс оценивают вслепую раз в день, начиная с дня переноса клеток (день 0) до дня 3, и дважды в день с дня 4 до дня 8. Клинические признаки оценивают в виде общей оценки степени пареза каждой лапы и хвоста. Клиническая оценка: 0 = признаки отсутствуют, 0,5 = вялый, слабый, поникший дистальный отдел хвоста, 1,0 = вялый хвост, 2,0 = слабый парапарез, атаксия, 3,0 = умеренный парапарез, 3,5 = паралич одной задней конечности, 4,0 = полный паралич задних конечностей, 5,0 = полный паралич задних конечностей и недержание, 5,5 = тетраплегия, 6,0 = агония или смерть. Крыс с оценкой 5,5 умерщвляли.
Лечение крыс с применением Κν1.3 блокатора РЕС-8Н< до начала ЕАЕ приводит к задержке начала заболевания и предотвращает смерть в зависимости от дозы (фиг. 62). Начало заболевания у крыс, которые получают один носитель, 10 мкг/кг 81Κ или 1 мкг/кг ΡЕС-8НΚ. наблюдают на 4 день, по сравнению с 4,5 днями у крыс получавших 10 мкг/кг РЕС-8Н< или 100 мкг/кг РЕС-8К. Помимо этого, у всех крыс, получавших один носитель, 10 мкг/кг 8ΗΚ или 1 мкг/кг РЕС- 81Κ, к концу исследования развилось тяжелое заболевание с оценкой по шкале ЕАЕ 5,5 или выше. Напротив, у крыс, получавших 10 мкг/кг РЕС8ΗΚ или 100 мкг/кг ΡЕС-8НΚ. оценка пика тяжести по клинической шкале оценок в среднем <2, и все крысы, кроме одной, были жизнеспособны до конца исследования. Кроме того, мы нашли, что масса тела крыс коррелирует с тяжестью заболевания (фиг. 63). Все крысы, получавшие один носитель, 10 мкг/кг 8ΗΚ или 1 мкг/кг РЕС-5К, в среднем потеряли 31 г, 30 г и 30 г соответственно, тогда как крысы, получавшие 10 мкг/кг РЕС-8К или 100 мкг/кг РЕС-БЖ, потеряли 18 г и 11 г соответственно. У крыс в последних двух группах также наблюдалось увеличение веса к концу исследования, что является признаком выздоровления. Следует отметить, что крысы, получавшие 10 мкг/кг РЕС-8НЕ или 100 мкг/кг РЕС81Κ, получают мольные эквиваленты 811Κ пептида. Значительно более высокая эффективность РЕС-8НЕ по сравнению с неконъюгированным 811Κ, по-видимому, вызвана более высокой стабильностью и более продолжительным периодом полужизни РЕС-8111< ш νί\Ό (см. пример 44).
Пример 46. Композиции, включающие Κν1.3 антагонистические пептиды, блокируют воспаление в человеческой цельной крови.
Ех νί\Ό анализ с целью изучения влияния Κν1.3 ингибиторов на секрецию 1Ь-2 и ΙΕΝ-д. Человеческую цельную кровь получают от здоровых, не получавших лекарств доноров, в гепариновых вакуумных контейнерах. Полные среды ЭМЕМ представляют собой среды Искова (Iксονек) ЭМЕМ (с Ь-глутамином и 25 мМ буфера Нерек), содержащие 0,1% человеческого альбумина (Вауег #68471), 55 мкМ 2меркаптоэтанола (С1Ьсо) и 1Х Реп-8!гер-6т (Р86, С1Ьсо, Са!#10378-016). Тапсигаргин получают от А1отопе ЬаЬк (1кгае1). Исходный 10 мМ раствор тапсигаргина в 100% ДМСО разводят с помощью полной среды ЭМЕМ до концентрации 40 мкМ, 4Х раствор для того, чтобы обеспечить стимуляцию 4Х тапсигаргином мобилизации кальция. Ингибирующий Κν1.3 пептид 811Κ (токсин Збскобасуба НеНапШик, Са!# Н2358) и ингибирующий ВΚСа1пептид 1ЬТх (1Ьепо!охт, Са!# Н9940) получают от ВасНет Вюкаепсек, тогда как Κν1.1 ингибирующий пептид ОТХ-к (^еπб^ο!οx^π-Κ, дендротоксин-К) получен от А1отопе ЬаЬк (1кгае1). Полученное при использовании СНО Ес-Е10-8111<|2-35| пептидное антитело, ингибитор Κν1.3, получают как указано в примере 4 и 39 в данном описании. Ингибитор кальциневрина циклоспорин А получают из банка образцов Атдеп, но его можно также получать от различных поставщиков. Десять 3-кратных серийных разведений ингибиторов готовят в полной среде ЭМЕМ с конечной концентрацией 4Х и 50 мкл каждого вносят в лунки 96-луночного плоскодонного микротитрационного планшета Ра1соп 3075. В то время как в лунках микропланшета вертикальных рядов 1-5 и 7-11 содержатся ингибиторы (каждый ряд с серийными разведениями отдельного ингибитора), 50 мкл одной полной среды ОМЕМ добавляют в 8 лунок в вертикальном ряду 6 и 100 мкл одной полной среды ОМЕМ добавляют в 8 лунок в вертикальном ряду 12. Для инициации эксперимента в каждую лунку титрационного микропланшета добавляют 100 мкл цельной крови. Затем планшет инкубируют при 37°С, 5% СО2 1 ч. Через 1 ч планшет удаляют и в каждую лунку планшета, за исключением 8 лунок вертикального ряда 12 добавляют 50 мкл 4Х тапсигаргина в качестве стимула (40 мкМ). Планшеты снова помещают в условия 37°С, 5% СО2 на 48 ч. Для определения количества 1Ь-2 и ΙΕΝ-д, секретируемого в цельной крови, 100
- 122 013470 мкл супернатанта (кондиционированных сред) из каждой лунки 96-луночного планшета переносят в планшет для хранения. Для МБО электрохемилюминесцентного анализа продукции цитокинов 20 мкл супернатантов (кондиционированных сред) добавляют в изготовленные по заказу Ми1!1-Бро! Си8!от Соа!ед планшеты с иммобилизованным (\\л\лг.те8о-8са1е.сот). Рабочие электроды на этих планшетах заранее покрывают четырьмя иммобилизованными антителами (ЫЬ-5, ЫЬ-2, и ЫЬ-4). После добавления 20 мкл кондиционированных сред в МБЬ планшет, в каждую лунку добавляют 150 мкл коктейля из идентифицирующих антител и Р4 буфер. 150 мкл коктейля содержит 20 мкл четырех идентифицирующих антител (ЫЬ-5, ЫЬ-2, ЫЕ^ и ЫЬ-4) с концентрацией каждого 1 мкг/мл и 130 мкл 2Х Р4 буфера. Планшеты покрывают и помещают на платформу для встряхивания на ночь (в темноте). На следующее утро планшеты читают на МБЬ Бес!ог Епадег. Так как 8 лунок в вертикальном ряду 6 каждого планшета содержат только стимул тапсигаргин и никакого ингибитора, средний МБЬ ответ в данном случае используют для расчета Высшее (Н1дИ) значения для планшета. Низшее (Ьоте) значение для планшета вычисляют исходя из среднего МБЬ ответа в 8 лунках вертикального ряда 12, не содержащих ни стимула тапсигаргина, ни ингибитора. Процент от контроля (РОС) представляет собой меру ответа по сравнению с контрольными величинами ответа нестимулированных относительно стимулированных, где 100 РОС эквивалентно среднему значению ответа одного стимула тапсигаргина или Высшей (Н1дИ) величине. Следовательно, 100 РОС представляет собой 0% ингибирования ответа. Напротив, 0 РОС обозначает 100% ингибирование ответа и эквивалентно ответу в отсутствие стимула или Низшему значению. Для расчета процента от контроля (РОС) применяют следующую формулу:
[(М8Б ответ лунки)-(Ьо\)]/[(Н1дИ)-(Ьо\)]х100.
Эффективность соединений в цельной крови рассчитывают по кривой ингибирования (К), а Κ.'50 получают, используя стандартную программу построения кривой. Хотя мы в данном описании рассказываем об измерении продуцирования цитокинов с применением высокопроизводительного МБЬ электрохемилюминесцентного анализа, специалист в данной области техники может легко представить, что более низкопроизводительные методы анализа ЕЫБА можно с равным успехом применять для измерения продукции цитокинов.
Ех у1уо анализ, демонстрирующий, что Ку1.3 ингибиторы блокируют активацию клеточной поверхности СЬ40Ь и ГЬ-2К. Человеческую цельную кровь получают от здоровых, не получавших лекарств доноров, в гепариновых вакуумных контейнерах. Полные среды ЬМЕМ представляют собой среды Искова (Ысоуе8) ЬМЕМ (с Ь-глутамином и 25 мМ буфера Нере8), содержащие 0,1% человеческого альбумина (Вауег #68471), 55 мкМ 2-меркаптоэтанола (С1Ьсо) и 1Х Реи-Б1гер-Сш (РБС, С1Ьсо, Са!#10378-016). Тапсигаргин получают от А1отоие ЬаЬ8 П8гае1). Исходный 10 мМ раствор тапсигаргина в 100% ДМСО разводят с помощью полной среды ЬМЕМ до концентрации 40 мкМ, получают 4Х раствор для того, чтобы обеспечить стимуляцию 4Х тапсигаргином (стимул тапсигаргин) мобилизации кальция. Ингибирующий Ку 1.3 пептид БИК (токсин БЕсИодасуИа Ие11аи1Ьи8, Са!# Н2358) и ингибирующий ВКСа1 пептид ЫТ.х (кепо^т, Са!# Н9940) получают от ВасИет Вю8аеисе8, тогда как Ку1.1 ингибирующий пептид ЬТХ-к (Пеидго!охт-К, дендротоксин-К) получен от А1отоие ЬаЬ8 П8гае1). Полученное при использовании СНО Ес-Ь10-БИК[2-35] пептидное антитело, ингибитор Ку1.3, получают, как указано в примере 4 и 39 в данном описании. Ингибитор кальциневрина циклоспорин А получают из банка образцов Атдеи, но его можно также получать от различных поставщиков. Ингибиторы ионных каналов БИК, ЫТ.х или ЬТКк разводят в полных средах ЬМЕМ до 4Х нужной конечной концентрации (конечная концентрация = 50 или 100 нМ). Ингибитор кальциневрина циклоспорин А также разводят в полных средах ЬМЕМ до 4Х нужной конечной концентрации (конечная концентрация =10 нМ). В соответствующие лунки 96луночного плоскодонного Еа1сои 3075 добавляют 50 мкл либо полной среды ЬМЕМ, либо 4Х растворов ингибитора. Затем добавляют 100 мкл человеческой цельной крови и планшет инкубируют 1 ч при 37°С, 5% СО2. Через 1 ч планшет убирают и в каждую лунку планшета, содержащую ингибитор, добавляют 50 мкл 4Х тапсигаргина в качестве стимула (40 мкМ). В некоторые лунки, не содержащие ингибитора, но содержащие только полные среды ЬМЕМ, также добавляют тапсигаргин, тогда как в другие лунки, содержащие только полные среды ЬМЕМ, не добавляют дополнительно 50 мкл полных сред ЬМЕМ. Лунки, не содержащие никакого ингибитора и стимула тапсигаргина, являются низшим (Ьоте) контролем. Лунки, не содержащие ингибитора, но содержащие тапсигаргин стимул, являются контрольными для максимальной стимуляции, или высшим контрольным значением. Планшеты снова помещают в условия 37°С, 5% СО2 на 24 ч. Через 24 ч планшеты убирают и лунки обрабатывают для ЕАСБ анализа. Клетки удаляют из лунок и отмывают в окрашивающем буфере (фосфатно-буферном растворе, содержащем 2% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки). Эритроциты лизируют, применяя лизирующий раствор ВО ЕАСБ, содержащий 15% формальдегида (ВО Вю8аеисе8), в соответствии с инструкцией производителя. Клетки распределяют с концентрацией 1 миллион клеток на 100 мкл окрашивающего буфера в пробирке. Клетки сначала окрашивают, используя 1 мкл меченных биотином антител к человеческим СЭ4, отмывают, затем окрашивают одновременно с помощью 1 мкл каждого из реагентов: стрептавидина-АРС, меченных ПТС антител к человеческим СЭ45ЕА и меченных фикоэритрином (РЕ) антител к человеческим С О40Ь. Клетки отмывают окрашивающим буфером между стадиями добавления антител. Все антитела получают от ВО Вю8с1еисе8 (Бат О1едо, СА). От двадцати до пятидесяти
- 123 013470 тысяч живых клеток (ехеп1к) собирают для каждого образца на проточном цитометре ВесЮп Оюкткоп ЕАС8Са11Ьег (Моип1ат ^ех, СА) и анализируют с помощью программы Е1ох1о (Тгее 81аг Лс., 8ап Саг1ок, СА). Погибшие клетки, моноциты и гранулоциты исключают из анализа на основании разброса свойств.
На фиг. 64 и 67 видно, что Κν1.3 ингибиторы 8ΗΚ и Εс-^10-8ЬΚ[2-35] эффективно блокируют секрецию ΙΕ-2 в клетках человеческой цельной крови, помимо подавления активации ΙΕ-2Κ на СЭ4+ Т клетках. Эффективность ингибитора Κν1.3 Εс-^10-8ЬΚ[2-35] при блокировании продуцирования Л-2 в человеческой цельной крови более чем в 200 раз превосходит эффективность циклоспорина А (фиг. 64), что отражается величиной !С50. На фиг. 65 видно, что ингибиторы Κν1.3 также эффективно блокируют секрецию ШИд в человеческой цельной крови, а на фиг. 66 демонстрируется, что позитивная регуляция СО40Ь на Т клетках дополнительно блокируется. Данные, представленные на фиг. 64-67, показывают, что Εс-^10-8ЬΚ[2-35] устойчив в клетках цельной крови при 37°С до 48 ч, что обеспечивает мощную блокаду воспалительных реакций. Необходимы токсичные пептиды как терапевтические агенты, нацеленные на Κν1.3 и имеющие продолжительный период полужизни, для обеспечения длительной блокады этих реакций ш νί\Ό во времени. Напротив, несмотря на то, что Κν1.3 ингибирующий пептид 8ΗΚ также является мощным блокатором в цельной крови, пептид 8ΗΚ имеет очень короткий период полужизни (~20 мин) ш х1хо (С. ВееЮп е1 а1. (2001) Ргос. №11. АсаБ. 8ск 98, 13942) и, следовательно, не может обеспечить пролонгированную блокаду. Анализ цельной крови является физиологически релевантным, позволяющим прогнозировать ответ у животных. Анализы цельной крови по данному описанию можно также использовать в качестве фармакодинамических (ΡΌ) анализов для измерения охвата цели и экспо зиции с лекарством после введения дозы пациентам. Эти данные, полученные на человеческой цельной крови, подтверждают терапевтическую полезность составов по настоящему изобретению для лечения различных иммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, типа 1 диабет, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, контактный дерматит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, астма, аллергия, рестеноз, системный склероз, фиброз, склеродермия, гломерулонефрит, синдром Шегрена, воспалительная резорбция кости, отторжение трансплантата, болезнь трансплантат-против-хозяина и волчанка.
Пример 47. Пэгилированные пептидные антитела.
Пэгилированные антитела по данному изобретению можно получать, например, следующим способом. К экспрессированному в СНО ЕсЬ10-0к<1 (19,2 мг; М.в. 30371 Да, 0,63 мкмоль) в 19,2 мл А58, 20 мМ NаВНзСN, рН 5, прибавляют 38 мг ПЭГ альдегида (М.в. 20 кДа; 3х, Ьо1 (партия) 104086). Герметизированную реакционную смесь перемешивают в холодной комнате в течение ночи. Степень модификации белка в ходе реакции контролируют с помощью 8ЕС ВЭЖХ на колонке 8ирегоке 6 НК 10/30 (АтегкИат РНаппааа Вю1есй), элюент 0,05 М фосфатного буфера, 0,5 М №С1, рН 7,0 при скорости потока 0,4 мл/мин. Реакционную смесь диализируют с помощью А58, рН 5 в течение ночи. Диализированный материал затем наносят на колонку 8Р НР ЕРЬС (16/10) в А58 рН 5 и элюируют в градиенте 1 М №С1. Собранные фракции анализируют с помощью 8ЕС ВЭЖХ, объединяют в 3 пула, обменивают в ЭРВ8, концентрируют и подвергают функциональному тестированию (табл. 34).
В другом примере к Εс^10-8йΚ1 (16,5 мг; М.в. 30065 кДа, 0,55 мкмоль) в 16,5 мл А58, 20 мМ NаВНзСN, рН 5 прибавляют 44 мг ПЭГ альдегида (М.в. 20 кДа; 4х, партия (Ьо1) 104086). Герметизированную реакционную смесь перемешивают в холодной комнате в течение ночи. Степень модификации белка в ходе реакции контролируют с помощью 8ЕС ВЭЖХ на колонке 8ирегоке 6 НК 10/30 (АтегкИат РНаппааа Вю1есй), элюент 0,05 М фосфатного буфера, 0,5 М №С1, рН 7,0 при скорости потока 0,4 мл/мин. Реакционную смесь диализируют с помощью А58, рН 5 в течение ночи. Диализированный материал затем наносят на колонку 8Р НР ЕРЬС (16/10) в А58 рН 5 и элюируют в градиенте 1 М №С1. Собранные фракции анализируют с помощью 8ЕС ВЭЖХ, объединяют в 3 пула, обменивают в ЭРВ8, концентрируют и подвергают функциональному тестированию (табл. 34).
Данные в табл. 35 демонстрируют эффективность пэгилированных пептидных антител в качестве ингибиторов Κν 1.3.
В табл. 34 показаны значения ΙΟ50, определенные электрофизиологическим методом пэтч-кламп (ра1сй-с1атр) на цельных клетках с помощью НЕ< 293, как описано выше в примере 36. Величину продолжительной Юзо получают при токе через 400 мс после возрастания потенциала от -80 мВ до +30 мВ. Образцы из пула #2 содержат дипэгилированные пептидные антитела, а образцы пула #3 содержат монопэгилированные пептидные антитела.
- 124 013470
Пэгилированное пептидное антитело Пул # 1С50 пролонгирован. (нМ)
РЕО-Рс-Ь10-8НК(2-35) 3 0.175 (п=4)
РЕО-Рс-Ы 0-8НК(2-35) 2 0.158 (п=4)
РЕО-РС-Ы0-О8К1 3 0.256 (п=3)
РЕО-РС-Ы0-О8К1 2 0.332 (п-3)
Пример 48. Пэгилированные токсичные пептиды.
Пэгилирование, очистка и анализ БИк и Озк-1. Синтетические БИк или ОБК1-1 токсичные пептиды селективно пэгилируют восстановительным алкилированием по Ν-концам. Конъюгации достигают, либо в случае БИк, либо в случае ОБК-1 токсичных пептидов, при концентрации 2 мг/мл в 50 мМ буфере для реакции КаНРОд, рН 4,5, содержащем 20 мМ натрия цианоборогидрида и 2-молярный избыток 20 кДа монометокси-ПЭГ-альдегида (\е'к!аг ТИегареийсз, Нип!зу111е, АЬ). Реакционную смесь для реакции конъюгации перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, а за ее ходом следят с помощью ОФ-ВЭЖХ. По завершении реакции реакционную смесь разводят в 4 раза, добавляя 20 мМ №ОАс, рН 4, доводят до рН 3,5 и охлаждают до 4°С. Затем ПЭГ-пептиды очищают колоночной хроматографией при 4°С на колонках БР Берйагозе НР (СЕ Неа1!йсаге, Р1зса!а^ау, ΝΙ), элюируют в линейном градиенте 0-1 М \аС1 в 20 мМ №ОАс, рН 4,0 (фиг. 68А и 68В). Элюированные фракции пиков анализируют методами БОБ-РАСЕ и ОФ-ВЭЖХ и определяют, что чистота пула >97%. Основными наблюдаемыми примесями является дипэгилированный токсичный пептид и немодифицированный токсичный пептид. Выбранные пулы концентрируют до 2-5 мг/мл на центрифужной установке фильтрацией через мембраны 3 кДа МVСО и диализируют против 10 мМ ШОАс, рН 4 с 5% сорбитола. Затем диализированные пулы подвергают стерильной фильтрации через фильтры 0,2 мкм и методами БОБ-РАСЕ и ОФ-ВЭЖХ определяют, что чистота пула >97% (фиг. 69А и 69В). Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводят на ВЭЖХ хроматографе модели Адйеп! 1100, используя колонку /огЬах 5 мкм 300БВ-С8 4,6 х 50 мм (РИепотепех), в 0,1% ТРА/Н2О при скорости потока 1 мл/мин и поддерживают температуру в колонке 40°С. Вводят образцы ПЭГ-пептида (20 мкг) и элюируют в линейном градиенте 6-60%, контролируя области длин волн 215 и 280 нм.
Электрофизиологические исследования проводят методом пэтч-кламп (ра!сИ с1атр) на цельных клетках (см. пример 36), получают пик 1С50 1,285 нМ для РЕС-ОБК1 и 0,169 нМ для РЕС-БИК[1-35] (фиг. 74), зависимую от концентрации блокаду внешнего калиевого тока регистрируют при использовании НЕК293 клеток, стабильно экспрессирующих Ку1.3 канал. Очищенный РЕС-БИК[1-35], также называемый 20К РЕС-БИК[1-35] и РЕС-БИК, имеет значительно более продолжительный период полужизни т у1уо, чем малый БИК пептид (фиг. 59 и 60). РЕС-БИК[1-35] подавляет тяжелый аутоиммунный энцефаломиелит у крыс (пример 45, фиг. 61-63) и проявляет более высокую эффективность, чем малый нативный БИК пептид.
Пример 49. Инсерции Рс петли токсичных пептидов БИК и ОБК1.
Приведенные в качестве примера на фиг. 70, 71, 72 и 73 связанные дисульфидной связью токсичные пептиды встраивают (инсерции) в домен Рс-1оор (петля) человеческого 1дС1, определяемый как последовательность Э137Е138Ъ139Т14оК141, согласно методу, опубликованному в примере 1 в Седд е! а1., МоШйей Рс то1еси1ез, международная заявка νθ 2006/036834 А2 [РСТ/иБ 2005/034273]. В качестве примеров получают РсЕоор-Е2-ОзК1-Е2, РсЕоор-Е2-БИК-Е2, РсЕоор-Е2-БИК-Е4 и РсЕоор-Е4-ОзК1-Е2, имеющие три связанных домена. Их собирают, очищают и подвергают функциональному тестированию.
Пептидные инсерции для этих примеров находятся между Рс остатками йеиш и ТИг140 и включают 2-4 остатка С1у в качестве линкеров, фланкирующих любую сторону встроенного пептида. Однако другие сайты инсерции в последовательности человеческого 1дС1 Рс или другие линкеры также применимы при практическом использовании настоящего изобретения, они известны в уровне техники, например описаны в примере 13 Седд е! а1., МоШйей Рс то1еси1ез, международная заявка VО 2006/036834 А2 [РСТ/иБ 2005/034273].
Пример 50. Очистка БйК(2-35)-Е-Рс от Е. со11.
Замороженную пасту Е. сой (117 г), полученную, как описано выше в примере 16, смешивают с 1200 мл раствора комнатной температуры, содержащего 50 мМ трис НС1, 5 мМ ЕОТА, рН 7,5, и добавляют примерно к 0,1 мг/мл лизоцима белка куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12000 РБ1 (82,73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 17700 д в течение 30 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 1200 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 17700 д в течение 30 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 1200 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 17700 д в течение 30 мин при 4°С. Затем 6,4 г пеллет (всего 14,2
- 125 013470
г) растворяют в 128 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем 20 мл раствора пеллет инкубируют с 0,67 мл 1 М ЭТТ в течение 60 мин при 37°С. Восстановленный материал переносят в 5500 мл буфера для рефолдинга (3 М мочевины, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 2,5 мМ БЭТА, 2,5 мМ цистамина НС1, 4 мМ цистеина, рН 9,5) при 4°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 3 дней при 4°С.
Продукт после рефолдинга разводят в 5,5 л воды и рН раствора доводят до 8,0 с помощью уксусной кислоты, затем раствор фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и нагружают на колонку 35 мл АтегзЕат О 8ерЕагозе-ЕЕ (2,6 см вн. диаметр, Ι.Ό.) при скорости потока 10 мл/мин в 0-буфере А (20 мМ Трис, рН 8,5) при температуре 8°С с встроенной колонкой 35 АтегзЕат МаЬ 8е1ес1 (2,6 см вн. диаметр). После загрузки колонку О 8ерЕагозе удаляют и в дальнейшем хроматографию проводят на колонке МаЬ 8е1ес1. Затем колонку промывают 0-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют постепенно доводя до 100 мМ глицина рН 3,0. Фракции, содержащие заданный продукт, сразу же нагружают на колонку 5,0 мл АтегзЕат 8Р-8ерЕагозе НР при скорости потока 5 мл/мин в 8-буфере А (10 мМ NаН2Р04, рН 7,0) при температуре 8°С. Затем колонку промывают 8буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют в линейном градиенте от 5 до 60% 8-буфера В (10 мМ NаН2Р04, 1 М рН 7,0), постепенно доводя до 100% 8-буфера В. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Ό8РАСЕ. Фракции, содержащие в основном заданный продукт, объединяют, а затем наносят на колонку 50 мл МЕР Нурегсе1 (2,6 см Ι.Ό.) при скорости потока 10 мл/мин в МЕР буфере А (20 мМ трис, 200 мМ ^С, рН 8,0) при температуре 8°С. Продукт из колонки элюируют в линейном градиенте от 5 до 50% МЕР буфера В (50 мМ цитрата натрия рН 4,0), а затем постепенно доводят до 100% МЕР буфера В. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Ό8РАСЕ, и фракции, содержащие в основном заданный продукт, объединяют.
Пул в МЕР буфере затем концентрируют примерно до 10 мл на центрифужном ультрафильтрационном устройстве Ра11 1итЬо-8ер с мембраной 10 кДа. Затем проводят спектральное сканирование на 50 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре Нес1е11 Раскагб 8453 (фиг. 76 А). Концентрация отфильтрованного материала равна 3,7 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30253 и коэффициента экстинкции 36900 М-1 см-1. Чистоту материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8П8-РАСЕ (фиг. 76В). Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 70 мкг продукта, который вводят в колонку РЕепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8 x 300 мм) в 50 мМ NаН2Р04, 250 мМ рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 76С). Затем проводят масс-спектрометрический анализ, хроматографируя около 4 мкг образца на колонке для ОФ-ВЭЖХ (Уубас С4, 1x150 мм). Растворитель А представляет собой 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в воде, а растворитель В представляет собой 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в 90% ацетонитрила, 10% воды. Колонку предварительно уравновешивают в 10% растворителя В при скорости потока 80 мкл в мин. Белок элюируют в линейном градиента от 10 до 90% растворителя В за 30 мин. Часть эффлюента направляют в БС'О масс-спектрометр с ионной ловушкой. Масс-спектр расшифровывают с помощью программы Вюсогкз, предоставленной производителем масс-спектрометра (фиг. 76Ό). Продукт фильтруют через целлюлозно-ацетатный фильтр 0,22 мкм и затем продукт хранят при -80°С.
В табл. 35 данные Κ'50 для очищенного полученного в Е. со11 8ЕК[2-35]-Б-Ес сравниваются с данными для некоторых других вариантов составов по изобретению.
Таблица 35. Полученные при использовании Е.со11 рекомбинантные пептидные антитела Ес-Б8ЕК[1-35], Ес-Б-8ЕК[2-35], Ес-Б-08К1, 8Ек[1-35]-Б-Ес и 8ЕК[2-35]-Б-Ес, содержащие Ес либо на N конце, либо на С-конце, эффективно блокируют человеческий Ку1.3. Также показана активность полученного при использовании СНО мутантного Ес-Б10-8ЕК[1-35] К1О. Электрофизиологический метод пэтч-кламп цельных клеток (^СУС), описанный в примере 36, осуществляют на НЕК293/Ку1.3 клетках, а приведенное значение Κ'50 является средним, найденным на кривой доза-эффект для 3 или более клеток. Эксперименты по йп^огкз™ (ΠΥΟ) планарной пэтч-кламп (ра!сЕ-с1ашр) электрофизиологии проводят методами, описанными в примере 44, на СН0/Ку1.3 клетках, и показано среднее значение Ιί^ο. Соединения по изобретению получают методами, описанными в указанном примере: полученные в Е.со11 Ес-Б-8ЕК[1-35] (примеры 3 и 38), полученные в Е.со11 Ес-Б-8ЕК[2-35] (примеры 4 и 39), Е.со11 Ес-Б-08К1 (примеры 10 и 40), 8ЕК[1-35]-Б-Ес (примеры 15 и 51) и 8ЕК[2-35]-Б-Ес (пример 16 и данный пример 50). Полученные при использовании СНО Ес-Б10-8ЕК[1-35] К1О генерируют по методам, аналогичным методами, описанным для полученного при использовании СНО Ес-Б10-8ЕК[1-35].
- 126 013470
Соединение Κν1.3 1С50 методом ХУСУС (нМ) Κν1.3 1С50 методом 1ЛУС> (нМ)
Е.соП Рс-Ь-8ЪК[1-35] 1.4
Е.соП Рс-Ь-8йК[2-35] 1.3 2.8
Е.соП Рс-Ь-О8К1 3.2
Е.соП 8йк[1-35]-Ь~Ес 2.4
Е.соП 8ЬК[2-35]-Ь-Рс 4.9
СНО Рс-Ы0-8йК[1-35] κις 2.2
Пример 51. Очистка Ме!-8ЬК(1-35)Ес из Е. соЬ.
Замороженную пасту Е. соЬ (65 г), полученную, как описано выше в примере 15, смешивают с 660 мл раствора комнатной температуры, содержащего 50 мМ трис НС1, 5 мМ ЕБТА, рН 7,5, и добавляют примерно к 0,1 мг/мл лизоцима белка куриного яйца. Суспендированную пасту дважды пропускают через охлажденный микрофлюидизатор при давлении 12,000 Р81 (82,73 кПа). Затем клеточный лизат центрифугируют при 17700 д в течение 30 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 660 мл 1% дезоксихолевой кислоты в измельчителе ткани (гомогенизаторе) и центрифугируют при 17700 д в течение 30 мин при 4°С. Пеллеты (клеточный осадок) затем ресуспендируют в 660 мл воды в гомогенизаторе и центрифугируют при 17700 д в течение 30 мин при 4°С. Затем 13 г пеллет растворяют в 130 мл 8 М раствора гуанидин НС1, 50 мМ трис НС1, рН 8,0. Затем 10 мл раствора пеллет инкубируют с 0,1 мл 1 М БТТ в течение 60 мин при 37°С. Восстановленный материал переносят в 1000 мл буфера для рефолдинга (2 М мочевины, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин НС1, 2,5 мМ ЕБТА, 1,2 мМ цистамина НС1, 4 мМ цистеина, рН 8,5) при 2°С при энергичном перемешивании. Скорость перемешивания затем замедляют и продолжают инкубацию в течение 3 дней при 4°С.
Продукт после рефолдинга разводят в 1 л воды и рН раствора и фильтруют через целлюлозноацетатный фильтр 0,22 мкм и нагружают на колонку 35 мл Атег8Ьат С) 8ерЬаго8е-ЕЕ (2,6 см внутр. диаметр, Ι.Ό.) при скорости потока 10 мл/мин в ^-буфере А (20 мМ Трис, рН 8,5) при температуре 8°С с встроенной колонкой 35 Атег8Ьат МаЬ 8е1ес! (2,6 см внутр. диаметр). После загрузки колонку С) 8ерЬаго8е удаляют и в дальнейшем хроматографию проводят на колонке МаЬ 8е1ес!. Затем колонку промывают ^-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют постепенно доводя до 100 мМ глицина рН 3,0. Фракции, содержащие заданный продукт, сразу же нагружают на колонку 5,0 мл Атег8Ьат 8Р-8ерЬаго8е НР при скорости потока 5 мл/мин в 8-буфере А (20 мМ КаН2РО4, рН 7,0) при температуре 8°С. Затем колонку промывают 8-буфером А в количестве, равном нескольким объемам колонки, и элюируют в линейном градиенте от 5 до 60% 8-буфера В (20 мМ КаН2РО4, 1 М КаС1, рН 7,0), постепенно доводя до 100% 8-буфера В. Затем анализируют фракции, используя окрашенный Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Б8-РАОЕ. Фракции, содержащие в основном заданный продукт, объединяют.
8-Пул затем концентрируют примерно до 10 мл на центрифужном ультрафильтрационном устройстве Ра11 1итЬо-8ер с мембраной 10 кДа. Затем проводят спектральное сканирование на 20 мкл объединенного пула, разведенного в 700 мкл РВ8, на спектрофотометре 11е\\'1еИ Раскагб 8453 (фиг. 77А). Концентрация отфильтрованного материала равна 3,1 мг/мл, как определено с учетом расчетной молекулярной массы 30409 и коэффициента экстинкции 36900 М-1 см-1. Чистоту материала затем определяют с помощью окрашенного Кумасси бриллиантовым синим трис-глицин 4-20% 8Б8-РАОЕ (фиг. 77В). Затем определяют молекулярную массу (макромолекулярный статус) продукта, используя эксклюзионную хроматографию 93 мкг продукта, который вводят в колонку РЬепотепех Вю8ер 8ЕС 3000 (7,8 ж 300 мм) в 50 мМ КаН2РО4, 250 мМ КаС1, рН 6,9 при скорости потока 1 мл/мин, наблюдают оптическую плотность при 280 нм (фиг. 77С). Затем проводят МАиТ масс-спектрометрический анализ. Аликвоту образца наносят в виде пятна с синаповой кислотой на МА1.1)1 плашку для образцов. Время-пролетный массспектрометр Уоуадег БЕ-ВР снабжен азотным лазером (337 нм, 3 нс импульс). Применяют положительный ион/линейный способ при ускоряющем напряжении 25 кВ. Каждый спектр получают накоплением данных от ~200 лазерных импульсов (фиг. 77Ό). Внешнюю калибровку масс выполняют, используя очищенные белки с известными молекулярными массами.
Величина 1С50 для блокады Ку1.3 очищенным полученным при использовании Е.соЬ Ме!-8ЬК(1-35)Ес, также называемым 8ЬК[1-35]-Ь-Ес, показана выше, в табл. 35.
Пример 52. Бактериальная экспрессия О8К1-Ь-Ес ингибитора Ку1.3.
Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рЛМО21а^ηрВ-Ρер-Рс и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях О8К1-Ь-Ес. Олигонуклеотиды, применяемые для получения дуплекса
- 127 013470 «ХЗТБТТАТСАТСААСБТТАААТБСААААТСТСССБТСАБТБССТББААССБТОСААААААССТСБТА
ТБСБТ //ЗЕБ ΙΏ N0:1347;
ТТСеСТАААТОСАТСААСССТАААТбССАСТаСАСССССАААТСТССТССТСеТОбТТСТ / / ЗЕ<2
ГО N0:1348;
САССАБААССАССАССАССАССАСАТТТСББООТБСАОТООСАТТТАССБТТСАТБСАТТТАССБААА
СБСАТ //ЗЕО ГО N0:1349;
АССАБСТТТТТТОСАСБбТТССАСБСАСТСАССБСАБАТТТТБСАТТТААСеТТСАТБАТААС //3Εζ) ГО N0:13501310
Показанные выше олигонуклеотиды используют для получения приведенных ниже дуплексов
СКЗбТеТТАТСАТСААССТТАААтеСААААТСТСССеТСАСТСССТСеААСС&ТеСААААА
1---------+---------+---------+---------+----------+---------+ 60
СААТАОТАеТТССААТТТАССТТТТАСАССССАСТСАСССАССТТСОСАССТТТТТ
0У1ТЫУКСК13К0СЕЕРСККАеСТССТАТОСеТТТССБТАААТССАТСААСБСТАААТБССАСТОСАССССОАААТСТБО 5у ----------1------------]-----------1-----------1-----------ь— -------— + 120
ТСБАССАТАСеСАААСССАТТТАСеТАСТТОССАТТТАССБТСАССТСОООСТТТАБАСС
АСМКЕСКСМИСКСНСТРКЗСТОСТОСТОСТТСТ //ЗЕО Го N0:13511350
121---------+-------137
АССАССАССААБАССАС //3Εβ ГО N0:1353 1352
С С С 3 Б - //5ΕΏ ГО N0:13 521351
Бактериальная экспрессия пептидного антитела описана в примере 3. а паста хранится в замороженном состоянии.
Пример 53. Бактериальная экспрессия О1у-8НК(1-35)-Ь-Ес ингибитора Ку1.3.
Методы клонирования и экспрессии пептидного антитела в бактериях описаны в примере 3. Вектор рЛМΘ21атрВ-рер-Εс и перечисленные ниже олигонуклеотиды используют для генерации дуплекса (см. ниже) для клонирования и экспрессии в бактериях О1у-8НК(1-35)-Ь-Ес. Олигонуклеотиды. применяемые для получения дуплекса
СОСТССТТСТТСТАТТСАТАСТАТТССААААТСТССТТСТАСТССТТТТСААТСТАААСАТТСТАТСА ААТАТССТСТТТСТТ //3Εζ) ГО N0:13541313;
ТТТСТСОТААААСТТСТБСТАСТТБТТСТСеТБСТСБТСБТТСТ //ЗЕО ГО N0:13551314;
САССАСААССАССАССАССАСААСААСТАССАСААСТТТТАССАСАААААСАААСАССАТАТТТСАТА БААТБТТТАСАТТБА //ЗЕО ГО N0:13561353;
АААОСАОТАСААСОАОАТТТТООААТАОТАТСААТАСААОААСС //ЗЕО ГО N0:13571354
Показанные выше олигонуклеотиды используют для получения приведенных ниже дуплексов
СЮСТССТТСТТбТАТТСАТАСТАТТССААААТСТСбТТОТАСТССТТТТСААТСТАААСА
1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
ССААСААСАТААСТАТСАТААСОТТТТАСАССААСАТСАССААААСТТАСАТТТСТ.
СК5С1ОТ1РКЗК.СТАР0СКНТТСТАТОАААТАТСОТСТТТСТТТТТОТСОТААААСТТСТОСТАСТТСТТСТСОТООТОО
61----------1---------—ΐ-----------1-----------1------------1----------—( 120
ААСАТАСТТТАТАССАОАААОАААААСАССАТТТТСААСАССАТСААСААСАССАССАСС змкукьзрскктсотсзоооТООТТСТ //ЗЕО ΙΏ N0:1355
121---------+ - 131
АССААСАССАС //ЗЕО ГО N0:1357
3 0 - //ЗЕО ΙΟ N0:1356
Бактериальная экспрессия пептидного антитела описана в примере 3. а паста хранится в замороженном состоянии.
- 128 013470
Сокращения
Ас ацетил (применяется по отношению к ацетилированным остаткам)
АсВра АЭСС ацетилированный п- бензоил- Ь- фенилаланин антитело- зависимая клеточная цитотоксичность
А1Ь аминоизомасляная кислота
ЪА бета- аланин
Вра ВгАс п- бензоил- Ь- фенилаланин бромацетил (ВгСНгС(О)
В8А альбумин бычьей сыворотки
Βζΐ бензил
Сар СОРО капроновая кислота хроническое обструктивное лёгочное заболевание
СТЬ цитотоксические Т лимфоциты
ЭСС дициклогексилкарбодиимид
Обе 1- (4,4- диметил- 2,6- диоксоциклогексилиден)этил
Ε8Ι- М8 масс- спектрометрия с ионизацией электрораспылением
Ртос флуоренилметоксикарбонил
НОВ! 1- гидроксибензотриазол
ВЭЖХ (НРЬС) высокоэффективная жидкостная хроматография
Н8Ь гомосерин лактон
ΙΒ тельца (тела) включения
КСа кальций- зависимый (активируемый) калиевый канал (включая
1КСа, ВКСа, 8КСа) Κν потенциал- зависимый калиевый канал
Баи лауриновая кислота
ЬР8 липополисахарид
ЬУМРН лимфоциты
ΜΑΓΟΙ- М8 масс- спектрометрия с ионизацией лазерной десорбцией в матрице
Ме метил
МеО метокси
МНС главный комплекс гистостовместимости (ГКГ)
ММР матриксная металлопротеиназа
1-№ар ΝΕΙΓΓ 1- нафтилаланин нейтрофилы
N1© норлейцин
ΝΜΡ Ν- метил- 2- пирролидинон
РАСЕ электрофорез в полиакриламидном геле
РВМС мононуклеарные клетки (мононуклеары) периферической крови
РВ8 фосфатно- буферный раствор, фосфатно- солевой буферный
раствор РЪ£ 2,2,4,6,7- пентаметилдигидробензофуран- 5- сульфонил
РСК полимеразная цепная реакция
Рес пипеколиновая кислота
РЕС (ПЭГ) рСГи Р1с полиэтиленгликоль пироглутаминовая кислота пиколиновая кислота
р¥ КВ8 фосфотирозин сайт связывания рибосом
КТ комнатная температура (25 °С)
8 аг саркозин
8Ώ8 натрия додецилсульфат
8ТК серин- треонинкиназа
ΐ- Вос трет- бутилоксикарбонил
Ши трет- бутил
ТНЕ гуморальный фактор тимуса
ТП тритил
- 129 -

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Состав формулы (I) или его мультимеры, где Е1 и Е2 обозначают фрагменты, продлевающие период полужизни, а ά и е, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из ά и е обозначает 1;
    X1, X2 и X3, каждый независимо, обозначают -(Е)гР-(Б)8, а £ и каждый независимо, обозначают 0 или 1;
    Р обозначает 811К токсичный пептид или пептидный аналог 811К протяженностью не более примерно 80 аминокислотных остатков, содержащий по меньшей мере две внутрипептидные дисульфидные связи;
    Б обозначает линкер и а, Ъ и с, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а, Ъ и с обозначает 1, и его фармацевтически приемлемая соль.
  2. 2. Состав по п.1 формулы, выбранный из
    Р-ОА-Р1, рЧЮг-Р, р-^-рЦьур, Р1-(Ь)гР-(Ь)гР2, рЧРгР-сь^-алгР, рЕрЧРгР, Р-ДА-Р^и ΡΤΡ,-ΡΕρ^ΡγΡ.
  3. 3. Состав по п.1, где Е1, или Е2, или оба обозначают полиэтиленгликоль, сополимер этиленгликоля, пропиленглико ль, сополимер пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, поли1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этиленгликоля/малеинового ангидрида, полиаминокислоту, декстран н-винилпирролидон, поли-н-винилпирролидон, гомополимер пропиленгликоля, полимер пропиленоксида, полимер этиленоксида, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, линейную или разветвленную гликозилированную цепь, полиацеталь, длинноцепную жирную кислоту, длинноцепную гидрофобную алифатическую группу, домен Ес иммуноглобулина или его участок, СН2 область домена Ес, петлю домена Ес, альбумин, альбуминсвязывающий белок, транстиретин, тироксинсвязывающий глобулин или лиганд, обладающий сродством к сывороточному белку с продолжительным периодом полужизни, причем указанный лиганд выбирают из группы, состоящей из пептидных лигандов и низкомолекулярных лигандов; или комбинацию любых из этих элементов.
  4. 4. Состав по п.1, отличающийся тем, что Е1, или Е2, или оба представляют собой Ес домен человеческого 1§О или его участок.
  5. 5. Состав по п.4, отличающийся тем, что Ес домен человеческого 1§О представляет собой Ес домен человеческого 1§О1.
  6. 6. Состав по п.4, отличающийся тем, что Ес домен человеческого 1§О представляет собой Ес домен человеческого 1§О2.
  7. 7. Состав по п.1, отличающийся тем, что Е1 или Е2 представляют собой различные фрагменты, продлевающие период полужизни.
  8. 8. Состав по п.1, отличающийся тем, что Е1, или Е2, или оба содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е(Д Ш N08: 2, 4, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 1340-1342 и 1359-1363.
  9. 9. Состав по п.1, отличающийся тем, что Е1, или Е2, или оба представляют собой домен белка человеческого сывороточного альбумина или домен белка транстиретина или биологически приемлемый полимер или сополимер.
  10. 10. Состав по п.9, отличающийся тем, что биологически приемлемый полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой от 1 до 100 кДа.
  11. 11. Состав по п.10, отличающийся тем, что ПЭГ выбирают из группы, состоящей из ПЭГ с молекулярной массой 5 и 20 кДа.
  12. 12. Состав по п.1, отличающийся тем, что формула выбрана из
    Р1-(Ь)г.р.(ъ)ё.р2, ^-(РгР-ф^-СРгР, Р-ДА-Р1-?2, ИР-СЬ^-РЕРЧЬУР,
    -130013470 где Е1 представляет собой Ес домен человеческого ΙβΘ или домен белка человеческого сывороточного альбумина и Е2 представляет собой ПЭГ, или формула выбрана из рЕ(Ь)гР-(Ь)6-Р2, РЧь>РЧЬ)е-Р2-(Ь)гР, Р1-?2-^- р, и Р-(Ь)е-Р1-р2-(Ь)гр, где Е2 представляет собой Ес домен человеческого ΙβΘ или домен белка человеческого сывороточного альбумина и Е1 представляет собой ПЭГ.
  13. 13. Состав по п.1, дополнительно содержащий одну или более молекул ПЭГ, конъюгированных с не-ПЭГ Е1, или с не-ПЭГ Е2, или с Р, или с любой комбинацией любого из них.
  14. 14. Состав по п.1, в котором токсичный пептид встраивают в петлю Ес домена человеческого ΙβΟ1.
  15. 15. Состав по п.1, отличающийся тем, что 8кК пептид или аналог 8кК пептида содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΏ КО: 5, 88-200, 548-561, 884950 и 1295-1300, представленных в табл. 2.
  16. 16. ДНК, кодирующая состав по п.1.
  17. 17. Экспрессирующий вектор, содержащий ДНК по п.16.
  18. 18. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.17.
  19. 19. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что она является эукариотической клеткой.
  20. 20. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что клетка является клеткой млекопитающего.
  21. 21. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что она является СНО-клеткой.
  22. 22. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что она является прокариотической клеткой.
  23. 23. Клетка- хозяин по п.18, отличающаяся тем, что она является клеткой Е. со11.
  24. 24. Состав по п.1, дополнительно содержащий добавочный фармакологически активный ковалентно связанный пептид.
  25. 25. Состав по п.1, отличающийся тем, что добавочный пептид связан с Е1, или с Е2, или с Р.
  26. 26. Состав по п.1, дополнительно содержащий пептид, агонистический или антагонистический в отношении активности токсичного пептида, или нацеливающий (таргетирующий) пептид.
  27. 27. Состав, включающий аналог 8кК токсичного пептида, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ΙΏ МО: 88, 89, 92, 148-200, 548-561, 884-949 и 1295-1300, или его фармацевтически приемлемая соль.
  28. 28. Фармацевтическая композиция, содержащая состав по любому из пп.1-27 и фармацевтически приемлемый носитель.
  29. 29. Применение состава по п.1 или состава, содержащего аналог 8кК пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΏ NО: 88, 89, 92, 148-200, 548-561, 884-949 и 12951300, или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления состава для предупреждения или подавления рецидива симптома рассеянного склероза.
  30. 30. Применение состава по п.1 или состава, содержащего аналог 8кК пептида, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΏ NО: 88, 89, 92, 148-200, 548-561, 884-949 и 12951300, или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления состава для лечения иммунного нарушения.
  31. 31. Состав по п.1, отличающийся тем, что любой Г или любой д обозначает 1, а Е обозначает пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО ЬЮ: 79, 84 и 637-656.
  32. 32. Состав по пп.1-27, у которого 8кК пептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΌ: 914.
  33. 33. Состав по пп.1-27, у которого 8кК пептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΌ: 915.
  34. 34. Состав по пп.1-27, у которого 8кК пептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΌ: 916.
  35. 35. Состав по пп.1-27, у которого 8кК пептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕО ГО ΝΌ: 917.
EA200702313A 2005-04-22 2006-04-18 Терапевтические агенты на основе токсичных пептидов EA013470B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67434205P 2005-04-22 2005-04-22
US11/406,454 US7833979B2 (en) 2005-04-22 2006-04-17 Toxin peptide therapeutic agents
PCT/US2006/015199 WO2006116156A2 (en) 2005-04-22 2006-04-18 Toxin peptides with extended blood halflife

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200702313A1 EA200702313A1 (ru) 2008-06-30
EA013470B1 true EA013470B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=37894298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702313A EA013470B1 (ru) 2005-04-22 2006-04-18 Терапевтические агенты на основе токсичных пептидов

Country Status (16)

Country Link
US (2) US7833979B2 (ru)
EP (1) EP1896080A2 (ru)
JP (2) JP5087536B2 (ru)
KR (2) KR20080021606A (ru)
AR (1) AR053234A1 (ru)
AU (1) AU2006239928B8 (ru)
BR (1) BRPI0607750A2 (ru)
CA (1) CA2604999A1 (ru)
CR (1) CR9452A (ru)
EA (1) EA013470B1 (ru)
IL (1) IL186527A0 (ru)
MX (1) MX2007013031A (ru)
NO (1) NO20076013L (ru)
NZ (1) NZ562201A (ru)
TW (1) TW200716748A (ru)
WO (1) WO2006116156A2 (ru)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US7192596B2 (en) * 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
GB0414272D0 (en) * 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives
US8324158B2 (en) * 2006-07-14 2012-12-04 Georgia Tech Research Corporation Methods for inhibiting CLC-2 channel with GATX2
US20090252703A1 (en) * 2006-10-19 2009-10-08 Gegg Jr Colin V Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
WO2008088422A2 (en) * 2006-10-25 2008-07-24 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
KR101524517B1 (ko) * 2007-05-14 2015-06-10 유니버시다드 나시오날 오토노마 드 멕시코 인체 Ｔ-임파구 칼륨 채널(아형 Ｋｖ1.3)을 높은 선택성으로 차단하며 래트에서 생체내 ＤＴＨ-반응을 감소시키는 두 개 전갈 펩타이드, Ｖｍ23 및 Ｖｍ24
WO2008143954A2 (en) * 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
EP2215247B1 (en) * 2007-11-13 2014-09-24 The Scripps Research Institute Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae
US8716437B2 (en) * 2007-12-07 2014-05-06 Steven A. Goldstein Identification of toxin ligands
BRPI0912683A2 (pt) 2008-05-15 2016-01-26 Transmolecular Inc tratamento de tumores metastáticos
WO2010011096A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
WO2010033221A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of protegrin peptides
AU2009292643B2 (en) * 2008-09-19 2016-02-18 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
EP2340046A2 (en) * 2008-09-19 2011-07-06 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of ziconotide peptides
US8252228B1 (en) * 2008-10-13 2012-08-28 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Methods for sterilizing carriers for treatment of a kidney
WO2010108153A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
ES2548030T3 (es) * 2009-06-01 2015-10-13 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas
AU2010321832B2 (en) 2009-11-20 2014-08-14 Amgen Inc. Anti-Orai1 antigen binding proteins and uses thereof
AU2011213678B2 (en) * 2010-02-04 2015-01-29 Eisai Inc. Chlorotoxin polypeptides and conjugates and uses thereof
CN106957356B (zh) * 2010-05-11 2021-05-25 弗雷德哈钦森癌症研究中心 氯毒素变体、缀合物及其使用方法
WO2012021648A1 (en) 2010-08-10 2012-02-16 Amgen Inc. Dual function in vitro target binding assay for the detection of neutralizing antibodies against target antibodies
CN103339145A (zh) 2010-09-22 2013-10-02 安姆根有限公司 运载体免疫球蛋白及其用途
US9340590B2 (en) 2011-03-16 2016-05-17 Amgen Inc. Potent and selective inhibitors of NaV1.3 and NaV1.7
EP3263123A3 (en) 2011-06-06 2018-05-16 Kineta One, LLC Shk-based pharmaceutical compositions and methods of manufacturing and using the same
AU2012318736A1 (en) * 2011-10-03 2014-05-22 The Regents Of The University Of California Treatment of obesity and obesity-related disorders by pharmacological targeting of Kv1.3 potassium channels
US9062119B2 (en) 2011-10-28 2015-06-23 University Of Debrecen Modified peptide toxins
EP2784080B1 (en) * 2011-10-31 2019-12-18 Shimadzu Corporation Peptide-hinge-free flexible antibody-like molecule
US20150011431A1 (en) 2012-01-09 2015-01-08 The Scripps Research Institute Humanized antibodies
MX349035B (es) 2012-05-17 2017-07-07 Extend Biosciences Inc Portadores para el suministro mejorado de farmaco.
US9102751B2 (en) 2012-05-18 2015-08-11 Janssen Biotech, Inc. Huwentoxin-IV variants and methods of use
US10414808B2 (en) 2012-05-18 2019-09-17 Janssen Biotech, Inc. Huwentoxin-IV variants and methods of use
HUE039000T2 (hu) 2012-10-11 2018-12-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Antitest-gyógyszer konjugát
EP2910573B1 (en) 2012-10-19 2020-02-19 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate produced by binding through linker having hydrophilic structure
JP2016505826A (ja) 2012-12-10 2016-02-25 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター スクリーニングの方法
JP6426107B2 (ja) 2012-12-20 2018-11-21 アムジエン・インコーポレーテツド Ａｐｊ受容体アゴニストおよびその使用
BR112015017795A2 (pt) * 2013-01-25 2017-11-21 Janssen Biotech Inc antagonistas de kv1.3 e métodos de uso
PT2956165T (pt) * 2013-02-14 2019-11-29 Texas A & M Univ Sys Composições e métodos de potenciação das respostas imunitárias frente a eimeria ou limitação de uma infeção por eimeria
WO2014165277A2 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Amgen Inc. POTENT AND SELECTIVE INHIBITORS OF Nav1.7
WO2014160037A2 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Regents Of The University Of California Activatable membrane-interacting peptides and methods of use
CN105814074B (zh) 2013-07-18 2020-04-21 图鲁斯生物科学有限责任公司 具有超长互补决定区的人源化抗体
CN105407904A (zh) * 2013-07-22 2016-03-16 奇尼塔一有限责任公司 以毒素为主的治疗性肽的眼科用途和其药用组合物
US11559580B1 (en) 2013-09-17 2023-01-24 Blaze Bioscience, Inc. Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof
JP6676523B2 (ja) 2013-10-03 2020-04-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド プロトキシン−ｉｉ変異体及びその使用方法
AU2013404615B2 (en) * 2013-10-28 2018-05-17 Baylor College Of Medicine Novel scorpion toxin analogue and method for treating autoimmune diseases
CA2933666C (en) * 2013-12-25 2021-08-03 Sapporo Medical University Anti-trop2 antibody-drug conjugate
DK3466976T3 (da) 2014-01-31 2021-12-13 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-her2-antistof-lægemiddelkonjugat
KR102624244B1 (ko) 2014-04-10 2024-01-11 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항her3 항체-약물 콘주게이트
US11185594B2 (en) 2014-04-10 2021-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited (Anti-HER2 antibody)-drug conjugate
GB201408135D0 (en) * 2014-05-08 2014-06-25 Conogenetix Biosciences Gmbh Kv1.3 potassium channel antagonists
JP6803236B2 (ja) 2014-06-10 2020-12-23 アムジェン インコーポレイテッド アペリンポリペプチド
CN104177489B (zh) * 2014-07-29 2017-03-22 暨南大学 基因重组TNF‑α衍生物RMP16及其制备方法与应用
WO2016025129A1 (en) * 2014-08-14 2016-02-18 Alhamadsheh Mamoun M Conjugation of pharmaceutically active agents with transthyretin ligands through adjustable linkers to increase serum half-life
US11111284B2 (en) 2014-08-21 2021-09-07 The General Hospital Corporation Tumor necrosis factor superfamily and TNF-like ligand muteins and methods of preparing
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
JP6946182B2 (ja) 2014-10-22 2021-10-06 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドＥｘｔｅｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ 治療用ビタミンｄコンジュゲート
CA2966865C (en) * 2014-11-07 2023-03-21 Kineta Chronic Pain, Llc Modifications and uses of conotoxin peptides
US20180264080A1 (en) * 2015-01-09 2018-09-20 Kineta One, Llc TOPICAL APPLICATIONS OF Kv1.3 CHANNEL BLOCKING PEPTIDES TO TREAT SKIN INFLAMMATION
MA41642A (fr) 2015-03-03 2018-01-09 Janssen Biotech Inc Variants de protoxine ii et méthodes d'utilisation
KR20170134542A (ko) 2015-04-02 2017-12-06 얀센 바이오테크 인코포레이티드 프로톡신-ii 변이체 및 사용 방법
WO2016187594A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
IL290959B2 (en) 2015-06-29 2023-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Preparations containing antibody-drug conjugates and methods for their production
BR112018073739A2 (pt) 2016-05-20 2019-02-26 Harpoon Therapeutics, Inc. proteína de ligação de albumina sérica de domínio único
AU2017267793B2 (en) 2016-05-20 2024-01-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US10849973B2 (en) 2016-11-23 2020-12-01 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
JP7215997B2 (ja) 2016-11-23 2023-01-31 ハープーン セラピューティクス，インク． 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）を標的とする三重特異性タンパク質と使用方法
WO2018102777A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 University Of South Florida Peptibodies, compositions thereof, and methods of treating atrial fibrillation
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11273155B2 (en) 2016-12-12 2022-03-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
WO2018135501A1 (ja) 2017-01-17 2018-07-26 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US10668113B2 (en) 2017-03-31 2020-06-02 Vivekananda Ramana Formulation for targeting cancer in humans and canines using venom
US10668112B2 (en) 2017-03-31 2020-06-02 Vivekananda Ramana Formulation for targeting cancer in humans and canines
US10668130B2 (en) 2017-03-31 2020-06-02 Vivekananda Ramana Formulation for targeting cancer in humans and canines using chlorotoxin
SG10202107880XA (en) 2017-05-12 2021-09-29 Harpoon Therapeutics Inc Mesothelin binding proteins
AU2018265860B2 (en) 2017-05-12 2022-08-11 Harpoon Therapeutics, Inc. MSLN targeting trispecific proteins and methods of use
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
US20230331827A1 (en) * 2017-07-12 2023-10-19 Maxion Therapeutics Limited Potassium channel inhibitors
GB201711208D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Iontas Ltd Ion channel inhibitors
KR102630307B1 (ko) 2017-08-31 2024-01-29 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 신규 제조 방법
CA3073924C (en) 2017-08-31 2023-10-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
US20200262877A1 (en) * 2017-10-09 2020-08-20 Blaze Bioscience, Inc. Ion channel-binding peptides and methods of use thereof
EP3694871A4 (en) 2017-10-13 2021-11-10 Harpoon Therapeutics, Inc. B-CELL MATURATION ANTIG-BINDING PROTEINS
AU2018347582A1 (en) 2017-10-13 2020-05-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
CA3100608A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Anti-muc1 antibody-drug conjugate
JP7300186B2 (ja) * 2018-05-24 2023-06-29 国立大学法人 熊本大学 薬物送達用担体
AU2019346466A1 (en) 2018-09-25 2021-05-20 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
KR20220066095A (ko) 2019-09-20 2022-05-23 질랜드 파마 에이/에스 Kv1.3 차단제
IL295448A (en) 2020-02-21 2022-10-01 Harpoon Therapeutics Inc flt3 binding proteins and methods of use
US20230374084A1 (en) 2020-09-23 2023-11-23 Aldevron, Llc Potent and selective inhibitors of nav1.7
CN112353934B (zh) * 2020-11-23 2023-05-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种芋螺毒素药物组合物及其冻干制剂
MX2023010930A (es) 2021-03-23 2023-09-28 Zealand Pharma As Bloqueadores de kv1.3.
WO2024083919A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Zealand Pharma A/S Inhibitors

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998023639A2 (en) * 1996-11-27 1998-06-04 University Of Florida ShK TOXIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
WO2000069900A2 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
US6267964B1 (en) * 1989-08-01 2001-07-31 Affibody Technology Sweden Ab Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives
WO2001083525A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
WO2002098446A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-12 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US20030069170A1 (en) * 2001-09-07 2003-04-10 Richard Soltero Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2004043396A2 (en) * 2002-11-09 2004-05-27 Nobex Corporation Modified carbamate-containing prodrugs and methods of synthesizing same

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JPH0669959B2 (ja) 1985-09-26 1994-09-07 東燃株式会社 コレラ毒素類を活性成分とする免疫抑制剤
AU607172B2 (en) 1986-12-22 1991-02-28 Cygnus, Inc. Diffusion matrix for transdermal drug administration
US5023084A (en) 1986-12-29 1991-06-11 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process
ATE81467T1 (de) 1987-02-24 1992-10-15 Xoma Corp Immunosuppression bei der auf immunotoxin basierten behandlung von menschen.
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4925677A (en) 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US4994439A (en) 1989-01-19 1991-02-19 California Biotechnology Inc. Transmembrane formulations for drug administration
US5397702A (en) 1989-03-06 1995-03-14 The Regents Of The University Of California Assay for and treatment of autoimmune diseases
US4994436A (en) * 1989-03-10 1991-02-19 American Air Liquide Process for safely destroying organic binders in ceramic components during the firing process
US4906159A (en) 1989-03-22 1990-03-06 Caterpillar Industrial Inc. Freely positionable load carrying attachment for an automatic guided vehicle
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
IL98932A0 (en) 1990-07-27 1992-07-15 Univ California Assay,kits and methods based on nk+channel expression
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO1992016192A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Amgen Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
WO1992016221A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
JPH0640945A (ja) * 1992-07-23 1994-02-15 Kureha Chem Ind Co Ltd Ｆｃフラグメント結合抗腫瘍剤
US5346701A (en) 1993-02-22 1994-09-13 Theratech, Inc. Transmucosal delivery of macromolecular drugs
US5494895A (en) 1993-07-22 1996-02-27 Merck & Co., Inc. Scorpion peptide margatoxin with immunosuppressant activity
US5460820B1 (en) 1993-08-03 1999-08-03 Theratech Inc Method for providing testosterone and optionally estrogen replacement therapy to women
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
EP0802798A1 (en) 1994-02-23 1997-10-29 Chiron Corporation Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents
FR2717688B1 (fr) 1994-03-28 1996-07-05 Lhd Lab Hygiene Dietetique Système matriciel transdermique d'administration d'un oestrogène et/ou un progestatif à base d'EVA.
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
PL320856A1 (en) 1994-12-22 1997-11-10 Astra Ab Aerosol drug preparations
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5783208A (en) 1996-07-19 1998-07-21 Theratech, Inc. Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid
US5763478A (en) 1996-10-16 1998-06-09 Merck & Co., Inc. Triterpene derivatives with immunosuppressant activity
ATE307829T1 (de) 1996-12-26 2005-11-15 Suntory Ltd Skorpion-spezifische neuropeptide
US6548644B1 (en) 1997-03-10 2003-04-15 Immunex Corporation Site protected protein modification
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
SG129211A1 (en) 1997-11-06 2007-02-26 Univ Singapore Therapeutic molecules
US6703485B2 (en) 1997-12-23 2004-03-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Brain and heart cyclic nucleotide gated ion channel compounds and uses thereof
US6551821B1 (en) 1997-12-23 2003-04-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Brain cyclic nucleotide gated ion channel and uses thereof
AU2333999A (en) 1998-01-23 1999-08-09 Prolifaron, Inc. Methods and compositions for the identification of growth factor mimetics, growth factors and inhibitors
JP3530004B2 (ja) 1998-02-06 2004-05-24 株式会社日立ユニシアオートモティブ 吸入式投薬器
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
US6166322A (en) * 1999-04-16 2000-12-26 Industrial Technology Research Institute Encapulation process for mono-and polycrystalline silicon solar cell modules
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
US6849714B1 (en) 1999-05-17 2005-02-01 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
US6768002B1 (en) 1999-06-22 2004-07-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Scorpion toxins
CA2372703A1 (en) 1999-06-22 2000-12-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Scorpion toxins
US6096891A (en) 1999-12-09 2000-08-01 Air Products And Chemicals, Inc. Process for the production of cyclic N,N'-dialkylureas
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
SE0000935D0 (sv) 2000-03-21 2000-03-21 Astrazeneca Ab An inhalation device
EP1276756A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1177806A1 (en) 2000-08-04 2002-02-06 The Technology Partnership Public Limited Company Dry powder inhaler
EP1361891A2 (en) * 2001-02-19 2003-11-19 MERCK PATENT GmbH Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
US7211395B2 (en) 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US6861405B2 (en) 2001-06-12 2005-03-01 Yale University Compositions and methods relating to glucose metabolism, weight control, and food intake
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6900317B2 (en) 2002-02-19 2005-05-31 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them
TW200403058A (en) 2002-04-19 2004-03-01 Bristol Myers Squibb Co Heterocyclo inhibitors of potassium channel function
GB0219512D0 (en) 2002-08-21 2002-10-02 Norton Healthcare Ltd Inhalation compositions with high drug ratios
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
SI1641483T1 (sl) 2003-06-12 2008-08-31 Lilly Co Eli Fuzijski proteini
AU2004282984B2 (en) 2003-11-13 2011-07-14 Hanmi Science Co., Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
GB0414272D0 (en) 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives
AU2005289685B2 (en) 2004-09-24 2009-07-16 Amgen Inc. Modified Fc molecules
EP3090753A1 (en) 2004-10-07 2016-11-09 The Regents of The University of California Analogs of shk toxin and their uses in selective inhibition of kv1.3 potassium channels
WO2008088422A2 (en) 2006-10-25 2008-07-24 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
WO2010108153A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6267964B1 (en) * 1989-08-01 2001-07-31 Affibody Technology Sweden Ab Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives
WO1998023639A2 (en) * 1996-11-27 1998-06-04 University Of Florida ShK TOXIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000069900A2 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
WO2001083525A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
WO2002098446A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-12 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US20030069170A1 (en) * 2001-09-07 2003-04-10 Richard Soltero Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
WO2004043396A2 (en) * 2002-11-09 2004-05-27 Nobex Corporation Modified carbamate-containing prodrugs and methods of synthesizing same

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAGD?üNY M. et al., Anuroctoxin, a new scorpion toxin of the alpha-KTx 6 subfamily, is highly selective for Kv1.3 over IKCal ion channels of human T lymphocytes, Mol. Pharmacol., 2005, v.67, n.4, p.1034-1044, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 15615696 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
BEETON C. et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases, Mol. Pharmacol., 2005, v.67,4, p.1369-1381, referat, s.1373, fig. 1E, c.1374, kol.2, abz. 3-s., 1375, kol.2, abz. 1 *
BERNARD S. et al., Solution structure of Ptu1, a toxin from the assassin bug Peirates turpis that blocks the voltage-sensitive calcium channel N-type, Biochemistry, 2001, v.40, n.43, p. 12795-12800, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 11669615 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
CALICETI P. et al., Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol) protein conjugates, Adv. Drug. Deliv. Rev., 2003, v.55, n. 10, p.1261-1277 *
CARLIER E. et al., Effect of maurotoxin, a four disulfide-bridged toxin from the chactoid scorpion Scorpio maurus, on Shaker K+ channels, J. Pept. Res., 2000, v.55, n.6, p.419-427, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 10888198 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
DAUPLAIS M. et al., Determination of the three-dimensional solution structure of noxiustoxin: analysis of structural differences with related short-chain scorpion toxins, Biochemistry, 1995, v.34, n.51, p.16563-16573, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 8527429 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
GARCIA M.L. et al., Purification and characterization of three inhibitors of voltage-dependent K+ channels from Leiurus quinquestriatus var. hebraeus venom, Biochemistry, 1994, v.33, n. 22, p. 6834-6839, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 8204618 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
GENDEH G.S. et al., A new potassium channel toxin from the sea anemone Heteractis magnifica: isolation, cDNA cloning, and functional expression, Biochemistry, 1997, v.36, n.38, p.11461-11471, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 9298966 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
JI Y.H. et al., Martentoxin, a novel K+-channeI-blocking peptide: purification, cDNA and genomic cloning, and electrophysiological and pharmacological characterization, J. Neurochem., 2003, v.84, n.2, p.325-335, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 12558995 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
KEIZER D.W. et al., Structural basis for tetrodotoxin-resistant sodium channel binding by mu-conotoxin SmIIIA, J. Biol. Chem., 2003, v.278, n. 47, p. 46805-46813, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 12970353 [PubMed -indexed for MEDLINE] *
KOROLKOVA Y.V. et al., An ERG channel inhibitor from the scorpion Buthus eupeus, J. Biol. Chem., 2001, v.276, n. 13, p.9868-9876, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 11136720 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
MIDDLETON R.E. et al., Two tarantula peptides inhibit activation of multiple sodium channels, Biochemistry, 2002, v.41, n.50, p. 14734-14747, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 12475222 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
MOUHAT S. et al., K+ channel types targeted by synthetic OSK1, a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. J., 2005, v.385, Pt 1, p.95-104, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 15588251 [PubMed -indexed for MEDLINE] *
NORTON R.S. et al., Potassium channel blockade by the sea anemone toxin ShK for the treatment of multiple sclerosis and other autoimmune diseases, Curr. Med. Chem., 2004, v.11, n. 23, p.3041-3052, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 15578998 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
OSWALD R.E. et al., Solution structure of peptide toxins that block mechanosensitive ion channels, J. Biol. Chem., 2002, v.277, n. 37, p.34443-34450, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 12082099 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
ROGOWSKI R.S. et al., Three new toxins from the scorpion Pandinus imperator selectively block certain voltage-gated K+ channels, Mol. Pharmacol., 1996, v.50, n.5, p.l 167-1177, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 8913348 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
SAVARIN P. et al., Structural and functional consequences of the presence of a fourth disulfide bridge in the scorpion short toxins: solution structure of the potassium channel inhibitor HsTX1, Protein Sci., 1999, v.8, n. 12, p. 2672-2685 [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 10631983 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
TAKAHASHI H. et al., Solution structure of hanatoxin1, a gat modifier of voltage-dependent K(+) channels: common surface features of gating modifier toxins, J. Mol. Biol., 2000, v.297, n.3, p.771-780, [referat], [on-layn], [naydeno 2008-06-06]. Naydeno v internet: PMID: 10731427 [PubMed - indexed for MEDLINE] *
WANG Q.C. et al., Polyethylene glycol-modified chimeric toxin composed of transforming growth factor alpha and Pseudomonas exotoxin, Cancer Res., 1993, v. 53, n. 19, p.4588-4594 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20076013L (no) 2008-01-22
EA200702313A1 (ru) 2008-06-30
AU2006239928B2 (en) 2010-12-02
JP2008538506A (ja) 2008-10-30
WO2006116156A2 (en) 2006-11-02
IL186527A0 (en) 2008-01-20
US20070071764A1 (en) 2007-03-29
AU2006239928B8 (en) 2011-03-31
TW200716748A (en) 2007-05-01
JP5087536B2 (ja) 2012-12-05
BRPI0607750A2 (pt) 2009-11-24
US20110045587A1 (en) 2011-02-24
AR053234A1 (es) 2007-04-25
US7833979B2 (en) 2010-11-16
MX2007013031A (es) 2007-12-12
US8907071B2 (en) 2014-12-09
JP2012100671A (ja) 2012-05-31
EP1896080A2 (en) 2008-03-12
NZ562201A (en) 2011-03-31
KR20100017942A (ko) 2010-02-16
JP5220915B2 (ja) 2013-06-26
AU2006239928A1 (en) 2006-11-02
WO2006116156A3 (en) 2007-10-04
CA2604999A1 (en) 2006-11-02
CR9452A (es) 2008-05-21
KR20080021606A (ko) 2008-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013470B1 (ru) Терапевтические агенты на основе токсичных пептидов
CA2687141C (en) Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
JP5239086B2 (ja) 修飾されたＦｃ分子
JP4949844B2 (ja) エリスロポエチン受容体に結合する新規ペプチド
JP5017116B2 (ja) 修飾Ｆｃ分子
ES2565834T3 (es) Agentes de unión a receptor de Fc de región constante de inmunoglobulina
JP2017031157A (ja) １７ｎａｖ１．３およびｎａｖ１．７の強力かつ選択的阻害剤
EP2081602A2 (en) Toxin peptide therapeutic agents
CZ302303B6 (cs) Homodimerní fúzní protein vykazující inhibicní aktivitu na angiogenezi, zpusob jeho produkce, molekula DNA a replikovatelný expresní vektor
KR20150108912A (ko) Kv1.3 길항제 및 사용 방법
ZA200709701B (en) Toxin peptide therapeutic agents
AU2011213759B2 (en) Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
AU2011213760A1 (en) Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU