KR20080021606A - 독소 펩티드 치료제 - Google Patents

독소 펩티드 치료제

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KR20080021606A
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존 케이. 설리반
조세프 쥐. 맥기번
레슬리 피. 미란다
훙 큐. 응우옌
케네쓰 더블유. 워커
쇼-펜 실비아 후
콜린 브이. 게그 주니어
스테판 아이. 맥도너
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암젠 인크
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Abstract

본원에는 다음 화학식 I 및 그의 다량체로 표시되는 화합물이 기재되어 있다:
화학식 I
(X1)a-(F1)d-(X2)b-(F2)e-(X3)c
상기 식에서, F1 및 F2는 반감기 연장성 부분이고, d 및 e는 각각 독립적으로 0 또는 1인데, 단 d 및 e 중의 적어도 하나는 1이며; X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 -(L)f-P-(L)g-이고, f 및 g는 각각 독립적으로 0 또는 1이며; P는 2개 이상의 펩티드내 디설파이드 결합을 포함하는, 길이가 약 80개 이하 아미노산 잔기의 독소 펩티드이고; L은 임의적인 링커이며; a, b, 및 c는 각각 독립적으로 0 또는 1인데, 단 a, b 및 c 중의 적어도 하나는 1이다. 반감기 연장성 부분(들)과 연결됨으로써 독소 펩티드의 생체내 반감기가 증가한다 (그렇치 않았다면 신속하게 분해될 것이다). 제약 조성물은 상기 화합물과 제약상 허용 가능한 담체를 포함한다. 또한, 본원에는 본 발명의 화합물을 암호화하는 DNA, 이러한 DNA를 포함하는 발현 벡터, 및 이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 기재되어 있다. 자가면역 질환, 예를 들어 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 비만, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질병, 및 루푸스의 치료 방법, 및 다발성 경화증의 증상 재발을 예방하거나 완화시키는 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

독소 펩티드 치료제 {Toxin Peptide Therapeutic Agents}
본 발명은 생화학 분야, 특히 의약 활성 펩티드 및 접합체에 관한 것이다.
이온 채널은 소형 무기 이온이 막을 가로질러 교환될 수 있게 해주는 다양한 분자 군이다. 모든 세포가 기능하기 위해서는 이온 채널이 필요하지만, 특히 신경계 및 심장에 존재하는 것과 같은 흥분성 세포 (excitable cell)의 경우에 더 필요하다. 이온 채널에 의해 조정된 전기 신호는 뇌의 사고, 심장 박동 및 근육 수축을 제어한다. 이온 채널은 세포 용적을 조절하는데 일정 역할을 하고, 광범위한 신호 전달 과정을 제어한다.
이온 채널 계열에는 Na+, K+, 및 Ca2+ 양이온 및 Cl- 음이온 채널이 포함된다. 집합적으로, 이온 채널은 리간드 의존형 채널 또는 전압 의존형 채널로서 구별된다. 리간드 의존형 채널에는 세포외 및 세포내 리간드 의존형 채널이 포함된다. 세포외 리간드 의존형 채널에는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR), 세로토닌 (5-히드록시트립타민, 5-HT) 수용체, 글리신 및 γ-부티르산 수용체 (GABA) 및 글루타메이트-활성화 채널, 예를 들어 카네이트, α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피온산 (AMPA) 및 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NMDA) 수용체가 포함된다 [참고: Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34]. 세포내 리간드 의존형 채널에는 사이클릭 뉴클레오티드 (예: cAMP, cGMP), Ca2+ 및 G-단백질에 의해 활성화되는 것들이 포함된다 [참고: Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34]. 전압 의존형 이온 채널은 무기 이온 종에 대한 그들의 선택성에 따라서 분류되는데, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 클로라이드 이온 채널이 있다 [참고: Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34].
전압 의존형 채널의 분류에 관한 통일 명명법이 최근에 제시되었다 [참고: Catterall et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55: 573-4; Gutman et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55, 583-6; Catterall et al. (2000) Pharmacol. Rev. 55: 579-81; Catterall et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55: 575-8; Hofmann et al. (2000), Pharmacol. Rev. 55: 587-9; Clapham et al. (2000), Pharmacol Rev. 55: 591-6; Chandy (1991), Nature 352: 26; Goldin et al. (2000), Neuron 28: 365-8; Ertel et al. (2000), Neuron 25: 533-5].
K+ 채널은 지금까지 보고된 이온 채널 중에서 가장 크고 가장 잘 파악된 계열의 이온 채널을 구성하고 있다. 칼륨 채널은 3가지 일반 군으로 세분된다: 6개 막관통부 (transmembrane) (6TM) K+ 채널, 2TM-2TM/리크 (leak) K+ 채널 및 2TM/Kir 내향 정류성 (inward rectifying) 채널 [참고: Tang et al. (2004), Ann. Rev. Physiol. 66, 131-159]. 이들 3가지 군은 서열 유사성에 기초하여 계열들로 추가 세분된다. (Kv1-6, Kv8-9), EAG, KQT, 및 Slo (BKCa)를 포함한 전압 의존형 K+ 채널은 6TM 군 계열의 구성원들이다. 2TM-2TM 군은 TWIK, TREK, TASK, TRAAK, 및 THIK를 포함하는 반면, 2TM/Kir 군은 Kir1-7로 이루어진다. 2가지 부가 부류의 이온 채널에는 내향 정류 칼륨 (IRK) 및 ATP-의존형 퓨린작동성 (P2X) 채널이 포함된다 [참고: Harte and Ouzounis (2002), FEBS Lett. 514: 129-34].
다양한 유기체에 의해 생산되는 독소 펩티드가 이온 채널을 표적으로 하도록 진화해 왔다. 강력하고 선택적으로 이온 채널 및 수용체를 표적으로 하는 작은 생활성 독소 펩티드 또는 "독소"의 풍부한 공급원 구실을 할 수 있는 독 (venom)을 생산하는 유기체의 몇 가지 예로는 뱀, 전갈, 거미, 벌, 달팽이 및 말미잘 (sea anemone)이 있다. 대부분의 경우에 이들 독소 펩티드는 채널 공극과 결합하여 이온 전도 경로를 물리적으로 차단시킴으로써 이온 채널의 강력한 길항제 또는 억제제로 진화해 왔다. 기타 몇 가지 경우에는, 몇몇 타란툴라 (tarantula) 독소 펩티드의 경우처럼 해당 펩티드가 공극을 벗어난 영역 (예를 들어, 전압 센서 도메인)과 결합함으로써 채널 기능에 길항하는 것으로 밝혀졌다.
독소 펩티드는 통상적으로 길이가 약 20개 내지 약 80개 아미노산이고, 2 내지 5개의 디설파이드 연결부를 함유하고 있으며 극히 조밀한 구조를 형성한다 (예를 들어, 도 10 참고). (예를 들어, 전갈, 말미잘 및 원뿔형 달팽이의 독에 함유된) 독소 펩티드를 분리하였고, 이들을 대상으로 하여 이온 채널에 대한 영향력에 관해 확인하였다. 이러한 펩티드는 효력 및 안정성이라는 중대한 과제를 해결하는 데 특히 적합한 비교적 소수의 구조적 골격으로부터 진화한 것으로 여겨진다. 예를 들어 대다수의 전갈 및 코누스 (Conus) 독소 펩티드는 10 내지 40개 아미노산과 최대 5개의 디설파이드 결합을 함유하여, 종종 단백질 분해에 대해서 저항성인 극도로 조밀하고 속박된 구조 (미소단백질)를 형성한다. 코노톡신 (conotoxin) 및 전갈 독소 펩티드는 그들의 디설파이드 결합과 펩티드 폴드에 기초하여 다수의 초분자군으로 나눌 수 있다. 이들의 상당 수의 용액 구조가 NMR 분광법에 의해 결정되었는데, 이는 그들의 조밀한 구조를 예시해주고 그들 계열의 폴드 보존을 검증시켜 주었다 [참고: 예를 들어, Tudor et al., lonisation behaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShK toxin, Eur. J. Biochem. 251 (1-2): 133-41 (1998); Pennington et al., Role of disulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity of ShK toxin, Biochem. 38(44): 14549-58 (1999); Jaravine et al., Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. 36(6):1223-32 (1997); del Rio-Portillo et al.; NMR solution structure of Cn12, a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxin sequence but with alpha-like physiological activity, Eur. J. Biochem. 271(12): 2504-16 (2004); Prochnicka-Chalufour et al., Solution structure of discrepin, a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KTx15 subfamily, Biochem.45(6): 1795-1804 (2006)].
보존된 디설파이드 구조는 해당 독소 계열의 개별적인 약리학적 활성을 반영할 수도 있다 [참고: Nicke et al. (2004), Eur. J. Biochem. 271 : 2305-19, Table 1; Adams (1999), Drug Develop. Res. 46: 219-34]. 예를 들어, α-코노톡신은 명확하게 식별되는 4개 시스테인/2개 디설파이드 루프 구조를 갖고 [참고: Loughnan, 2004], 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 억제한다. 이와는 달리, ω-코노톡신은 6개 시스테인/3개 디설파이드 루프 컨센서스 구조를 갖고 [참고: Nielsen, 2000], 칼슘 채널을 차단시킨다. 독소의 구조적 일부가 전압 의존형 또는 칼슘 활성화 칼륨 채널을 억제하도록 진화해 왔다. 도 9는 벌에서부터 달팽이까지 그리고 전갈에서부터 뱀까지의 각종 유독성 동물이 공유하고 있는 제한된 수의 보존적 디설파이드 구조가 이온 채널을 표적으로 한다는 것을 도시하고 있다. 도 7은 알파-전갈 독소 계열을 정렬한 것이고, 보존된 구조적 골격을 이용하여 광범위한 칼륨 채널을 표적으로 하는 독소를 유도시킨다는 것을 예시하고 있다.
독소 펩티드는 특이적 이온 채널을 강력하고도 선택적으로 차단시키기 때문에, 이들은 수 십년 동안 이온 채널의 약리학을 연구하기 위한 도구로서 사용되어 왔다. 심장, 근육 및 뇌에 존재하는 것과 같은 흥분성 세포 및 조직 이외에도, 이온 채널은 면역 세포와 같은 비-흥분성 세포에도 중요하다. 따라서, 독소 펩티드는 특히 칼륨 채널, 예를 들어 Kv1.3 및 IKCa1를 억제함으로써 각종 면역 장애를 치료하는데 있어 효능있는 치료적 유용성을 지니는 것으로 간주되었는데, 이는 이들 채널이 림프구에서 칼슘 신호 전달 경로를 간접적으로 제어하기 때문이다 [참고: 예를 들어, Kem et al., ShK toxin compositions and methods of use, US Patent No. 6,077,680; Lebrun et al., Neuropeptides originating in scorpion, US Patent No. 6,689,749; Beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channnels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005); Mouhat et al., K+ channel types targeted by synthetic OSK1, a toxin from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom, Biochem. J. 385:95-104 (2005); Mouhat et al., Pharmacological profiling of Orthochirus scrobiculosus toxin 1 analogs with a trimmed N-terminal domain, Molec. Pharmacol. 69:354-62 (2006); Mouhat et al, OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2; B.S. Jensen et al. The Ca2+-activated K+ Channel of Intermediate Conductance: A Molecular Target for Novel Treatments, Current Drug Targets 2:401-422 (2001); Rauer et al. Structure-guided Transformation of Charybdotoxin Yields an Analog That Selectively Targets Ca2+-activated over Voltage-gated K+ Channels, J. Biol. Chem. 275: 1201-1208 (2000); Castle et al., Maurotoxin: A Potent Inhibitor of Intermediate Conductance Ca2+-Activated Potassium Channels, Molecular Pharmacol. 63: 409-418 (2003); Chandy et al., K+ channels as targets for specific Immunomodulation, Trends in Pharmacol. Sciences 25: 280-289 (2004); Lewis & Garcia, Therapeutic Potential of Venom Peptides, Nat. Rev. Drug Discov. 2: 790-802 (2003)].
Kv1.3 및 IKCa1 칼륨 채널 및 T 세포에서의 주요 칼슘 유입 채널인 CRAC의 소분자 억제제가 면역 장애를 치료하기 위해 또한 개발되었지만 [참고: A. Schmitz et al. (2005) Molecul. Pharmacol.68, 1254; K.G. Chandy et al. (2004) TIPS 25, 280; H. Wulff et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 32040; C. Zitt et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 12427], 이들 표적 중의 몇몇에 대한 선택성을 지닌 소분자를 획득하기가 어려웠다.
림프구에서의 칼슘 이동이 염증 반응을 활성화시키는데 있어 결정적 경로인 것으로 공지되어 있다 [참고: M.W. Winslow et al. (2003) Current Opinion Immunol. 15, 299]. 기타 세포와 비교해서 T 세포는 세포내 칼슘 수준의 상승에 대해 독특한 민감성을 나타내고, 이온 채널은 이러한 과정을 직간접적으로 제어한다. 이노시톨 트리포스페이트 (IP3)는 칼슘 신호 전달 경로를 활성화시키는 천연의 제2 메신저이다. IP3은 리간드-유도된 T 세포 수용체 (TCR) 활성화 이후에 생성되고, 그의 세포내 수용체와의 결합시 (특정 채널은) 세포내 칼슘 저장소의 칼슘 배출을 야기시킨다. 내형질 세망은 한 가지 중요한 칼슘 저장소를 제공한다. 근육세포질-내형질 세망 칼슘 ATPase (SERCA)의 억제제인 탑시가르긴 (Thapsigargin) 또한 림프구에서 세포내 저장소의 칼슘을 배출시키고 칼슘 신호 전달 경로를 활성화시킨다. 따라서, 탑시가르긴은 T 세포에서 칼슘 신호 전달 경로의 특이적 자극으로서 사용될 수 있다. T 세포에서 세포내 칼슘 저장물의 배출은 세포 외부로부터의 칼슘 유입을 가능하게 하는 세포 표면 칼슘 채널의 활성화를 초래하는 것으로 공지되어 있다. T 세포 상의 이 저장물 구동 칼슘 채널 (SOCC)을 "CRAC" (칼슘 방출 활성화 채널)라고 지칭하며, 이 채널을 통한 칼슘의 지속적 유입이 완전한 T 세포 활성화에 중요한 것으로 공지되어 있다 [참고: S. Feske et al. (2005) J. Exp. Med. 202, 651 and N. Venkatesh et al. (2004) PNAS 101, 8969]. 수 십년 동안, 칼슘을 T 세포 내로 지속적으로 유입시키기 위해서는 세포 막이 칼륨 이온 유출을 통하여 과분극 상태로 유지되어야만 하는 것으로 인식되었다. T 세포에서의 칼륨 유출은 전압 의존형 칼륨 채널 Kv1.3 및 칼슘 활성화 칼륨 채널 IKCa1에 의해 달성된다 [참고: K.G. Chandy et al. (2004) TIPS 25, 280]. 따라서, 이들 칼륨 채널은 CRAC를 통한 지속적인 칼슘 유입을 가능하게 하는 데 필요한 칼륨 유출을 가능하게 함으로써, 칼슘 신호 전달 경로를 간접적으로 제어한다.
세포내 칼슘의 지속적인 증가는 T 세포에서의 각종 경로, 예를 들어 NFAT, NF-kB 및 AP-1의 활성화 유발 경로를 활성화시킨다 [참고: Quintana-A (2005) Pflugers Arch. - Eur. J. Physiol.450, 1]. 이들 사건은 각종 T 세포 반응, 예를 들어 세포 크기 및 막 구성의 변경, 세포 표면 효과기 분자의 활성화, 사이토킨 생성 및 증식을 유발시킨다. 몇 가지 칼슘 감지 분자는 칼슘 신호를 전달하고 세포성 반응을 조정한다. 칼슘과 결합하는 한 가지 분자로서 칼모둘린 (Calmodulin)이 있지만, 기타 많은 분자들도 확인되었다 [참고: M.J. Berridge et al. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 517]. 칼슘-칼모둘린 의존성 포스파타제 칼시네우린 (calcineurin)은 세포내 칼슘의 지속적인 증가시 활성화되고 시토졸성 NFAT를 탈인산화시킨다. 탈인산화된 NFAT는 신속하게 핵으로 전위되고, T 세포 활성화에 있어 결정적인 전사 인자로서 널리 허용되고 있다 [참고: F. Macian (2005) Nat. Rev. Immunol. 5, 472 and N. Venkatesh et al. (2004) PNAS 101, 8969]. 칼시네우린의 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A [네오랄 (Neoral), 공급처: Sandimmune] 및 FK506 [타크롤리무스 (Tacrolimus)]은 중증의 면역 장애, 예를 들어 고형 장기 이식 후 거부를 야기시키는 면역 장애를 치료하기 위한 주요 약물이다 [참고: I.M. Gonzalez-Pinto et al. (2005) Transplant. Proc. 37, 1713 and D.R.J. Kuypers (2005) Transplant International 18, 140]. 네오랄은 이식조직 거부, 중증의 류마티스성 관절염 [참고: D.E. Yocum et al. (2000) Rheumatol. 39, 156] 및 중증 건선 [참고: J. Koo (1998) British J. Dermatol. 139, 88]을 치료하는 것으로 승인되었다. 전임상 및 임상 데이터가 또한 제공되었는데, 이는 칼시네우린 억제제가 염증성 장 질환 [IBD; 참고 (Baumgart DC (2006) Am. J. Gastroenterol. Mar 30; Epub ahead of print)], 다발성 경화증 [참고: Ann. Neurol. (1990) 27, 591] 및 천식 [참고: S. Rohatagi et al. (2000) J. Clin. Pharmacol. 40, 1211]을 치료하는데 유용할 수 있다고 제안하고 있다. 루푸스는 조력 (helper) T 세포의 활성화를 차단시키는 작용제로부터 이득이 얻을 수 있는 또 다른 장애를 나타낸다. T 세포에서 NFAT를 조절하는데 있어서 칼시네우린이 중요함에도 불구하고, 칼시네우린은 기타 조직 (예: 신장)에서 발현되기도 하고, 시클로스포린 A & FK506은 기전에 의거한 독성으로 인해 안전 영역이 협소하다. 신장 독성과 고혈압은 시클로스포린 & FK506의 밝은 전망을 제한하고 있는 부작용이다. 독성에 관한 우려 때문에, 칼시네우린 억제제는 대개 중증 면역 질환만을 치료하기 위해 사용되고 있다 [참고: Bissonnette-R et al. (2006) J. Am. Acad. Dermatol. 54, 472]. Kv1.3 억제제는 면역 장애를 치료하기 위한 보다 안전한 칼시네우린 억제제 대안을 제공한다. 이는 Kv1.3이 또한 T 세포에서 칼슘 신호 전달 경로를 제어하도록 작동하긴 하지만, 칼시네우린 억제제와는 별개의 기전을 통하여 제어하기 때문이며, Kv1.3 발현 및 기능에 대한 명백한 증거는 Kv1.3이 각종 비-림프계 세포 및 조직에서도 기능하는 칼시네우린과 비교해서 T 세포 생물학에 있어 보다 제한된 역할을 한다는 것을 나타낸다.
면역 세포에서의 칼슘 이동은 또한, 염증의 중요한 매개인자인 사이토킨 인터루킨 2 (IL-2) 및 인터페론 감마 (IFNg)의 생성을 활성화시킨다. IL-2는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 팽창 및 분화에서부터 B 세포에 의한 항체 분비 및 증식의 증강까지 다양한 각종 생물학적 반응을 유도시켜 NK 세포를 활성화시킨다 [참고: S.L. Gaffen & K.D. Liu (2004) Cytokine 28, 109]. IL-2의 분비는 T 세포 활성화 후에 신속하게 일어나며, T 세포는 이러한 사이토킨의 주요 공급원을 나타낸다. 활성화 직후에, 고 친화성 IL-2 수용체 (IL2-R)가 T 세포 상에서 상향 조절되어, IL-2에 반응하여 증식할 수 있는 능력이 부여되었다. T 세포, NK 세포, B 세포 및 전문 항원 제시 세포 (APC)는 모두 활성화시 IFNg를 분비할 수 있다. T 세포는 적응 면역 반응을 매개하는데 있어서 IFNg 생성의 주요 공급원을 나타내는 반면, 천연 킬러 (NK) 세포 및 APC는 감염에 대항한 숙주 방어 동안에 중요한 공급원인 것으로 예상된다 [참고: K. Schroder et al. (2004) J. Leukoc. Biol. 75, 163]. 최초에는 대식세포-활성화 인자로서 지칭된 IFNg는 단구, 대식세포 및 수지상 세포에 의한 항원 프로세싱과 제시를 상향 조절한다. IFNg는 많은 세포 유형에서 다양한 생물학적 활성 어레이를 매개하는데 [참고: U. Boehm et al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15, 749], 이에는 성장과 분화, NK 세포 활성의 증강, 및 B 세포 면역글로불린 생성 및 부류 전환의 조절이 포함된다.
CD40L은 칼슘 이동 후 활성화 T 세포 상에 발현된 또 다른 사이토킨이고, B 세포 상에서 그의 수용체와의 결합시 B 세포 배아 중심 형성, B 세포 분화 및 항원 이소형 전환을 허용하는데 있어 결정적인 도움을 제공한다. B 세포 상에서의 CD40의 CD40L-매개된 활성화는 B 세포를 생산하는 면역글로불린 (Ig)의 현저한 분화와 클로날 팽창을 유도시킬 수 있다 [참고: S. Quezada et al. (2004) Annu. Rev. Immunol. 22, 307]. CD40 수용체가 수지상 세포에서 발견될 수도 있고, CD40L 신호 전달은 또한 수지상 세포 활성화와 분화를 매개할 수도 있다. B 세포 및 수지상 세포의 항원 제시 능력은 CD40L 결합에 의해 증진되는데, 이는 적응 면역에 있어서의 상기 사이토킨의 광범위한 역할을 추가로 예시해준다. CD40 신호 전달이 B 세포 생물학에 대해 중요한 역할을 한다면, CD40L에 대한 중화 항체를 대상으로 하여 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) (조직 내에서의 항체 복합체 침착, 염증 및 기관 손상을 특징으로 하는 장애) 치료에 유용한지를 알아보기 위해 전임상 및 임상 연구로 조사하였다 [참고: J. Yazdany and J Davis (2004) Lupus 13, 377].
독소 펩티드의 생산은 독을 분비하는 유기체에서 복잡한 과정이고, 합성적으로는 훨씬 더 복잡한 과정이다. 보존된 디설파이드 구조를 갖고 있고 효율적인 산화적 리폴딩 (refolding)을 필요로 하기 때문에, 독소 펩티드는 합성에 대한 과제를 제공한다. 독소 펩티드가 수 년간 고도로 선택적인 이온 채널의 약리학적 억제제로서 사용되어 오기는 했지만, 합성 비용이 많이 들고 독소 펩티드를 리폴딩해야 하며 그들의 생체내 반감기가 짧기 때문에, 이들 펩티드를 의약의 한 양식으로 채택하는 것이 지연되었다. 소분자 억제제를 이온 채널의 의약 활성 길항제로서 확인하기 위해, 독소 펩티드 자체에 대해 주어진 것보다 훨씬 더 많은 노력을 들였다. 한 가지 예외는 최근에 난치성 통증 치료용으로 승인된 저분자 ω-코노톡신 MVIIA 펩티드 [지코노티드 (Ziconotide™)]이다. 그러나, 지코노티드에 대한 합성 및 리폴딩 생성 과정은 비용이 많이 들고 생체내 반감기가 극히 짧은 (약 4시간) 저분자 펩티드 생성물만을 생성시킨다.
이온 채널 억제제 등과 같은 치료제를 생산하기 위한 비용 면에서 효과적인 방법이 절실히 요구되어 본 발명에 의해 제공되는데, 이는 독소 펩티드를 비히클과 융합시키거나 공유 접합시키는 것을 포함한다.
발명의 요약
본 발명은 다음 화학식 I 또는 그의 다량체로 표시되는 화합물 (composition of matter)에 관한 것이다:
(X1)a-(F1)d-(X2)b-(F2)e-(X3)c
상기 식에서,
F1 및 F2는 반감기 연장성 부분이고, d 및 e는 각각 독립적으로 0 또는 1인데, 단 d 및 e 중의 적어도 하나는 1이며;
X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 -(L)f-P-(L)g-이고, f 및 g는 각각 독립적으로 0 또는 1이며;
P는 2개 이상의 펩티드내 디설파이드 결합을 포함하는, 길이가 약 80개 아미노산 잔기 이하인 독소 펩티드이고;
L은 임의적인 링커 (f가 1이고/이거나 g가 1인 경우에 존재함)이며;
a, b, 및 c는 각각 독립적으로 0 또는 1인데, 단 a, b 및 c 중의 적어도 하나는 1이다.
따라서, 본 발명은 화학식 I 상의 가변부를 갖는 분자, 예를 들어 다음 화학식:
(II) P-(L)g-F1 (즉, b, c, 및 e는 0이다);
(III) F1-(L)f-P (즉, a, c, 및 e는 0이다);
(IV) P-(L)g-F1-(L)f-P 또는 (X1)a-F1-(X2)b (즉, c 및 e는 0이다);
(V) F1-(L)f-P-(L)g-F2 (즉, a 및 c는 0이다);
(VI) F1-(L)f-P-(L)g-F2-(L)f-P (즉, a는 0이다);
(VII) F1-F2-(L)f-P (즉, a 및 b는 0이다);
(VIII) P-(L)g-F1-F2 (즉, b 및 c는 0이다);
(IX) P-(L)g-F1-F2-(L)f-P (즉, b는 0이다);
및 통상적으로 펩티드(들)의 N-말단이 왼쪽에 위치하는 것으로 하여 이들의 모든 다량체에 관한 것이다. 상기 화학식 II 내지 IX의 분자 모두가 화학식 I의 의미 내에 있다. 화학식 I의 의미 내에서 독소 펩티드 (P)가 1개 이상 존재하는 경우, 이러한 펩티드는 독립적으로, 본 발명의 화합물에 또한 존재하는 기타 모든 독소 펩티드(들)와 동일하거나 상이할 수 있고, 존재하는 경우 링커 부분 [(L)f 및/또는 (L)g]은 독립적으로, 본 발명의 화합물 내에 존재할 수도 있는 기타 모든 링커(들)와 동일하거나 상이할 수 있다. 독소 펩티드(들)를 반감기 연장성 부분(들)과 접합시키는 것은 이러한 독소 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단을 통해서 이루어질 수도 있고, 그의 일차 아미노산 서열의 중간에 삽입되는 형태일 수도 있는데, F1은 F2보다 독소 펩티드의 N-말단에 더 근접하여 연결된다. 유용한 반감기 연장성 부분 (F1 또는 F2)에는 면역글로불린 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이 포함된다. 본원에 기재된 이들 및 기타 반감기 연장성 부분은 개별적으로 또는 병용해서 유용하다.
본 발명은 또한, 본래의 서열을 갖는 ShK, 0SK1, 또는 마우로톡신 (Maurotoxin: MTX) 펩티드와 비교해서 더 큰 Kv1.3 또는 IKCa1 길항제 활성 및/또는 표적 선택성을 지닌, 1개 이상의 아미노산 잔기에서 본래의 서열로부터 변형된 ShK, 0SK1, ChTx, 또는 마우로톡신의 독소 펩티드 유사체 (접합되거나 접합되지 않음)를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 이러한 독소 펩티드 유사체는 다음 서열들 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
표 2에 제시된 바와 같은 서열 88, 89, 92, 148 내지 200, 548 내지 561, 884 내지 949, 또는 1295 내지 1300; 또는
표 7에 제시된 바와 같은 서열 980 내지 1274, 1303, 또는 1308; 또는
표 13에 제시된 바와 같은 서열 330 내지 337, 341, 1301, 1302, 1304 내지 1307, 1309, 1311, 1312, 및 1315 내지 1336; 또는
서열 14에 제시된 바와 같은 서열 36, 59, 344-346, 또는 1369 내지 1390.
본 발명은 또한, 다음 서열들 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 기타 독소 펩티드 유사체에 관한 것이다:
표 3에 제시된 바와 같은 서열 201 내지 225; 또는
표 4에 제시된 바와 같은 서열 242 내지 248 또는 250 내지 260; 또는
표 5에 제시된 바와 같은 서열 261 내지 275; 또는
표 6에 제시된 바와 같은 서열 276 내지 293; 또는
표 8에 제시된 바와 같은 서열 299 내지 315; 또는
표 9에 제시된 바와 같은 서열 316 내지 318; 또는
표 10에 제시된 바와 같은 서열 319; 또는
표 11에 제시된 바와 같은 서열 327 또는 328; 또는
표 13에 제시된 바와 같은 서열 330 내지 337, 341, 1301, 1302, 1304 내지 1307, 1309, 1311, 1312, 또는 1315 내지 1336; 또는
표 14에 제시된 바와 같은 서열 1369 내지 1390; 또는
표 16에 제시된 바와 같은 서열 348 내지 353; 또는
표 19에 제시된 바와 같은 서열 357 내지 362, 364 내지 368, 370, 372 내지 385, 또는 387 내지 398; 또는
표 20에 제시된 바와 같은 서열 399 내지 408; 또는
표 22에 제시된 바와 같은 서열 410 내지 421; 또는
표 23에 제시된 바와 같은 서열 422, 424, 426, 또는 428; 또는
표 24에 제시된 바와 같은 서열 430 내지 437; 또는
표 25에 제시된 바와 같은 서열 438 내지 445; 또는
표 26에 제시된 바와 같은 서열 447, 449, 451, 453, 455, 또는 457; 또는
표 28에 제시된 바와 같은 서열 470 내지 482 또는 484 내지 493; 또는
표 29에 제시된 바와 같은 서열 495 내지 506; 또는
표 30에 제시된 바와 같은 서열 507 내지 518.
본 발명은 또한, 본 발명의 화합물과 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 통상적인 합성 방법, 재조합 DNA 기술, 또는 당해 분야에 널리 공지된 기타 펩티드 및 융합 단백질의 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 비-펩티드 부분을 갖는 본 발명의 화합물은 적용 가능한 경우 통상적인 펩티드 화학 반응 이외에도 통상적인 유기 화학 반응에 의해 합성할 수 있다.
고려되는 일차 용도는 치료제 및 예방제로서의 용도이다. 독소 펩티드를 혼입한 본 발명의 화합물은 접합되지 않은 펩티드와 거의 동등한 수준이거나 접합되지 않은 펩티드보다 훨씬 더 큰 수준의 활성 및/또는 이온 채널 표적 선택성을 지닐 수 있다.
따라서, 본 발명에는 자가면역 질환, 예를 들어 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재발 협착증, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질병, 또는 루푸스가 있는 것으로 진단된 환자에게, 치료적 유효량의 본 발명의 화합물 (바람직하게는 Kv1.3 길항제 펩티드 또는 IKCa1 길항제 펩티드를 포함하는 화합물)을 투여함으로써, 상기 질환의 한 가지 이상 증상을 경감시키는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법이 포함된다.
본 발명은 추가로, 기존에 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상을 경험한 적이 있는 환자에게, 예방적 유효량의 본 발명의 화합물 (바람직하게는 Kv1.3 길항제 펩티드 또는 IKCa1 길항제 펩티드를 포함하는 화합물)을 투여하여, 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상이 재발되는 것을 예방하거나 완화시키는 것을 포함하는, 다발성 경화증의 증상 재발을 예방하거나 완화시키는 방법에 관한 것이다.
대개는 치료제로서 고려되긴 하지만, 본 발명의 화합물은 치료제 또는 진단제에 대한 스크리닝에 유용할 수도 있다. 예를 들어, Fc-펩티드를, 항-Fc 피복된 판을 이용하는 검정에 사용할 수 있다. 반감기 연장성 부분, 예를 들어 Fc는 불용성 펩티드를 가용성으로 만들 수 있으므로, 수 많은 검정에 유용하다.
본 발명의 수 많은 부가 국면 및 이점들이 본 발명의 도면 및 상세한 설명을 고려할 때 명백할 것이다.
도 1은 IgG1 항체로부터 유래될 수 있는 몇몇 예시적인 Fc 이량체의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 본 도면에서의 "Fc"는 본원의 "Fc 도메인"의 의미 내의 Fc 변이체를 나타낸다. "X1" 및 "X2"는 다음에 정의되는 바와 같은 펩티드 또는 링커-펩티드 조합물을 나타낸다. 구체적인 이량체는 다음과 같다:
도 1A 및 도 1D: 단일 디설파이드-결합된 이량체;
도 1B 및 도 1E: 이중 디설파이드-결합된 이량체;
도 1C 및 도 1F: 비공유 이량체.
도 2는 약리학적 활성 독소 펩티드의 단일 단위를 보여주는 본 발명의 화합물의 몇몇 양태의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 도 2A는 단일 쇄 분자를 도시한 것이고, 이러한 분자에 대한 DNA 구조물을 나타낼 수도 있다. 도 2B는 링커-펩티드 일부가 이량체의 1개 쇄 상에만 존재하는 이량체를 도시한 것이다. 도 2C는 양 쇄 상에 펩티드 일부를 갖는 이량체를 도시한 것이다. 도 2C의 이량체는 도 2A에 도시된 단일 쇄를 암호화하는 DNA 구조물의 발현시 특정 숙주 세포에서 자발적으로 형성될 것이다. 다른 숙주 세포에서는, 이 세포가 이량체의 형성을 선호하하는 조건 하에 놓여질 수 있거나 이량체가 시험관 내에서 형성될 수 있다.
도 3은 포유류 발현에 대해 최적화시키고 본 발명에 사용할 수 있는, 인간 IgG1 Fc의 예시적 핵산 및 아미노산 서열 (각각 서열 1 및 2)을 도시한 것이다.
도 4는 세균성 발현에 대해 최적화시키고 본 발명에 사용할 수 있는, 인간 IgG1 Fc의 예시적 핵산 및 아미노산 서열 (각각 서열 3 및 4)을 도시한 것이다.
도 5A는 포유류 세포, 세균 또는 효모에서의 발현에 대해 최적화시킨 코돈을 함유하는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는, 성숙한 ShK 펩티드의 아미노산 서열 (서열 5)을 도시한 것이다.
도 5B는 ShK 펩티드 (서열 10) 내의 6개 시스테인에 의해 형성된 3개의 디설파이드 결합 (--S-S--)을 도시한 것이다.
도 6은 전압 의존형 칼륨 채널 억제제 스티코닥틸라 헬리안투스 (Stichodactyla helianthus) (ShK)와, 밀접하게 관련된 말미잘 독소 계열의 기타 구성원과의 정렬을 도시한 것이다. 스티코닥틸라 헬리안투스의 독으로부터 분리한 35개 아미노산 성숙한 ShK 독소 서열 (승인 #P29187)을, 밀접하게 관련된 말미잘 계열의 기타 구성원과 정렬시켜 도시하였다. 컨센서스 서열과 예측된 디설파이드 연쇄가 도시되었는데, 고도로 보존된 잔기가 음영 처리되었다. 도시된 HmK 펩티드 독소 서열 (Swiss-Protein 승인 #097436)은 최고의 말미잘 [라디안투스 마그니피카 (Radianthus magnifica); 헤테락티스 마그니피카 (Heteractis magnifica)]로부터의 미성숙 전구체의 서열이고, 추정상 신호 펩티드가 밑줄처져 있다. 성숙한 HmK 펩티드 독소는 길이가 35개 아미노산이고 잔기 40에서부터 74까지에 걸쳐 있는 것으로 예측되었다. AeK는 말미잘 악티니아 에퀸 (Actinia equine) (승인 #P81897)의 독으로부터 분리한 성숙한 펩티드 독소이다. 말미잘 아네모니아 술카타 (Anemonia sulcata) 및 부노도소마 그라눌리페라 (Bunodosoma granulifera) 각각의 독으로부터 분리한 성숙한 펩티드 독소 AsKS (승인 #Q9TWG1) 및 BgK (승인 #P29186)의 서열이 또한 도시된다. 도 6A는 말미잘 계열 독소의 기타 구성원, HmK [서열 6 (성숙한 펩티드), (서열 542, 신호 및 성숙한 펩티드 일부)], AeK (서열 7), AsKs (서열 8), 및 BgK (서열 9)에 대한 ShK의 아미노산 정렬 (서열 10)을 도시한 것이다. 예측된 디설파이드 연쇄가 도시되고 보존된 잔기를 강조하였다. (HmK, 서열: 543; ShK, 서열 10; AeK, 서열 544; AsKS, 서열 545). 도 6B는 3개의 디설파이드 연쇄 (C1-C6, C2-C4, C3-C5)를 갖는 상기 계열에 대한 디설파이드 연쇄 지도를 도시한 것이다.
도 7은 알파-전갈 독소 계열의 칼륨 채널 억제제의 아미노산 정렬을 도시한 것이다. [BmKK1, 서열 11; BmKK4, 서열 12; PBTx1, 서열 14; Tc32, 서열 13; BmKK6, 서열 15; P01, 서열 16; Pi2, 서열 17; Pi3, 서열 18; Pi4, 서열 19; MTX, 서열 20; Pi1, 서열 21; HsTx1, 서열 61; AgTx2, 서열 23; KTX1, 서열 24; OSK1, 서열 25; BmKTX, 서열 22; HgTX1, 서열 27; MgTx, 서열 28; C11Tx1, 서열 29; NTX, 서열 30; Tc30, 서열 31; TsTX-Ka, 서열 32; PBTx3, 서열 33; Lqh 15-1, 서열 34; 마르텐 (Marten)Tx, 서열 37; ChTx, 서열 36; ChTx-Lq2, 서열 42; IbTx, 서열 38; SloTx, 서열 39; BmTx1, 서열 43; BuTx, 서열 41; AmmTx3, 서열 44; AaTX1, 서열 45; BmTX3, 서열 46; Tc1, 서열 48; OSK2, 서열 49; TsK, 서열 54; CoTx1, 서열 55; CoTx2, 서열 871; BmPo5, 서열 60; ScyTx, 서열 51; P05, 서열 52; 타마핀 (Tamapin), 서열 53; 및 TmTx, 서열 691]. 고도로 보존된 잔기는 음영 처리하였고, 컨센서스 서열이 열거되었다. α-KTx의 아계열이 열거되었고, 이는 문헌 [참고: Rodriguez de la Vega, R.C. et al. (2003) TIPS 24: 222-227]에 보고된 것이다. 길항되는 것으로 보고된 몇몇 이온 채널 목록이 열거되었다 (IK = IKCa, BK=BKCa, SK=SKCa, Kv=전압 의존형 K+ 채널). 이러한 정렬에서의 대부분의 계열 구성원이 성숙한 펩티드 생성물을 나타내긴 하지만, 몇 가지는 미성숙 또는 변형된 형태의 펩티드를 나타내고, 이에는 다음이 포함된다: BmKK1, BmKK4, BmKK6, BmKTX, 마르텐Tx, ChTx, ChTx-Lq2, BmTx1, AaTx1, BmTX3, TsK, CoTx1, BmP05.
도 8은 본 발명에서 펩티보디 (peptibody)로 전환된 독소 펩티드의 정렬을 도시한 것이다 (아파민 (Apamin), 서열 68; HaTx1, 서열 494; ProTx1, 서열 56; PaTx2, 서열 57; ShK[2-35], 서열 92; ShK[1-35], 서열 5; HmK, 서열 6; ChTx (K32E), 서열 59; ChTx, 서열 36; IbTx, 서열 38; 0SK1 (E16K, K20D), 서열 296; 0SK1, 서열 25; AgTx2, 서열 23; KTX1, 서열 24; MgTx, 서열 28; NTX, 서열 30; MTX, 서열 20; Pi2, 서열 17; HsTx1, 서열 61; 아누록톡신 (Anuroctoxin) [AnTx], 서열 62; BeKm1, 서열 63; ScyTx, 서열 51; ωGVIA, 서열 64; ωMVIIa, 서열 65; Ptu1, 서열 66; 및 CTX, 서열 67). 독소의 본래 공급원이 표기될 뿐만 아니라 각각에서의 시스테인 수도 표기되었다. 표적화된 주요 이온 채널이 열거되었다. 상기 정렬은 그들의 공급원 및 이온 채널 표적 영향력을 기초로 하여 독소 펩티드의 군집을 형성한다는 것을 보여준다.
도 9는 독소 계열 내에서의 디설파이드 배열을 도시한 것이다. 각각의 아계열에 대한 디설파이드 수 및 디설파이드 결합 순서가 표기되었다. 각 디설파이드 연쇄 범주 내에 속하는 독소에 관한 부분 목록이 제시되었다.
도 10은 독소의 용액 구조가 조밀한 구조를 나타낸다는 것을 예시하고 있다. 말미잘 (ShK), 전갈 (MgTx, MTX, HsTx1), 해양 원뿔형 달팽이 (wGVIA) 및 타란툴라 (HaTx1)로부터의 본래 독소의 용액 구조는 28 내지 39개 아미노산 펩티드 모두가 조밀한 구조를 형성하고 있다는 것을 표시한다. 도시된 독소는 3 또는 4개 디설파이드 연쇄를 갖고 있고, 도 9에 도시된 6개 아계열 중의 4개에 속한다. 말미잘 (ShK), 전갈 (MgTx, MTX, HsTx1), 해양 원뿔형 달팽이 (wGVIA) 및 타란툴라 (HaTx1)로부터의 본래 독소의 용액 구조는 MMDB 엔트레즈 (Entrez) 3D-구조 데이터베이스 [참고: J. Chen et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 474] 및 뷰어 (viewer)를 이용하여, 단백질 데이터 은행 (PDB) 승인 번호 1ROO (mmdbId:5247), 1MTX (mmdbId:4064), 1TXM (mmdbId:6201), 1QUZ (mmdbId:36904), 1OMZ (mmdbId:1816) 및 1D1H (mmdbId:14344)으로부터 유래하였다.
도 11A-C는 pAMG21ampR-Fc-pep의 잔기 5131-6660의 핵산 서열 (서열 69 및 서열 1358) 및 암호화된 아미노산 서열 (서열 70, 서열 1359 및 서열 1360)을 도시한 것이다. Fc 도메인의 서열 (서열 71 및 72)은 5개의 C-말단 글리신 잔기를 제외한다. 이러한 벡터는 펩티드-링커 일부가 Fc 도메인의 C-말단에 존재하는 펩티보디의 생성을 가능케 한다.
도 11D는 펩티드-링커 서열로 대체되는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 (cat; "CmR" 부위)를 갖는 펩티보디 세균성 발현 벡터 pAMG21ampR-Fc-pep의 환 다이아그램을 도시한 것이다.
도 12A-C는 pAMG21ampR-Pep-Fc의 잔기 5131-6319의 핵산 서열 (서열 73 및 서열 1361) 및 암호화된 아미노산 서열 (서열 74, 서열 1362 및 서열 1363)을 도시한 것이다. Fc 도메인의 서열 (서열 75 및 76)은 5개의 N-말단 글리신 잔기를 제외한다. 이러한 벡터는 펩티드-링커 일부가 Fc 도메인의 N-말단에 존재하는 펩티보디의 생성을 가능케 한다.
도 12D는 펩티드-링커 서열로 대체되는 제오신 (zeocin) 내성 (ble; "ZeoR") 부위를 갖는 펩티보디 세균성 발현 벡터의 환 다이아그램을 도시한 것이다.
도 12E-F는 pAMG21ampR-Pep-Fc의 핵산 서열 (서열 1339) 및 암호화된 아미노산 서열 (서열 1340, 서열 1341 및 서열 1342)을 도시한 것이다. Fc 도메인의 서열 (서열 75 및 76)은 5개의 N-말단 글리신 잔기를 제외한다. 이러한 벡터는 펩티드-링커 일부가 Fc 도메인의 N-말단에 존재하는 펩티보디의 생성을 가능케 한다.
도 13A는 포유류 발현 벡터 pCDNA3.1(+) CMVi의 환 다이아그램이다.
도 13B는 인간 IgG1로부터의 Fc 영역, 10개 아미노산 링커 및 악티빈 (activin) RIIb 유전자를 함유하는 포유류 발현 벡터 pCDNA3.1(+)CMVi-Fc-2xG4S-악티빈 RIIb의 환 다이아그램이다.
도 13C는 Fc-L10-ShK[2-35] 암호화 서열을 함유하는 CHO 발현 벡터 pDSRa22의 환 다이아그램이다.
도 14는 후술되는 실시예 1에서 "Fc-L10-ShK[1-35]"으로서 확인된 분자의 뉴클레오티드 및 암호화된 아미노산 서열 (각각 서열 77 및 78)을 도시한 것이다. L10 링커 아미노산 서열 (서열 79)이 밑줄처져 있다.
도 15는 후술되는 실시예 2에서 "Fc-L10-ShK[2-35]"으로서 확인된 분자의 뉴클레오티드 및 암호화된 아미노산 서열 (각각 서열 80 및 81)을 도시한 것이다. Fc-L10-ShK[1-35] (도 14)에 사용된 바와 동일한 L10 링커 아미노산 서열 (서열 79)이 밑줄처져 있다.
도 16은 후술되는 실시예 2에서 "Fc-L25-ShK[2-35]"으로서 확인된 분자의 뉴클레오티드 및 암호화된 아미노산 서열 (각각 서열 82 및 83)을 도시한 것이다. L25 링커 아미노산 서열 (서열 84)이 밑줄처져 있다.
도 17은 후술되는 실시예 32에 기재되기도 하는, 환원적 아민화에 의한 ShK 펩티드 (서열 5 및 서열 10)의 N-말단 PEG화를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 18은 후술되는 실시예 34에 기재되기도 하는, 아민 형성을 통한 ShK 펩티드 (서열 5 및 서열 10)의 N-말단 PEG화를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 19는 후술되는 실시예 33에 기재되기도 하는, 화학선택적 옥심 형성에 의한 ShK 펩티드 (서열 5 및 서열 10)의 N-말단 PEG화를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2OA는 214 nm에서의 역상 HPLC 분석을 도시한 것이고, 도 2OB는 폴딩된-"Des-Arg1-ShK" (펩티드 2)로서 기재되기도 한 폴딩된 ShK[2-35]의 전기 분무 질량 분석을 도시한 것이다.
도 21은 N-말단적 PEG화 ShK[2-35] (이는 N-말단적 PEG화-"Des-Arg1-ShK"로서 지칭되기도 한다)의 214 nm에서의 역상 HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 22A는 폴딩된 ShK[1-35] (이는 "ShK"로서 지칭되기도 한다)의 214 nm에서의 역상 HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 22B는 폴딩된 ShK[1-35] (이는 "ShK"로서 지칭되기도 한다)의 전기 분무 질량 분석을 도시한 것이다.
도 23은 후술되는 실시예 31에 기재되기도 하는, 환원적 아민화에 의한 ShK[2-35] (서열 92 및 58; 이는 "Des-Arg1-ShK" 또는 "ShK d1"로서 지칭되기도 한다)의 N-말단 PEG화를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 24A는 Fc-L10-ShK[1-35]으로 일시적으로 형질감염시킨 HEK 293 세포로부터의 적응용 배지의 웨스턴 블롯 (western blot)을 도시한 것이다. 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 15 ㎕ Fc-L1O-ShK; 레인 3: 10 ㎕ Fc-L1O-ShK; 레인 4: 5 ㎕ Fc-L1O-ShK; 레인 5; 분자량 마커; 레인 6: 블랭크; 레인 7: 15 ㎕ No DNA 대조군; 레인 8: 10 ㎕ No DNA 대조군; 레인 9: 5 ㎕ No DNA 대조군; 레인 10; 분자량 마커
도 24B는 Fc-L-ShK[1-35]로 안정적으로 형질감염시킨 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포의 클론으로부터의 15 ㎕ 적응용 배지를 이용한 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 1 내지 15는 다음과 같이 부하되었다: 블랭크, BB6, 분자량 마커, BB5, BB4, BB3, BB2, BB1, 블랭크, BD6, BD5, 분자량 마커, BD4, BD3, BD2.
도 25A는 Fc-L-SmIIIA로 일시적으로 형질감염시킨 293T 세포로부터의 적응용 배지를 함유하는 비-환원성 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
도 25B는 Fc-L-SmIIIA로 일시적으로 형질감염시킨 293T 세포로부터의 적응용 배지를 함유하는 환원성 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다.
도 26A는 휴렛 팩카드 (Hewlett Packard) 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 안정적으로 형질감염시킨 CHO 세포로부터의 10 ㎕ 정제된 Fc-L10-ShK[1-35] 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 26B는 최종 Fc-L10-ShK[1-35] 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 (Novex Mark12) 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 26C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 (Phenomenex BioSep) SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-ShK[1-35] 생성물 20 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 26D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 (Voyager) DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-ShK[1-35] 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 27A는 안정적으로 형질감염시킨 CHO 세포로부터의 최종 정제된 Fc-L10-ShK[2-35] 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 27B는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 정제된 Fc-L10-ShK[2-35] 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 27C는 안정적으로 형질감염시킨 CHO 세포로부터 정제된 Fc-L5-ShK[2-35]의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 27D는 안정적으로 형질감염시킨 CHO 세포로부터 정제된 Fc-L25-ShK[2-35]의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 27E는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 10 ㎕의 Fc-L10-ShK[2-35] 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 27F는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-ShK[2-35] 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 27G는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 10 ㎕의 Fc-L5-ShK[2-35] 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 27H는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L5-ShK[2-35] 생성물 50 mg 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 27I는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L5-ShK[2-35] 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 27J는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 20 ㎕의 상기 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 27K는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L25-ShK[2-35] 생성물 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 27L은 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L25-ShK[2-35] 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 28A는 세균성 세포로부터 정제되고 리폴딩된 Fc-L10-KTX1의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 28B는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 정제된 Fc-L10-KTX1 45 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 28C는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 20 ㎕의 Fc-L10-KTX1 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 28D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-KTX1 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 29A는 세균성 세포로부터 정제되고 리폴딩된 Fc-L-AgTx2의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 29B는 세균성 세포로부터 정제되고 리폴딩된 Fc-L10-HaTx1의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물, 정제된 물질의 스펙트럼 스캔.
도 29C는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 20 ㎕의 Fc-L10-AgTx2 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 29D는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-AgTx2 생성물 20 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 29E은 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-AgTx2 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 29F는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 20 ㎕의 Fc-L10-HaTx1 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 29G는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-HaTx1 생성물 20 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 29H은 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-HaTx1 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 3OA는 CHO 세포로부터 정제된 Fc-L10-ShK[1-35]가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있다.
도 3OB는 각종 농도에서 Fc-L10-ShK[1-35]에 의한 칼륨 전류 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. IC50은 15 ± 2 pM (n = 4개 세포)인 것으로 추정되었다.
도 3OC는 합성 ShK[1-35] (이는 "ShK" 단독으로 지칭되기도 한다)가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있다.
도 3OD는 각종 농도에서의 ShK[1-35] 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. ShK에 대한 IC50은 12 ± 1 pM (n = 4개 세포)인 것으로 추정되었다.
도 31A는 합성 펩티드 유사체 ShK[2-35]가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 바와 같은 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있다 [IC50은 49 ± 5 pM (n = 3개 세포)이다].
도 31B는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[2-35] 펩티보디가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 바와 같은 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있다 [IC50은 115 ± 18 pM (n = 3개 세포)이다].
도 31C는 Fc-L5-ShK[2-35] 펩티보디가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있다 [IC50은 100 pM (n = 3개 세포)이다].
도 32A는 세균성 세포로부터 정제된 Fc-L-KTX1 펩티보디가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 바와 같은 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있다.
도 32B는 각종 농도에서 Fc-L10-KTX1에 의한 칼륨 전류 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다.
도 33은 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디는, 인간 Kv1.3으로 안정적으로 형질감염시킨 HEK 293 세포를 염색시키는 반면 (도 33A), 형질감염시키지 않은 HEK 293 세포는 상기 펩티보디로 염색되지 않는다는 것을 (도 33B) 면역조직화학에 의해 도시하고 있다.
도 34는 인간 Kv1.3으로 안정적으로 형질감염시킨 고정된 HEK 293 세포를 사용한 효소-면역검정 결과를 도시한 것이다. 도 34A는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] (이는 간단히 "Fc-L1O-ShK"로서 지칭되기도 한다) 펩티보디가 용량-의존적 반응 증가를 나타내는 반면, CHO-Fc 대조군 ("Fc 대조군")은 그렇치 못하다는 것을 도시한 것이다. 도 34B는 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디 (이는 "Fc-ShK"로서 지칭되기도 한다)가, 유사한 조건을 사용하여 형질감염시키지 않은 HEK 293 세포로부터는 반응을 유도시키지 않는다는 것을 도시하고 있고, 또한 기타 음성 대조군을 도시하고 있다.
도 35는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가, PMA 및 αCD3 항체 자극된 인간 PBMC로부터의 IL-2 (도 35A) 및 IFNγ (도 35B) 생성을 용량-의존적으로 억제한다는 것을 도시한 것이다. 상기 펩티보디는 해당 반응의 완전한 억제를 나타내는 신규한 약리학을 보여주는 반면, 합성 ShK[1-35] 펩티드 단독은 단지 부분 억제만을 보여준다.
도 36은 포유류-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가, CD3 및 CD28에 대한 항체로 자극한 2명의 정상 공여자로부터의 인간 PBMC 중에서의 T 세포 증식 (3H-티미딘 혼입)을 억제한다는 것을 도시한 것이다. 도 36A는 공여자 1의 반응을 도시한 것이고, 도 36B는 공여자 2의 반응을 도시한 것이다. 항-CD32 (FcgRII) 차단성 항체와 함께 예비-항온 배양하는 것은 상기 펩티보디에 대한 민감성을 변경시키지 못하였다.
도 37은 정제된 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가, αCD3 및 αCD28 항체 자극된 인간 PBMC로부터의 IL-2 (도 37A) 및 IFNγ (도 37B) 생성을 용량-의존적으로 억제한다는 것을 도시한 것이다.
도 38A는 PEG화 ShK[2-35] 합성 펩티드가, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류를 농도 의존적으로 차단시킨다는 것을 도시하고 있고, 시간 경과에 따른 각종 농도에서의 칼륨 전류 차단이 도 38B에 도시되어 있다.
도 39A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 Fc-L10-ShK[1-35] 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 39B는 최종 Fc-L10-ShK[1-35] 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 39C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-ShK[1-35] 생성물 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 40A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 20 ㎕의 Fc-L10-ShK[2-35] 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 40B는 최종 Fc-L10-ShK[2-35] 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 40C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-ShK[2-35] 생성물 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 40D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-ShK[2-35] 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 41A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 Fc-L10-OSK1 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 41B는 최종 Fc-L10-OSK1 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 41C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-OSK1 생성물 123 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 41D는 LCQ 이온 트랩 질량 분광계 내로 지시된 유출물의 일부를 수반한 비닥 (Vydac) C4 칼럼을 사용하여 대략 4 ㎍의 최종 Fc-L10-OSK1 샘플의 액체 크로마토그래피-질량 분광 분석을 도시한 것이다. 상기 질량 분광계 제조업자가 제공한 바이오워크스 (Bioworks) 소프트웨어를 이용하여 질량 스펙트럼을 풀어내었다 (deconvolute).
도 42A-B는 Fc-L10-OSK1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열 1040 및 서열 1041)을 도시한 것이다.
도 43A-B는 Fc-L10-OSK1[K7S]의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열 1042 및 서열 1043)을 도시한 것이다.
도 44A-B는 Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열 1044 및 서열 1045)을 도시한 것이다.
도 45A-B는 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (각각 서열 1046 및 서열 1047)을 도시한 것이다.
도 46은 항-인간 Fc 항체를 이용한 (트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE로부터의) 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 1 내지 6은 다음과 같이 부하하였다: 15 ㎕의 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]; 15 ㎕의 Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]; 15 ㎕의 Fc-L10-OSK1[K7S]; 15 ㎕의 Fc-L10-OSK1; 15 ㎕의 "No DNA" 대조군; 분자량 마커.
도 47은 항-인간 Fc 항체를 이용한 (트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE로부터의) 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 1 내지 5는 다음과 같이 부하하였다: 2 ㎕의 Fc-L10-OSK1; 5 ㎕의 Fc-L10-OSK1; 10 ㎕의 Fc-L10-OSK1; 20 ng 인간 IgG 표준물; 분자량 마커.
도 48은 항-인간 Fc 항체를 이용한 (트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE로부터의) 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 1 내지 13은 다음과 같이 부하하였다: 20 ng 인간 IgG 표준물; D1; C3; C2; B6; B5; B2; B1; A6; A5; A4; A3; A2 (5 ㎕의 클론-적응용 배지가 레인 2 내지 13에 부하되었다).
도 49A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 Fc-L10-OsK1 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 49B는 최종 Fc-L10-OsK1 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 49C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-OsK1 생성물 149 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 49D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 Fc-L10-OsK1 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 50A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 Fc-L10-OsK1(K7S) 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 50B는 최종 Fc-L10-OsK1(K7S) 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 50C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-OsK1(K7S) 생성물 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 50D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 생성물 Fc-L10-OsK1(K7S) 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 51A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 Fc-L10-OsK1(E16K,K20D) 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 51B는 최종 Fc-L10-OsK1(E16K,K20D) 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 51C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-OsK1(E16K,K20D) 생성물 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 51D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 생성물 Fc-L10-OsK1(E16K,K20D) 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 52A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 Fc-L10-OsK1(K7S,E16K,K20D) 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 52B는 최종 Fc-L10-OsK1(K7S,E16K,K20D) 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 52C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 Fc-L10-OsK1(K7S,E16K,K20D) 생성물 50 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 52D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 생성물 Fc-L10-OsK1(K7S,E16K,K20D) 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
도 53은 아시아산 전갈 오르토키루스 스크로비쿨로수스 (Orthochirus scrobiculosus) 독의 38개 잔기 독소 펩티드인 합성 Osk1에 의한, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류의 억제를 도시한 것이다. 도 53A는 합성 Osk1 독소 펩티드에 의한, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류의 농도 의존적 차단을 도시하고 있다. 도 53B는 각종 농도에서 합성 Osk1 독소 펩티드에 의한 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. 합성 Osk1 독소 펩티드에 대한 IC50은 39 ± 12 pM (n = 4개 세포)인 것으로 추정되었다.
도 54는 특정 항체의 Fc-단편과 융합시킴으로써 합성 OSK1 독소 펩티드를 변형시킨 것 (OSK1-펩티보디)이 인간 Kv1.3 채널에 대항한 억제 활성을 보유하였다는 것을 도시하고 있다. 도 54A는 10개 아미노산 잔기의 링커 쇄 길이를 이용하여 인간 IgG1 Fc-단편과 연결시킨 OSK1 (Fc-L10-OSK1)에 의한, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류의 농도 의존적 차단을 도시하고 있다. 상기 융합 구조물은 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 안정적으로 발현하였다. 도 54B는 각종 농도에서 Fc-L10-OSK1에 의한 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. Fc-L10-OSK1에 대한 IC50은 198 ± 35 pM (n = 6개 세포)인 것으로 추정되었는데, 이는 합성 OSK1 독소 펩티드보다 대략 5배 정도 덜 효능있다.
도 55는 OSK1-펩티보디의 단일 아미노산 잔기 치환물이 인간 Kv1.3 채널에 대항한 억제 활성을 보유하였다는 것을 도시하고 있다. 도 55A는 단일 아미노산 치환 (N-말단으로부터 7번째 위치에서 리신을 세린으로 치환시킴, [K7S])을 수반하고 10개 아미노산 잔기의 링커 쇄 길이를 이용하여 인간 IgG1 Fc-단편과 연결시킨 OSK1-펩티보디 (Fc-L10-OSK1[K7S])에 의한, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류의 농도 의존적 차단을 도시하고 있다. 상기 융합 구조물은 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 안정적으로 발현하였다. 도 55B는 각종 농도에서 Fc-L10-OSK1[K7S]에 의한 칼륨 전류 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. IC50은 372 ± 71 pM (n = 4개 세포)인 것으로 추정되었는데, 이는 합성 OSK1 독소 펩티드보다 대략 10배 정도 덜 효능있다.
도 56은 OSK1-펩티보디의 2개 아미노산 잔기 치환물이 인간 Kv1.3 채널에 대항한 억제 활성을 보유하였다는 것을 도시하고 있다. 도 56A는 2개 아미노산 치환 (N-말단으로부터 16번째 및 20번째 위치에서 각각 글루탐산을 리신으로 치환시키고, 리신을 아스파르트산으로 치환시킴 [E16K,K20D])을 수반하고 10개 아미노산 잔기의 링커 쇄 길이를 이용하여 인간 IgG1 Fc-단편과 연결시킨 OSK1-펩티보디 (Fc-L10-OSK1[E16K,K20D])에 의한, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류의 농도 의존적 차단을 도시하고 있다. 상기 융합 구조물은 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 안정적으로 발현하였다. 도 56B는 각종 농도에서 Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]에 의한 칼륨 전류 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. IC50은 248 ± 63 pM (n = 3개 세포)인 것으로 추정되었는데, 이는 합성 OSK1 독소 펩티드보다 대략 6배 정도 덜 효능있다.
도 57은 OSK1-펩티보디의 삼중 아미노산 잔기 치환물이 인간 Kv1.3 채널에 대항한 억제 활성을 보유하고 있지만, 억제 효력은 합성 OSK1 독소 펩티드와 비교해서 상당히 저하되었다는 것을 도시하고 있다. 도 57A는 삼중 아미노산 치환 (N-말단으로부터 7번째, 16번째 및 20번째 위치에서 각각 리신을 세린으로 치환시키고, 글루탐산을 리신으로 치환시키고, 리신을 아스파르트산으로 치환시킴 [K7S,E16K,K20D])을 수반하고 10개 아미노산 잔기의 링커 쇄 길이를 이용하여 인간 IgG1 Fc-단편과 연결시킨 OSK1-펩티보디 (Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D])에 의한, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록한 외측 칼륨 전류의 농도 의존적 차단을 도시하고 있다. 상기 융합 구조물은 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 안정적으로 발현하였다. 도 57B는 각종 농도에서 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]에 의한 칼륨 전류 차단을 시간 경과에 따라 도시한 것이다. IC50은 812 ± 84 pM (n = 3개 세포)인 것으로 추정되었는데, 이는 합성 OSK1 독소 펩티드보다 대략 21배 정도 덜 효능있다.
도 58은 소정의 혈청 비율 (%)에서 각 표준물에 대한 선형 회귀 방정식을 함유하는 ShK (도 58A) 및 2OK PEG-ShK[1-35] (도 58B)에 대한 표준 곡선을 도시한 것이다.
도 59는 랫트에서 정맥내 주사 후 2OK PEG-ShK[1-35] 분자의 약동학적 프로파일을 도시한 것이다.
도 60은 Kv1.3 억제제 ShK 대 2OK PEG-ShK[1-35]을 등몰 량으로 단일 정맥내 주사한 랫트의 혈청 샘플 (5%) 중에서의 Kv1.3 억제 활성을 도시한 것이다.
도 61은 적응 전이 EAE 모델 실험 계획을 예시한 것이다 (처리군당 5마리 랫트). 투여 값 [마이크로그램/킬로그램 (mg/kg)]은 펩티드 함량을 기준으로 한 것이다.
도 62는 PEG-ShK를 이용한 처치가, 적응 전이 EAE 모델 중의 랫트에게서 질병을 개선시켰다는 것을 도시한 것이다. 임상 스코어링: 0 = 징후가 전혀 없음, 0.5 = 말단 미부 (tail)에 기운이 없음, 1.0 = 미부에 기운이 없음, 2.0 = 순한 정도의 하반신 부전마비 (paraparesis), 운동실조, 3.0 = 중간 정도의 하반신 부전마미, 3.5 = 1개 뒷다리 부전마비, 4.0 = 전체 뒷다리 부전마비, 5.0 = 전체 뒷다리 부전마비 및 실금, 5.5 = 사지마비 (tetraplegia), 6.0 = 빈사 상태 또는 사망. 스코어가 5.5 내지 6인 랫트는 사망하였거나 안락사시켰다. 평균 ± sem 값이 제시되었다 (처리군당 5마리 랫트).
도 63은 PEG-ShK를 이용한 처치가, 적응 전이 EAE 모델에게서 체중 손실을 예방시켰다는 것을 도시한 것이다. 랫트를 대상으로 하여 (살아있는 랫트의 경우에) -1, 4, 6 및 8일째에 칭량하였다. 평균 ± sem 값이 제시되었다.
도 64는 인간 전혈에서 탑시가르긴-유도된 IL-2 생성이 Kv1.3 채널 억제제 ShK[1-35] 및 Fc-L10-ShK[2-35]에 의해 억제되었다는 것을 도시한 것이다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A 또한 상기 반응을 차단시켰다. BKCa 채널 억제제 이베리오톡신 (IbTx)은 유의적 활성을 전혀 나타내지 않았다. 2명의 별개의 공여자로부터의 전혈의 반응이 도 64A 및 도 64B에 도시되어 있다.
도 65는 인간 전혈에서 탑시가르긴-유도된 IFN-g 생성이 Kv1.3 채널 억제제 ShK[1-35] 및 Fc-L10-ShK[2-35]에 의해 억제되었다는 것을 도시한 것이다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A 또한 상기 반응을 차단시켰다. BKCa 채널 억제제 이베리오톡신 (IbTx)은 유의적 활성을 전혀 나타내지 않았다. 2명의 별개의 공여자로부터의 전혈의 반응이 도 65A 및 도 65B에 도시되어 있다.
도 66은 인간 전혈에서 T 세포 상에서의 탑시가르긴-유도된 CD40L 상향 조절이 Kv1.3 채널 억제제 ShK[1-35] 및 Fc-L10-ShK[1-35] (Fc-Shk)에 의해 억제되었다는 것을 도시한 것이다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A (CsA) 또한 상기 반응을 차단시켰다. 도 66A는 총 CD4+ T 세포의 반응을 조사한 실험 결과를 도시한 것이다. 도 66B는 총 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 CD4+CD45+ 및 CD4+CD45- T 세포를 조사한 실험 결과을 도시한 것이다. 도 66B에서, BKCa 채널 억제제 이베리오톡신 (IbTx) 및 Kv1.1 채널 억제제 덴드로톡신-K (DTX-K)는 유의적 활성을 전혀 나타내지 않았다.
도 67은 인간 전혈에서 T 세포 상에서의 탑시가르긴-유도된 IL-2R 상향 조절이 Kv1.3 채널 억제제 ShK[1-35] 및 Fc-L10-ShK[1-35] (Fc-Shk)에 의해 억제되었다는 것을 도시한 것이다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A (CsA) 또한 상기 반응을 차단시켰다. 도 67A는 총 CD4+ T 세포의 반응을 조사한 실험 결과를 도시한 것이다. 도 67B는 총 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 CD4+CD45+ 및 CD4+CD45- T 세포를 조사한 실험 결과를 도시한 것이다. 도 67B에서, BKCa 채널 억제제 이베리오톡신 (IbTx) 및 Kv1.1 채널 억제제 덴드로톡신-K (DTX-K)는 유의적 활성을 전혀 나타내지 않았다.
도 68은 PEG-Shk 정제 (도 68A) 및 PEG-OSK-1 정제 (도 68B)를 위한 SP 세파로스 HP 칼럼 상에서의 PEG-펩티드 정제의 양이온 교환 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 69는 PEG-Shk 순도 >99% (도 69A) 및 PEG-0sk1 순도 >97% (도 69B)를 입증하기 위한 최종 PEG-펩티드 풀 상에서의 RP-HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 70은 다음 3개의 연결된 도메인을 갖는 예시되는 Fc루프-L2-OsK1-L2의 아미노산 서열 (서열 976)을 도시한 것이다: Fc N-말단 도메인 (아미노산 잔기 1-139); OsK1 (밑줄친 아미노산 잔기 142-179); 및 Fc C-말단 도메인 (아미노산 잔기 182-270).
도 71은 다음 3개의 연결된 도메인을 갖는 예시되는 Fc루프-L2-ShK-L2의 아미노산 서열 (서열 977)을 도시한 것이다: Fc N-말단 도메인 (아미노산 잔기 1-139); ShK (밑줄친 아미노산 잔기 142-176); 및 Fc C-말단 도메인 (아미노산 잔기 179-267).
도 72는 다음 3개의 연결된 도메인을 갖는 예시되는 Fc루프-L2-ShK-L4의 아미노산 서열 (서열 978)을 도시한 것이다: Fc N-말단 도메인 (아미노산 잔기 1-139); ShK (밑줄친 아미노산 잔기 142-176); 및 Fc C-말단 도메인 (아미노산 잔기 181-269).
도 73은 다음 3개의 연결된 도메인을 갖는 예시되는 Fc루프-L4-OsK1-L2의 아미노산 서열 (서열 979)을 도시한 것이다: Fc N-말단 도메인 (아미노산 잔기 1-139); OsK1 (밑줄친 아미노산 잔기 144-181); 및 Fc C-말단 도메인 (아미노산 잔기 184-272).
도 74는 2OK PEG화 ShK[1-35]가, HEK293/Kv1.3 세포 상에서 완전 세포 패치 클램프 (patch clamp) 전기생리학에 의해 결정된 바와 같이 인간 Kv1.3을 강력하게 차단시켰다는 것을 도시한 것이다. 데이터는 피크 전류의 차단을 나타낸다.
도 75는 본 발명의 화합물의 몇몇 기타 예시적 양태의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. "X2" 및 "X3"은 본원에 정의된 바와 같은 독소 펩티드 또는 링커-독소 펩티드 조합물 [즉, -(L)f-P-(L)g-]을 나타낸다. 본원에 기재되긴 하였지만, 도 75에 도시되지 않은 부가의 X1 도메인 및 하나 이상의 부가의 PEG 부분 또한 기타 양태에 포괄된다. 본 도면에 도시된 구체적 양태들은 다음과 같다:
도 75C, 도 75D, 도 75G 및 도 75H는 단일 쇄 분자를 도시한 것이고, 이러한 분자에 대한 DNA 구조물을 나타낼 수도 있다.
도 75A, 도 75B, 도 75E 및 도 75F는 이중으로 디설파이드-결합된 Fc 이량체 (위치 F2에서)를 도시한 것이고; 도 75A 및 도 75B는 위치 X3 내의 양 쇄 상에 독소 펩티드 일부를 갖는 이량체를 도시한 것이며; 도 75E 및 도 75F는 위치 X2 내의 양 쇄 상에 독소 펩티드 일부를 갖는 이량체를 도시한 것이다.
도 76A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 50 ㎕의 ShK[2-35]-Fc 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 76B는 최종 ShK[2-35]-Fc 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 76C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 ShK[2-35]-Fc 생성물 70 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 76D는 아질런트 (Agilent) 1100 HPLC 수행 역상 크로마토그래피를 사용한 최종 ShK[2-35]-Fc 샘플의 LC-MS 분석을 도시한 것인데, 컬럼 유출물은 더모 핀니간 (Thermo Finnigan) LCQ 이온 트랩 질량 분광계의 전기 분무 공급원과 직접 커플링시켰다. 바이오워크스 소프트웨어 패키지를 사용하여 관련 스펙트럼을 합하고 질량 데이터로 풀어 내었다.
도 77A는 휴렛 팩카드 8453 분광광도계 및 1-cm 경로 길이 석영 큐벳을 이용하여, 700 ㎕ PBS (블랭크 완충액) 중에서 희석시킨 20 ㎕의 met-ShK[1-35]-Fc 생성물의 스펙트럼 스캔을 도시한 것이다.
도 77B는 최종 met-ShK[1-35]-Fc 생성물의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE를 도시한 것이다. 레인 1 내지 12는 다음과 같이 부하되었다: 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 비-환원 생성물, 블랭크, 10 ㎍ 비-환원 생성물, 노벡스 마크12 광범위 단백질 표준물, 0.5 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 2.0 ㎍ 환원 생성물, 블랭크, 및 10 ㎍ 환원 생성물.
도 77C는 280 nm에서의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, 및 pH 6.9 중에서 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 최종 met-ShK[1-35]-Fc 생성물 93 ㎍ 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 도시한 것이다.
도 77D는 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석한 최종 met-ShK[1-35]-Fc 샘플의 MALDI 질량 분광 분석을 도시한 것이다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
용어 정의
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어들은 구체적 예로 달리 제한하지 않는 한은 다음과 같이 정의된다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 단수 형태는 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 복수 대상물을 포함한다.
용어 "반감기 연장성 부분" (즉, 화학식 I 중의 F1 또는 F2)은 접합되지 않은 형태의 독소 펩티드와 비교해서, 독소 펩티드의 생체내 단백질분해적 분해 또는 기타 활성-저하성 화학적 변형을 방지 또는 완화시키고/시키거나, 반감기 또는 기타 약동학적 특성 (이에는 흡수율 증가가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)을 증가시키고/시키거나, 독성을 저하시키고/시키거나, 용해도를 개선시키고/시키거나, 관심있는 표적 이온 채널과 관련하여 독소 펩티드의 표적 선택성 및/또는 생물학적 활성을 증가시키고/시키거나, 제조 가능성을 증가시키고/시키거나, 독소 펩티드의 면역원성을 저하시키는, 독소 펩티드와 접합되거나 공유 결합에 의해 연결된 제약상 허용 가능한 부분, 도메인, 또는 "비히클"을 지칭한다.
"PEG화 펩티드"란 펩티드 자체의 아미노산 잔기에 공유 결합되거나, 또는 펩티드의 잔기에 공유 결합된 펩티딜 또는 비-펩티딜 링커 (이에는 방향족 링커가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다)에 공유 결합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분을 갖는 펩티드 또는 단백질을 의미한다.
"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"란 커플링제를 사용하거나 사용하지 않으면서, 또는 커플링 또는 활성화 부분 (예를 들어, 알데히드, 히드록시석신이미딜, 히드라지드, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, 오르토피리딜 디설파이드, 비닐설폰, 요오도아세트아미드 또는 말레이미드 부분)을 이용한 유도체화를 수반하거나 수반하지 않은, 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 의미한다. 본 발명에 따라서 유용한 PEG에는 실질적으로 선형, 직쇄 PEG, 측쇄 PEG, 또는 수지상 PEG가 포함된다 [참고: 예를 들어, Merrill, 미국 특허 제5,171,264호; Harris et al., Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces, 미국 특허 제5,932,462호; Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, 미국 특허 제6,602,498호].
용어 "펩티보디"는 F1 및/또는 F2가 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 일부, 예를 들어 Fc의 CH2 도메인이거나, 또는 독소 펩티드가 인간 IgG1 Fc 도메인 루프 내로 삽입되어 F1 및 F2가 각각, 그들 사이에 독소 펩티드가 삽입된 Fc 도메인의 일부가 되도록 한 화학식 I의 분자를 지칭한다 [참고: 예를 들어, 본원의 도 70 내지 73 및 본원 실시예 49]. 본 발명의 펩티보디를 본원에 추가로 기재되는 바와 같이, Fc 도메인 또는 그의 일부에서, 또는 본 발명의 화합물의 독소 펩티드(들) 부분에서, 또는 둘 다에서 PEG화시킬 수도 있다.
용어 "본래의 Fc"는 단량체성 형태이든 아니면 다량체성 형태이든지 간에, 완전 항체를 분해시킴으로써 비롯되는 비-항원-결합성 단편의 서열을 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 본래의 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 바람직하게 인간 기원이고, 면역글로불린 중의 어느 것일 수도 있으나, IgG1 또는 lgG2가 바람직하다. 본래의 Fc는 공유적 (즉, 디설파이드 결합) 및 비-공유적 연합에 의해 이량체성 또는 다량체성 형태로 연결될 수 있는 단량체성 폴리펩티드로 구성되어 있다. 본래의 Fc 분자의 단량체성 소단위체들 간의 분자간 디설파이드 결합 수는 부류 (예: IgG, IgA, IgE) 또는 아부류 (예: IgG1, lgG2, IgG3, IgA1, lgGA2)에 따라서 1 내지 4개이다. 본래의 Fc의 한 가지 예는 IgG를 파파인 분해시킴으로써 비롯되는 디설파이드-결합된 이량체이다 [참고: Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9]. 본원에 사용된 용어 "본래의 Fc"는 단량체성, 이량체성 및 다량체성 형태에 대해 총칭적이다.
용어 "Fc 변이체"는 본래의 Fc로부터는 변형되었지만, 재이용 수용체 FcRn에 대한 결합 부위는 여전히 포함하고 있는 분자 또는 서열을 지칭한다. 몇 가지 공개된 특허 문서에는 예시적 Fc 변이체 뿐만 아니라 재이용 수용체와의 상호 작용이 기재되어 있다 [참고: 국제공개공보 WO 97/34631 (1997년 9월 25일자로 공개됨); WO 96/32478 (2000년 8월 1일자로 허여된 미국 특허 제 6,096,891에 상응하고, 그의 전문이 본원에 참고로 도입됨); 및 WO 04/110472]. 따라서, 용어 "Fc 변이체"에는 비-인간 본래의 Fc로부터 인간화시킨 분자 또는 서열이 포함된다. 더우기, 본래의 Fc는, 본 발명의 융합 분자에 요구되지 않는 생물학적 활성이나 구조적 특징을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 부위를 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"에는 (1) 디설파이드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 비화합성, (3) 선택된 숙수 세포에서의 발현시 N-말단 이질성, (4) 당화, (5) 보체와의 상호 작용, (6) 재이용 수용체 이외의 Fc 수용체와의 결합, 또는 (7) 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 관여하거나 이에 영향을 미치는 1개 이상의 본래의 Fc 부위 또는 잔기가 결여된 분자 또는 서열이 포함된다. Fc 변이체는 다음에 추가로 상세히 기재된다.
용어 "Fc 도메인"은 상기 정의된 바와 같은 본래의 Fc 및 Fc 변이체 분자 및 서열을 포괄한다. Fc 변이체 및 본래의 Fc와 같이, 용어 "Fc 도메인"에는 완전 항체로부터 분해되든지 아니면 기타 수단에 의해 생성되든지 간에, 단량체성 또는 다중체성 형태의 분자가 포함된다.
Fc 도메인에 적용되거나 Fc 도메인을 포함하는 분자에 적용되는 용어 "다량체"는 공유적으로 연합되거나, 비공유적으로 연합되거나, 또는 공유적 및 비공유적 상호 작용 둘 다에 의해 연합된 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 갖는 분자를 지칭한다. IgG 분자는 전형적으로 이량체를 형성하고; IgM은 오량체를 형성하며; IgD는 이량체를 형성하고; IgA는 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체를 형성한다. 당업자는 Fc의 본래의 Ig 공급원의 서열과 이로써 생성된 활성을 활용하거나 이러한 본래의 Fc를 (다음에 정의된 바와 같이) 유도체화함으로써 다량체를 형성할 수 있다.
Fc 도메인에 적용되거나 Fc 도메인을 포함하는 분자에 적용되는 용어 "이량체"는 공유적 또는 비-공유적으로 연합된 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 분자를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 범위 내에 속하는 이량체의 예가 도 2에 도시된 바와 같다.
용어 "유도체화하는" 및 "유도체" 또는 "유도체화"란 공정 및 이로써 생성된 화합물 각각을 포함하는데, (1) 이러한 화합물은 사이클릭 부분을 갖는데, 예를 들어 해당 화합물 내의 시스테이닐 잔기 간에 가교결합을 갖고; (2) 상기 화합물은 가교결합되거나 가교 결합성 부위를 갖는데, 예를 들어 시스테이닐 잔기를 가지므로, 배양 하에 또는 생체 내에서 가교결합된 이량체를 형성하며; (3) 하나 이상의 펩티딜 연쇄가 비-펩티딜 연쇄에 의해 대체되고; (4) N-말단이 -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, 석신이미드기, 또는 치환되거나 치환되지 않은 벤질옥시카보닐-NH- [여기서, R 및 R1, 및 환 치환체는 다음에 정의되는 바와 같다]에 의해 대체되며; (5) C-말단이 -C(O)R2 또는 -NR3R4 [여기서, R2, R3 및 R4는 다음에 정의되는 바와 같다]에 의해 대체되고; (6) 개개의 아미노산 부분이, 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 작용제를 이용한 처리에 의해 변형된다. 유도체는 다음에 추가로 기재된다.
용어 "펩티드"는 2 내지 약 80개 아미노산 잔기 분자를 지칭하는데, 약 10 내지 약 60개 아미노산 잔기 분자가 바람직하고, 약 30 내지 약 50개 아미노산 잔기 분자가 가장 바람직하다. 예시되는 펩티드는 공지된 모든 방법에 의해 무작위로 생성시키거나, 펩티드 라이브러리 (예: 파아지 디스플레이 라이브러리)에서 가져오거나, 또는 단백질을 분해시킴으로써 유래될 수 있다. 본 발명의 화합물의 펩티드 일부, 예를 들어 본원에 기재된 독소 펩티드 또는 펩티드 링커에서는, 부가의 아미노산이 소정의 서열의 N-말단 또는 C-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 포함될 수 있다. 물론, 이들 부가의 아미노산 잔기는 해당 화합물의 기능적 활성을 상당히 방해하지 말아야 한다. "독소 펩티드"에는 특정 독으로부터 분리될 수 있는 천연 발생적 약리학적 활성 펩티드의 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 포함되고, 또한 이러한 천연 발생적 분자의 변형된 펩티드 유사체가 포함된다. 본 발명을 실시하는데 유용한 독소 펩티드가 표 1 내지 32에 기재되어 있다. 독소 펩티드 ("P", 또는 도 2에서 "P1"로서 등가적으로 나타냄)는, 예를 들어 도 9에 도시된 바와 같이 2개 이상의 펩티드내 디설파이드 결합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 분자에 관한 것이다:
a) C1-C3 및 C2-C4 디설파이드 결합 [여기서, C1, C2, C3, 및 C4는 시스테인 잔기가 좌측에 펩티드의 N-말단을 통상적으로 수반하는 것으로 언급되는 독소 펩티드의 일차 서열 내에 존재하는 순서를 나타내는데, 아미노산 서열 내의 제1 시스테인과 제3 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제2 시스테인과 제4 시스테인이 디설파이드 결합을 형성한다]. 이러한 C1-C3, C2-C4 디설파이드 결합 패턴을 나타내는 독소 펩티드의 예에는 아파민 펩티드, α-코노펩티드, PnlA 펩티드, PnlB 펩티드 및 MII 펩티드, 및 이들의 유사체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
b) C1-C6, C2-C4 및 C3-C5 디설파이드 결합 [여기서, 상기 정의된 바와 같이 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6은 좌측에 펩티드의 N-말단을 통상적으로 수반하는 것으로 언급된 독소 펩티드의 일차 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기 순서를 나타내는데, 아미노산 서열 내의 제1 시스테인과 제6 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제2 시스테인과 제4 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하며, 제3 시스테인과 제5 시스테인이 디설파이드 결합을 형성한다]. 이러한 C1-C3, C2-C4 및 C3-C5 디설파이드 결합 패턴을 나타내는 독소 펩티드의 예에는 ShK, BgK, HmK, AeKS, AsK, 및 DTX1, 및 이들의 유사체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
c) C1-C4, C2-C5 및 C3-C6 디설파이드 결합 [여기서, 상기 정의된 바와 같이 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6은 좌측에 펩티드의 N-말단을 통상적으로 수반하는 것으로 언급된 독소 펩티드의 일차 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기 순서를 나타내는데, 아미노산 서열 내의 제1 시스테인과 제4 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제2 시스테인과 제5 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하며, 제3 시스테인과 제6 시스테인이 디설파이드 결합을 형성한다]. 이러한 C1-C4, C2-C5 및 C3-C6 디설파이드 결합 패턴을 나타내는 독소 펩티드의 예에는 ChTx, MgTx, OSK1, KTX1, AgTx2, Pi2, Pi3, NTX, HgTx1, BeKM1, BmKTX, P01, BmKK6, Tc32, Tc1, BmTx1, BmTX3, IbTx, P05, ScyTx, TsK, HaTx1, ProTX1, PaTX2, Ptu1, ωGVIA, ωMVIIA, 및 SmIIIa, 및 이들의 유사체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
d) C1-C5, C2-C6, C3-C7, 및 C4-C8 디설파이드 결합 [여기서, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 및 C8은 좌측에 펩티드의 N-말단을 통상적으로 수반하는 것으로 언급된 독소 펩티드의 일차 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기 순서를 나타내는데, 아미노산 서열 내의 제1 시스테인과 제5 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제2 시스테인과 제6 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하며, 제3 시스테인과 제7 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제4 시스테인과 제8 시스테인이 디설파이드 결합을 형성한다]. 이러한 C1-C5, C2-C6, C3-C7, C4-C8 디설파이드 결합 패턴을 나타내는 독소 펩티드의 예에는 아누록톡신 (AnTx), Pi1, HsTx1, MTX (P12A, P20A), 및 Pi4 펩티드, 및 이들의 유사체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
e) C1-C4, C2-C6, C3-C7, 및 C5-C8 디설파이드 결합 [여기서, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 및 C8은 좌측에 펩티드의 N-말단을 통상적으로 수반하는 것으로 언급된 독소 펩티드의 일차 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기 순서를 나타내는데, 아미노산 서열 내의 제1 시스테인과 제4 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제2 시스테인과 제6 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하며, 제3 시스테인과 제7 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제5 시스테인과 제8 시스테인이 디설파이드 결합을 형성한다]. 이러한 C1-C4, C2-C6, C3-C7, C5-C8 디설파이드 결합 패턴을 나타내는 독소 펩티드의 예에는 클로로톡신 (Chlorotoxin), Bm-12b, 및 이들의 유사체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
f) C1-C5, C2-C6, C3-C4, 및 C7-C8 디설파이드 결합 [여기서, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 및 C8은 좌측에 펩티드의 N-말단을 통상적으로 수반하는 것으로 언급된 독소 펩티드의 일차 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기 순서를 나타내는데, 아미노산 서열 내의 제1 시스테인과 제5 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제2 시스테인과 제6 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하며, 제3 시스테인과 제4 시스테인이 디설파이드 결합을 형성하고, 제7 시스테인과 제8 시스테인이 디설파이드 결합을 형성한다]. 이러한 C1-C5, C2-C6, C3-C4, C7-C8 디설파이드 결합 패턴을 나타내는 독소 펩티드의 예에는 마우로톡신 펩티드 및 이의 유사체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
펩티드 서열을 지칭하기 위해 사용된 용어 "무작위화"는 완전한 무작위 서열 (예를 들어, 파아지 디스플레이 방법에 의해 선택됨), 및 천연 발생적 분자의 1개 이상의 잔기가 천연 발생적 분자 내의 해당 위치에서는 존재하는 않는 아미노산 잔기에 의해 대체되는 서열을 지칭한다. 펩티드 서열을 확인하기 위한 방법의 예에는 파아지 디스플레이, 이. 콜라이 (E. coli) 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 효모에 의거한 스크리닝, RNA-펩티드 스크리닝, 화학적 스크리닝, 합리적 설계, 단백질 구조적 분석 등이 포함된다.
용어 "약리학적 활성"은 언급되는 특정 물질이 의학적 파라미터 (예: 혈압, 혈액 세포 계수, 콜레스테롤 수준) 또는 질병 상태 (예: 암, 자가면역 질환)에 영향을 미치는 활성을 지닌 것으로 확인되었다는 것을 의미한다. 따라서, 약리학적 활성 펩티드는 다음에 정의되는 바와 같은, 작동성 또는 모방성 및 길항성 펩티드를 포함한다.
용어 "-모방체 펩티드" 및 "-작동제 펩티드"는 천연 발생적 독소 펩티드 분자, 예를 들어 천연 발생적 ShK 독소 펩티드와 거의 동등한 수준의 생물학적 활성을 지닌 펩티드를 지칭한다. 이들 용어에는, 예를 들어 천연 발생적 독소 펩티드 분자의 효과를 증강시킴으로써 이러한 천연 발생적 독소 펩티드 분자의 활성을 간접적으로 모방하는 펩티드가 추가로 포함된다.
용어 "-길항제 펩티드" 또는 "억제제 펩티드"는 관심있는 특정 수용체의 생물학적 활성을 차단시키거나 몇몇 방식으로는 이러한 활성을 방해하거나, 또는 관심있는 수용체 (예를 들어, 이온 채널 등)의 공지된 길항제 또는 억제제와 거의 동등한 수준의 생물학적 활성을 지니고 있는 펩티드를 지칭한다.
용어 "산성 잔기"는 산성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 산성 잔기에는 D 및 E가 포함된다.
용어 "아미드 잔기"는 산성 기의 아미드 유도체를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 잔기에는 N 및 Q가 포함된다.
용어 "방향족 잔기"는 방향족 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 방향족 잔기에는 F, Y, 및 W가 포함된다.
용어 "염기성 잔기"는 염기성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 염기성 잔기에는 H, K, R, N-메틸-아르기닌, ω-아미노아르기닌, ω-메틸-아르기닌, 1-메틸-히스티딘, 3-메틸-히스티딘, 및 호모아르기닌 (hR) 잔기가 포함된다.
용어 "친수성 잔기"는 극성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 친수성 잔기에는 C, S, T, N, Q, D, E, K, 및 시트룰린 (Cit) 잔기가 포함된다.
용어 "비-관능적 잔기"는 산성, 염기성 또는 방향족 기가 결여된 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 비-관능적 아미노산 잔기에는 M, G, A, V, I, L 및 노르루이신 (Nle)이 포함된다.
용어 "중성 극성 잔기"는 염기성, 산성 또는 극성 기가 결여된 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 중성 극성 아미노산 잔기에는 A, V, L, I, P, W, M, 및 F가 포함된다.
용어 "극성 소수성 잔기"는 극성 기를 포함하는 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 극성 소수성 아미노산 잔기에는 T, G, S, Y, C, Q, 및 N이 포함된다.
용어 "소수성 잔기"는 염기성 또는 산성 기가 결여된 측쇄를 갖는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예시되는 소수성 아미노산 잔기에는 A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q, 및 N이 포함된다.
본 발명의 화합물의 몇몇 유용한 양태에서는, 독소 펩티드의 아미노산 서열을 관심있는 본래의 독소 펩티드 서열, 예를 들어 본래의 ShK 또는 OSK1 서열, 그들의 펩티드 유사체, 또는 표 1 내지 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 기타 모든 독소 펩티드와 관련하여 한 가지 이상의 방식으로 변형시킨다. 한 가지 이상 유용한 변형에는 아미노산 부가 또는 삽입, 아미노산 결실, 펩티드 절단, 아미노산 치환, 및/또는 공지된 화학적 기술에 의해 수행된 아미노산 잔기의 화학적 유도체화가 포함될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 효력, 선택성 및/또는 단백질 분해적 안정성 등을 증강시키기 위한 목적일 수 있다. 당업자는 이러한 증강된 특성을 지닌 펩티드 유사체를 설계하는 기술을 잘 알고 있으며, 예를 들면 알라닌 스캐닝, 공지된 독소 펩티드 서열을 이용한 정렬 매개형 돌연변이 유발에 기초한 합리적 설계, 및/또는 분자 모델링이 있다. 예를 들어, ShK 유사체는 HmK을 이용한 정렬 매개형 돌연변이 유발 (예를 들어, 도 6 참고) 및 분자 모델링에 부분적으로 기초하여, 본 발명의 ShK 펩티드- 또는 ShK 유사체-함유 화합물에서 프로테아제 절단 부위 (예를 들어, K 또는 R 잔기에서의 트립신 절단 부위, 및/또는 F, Y 또는 W 잔기에서의 키모트립신 절단 부위)를 제거하도록 설계할 수 있다 [참고: 예를 들어, Kalman et al., ShK-Dap22, a potent Kv1.3-specific immunosuppressive polypeptide, J. Biol. Chem. 273(49):32697-707 (1998); Kem et al., US Patent No. 6,077,680; Mouhat et al., OsK1 derivatives, WO 2006/002850 A2].
용어 "프로테아제"는 "펩티다제"와 동의어이다. 프로테아제는 2가지 효소 군을 포함한다: 해당 단백질 내의 여러 지점에서 펩티드 결합을 절단시키는 엔도펩티다제, 및 N-말단 또는 C-말단 각각으로부터 1개 이상의 아미노산을 제거하는 엑소펩티다제. 용어 "프로테이나제"는 또한, 엔도펩티다제에 대한 동의어로서 사용된다. 4가지 기전적 부류의 프로테이나제는 세린 프로테이나제, 시스테인 프로테이나제, 아스파르트산 프로테이나제 및 메탈로-프로테이나제이다. 이들 4가지 기전적 부류 이외에도, 미확인 촉매적 기전의 프로테아제에 대해 할당된 효소 명칭의 일부가 있다. 이는 촉매적 기전이 확인되지 않았다는 것을 나타낸다.
절단 아부위 명칭은 다음 문헌에 기재된 도식으로부터 통상적으로 채택된다 [참고: Schechter I. & Berger A., On the size of the active site in proteases. I. Papain, Biochemical and Biophysical Research Communication, 27:157 (1967); Schechter I. & Berger A., On the active site of proteases. 3. Mapping the active site of papain; specific inhibitor peptides of papain, Biochemical and Biophysical Research Communication, 32:898 (1968)]. 이러한 모델에 따르면, 절단을 진행하고 있는 기질 내의 아미노산 잔기는 절단된 결합으로부터 N-말단 방향으로 P1, P2, P3, P4 등으로 명명된다. 마찬가지로, C-말단 방향의 잔기는 P1', P2', P3', P4' 등으로 명명된다.
당업자는 관심있는 프로테아제 결합 부위 또는 프로테아제 절단 부위를 확인하기 위한 각종 도구를 알고 있다. 예를 들어, 펩티드커터 (PeptideCutter) 소프트웨어 툴이 다음 공급처로부터 입수 가능하다 [ExPASy (Expert Protein Analysis System) proteomics server of the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB; www.expasy.org/tools/peptidecutter)]. 펩티드커터는 프로테아제 절단 부위를 알아보기 위해 SWISS-PROT 및/또는 TrEMBL 데이터베이스로부터의 단백질 서열 또는 사용자가 입력한 단백질 서열을 조사한다. 단일 프로테아제 및 화학물질, 특정 선택범위 또는 열거된 모든 프로테아제 및 화학물질을 사용할 수 있다. 이러한 결과의 상이한 형태의 출력물도 이용 가능하다: 절단 부위 표는 효소 명칭에 따라서 알파벳 순으로 분류하였거나 아미노산 수에 따라서 일련으로 분류하였다. 출력물에 대한 세 번째 옵션은 절단 부위의 지도이다. 지도 상에 나타낸 서열 및 절단 부위는 블록으로 분류하는데, 그의 크기는 사용자에 의해 선택될 수 있다. 프로테아제 절단 부위를 결정하기 위한 기타 도구 또한 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Turk, B. et al., Determination of protease cleavage site motifs using mixture-based oriented peptide libraries, Nature Biotechnology, 19:661-667 (2001); Barrett A. et al., Handbook of proteolytic enzymes, Academic Press (1998)].
세린 프로테이나제에는 키모트립신 계열이 포함되는데, 이에는 포유류 프로테아제 효소, 예를 들어 키모트립신, 트립신 또는 엘라스타제 또는 칼리크레인이 포함된다. 세린 프로테이나제는 기질 잔기와 상호 작용하는 각종 효소 아부위에서의 아미노산 치환과 관련되는 상이한 기질 특이성을 나타낸다. 몇몇 효소는 기질과의 연장된 상호 작용 부위를 갖고 있는 반면, 기타 효소는 P1 기질 잔기에 제한된 특이성을 지니고 있다.
트립신은 위치 P1 중의 R 또는 K를 우선적으로 절단시킨다. 다음 문헌에 기재된 바와 같이 수행된 통계적 연구는 트립신 절단 동안에 Arg- 및 Lys- 결합 (즉, 각각 위치 P2 및 P1')을 둘러싸고 있는 잔기가 불리한 영향을 미친다고 보고하였다 [참고: Keil, B., Specificity of proteolysis, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-NewYork, 335 (1992)]. 위치 P1'에서의 프롤린 잔기는 정상적으로, 트립신 절단에 대해 강력하게 불리한 영향력을 발휘한다. 유사하게, P1'에 R 및 K가 위치 설정하면 억제가 발생할 뿐만 아니라 위치 P2 및 P1' 내에 음전하를 띤 잔기가 발생한다.
키모트립신은 위치 P1 내의 W, Y 또는 F를 우선적으로 절단시키고 (고 특이성), 이보다 덜한 정도로 위치 P1 내의 L, M 또는 H 잔기를 절단시킨다 [참고: Keil, 1992]. 이들 규칙에 대한 예외는 다음과 같다: W가 위치 P1에서 발견되는 경우, 이와 동시에 M 또는 P가 위치 P1'에 존재하는 경우에 절단이 차단된다. 더우기, 위치 P1'에서의 프롤린 잔기는 위치 P1에서 발견된 아미노산과는 독립적인 절단을 거의 완전히 차단시킨다. M 잔기가 위치 P1에서 발견되는 경우에는, 위치 P1'에 Y 잔기가 존재함으로 인해 절단이 차단된다. 최종적으로, H가 위치 P1에 존재하는 경우, D, M 또는 W 잔기의 존재가 또한 절단을 차단시킨다.
막 메탈로-엔도펩티다제 [NEP; 중성 엔도펩티다제, 신장-쇄자연 (kidney-brush-border) 중성 프로테이나제, 엔케팔리나제, EC 3.4.24.11]는 소수성 아미노산 잔기의 아미노 측쇄에서의 펩티드를 절단시킨다 [참고: Connelly, JC et al., Neutral Endopeptidase 24.11 in Human Neutrophils: Cleavage of Chemotactic Peptide, PNAS, 82(24):8737-8741 (1985)].
트롬빈은 위치 P1 내의 R 잔기를 우선적으로 절단시킨다 [참고: Keil, 1992]. 트롬빈의 천연 기질은 피브리노겐이다. 최적의 절단 부위는 R 잔기가 위치 P1에 존재하고 Gly가 위치 P2 및 위치 P1'에 존재하는 경우이다. 마찬가지로, 소수성 아미노산 잔기가 위치 P4 및 위치 P3에서 발견되고, 프롤린 잔기가 위치 P2에서 발견되며, R 잔기가 위치 P1에서 발견되고, 비-산성 아미노산 잔기가 위치 P1' 및 위치 P2'에서 발견되는 경우이다. 그의 천연 기질 피브리노겐에 대한 극히 중요한 잔기는 P10에서의 D 잔기이다.
카스파제는 보존된 아미노산 서열을 수반하고 있는 활성 부위를 보유하고 있고 구체적으로는 D 잔기 다음의 펩티드를 절단시키는 시스테인 프로테아제 계열이다 [참고: Earnshaw WC et al., Mammalian caspases: Structure, activation, substrates, and functions during apoptosis, Annual Review of Biochemistry, 68:383-424 (1999)].
Arg-C 프로테이나제는 위치 P1 내의 R 잔기를 우선적으로 절단시킨다. 이러한 절단 행위는 위치 P1' 내의 잔기에 의해서만 적당한 수준으로 영향을 받는 것으로 여겨진다 [참고: Keil, 1992]. Asp-N 엔도펩티다제는 위치 P1' 내의 D 잔기를 수반한 결합을 특이적으로 절단시킨다 [참고: Keil, 1992].
전술된 내용은 단지 예시적이며, 당업자가 본 발명을 실시하는데 있어서 제거하는데 관심을 가질 수 있는 프로테아제 결합 및/또는 절단 부위에 관해 당업자에게 이용 가능한 처리 기술을 철저하게 규명한 것은 결코 아니다.
기타 예에서, 천연 발생적 독소 펩티드 아미노산 서열로부터 변형된 독소 펩티드 아미노산 서열에는 관심있는 본래의 독소 펩티드 서열의 아미노산 서열과 비교해서 1개 이상의 아미노산 잔기가 삽입되거나 치환되는데, 이러한 삽입되거나 치환된 아미노산 잔기는 친핵성 또는 친전자성 반응성 관능기를 포함하는 측쇄를 가짐으로써 해당 펩티드가 링커 또는 반감기 연장성 부분과 접합되도록 한다. 본 발명에 따르면, 이러한 친핵성 또는 친전자성 반응성 관능기의 유용한 예에는 티올, 1급 아민, 셀레노, 히드라지드, 알데히드, 카복실산, 케톤, 아미노옥시, 은폐된 (보호된) 알데히드, 또는 은폐된 (보호된) 케토 관능기가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 친핵성 반응성 관능기를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 예에는 리산 잔기, α,β-디아미노프로피온산 잔기, α,γ-디아미노부티르산 잔기, 오르니틴 잔기, 시스테인, 호모시스테인, 글루탐산 잔기, 아스파르트산 잔기, 또는 셀레노시스테인 잔기가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
본원의 독소 펩티드를 추가로 기재하는데 있어서, 천연 발생적 펩티드 및 단백질 내로 일반적으로 혼입된 20개의 "정규" 아미노산 잔기의 실체를 명명하기 위해, 종종 1-문자 약어 시스테임 적용된다 (표 1A). 이러한 1-문자 약어는 3-문자 약어 또는 비-약칭 아미노산 명칭 의미와 전적으로 상호 교환 가능하다. 본원에 사용된 1-문자 약어 시스템 내에서, 달리 표기하지 않는 한 대문자는 L-아미노산을 표시하고, 소문자는 D-아미노산을 표시한다. 예를 들어, 약어 "R"은 L-아르기닌을 지칭하고, 약어 "r"은 D-아르기닌을 지칭한다.
특정 아미노산 서열 내에서의 아미노산 치환은 본원에서 전형적으로, 특정 위치에서의 아미노산 잔기에 대한 1-문자 약어를 이용하여 지칭한 다음, 관심있는 본래의 독소 펩티드 서열을 기준으로 한 아미노산 위치를 수치로 표기하고, 그 다음에 그 내부에 치환된 아미노산 잔기에 대한 1-문자 부호를 표기한다. 예를 들어, "T30D"는 트레오닌 잔기가 가상적 본래의 독소 펩티드 서열을 기준으로 하여 아미노산 위치 30에서 아스파르테이트 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 추가의 예를 들면, "R18hR" 또는 "R18Cit"는 아르기닌 잔기가 가상적 본래의 독소 펩티드 서열을 기준으로 하여 아미노산 위치 18에서 각각 호모아르기닌 또는 시트룰린 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 본원에 기재된 특정한 독소 펩티드 (또는 펩티드 유사체)의 아미노산 서열 내의 아미노산 위치는 본래의 서열과 비교해서 그의 위치와 상이할 수 있는데, 즉 해당 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단을, 적당한 바와 같은 본래의 독소 펩티드 서열의 N-말단 또는 C-말단과 정렬함으로써 결정되는 바와 같다. 예를 들어, 본래의 ShK(1-35) (서열 5)의 C-말단과 정렬되는 바와 같은, 본래의 ShK 서열의 N-말단 절단물인 서열 SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC [ShK(2-35); 서열 92]의 아미노산 위치 1은 본래의 서열과 비교해서 아미노산 위치 2에 상응하고, 서열 92의 아미노산 위치 34는 본래의 서열 (서열 5)과 비교해서 아미노산 위치 35에 상응한다.
본 발명의 특정 양태에서, 아미노산 치환물에는 비-정규 아미노산 잔기가 포괄되는데, 이에는 천연상 (펩티드 또는 단백질로는) 드문 아미노산 잔기 또는 천연이 아닌 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 비-정규 아미노산 잔기는 재조합적으로 발현하는 세포와 같은 생물학적 시스템에서 합성하는 것보다는 오히려 화학적 펩티드 합성에 의해 펩티드 내로 혼입시킬 수 있거나, 또는 당업자는 재조합적으로 발현하는 세포를 이용하는 공지된 단백질 공학 기술을 이용할 수 있다 [참고: 예를 들어, Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)]. 용어 "비-정규 아미노산 잔기"는 일반적으로 천연 발생적 단백질 내로 혼입된 20개의 정규 아미노산이 아닌, D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기, 예를 들어 β-아미노산, 호모아미노산, 사이클릭 아미노산, 및 유도체화 측쇄를 수반한 아미노산을 지칭한다. 그의 예에는 (L-형태 또는 D-형태의) 시트룰린 (Cit), 호모시트룰린 (hCit), N-메틸시트룰린 (NMeCit), N-메틸호모시트룰린 (NMeHoCit), 오르니틴 (Orn 또는 O), N-메틸오르니틴 (NMeOrn), 사르코신 (Sar), 호모리신 (hK 또는 Hlys), 호모아르기닌 (hR 또는 hArg), 호모글루타민 (hQ), N-메틸아르기닌 (NMeR), N-메틸루이신 (NMeL), N-메틸호모리신 (NMeHoK), N-메틸글루타민 (NMeQ), 노르루이신 (Nle), 노르발린 (Nva), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린 (Tic), 니트로페닐알라닌 (nitrophe), 아미노페닐알라닌 (aminophe), 벤질페닐알라닌 (benzylphe), γ-카복시글루탐산(γ-carboxyglu), 히드록시프롤린 (hydroxypro), p-카복실-페닐알라닌 (Cpa), α-아미노아디프산 (Aad), 아세틸아르기닌 (acetylarg), α,β-디아미노프로피온산 (Dpr), α,γ-디아미노부티르산 (Dab), 디아미노프로피온산 (Dap), β-(1-나프틸)-알라닌 (1Nal), β-(2-나프틸)-알라닌 (2Nal), 시클로헥실알라닌 (Cha), 4-메틸-페닐알라닌 (MePhe), β,β-디페닐-알라닌 (BiPhA), 아미노부티르산 (Abu), 4-페닐-페닐알라닌 (4Bip), α-아미노-이소부티르산 (Aib), 및 본원에 기재된 바와 같은 이들 모두의 유도체화 형태가 포함된다. 생화학적 명칭에 대한 UPAC-IUB 연합 위원회 (JCBN)에 의한 아미노산 및 펩티드에 관한 명칭 및 부호는 다음 문헌에 공개되었다 [참고: Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internal J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p 84; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, pages 39-69].
본원에 언급된 바와 같이 본 발명에 따라서, 본 발명의 화합물의 펩티드 일부, 예를 들어 독소 펩티드 또는 펩티드 링커는 1개 이상의 아미노산 잔기에서 화학적으로 유도체화시킬 수도 있다. 유도체화 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드는 공지된 유기 화학 기술에 의해 합성할 수 있다. 펩티드 맥락에서 "화학적 유도체" 및 "화학적으로 유도체화된"이란 측쇄 관능기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 대상 펩티드를 지칭한다. 이러한 유도체화 분자에는, 예를 들어 자유 아미노 기를 유도체화하여 아민 히드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 기, 카보벤족시 기, t-부틸옥시카보닐 기, 클로로아세틸 기 또는 포밀 기를 형성시킨 분자가 포함된다. 자유 카복실 기를 유도체화하여 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 기타 유형의 에스테르 또는 히드라지드를 형성시킬 수 있다. 자유 히드록실 기를 유도체화하여 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성시킬 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소를 유도체화하여 N-임-벤질히스티딘을 형성시킬 수 있다. 또한, 화학적 유도체로서 포함되는 것은 L-형태든 D-형태든지 간에 20개 정규 아미노산의 하나 이상의 천연 발생적 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드이다. 예를 들어, 프롤린을 4-히드록시프롤린으로 대체할 수 있고; 리신을 5-히드록시리신으로 대체할 수 있으며; 히스티딘을 3-메틸히스티딘으로 대체할 수 있고; 세린을 호모세린으로 대체할 수 있으며; 리신을 오르니틴으로 대체할 수 있다.
본 발명의 몇몇 양태에서는, 관심있는 독소 펩티드의 염기성 잔기 (예: 리신)를 기타 잔기 (비-관능적 잔기가 바람직하다)로 대체시킬 수 있다. 이러한 분자는 이들이 유래된 분자보다는 덜 염기성일 것이지만, 이들이 유래된 분자의 활성을 보유하고 있으므로, 안정성 및 면역원성에 있어 유리할 수 있지만, 본 발명이 이러한 이론으로만 제한되지 않아야 한다.
부가적으로, 본 발명의 화합물이 본원에서 "분자" 또는 "화합물"로서 지칭되는 경우를 포함하여, 본 발명의 화합물의 생리학상 허용 가능한 염 또한 본 발명에 포함된다. "생리학상 허용 가능한 염"이란 제약상 허용 가능한 것으로 공지되어 있거나 나중에 밝혀질 모든 염을 의미한다. 몇몇 예는 아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 히드로할라이드, 예를 들어 히드로클로라이드 및 히드로브로마이드; 설페이트; 시트레이트; 말레에이트; 타르트레이트; 글리콜레이트; 글루코네이트; 석시네이트; 메실레이트; 베실레이트; 및 옥살레이트 염이다.
화합물의 구조:
일반적. 재조합 단백질은 특히 반감기 연장성 부분에 대한 공유적 부착을 통하여 치료제로서 개발되어 왔다. 이러한 부분에는 엔브렐 (Enbrel®) (에타네르셉트: etanercept)에 사용되는 바와 같은, 항체의 "Fc" 도메인 뿐만 아니라 노일라스타 (Neulasta®) (페그필그라스팀: pegfilgrastim)에 사용되는 바와 같은, 생물학적으로 적합한 중합체 (예: 폴리에틸렌 글리콜 또는 "PEG")가 포함된다. 페이지 (Feige) 등은 2003년 12월 9일자로 허여된 미국 특허 제6,660,843호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에서 펩티드를 수반한 반감기 연장제의 사용을 보고하였다.
본 발명자들은 본 발명의 분자 - 2개 이상의 펩티드내 디설파이드 결합을 수반한 약 80개 이하 아미노산의 펩티드 -가 반감기 연장성 부분에 공유적으로 부착된 경우에 치료적 이점을 갖는 것을 확인하였다. 본 발명의 분자는 반감기 연장성 부분 (F1 및/또는 F2) 또는 펩티드 일부 (P)와 결합될 수 있는, 공유적으로 결합된 부가의 약리학적 활성 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 반감기 연장성 부분 (F1 및 F2)을 함유하는 본 발명의 화합물의 양태에는 F1 및 F2가 동일하거나 상이한 반감기 연장성 부분인 화합물이 포함된다. (각 도메인 간에 링커를 수반하거나 수반하지 않는) 그의 예에는 도 75에 예시된 바와 같은 구조 뿐만 아니라 다음 양태 (및 본원 및 작동 실시예에 기재된 기타 양태)가 포함된다:
20KPEG - 독소 펩티드 - Fc 도메인; 식 [(F1)1-(X2)1-(F2)1]과 일관됨;
20KPEG - 독소 펩티드 - Fc CH2 도메인; 식 [(F1)1-(X2)1-(F2)1]과 일관됨;
20KPEG - 독소 펩티드 - HSA, 식 [(F1)1-(X2)1-(F2)1]과 일관됨;
20KPEG - Fc 도메인 - 독소 펩티드; 식 [(F1)1-(F2)1-(X3)1]과 일관됨;
20KPEG - Fc CH2 도메인 - 독소 펩티드; 식 [(F1)1-(F2)1-(X3)1]과 일관됨; 및
20KPEG - HSA - 독소 펩티드; 식 [(F1)1-(F2)1-(X3)1]과 일관됨.
독소 펩티드. 어떠한 수의 독소 펩티드 (즉, "P", 또는 도 2에서 "P1"로서 등가적으로 제시됨)도 본 발명과 연계해서 사용할 수 있다. 특히 관심있는 것은 독소 펩티드 ShK, HmK, MgTx, AgTx2, OsK1 (이는 "OSK1"로서 지칭되기도 한다), 아가톡신 (Agatoxin), 및 HsTx1 뿐만 아니라 이들의 변형된 유사체, 및 상기 독소 펩티드의 활성을 모방하는 기타 펩티드이다. 상기 본원에서 언급된 바와 같이, 하나 이상의 독소 펩티드 "P"가 본 발명의 화합물에 존재하는 경우, "P"는 독립적으로, 본 발명의 화합물에 또한 존재하는 기타 모든 독소 펩티드(들)와 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 식 P-(L)g-F1-(L)f-P를 갖는 화합물에서 양 독소 펩티드 "P"는 ShK의 동일한 펩티드 유사체, ShK의 상이한 펩티드 유사체일 수 있거나, 또는 하나는 ShK의 펩티드 유사체이고 다른 하나는 OSK1의 펩티드 유사체일 수 있다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 관심있는 기타 펩티드는 화학식 I의 분자에 비해 부가의 특징을 지닌 분자에 특히 유용하다. 이러한 분자에서, 화학식 I의 분자는 작동성 펩티드, 길항성 펩티드 또는 표적화 펩티드인, 공유적으로 결합된 부가의 약리학적 활성 펩티드를 추가로 포함하는데, 이러한 펩티드는 F1 또는 F2 또는 P와 접합될 수 있다. 이러한 작동성 펩티드는 당해 독소 펩티드에 대해 작동성인 활성을 지니고 있지만, 독소 펩티드와 동일한 기전에 의해 상기 활성을 발휘하도록 요구되지는 않는다. 펩티드 길항제 또한, 본 발명의 양태에 유용한데, 독소 펩티드의 활성에 대해 상보적일 수 있는 활성을 지닌 것이 바람직하다. 표적화 펩티드, 예를 들어 해당 분자가 특정한 세포 유형, 기관 등을 향하도록 하는 펩티드가 또한 관심이 있다. 이들 부류의 펩티드는 본 명세서에 인용된 참고 문헌 및 기타 참고 문헌에 기재된 방법에 의해 밝혀질 수 있다. 특히, 파아지 디스플레이가 본 발명에 사용하기 위한 독소 펩티드를 생성시키는데 유용하다. 무작위 펩티드 라이브러리로부터의 친화성 선별을 이용하여 모든 유전자 생성물의 모든 부위에 대한 펩티드 리간드를 확인할 수 있다 [참고: Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30]. 세포 표면 수용체로서 관심있는 상기 단백질 또는 선형 에피토프를 갖는 모든 단백질과 결합하는 펩티드를 확인하는데 특히 적합한 것이 파아지 디스플레이이다 [참고: Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8]. 이러한 단백질은 그의 전문이 본원에 참고로 도입된 다음 문헌에 광범위하게 고찰되었다 [참고: Herz et al. (1997), J. Receptor and Signal Transduction Res. 17(5): 671-776]. 관심있는 상기 단백질이 본 발명에 사용하기 바람직하다.
특히 바람직한 펩티드가 다음 표에 제시된다. 이들 펩티드는 당해 분야에 기재된 방법에 의해 또는 후술되는 바와 같이 제조할 수 있다. 단일 문자 아미노산 약어를 사용한다. 달리 명시되지 않는 한, 각 X는 독립적으로 비-관능적 잔기이다.
표 2에 기재된 바와 같은 많은 펩티드는 2000년 6월 20일자로 켐 (Kem) 등에게 허여된 미국 특허 제6,077,680호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 표 2의 기타 펩티드는 당해 분야에 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, ShK(L5) (서열 950)은 문헌 [참고: Beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3 channels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol.67(4): 1369-81 (2005); 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 표 2 및 본 명세서 전반에 걸쳐, Xs15, Xs21, Xs22, Xs23 및 Xs27은 각각 독립적으로, 비-관능적 아미노산 잔기를 지칭한다.
표 3 및 본 명세서 전반에 걸쳐, Xh6, Xh22, Xh26은 각각 독립적으로, 비-관능적 잔기이다.
표 4에 기재된 바와 같은 많은 펩티드는 1995년 2월 2일자로 공개된 WO 95/03065 (출원인: Merck & Co., Inc.)에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 이 출원은 1993년 7월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제07/096,942호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 상응한다.
표 5에 기재된 바와 같은 펩티드는 2004년 2월 10일자로 레브런 (Lebrun) 등에게 허여된 미국 특허 제6,689,749호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
표 7에 제시된 서열 모두는 4 내지 10개의 탄소 원자와 0 내지 2개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방산, 또는 그의 유도체, 예를 들어 ω-아미노 지방산을 이용하여 그의 N-말단 또는 C-말단에서 유도체화할 수도 있다 [참고: 예를 들어, Mouhat ef al., WO 2006/002850 A2; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 이러한 지방산의 예에는 발레르산 또는 (C-말단에 대한) ω-아미노 발레르산이 포함된다.
표 13 및 본 명세서 전반에 걸쳐, Xm19 및 Xm34는 각각 독립적으로, 비-관능적 잔기이다.
본 발명에 따르면, 해당 분자의 독소 펩티드 (P) 일부 중의 적어도 하나가 Kv1.3 길항제 펩티드를 포함하는 분자가 제공된다. ShK, HmK, MgTx, AgTx1, AgTx2, 헤테로미트루스 스핀니페르 (HsTx1), 0SK1, 아누록톡신 (AnTx), 녹시우스톡신 (NTX), KTX1, 혼고톡신 (Hongotoxin), ChTx, 티티스톡신 (Titystoxin), BgK, BmKTX, BmTx, AeK, AsKS Tc30, Tc32, Pi1, Pi2, 및/또는 Pi3 독소 펩티드 및 이들 모두의 펩티드 유사체 중에서 선택된 아미노산 서열이 바람직하다. 유용한 Kv1.3 길항제 펩티드 서열의 예에는 상기 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 표 10 및/또는 표 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 IKCa1 길항제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함된다. 유용한 IKCa1 길항제 펩티드에는 마우로톡신 (MTx), ChTx 펩티드 및 이들 중 어느 하나의 펩티드 유사체가 포함되고, 그의 예에는 표 12, 표 13 및/또는 표 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 SKCa 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함된다. 유용한 SKCa 억제제 펩티드에는 아파민, ScyTx, BmP05, P01, P05, 타마핀, TsK, 및 이들 모두의 펩티드 유사체가 포함되고, 그의 예에는 표 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 아파민 펩티드, 및 아파민의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 실로톡신 계열 펩티드, 및 이들 모두의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 BKCa 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 슬로톡신 계열 펩티드, 및 이들 모두의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 마르텐톡신 펩티드, 및 그의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 N-유형 Ca2+ 채널 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 ωMVIIA 펩티드, 및 그의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 ωGVIA 펩티드, 및 그의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 Ptul 펩티드, 및 그의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 ProTx1 펩티드, 및 그의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 BeKM1 펩티드, 및 그의 펩티드 유사체인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 Na+ 채널 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 27에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 Cl- 채널 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 Kv2.1 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 Kv4.2/Kv4.3 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 30에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 nACHR 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 31에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
본 발명의 화합물의 기타 양태에는 아가톡신 펩티드, 그의 펩티드 유사체 또는 기타 칼슘 채널 억제제 펩티드인 하나 이상의 독소 펩티드 (P)가 포함되고, 그의 예에는 표 32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다.
반감기 연장성 부분.
본 발명은 사이에 낀 아미노산 잔기 중의 하나의 측쇄, N-말단 또는 C-말단을 통하여 펩티드와 부착된 하나 이상의 반감기 연장성 부분 (화학식 I 중의 F1 및/또는 F2)의 존재를 포함한다. 다수의 반감기 연장성 부분, 예를 들어 각 말단에서의 Fc 또는 특정 말단에서의 Fc 및 다른 말단 또는 측쇄에서의 PEG 기를 사용할 수 있다. 기타 양태에서는 Fc 도메인을 PEG화할 수 있다 (예를 들어, 식 F1-F2-(L)f-P; P-(L)g-F1-F2; 또는 P-(L)g-F1-F2-(L)f-P에 따름).
반감기 연장성 부분은 본 발명의 화합물이 생체내 신장 여과에 의한 청소를 방지시키기에 충분한 유체역학적 크기를 달성하도록 선택할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 직쇄, 측쇄 또는 수지상 형태의 중합체성 거대분자인 반감기 연장성 부분을 선택할 수 있다. 또 다른 한편, 반감기 연장성 부분은 본 발명의 화합물이 생체 내에서 혈청 단백질과 결합하여 복합체를 형성하도록 하고, 이로써 형성된 복합체가 실재적 신장 청소를 피하도록 선택될 수 있다. 반감기 연장성 부분은 예를 들어, 지질; 콜레스테롤 기 (예: 스테로이드); 탄수화물 또는 올리고당류; 또는 재이용 수용체와 결합하는 모든 천연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다.
본 발명에 따라서 사용될 수 있는 예시적 반감기 연장성 부분에는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 일부, 또는 생물학적으로 적합한 중합체 또는 공중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜이 포함된다. 기타 적당한 폴리알킬렌 글리콜 화합물에는 다음 유형의 전하를 띤 중합체 또는 중성 중합체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 덱스트란, 폴리리신, 콜로민산 (colominic acid) 또는 기타 탄수화물계 중합체, 아미노산의 중합체 및 바이오틴 유도체.
본 발명에 따르는 반감기 연장성 부분의 기타 예에는 에틸렌 글리콜의 공중합체, 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (예: 폴리리신), 덱스트란 n-비닐 피롤리돈, 폴리 n-비닐 피롤리돈, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 프로필렌 옥사이드 중합체, 에틸렌 옥사이드 중합체, 폴리옥시에틸화 글리콜, 폴리비닐 알코올, 선형 또는 분지된 당화 쇄, 폴리아세탈, 장쇄 지방산, 장쇄 소수성 지방족 기, 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 일부 [참고: 예를 들어, Feige et al., Modified peptides as therapeutic agents, US Patent No.6,660,843), Fc의 CH2 도메인, 알부민 [예: 인간 혈청 알부민 (HSA)] [참고: 예를 들어, Rosen et al., Albumin fusion proteins, US Patent No. 6,926,898 and US 2005/0054051; Bridon et al., Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components, US 6,887,470], 트랜스티레틴 (transthyretin) [TTR; 참고: 예를 들어, Walker et al., Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins, US 2003/0195154 A1; 2003/0191056 A1], 또는 티록신-결합성 글로불린 (TBG)가 포함된다. 따라서, 본 발명의 화합물의 예시적 양태에는 또한, HSA 융합 구조물이 포함되는데, 이에는 HSA와 ShK, OSK1, 또는 이들 독소 펩티드의 변형된 유사체와의 융합물이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이의 예에는 HSA-L10-ShK(2-35); HSA-L10-OsK1(1-38); HSA-L10-ShK(2-35); 및 HSA-L10-OsK1(1-38)이 포함된다.
본 발명에 따르는 반감기 연장성 부분의 기타 양태에는 온도, pH, 및 이온 강도의 생리적 조건 하에 반감기가 긴 혈청 단백질에 대한 결합 친화성을 지니는 펩티드 리간드 또는 소분자 (유기 분자) 리간드가 포함된다. 이의 예에는 알부민-결합성 펩티드 또는 소분자 리간드, 트랜스티레틴-결합성 펩티드 또는 소분자 리간드, 티록신-결합성 글로불린-결합성 펩티드 또는 소분자 리간드, 항체-결합성 펩티드 또는 소분자 리간드, 또는 반감기가 긴 혈청 단백질에 대한 친화성을 지닌 또 다른 펩티드 또는 소분자가 포함된다 [참고: 예를 들어, Blaney et al., Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands, US Patent. No. 5,714,142; Sato et al., Serum albumin binding moieties, US 2003/0069395 A1; Jones et al., Pharmaceutical active conjugates, US Patent No. 6,342,225]. "반감기가 긴 혈청 단백질"은 포유류 혈액 혈장에 용해된 수 백개의 상이한 단백질 중의 하나이고, 이에는 소위 "운반체 단백질" (예: 알부민, 트랜스페린 및 합토글로빈), 피브리노겐 및 기타 혈액 응고 인자, 보체 성분, 면역글로불린, 효소 억제제, 안지오텐신 (angiotensin) 및 브래디키닌 (bradykinin) 등의 물질의 전구체, 및 기타 많은 유형의 단백질이 포함된다. 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 제약상 허용 가능한 반감기 연장성 부분의 모든 단일 종의 사용, 또는 2가지 이상의 상이한 반감기 연장성 부분의 조합물, 예를 들어 PEG와 면역글로불린 Fc 도메인 또는 Fc의 CH2 도메인, 알부민 (예; HSA), 알부민-결합성 단백질, 트랜스티레틴 또는 TBG의 조합물의 사용을 포괄한다.
본 발명의 몇몇 양태에서는, Fc 도메인 또는 그의 일부, 예를 들어 Fc의 CH2 도메인이 반감기 연장성 부분으로서 사용된다. Fc 도메인을 해당 독소 펩티드의 N-말단과 융합시키거나 [예를 들어, 식 F1-(L)f-P에 따름], C-말단과 융합시키거나 [예를 들어, 식 P-(L)g-F1에 따름], 또는 N 말단과 C 말단 모두에서 융합시킬 수 있다 [예를 들어, F1-(L)f-P-(L)g-F2 또는 P-(L)g-F1-(L)f-P에 따름]. 펩티드 링커 서열을 본원에 기재된 바와 같이, Fc 도메인과 독소 펩티드 사이에 임의로 포함시킬 수 있다. 식 F1-(L)f-P의 예에는 Fc-L10-ShK(K22A)[2-35]; Fc-L10-ShK(R1K/K22A)[1-35]; Fc-LIO-ShK(R1H/K22A)[1-35]; Fc-L10-ShK(R1Q/K22A)[1-35]; Fc-L10-ShK(R1Y/K22A)[1-35]; Fc-L1O-PP-ShK(K22A)[1-35]; 및 본원에 기재된 기타 모든 작동 실시예가 포함된다. 식 P-(L)g-F1의 예에는 ShK(1-35)-L10-Fc; OsK1(1-38)-L10-Fc; Met-ShK(1-35)-L10-Fc; ShK(2-35)-L10-Fc; Gly-ShK(1-35)-L10-Fc; Osk1(1-38)-L10-Fc; 및 본원에 기재된 기타 모든 작동 실시예가 포함된다.
Fc 변이체는 본 발명의 범위 내에서 적합한 반감기 연장성 부분이다. 본래의 Fc를 광범위하게 변형시켜 본 발명에 따르는 Fc 변이체를 형성시킬 수 있는데, 단 재이용 수용체에 대한 결합성은 유지시켜야 한다 [참고: 예를 들어, WO 97/34631, WO 96/32478, and WO 04/110472]. 이러한 Fc 변이체에서는, 본 발명의 융합 분자에 의해서는 요구되지 않는 구조적 특징이나 기능적 활성을 제공하는 본래의 Fc의 하나 이상의 부위를 제거할 수 있다. 이들 부위는, 예를 들어 잔기를 치환 또는 결실시키거나, 잔기를 해당 부위 내로 삽입하거나, 또는 이러한 부위를 함유하는 일부를 절단시킴으로써 제거할 수 있다. 삽입되거나 치환된 잔기는 변형된 아미노산, 예를 들어 펩티드 모방제 또는 D-아미노산일 수도 있다. Fc 변이체는 수 많은 이유로 인해 요망될 수 있는데, 이러한 이유들 중의 몇 가지가 다음에 기재되어 있다. 예시되는 Fc 변이체에는 다음과 같은 분자 및 서열이 포함된다:
1. 디설파이드 결합 형성에 관여한 부위를 제거한다. 이러한 제거로 인해, 본 발명의 분자를 생성하기 위해 사용된 숙주 세포에 존재하는 기타 시스테인-함유 단백질과의 반응을 피할 수 있다. 이를 위해, N-말단에 있는 시스테인-함유 절편을 절단시킬 수 있거나, 또는 시스테인 잔기를 결실시키거나 기타 아미노산 (예: 알라닐, 세릴)으로 치환시킬 수 있다. 특히, 서열 2의 N-말단 20개 아미노산 절편을 절단시킬 수 있거나, 또는 서열 2의 위치 7 및 10에서의 시스테인 잔기를 결실 또는 치환시킬 수 있다. 시스테인 잔기를 제거한 경우라도, 단일 쇄 Fc 도메인은 비공유적으로 묶어 놓은 이량체 Fc 도메인을 여전히 형성할 수 있다.
2. 본래의 Fc가 선택된 숙주 세포와 보다 화합성이 되도록 본래의 Fc를 변형시킨다. 예를 들어, 이. 콜라이 중의 소화 효소, 예를 들면 프롤린 이미노펩티다제에 의해 인식될 수 있는, 전형적인 본래의 Fc의 N-말단 근처에 있는 PA 서열을 제거할 수 있다. 또한, 특히 해당 분자가 이. 콜라이와 같은 세균성 세포에서 재조합적으로 발현되는 경우에, N-말단 메티오닌 잔기를 부가할 수 있다. 서열 2 (도 4)의 Fc 도메인은 이러한 Fc 변이체 중의 하나이다.
3. 본래의 Fc의 N-말단 일부를 제거하여, 선택된 숙주 세포에서 발현된 경우에 N-말단 이질성을 방지시킨다. 이를 위해, N-말단에서의 처음 20개 아미노산 잔기, 특히 위치 1, 2, 3, 4 및 5에서의 아미노산 잔기를 결실시킬 수 있다.
4. 하나 이상의 당화 부위를 제거한다. 전형적으로 당화되는 잔기 (예: 아스파라긴)는 세포용해 반응을 부여할 수 있다. 이러한 잔기를 결실시키거나 비당화 잔기 (예: 알라닌)로 치환시킬 수 있다.
5. 보체와의 상호 작용에 관여한 부위, 예를 들어 C1q 결합 부위를 제거한다. 예를 들어, 인간 IgGl의 EKK 서열을 결실시키거나 치환시킬 수 있다. 본 발명의 분자의 경우에는 보체 이동이 유리하지 않을 수 있으므로, 이러한 Fc 변이체를 사용하는 경우에는 피할 수 있다.
6. 재이용 수용체 이외의 Fc 수용체에 대한 결합성에 영향을 미치는 부위를 제거한다. 본래의 Fc는 본 발명의 융합 분자에 요구되지 않으므로 제거될 수 있는, 특정의 백혈구 세포와의 상호 작용을 위한 부위를 가질 수 있다.
7. ADCC 부위를 제거한다. ADCC 부위는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG1에서의 ADCC 부위에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)]. 이들 부위 역시 본 발명의 융합 분자에 요구되지 않으므로, 제거될 수 있다.
8. 본래의 Fc가 비-인간 항체로부터 유래되는 경우에는, 본래의 Fc를 인간화시킬 수 있다. 전형적으로 본래의 Fc를 인간화시키기 위해, 비-인간 본래의 Fc 중에서 선택된 잔기를 인간 본래의 Fc에서 정상적으로 발견되는 잔기로 치환시킬 것이다. 항체 인간화 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
바람직한 Fc 변이체에는 다음이 포함된다. 서열 2에서, 위치 15에서의 루이신을 글루타메이트로 치환시킬 수 있고; 위치 99에서의 글루타메이트를 알라닌으로 치환시킬 수 있으며; 위치 101 및 103에서의 리신을 알라닌으로 치환시킬 수 있다. 또한, 페닐알라닌 잔기를 하나 이상의 티로신 잔기로 대체할 수 있다.
또 다른 반감기 연장성 부분은 재이용 수용체와 결합할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항체 단편 또는 소분자 (예: 펩티드 모방성 화합물)일 것이다. 예를 들어, 반감기 연장성 부분으로서 1998년 4월 14일자로 프레스타 (Presta) 등에게 허여된 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 사용할 수 있었다. FcRn 재이용 수용체와 결합하기 위한 펩티드가 파아지 디스플레이에 의해 선택될 수도 있었다. 이러한 재이용 수용체-결합성 화합물이 또한, "반감기 연장성 부분"의 의미 내에 포함되고, 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 반감기 연장성 부분은 반감기를 증가시키고 (예를 들어, 프로테아제에 의해 인식된 서열을 피함으로써 달성한다) 면역원성을 저하시키도록 (예를 들어, 항체 인간화에서 발견된 바와 같은, 비-면역원성 서열을 선호함으로써 달성한다) 선택해야 한다.
상기 언급된 바와 같이, 중합체 반감기 연장성 부분을 F1 및 F2에 사용할 수도 있다. 반감기 연장성 부분으로서 유용한 화학적 부분을 부착시키기 위한 각종 수단이 현재 이용 가능하다 [참고: 예를 들어, "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods,"란 발명의 명칭으로 공개된 특허 협력 조약 ("PCT") 국제공개공보 WO 96/11953; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 이러한 PCT 공개공보에는 특히, 수용성 중합체를 단백질의 N-말단에 선택적으로 부착시키는 것이 기재되어 있다.
본 발명의 화합물의 몇몇 양태에서는, F1 및/또는 F2로서의 중합체 반감기 연장성 부분이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이지만, 위치 F1 및/또는 F2를 벗어난 본 발명의 화합물 또한, 해당 분자의 기타 부위, 예를 들어 독소 펩티드 상의 하나 이상의 부위에서 접합된 하나 이상의 PEGs를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물의 몇몇 양태에는 F1 및/또는 F2인 비-PEG 반감기 연장성 부분, 또는 독소 펩티드 (P), 또는 이들 모두의 조합물과 접합된 하나 이상의 PEG 부분이 추가로 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 중의 Fc 도메인 또는 그의 일부 (F1 및/또는 F2로서)는 환원적 알킬화 공정에 의해 모노-PEG화, 디-PEG화 또는 다중-PEG화시킬 수 있다.
단백질 및 펩티드와 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)와의 공유 접합은 치료적 단백질의 생체내 순환성 반감기를 상당히 연장시키기 위한 접근 방식으로서 널리 인식되어 왔다. PEG화는 주로 신장 청소를 지연시킴으로써 상기 효과를 달성시키는데, 이는 PEG 부분이 해당 단백질에 상당한 유체역학 반경을 부가해주기 때문이다 [참고: Zalipsky, S., et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides., in poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications., J.M. Harris, Ed., Plenum Press: New York., 347-370 (1992)]. 단백질 및 펩티드를 PEG화함으로써 종종 부여되는 부가의 이득에는 용해도 증가, 단백질 분해적 분해에 대한 저항성, 및 치료적 폴리펩티드의 면역원성 저하가 포함된다. 단백질 PEG화의 장점은 몇 가지 PEG화 단백질을 상품화함으로써 명백히 입증되는데, 이에는 PEG-아데노신 데아미나제 (Adagen™/공급처: Enzon Corp,), PEG-L-아스파라기나제 (Oncaspar™/공급처: Enzon Corp.), PEG-인터페론 α-2b (PEG-lntron™/공급처: Schering/Enzon), PEG-인터페론 α-2a (PEGASYS™/공급처: Roche) 및 PEG-G-CSF (Neulasta™/공급처: Amgen) 뿐만 아니라 임상 시험 중인 기타 많은 것들이 포함된다.
간략하게 언급하면, PEG 기를 일반적으로, PEG 부분 상의 반응성 기 (예를 들어, 알데히드, 아미드, 티올 또는 에스테르 기)를 통하여 본 발명의 화합물 상의 반응성 기 (예를 들어, 알데히드, 아미드 또는 에스테르 기)로 환원적 알킬화 또는 아실화함으로써 본 발명의 화합물의 펩티드 일부에 부착시킨다.
합성 펩티드를 PEG화하는데 유용한 전략은 용액 중에서의 접합체 연쇄 형성을 통하여, 각각 서로에 대해 상호 반응성인 특수 관능기를 보유하고 있는 펩티드와 PEG 부분을 조합하는 것으로 이루어진다. 펩티드는 통상적인 고체 상 합성을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다 [예를 들어, 도 5 및 6, 및 본원에 수반된 텍스트 참고]. 펩티드는 특정 위치에서 적당한 관능기를 이용하여 "예비-활성화"시킨다. 전구체를 정제하고, PEG 부분과 반응시키기에 앞서 완전히 성상 확인한다. 펩티드를 PEG와 연결시키는 것은 통상적으로, 수성 상에서 일어나고 역상 분석적 HPLC에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다. PEG화 펩티드는 분취 HPLC에 의해 용이하게 정제할 수 있고, 분석적 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광법에 의해 성상 확인할 수 있다.
PEG는 시판되고 있거나 또는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라서 에틸렌 글리콜을 개환 중합 반응시킴으로써 제조할 수 있는, 널리 공지된 수용성 중합체이다 [참고: Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]. 본원에서 용어 "PEG"는 크기나 PEG의 말단에서의 변형에 상관없이, 일-, 이- 또는 다-관능성 형태의 모든 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하기 위해 광범위하게 사용되고 있고, 다음 화학식 X로써 나타낼 수 있다:
X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH
상기 식에서, n은 20 내지 2300이고, X는 H 또는 말단 변형물, 예를 들어 C1-4 알킬이다.
몇몇 유용한 양태에서, 본 발명에 사용된 PEG는 히드록시 또는 메톡시를 수반한 하나의 말단 상에서 종결된다 [즉, X는 H 또는 CH3이다 ("메톡시 PEG")]. OH로 종결되는 화학식 II에 제시되는, PEG의 다른 말단은 에테르 산소 결합, 아민 연쇄 또는 아미드 연쇄를 통하여 활성화 부분에 공유적으로 부착된다는 것을 인지해야 한다. 화학 구조로 사용된 경우의 용어 "PEG"에는 제시된 히드록실 기의 수소를 수반하지 않은 상기 화학식 II가 포함되는데, 이로써 링커의 자유 탄소 원자와 반응하는데 이용 가능한 산소가 남게되어 에테르 결합을 형성한다. 보다 구체적으로 언급하면, PEG를 펩티드와 접합시키기 위해서는, 펩티드가 "활성화" 형태의 PEG와 반응해야만 한다. 활성화 PEG는 다음 화학식 XI로써 나타낼 수 있다:
(PEG)-(A)
상기에서, (상기 정의된) PEG는 활성화 부분 (A)의 탄소 원자에 공유적으로 부착하여 에테르 결합, 아민 연쇄, 또는 아미드 연쇄를 형성하고, (A)는 펩티드에 공유적으로 부착된 링커 부분 또는 펩티드의 아미노산 잔기 상의 아미노, 이미노 또는 티올 기와 반응할 수 있는 반응성 기를 함유한다.
활성화 PEG 및 그와 생물학적 활성 펩티드와의 접합물을 제조하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,643,575, 5,919,455, 5,932,462, and 5,990,237; Thompson et al., PEGylation of polypeptides, EP 0575545 B1; Petit, Site specific protein modification, US Patent Nos, 6,451,986, and 6,548,644; S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); Y. Lu et al., Pegylated peptides III: Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecular weight: synthesis of multiply PEGylated peptides, Reactive Polymers, 22:221-229 (1994); A.M. Felix et al., PEGylated Peptides IV: Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs, Int. J. Peptide Protein Res., 46:253-264 (1995); A.M. Felix, Site-specific poly(ethylene glycol)ylation of peptides, ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol)): 218-238 (1997); Y. Ikeda et al., Polyethylene glycol derivatives, their modified peptides, methods for producing them and use of the modified peptides, EP 0473084 B1; G. E. Means et al., Selected techniques for the modification of protein side chains, in: Chemical modification of proteins, Holden Day, Inc., 219 (1971)].
활성화 PEG, 예를 들어 PEG-알데히드 또는 PEG-알데히드 수화물은 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있거나, 또는 상업 공급원 [예: Shearwater Polymers, (Huntsville, Al) 또는 Enzon, Inc. (Piscataway, N.J.)]으로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 목적에 유용한 활성화 PEG의 특정 예는 PEG-알데히드 화합물 (예: 메톡시 PEG-알데히드), 예를 들어 PEG-프로피온알데히드 [공급처: Shearwater Polymers (Huntsville, Al)]이다. PEG-프로피온알데히드는 식 PEG-CH2CH2CHO로써 나타낸다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,252,714호]. 유용한 활성화 PEG의 기타 예는 PEG 아세트알데히드 수화물 및 PEG 비스알데히드 수화물인데, 후자는 이관능성 활성화 구조물을 생성시킨다 [참고: 예를 들어, Bentley et al., Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines, US Patent No. 5,990,237].
본 발명의 PEG-접합된 펩티드를 생성시키는데 유용한 또 다른 활성화 PEG는 PEG-말레이미드 화합물, 예를 들어 메톡시 PEG-말레이미드인데, 예를 들면 말레이미도 모노메톡시 PEG가 본 발명의 PEG-접합된 펩티드를 생성시키는데 특히 유용하다 [참고: 예를 들어, Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, US Patent No. 6,602,498; C. Delgado et al., The uses and properties of PEG-linked proteins., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 9:249-304 (1992); S. Zalipsky et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides, in: Poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications (J.M. Harris, Editor, Plenum Press: New York, 347-370 (1992); S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); P.J. Shadle et al., Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1, U.S. Patent No. 4,847,325; G. Shaw et al., Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof, U.S. Patent No.5,166,322 and EP 0469074 B1; G. Shaw et al., Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof, EP 0668353 A1; G. Shaw et al., Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof, EP 0668354 A1; N.V. Katre et al., Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof, U.S. Patent No. 5,206,344; R.J. Goodson and N.V. Katre, Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylate site, Biotechnology, 8:343-346 (1990)].
폴리(에틸렌 글리콜) 비닐 설폰은 티올화 아미노산 잔기, 예를 들어 C 잔기에서 접합시킴으로써 본발명의 PEG-접합된 펩티드를 생성시키는데 유용한 또 다른 활성화 PEG의 예이다 [참고: 예를 들어, M. Morpurgo et al., Preparation and characterization of poly(ethylene glycol) vinyl sulfone, Bioconj. Chem., 7:363-368 (1996); Harris, Functionalization of polyethylene glycol for formation of active sulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologically compatible materials, U.S. Patent Nos. 5,446,090; 5,739,208; 5,900,461; 6,610,281 and 6,894,025; and Harris, Water soluble active sulfones of poly(ethylene glycol), WO 95/13312 A1].
본 발명에 따라서 유용한 또 다른 활성화 형태의 PEG는 PEG-N-히드록시석신이미드 에스테르 화합물, 예를 들어 메톡시 PEG-N-히드록시석신이미딜 (NHS) 에스테르이다.
이종-이관능성 활성화 형태의 PEG가 또한 유용하다 [참고: 예를 들어, Thompson et al., PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith, U.S. Patent No. 6,552,170].
전형적으로, 독소 펩티드, 또는 이러한 독소 펩티드를 포함하는 융합 단백질은 공지된 화학적 기술에 의해 활성화 PEG 화합물, 예를 들어 티올-활성화 PEG 화합물, 디올-활성화 PEG 화합물, PEG-히드라지드 화합물, PEG-옥시아민 화합물 또는 PEG-브로모아세틸 화합물과 반응시킨다 [참고: 예를 들어, S. Herman, Poly(ethylene glycol) with Reactive Endgroups: I. Modification of Proteins, J. Bioactive and Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Advanced Drug Delivery Reviews, 16:157-182 (1995); R. Greenwald et al., Poly(ethylene glycol) conjugated drugs and prodrugs: a comprehensive review, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 17:101-161 (2000)].
N-말단 PEG화 방법이 본원 실시예 31-34, 45 및 47-48에 예시되었지만, 당업자가 이용할 수 있는 PEG화 방법이 이들로써 제한되지 않는다.
PEG에 대한 분자량은 실제적으로 요망되는 바 대로 사용할 수 있는데, 예를 들면 약 1,000 또는 2,000 달톤 (Da) 내지 약 100,000 Da (n은 20 내지 2300이다)이다. 바람직하게는, 본 발명의 PEG-접합된 펩티드에 사용된 PEG의 합한 또는 총 분자량은 약 3,000 Da 또는 5,000 Da 내지 약 50,000 Da 또는 60,000 Da (총 n은 70 내지 1,400이다), 보다 바람직하게 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da (총 n은 약 230 내지 약 910이다)이다. PEG에 대한 가장 바람직한 총 분자량은 약 20,000 Da 내지 약 30,000 Da (총 n은 약 450 내지 약 680이다)이다. PEG 중의 반복 단위 "n"의 수는 달톤으로 기재된 분자량과 근사치이다. 활성화 링커 상의 PEG의 합한 분자량은 제약용으로 적합한 것이 바람직하다. 따라서, PEG 분자의 합한 분자량이 약 100,000 Da를 초과하지 않아야 한다.
다당류 중합체는 단백질 변형을 위해 사용될 수 있는 또 다른 유형의 수용성 중합체이다. 덱스트란은 주로 α1-6 연쇄에 의해 연결된 개개의 글루코스 소단위체로 구성된 다당류 중합체이다. 덱스트란 그 자체는 많은 분자량 범위에서 이용 가능하고, 약 1 kD 내지 약 70 kD의 분자량에서 용이하게 이용 가능하다. 덱스트란은 단독으로 또는 또 다른 반감기 연장성 부분 (예: Fc)과 병용해서 반감기 연장성 부분으로서 본 발명에 사용하는데 적합한 수용성 중합체이다 [참고: 예를 들어, WO 96/11953 and WO 96/05309]. 치료적 또는 진단적 면역글로불린과 접합된 덱스트란의 용도가 보고되었다 [참고: 예를 들어, 유럽 특허공보 0 315456; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 덱스트란이 본 발명에 따라서 반감기 연장성 부분으로서 사용되는 경우에는 약 1 kD 내지 약 20 kD의 덱스트란이 바람직하다.
링커. 어떠한 "링커" 군 또는 부분 (즉, 화학식 I 내지 IX 중의 "-(L)f-" 또는 "-(L)g-")도 임의적이다. 존재하는 경우, 그의 화학 구조는 중요하지 않은데, 이는 주로 스페이서로서 제공되기 때문이다. 상기 언급된 바와 같이, 링커 부분 (-(L)f- 및/또는 -(L)g-)은 존재하는 경우, 본 발명의 화합물에 존재할 수도 있는 기타 모든 링커(들)와 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, "(L)f"는 본 발명에 따르는 모든 "(L)g" 또는 기타 모든 "(L)f"와 동일한 부분을 나타내거나 상이한 부분을 나타낼 수 있다. 링커는 바람직하게, 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 구성된다. 따라서 몇몇 양태에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 약 30개 아미노산으로 구성되고, 이러한 아미노산은 20개 천연 발생적 아미노산 중에서 선택된다. 이들 아미노산 중의 몇몇은 당해 분야에서 널리 이해되고 있는 바와 같이 당화시킬 수 있다. 예를 들어, 시알릴화 부위를 구성하고 있는 유용한 링커 서열은 X1X2NX4X5G (서열 637) [여기서, X1, X2, X4, 및 X5는 각각 독립적으로 모든 아미노산 잔기이다]이다.
몇몇 양태에서, 1 내지 20개 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 리신 중에서 선택된다. 보다 더 바람직하게, 링커는 입체적으로 장애되지 않은 대다수의 아미노산, 예를 들어 글리신 및 알라닌으로 구성된다. 따라서, 바람직한 링커에는 폴리글리신 [특히 (Gly)4, (Gly)5], 폴리(Gly-Ala), 및 폴리알라닌이 포함된다. 기타 바람직한 링커는 본원에서 "L5" (GGGGS; 서열 638), "L10" (GGGGSGGGGS; 서열 79), "L25" (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; 서열 84)로서 확인된 링커, 및 후술되는 작동 실시예에서 사용되는 모든 링커이다. 그러나, 본원에 기재된 링커는 예시적이며, 본 발명의 범위 내에 속하는 링커는 훨씬 더 길 수 있고 기타 잔기를 포함할 수 있다.
펩티드 링커 부분 (L)을 포함하는 본 발명의 화합물의 몇몇 양태에서는, 산성 잔기, 예를 들어 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기를 상기 링커 부분 (L)의 아미노산 서열에 놓아둔다. 그의 예에는 다음 펩티드 링커 서열이 포함된다:
GGEGGG (서열 639);
GGEEEGGG (서열 640);
GEEEG (서열 641);
GEEE (서열 642);
GGDGGG (서열 643);
GGDDDGG (서열 644);
GDDDG (서열 645);
GDDD (서열 646);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (서열 647);
WEWEW (서열 648);
FEFEF (서열 649);
EEEWWW (서열 650);
EEEFFF (서열 651);
WWEEEWW (서열 652); 또는
FFEEEFF (서열 653).
기타 양태에서는, 링커가 인산화 부위, 예를 들면 X1X2YX3X4G (서열 654) [여기서, X1, X2, X3, 및 X4는 각각 독립적으로 모든 아미노산 잔기이다]; X1X2SX3X4G (서열 655) [여기서, X1, X2, X3, 및 X4는 각각 독립적으로 모든 아미노산 잔기이다]; 또는 X1X2TX3X4G (서열 656) [여기서, X1, X2, X3, 및 X4는 각각 독립적으로 모든 아미노산 잔기이다]를 구성한다.
비-펩티드 링커가 또한 가능하다. 예를 들어, 알킬 링커, 예를 들면 -NH-(CH2)S- C(O)- [여기서, s는 2 내지 20이다]를 사용할 수 있다. 이들 알킬 링커는 비-입체적 장애 기, 예를 들어 저급 알킬 (예: C1-C6) 저급 아실, 할로겐 (예: Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등에 의해 추가로 치환될 수 있다. 예시되는 비-펩티드 링커는 다음 화학식 XII의 PEG 링커이다:
상기에서, n은 해당 링커가 분자량 100 내지 5000 kD, 바람직하게 100 내지 500 kD이 되도록 하는 값이다. 펩티드 링커를 변경시켜 상기 언급된 바와 동일한 방식으로 유도체를 형성시킬 수 있다.
유도체. 본 발명자들은 또한, 당해 화합물의 펩티드 및/또는 반감기 연장성 부분 일부를 유도체화하는 것을 고려한다. 이러한 유도체는 화합물의 용해도, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 상기 부분은 또 다른 한편으론, 해당 화합물의 바람직하지 못한 부작용을 없애거나 약화시킬 수 있다. 예시되는 유도체에는 다음과 같은 화합물이 포함된다:
1. 화합물 또는 그의 몇몇 일부는 사이클릭이다. 예를 들어, 디설파이드 결합 형성에 의해 폐환될 수 있는 2개 이상의 Cys 잔기 (예를 들어, 링커 내에 존재함)를 함유하도록 펩티드 일부를 변형시킬 수 있다.
2. 화합물은 가교 결합되거나 또는 분자들 간을 가교 결합할 수 있도록 한다. 예를 들어, 하나의 Cys 잔기를 함유하도록 함으로써 링커 분자와 분자내 디설파이드 결합을 형성할 수 있도록 펩티드 일부를 변형시킬 수 있다. 상기 화합물은 또한, 다음 화학식 XIII에 제시된 분자에서와 같이 그의 C-말단을 통하여 가교 결합될 수 있다:
3. 비-펩티딜 연쇄 (결합)이 하나 이상의 펩티딜 [-C(O)NR-] 연쇄를 대체한다. 예시되는 비-펩티딜 연쇄는 -CH2-카바메이트 [-CH2-OC(O)NR-], 포스포네이트, -CH2-설폰아미드 [-CH2-S(O)2NR-], 우레아 [-NHC(O)NH-], -CH2-2급 아민, 및 알킬화 펩티드 [-C(O)NR6- (여기서, R6은 저급 알킬이다)]이다.
4. N-말단이 화학적으로 유도체화된다. 전형적으로, N-말단을 아실화 또는 변형시켜 치환된 아민으로 만들 수 있다. 예시되는 N-말단 유도체 기에는 -NRR1 (-NH2 이외), -NRC(O)R1, NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, 석신이미드, 또는 벤질옥시카보닐-NH-(CBZ-NH-) [여기서, R 및 R1은 각각 독립적으로, 수소 또는 저급 알킬이고, 페닐 환은 C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, 클로로 및 브로모로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 3개의 치환체에 의해 치환될 수 있다]이 포함된다.
5. 자유 C-말단을 유도체화한다. 전형적으로, C-말단을 에스테르화 또는 아미드화한다. 예를 들어, 당해 분야에 보고된 방법을 사용하여, C-말단에 서열 504 내지 508을 갖는 본 발명의 화합물에 (NH-CH2-CH2-NH2)2를 부가할 수 있다. 마찬가지로, 당해 분야에 보고된 방법을 사용하여, C-말단에 서열 924 내지 955, 963 내지 972, 1005 내지 1013, 또는 1018 내지 1023을 갖는 본 발명의 화합물에 -NH2를 부가할 수 있다. 예시되는 C-말단 유도체 기에는, 예를 들어 -C(O)R2 [여기서, R2는 저급 알콕시이다) 또는 -NR3R4 [여기서, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 C1-C8 알킬 (바람직하게, C1-C4 알킬)이다]가 포함된다.
6. 디설파이드 결합을 또 다른, 바람직하게는 보다 안정한 가교 결합성 부분 (예: 알킬렌)으로 대체시킨다 [참고: 예를 들어, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9].
7. 하나 이상의 개별적 아미노산 잔기를 변형시킨다. 각종 유도체화제가 다음에 상세히 기재되는 바와 같이, 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 특이적으로 반응하는 것으로 공지되어 있다.
리시닐 잔기 및 아미노 말단 잔기를, 이러한 리시닐 잔기의 전하를 역전시키는 석신산 또는 기타 카복실산 무수물과 반응시킬 수 있다. 알파-아미노 함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 기타 시약에는 이미도에스테르, 예를 들어 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로히드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 트랜스아미나제-촉매된 글리옥실레이트와의 반응물이 포함된다.
아르기닐 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온 및 닌히드린을 포함한 몇 가지 통상적인 시약들 중의 어느 한 가지 또는 조합물과 반응시킴으로써 변형시킬 수 있다. 아르기닐 잔기를 유도체화하기 위해서는, 구아니딘 관능기의 높은 pKa 때문에 상기 반응을 알칼리성 조건 하에 수행해야만 한다. 더우기, 이들 시약은 리신 기 뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노 기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형에 관한 광범위한 연구가 이루어졌는데, 특히 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 스펙트럼 표지를 티로실 잔기 내로 도입하는 것에 관심이 있다. 가장 통상적으로는, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 형성시킨다.
카복실 측쇄 기 (아스파르틸 또는 글루타밀)을 카보디이미드 (R'-N=C=N-R'), 예를 들어 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드와 반응시킴으로써 선택적으로 변형시킬 수 있다. 더우기, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기를 암모늄 이온과 반응시킴으로써 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킬 수 있다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 탈아미드화하여 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 만들 수 있다. 또 다른 한편, 이들 잔기를 순한 산성 조건 하에 탈아미드화한다. 이들 잔기의 어느 형태도 본 발명의 범위 내에 속한다.
시스테이닐 잔기는 디설파이드 결합을 제거하거나 또는 역으로 가교 결합을 안정화시키는 아미노산 잔기 또는 기타 부분으로 대체시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9].
이관능성 작용제로 유도체화하는 것이, 펩티드 또는 그의 기능적 유도체를 수불용성 지지체 매트릭스 또는 기타 거대분자 반감기 연장성 부분에 가교 결합시키는데 유용하다. 흔히 사용되는 가교 결합제에는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시석신이미드 에스테르, 예를 들면 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종-이관능성 이미도에스테르, 예를 들어 디석신이미딜 에스테르 [예: 3,3'-디티오비스(석신이미딜프로피오네이트)], 및 이관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄이 포함된다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 빛의 존재 하에 가교결합물을 형성할 수 있는 광활성 가능한 중간체를 산출시킨다. 또 다른 한편으론, 반응성 수불용성 매트릭스, 예를 들어 시아노겐 브로마이드-활성화 탄수화물 및 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 반응성 기질이 단백질 고정화에 이용된다.
탄수화물 (올리고당류) 기를 단백질 내의 당화 부위인 것으로 공지되어 있는 부위에 부착시키는 것이 편리할 수 있다. 일반적으로, O-연결된 올리고당류는 세린 (Ser) 또는 트레오닌 (Thr) 잔기에 부착시키는 반면, N-연결된 올리고당류는 이들이 서열 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산일 수 있다)의 일부인 경우에는 아스파라긴 (Asn) 잔기에 부착시킨다. X는 바람직하게, 프롤린 이외의 19개 천연 발생적 아미노산 중의 하나이다. N-연결된 및 O-연결된 올리고당류의 구조 및 각 유형에서 발견된 당 잔기는 상이하다. 흔히 둘 다에서 발견되는 한 가지 유형의 당은 N-아세틸뉴라민산 (시알산으로서 지칭된다)이다. 시알산은 통상적으로, N-연결된 올리고당류와 O-연결된 올리고당류 둘 다의 말단 잔기이고, 그의 음전하를 통하여 당화 화합물에 산성 특성을 부여할 수 있다. 이러한 부위(들)를 본 발명의 화합물의 링커에 혼입할 수 있고, 폴리펩티드 화합물의 재조합 생성 동안 특정 세포 (예를 들어, CHO, BHK, COS 등의 포유류 세포)에 의해 당화되는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 부위는 당해 분야에 공지된 합성 또는 반합성 과정에 의해 추가로 당화시킬 수 있다.
기타 가능한 변형에는 프롤린 및 리신의 히드록시화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화; Cys 중의 황 원자의 산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노 기의 메틸화가 포함된다 [참고: Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman and Co., San Francisco), pp.79-86 (1983)].
본 발명의 화합물은 또한, DNA 수준에서 변화시킬 수 있다. 본 발명의 화합물 일부의 DNA 서열을, 선택된 숙주 세포와 보다 잘 화합성인 코돈으로 변화시킬 수 있다. 바람직한 숙주 세포인 이. 콜라이의 경우에 최적화된 코돈이 당해 분야에 공지되어 있다. 코돈을 치환시켜 제한 부위를 없애거나, 또는 선택된 숙주 세포에서 DNA를 프로세싱하는데 도움을 줄 수 있는 침묵 제한 부위를 포함시킬 수 있다. 반감기 연장성 부분, 링커 및 펩티드 DNA 서열을 변형시켜 전술된 서열 변화 모두를 포함하도록 할 수 있다.
접합 유도체의 제조 방법이 또한 고려된다. 종양 세포는, 예를 들어 그들의 정상적인 대응물 상에서는 발견되지 않는 에피토프를 나타낸다. 이러한 에피토프에는, 예를 들어 그들의 신속한 증식으로부터 비롯되는 상이한 해독 후 변형물이 포함된다. 따라서, 본 발명의 한 국면은
a) 표적 에피토프와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 무작위화 펩티드를 선택하는 단계; 및
b) (i) 하나 이상의 반감기 연장성 부분 (Fc 도메인이 바람직하다), (ii) 상기 선택된 펩티드(들)의 하나 이상의 아미노산 서열, 및 (iii) 효과기 분자를 포함하는 약리학적 작용제를 제조하는 단계
를 포함하는 방법이다.
표적 에피토프는 바람직하게, 종양 특이적 에피토프 또는 병원성 유기체에 대해 특이적인 에피토프이다. 효과기 분자는 상기 언급된 모든 접합 파트너일 수 있고, 바람직하게는 방사성 동위원소이다.
제조 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 유용한 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 진핵 세포일 수 있고, 포유류 세포가 바람직하며, CHO 세포가 가장 바람직하다. 숙주 세포는 원핵 세포일 수도 있는데, 이. 콜라이 세포가 가장 바람직하다.
본 발명의 화합물은 대개, 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 숙주 세포에서 만들 수 있다. 이렇게 하기 위해, 당해 펩티드를 암호화하는 재조합 DNA 분자를 제조한다. 이러한 DNA 분자의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 서열은 적합한 제한 효소를 사용하여 DNA로부터 절단할 수 있다. 또 다른 한편으론, 화학적 합성 기술, 예를 들어 포스포르아미데이트 방법을 사용하여 DNA 분자를 합성할 수 있다. 또한, 이들 기술의 조합을 사용할 수도 있다.
본 발명에는 또한, 펩티드를 적당한 숙주에서 발현할 수 있는 벡터가 포함된다. 이러한 벡터는 적당한 발현 제어 서열과 작동적으로 연결된 펩티드를 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. DNA 분자를 벡터 내로 삽입하기 전 또는 후에, 이러한 작동적 연결을 수행하는 방법은 널리 공지되어 있다. 발현 제어 서열에는 프로모터, 활성인자, 증강인자, 작동인자, 리보솜성 결합 부위, 출발 신호, 정지 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 전사 또는 해독 제어와 관련된 기타 신호가 포함된다.
이로써 생성된, 해당 DNA 분자를 갖는 벡터를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시킨다. 이러한 형질전환은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
입수 가능하고 널리 공지된 상당 수의 숙주 세포가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 특정한 숙주의 선택은 당해 분야에 인식된 수 많은 요인들에 의해 좌우된다. 이에는, 예를 들어 선택된 발현 벡터와의 화합성, DNA 분자에 의해 암호화된 펩티드의 독성, 형질전환 속도, 펩티드의 회수 용이성, 발현 특징, 생체-안전성 및 비용이 포함된다. 이들 인자 간의 밸런스는 모든 숙주가 반드시 특정한 DNA 서열의 발현에 대해 동등하게 유효할 수 없다는 것을 인식해야만 한다. 이러한 일반적 지침 내에서 유용한 미생물 숙주에는 세균 (예: 이. 콜라이 종), 효모 [예: 삭카로마이세스 종 (Saccharomyces sp.)] 및 기타 진균, 곤충, 식물, 배양 중인 포유류 (인간 포함) 세포, 또는 당해 분야에 공지된 기타 숙주가 포함된다.
이어서, 형질전환된 숙주를 배양하고 정제한다. 숙주 세포는 목적 화합물을 발현시키는 통상적인 발효 조건 하에 배양할 수 있다. 이러한 발효 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 최종적으로, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 배양물로부터 펩티드를 정제한다.
본 발명의 화합물은 합성 방법에 의해 만들 수도 있다. 고체 상 합성이 개개의 펩티드를 제조하는데 바람직한 기술인데, 이는 이 방법이 저분자 펩티드를 제조하는데 있어 비용 면에서 가장 유효한 방법이기 때문이다. 예를 들어, 널리 공지된 고체 상 합성 기술에는 보호기, 링커 및 고체 상 지지체의 사용 뿐만 아니라 특이적 보호 및 탈보호 반응 조건, 링커 절단 조건, 스캐빈저 (scavenger)의 사용, 및 고체 상 펩티드 합성의 기타 국면이 포함된다. 적합한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985). Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis: U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," W. C. Chan and P. D, White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183].
본 발명의 화합물이 합성 기술에 의해 제조되든지 아니면 재조합 기술에 의해 제조되든지 간에, 적합한 단백질 정제 기술이 적용 가능하다면 이를 포함할 수도 있다. 본 발명의 화합물의 몇몇 양태에서는, 독소 펩티드 부분 및/또는 반감기 연장성 부분, 또는 기타 모든 부분은 정량화 또는 탐지의 용이성을 위해, 적합한 동위원소 표지 (예:, 125I, 14C, 13C, 35S, 3H, 2H, 13N, 15N, 18O, 17O 등)가 포함되도록 제조할 수 있다.
유도체화 펩티드를 함유하거나 비-펩티드 기를 함유하는 화합물은 널리 공지된 유기 화학 기술에 의해 합성할 수 있다.
본 발명의 화합물의 용도
일반적 용도: 본 발명의 화합물은 관심있는 단백질의 본래의 리간드의 작동제, 모방제 또는 길항제로서 상기 관심있는 단백질과 결합할 수 있는 능력으로부터 비롯되는 약리학적 활성을 지니고 있다. 이온 채널과 연관이 있는 것으로 공지되어 있는 유전성 질환 ("채널병증")은 각종 의학 분야를 포괄하는데, 이중 몇몇에는 신경학, 신장학, 근육학 및 심장학이 포함된다. 이온 채널에 기인한 유전 장애에 관한 목록에는 다음이 포함된다:
● 낭포성 섬유증 (Cl- 채널; CFTR),
● 덴트병 (Dent's disease) (단백뇨 및 고칼슘뇨; Cl- 채널; CLCN5),
● 대리석골병 (osteopetrosis) (Cl- 채널; CLCN7),
● 가족성 고인슐린혈증 (SUR1; KCNJ11; K 채널),
● 당뇨병 (KATP / SUR 채널),
● 앤더센 증후군 (Andersen syndrome) (KCNJ2, Kir2.1 K 채널),
● 바르터 증후군 (Bartter syndrome) (KCNJ1; Kir1.1/ROMK; K 채널),
● 유전성 청력 상실 (KCNQ4; K 채널),
● 유전성 고혈압 [리들 증후군 (Liddle's syndrome); SCNN1; 상피 Na 채널],
● 확장형 심근병증 (SUR2, K 채널),
● 장-QT 증후군 또는 심부전증 (심장 칼륨 및 나트륨 채널),
● 티모시 증후군 (Thymothy syndrome) (CACNA1C, Cav1.2),
● 근무력증 증후군 (CHRNA, CHRNB, CNRNE; nAChR), 및 각종 기타 근병증,
● 과칼륨성 주기적 마비 (Na 및 K 채널),
● 간질 (Na+ 및 K+ 채널),
● 편마비성 편두통 (CACNA1A, Cav2.1 Ca2+ 채널 및 ATP1A2),
● 중추 핵 질병 (RYR1, RyR1; Ca2+ 채널); 및
● 이상근육긴장증 및 근육긴장증 (Na+, Cl- 채널)
[참고: L.J. Ptacek and Y-H Fu (2004), Arch. Neurol. 61: 166-8; B.A. Niemeyer et al. (2001), EMBO reports 21: 568-73; F. Lehmann-Horn and K. Jurkat-Rott (1999), Physiol. Rev. 79: 1317-72]. 전술된 목록이 유전적 기원의 장애에 관한 것이긴 하지만, 이들 장애에 언급된 채널을 표적으로 하는 분자는 기타 기원이나 불확정 기원의 관련 장애를 치료하는데 유용할 수도 있다.
전술된 장애 이외에, 다음 질환을 치료하기 위한 표적으로서 이온 채널을 뒷받침하는 명백한 증거가 또한 제공되었다:
● 겸상 적혈구 빈혈 (IKCa1) - 겸상 적혈구 빈혈에서는, 적혈구로부터의 수분 손실로 인해 헤모글로빈 중합 반응이 일어나고, 계속해서 용혈과 혈관 폐색증이 발생한다. 이러한 수분 손실은 칼륨이 소위 가르도스 (Gardos) 채널, 즉 IKCa1을 통하여 유출되는 것에 따른 결과이다. 따라서, IKCa1을 차단시키는 것이 겸상 적혈구 빈혈에 대해 효능있는 치료적 처치이다.
● 녹내장 (BKCa) - 녹내장에서는 안내 압력이 너무 높아서 시신경 손상, 비정상적인 눈 기능이 야기되고, 가능하게는 실명되기도 한다. BKCa 칼륨 채널을 차단시키는 것이 안내 유체 분비를 저하시키고 평활근 수축을 증가시켜, 안내 압력을 저하시키고 시신경을 보호해줄 수 있다.
● 다발성 경화증 (Kv, KCa),
● 건선 (Kv, KCa),
● 관절염 (Kv, KCa),
● 천식 (KCa, Kv),
● 알레르기 (KCa, Kv),
● COPD (KCa, Kv, Ca),
● 알레르기성 비염 (KCa, Kv),
● 폐 섬유증,
● 루푸스 (IKCa1, Kv),
● 이식, GvHD (KCa, Kv),
● 염증성 골 흡수 (KCa, Kv),
● 치주 질환 (KCa, Kv),
● 당뇨병, 유형 I (Kv) - 유형 I 당뇨병은 비정상적인 글루코스, 단백질 및 지질 대사를 특징으로 하고 인슐린 결핍증 또는 저항성과 연관되는 자가면역 질환이다. 이 질환에서는, Kv1.3-발현성 T-림프구가 췌장 섬을 공격하여 파괴시켜, 베타-세포 손실을 야기시킨다. Kv1.3을 차단시키면 염증성 사이토킨이 감소한다. 또한, Kv1.3을 차단시키면 GLUT4가 혈장 막으로 전위되는 것이 촉진됨으로써, 인슐린 민감성이 증가한다.
● 비만 (Kv) - Kv1.3은 에너지 생체항상성을 제어하고 식이-유도된 비만으로부터 보호하는데 있어 결정적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 결과적으로, Kv1.3 차단제는 대사율을 증가시켜, 보다 많은 에너지를 활용하게 하고 체중을 감소시킨다.
● 재발 협착증 (KCa, Ca2+) - 혈관 평활근 세포의 증식과 유주로 인해, 신생내막이 비대화되고 혈관 재발협착증이 발생할 수 있다. 과도한 신생내막 혈관 평활근 세포 증식은 IKCa1의 발현 상승과 연관이 있다. 따라서, IKCal을 차단시키는 것이 혈관형성술 후 재발 협착증을 예방하기 위한 치료적 전략일 수 있다.
● 허혈증 (KCa, Ca2+) - 신경세포성 또는 심장 허혈증에서는, 세포 막의 탈분극으로 인해 전압-의존형 나트륨 및 칼슘 채널이 개방된다. 결국에는 이로 인해, 칼슘이 과부하되는데 이는 세포독성이다. 전압 의존형 나트륨 및/또는 칼슘 채널을 차단시키는 것이 칼슘 과부하를 저하시킬 수 있고 세포보호 효과를 제공할 수 있다. 또한, 세포 막 전위를 제어하고 안정화시키는데 있어 결정적 역할을 하기 때문에, 전압- 및 칼슘-활성화 칼륨 채널의 조정인자가 칼슘 과부화를 저하시키고 세포를 보호하는 작용을 할 수도 있다.
● 신장 실금 (KCa) - 신장 실금은 과활성 방광 평활근 세포와 연관이 있다. 칼슘 활성화 칼륨 채널은 방광 평활근 세포에서 발현되는데, 여기서 이들은 막 전위를 제어하고 세포 수축력과 수축 빈도를 간접적으로 제어한다. 따라서, 칼슘 활성화 칼륨 채널 오프너 (opener)는 방광에서 전기적 및 수축 활성을 저하시키는 기전을 제공함으로써, 뇨의 절박감을 저하시킨다.
● 골다공증 (Kv),
● 편두통 포함한 통증 (Nav, TRP [일시적 수용체 전위 채널], P2X, Ca2+) - N-유형 전압 의존형 칼슘 채널은 척수에서 침해수용 (nociceptive) 신경전달의 주요 조절인자이다. N-유형 칼슘 채널의 펩티드 차단제인 지코노티드는 침해수용 신경전달을 저하시키고, 인간에게서 중증 만성 통증의 증상을 경감시키는 것으로 전세계적으로 승인되었다. 침해수용기-특이적 N-유형 칼슘 채널의 신규한 차단제는 저하된 부작용 프로파일을 나타내는 개선된 진통제일 것이다.
● 고혈압 (Ca2+) - L-유형 및 T-유형 전압 의존형 칼슘 채널은 혈관 평활근 세포에서 발현되는데, 여기서 이들은 여기-수축 커플링과 세포성 증식을 제어한다. 특히, T-유형 칼슘 채널 활성은 고혈압 동안 신생내막 형성과 연계되었다. L-유형 및 T-유형 칼슘 채널의 차단제는 고혈압의 임상 치료에 유용한데, 이는 칼슘 유입을 저하시키고 평활근 세포 수축을 억제하기 때문이다.
● 상처 치유 - 세포 유주는 상처 치유에서 중요한 역할을 제공한다. 세포내 칼슘 구배는 각질세포 및 섬유아세포에서 세포성 유주 기구의 중요한 조절인자로서 밀접한 영향을 끼쳐 왔다. 또한, 세포막을 가로지르는 이온 유속은 세포 용적 변화와 연관이 있다. 세포 용적을 제어함으로써, 이온 채널은 세포성 유주 기구의 작동을 요구하는 세포내 환경에 일조한다. 특히, IKCa1은 세포 유주를 위해 만능적으로 요구되는 것으로 여겨진다. 또한, Kv1.3, Kv3.1, NMDA 수용체 및 N-유형 칼슘 채널은 림프구 및 신경세포의 유주와 연관이 있다.
● 발작,
● 알츠하이머병 (Alzheimer's disease),
● 파킨슨병 (Parkenson's Disease) (nACHR, Nav)
● 양극성 장애 (Nav, Cav),
● 암 - 수 많은 암성 상태에서는 많은 칼륨 채널 유전자가 증폭되고 단백질 소단위체가 상향 조절된다. 칼률 채널 상향 조절에 대한 병리생리학적 역할과 일관되게, 칼륨 채널 차단제는, 아마도 칼슘 유입 억제와 칼슘 의존성 유전 발현에 대한 효과를 통하여 자궁 암세포와 간암종 세포의 증식을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
● 각종 신경학적, 심혈관계, 대사 및 자가면역 질환.
이온 채널의 작동제와 길항제 둘 다는 치료적 이득을 달성할 수 있다. 치료적 이득은, 예를 들어 Kv1.3, IKCa1, SKCa, BKCa, N-유형 또는 T-유형 Ca2+ 채널 등을 길항시킴으로써 비롯될 수 있다. 이들 채널의 소분자 및 펩티드 길항제는 시험관내 및 생체내 활용성을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 생산 효율 및 약동학에 있어서의 제한은 이온 채널의 억제제 펩티드의 임상적 연구를 상당히 방지하였다.
전압 의존형 칼륨 채널 Kv1.3의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 화합물은 자가면역 질환에 대한 치료적 가치를 나타내는 면역억제제로서 유용하다. 예를 들어, 이러한 분자는 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환 및 류마티스성 관절염을 치료하는데 유용하다 [참고: 예를 들어, H. Wulff et al. (2003) J. Clin. Invest. 111, 1703-1713 and H. Rus et al. (2005) PNAS 102, 11094-11099; Beeton et al., Targeting effector memory T cells with a selective inhibitor peptide of Kv1.3 channnels for therapy of autoimmune diseases, Molec. Pharmacol. 67(4):1369-81 (2005);1 Beeton et al. (2006), Kv1.3: therapeutic target for cell-mediated autoimmune disease, electronic preprint at //webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/ 2670029.1]. 전압 의존형 칼륨 채널 Kv1.3의 억제제가 각종 전임상 염증 동물 모델에서 조사되었다. Kv1.3의 소분자 및 펩티드 억제제는 오브알부민 [참고: C. Beeton et al. (2005) Mol. Pharmacol. 67, 1369] 및 파상풍 톡소이드 [참고: G.C. Koo et al. (1999) Clin. Immunol. 197, 99]에 대한 지연형 과민성 반응을 차단시키는 것으로 밝혀졌다. 피부 염증을 저해시키는 것 이외에도, 억제제는 또한 항체 생성을 저하시켰다 [참고: G.C. Koo et al. (1997) J. Immunol. 158, 5120]. Kv1.3 길항제는 다발성 경화증 (MS)의 랫트 적응 전이 실험적 자가면역성 뇌척수염 (AT-EAE) 모델에서 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. Kv1.3 채널은 MS 환자로부터의 미엘린-특이적 T 세포 상에 과발현되므로, MS를 치료하는데 있어 Kv1.3 억제제를 제공하는 것이 유용할 수 있다는 것을 추가로 뒷받침해준다. 염증성 골 흡수 역시, 치주 질환의 전임상 적응 전이 모델에서 Kv1.3 억제제에 의해 저해되었다 [참고: P. Valverde et al. (2004) J. Bone Mineral Res. 19, 155]. 이 연구에서, 억제제는 세균성 외부 막 단백질 (이는 잇몸 염증을 유도시키기 위해 사용되어 온 세균의 한 성분이다)에 대한 항체 생성을 부가적으로 차단시켰다. 최근의 전임상 랫트 모델에서는, 프리스탄 (pristane)-유도된 관절염 및 당뇨병을 치료하는데 있어서의 Kv1.3 억제제의 효능이 밝혀졌다 [참고: C. Beeton et al. (2006) preprint available at //webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/_xy-2670029_1.]. Kv1.3 채널은 모든 T 세포 및 B 세포의 일부 상에 발현되지만, 효과기 기억 T 세포 및 부류-전환된 기억 B 세포는 Kv1.3에 특히 의존적이다 [참고: H. Wulff et al. (2004) J. Immunol. 173, 776]. 신규 발병 유형 1 당뇨병 환자로부터의 Gad5 / 인슐린 특이적 T 세포, MS 환자로부터의 미엘린-특이적 T 세포, 및 류마티스성 관절염 환자의 활막으로부터의 T 세포는 모두 Kv1.3을 과발현한다 [참고: C. Beeton et al. (2006) preprint at //webfiles.uci.edu/xythoswfs/webui/_xy-2670029_1.]. Kv1.3가 결핍된 마우스를 고 지방 식이 하에 놓아둔 경우에는 체중 손실을 나타내고 [참고: J. Xu et al. (2003) Human Mol. Genet. 12, 551], 변경된 글루코스 활용을 나타내기 때문에 [참고: J. Xu et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci, 101, 3112], Kv1.3은 비만과 당뇨병 치료를 위해 또한 연구되고 있다. 유방암 표본 [참고: M. Abdul et al. (2003) Anticancer Res. 23, 3347] 및 전립선 암 세포주 [참고: S.P. Fraser et al. (2003) Pflugers Arch. 446, 559]는 또한 Kv1.3을 발현하는 것으로 밝혀졌고, Kv1.3 차단은 암을 치료하는데 유용할 수 있다. Kv1.3 억제제 독소 펩티드(들)를 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 본 발명의 방법에 따라서 치료될 수 있는 장애에는 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재발 협착증, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질환, 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 및 기타 형태의 루푸스가 포함된다.
중간 전도도 IKCa1의 칼슘 활성화 칼륨을 발현하는 몇몇 세포에는 T 세포, B 세포, 비만 세포 및 적혈구 (RBCs)가 포함된다. IKCa1이 결핍된 마우스로부터의 T 세포 및 RBCs는 용량 조절 상의 결함을 나타낸다 [참고: T. Begenisich et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 47681]. 전임상 및 임상 연구 결과, IKCa1 억제제가 겸상 적혈구 빈혈을 치료하는데 유용한 것으로 입증되었다 [참고: J. W. Stocker et al. (2003) Blood 101, 2412; www.icagen.com]. IKCa1 채널 차단제는 또한 EAE를 차단시키는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이들 차단제가 MS를 치료하는데 유용할 수 있다는 지표이다 [참고: E. P. Reich et al. (2005) Eur. J. Immunol. 35, 1027]. 비만 세포로부터의 IgE-매개된 히스타민 생성이 또한 IKCa1 억제제에 의해 차단되므로 [참고: S. Mark Duffy et al. (2004) J. Allergy Clin. Immunol. 114, 66], 상기 억제제는 천식을 치료하는데 유익할 수도 있다. IKCa1 채널은 활성화 T 및 B 림프구 상에서 과발현되므로 [참고: H. Wulff et al. (2004) J. Immunol. 173, 776], 광범위한 면역 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 면역계 외부에서도 IKCa1 억제제는 랫트 혈관성 재발 협착증 모델에서 효능이 있는 것을 밝혀졌으므로, 혈관형성술 후 재발 협착증을 예방하기 위한 새로운 치료적 전략을 나타낼 수도 있다 [참고: R. Kohler et al. (2003) Circulation 108, 1119]. IKCa1 길항제는 종양 혈관형성을 치료하는데 유용한 것으로 여겨지기도 하는데, 이는 억제제가 내피 세포 증식과 생체내 혈관형성을 저해하였기 때문이다 [참고: I. Grgic et al. (2005) Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 25, 704]. IKCa1 채널은 췌장 종양에서 상향 조절되고 억제제는 췌장 종양 세포주의 증식을 차단시켰다 [참고: H. Jager et al. (2004) Mol Pharmacol. 65, 630]. IKCa1 길항제는 또한, 외상성 뇌 손상에 의해 유발된 급성 뇌 손상을 약화시키기 위한 접근방식을 나타낼 수 있다 [참고: F. Mauler (2004) Eur. J. Neurosci. 20, 1761]. IKCa1 억제제를 이용하여 치료할 수 있는 장애에는 다발성 경화증, 천식, 건선, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 및 건선성 관절염, 염증성 장 질환, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질환, 루푸스, 재발 협착증, 췌장암, 종양 혈관형성 및 외상성 뇌 손상이 포함된다.
따라서, 중간 전도도의 칼슘 활성화 칼륨 채널 IKCa의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 면역 기능이상, 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재발 협착증, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질환, 및 루푸스를 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명에는 자가면역 질환, 예를 들어 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재발 협착증, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질환, 또는 루푸스가 있는 것으로 진단된 환자에게, 치료적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함으로써, 상기 환자에게서 해당 질환의 한 가지 이상 증상을 경감시키는 것을 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법이 포함된다. "경감된"이란 관심있는 증상이 특정 환자에게서 완전히 소거되거나, 박멸되거나, 제거되거나 또는 예방되는지에 상관없이, 감소, 경량, 저하, 단축, 완화 (즉, 보다 순하게 만듬), 가라앉힘, 진정, 중지, 구제, 무력화 또는 반감시키는 것을 의미한다.
본 발명은 추가로, 기존에 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상을 경험한 적이 있는 환자에게, 예방적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함으로써, 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상이 재발되는 것을 예방하거나 완화시키는 것을 포함하는, 다발성 경화증의 증상 재발을 예방하거나 완화시키는 방법에 관한 것이다.
자가면역 질환을 치료하는 본 발명의 방법 및 다발성 경화증의 증상 재발을 예방하거나 완화시키는 방법을 실시하는데 사용하기 바람직한 본 발명의 화합물은 P (화학식 I에서와 같이 접합됨)로서, Kv1.3 또는 IKCa1 길항제 펩티드, 예를 들어 ShK 펩티드, 0SK1 펩티드, ChTx 펩티드 및/또는 마우로톡신 (MTx) 펩티드, 또는 이들 모두의 펩티드 유사체를 포함한다.
예를 들어, 접합된 ShK 펩티드 또는 ShK 펩티드 유사체는 다음 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
표 2에 제시된 바와 같은 서열 5, 88 내지 200, 548 내지 561, 884 내지 950, 또는 1295 내지 1300.
접합된 OSK1 펩티드 또는 OSK1 펩티드 유사체는 다음 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
표 7에 제시된 바와 같은 서열 25, 294 내지 298, 562 내지 636, 980 내지 1274, GVIINVSCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK (OSK1-S7) (서열 1303), 또는 GVIINVSCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK (OSK1-S7,K16,D20) (서열 1308).
또한 예를 들면, 접합된 MTX 펩티드, MTX 펩티드 유사체, ChTx 펩티드 또는 ChTx 펩티드 유사체는 다음 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
표 13에 제시된 바와 같은 서열 20, 330 내지 343, 1301, 1302, 1304 내지 1307, 1309, 1311, 1312, 또는 1315 내지 1336; 또는 표 14에 제시된 바와 같은 서열 36, 59, 344 내지 346, 또는 1369 내지 1390.
또한 이들 방법에 유용한 것은 다음 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 접합되거나 접합되지 않은 Kv1.3 또는 IKCa1 억제제 독소 펩티드 유사체이다:
표 2에 제시된 바와 같은 서열 88, 89, 92, 148 내지 200, 548 내지 561, 884 내지 949, 또는 1295 내지 1300; 또는 표 7에 제시된 바와 같은 서열 980 내지 1274, GVIINVSCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK (0SK1-S7) (서열 1303), 또는 GVIINVSCKISRQCLKPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK (0SK1-S7,K16,D20)(서열 1308); 또는 표 13에 제시된 바와 같은 서열 330 내지 337, 341, 1301, 1302, 1304 내지 1307, 1309, 1311, 1312, 및 1315 내지 1336.
이들 본 발명의 방법에 따르면, 자가면역 질환, 예를 들어 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재발 협착증, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질환 또는 루푸스가 있는 것으로 진단된 환자, 또는 기존에 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상을 경험한 적이 있는 환자는 자가면역 질환 및 그들의 증상을 잘 알고 있는 당업자 (예를 들어, 의사)에 의해 널리 인식 가능하고/하거나 진단된다.
예를 들어, 다발성 경화증의 증상에는 다음이 포함될 수 있다:
시각 증상, 예를 들어 시신경염 (흐린 시력, 눈 통증, 색맹, 실명); 복시 (겹보임); 눈떨림 (경련성 안구 운동); 안구운동 조절이상 (일정한 저- 또는 과슈팅 안구 운동); 핵간 안근마비 (두 눈 간의 협력 결여, 눈떨림, 복시); 움직임 및 음향 안내 섬광 (안구를 움직이거나 갑작스런 소음에 반응하는 경우의 섬광); 구심성 동공운동장애 (비정상적인 동공 반응);
운동 증상, 예를 들어 부전마비 (paresis), 단부전마비, 하반신 부전마비, 편측 부전마비, 사지 부전마비 (근육 약화 - 부분적 또는 온순한 마비); 마비, 하반신 마비, 편측 마비, 사지 마비 (마비 - 근육 강도의 완전 손실 또는 거의 완전 손실); 경직 (강직, 통증 및 감염된 사지의 제한성 자유 운동을 유발시키는 근육 긴장 상실); 구음 장애 (불명료 언어 및 관련 언어 장애); 근육 위축증 (사용하지 않음으로 인한 근육 폐기); 연축, 경련 (비자발적 근육 수축); 긴장저하, 간대성 경련 (clonus) (자세 장애); 간대성 근경련, 근육잔떨림 (경련성 및 단일수축성 근육, 티크); 하지 불편 증후군 (비자발적 사지 운동, 특히 밤에 성가심); 하수족 (발처짐) (보행시 마루를 따라 발을 끈다); 기능이상성 반사 작용 (MSRs, Babinski's, Hoffman's, Chaddock's);
감각 증상, 예를 들어 지각착오 (부분적 저림, 소양감, 윙윙거림 및 진공 감각); 무감각증 (완전한 저림/감각 상실); 신경통, 신경병증성 및 신경성 통증 (명백한 이유가 없는 통증, 화상, 가려움증 및 전기 자극 감각); 레르미트 증후군 (L'Hermitte's) (전기 쇽 및 머리를 움직일 때 윙윙거리는 감각); 고유감각 기능이상 (신체 일부 위치의 지각 상실); 삼차 신경통 (안면 통증);
협동 및 균형 증상, 예를 들어 운동실조 (협동 상실); 활동 떨림 (미세한 움직임을 수행할 때의 떨림); 운동거리 조절이상 (dysmetria) (일정한 저- 또는 과슈팅 사지 운동); 전정성 운동실조 (내이의 비정상적인 균형 기능); 현기증 (전정성 운동실조로부터 여행병에 대한 민감증/오심/구토); 언어 운동실조 (언어 협동 장애, 말더듬); 근육긴장이상 (느린 사지 위치 피드백); 되풀이운동장애 (dysdiadochokinesia) (예를 들어, 리듬에 따라 움직이기 위해, 신속하게 또 다른 움직임을 만들 수 있는 능력의 상실);
장, 방광 및 성적 증상, 예를 들어 빈번한 배뇨, 방광 경직 (요의 절박 및 실금); 이완 방광, 배뇨근-괄약근 근실조 (배뇨 지연 및 정체); 발기 기능장애 (남성 및 여성 발기부전증); 이상성감증 (오르가즘 달성 불능); 역행성 사정 (방광 내로의 사정); 불감증 (성적으로 흥분하지 못함); 변비 (드물거나 불규칙적인 장 운동); 대변 절박증 (장 절박증); 대변 실금 (장 실금);
인지 증상, 예를 들어 우울증; 인지 기능장애 (단기 및 장기 기억 장애, 건망증, 느린 단어 연상); 치매; 기분 변동, 감정 불안정, 도취감; 양극성 증후군; 불안증; 언어 상실증; 언어 장애 (언어 이해와 생성에 대한 장해); 및
기타 증상, 예를 들어 피로; 유토프 (Uhthoff's) 증상 (중증의 발열 증상 증가); 위식도 역류 (산 역류); 미각 및 후각 손상; 간질성 경련; 삼키기 (swallowing) 장애; 호흡 장애; 및 수면 장애.
상기 열거된 다발성 경화증의 증상들은 단지 예시적이고, 단일 환자 또는 몇 명의 종합 환자가 경험한 가능한 모든 증상 및 본 발명에 관한 철처한 설명으로 간주되지 않는다. 당업자는 각종 임상 증상들과, 개개의 환자들에게 고통을 주고 있는 자가면역 질환 증상들, 및 자가면역 질환을 치료하거나 다발성 경화증의 증상 재발을 예방 또는 완화시키는 본 발명의 방법이 지시하는 증상들을 알고 있다.
자가면역 질환을 치료하거나 다발성 경화증의 증상 재발을 예방 또는 완화시키는 본 발명의 방법에 관여한 치료적 유효량, 예방적 유효량, 및 투여량 섭생은 치료제의 작용을 변형시키는 각종 요인들, 예를 들어 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 치료하고자 하는 질환의 중증도, 투여 시간, 및 기타 임상 요인을 고려하여 담당의에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 1일 투여량 또는 섭생은 체중 1 kg당 비히클-접합된 펩티드 약 1 내지 약 10,000 마이크로그램 (㎍), 바람직하게는 체중 1 kg당 약 1 내지 약 5,000 ㎍, 가장 바람직하게는 체중 1 kg당 약 1 내지 약 1,000 ㎍의 범위여야 한다.
전압 의존형 칼륨 채널 Kv2.1의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 유형 II 당뇨병을 치료할 수 있다.
M 전류의 펩티드 길항제 (예: BeKm-1)를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 알츠하이머병을 치료할 수 있고, 인지력을 증강시킬 수 있다.
전압 의존형 칼륨 채널 Kv4.3의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 알츠하이머병을 치료할 수 있다.
소 전도도의 칼슘 활성화 칼륨 채널의 펩티드 길항제 SKCa를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 간질, 기억, 학습, 신경정신과, 신경학, 신경근육 및 면역 장애, 정신분열병, 양극성 장애, 수면 무호흡, 신경변성, 및 평활근 장애를 치료할 수 있다.
N-유형 칼슘 채널 길항제 펩티드를 혼입한 본 발명의 분자는 통증을 완화시키는데 유용하다. 이러한 활성을 지닌 펩티드 (예: Ziconotide™, ω-코노톡신-MVIIA)가 임상적으로 검증되었다.
T-유형 칼슘 채널 길항제 펩티드를 혼입한 본 발명의 분자는 통증을 완화시키는데 유용하다. 후근절 중의 Cav3.2를 억제시키면 만성 통증을 경감시킬 수 있다는 것을 표시하는 몇 가지 일련의 증거들이 있다. T-유형 칼슘 채널은 DRG 중의 일부 신경세포의 세포체 내에 극도로 높은 수준으로 존재하는데; 이들은 서서히 움직이는 자극을 탐지하도록 적응시킨 기계적 수용체인 것으로 예상되고 [참고: Shin et al., Nature Neuroscience 6:724-730, 2003], T-유형 채널 활성은 돌발 스파이킹에 책임이 있는 것으로 예상된다 [참고: Nelson et al., J Neurosci 25:8766-8775, 2005]. 미베프라딜 (mibefradil) 또는 에토숙시미드 (ethosuximide)에 의한 T-유형 채널의 억제는 신경 손상 [참고: Dogrul et al., Pain 105:159-168, 2003] 또는 화학요법 [참고: Flatters and Bennett, Pain 109:150-161, 2004]에 의해 유도된 동물에게서의 기계적 무해 자극 통증 (allodynia)을 역전시킨다. Cav3.2에 대한 안티센스는 동물에게서의 통증 한계를 증가시키고, DRG에서의 Cav3.2 단백질의 발현을 저하시키지만, Cav3.1 또는 Cav3.3에 대한 안티센스는 그렇치 못하다 [참고: Bourinet et al., EMBO J 24:315-324, 2005]. 유사하게, 국소 주사된 환원제는 통증을 유발시키고 Cav3.2 전류를 증가시키며, 산화제는 통증을 저하시키고 Cav3.2 전류를 억제시키며, 말초 투여된 뉴로스테로이드는 진통제이며 DFR로부터의 T-유형 전류를 억제한다 [참고: Todorovic et al., Pain 109:328-339, 2004; Pathirathna et al., Pain 114:429-443, 2005]. 따라서, DRG 신경세포의 세포체 중의 Cav3.2를 억제하면, 만성 통증 상태와 연관된 이들 신경세포의 반복적 스파이킹을 억제할 수 있는 것으로 여겨진다.
L-유형 칼슘 채널 길항제 펩티드를 혼입한 본 발명의 분자는 고혈압을 치료하는데 유용하다. 이러한 활성을 지닌 소분자 (예: DHP)가 임상적으로 검증되었다.
Nav1 (TTXs-유형) 채널의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 통증을 경감시킬 수 있다. 이러한 활성을 지닌 국소 마취제 및 트리사이클릭 항우울제가 임상적으로 검증되었다. 이러한 본 발명의 분자는 근육 이완제로서 특히 유용할 수 있다.
Nav1 (TTXR-유형) 채널의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 신경 및/또는 조직 손상으로부터 유발된 통증을 경감시킬 수 있다.
신경교 및 상피 세포 Ca2+-활성화 클로라이드 채널의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 암 및 당뇨병을 치료할 수 있다.
NMDA 수용체의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 통증, 간질, 뇌 및 척수 손상을 치료할 수 있다.
니코틴성 수용체의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 근육 이완제로서 사용할 수 있다. 이러한 분자를 사용하여 통증, 위장 운동 장애, 뇨실금, 니코틴 중독 및 기분 장애를 치료할 수 있다.
5HT3 수용체의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 오심, 통증 및 불안증을 치료할 수 있다.
노르에피네프린 수송인자의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 통증, 우울증, 학습 장애, 기억 장애 및 뇨실금을 치료할 수 있다.
뉴로텐신 (Neurotensin) 수용체의 펩티드 길항제를 혼입한 본 발명의 분자를 사용하여 통증을 치료할 수 있다.
치료적 용도 이외에도, 본 발명의 화합물은 관심있는 그들의 연합 단백질의 이상기능을 특징으로 하는 질병을 진단하는데 유용할 수 있다. 한 가지 양태에서, 특정 생물학적 샘플 중에서, 활성화될 수 있는 관심있는 단백질 (예: 수용체)를 탐지하는 방법은 (a) 상기 샘플을 본 발명의 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 본 발명의 화합물에 의해 관심있는 단백질의 활성화를 탐지하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플에는 조직 표본, 본래 세포 또는 그의 추출물이 포함된다. 본 발명의 화합물은 생물학적 샘플 중에서 관심있는 그들의 연합 단백질의 존재 여부를 탐지하기 위한 진단 키트의 일부로서 사용할 수 있다. 이러한 키트는 탐지를 가능케 하는 표지가 부착된 본 발명의 화합물을 이용한다. 이러한 화합물은 관심있는 정상적 또는 비정상적 단백질을 확인하는데 유용하다.
본 발명의 치료적 방법, 조성물 및 화합물은 또한, 질병을 치료하는데 있어서 단독으로 이용할 수 있거나 또는 기타 분자와 병용해서 이용할 수 있다.
제약 조성물
일반적: 본 발명은 또한, 본 발명의 화합물과 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 광범위한 전달 경로, 예를 들어 혈관내 전달 경로, 예를 들면 주사 또는 주입, 피하, 근육내, 복강내, 경막, 또는 수막강내 전달 경로, 또는 경구, 경장, 폐 (예: 흡입제), 비내, 경점막 (예: 설하 투여), 경피 또는 당해 분야에 공지된 기타 전달 경로 및/또는 투여 형태에 의해 환자에게 투여하도록 형상화할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 액상 형태로 제조할 수 있거나, 또는 건조된 분말 형태, 예를 들어 동결건조 형태로 제조할 수 있다. 경구 또는 경장용인 경우에는, 본 발명의 제약 조성물을 예를 들어, 정제, 트로키제, 로젠지, 수성 또는 오일상 현탁제, 분산성 산제 또는 과립제, 에멀션, 경질 또는 연질 캅셀제, 시럽, 엘릭서제 또는 소화관 영양처방제로서 형상화할 수 있다.
본 발명을 실시하는데 있어서, "제약상 허용 가능한 담체"는 제약 조성물을 제형화하는데 유용한 분야의 업자에게 공지된, 생리적으로 관용된 모든 물질이며, 이에는 모든 제약상 허용 가능한 희석제, 부형제, 분산제, 결합제, 충진제, 활탁제, 항마찰제, 압축 보조제, 정제-붕해제 (붕해제), 현탁제, 윤활제, 향미제, 방향제, 감미제, 투과 또는 침투 증강제, 방부제, 계면활성제, 가용화제, 유화제, 증점제, 아주반트, 염료, 피복제, 피막화제, 및/또는 기타 부가제 단독 또는 조합물이 포함된다. 이러한 제약 조성물은 각종 완충제 함량 (예: 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 부가제, 예를 들어 세정제 및 가용화제 [예: 트윈 (Tween®) 80, 폴리솔베이트 80], 항산화제 (예: 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 방부제 [예: 티메르솔 (Thimersol®), 벤질 알코올] 및 벌크 물질 (예: 락토스, 만니톨)을 포함할 수 있고; 상기 물질을 중합체성 화합물, 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립 제제 내로 혼입하거나 또는 리포솜 내로 혼입할 수 있다. 히알루론산을 사용할 수도 있고, 이는 순환시 약물 지속 기간을 증진시키는 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다 [참고: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 상기 조성물은 액상 형태로 제조될 수 있거나, 또는 건조 분말, 예를 들어 동결건조 형태로 제조될 수 있다. 이식 가능한 지속 방출 제형이 또한, 경피 또는 경점막 제형으로서 유용하다. 부가적으로 (또는 또 다른 한편), 본 발명은 당업자에게 공지된 각종 서방출 또는 지속 방출 제형이나 미립자 제형, 예를 들어 폐, 비내 또는 피하 전달 경로를 통하여 투여할 수 있는 지속 방출 미립자 제형에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
불활성 물질을 사용하여 본 발명의 화합물을 희석시킬 수 있거나 본 발명의 제약 조성물의 용적을 증가시킬 수 있다. 이러한 희석제에는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 슈크로스, 개질 덱스트란 및 전분이 포함될 수 있다. 특정의 무기 염을 충진제로서 사용할 수도 있는데, 이에는 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨이 포함된다. 몇몇 시판용 희석제는 패스트-플로 (Fast-Flo), 엠덱스 (Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스 (Emcompress) 및 아비셀 (Avicell)이다.
통상적인 각종 증점제가 본 발명의 제약 조성물의 크림, 연고, 좌제 및 겔 형상에 유용하고, 예를 들어 알지네이트, 크산탄 검 또는 광유를 이러한 본 발명의 제약 조성물의 형상에 이용할 수도 있다. 침투 또는 투과 증강제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 디메틸 설폭시드, N-비닐-2-피롤리돈, N-(2-히드록시에틸)-피롤리돈, 또는 3-히드록시-N-메틸-2-피롤리돈을 이용할 수도 있다. 히드로겔 매트릭스를 생성시키는데 유용한 기술은 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Feijen, Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents, U.S. Patent No.4,925,677; Shah et al., Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents, WO 00/38651 A1]. 이러한 생분해성 겔 매트릭스는, 예를 들어 단백질성 성분과 다당류 또는 점액성 다당류 성분을 가교결합시킨 다음, 전달하고자 하는 본 발명의 화합물을 부하함으로써 형성시킬 수 있다.
멸균성 용제 또는 현탁제인 본 발명의 액상 제약 조성물은, 예를 들어 근육내, 수막강내, 경막, 혈관내 (예를 들어, 정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 피하 주사함으로써 환자에게 투여할 수 있다 [참고: 예를 들어, Goldenberg et al., Suspensions for the sustained release of proteins, U.S. Patent No. 6,245,740 and WO 00/38652 A1]. 멸균성 용제를 정맥내 주입함으로써 투여할 수도 있다. 본 발명의 화합물은 멸균성 수, 식염수, 완충 식염수 또는 기타 적당한 멸균성 주사용 매질을 사용하여 환자에게 투여하기 전에 편리한 시간에 용해 또는 현탁시킬 수 있는 멸균성 고형 제약 조성물 (예: 동결건조 분말)로 포함될 수 있다.
이식 가능한 지속 방출 제형이 본 발명의 제약 조성물의 유용한 양태이기도 하다. 예를 들어, 채내에 이식되거나 인간 또는 비-인간 척추동물의 피부 아래에 이식된 생분해성 매트릭스인 제약상 허용 가능한 담체는 상기 언급된 바와 유사한 히드로겔일 수 있다. 또 다른 한편으론, 폴리-알파-아미노산 성분으로부터 형성될 수 있다 [참고: Sidman, Biodegradable, implantable drug delivery device, and process for preparing and using same, U.S. Patent No. 4,351,337]. 약물 전달용 이식물의 기타 제조 기술 또한 공지되어 있고, 본 발명에 따라서 유용하다.
분말 형태에서는, 제약상 허용 가능한 담체가 미분된 고형물이고, 이는 미분된 활성 성분들 (본 발명의 화합물 포함)과 혼합된다. 예를 들어, 몇몇 양태에서 분말 형태는 본 발명의 제약 조성물이 흡입제로서 형상화된 경우에 유용하다 [참고: 예를 들어, Zeng et al., Method of preparing dry powder inhalation compositions, WO 2004/017918; Trunk et al., Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them, U.S. Patent No. 6,900,317].
불활성 물질을 사용하여 본 발명의 화합물의 용적을 증가 또는 희석시킬 수 있다. 이들 희석제에는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 슈크로스, 개질 덱스트란 및 전분이 포함될 수 있다. 특정의 무기 염을 충진제로서 사용할 수도 있는데, 이에는 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨이 포함된다. 몇몇 시판용 희석제는 패스트-플로 (Fast-Flo™), 엠덱스 (Emdex™), STA-Rx™ 1500, 엠콤프레스 (Emcompress™) 및 아비셀 (Avicell™)이다.
붕해제가 본 발명의 제약 조성물의 제형에 포함되어 고형 투여 형태를 만들 수 있다. 붕해제로서 사용된 물질에는 전분에 기초한 시판용 붕해제 엑스플로탑 (Explotab™)를 포함한 전분이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 나트륨 전분 글리콜레이트, 앰버라이트 (Amberlite™), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 울트라밀로펙틴, 나트륨 알지네이트, 젤라틴, 오렌지 필, 산 카복시메틸 셀룰로스, 천연 스폰지 및 벤토나이트를 모두 사용할 수 있다. 불용성 양이온성 교환 수지는 또 다른 형태의 붕해제이다. 분말형 검을 붕해제 및 결합제로서 사용할 수 있고, 이들에는 분말형 검, 예를 들어 한천, 카라야 또는 트라가칸드 검이 포함될 수 있다. 알진산 및 그의 나트륨 염이 또한 붕해제로서 유용하다.
결합제를 사용하여 치료제를 묶어 놓아 경질 정제를 형성시킬 수 있고, 이에는 천연 생성물로부터의 물질, 예를 들어 아카시아, 트라가칸드, 전분 및 젤라틴이 포함된다. 기타에는 메틸 셀룰로스 (MC), 에틸 셀룰로스 (EC) 및 카복시메틸 셀룰로스 (CMC)가 포함된다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC) 둘 다가 알코올성 용액에 사용되어 치료제를 과립화할 수 있었다.
항마찰제가 치료제의 제형에 포함되어 해당 제형화 공정 동안의 부착을 방지할 수 있다. 윤활제를 치료제와 다이 벽 간의 특정 층으로서 사용할 수 있고, 이에는 스테아르산 (그의 마그네슘 및 칼슘 염 포함), 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액상 파라핀, 식물성 오일 및 왁스가 포함될 수 있지만, 그에 제한되지 않는다. 가용성 윤활제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카보왁스 (Carbowax) 4000 및 6000을 사용할 수도 있다.
제형화 동안 약물의 유동성을 개선시킬 수 있고 압축 동안 재배열을 보조할 수 있는 활탁제를 부가할 수도 있다. 활탁제에는 전분, 탈크, 발열원성 실리카 및 수화 실리코알루미네이트가 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물을 수성 환경 내로 용해시키는 것을 보조하기 위해, 계면활성제를 습윤제로서 부가할 수도 있다. 계면활성제에는 음이온성 세정제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트가 포함될 수 있다. 양이온성 세정제를 사용할 수 있고, 이에는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드가 포함될 수 있었다. 해당 제형 내에 계면활성제로서 포함될 수 있는 잠재적 비이온성 세정제의 목록은 라우로매크로졸 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 40, 60, 65 및 80, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스이다. 이들 계면활성제는 본 발명의 단백질 또는 유도체의 제형에 단독으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.
경구 투여 형태: 본 발명의 화합물의 경구 투여 형태가 또한 유용하다. 필요한 경우, 경구 전달이 유효하도록 본 발명의 화합물을 화학적으로 변형시킬 수 있다. 일반적으로, 고려된 화학적 변형은 하나 이상의 부분을 분자 자체에 부착시키는 것인데, 이러한 부분은 (a) 단백질 분해를 억제시킬 수 있고; (b) 위 또는 장으로부터 혈류 내로의 흡수를 가능하게 해준다. 또한, 화합물의 전반적인 안정성을 증가시키고 체내 순환 시간을 증가시키는 것이 요망된다. 본 발명에서 공유적으로 부착된 반감기 연장성 부분으로서 유용한 부분을 이러한 목적에 사용할 수도 있다. 상기 부분의 예에는 PEG, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린이 포함된다 [참고: 예를 들어, Abuchowski and Davis (1981), Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (Hocenberg and Roberts, eds.), Wiley-lnterscience, New York, NY, pp 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9]. 사용될 수 있는 기타 중합체는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이다. 상기 나타낸 바와 같은 제약용으로 바람직한 것은 PEG 부분이다.
경구 전달 투여 형태의 경우, 본 발명의 치료적 화합물의 흡수를 증강시키기 위한 담체로서 변형된 지방족 아미노산의 염, 예를 들어 나트륨 N-(8-[2-히드록시벤조일]아미노)카프릴레이트 (SNAC)를 사용하는 것이 또한 가능하다. SNAC를 이용한 헤파린 제형의 임상 효능은 에미스피어 테크놀로지 (Emisphere Technologies)에 의해 수행된 제II상 시험에서 입증되었다 [참고: 미국 특허 제5,792,451호, "Oral drug delivery composition and methods"].
한 양태에서, 제약상 허용 가능한 담체는 액상일 수 있고, 제약 조성물은 용제, 현탁제, 에멀션, 시럽, 엘릭서제 또는 가압 조성물의 형태로 제조한다. 활성 성분(들) (예: 본 발명의 화합물)을 제약상 허용 가능한 액상 담체, 예를 들어 물, 유기 용매, 둘 다의 혼합물, 또는 제약상 허용 가능한 오일 또는 지방에 용해, 희석 또는 현탁시킬 수 있다. 액상 담체는 기타 적합한 제약 부가제, 예를 들어 세정제 및/또는 가용화제 (예: 트윈 80, 폴리솔베이트 80), 유화제, 적당한 pH의 완충제 (예: 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 아주반트, 항산화제 (예: 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 방부제 (예: 티메르솔, 벤질 알코올), 감미제, 향미제, 현탁제, 증점제, 벌크 물질 (예: 락토스, 만니톨), 착색제, 점도 조절제, 안정화제, 전해질, 삼투질 또는 삼투 조절제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물의 흡수를 증강시키기 위한 부가제가 당해 제형에 포함될 수도 있다. 이러한 특성을 잠재적으로 지니고 있는 부가제는, 예를 들어 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이다.
그의 전문이 본원에 참고로 도입된 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 상기 참고, in Chapter 89]에 일반적으로 기재되어 있는 경구 고형 투여 형태가 유용하다. 고형 투여 형태에는 정제, 캅셀제, 환제, 트로키제 또는 로젠지, 교갑 또는 펠릿이 포함된다. 또한, 리포솜성 또는 단백질유사체 피막화를 이용하여 본 발명의 화합물을 제형화할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,925,673호에 보고된 단백질유사체 미소구로서 제형화한다). 리포솜성 피막화를 사용할 수 있고, 리포솜을 각종 중합체로 유도체화할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,013,556호]. 치료제에 대한 가능한 고형 투여 형태에 관한 설명이 다음 문헌에 제시되었다 [참고: Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes, in Chapter 10; 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 일반적으로, 본 발명의 제형은 본 발명의 화합물과, 위 환경으로부터 보호해줄 수 있고 생물학적 활성 물질을 장에서 방출시킬 수 있는 불활성 성분을 포함할 것이다.
본 발명의 화합물은 입자 크기가 약 1 mm인 펠릿 또는 과립 형태의 미세 다중미립자로서 제형 내에 포함될 수 있다. 캡슐 투여하기 위한 물질의 제형은 분말, 약한 수준으로 압축된 플러그 또는 심지어 정제로서 존재할 수도 있다. 치료제를 압축에 의해 제조할 수 있다.
착색제 및 향미제를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 (또는 유도체)를 (예를 들어, 리포솜 또는 미소구 피막화에 의해) 제형화할 수 있고, 이어서 식용 제품, 예를 들어 착색제와 향미제를 함유하는 냉장 음료 내에 추가로 함유시킬 수 있다.
정제 형태에서는, 활성 성분(들)을, 필요한 압축 특성을 지닌 제약상 허용 가능한 담체와 적합한 비율로 혼합하고, 목적하는 외형과 크기로 압착시킨다. 산제 및 정제는 바람직하게 활성 성분을 99% 이하 함유한다. 적합한 고형 담체에는, 예를 들어 인산칼슘, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 저 용융 왁스 및 이온 교환 수지가 포함된다.
제어 방출 제형이 요망될 수 있다. 본 발명의 화합물은 확산 또는 침출 기전에 의한 방출을 허용해주는 불활성 매트릭스 (예: 검) 내로 혼입할 수 있다. 느린 변성 매트릭스, 예를 들어 알지네이트, 다당류를 제형 내로 혼입할 수도 있다. 본 발명의 화합물의 또 다른 형태의 제어 방출은 오로스 (Oros™) 치료 시스템 (공급처: Alza Corp.)에 기초한 방법에 의한 것인데, 즉 물을 유입시켜 주고 삼투 효과로 인해 단일 소 개구를 통하여 약물을 밀어내게 해주는 반투과성 막에 해당 약물을 봉입시킨다. 몇몇 장내 피복재가 지연 방출 효과를 나타내기도 한다.
기타 피복제를 제형에 사용할 수 있다. 이에는 피복 팬에 적용될 수 있는 각종 당이 포함된다. 치료제가 필름-피복 정제에 제공될 수도 있고, 이러한 경우에 사용된 물질은 2가지 군으로 나뉜다. 첫 번째 군은 비-장내 물질이고, 이에는 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 메틸히드록시-에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필-메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 두 번째 군은 장내 물질로 이루어지고, 이는 통상적으로 프탈산의 에스테르이다.
물질 혼합물을 사용하여 최적의 필름 피복을 제공할 수도 있다. 필름 피복은 팬 피복기 또는 유동층에서, 또는 압축 피복에 의해 수행할 수 있다.
폐 전달 형태: 본 발명의 화합물을 폐 전달하는 것이 또한 유용하다. 단백질 (또는 유도체)는 흡입하는 동안 포유류의 폐로 전달되어 폐 상피 내막을 가로질로 혈류 내로 전달된다. 이에 관한 기타 보고서로는 다음 문헌이 있다 [참고: Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (leuprolide acetate); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl.5): s.143-146 (endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (α1-antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (α1-proteinase); Oswein et al. (March 1990), "Aerosolization of Proteins," Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (recombinant human growth hormone); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferon-γ and tumor necrosis factor α) and Platz et al., U.S. Patent No.5,284,656 (granulocyte colony stimulating factor)].
본 발명의 실시에 유용한 것은 치료 제품을 폐 전달하기 위해 설계된 광범위한 기계적 장치인데, 이에는 분무기, 계량식 흡입기, 및 분말 흡입기가 포함되지만 그에 제한되지 않고, 이들 모두는 당업자에 잘 알려져 있다. 본 발명의 실시에 적합한 시판용 장치의 몇몇 구체적 예는 울트라벤트 (Ultravent) 분무기 [공급처: Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri]; 아코른 (Acorn) II 분무기 [공급처: Marquest Medical Products, Englewood, Colorado]; 벤톨린 (Ventolin) 계량식 흡입기 [공급처: Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina]; 및 스핀홀러 (Spinhaler) 분말 흡입기 [공급처: Fisons Corp., Bedford, Massachusetts]이다 [참고: 예를 들어, Helgesson et al., Inhalation device, U.S. Patent No.6,892,728; McDerment et al., Dry powder inhaler, WO 02/11801 A1; Ohki et al., Inhalant medicator, U.S. Patent No. 6,273,086].
이러한 장치 모두는 본 발명의 화합물을 투약하는데 적합한 제형을 사용해야 한다. 전형적으로, 각 제형은 이용된 장치의 유형에 대해 특이적이고, 요법에 유용한 희석제, 아주반트 및/또는 담체 이외의 적당한 추진체 물질을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물을 말단부 폐까지 가장 효과적을 전달하기 위해서는, 가장 유리하게는 평균 입자 크기가 10 ㎛ (또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎛인 미립자 형태로 제조해야 한다.
제약상 허용 가능한 담체에는 탄수화물, 예를 들어 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 슈크로스, 락토스 및 솔비톨이 포함된다. 제형에 사용하기 위한 기타 성분에는 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC가 포함될 수 있다. 천연 또는 합성 계면활성제를 사용할 수 있다. (단백질 또는 유사체를 유도체화하는데 있어서의 그의 용도와는 별도로) PEG를 사용할 수도 있다. 덱스트란, 예를 들어 시클로덱스트란을 사용할 수 있다. 담즙 염 및 기타 관련 증강제를 사용할 수 있다. 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체를 사용할 수 있다. 아미노산을 사용할 수 있는데, 예를 들어 완충제 제형에 사용할 수 있다.
또한, 리포솜, 미소캡슐 또는 미소구, 봉입 복합체, 또는 기타 유형의 담체가 고려된다.
제트식 또는 초음파 분무기와 함께 사용하기 적합한 제형은 전형적으로, 용액 1 ml당 생물학적 활성 단백질 약 0.1 내지 25 mg의 농도로 수중 용해된 본 발명의 화합물을 포함할 것이다. 상기 제형은 완충제 및 단당류 (예를 들어, 단백질 안정화 및 삼투압 조절를 위함)을 포함할 수도 있다. 분무기 제형은 에어로솔을 형성시키는데 있어서 용액을 분무함으로써 야기된 단백질의 표면 유도된 응집을 저하시키거나 방지하기 위해 계면활성제를 함유할 수도 있다.
계량식 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 제형은 일반적으로, 계면활성제의 보조 하에 추진체에 현탁된 본 발명의 화합물을 함유하는 미분된 분말을 포함할 것이다. 이러한 추진체는 상기 목적을 위해 이용되고 있는 통상적인 모든 물질일 수 있는데, 예를 들면 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본, 또는 히드로카본, 예를 들어 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올, 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 그의 조합물이 있다. 적합한 계면활성제에는 솔비탄 트리올레에이트 및 콩 레시틴이 포함된다. 올레산이 계면활성제로서 유용할 수도 있다 [참고: 예를 들어, Backstrom et al., Aerosol drug formulations containing hydrofluoroalkanes and alkyl saccharides, U.S. Patent No. 6,932,962].
분말 흡입기 장치로부터 투여되는 제형은 본 발명의 화합물을 함유하는 미분된 건조 분말을 포함할 것이고, 이는 벌크제, 예를 들어 락토스, 솔비톨, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 크실리톨을, 해당 장치로부터 분말의 투여를 촉진시키는 양, 예를 들면 제형의 50 내지 90중량%으로 포함할 수도 있다.
비내 전달 형태: 본 발명에 따라서, 생성물을 폐에 침착시킬 필요없이 코 내부로의 투여 직후 혈류로 통과할 수 있게 해주는, 본 발명의 화합물 및/또는 제약 조성물의 비내 전달이 유용하다. 비내 투여에 적합한 제형에는 덱스트란 또는 시클로덱스트란을 수반한 제형이 포함되고, 비내 전달 장치는 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Freezer, Inhaler, U.S. Patent No.4,083,368].
경피 및 경점막 (예를 들어, 볼내) 전달 형태: 몇몇 양태에서, 본 발명의 화합물은 제약상 허용 가능한 경피 또는 경점막 패치 또는 트로키제의 일부로서 형상화된다. 경피 패치 약물 전달 시스템, 예를 들어 매트릭스 유형 경피 패치가 공지되어 있고, 이는 본 발명의 제약 조성물의 몇몇 양태를 실시하는데 유용하다 [참고: 예를 들어, Chien et al., Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process, U.S. Patent Nos. 4,906,169 and 5,023,084; Cleary et al., Diffusion matrix for transdermal drug administration and transdermal drug delivery devices including same, U.S. Patent No. 4,911,916; Teillaud et al., EVA-based transdermal matrix system for the administration of an estrogen and/or a progestogen, U.S. Patent No. 5.605,702; Venkateshwaran et al., Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid, U.S. Patent No. 5,783,208; Ebert et al., Methods for providing testosterone and optionally estrogen replacement therapy to women, U.S. Patent No.5,460,820]. 치료제를 경점막 전달하기 위한 각종 제약상 허용 가능한 시스템이 또한 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 실시에 적합하다 [참고: 예를 들어, Heiber et al., Transmucosal delivery of macromolecular drugs, U.S. Patent Nos. 5,346,701 and 5,516,523; Longenecker et al., Transmembrane formulations for drug administration, U.S. Patent No. 4,994,439].
본 발명의 화합물의 볼내 전달이 또한 유용하다. 볼내 전달 제형은 펩티드와 함께 사용하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 구강 점막 (예를 들어, 설하 점막)을 통하여 약물을 전달하도록 형상화된 공지된 정제 또는 패치 시스템에는 약물, 침투 증강제, 예를 들어 담즙 염 또는 푸시데이트, 및 친수성 중합체, 예를 들어 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 덱스트란, 펙틴, 폴리비닐 피롤리돈, 전분, 젤라틴, 또는 상기 목적에 유용한 것으로 공지된 기타 수 많은 중합체를 함유하는 내부 층을 포함하는 몇몇 양태가 포함된다. 이러한 내부 층의 한 표면은 구강의 습윤 점막 조직과 접촉하여 이에 부착하도록 적응시키고, 그 반대 표면은 덮고 있는 비-부착성 불활성 층에 부착될 수 있다. 임의로, 이러한 경점막 전달 시스템은 이층 정제 형태일 수 있는데, 내부 층은 부가의 결합제, 향미제 또는 충진제를 함유하기도 한다. 몇몇 유용한 시스템은 비이온성 세정제를 침투 증강제와 함께 이용한다. 경점막 전달 장치는 자유 형태, 예를 들어 크림, 젤 또는 연고일 수 있거나, 또는 정제, 패치 또는 트로키제 등의 결정적 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 전달은, 예를 들면 부착 층, 이면 층, 본 발명의 화합물을 함유하는 저장고를 한정하는 침투 가능한 막, 막의 기저가 되는 박리 실 (peel seal) 디스크, 하나 이상의 열 실, 및 제거 가능한 방출 라이너의 적층식 복합체를 포함하는 경점막 전달 시스템을 통해서 이루어질 수 있다 [참고: 예를 들어, Ebert et al., Transdermal delivery system with adhesive overlay and peel seal disc, U.S. Patent No. 5,662,925; Chang et al., Device for administering an active agent to the skin or mucosa, U.S. Patent Nos. 4,849,224 and 4,983,395]. 이들 예는 이용 가능한 경점막 약물 전달 기술을 단지 예시한 것이고, 이로써 본 발명이 제한되지 않는다.
투여량: 상기 언급된 질환을 치료하는 방법에 관여하는 투여량 섭생은 약물 작용을 변형시키는 각종 요인들, 예를 들어 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 모든 감염의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상 요인을 고려하여 담당의에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 1일 섭생은 체중 1 kg 당 본 발명의 화합물 0.1 내지 1000 마이크로그램, 바람직하게는 0.1 내지 150 마이크로그램의 범위여야 한다.
상기 언급된 화합물은 다음에 기재되는 바와 같이 제조할 수 있다. 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되서는 안된다.
실시예 1
Fc-L10-ShK[1-351] 포유류 발현
Fc-L1O-ShK[1-35]는 Kv1.3의 억제제인 "Fc-2xL-ShK[1-35]"로서 지칭되기도 한다. Kv1.3 억제제 펩티드 ShK[1-35]의 단량체 및 링커 서열과 동일 프레임 내에서 융합된 인간 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 DNA 서열을 다음에 기재된 바와 같이 구축하였다. 포유류 세포 (HEK 293 및 중국산 햄스터 난소 세포)로부터의 펩티보디를 발현 및 정제하는 방법은 본원에 기재되었다.
발현 벡터 pcDNA3.1(+)CMVi (도 13A)는 pcDNA3.1(+) 중의 MluI와 HindIII 간의 CMV 프로모터를 CMV 프로모터 플러스 인트론 (공급처: Invitrogen)으로 대체시킴으로써 구축하였다. 발현 벡터 pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB (도 13B)는 5' 코작 (Kozak) 서열, 신호 펩티드, 및 HindIII-NotI 분해된 pcDNA3.1(+)CMVi의 큰 단편과의 인간 Fc-링커-ActivinRIIB 융합 단백질을 함유하는 HindIII-NotI 분해된 PCR 생성물을 클로닝함으로써 생성시켰다. pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB 중의 인간 IgG1 Fc 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 도 3에 도시되었다. 상기 벡터는 BamHI 부위에 의해 분할된 GGGGSGGGGS ("L10"; 서열 79) 링커를 가짐으로써, 하기 올리고를 사용하여 최종 Fc-L1O-ShK[1-35] 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (도 14 및 서열 77 및 서열 78)에 대한 ShK[1-35] 펩티드와 Fc 간의 10개 아미노산 링커를 형성할 수 있게 하였다 (도 14 참고).
Fc-L1O-ShK[1-35] 발현 벡터는 2개의 정지 코돈을 수반하는 4개 글리신 및 1개 세린 아미노산 링커 (본원에서 소문자는 L-형태 아미노산 잔기의 링커 서열을 나타낸다)와 연결되고 다음에 제시된 바와 같은 BamHI 및 NotI 제한 부위에 의해 플랭킹된 완전한 길이의 ShK 유전자를 생성시키기 위한 PCR 전략을 이용하여 구축하였다:
다음에 표시된 바와 같은 서열을 수반한 2개의 올리고를 94℃-30초, 50℃-30초, 및 72℃-1분 하에 30주기 동안 헤르쿨라세 (Herculase™) 폴리머라제 (공급처; Stratagene)를 이용한 PCR 반응에 사용하였다.
이로써 생성된 PCR 생성물은 1% 아가로스 겔 상에서 150 bp 밴드로서 용해되었다. 이러한 150 bp PCR 생성물을 BamHI 및 NotI (공급처: Roche) 제한 효소로 분해시키고, 겔 정제용 키트 (공급처: Qiagen)에 의해 아가로스 겔 정제하였다. 이와 동시에, pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB 벡터 (도 13B)를 BamHI 및 NotI 제한 효소로 분해시키고, 큰 단편을 겔 정제용 키트에 의해 정제하였다. 이와 같이 겔 정제된 PCR 단편을 상기 정제된 큰 단편에 연결시키고, XL-1blue 세균 (공급처: Stratagene) 내로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 세균성 집락으로부터 DNAs를 분리하고, BamHI 및 NotI 제한 효소로 분해시킨 다음, 1% 아가로스 겔 상에서 용해시켰다. 예상 패턴을 나타내는 DNAs을 서열 분석용으로 제출하였다. 클론의 몇 가지 서열을 분석한 결과 상기 서열과의 100% 정합물이 산출되긴 하였지만, 단지 1개의 클론 만이 대규모 플라스미드 정제를 위해 선별되었다. pcDNA3.1(+)CMVi 클론 중의 Fc-2xL-ShK로부터의 DNA를 재서열 분석하여 Fc와 링커 영역을 확증하였고, 상기 서열은 도 14에 도시되어 있는 예측 암호화 서열과 100% 동일하였다.
pcDNA3.1(+)CMVi 단백질 중의 Fc-2xL-ShK[1-35]의 일시적 형질감염 발현에 사용된 HEK-293 세포를, DMEM 고 글루코스 (공급처: Gibco), 10% 태아 소 혈청 (FBS; 공급처: Gibco) 및 1X 비-필수 아미노산 (NEAA; 공급처: Gibco)을 함유하는 성장 배지에서 배양하였다. 페놀/클로로포름 추출시킨 pcDNA3.1(+)CMVi 플라스미드 중의 5.6 ㎍의 Fc-2xL-ShK[1-35]를, 푸젠 (Fugene) 6 (공급처: Roche)을 이용하여 HEK-293 세포 내로 형질감염시켰다. 세포를 24시간 동안 회수한 다음, DMEM 고 글루코스 및 1x NEAA 배지에 48시간 동안 놓아두었다. 센트리프렙 (Centriprep) YM-10 필터 (공급처: Amicon)을 통하여 30 ml를 수행함으로써 적응용 배지를 50배 농축시키고, 센트리콘 (Centricon) YM-10 필터 (공급처: Amicon)에 의해 추가로 농축시켰다. 각종 양의 농축 배지를 자가 4x 부하 완충액 (B-머캅토에탄올을 수반하지 않음)와 혼합하고, 10 ㎕의 벤크마크 (BenchMark) 예비염색된 단백질 래더 (공급처: Invitrogen)와 함께 5x 탱크 완충 용액 (0.123 트리스 기제, 0.96 M 글리신) 중에서 2시간 동안 101 V/46 mA 하의 노벡스 엑셀 (Novex Xcell) II 장치를 이용하여 노벡스 4-20% 트리스-글리신 겔 상에서 전기영동하였다. 이어서, 상기 겔을 전기블롯 (Electroblot) 완충액 (35 mM 트리스 기제, 20% 메탄올, 192 mM 글리신)에 30분 동안 침지시켰다. 노벡스로부터의 PVDF 막 (Cat. No. LC2002, 0.2 ㎛ 공극 크기)를 메탄올에 30분 동안 침지시켜 PVDF를 활성화시키고, 탈이온수로 세정한 다음, 전기블롯 완충액에 침지시켰다. 예비-침지된 겔을, 40 mA 하에 2시간 동안 제조업자의 지시 (Novex)에 따라서 엑셀 II 블롯 모듈을 사용하여 PVDF 막에 블롯팅하였다. 그 다음, 상기 블롯을 먼저, 실온에서 1시간 동안 트리스 완충 식염수 용액 pH 7.5 (TBS) 중의 5% 우유 (Carnation)에 침지시키고, 실온에서 2시간 진탕시키는 동안 0.1% 트윈-20 (공급처: TBST Sigma) 및 1% 우유 완충액의 HRP-접합된 뮤린 항-인간 Fc 항체 (공급처: Zymed Laboratores Cat, no. 05-3320)와 함께 TBS 중에서 1:500 희석률로 항온 배양하였다. 이어서, 상기 블롯을 실온에서 세척당 15분 동안 TBST 중에서 3회 세척하였다. 제조업자의 지시에 따라서 아머샴 파마시아 바이오텍 (Amersham Pharmacia Biotech's) ECL 웨스턴 블롯팅 탐지 시약을 사용하여 일차 항체를 탐지하였다. ECL 탐지시, 웨스턴 블롯 분석은 비-환원성 겔 조건 하에서 예상 크기가 66 kDa이라고 표시하였다 (도 24A).
Fc-L10-ShK[1-35] 단백질의 안정한 발현에 사용된 AM1 CHOd- (공급처: Amgen Proprietary) 세포를, DMEM 고 글루코스, 10% 태아 소 혈청, 1x 히포크산틴/티미딘 (HT; 공급처: Gibco) 및 1X NEAA를 함유하는 AM1 CHOd- 성장 배지에서 배양하였다. 6.5 ㎍의 pcDNA3.1(+)CMVi-Fc-ShK 플라스미드를, 푸젠 6을 사용하여 AM1 CHOd- 세포 내로 형질감염시켰다. 그 다음날, 이와 같이 형질감염시킨 세포를 20개의 15 cm 디쉬에 놓아두고, DMEM 고 글루코스, 10% FBS, 1x HT, 1x NEAA 및 제네티신 (Geneticin) (800 ㎍/mi G418; 공급처: Gibco)를 이용하여 13일 동안 선별하였다. 48개 생존 집락을 2개의 24-웰 판으로 골라내었다. 상기 판을 1주 동안 성장시킨 다음, 동결시키기 위해 복제시켰다. 각 판 한 세트를 48시간 동안 10% PBS를 수반하지 않은 AM1 CHOd- 성장 배지에 옮기고, 적응용 배지를 수거하였다. 동일한 항-인간 Fc 항체에 의한 탐지를 나타내는 일시적 웨스턴 블롯 분석과 유사한 웨스턴 블롯 분석을 사용하여, 안정한 CHO 클론을 발현하는 것을 알아보기 위해 15 ㎕의 적응용 배지를 스크리닝하였다. 48개의 안정한 클론 중에서, 50% 초과가 예상 크기 66 kDa에서 ShK 발현을 나타내었다. 일차 클론 BB6에 대한 백업으로서 BD5 및 BD6을 이용하여 BB6, BD5 및 BD6 클론을 선별하였다 (도 24B).
이러한 BB6 클론은 AM1 CHOd- 성장 배지를 사용하여 10개 롤러 병 (공급처: Corning) 내로 확대하였고, 현미경으로 판단한 바와 같은 밀집도를 나타낼 때까지 성장시켰다. 이어서, 상기 배지를, 50% DMEM 고 글루코스 및 50% 햄스 (Ham's) F12 (공급처: Gibco)를 함유하고 1x HT 및 1x NEAA를 수반한 혈청-무함유 배지로 교환하고, 1주 동안 항온 배양하였다. 적응용 배지를 1주 배양 시점에 수거하고, 0.45 ㎛ 필터 (공급처: Corning) 내로 여과시킨 다음 동결시켰다. 신선한 혈청 무함유 배지를 가하고, 1주 더 항온 배양하였다. 이와 같이 적응시킨 혈청 무함유 배지를 처음과 같이 수거하고 동결시켰다.
대략 4 L의 적응용 배지를 실온하 수욕에서 해동시켰다. 실온에서 사토리우스 사르토콘 (Satorius Sartocon) 폴리설폰 10 접선 유동 한외여과 카세트 (0.1 ㎡)을 사용하여 상기 배지를 약 450 ml로 농축시켰다. 이어서, 보존물을 예비-필터가 장착된 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시켰다. 이어서, 보존물을 7℃ 하에 5 ml/min으로 5 ml 아머샴 하이트랩 (Amersham HiTrap) 단백질 A 칼럼 상으로 부하하고, 이 칼럼을 2가 양이온을 수반하지 않은 둘벡코 (Dulbecco's) 인산염 완충 식염수 (PBS)의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 샘플을 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 단백질 A 용출 풀 (대략 9 ml)을 물로 50 ml가 되도록 희석시키고, 7℃ 하에 5 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 5 ml 아머샴 하이트랩 SP-HP 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5 ml/min으로 25% 내지 75% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 전개시킨 다음, 7℃에서 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다. 이어서, 이와 같이 모은 물질을 다음 원심분리형 한외 여과 장치 (Pall Life Sciences Macrosep 1OK Omega 원심분리형 한외 여과 장치)를 사용하여 약 3.4 ml가 되도록 농축시킨 다음, 코스타르 (Costar) 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 주사기 필터를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 여과시킨 물질 10 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 26A). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 32,420 g/mol과 흡광 계수 47,900 M-1cm-1를 이용하여 5.4 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 26B). 그 다음, <1 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 PBS 중의 샘플의 108배 희석을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프 (Charles River Laboratories Endosafe)-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 20 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 26C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 26D), (실험 오차 없이) 정제된 펩티보디의 완전성을 확증하였다 . 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
정제된 Fc-L10-ShK[1-35]는 전기생리학 (실시예 36 참고)에 의해 결정된 바와 같이 인간 Kv1.3을 강력하게 차단시켰다 (도 3OA 및 도 30B). 정제된 Fc-L10-ShK[1-35] 분자는 또한, T 세포 증식 (도 36A 및 도 36B)과 사이토킨 IL-2의 생성 (도 35A 및 도 37A) 및 IFN-g의 생성 (도 35B 및 도 37B)을 차단시켰다.
실시예 2
Fc-L-ShK[2-35] 포유류 발현
Kv1.3 억제제 펩티드 ShK[2-35]의 단량체와 동일 프레임 내에서 융합된 인간 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 DNA 서열을 표준 PCR 기술을 이용하여 구축하였다. 해당 분자의 ShK[2-35] 및 5, 10, 또는 25개 아미노산 링커 일부는 주형으로서 pcDNA3.1(+)CMVi 중의 본래의 Fc-2xL-ShK[1-35]를 사용하여 PCR 반응에서 생성시켰다 (실시예 1, 도 14). 모든 ShK 구조물은 다음 아미노산 서열을 가져야 하는데, 야생형 서열의 첫 번째 아미노산이 결실되었다:
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC (서열 92).
"Fc-1xL-ShK[2-35]"으로서 지칭되기도 한 Fc-L5-ShK[2-35]을 생성시키기 위해 사용되는 프라이머의 서열이 다음에 제시된다:
cat gga tcc agc tgc atc gac acc atc//서열 661;
cat gcg gcc gct cat tag c// 서열 662.
"Fc-2xL-ShK[2-35]"으로서 지칭되기도 한 Fc-L10-ShK[2-35]을 생성시키기 위해 사용되는 프라이머의 서열이 다음에 제시된다:
cat gga tcc gga gga gga gga agc agc tgc a //서열 663;
cat gcg gcc gct cat tag cag gtg c //서열 664.
"Fc-5xL-ShK[2-35]"으로서 지칭되기도 한 Fc-L25-ShK[2-35]을 생성시키기 위해 사용되는 프라이머의 서열이 다음에 제시된다:
cat gga tcc ggg ggt ggg ggt tct ggg ggt ggg ggt tct gga gga
gga gga agc gga gga gga gga agc agc tgc a//서열 665;
cat gcg gcc gct cat tag cag gtg c//서열 666.
PCR 생성물을 BamHI 및 NotI (공급처: Roche) 제한 효소로 분해시키고, 겔 정제용 키트에 의해 아가로스 겔 정제하였다. 이와 동시에, pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ActivinRIIB 벡터를 BamHI 및 NotI 제한 효소로 분해시키고, 큰 단편을 겔 정제용 키트에 의해 정제하였다. 각각의 정제된 PCR 생성물을 상기 큰 단편에 연결시키고, XL-1blue 세균 내로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 세균성 집락으로부터 DNAs를 분리하고, BamHI 및 NotI 제한 효소로 분해시킨 다음, 1% 아가로스 겔 상에서 용해시켰다. 예상 패턴을 나타내는 DNAs을 서열 분석용으로 제출하였다. 클론의 몇 가지 서열을 분석한 결과 상기 서열과의 100% 정합물이 산출되긴 하였지만, 단지 1개의 클론 만이 대규모 플라스미드 정제를 위해 선별되었다. 이러한 클론으로부터의 DNA를 재서열 분석하여 Fc와 링커 영역을 확증하였고, 상기 서열은 예측 서열과 100% 동일하였다.
pcDNA3.1(+)CMVi 벡터 중의 Fc-1xL-Shk[2-35], Fc-2xL-Shk[2-35] 및 Fc-5xL-Shk[2-35] 삽입물을 함유하는 플라스미드를 XbaI 및 XhoI (공급처: Roche) 제한 효소로 분해시키고 겔 정제하였다. 상기 삽입물을 NotI 및 SalI (공급처: Roche) 분해된 pDSRα-22 (공급처: Amgen Proprietary) 발현 벡터 내로 개별적으로 연결시켰다. 이로써 생성된 구조물의 완전성은 DNA 서열 분석함으로써 확증하였다. 최종 플라스미드 DNA 발현 벡터 구조물은 pDSRα-22-Fc-1xL-Shk[2-35], pDSRα-22-Fc-2xL-Shk[2-35] (도 13C 및 도 15) 및 pDSRα-22-Fc-5xL-Shk[2-35] (도 16)였고, 이는 각각 5, 10 및 25개 아미노산 링커를 함유하였다.
형질감염시키기 24시간 전에, 1.2e7 AM-1/D CHOd- (공급처: Amgen Proprietary) 세포를 T-175 cm 멸균성 조직 배양 플라스크에 도말하여, 형질감염 당일에 70 내지 80% 밀집도가 되도록 하였다. 이 세포를, DMEM 고 글루코스, 5% FBS, 1X 글루타민 Pen/Strep (공급처: Gibco), 1X HT, 1X NEAA 및 1X 나트륨 피루베이트 (공급처: Gibco)를 함유하는 AM-1/D CHOd- 배양 배지에 유지시켰다. 그 다음 날, 18 마이크로그램의 각각의 선형화 pDSRα22:Fc-1xL-ShK[2-35], pDSRα22:Fc-2xL-ShK[2-35] 및 pDSRα22:Fc-5xL-ShK[2-35] (RDS's # 20050037685, 20050053709, 20050073295) 플라스미드를 72 ㎍의 선형화 셀렉시스 (Selexis) MAR 플라스미드 및 pPAGO1 (RDS 20042009896)과 혼합하고, 50 ml 원뿔형 튜브 중의 6 ml의 OptiMEM 내로 희석시키며 5분 동안 항온 배양하였다. LF2000 (210 ㎕)를 6 ml의 OptiMEM에 가하고 5분 동안 항온 배양하였다. 이와 같이 희석된 DNA 및 LF2000을 함께 혼합하고, 실온에서 20분 동안 항온 배양하였다. 이러는 동안, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 항생제를 수반하지 않은 30 ml OptiMEM을 상기 세포에 가하였다. OptiMEM을 흡인 제거하고, 세포를 12 ml의 DNA/LF2000 혼합물과 함께 6시간 동안 항온 배양하거나 또는 진탕시키면서 37℃ 항온 배양기에서 밤새 항온 배양하였다. 형질감염시킨지 24시간 후에, 세포를 집락 선별을 위해 상이한 희석율 하에 AM-1/D CHOd- 배양 배지 내로 1:5로 분할하였다. 형질감염시킨지 72시간 후에 세포 배지를, DMEM 고 글루코스 중의 10% 투석된 FBS (공급처: Gibco) 플러스 1X 글루타민 Pen/Strep, 1X NEAA's 및 1X Na Pyr를 함유하는 DHFR 선별 배지로 대체시켜, 단백질을 발현시키고 단백질이 세포 배지 내로 분비될 수 있게 하였다. 해당 집락을 집어내기에 충분히 클 때까지 선별 배지를 1주에 2회 변화시켰다. pDSRα22 발현 벡터는 DHFR 발현 카세트를 함유하는데, 이는 형질감염된 세포가 히포크산틴 및 티민의 부재 하에서 성장할 수 있게 해준다. 이로써 생성된 집락의 5개 T-175 풀을 롤러 병 내로 확대시키고, 혈청 무함유 조건 하에 배양하였다. 적응용 배지를 수거하고 1주 간격으로 대체시켰다. 이로써 생성된 3 리터의 적응용 배지를 0.45 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터 (공급처: Corning, Acton, MA)를 통하여 여과시키고, 정제를 위해 단백질 화학으로 옮겼다. 백업으로서, DHFR 선별 배지 상에서 10 내지 14일 후에 10 cm 판으로부터 12개 집락을 선별하였고, 프로브로서 HRP 접합된 항-인간 IgGFc를 사용하여 웨스턴 블롯함으로써 발현 수준을 평가하였다. 각각의 상이한 링커 길이 Fc-L-ShK[2-35] 융합 단백질의 가장 높은 수준을 발현하는 3개의 가장 우수한 클론을 확장시키고, 추가의 사용을 위해 동결시켰다.
Fc-L10-ShK(2-35)의 정제: 대략 1 L의 적응용 배지를 실온하 수욕에서 해동시켰다. 상기 배지를 7℃ 하에 5 ml/min으로 5 ml 아머샴 하이트랩 단백질 A 칼럼 상으로 부하하고, 이 칼럼을 2가 양이온을 수반하지 않은 둘벡코 인산염 완충 식염수 (PBS)의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 샘플을 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 단백질 A 용출 풀 (대략 8.5 ml)을 71 ㎕ 3 M 나트륨 아세테이트와 합한 다음, 물로 50 ml가 되도록 희석시켰다. 이와 같이 희석시킨 물질을 7℃ 하에 5 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 5 ml 아머샴 하이트랩 SP-HP 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5 ml/min으로 0% 내지 75% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 전개시킨 다음, 7℃에서 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다. 이어서, 이와 같이 모은 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 다음 원심분리형 한외 여과 장치 (Pall Life Sciences Macrosep 1OK Omega 원심분리형 한외 여과 장치)를 사용하여 약 3.9 ml가 되도록 농축시켰다. 이어서, 이와 같이 농축시킨 물질을 실온 하에 2 ml/min으로 0.22 ㎛, 25 mm 머스탕 (Mustang) E 막을 수반한 폴 라이프 사이언스 아크로디스크 (Pall Life Sciences Acrodisc)를 통하여 여과시켰다. 그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 여과시킨 물질 10 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 27E). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,008 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 2.76 mg/ml인 것으로 결정되었다. 물질이 침투물에 존재하기 때문에, 신규한 매크로셉 (Macrosep) 카트릿지를 사용하여 상기 침투물 상에서 농축 단계를 반복하였다. 이어서, 신규 배치의 농축 물질을 실온 하에 2 ml/min으로 0.22 ㎛, 25 mm 머스탕 E 막을 수반한 폴 라이프 사이언스 아크로디스크를 통하여 여과시켰다. 이들 둘 다의 농축 물질을 1개 풀 내로 합하였다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 10 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다. 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,008 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 3.3 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 27A). 그 다음, <1 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 PBS 중의 샘플의 67배 희석을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 50 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 27B). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 27F), 실험 오차 없이 펩티보디의 완전성을 확증하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
도 31B는 정제된 Fc-L10-ShK[2-35]가 인간 Kv1.3 전류를 강력하게 차단시켰다는 것을 도시하였다 (실시예 36에 기재된 바와 같은 전기생리학을 수행하였다). 정제된 Fc-L10-ShK[2-35] 분자는 또한, 인간 전혈에서의 IL-2 (도 64A 및 도 64A) 및 IFN-g (도 65B 및 도 65B) 생성을 차단시켰을 뿐만 아니라 T 세포 상에서 CD40L (도 66A 및 도 66B) 및 IL-2R (도 67A 및 도 67B)을 상향 조절하였다.
Fc-L5-ShK(2-35)의 정제: 대략 1 L의 적응용 배지를 7℃ 하에 5 ml/min으로 5 ml 아머샴 하이트랩 단백질 A 칼럼 상으로 부하하고, 이 칼럼을 2가 양이온을 수반하지 않은 둘벡코 인산염 완충 식염수 (PBS)의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 샘플을 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 단백질 A 용출 풀 (대략 9 ml)을 450 ㎕ 1 M 트리스 HCl pH 8.5과 합한 다음, 230 ㎕ 2 M 아세트산과 합한 후, 물로 50 ml가 되도록 희석시켰다. pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 7℃ 하에 5 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 5 ml 아머샴 하이트랩 SP-HP 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5 ml/min으로 0% 내지 75% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 전개시킨 다음, 7℃에서 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다. 이어서, 이와 같이 모은 물질을 다음 원심분리형 한외 여과 장치 (Pall Life Sciences Macrosep 1OK Omega 원심분리형 한외 여과 장치)를 사용하여 약 5.5 ml가 되도록 농축시켰다. 이어서, 이와 같이 농축시킨 물질을 실온 하에 2 ml/min으로 0.22 ㎛, 25 mm 머스탕 E 막을 수반한 폴 라이프 사이언스 아크로디스크를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 10 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 27G). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 29,750 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 4.59 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 27C). 그 다음, <1 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 내독소 특이적 완충제 BG120 중의 샘플 92배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 50 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 27H). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 27I), 실험 오차 없이 펩티보디의 완전성을 확증하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
도 31C는 정제된 Fc-L5-ShK[2-35]가 고도로 활성이고, 완전 세포 패치 클램프 전기생리학에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 36 참고) 인간 Kv1.3을 차단시킨다는 것을 도시하였다.
Fc-L25-ShK(2-35)의 정제: 대략 1 L의 적응용 배지를 7℃ 하에 5 ml/min으로 5 ml 아머샴 하이트랩 단백질 A 칼럼 상으로 부하하고, 이 칼럼을 2가 양이온을 수반하지 않은 둘벡코 인산염 완충 식염수 (PBS)의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 샘플을 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 단백질 A 용출 풀 (대략 9.5 ml)을 119 ㎕ 3 M 나트륨 아세테이트와 합한 후, 물로 50 ml가 되도록 희석시켰다. pH 조정시킨 물질을 7℃ 하에 5 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 5 ml 아머샴 하이트랩 SP-HP 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5 ml/min으로 0% 내지 75% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 전개시킨 다음, 7℃에서 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 크로마토그램으로부터의 주요 피크를 함유하는 분획들을 모으고, 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 20 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 27J). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 31,011 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 1.40 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 27D). 그 다음, <1 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 내독소 특이적 완충제 BG120 중의 샘플 28배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 50 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 27K). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 27L), 실험 오차 없이 펩티보디의 완전성을 확증하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
정제된 Fc-L25-ShK[2-35]는 HEK293/Kv1.3 세포 상에서 완전 세포 패치 클램프 전기생리학에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 36 참고), IC50 약 150 pM으로 인간 Kv1.3을 억제하였다.
실시예 3
Fc-L-ShK[1-35] 세균성 발현
세균성 펩티보디 발현 벡터 및 펩티보디의 클로닝 및 발현 과정에 관한 설명: 세균성 발현을 위해 사용된 클로닝 벡터 (실시예 3-30)는 pAMG21에 기초한 것이다 (미국 특허 제2004/0044188호에 최초로 기재됨). 이는 해당 벡터의 독특한 BstBI 부위와 NsiI 부위 간의 DNA를 절단시키고, 앰피실린에 대한 내성을 부여해주는 베타-락타마제 유전자의 주형 공급원으로서 pUC19 DNA를 사용하고 PCR 프라이머 CCA ACA CAC TTC GAA AGA CGT TGA TCG GCA C (서열 667) 및 CAC CCA ACA ATG CAT CCT TAA AAA AAT TAC GCC C (서열 668)을 사용하여 베타-락타마제 유전자를 보유하고 있는 적당히 분해된 PCR 단편으로 대체시킴으로써, 카나마이신 내성 성분을 앰피실린 내성 성분으로 대체시켰다는 점에서 변형되었다. 신규한 버젼은 pAMG21ampR로 지칭된다.
실시예 3 내지 30 (실시예 15 및 16은 제외된다)에 사용된 클로닝 벡터 pAMG21ampR-Fc-Pep에 관한 설명. 도 11A-C 및 11D (도식적 다이아그램)은 Fc 유전자의 C-말단과의 펩티드 융합물을 클로닝할 수 있도록 하기 위해 기본 벡터 pAMG21ampR에 부가된 ds-DNA를 도시한 것이다. 이러한 DNA는 pAMG21ampR 벡터 중의 독특한 NdeI 부위와 BamHI 부위 사이에 도입하였다. 상기 DNA의 전체 영역이 도 11A-C에 도시되었다. Fc에 대한 암호화 영역은 nt 5134부터 5817까지 연장하였고, 단백질 서열은 DNA 서열 아래에 나타내었다. 그 다음, 동일 프레임 내에 glyX5 링커 (nt's 5818-5832)가 존재한다. BsmBI 부위 (GAGACG)는 nt's 5834-5839에 걸쳐 있다. DNA 절단은 상부 DNA 가닥 상의 nt's 5828와 5829 사이, 그리고 하부 DNA 가닥 상의 nt's 5832와 5833 사이에서 일어난다. 분해로 인해 본원에 제시된 바와 같이 4 bp 점착 말단이 창출된다. BsmBI 부위가 밑줄처져 있다.
AGGTGG TGGTTGAGACG 서열 683
TCCACCACCA ACTCTGC
서열 684
두 번째 BsmBI 부위는 nt's 6643 내지 6648에 존재하는데, 즉 CGTCTC이다. DNA 절단은 상부 가닥 상의 nt's 6650과 6651 사이, 그리고 하부 가닥 상의 6654와 6655 사이에서 일어난다.
CGTCTCT TAAGGATCCG 서열 685
GCAGAGAATTC CTAGGC
서열 686
상기 2개의 BsmBI 부위 사이에는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 구성적으로 발현하는 불필요한 클로람페니콜 내성 카세트 (cat 유전자)가 존재한다. 다음 cat 단백질 서열이 도 11A-C에 도시되고, 이는 nt's 5954부터 6610까지 연장된다:
각 실시예 (실시예 15 및 16 제외)에서 이중체를 암호화하는 펩티드는 상기 벡터에 의해 제시된 것에 대해 상보적인 점착 말단을 보유하고 있다.
실시예 15 및 16에 사용된 클로닝 벡터 pAMG21ampR-Pep-Fc에 관한 설명. 도 12A-C, 및 도 12D에서의 도식적 다이아그램은 Fc 유전자의 N-말단과의 펩티드 융합물을 클로닝할 수 있도록 하기 위해 기본 벡터 pAMG21ampR에 부가된 ds-DNA를 도시한 것이다. 이러한 DNA는 pAMG21ampR 벡터 중의 독특한 NdeI 부위와 BamHI 부위 사이에 도입하였다. Fc에 대한 암호화 영역은 nt 5640부터 6309까지 연장하고, 단백질 서열은 DNA 서열 아래에 나타내었다. 그 다음, 동일 프레임 내에 glyX5 링커 (nt's 5614-5628)가 존재한다. BsmBI 부위 (GAGACG)는 nt's 5138 내지 5143에 걸쳐 있다. 절단은 상부 DNA 가닥 상의 nt's 5132와 5133 사이, 그리고 하부 DNA 가닥 상의 nt's 5136과 5137 사이에서 일어난다.
분해로 인해 본원에 제시된 바와 같이 4 bp 점착 말단이 창출된다. BsmBI 부위가 밑줄처져 있다.
AATAACA TATGCGAGACG 서열 687
TTATTGTATAC GCTCTGC
서열 688
두 번째 BsmBI 부위는 nt's 5607 내지 5612에 존재하는데, 즉 CGTCTC이다. 절단은 상부 가닥 상의 nt's 5613과 5614 사이, 그리고 하부 가닥 상의 5617과 5618 사이에서 일어난다.
CGTCTCA GGTGGTGGT
GCAGAGTCCAC CACCA
서열 689
상기 BsmBI 부위 사이에는 시겔라 (Shegella) ble 단백질을 구성적으로 발현하는 불필요한 제오신 내성 카세트가 존재한다. 다음 ble 단백질 서열이 도 12A-C에서 nt's 5217부터 5588까지 연장되는 것으로 도시된다:
실시예 15 및 16에서 이중체를 암호화하는 펩티드는 상기 벡터에 의해 제시된 것에 대해 상보적인 점착 말단을 보유하고 있다.
실시예 52 및 53에 사용된 클로닝 벡터 pAMG21ampR-Pep-Fc에 관한 설명. 도 12E-F는 Fc 유전자의 N-말단과의 펩티드 융합물을 클로닝할 수 있도록 하기 위해 기본 벡터 pAMG21ampR에 부가된 ds-DNA를 도시한 것인데, 상기 펩티드의 첫 번째 2개 코돈은 met-gly이어야 한다. 이러한 DNA는 pAMG21ampR 벡터 중의 독특한 NdeI 부위와 BamHI 부위 사이에 도입하였다. Fc에 대한 암호화 영역은 nt 5632부터 6312까지 연장하고, 단백질 서열은 DNA 서열 아래에 나타내었다. 그 다음, 동일 프레임 내에 glyX5 링커 (nt's 5617-5631)가 존재한다. BsmBI 부위는 (GAGACG)는 nt's 5141 내지 5146에 걸쳐 있다. 절단은 상부 DNA 가닥 상의 nt's 5135와 5136 사이, 그리고 하부 DNA 가닥 상의 nt's 5139과 5140 사이에서 일어난다.
분해로 인해 본원에 제시된 바와 같이 4 bp 점착 말단이 창출된다. BsmBI 부위가 밑줄처져 있다.
AATAACATAT GGGTCGAGACG 서열 1344
서열 1343
TTATTGTATACCCA GCTCTGC
서열 1345
두 번째 BsmBI 부위는 nt's 5607 내지 5612에 존재하는데, 즉 CGTCTC이다. 절단은 상부 가닥 상의 nt's 5613과 5614 사이, 그리고 하부 가닥 상의 5617과 5618 사이에서 일어난다.
CGTCTCA GGTGGTGGT
GCAGAGTCCAC CACCA
서열 1346
상기 BsmBI 부위 사이에는 시겔라 ble 단백질을 구성적으로 발현하는 불필요한 제오신 내성 카세트가 존재한다. 상기 언급된 바와 같은 ble 단백질 서열은 nt's 5220부터 5591까지 연장되는 것으로 도시된다. 다음에 기재된 실시예 52 및 53에서 이중체를 암호화하는 펩티드는 상기 벡터에 의해 제시된 것에 대해 상보적인 점착 말단을 보유하고 있다.
모두 세균성 발현을 위한 실시예 3 내지 30의 경우에, 클로닝된 펩티드 서열은 모두 적당한 벡터와 직접 연결되는 DNA 이중체를 창출시키기 위해 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킴으로써 유도되었다. 실시예 20의 경우에는 2개의 올리고면 충분하고, 기타 모든 실시예의 경우에는 4개가 요구된다. 이중체를 Fc의 N-말단에 삽입시켜야 하는 경우에는 (본원의 실시예 15, 16, 52, 및 53 참고), 각 실시예에서 올리고의 목록에 부합되는 서수를 수반하여 다음과 같이 설계하였다:
이중체를 Fc의 C-말단에 삽입시켜야 하는 경우에는 (실시예 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 및 30), 다음과 같이 설계하였다:
나머지 모든 실시예는 Fc의 C-말단에 삽입된 이중체를 갖고 있으며, 다음 설계를 활용하였다:
키나싱 단계는 상기 올리고의 인산화를 위해 전혀 요구되지 않는다. 이중체를 성공적으로 삽입하면, 불필요한 항생제 내성 카세트 (pAMG21ampR-Pep-Fc에 대한 제오신 내성 및 pAMG21ampR-Fc-Pep에 대한 클로람페니콜 내성)가 대체된다. 이로써 생성된 표현형 상의 변화는 재조합 클론을 비-재조합 클론과 구별하는데 유용하다.
다음 설명은 본원에 예시된 세균성 발현된 재조합 단백질 30개 모두의 클로닝을 수행하기 위한 균일한 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 세트와 벡터 만이 다양하다. 이들 명세서가 다음 각 실시예에 제공된다.
소정의 펩티드에 대한 암호화 영역을 함유하는 올리고뉴클레오티드 이중체는 각 실시예에 열거된 올리고뉴클레오티드를 어닐링시킴으로써 형성시켰다. 10 피코몰의 각 올리고를 제한 엔도뉴클레아제 BsmBI로 미리 분해시킨 0.3 ㎍의 적당한 벡터와 함께 1X 연결 완충액을 함유하는 최종 용적 10 ㎕로 혼합하였다. 이 혼합물을 80℃로 가열하고 초당 1℃씩 실온으로 냉각시켰다. 이에 10 ㎕의 1X 리가제 완충액 + 400 단위의 T4 DNA 리가제를 가하였다. 샘플을 14℃에서 20분 동안 항온 배양하였다. 리가제를 65℃ 하에 10분 동안 가열함으로써 불활성화하였다. 이어서, 10 단위의 제한 엔도뉴클레아제 BsmBI를 가한 다음, 55℃에서 1시간 동안 항온 배양하여 개선된 모든 모 벡터 분자를 절단시켰다. 50 ㎕의 화학적으로 적격한 이. 콜라이 세포를 가하고, 2℃에서 20분 동안 유지시킨 다음, 42℃에서 5초 동안 열 쇽하였다. 전 용적을 카르베니실린으로 보충시킨 루리아 (Luria) 한천 판 상으로 200 ㎍/ml로 확산시키고 37℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 집락을 대상으로 하여, 대체 가능한 항생제 내성 마커에 대한 내성 상실에 대해 시험하였다. 표준 PCR 시험을 사용하여 이중체 삽입물의 예상 크기를 확증할 수 있다. 플라스미드 제제를 수득하고, 재조합 삽입물을 DNA 서열 분석에 의해 검증하였다. 특정 서열의 0.5 리터 배양물은 구조물을 테리픽 (Terrific) 육즙에서 성장시켰다는 것을 확증시켜 주었고, 펩티보디의 발현은 N-(3-옥소-헥사노일)-호모세린 락톤을 50 ng/ml으로 부가함으로써 유도되었으며, 37℃에서 4 내지 6시간 동안 진탕시킨 후, 세포를 원심분리시키고 세포 페이스트를 -20℃ 하에 저장하였다.
다음은 각 융합 단백질을 구축하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 세트와 클로닝 벡터에 관한 각 예를 제공한다. 또한 DNA/단백질 지도가 제시된다.
Kv1.3의 Fc-L-ShK[1-35] 억제제의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 상기 언급되어 있다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ShK[1-35]을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고:
올리고 이중체가 다음에 제시된다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다. 세균성 발현된 Fc-L10-ShK(1-35)의 정제가 하기 실시예 38에 추가로 기재되어 있다.
실시예 4
Fc-L-ShK[2-35] 세균성 발현
Fc-L-ShK[2-35]의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ShK[2-35]을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
형성된 올리고 이중체가 다음에 제시된다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다. 세균성 발현된 Fc-L10-ShK(2-35)의 정제가 하기 실시예 39에 추가로 기재되어 있다.
실시예 5
Fc-L-HmK 세균성 발현
Fc-L-HmK의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-HmK를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
형성된 올리고 이중체가 다음에 제시된다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 6
Fc-L-KTX1 세균성 발현
Fc-L-KTX1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-KTX1을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
형성된 올리고 이중체가 다음에 제시된다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
세균에서 발현된 Fc-L-KTX1의 정제 및 리폴딩. 동결된 이. 콜라이 페이스트 (28 g)를 210 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 (4.8 g)을 48 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이와 같이 용해시킨 펠릿을, 30 ㎕의 1 M 디티오트레이톨을 3 ml의 용액에 가하고 37℃에서 30분 동안 항온 배양함으로써 환원시켰다. 이와 같이 환원시킨 펠릿 용액을 실온에서 5분 동안 14,000 g으로 원심분리시킨 다음, 2.5 ml의 상등액을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 250 ml의 리폴딩 완충액 (2 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 5 mM EDTA, 1 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 8.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 2일 동안 지속하였다. 그 다음, 리폴딩 용액을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 4℃ 하에 3일 동안 저장하였다.
이와 같이 저장한 리폴딩물을 1 L의 물로 희석시키고, 1 M H3PO4를 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. pH 조정시킨 물질을 7℃ 하에 10 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 10 ml 아머샴 SP-HP 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 0% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 7℃에서 5 ml/min으로 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다 (45 ml). 이어서, 상기 풀을 7℃에서 2 ml/min으로 PBS 중의 1 ml 아머샴 단백질 A 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이 컬럼을 PBS의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 100 mM 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. 용출 피크 (2.5 ml)에, 62.5 ㎕ 2 M 트리스 기제를 가한 다음, pH 조정시킨 물질을 실온 하에 2 ml/min으로 0.22 ㎛, 25 mm 머스탕 E 막을 수반한 폴 라이프 사이언스 아크로디스크를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 20 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 28C). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,504 g/mol과 흡광 계수 35,410 M-1cm-1를 이용하여 2.49 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 28A). 그 다음, <1 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 내독소 특이적 완충제 BG120 중의 샘플 50배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 45 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 28B). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 28D), 이들 연구는 실험 오차 없이 정제된 펩티보디의 완전성을 확증하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
정제된 Fc-L-KTX1은 전기생리학 (실시예 36에 기재된 바와 같은 방법)에 의해 용량 의존적 방식으로 인간 Kv1.3 전류를 차단시켰다 (도 32A 및 도 32B).
실시예 7
Fc-L-HsTx1 세균성 발현
Fc-L-HsTx1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-HsTx1을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
올리고에 의해 형성된 이중체가 다음에 제시된다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 8
Fc-L-MgTx 세균성 발현
Fc-L-MgTx의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-MgTx을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 다음에 제시된 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 9
Fc-L-AgTx2 세균성 발현
Fc-L-AgTx2의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-AgTx2를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 열거된 올리고를 사용하여 다음에 제시된 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
세균에서 발현된 Fc-L-AgTx2의 정제 및 리폴딩. 동결된 이. 콜라이 페이스트 (15 g)를 120 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 (4.6 g)을 46 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이와 같이 용해시킨 펠릿을, 30 ㎕의 1 M 디티오트레이톨을 3 ml의 용액에 가하고 37℃에서 30분 동안 항온 배양함으로써 환원시켰다. 이와 같이 환원시킨 펠릿 용액을 실온에서 5분 동안 14,000 g으로 원심분리시킨 다음, 2.5 ml의 상등액을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 250 ml의 리폴딩 완충액 (2 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 5 mM EDTA, 1 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 8.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 2일 동안 지속하였다. 그 다음, 리폴딩 용액을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, -70℃ 하에 저장하였다.
이와 같이 저장한 리폴딩물을 녹인 다음, 1 L의 물로 희석시키고, 1 M H3PO4를 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 7℃ 하에 10 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 10 ml 아머샴 SP-HP 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 0% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 7℃에서 5 ml/min으로 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다 (15 ml). 이어서, 상기 풀을 7℃에서 2 ml/min으로 PBS 중의 1 ml 아머샴 단백질 A 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이 컬럼을 20 mM NaH2PO4 pH 6.5, 1 M NaCl의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 100 mM 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. 용출 피크 (1.5 ml)에, 70 ㎕ 1 M 트리스 HCl pH 8.5를 가한 다음, pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 20 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 29C). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,446 g/mol과 흡광 계수 35,410 M-1cm-1를 이용하여 1.65 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 29A). 그 다음, <4 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 내독소 특이적 완충제 BG120 중의 샘플 33배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 20 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 29D). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 29E), 이들 연구는 실험 오차 없이 정제된 펩티보디의 완전성을 확증하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
실시예 10
Fc-L-OSK1 세균성 발현
Fc-L-OSK1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-OSK1을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 다음 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 나중에 사용하기 위해 동결 저장하였다. 이. 콜라이 페이스트로부터의 Fc-L-OSK1의 정제가 하기 실시예 40에 기재되었다.
실시예 11
Fc-L-OSK1(E16K,K20D) 세균성 발현
Fc-L-OSK1(E16K,K20D)의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-OSK1(E16K,K20D)을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 다음 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 나중에 사용하기 위해 동결 저장하였다.
실시예 12
Fc-L-아누록톡신 세균성 발현
Fc-L-아누록톡신의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-아누록톡신을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 다음 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 13
Fc-L-녹시우스톡신 세균성 발현
Fc-L-녹시우스톡신 또는 Fc-L-NTX의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-NTX를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 다음 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 14
Fc-L-Pi2 세균성 발현
Fc-L-Pi2의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-Pi2를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 다음 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 15
ShK[1-35]-L-Fc 세균성 발현
ShK[1-35]-L-Fc의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Pep-Fc이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 ShK[1-35]-L-Fc를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 다음 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다. met-ShK[1-35]-Fc의 정제가 하기 실시예 51에 기재되었다.
실시예 16
ShK[2-35]-L-Fc 세균성 발현
ShK[2-35]-L-Fc의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Pep-Fc이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 ShK[2-35]-L-Fc를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
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펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다. ShK[2-35]-Fc의 정제가 하기 실시예 50에 기재되었다.
실시예 17
Fc-L-ChTx 세균성 발현
Fc-L-ChTx의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ChTx을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
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펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 18
Fc-L-MTX 세균성 발현
Fc-L-MTX의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-MTX을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
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실시예 19
Fc-L-ChTx(K32E) 세균성 발현
Fc-L-ChTx(K32E)의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ChTx(K32E)을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
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펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 20
Fc-L-아파민 세균성 발현
Fc-L-아파민의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-아파민을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
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펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 21
Fc-L-실라톡신 세균성 발현
Fc-L-실라톡신 또는 Fc-L-ScyTx의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ScyTx을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
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펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 22
Fc-L-IbTx 세균성 발현
Fc-L-IbTx의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-IbTx을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 23
Fc-L-HaTx1 세균성 발현
Fc-L-HaTx1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-HaTx1을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
세균에서 발현된 Fc-L-HaTx1의 정제 및 리폴딩. 동결된 이. 콜라이 페이스트 (13 g)를 100 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 20분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 (2.6 g)을 26 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이와 같이 용해시킨 펠릿을, 30 ㎕의 1 M 디티오트레이톨을 3 ml의 용액에 가하고 37℃에서 30분 동안 항온 배양함으로써 환원시켰다. 이와 같이 환원시킨 펠릿 용액을 실온에서 5분 동안 14,000 g으로 원심분리시킨 다음, 2.5 ml의 상등액을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 250 ml의 리폴딩 완충액 (2 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 5 mM EDTA, 1 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 8.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 2일 동안 지속하였다. 그 다음, 리폴딩 용액을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, -70℃ 하에 저장하였다.
이와 같이 저장한 리폴딩물을 녹인 다음, 1 L의 물로 희석시키고, 1 M H3PO4를 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 7℃ 하에 10 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 10 ml 아머샴 SP-HP 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 0% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 7℃에서 5 ml/min으로 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다 (15 ml). 이어서, 상기 풀을 7℃에서 2 ml/min으로 PBS 중의 1 ml 아머샴 단백질 A 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이 컬럼을 20 mM NaH2PO4 pH 6.5, 1 M NaCl의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 100 mM 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. 용출 피크 (1.4 ml)에, 70 ㎕ 1 M 트리스 HCl pH 8.5를 가한 다음, pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 20 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 29F). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,469 g/mol과 흡광 계수 43,890 M-1cm-1를 이용하여 1.44 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 29B). 그 다음, <4 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 내독소 특이적 완충제 BG120 중의 샘플 33배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 20 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 29G). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ㎕)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였고 (도 29H), 이들 연구는 실험 오차 없이 정제된 펩티보디의 완전성을 확증하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
실시예 24
Fc-L-PaTx2 세균성 발현
Fc-L-PaTx2의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-PaTx2를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 25
Fc-L-wGVIA 세균성 발현
Fc-L-wGVIA의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-wGVIA를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 26
Fc-L-ωMVIIA 세균성 발현
Fc-L-ωMVIIA의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ωMVIIA를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 27
Fc-L-Ptu1 세균성 발현
Fc-L-Ptu1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-Ptu1를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 28
Fc-L-ProTx1 세균성 발현
Fc-L-ProTx1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-ProTx1을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 29
Fc-L-BeKM1 세균성 발현
Fc-L-BeKM1의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-BeKM1을 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 30
Fc-L-CTX 세균성 발현
Fc-L-CTX의 세균성 발현. 펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-Fc-Pep이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Fc-L-CTX를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 올리고를 사용하여 하기 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 31
N-말단적 PEG화-Des-Arg1-ShK
환원된 Des-Arg1-ShK의 펩티드 합성. 다음 서열
SCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC (펩티드 1, 서열 92)을 갖는 Des-Arg1-ShK는 텐타젤 (Tentagel™)-S PHB Fmoc-Cys(Trt)-수지 상에서 0.1 mmol 당량 수지 규모로 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)/N-메틸 모르폴린 (NMM)/N,N-디메틸-포름아미드 (DMF) 커플링 화학을 이용하여 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)에 의해 심포니 (Symphony™) 다중-펩티드 합성기 상에서 단계별 방식으로 합성하였다. N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카보닐)- 및 측쇄 보호된 아미노산은 공급처 [Midwest Biotech Incorporated]로부터 구입하였다. Fmoc-Cys(Trt)-텐타젤 수지는 공급처 [Fluka]로부터 구입하였다. 다음 측쇄 보호 전략을 이용하였다: ASp(OtBu), Arg(Pbf), Cys(Trt), Gln(Trt), His(Trt), Lys(Nε-Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu) 및 Tyr(OtBu). 2개의 옥사졸리딘 디펩티드, 즉 Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH 및 Fmoc-Leu-Ser(ψMe,MePro)-OH를 쇄 어셈블리에 사용하였고, 공급처 [NovaBiochem]로부터 수득하였으며 서열 합성에 사용하였다. 이와 같이 보호시킨 아미노산 유도체 (20 mmol)를 DMF 중의 100 ml 20% 디메틸 설폭사이드 (DMSO) (v/v)에 용해시켰다. 보호된 아미노산을 DMF 중의 20% DMSO 중의 400 mM NMM, 20 mM HBTU으로 활성화시키고, 20% DMF/DMSO 중의 1 mmol NMM, 0.5 mmol 보호된 아미노산, 0.5 mmol HBTU를 이용하여 2회 처리하는데, 25분 동안 처리한 다음, 40분 동안 처리함으로써 커플링을 수행하였다. DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v) 용액을 이용하여 2회 처리하는데, 10분 동안 처리한 다음 15분 동안 처리함으로써 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다. 합성한 후, 수지를 배출시키고, DCM, DMF, DCM으로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다. 펩티드-수지를 탈보호시키고, 실온에서 1시간 동안 TFA/EDT/TIS/H2O (92.5:2.5:2.5:2.5 (v/v)) 용액으로 처리함으로써 수지로부터 방출시켰다. 이어서, 질소 기체 스트림을 이용하여 휘발성 물질을 제거하고, 조 펩티드를 찬 디에틸 에테르로 2회 침전시킨 다음, 원심분리함으로써 수집하였다. 이어서, 주피터 (Jupiter) 4 ㎛ 프로테오 (Proteo™) 9OÅ 칼럼 상에서 선형 구배 (0-60% 완충액 B, 12분; A: 수중 0.1% TFA, B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)를 이용하여 조 펩티드를 워터스 (Waters) 2795 분석적 RP-HPLC 시스템 상에서 분석하였다. PE-Sciex™ API 전기-분무 질량 분광계를 사용하여 정확한 펩티드 생성물 질량을 확증하였다. 조 펩티드를 143 mg 수득량으로 획득하였는데, 분석적 RP-HPLC 분석에 의해 추정된 바와 같은 순도는 대략 70%였다. 환원된 Des-Arg1-ShK (펩티드 1) 체류 기간 (Rt) = 5.31분, 분자량 계산치 = 3904.6917 Da (평균); 분자량 실험 관측치 3907.0 Da.
Des-Arg1-ShK의 폴딩 (디설파이드 결합 형성). TFA 절단 및 펩티드 침전 후, 환원된 Des-Arg1-ShK를 공기-산화시켜 폴딩된 펩티드를 수득하였다. 상기 절단된 조 펩티드를 수중 20% AcOH (v/v)를 사용하여 추출한 다음, 물로 희석시켜 1 ml당 대략 0.15 mg의 환원된 Des-Arg1-ShK 농축물로 만들고, NH4OH (28-30%)를 사용하여 pH를 약 8.0으로 조정한 다음, 실온에서 36시간 동안 온화하게 교반시켰다. 폴딩 공정을 LC-MS 분석에 의해 모니터링하였다. 이 후, 폴딩된 Des-Arg1-ShK 펩티드를 선형 구배 0-40% 완충액 B, 120분 (A: 수중 0.1% TFA, B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)를 이용하고 1" 루나 (Luna) 5 ㎛ C18 100Å 프로테오 칼럼을 사용하여 역상 HPLC함으로써 정제하였다. 폴딩된 Des-Arg1-ShK 조펩티드는 대략 25% 완충액 B에서 (그의 환원 형태에서의 용출 시간과 비교해서) 조기에 용출되었다. 폴딩된 Des-Arg1-ShK (펩티드 2)를 23.2 mg 수득량으로 획득하였는데, 분석적 RP-HPLC 분석에 의해 추정된 바와 같은 순도는 >97%였다 (도 20). 분자량 계산치 = 3895.7693 Da (단일동위원소), 분자량 실험 관측치 = 3896.5 Da (Waters LCT Premier Micromass MS Technologies 상에서 분석함). Des-Arg1-ShK 디설파이드 연결성은 C1-C6, C2-C4, C3-C5였다.
(펩티드 2, 서열 58)
폴딩된 Des-Arg1-ShK의 N-말단 PEG화. 폴딩된 Des-Arg1-ShK (펩티드 2)를 1 mg/ml 농도로 물에 용해시켰다. 50 mM NaOAc, pH 4.5 중의 2 M MeO-PEG-알데히드, CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CHO (평균 분자량 20 kDa) 용액, 및 NaCNBH3의 별개의 1 M 용액을 신선하게 제조하였다. 이어서, 이러한 펩티드 용액을 MeO-PEG-알데히드 함유 용액에 가한 다음, NaCNBH3 용액을 가하였다. 반응 화학량론은 각각 펩티드:PEG:NaCNBH3 (1:2:0.02)였다. 반응물을 48시간 동안 정치시켜 두고, 선형 구배 (0-60% 완충액 B, 16분; A: 수중 0.1% TFA, B: 수중 0.1% TFA/90% ACN)를 이용하고 40℃ 하에 조르박스 (Zorbax™) 300SB-C8 5 ㎛ 칼럼을 사용하여 아질런트 (Agilent) 1100 RP-HPLC 시스템 상에서 분석하였다. 모노-PEG화 폴딩된 Des-Arg1-ShK는 분석적 RP-HPLC에 의해 조 생성물 대략 58%를 구성하였다. 이어서, 25 칼럼 용적 중의 0-50% B의 구배 (완충액: A = 20 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0, B = 1 M NaCl, 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0)를 이용하여 4℃에서 1 ml/min으로 AKTA FPLC 시스템 상에서 하이트랩 (HITrap™) 5 ml SP HP 양이온 교환 칼럼을 사용하여 모노 PEG화 Des-Arg1-ShK를 분리하였다. 4-20 트리스-Gly SDS-PAGE 겔 및 RP-HPLC을 사용하여 분획을 분석하였다 (조 생성물에 대해 기재된 바와 같음). SDS-PAGE 겔을 125 V, 35 mA, 5 W에서 1.5시간 동안 수행하였다. 이어서, 모은 생성물을 1 L의 A4S 완충액 (10 mM NaOAc, 5% 솔비톨, pH 4.0) 3가지 변화물 중에서 4℃ 하에 투석하였다. 그 다음, 이와 같이 투석시킨 생성물을 10 K 미소원심분리용 필터에서 농축시켜 2 mL 용적으로 만들고, 0.2 μM 주사기 필터를 사용하여 멸균성 여과시켜 최종 생성물을 수득하였다. N-말단적 PEG화-Des-Arg1-ShK (펩티드 3)를 1.7 mg 수득량으로 분리하였는데, 분석적 RP-HPLC 분석에 의해 추정된 바와 같은 순도는 85%였다 (도 23).
"PEG-ShK[2-35]"로서 지칭되기도 하는 N-말단적 PEG화-Des-Arg1-ShK는 패치 클램프 전기생리학에 의해 결정된 바와 같이 (실시예 36) 인간 Kv1.3을 차단시키는 활성이 있었다 (도 38A 및 도 38B).
실시예 32
N-말단적 PEG화 ShK
본 작동 실시예의 실험 과정은 도 17에 도시된 결과에 상응한다.
환원된 ShK의 펩티드 합성. 다음 아미노산 서열
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC (펩티드 4, 서열 5)을 갖는 ShK를 텐타젤-S PHB Fmoc-Cys(Trt)-수지 상에서 0.1 mmol 당량 수지 규모로 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)/N-메틸 모르폴린 (NMM)/N,N-디메틸-포름아미드 (DMF) 커플링 화학을 이용하여 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)에 의해 심포니 다중-펩티드 합성기 상에서 단계별 방식으로 합성하였다. N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카보닐)- 및 측쇄 보호된 아미노산은 공급처 [Midwest Biotech Incorporated]로부터 구입하였다. Fmoc-Cys(Trt)-텐타젤 수지는 공급처 [Fluka]로부터 구입하였다. 다음 측쇄 보호 전략을 이용하였다: ASp(OtBu), Arg(Pbf), Cys(Trt), Gln(Trt), His(Trt), Lys(Nε-Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu) 및 Tyr(OtBu). 2개의 옥사졸리딘 디펩티드, 즉 Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH 및 Fmoc-Leu-Ser(ψMe,MePro)-OH를 쇄 어셈블리에 사용하였고, 공급처 [NovaBiochem]로부터 수득하였으며 서열 합성에 사용하였다. 이와 같이 보호시킨 아미노산 유도체 (20 mmol)를 DMF 중의 100 ml 20% 디메틸 설폭사이드 (DMSO) (v/v)에 용해시켰다. 보호된 아미노산을 DMF 중의 20% DMSO 중의 400 mM NMM, 20 mM HBTU으로 활성화시키고, 20% DMF/DMSO 중의 1 mmol NMM, 0.5 mmol 보호된 아미노산, 0.5 mmol HBTU를 이용하여 2회 처리하는데, 25분 동안 처리한 다음, 40분 동안 처리함으로써 커플링을 수행하였다. DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v) 용액을 이용하여 2회 처리하는데, 10분 동안 처리한 다음 15분 동안 처리함으로써 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다. 합성한 후, 수지를 배출시키고, DCM, DMF, DCM으로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다. 펩티드-수지를 탈보호시키고, 실온에서 1시간 동안 TFA/EDT/TIS/H2O (92.5:2.5:2.5:2.5 (v/v)) 용액으로 처리함으로써 수지로부터 방출시켰다. 이어서, 질소 기체 스트림을 이용하여 휘발성 물질을 제거하고, 조 펩티드를 찬 디에틸 에테르로 2회 침전시킨 다음, 원심분리함으로써 수집하였다. 이어서, 주피터 4 ㎛ 프로테오 9OÅ 칼럼 상에서 선형 구배 (0-60% 완충액 B, 12분; A: 수중 0.1% TFA, B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)를 이용하여 조 펩티드를 워터스 2795 분석적 RP-HPLC 시스템 상에서 분석하였다. PE-Sciex API 전기-분무 질량 분광계를 사용하여 정확한 펩티드 생성물 질량을 확증하였다. 조 펩티드를 대략 170 mg 수득량으로 획득하였는데, 분석적 RP-HPLC 분석에 의해 추정된 바와 같은 순도는 대략 45%였다. 환원된 ShK (펩티드 4) 체류 기간 (Rt) = 5.054분, 분자량 계산치 = 4060.8793 Da (평균); 분자량 실험 관측치 4063.0 Da.
ShK의 폴딩 (디설파이드 결합 형성). TFA 절단 및 펩티드 침전 후, 환원된 ShK를 공기-산화시켜 폴딩된 펩티드를 수득하였다. 상기 절단된 조 펩티드를 수중 20% AcOH (v/v)를 사용하여 추출한 다음, 물로 희석시켜 1 ml당 대략 0.15 mg의 환원된 ShK 농축물로 만들고, NH4OH (28-30%)를 사용하여 pH를 약 8.0으로 조정한 다음, 실온에서 36시간 동안 온화하게 교반시켰다. 폴딩 공정을 LC-MS 분석에 의해 모니터링하였다. 이 후, 폴딩된 ShK 펩티드를 선형 구배 0-40% 완충액 B, 120분 (A: 수중 0.1% TFA, B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)를 이용하고 1" 루나 5 ㎛ C18 100Å 프로테오 칼럼을 사용하여 역상 HPLC함으로써 정제하였다. 폴딩된 ShK 조 펩티드는 대략 25% 완충액 B에서 (그의 환원 형태에서의 용출 시간과 비교해서) 조기에 용출되었다. 폴딩된 ShK (펩티드 5)를 25.5 mg 수득량으로 획득하였는데, 분석적 RP-HPLC 분석에 의해 추정된 바와 같은 순도는 >97%였다 (도 60 참고). 분자량 계산치 = 4051.8764 Da (단일동위원소), 분자량 실험 관측치 = 4052.5 Da (Waters LCT Premier Micromass MS Technologies 상에서 분석함). ShK 디설파이드 연결성은 C1-C6, C2-C4, C3-C5였다.
(펩티드 5, 서열 10)
폴딩된 ShK의 N-말단 PEG화. 다음 아미노산 서열
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC (서열 5)을 갖는 폴딩된 ShK를 1 mg/ml 농도로 물에 용해시킬 수 있다. 50 mM NaOAc, pH 4.5 중의 2 M MeO-PEG-알데히드, CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CHO (평균 분자량 20 kDa) 용액, 및 NaCNBH3의 별개의 1 M 용액을 신선하게 제조할 수 있다. 이어서, 이러한 펩티드 용액을 MeO-PEG-알데히드 함유 용액에 가한 다음, NaCNBH3 용액을 가할 수 있다. 반응 화학량론은 각각 펩티드:PEG:NaCNBH3 (1:2:0.02)일 수 있다. 반응물을 48시간 동안 정치시켜 두고, 선형 구배 (6-60% B, 16분; A: 수중 0.1% TFA, B: 수중 0.1% TFA/90% ACN)를 이용하고 40℃ 하에 조르박스 300SB-C8 5 ㎛ 칼럼을 사용하여 아질런트 1100 RP-HPLC 시스템 상에서 분석할 수 있다. 모노-PEG화 ShK (펩티드 6)는 25 칼럼 용적 중의 0-50% B의 구배 (완충액: A = 20 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0, B = 1 M NaCl, 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0)를 이용하여 4℃에서 1 ml/min으로 AKTA FPLC 시스템 상에서 하이트랩 5 ml SP HP 양이온 교환 칼럼을 사용하여 분리할 수 있다. 4-20 트리스-Gly SDS-PAGE 겔 및 RP-HPLC을 사용하여 분획을 분석할 수 있다. SDS-PAGE 겔을 125 V, 35 mA, 5 W에서 1.5시간 동안 수행할 수 있다. 이어서, 모은 생성물을 1 L의 A4S 완충액 (10 mM 나트륨 아세테이트, 5% 솔비톨, pH 4.0) 3가지 변화물 중에서 4℃ 하에 투석할 수 있다. 그 다음, 이와 같이 투석시킨 생성물을 10 K 미소원심분리용 필터에서 농축시켜 2 mL 용적으로 만들고, 0.2 μM 주사기 필터를 사용하여 멸균성 여과시켜 최종 생성물을 수득할 수 있다.
실시예 33
옥심 형성에 의한 N-말단적 PEG화 ShK
환원된 ShK의 펩티드 합성. 다음 아미노산 서열
RSCIDTIPKSRCTAFQCKHSMKYRLSFCRKTCGTC (서열 5)을 갖는 ShK를 텐타젤-S PHB Fmoc-Cys(Trt)-수지 상에서 0.1 mmol 당량 수지 규모로 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)/N-메틸 모르폴린 (NMM)/N,N-디메틸-포름아미드 (DMF) 커플링 화학을 이용하여 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)에 의해 심포니 다중-펩티드 합성기 상에서 단계별 방식으로 합성할 수 있다. N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카보닐)- 및 측쇄 보호된 아미노산은 공급처 [Midwest Biotech Incorporated]로부터 구입할 수 있다. Fmoc-Cys(Trt)-텐타젤 수지는 공급처 [Fluka]로부터 구입할 수 있다. 다음 측쇄 보호 전략을 이용할 수 있다: ASp(OtBu), Arg(Pbf), Cys(Trt), Gln(Trt), His(Trt), Lys(Nε-Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu) 및 Tyr(OtBu). 2개의 옥사졸리딘 디펩티드, 즉 Fmoc-Gly-Thr(ψMe,MePro)-OH 및 Fmoc-Leu-Ser(ψMe,MePro)-OH를 쇄 어셈블리에 사용할 수 있고, 공급처 [NovaBiochem]로부터 수득할 수 있으며 서열 합성에 사용할 수 있다. 이와 같이 보호시킨 아미노산 유도체 (20 mmol)를 DMF 중의 100 ml 20% 디메틸 설폭사이드 (DMSO) (v/v)에 용해시킬 수 있다. 보호된 아미노산을 DMF 중의 20% DMSO 중의 400 mM NMM, 20 mM HBTU으로 활성화시킬 수 있고, 20% DMF/DMSO 중의 1 mmol NMM, 0.5 mmol 보호된 아미노산, 0.5 mmol HBTU를 이용하여 2회 처리할 수 있는데, 25분 동안 처리한 다음, 40분 동안 처리함으로써 커플링을 수행할 수 있다. DMF 중의 20% 피페리딘 (v/v) 용액을 이용하여 2회 처리할 수 있는데, 10분 동안 처리한 다음 15분 동안 처리함으로써 Fmoc 탈보호 반응을 수행할 수 있다. ShK 펩티드의 쇄 어셈블리 후, Boc-아미노옥시아세트산 (1.2 당량)을 DMF 중의 1.5 M HBTU를 사용하여 N-말단에서 4 당량의 콜리딘과 5분 동안 커플링시킬 수 있다. 합성한 후, 수지를 배출시키고, DCM, DMF, DCM으로 세척한 다음, 진공 하에 건조시킬 수 있다. 펩티드-수지를 탈보호시키고, 실온에서 1시간 동안 TFA/아미노옥시아세트산/TIS/EDT/H2O (90:2.5:2.5:2.5:2.5) 용액으로 처리함으로써 수지로부터 방출시킬 수 있다. 이어서, 질소 기체 스트림을 이용하여 휘발성 물질을 제거할 수 있고, 조 펩티드를 찬 디에틸 에테르로 2회 침전시킨 다음, 원심분리함으로써 수집할 수 있다. 이어서, 주피터 4 ㎛ 프로테오 9OÅ 칼럼 상에서 선형 구배 (0-60% 완충액 B, 12분; A: 수중 0.1% TFA (또한 0.1% 아미노옥시아세트산을 함유함), B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)를 이용하여 아미노옥시-ShK 펩티드 (펩티드 7)를 워터스 2795 분석적 RP-HPLC 시스템 상에서 분석할 수 있다.
역상 HPLC 정제. 분취 역상 고 성능 액체 크로마토그래피를 C18, 5 ㎛, 2.2 cm x 25 cm) 칼럼 상에서 수행할 수 있다. 크로마토그래피 분리는 전형적으로 15 ml/min으로 90분에 걸쳐 5-95%의, A 중의 완충액 B의 선형 구배 [A = 0.1% 수성 TFA; B = 90% 수성 ACN (0.09% TFA 및 0.1% 아미노옥시아세트산을 함유함)]를 사용하여 달성할 수 있다. 분취 HPLC 분획을 ESMS 및 포토다이오드 어레이 (photodiode array) (PDA) HPLC에 의해 성상 확인할 수 있고, 합한 다음 동결건조시킬 수 있다.
옥심 형성에 의한 ShK의 N-말단 PEG화. 동결건조시킨 아미노옥시-ShK (펩티드 7)를 50% HPLC 완충액 A/B (5 mg/ml)에 용해시킬 수 있고, 2배 몰 과량의 MeO-PEG-알데히드, CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CHO (평균 분자량 20 kDa)를 가할 수 있다. 반응물을 24시간 동안 정치시켜 두고, 선형 구배 (6-60% B, 16분; A: 수중 0.1% TFA, B: 수중 0.1% TFA/90% ACN)를 이용하고 40℃ 하에 조르박스 300SB-C8 5 ㎛ 칼럼을 사용하여 아질런트 1100 RP-HPLC 시스템 상에서 분석할 수 있다. 모노-PEG화 환원된 ShK는 분석적 RP-HPLC에 의해 조 생성물 대략 58%를 구성하였다. 모노 PEG화 (옥심화) ShK (펩티드 8)은 25 칼럼 용적 중의 0-50% B의 구배 (완충액: A = 20 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0, B = 1 M NaCl, 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0)를 이용하여 4℃에서 1 ml/min으로 AKTA FPLC 시스템 상에서 하이트랩 5 ml SP HP 양이온 교환 칼럼을 사용하여 분리할 수 있다. 4-20 트리스-Gly SDS-PAGE 겔 및 RP-HPLC을 사용하여 분획을 분석할 수 있다. SDS-PAGE 겔을 125 V, 35 mA, 5 W에서 1.5시간 동안 수행할 수 있다. 이어서, 모은 생성물을 1 L의 A4S 완충액 (10 mM NaOAc, 5% 솔비톨, pH 4.0) 3가지 변화물 중에서 4℃ 하에 투석할 수 있다. 그 다음, 이와 같이 투석시킨 생성물을 10 K 미소원심분리용 필터에서 농축시켜 2 mL 용적으로 만들고, 0.2 μM 주사기 필터를 사용하여 멸균성 여과시켜 최종 생성물을 수득할 수 있다.
ShK의 폴딩 (디설파이드 결합 형성). 모노-PEG화 (옥심화) ShK를 수중 20% AcOH (v/v)에 용해시킨 다음, 물로 희석시켜 1 ml당 대략 0.15 mg 펩티드의 농축물로 만들고, NH4OH (28-30%)를 사용하여 pH를 약 8.0으로 조정한 다음, 실온에서 36시간 동안 온화하게 교반시킬 수 있다. 폴딩 공정을 LC-MS 분석에 의해 모니터링할 수 있다. 이 후, 폴딩된 모노-PEG화 (옥심화) ShK (펩티드 9)를 선형 구배 0-40% 완충액 B, 120분 (A: 수중 0.1% TFA, B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)를 이용하고 1" 루나 5 ㎛ C18 100Å 프로테오 칼럼을 사용하여 역상 HPLC함으로써 정제할 수 있다. 모노-PEG화 (옥심화) ShK 디설파이드 연결성은 C1-C6, C2-C4, C3-C5일 수 있다.
(펩티드 9, 서열 10)
실시예 34
N-말단적 PEG화 ShK (아미드화)
본 작동 실시예의 실험 과정은 도 18에 도시된 결과에 상응한다.
아미드 형성에 의한 ShK의 N-말단 PEG화. 100 mM 바이신 (Bicine) pH 8.0 중의 폴딩된 ShK (펩티드 5)의 10 mg/mL 용액을, ShK에 대한 1.5몰 과량의 mPEG-SPA를 사용하여 실온 하에 20 kDa PEG 프로피온산 (mPEG-SPA; CH3O-[CH2CH2O]n-CH2CH2CO-NHS)의 고형 석신이미딜 에스테르에 가할 수 있다. 온화하게 교반시키면서 1시간 후에, 상기 혼합물을 물로 2 mg/mL이 되도록 희석시킬 수 있고, 묽은 HCl을 사용하여 pH를 4.0으로 조정할 수 있다. 0.05 M NaH2PO4, 0.05 M Na2HPO4, 0.15 M NaCl, 0.01 M NaN3, pH 6.8으로 1 mL/min 하에 용출시킨 슈퍼덱스 (Superdex™) 75 HR 10/30 칼럼 (공급처: Amersham)을 사용하여 SEC HPLC함으로써, 모노-PEG화 Shk (펩티드 10), 몇몇 디-PEG화 Shk 또는 트리-PEG화 Shk, 변형되지 않은 Shk 및 석신이미딜 에스테르 가수분해 정도를 결정할 수 있다. 4-20 트리스-Gly SDS-PAGE 겔 및 RP-HPLC을 사용하여 분획을 분석할 수 있다. SDS-PAGE 겔을 125 V, 35 mA, 5 W에서 1.5시간 동안 수행할 수 있다. 이어서, 모은 생성물을 1 L의 A4S 완충액 (10 mM NaOAc, 5% 솔비톨, pH 4.0) 3가지 변화물 중에서 4℃ 하에 투석할 수 있다. 그 다음, 이와 같이 투석시킨 N-말단적 PEG화 (아미드화) ShK (펩티드 10)를 10 K 미소원심분리용 필터에서 농축시켜 2 mL 용적으로 만들고, 0.2 μM 주사기 필터를 사용하여 멸균성 여과시켜 최종 생성물을 수득할 수 있다.
(펩티드 10, 서열 10)
실시예 35
Fc-L-SmIIIA
Fc-SmIIIA 발현 벡터. 부분 링커 서열 및 인간 고 주파수 코돈으로 암호화시킨 SmIIIA 펩티드를 함유하는 104 bp BamHI-NotI 단편을, 중복 프라이머 3654-50 및 3654-51을 사용하여 PCR함으로써 어셈블리하고, 7.1 kb NotI-BamHI 주쇄 내로 클로닝하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-SmIIIA를 생성시켰다.
최종 구조물에서 BamHI 내지 NotI 단편의 서열은 서열 분석에 의해 검증되었다.
Fc-L-SmIIIa의 일시적 발현. 7.5 ㎍의 독소 펩티드 Fc 융합 구조물 pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-SmIIIA를 형질감염 시약으로서 푸젠 6을 사용하여 10 cm 조직 배양 판에서 293-T 세포 내로 형질감염시켰다. 배양 배지를 형질감염 후 24시간째에 혈청 무함유 배지로 대체시키고, 형질감염 후 5일째에 적응용 배지를 수거하였다. 293-T 세포로부터 Fc-SmIIIA의 일시적 발현은 항-hFc 항체를 사용하여 프로빙된 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다 (도 25A 및 도 25B). 추정 MW를 갖는 발현된 단백질의 단일 밴드가 환원된 샘플과 비-환원된 샘플 둘 다에서 나타났다. Fc-SmIIIA의 일시적 발현 수준은 ELISA에 따라서 73.4 ㎍/ml인 것으로 추가 결정되었다.
실시예 36
전기생리학 실험
세포 배양. 인간 Kv1.3 채널을 발현하는 안정한 세포주가 공급처 [Biofocus]로부터 허가되었다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 환경 하에 유지시켰다. 배양 배지는 DMEM [GlutaMax™, 공급처: Invitrogen], 1X 비-필수 아미노산, 10% 태아 소 혈청 및 500 ㎍/mL 제네티신을 함유하였다. 세포를 도말하고, 전기생리학 실험하기에 앞서 적어도 24시간 동안 35 mm 배양 디쉬 상에서 저 밀집도로 성장시켰다.
패치 클램핑에 의한 전기생리학 기록. 패치-클램프 기술의 조밀한 실 형상을 이용함으로서 단일 세포로부터 완전 세포 전류를 기록하였다. 배양 배지를 135 mM NaCl. 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 및 5 mM 글루코스를 함유하는 기록용 완충액으로 세정 및 대체한 후에, 35 mm 배양 디쉬를 기록계로 옮겼다. NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하고, 삼투압을 300 mOsm으로 설정하였다. 유리 모세관을 기록하고자 하는 세포 상부에 직접적으로 위치시키는 전동식 막대에 부착되고 나란히 배열된 유리 모세관들 중의 하나를 통하여 기록용 완충액을 세포에 지속적으로 관류하였다. 기록 피펫 용액은 90 mM K-글루코네이트, 20 mM KF, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2-6H20, 10 mM EGTA, 5 mM K2-ATP, 및 10 mM HEPES를 함유하였다. KOH를 사용하여 내부 용액에 대한 pH를 7.4로 조정하고, 삼투압을 280 mOsm으로 설정하였다. 실험을 실온 (20-22℃)에서 수행하고, 멀티클램프 (Multiclamp™) 700A 증폭기 (공급처: Molecular Devices Inc.)를 사용하여 기록하였다. 피펫 저항은 전형적으로 2-3 MΩ이었다.
Kv1.3 전류에 대한 단백질 독소 효력 결정. 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 -80 mV 유지 전위에서 전압 클램핑하였다. 외측 Kv1.3 전류는 -80 mV 유지 전위로부터 +30 mV에 200 msec 장 탈분극 단계를 제공함으로써 활성화시키고, 3 kHz으로 여과시켰다. 각 탈분극 단계는 10초 간격으로 후속 단계와 격리시켰다. 유사한 신호를 디지다타 (Digidata™) 1322A 디지털기 (공급처: Molecular Devices)에 의해 디지털화한 후에, 클램프피트 (Clampfit™) 9 (공급처: Molecular Devices Inc.)를 사용하여 오프라인 분석하기 위해 컴퓨터 디스크 상에 저장하였다. 모든 연구에서는, 단백질 독소를 증분 농도로 관류하기 전 4분 동안, 안정한 기준선 Kv1.3 전류 진폭을 확립하였다. 후속 농도의 단백질 독소를 관류시키기 전에 정지 상태 차단을 항상 달성하였다.
데이터 분석. 다음 방정식에 기초하여 대조군 비율 (POC)을 계산하였다: (단백질 독소 부가 후 Kv1.3 전류/대조군 중의 Kv1.3 전류)* 100. 적어도 5가지 농도의 단백질 독소 (예를 들어, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 100 nM)를 사용하여 IC5O 값을 계산하였다. IC5O 값과 곡선 피트는 XLfit 소프트웨어 (공급처: Microsoft Corp.)의 4가지 파라미터 로지스틱 피트를 사용하여 평가하였다. IC5O 값은 평균 값 ± s.e.m. (평균의 표준 오차)로서 제시하였다.
약물 제제. 단백질 독소 (전형적으로 10 내지 100 μM)를 증류수에 용해시킨 다음, -80℃ 하에 동결 유지시켰다. 원액 단백질 독소의 일련의 희석물을, 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 기록 완충액과 혼합한 후, 유리 관류 저장고에 옮겼다. 전자 핀치 밸브는 단백질 독소가 상기 저장고로부터 기록하고자 하는 세포 상으로 유동되는 것을 조절하였다.
실시예 37
면역생물학 및 채널 결합
PBMC의 PMA 및 항-CD3 항체 자극 후 T 세포 사이토킨 생성의 억제. PBMC를 정상적인 인간 공여자 백혈구성분 채집용 팩으로부터 미리 분리하고, 밀도 구배 원심분리 (Ficoll Hypaque)함으로써 정제하며, CPZ 냉동보존 완전 배지 (INCELL, MCPZF-100 + 10% DMSO 최종)에서 냉동보존하였다. PBMC를 해동시키고 (95% 생육성), 세척한 다음, 96-웰 평저 조직 배양 판 중에서 10% 태아 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10O μM 비-필수 아미노산 및 2O μM 2-ME로 보충시킨 배양 배지 (RPMI 배지 1640; 공급처: GlBCO)에서 웰당 2 x 105개 세포로 시딩하였다. 세포를 최종 검정 용적 200 ㎕에서 PMA/항-CD3 (각각 1 ng/ml 및 50 ng/ml)로 48시간 동안 자극하기 전 90분 동안, 일련으로 희석된 (100 nM-0.001 nM 최종) ShK[1-35], Fc-L10-ShK[1-35] 또는 fc 대조군과 함께 예비항온 배양하였다. 다음 기기 [Meso Scale Discovery (MSD) SECTOR™ Imager 6000 (공급처: Meso Scale Discovery, Gaithersbury, MD)]를 사용하여 검정 샘플 분석을 수행하여, 전기화학발광 (ECL)을 활용함으로써 IL-2 및 IFNg 단백질 수준을 측정하였다. 적응용 배지 (50 ㎕)를 MSD 다중-스폿 96-웰 판 (각 웰은 3가지 포획 항체 IL-2, TNF, IFNγ를 함유한다)에 가하였다. 이 판을 밀봉시키고, 주석 호일로 싼 다음, 2시간 동안 판 진탕기 상에서 실온 하에 항온 배양하였다. 상기 웰을 200 ㎕ PBST (BIOTEK, Elx405 Auto Plate Washer)로 1회 세척하였다. 각 웰에 대해, 20 ㎕의 루테늄-표지된 탐지 항체 (항체 희석 완충액 중의 1 ㎍/ml 최종; IL-1, TNF, IFNγ) 및 130 ㎕의 2X MSD 판독 완충액을 최종 용적 150 ㎕로 가하였다. 상기 판을 밀봉시키고, 주석 호일로 싼 다음, 판 진탕기 상에서 1시간 동안 실온 하에 항온 배양하였다. 이어서, 상기 판을 SECTOR™ 영상화기 6000 상에서 판독하였다. 도 35A & 35B는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가 T 세포로부터의 IL-2 및 IFNγ 생성을 용량-의존적 방식으로 강력하게 억제한다는 것을 도시한 것이다. 본래의 ShK[1-35] 펩티드와 비교해서, 상기 펩티보디는 보다 큰 정도의 억제를 야기시킨다 (POC = 억제제의 부재 하에서의 반응 대조군의 비율).
PBMC의 항-CD3 및 항-CD28 항체 자극 후 T 세포 사이토킨 생성의 억제. PBMC를 정상적인 인간 공여자 백혈구성분 채집용 팩으로부터 미리 분리하고, 밀도 구배 원심분리 (Ficoll Hypaque)함으로써 정제하며, INCELL 냉동 배지를 사용하여 냉동보존하였다. PBMC를 해동시키고 (95% 생육성), 세척한 다음, 96-웰 평저 판 내로 웰당 2 x 105개 세포로 (혈청 보충물, PSG를 함유하는 RPMI 완전 배지에) 시딩하였다. 세포를 최종 검정 용적 200 ml에서 aCD3 및 aCD28 (각각 2.5 ng/ml 및 100 ng/ml)를 부가하기 전 1시간 동안, 일련으로 희석된 (100 nM-0.003 nM 최종) ShK[1-35], Fc-L10-ShK[1-35] 또는 Fc 대조군과 함께 예비항온 배양하였다. 48시간 후에 상등액을 수집하고, 다음 기기 [Meso Scale Discovery (MSD) SECTOR™ Imager 6000 (공급처: Meso Scale Discovery, Gaithersbury, MD)]를 사용하여 분석하여, 전기화학발광 (ECL)을 활용함으로써 IL-2 및 IFNg 단백질 수준을 측정하였다. 20 ml의 상등액을 MSD 다중-스폿 96-웰 판 (각 웰은 IL-2, TNFα, IFNγ 포획 항체를 함유한다)에 가하였다. 이 판을 밀봉시키고, 1시간 동안 판 진탕기 상에서 실온 하에 항온 배양하였다. 이어서, 20 ml의 루테늄-표지된 탐지 항체 (항체 희석 완충액 중의 1 ㎍/ml 최종 IL-1, TNFα, IFNγ) 및 110 ml의 2X MSD 판독 완충액을 가하였다. 상기 판을 밀봉시키고, 주석 호일로 덮은 다음, 판 진탕기 상에서 1시간 동안 실온 하에 항온 배양하였다. 이어서, 상기 판을 SECTOR™ 영상화기 6000 상에서 판독하였다. 도 37A & 37B는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가 T 세포로부터의 IL-2 및 IFNγ 생성을 용량-의존적 방식으로 강력하게 억제한다는 것을 도시한 것이다. 부분적 억제만을 나타내는 본래의 ShK[1-35] 펩티드와 비교해서, 상기 펩티보디는 염증성 사이토킨 반응을 거의 완전히 억제시킨다 (POC = 억제제의 부재 하에서의 반응 대조군의 비율).
PBMC의 항-CD3 및 항-CD28 항체 자극 후 T 세포 증식의 억제. PBMC를 정상적인 인간 공여자 백혈구성분 채집용 팩으로부터 미리 분리하고, 밀도 구배 원심분리 (Ficoll Hypaque)함으로써 정제하며, CPZ 냉동보존 완전 배지 (INCELL, MCPZF-100 + 10% DMSO 최종)에서 냉동보존하였다. PBMC를 해동시키고 (95% 생육성), 세척한 다음, 96-웰 평저 조직 배양 판 중에서 10% 태아 송아지 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10O μM 비-필수 아미노산 및 2O μM 2-ME로 보충시킨 배양 배지 (RPMI 배지 1640; 공급처: GlBCO)에서 웰당 2 x 105개 세포로 시딩하였다. 세포를 항-인간 CD32 (FcyRII) 차단성 항체 (제조업자 지시에 따름; EASY SEP Human Biotin Selection Kit #18553, StemCell Technologies Vancouver, BC) 또는 Fc-L1O-ShK (100 nM-0.001 nM 최종)과 함께 45분 동안 예비항온 배양하였다. 이어서, Fc-L1O-ShK (100 nM-0.001 nM 최종)을, 항-인간 CD32 차단성 항체를 함유하는 세포에 가하는 동안, 배지를 Fc-L1O-ShK 함유 세포에 가하였다. 양 세트를 aCD3/aCD28 (각각 0.2 ng/ml 및 100 ng/ml)로 48시간 동안 자극하기 전에 45분 더 항온 배양하였다. 최종 검정 용적은 200 ㎕였다. [3H]TdR (웰당 1 μCi)을 가하고, 판을 16시간 더 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 유리 섬유 필터 상으로 수거하고, 방사능을 B-신틸레이션 계수기에서 측정하였다. 도 36A & 36B는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가 T 세포의 증식을 용량-의존적 방식으로 강력하게 억제한다는 것을 도시한 것이다. 항-CD32 (FcR) 차단성 항체로 예비-차단시키는 것은 T 세포 증식을 억제할 수 있는 펩티보디의 능력에 거의 영향을 미치지 못하였는데, 이는 Kv1.3 억제를 제안하고, FcR 결합은 관찰된 억제에 대한 기전이 아니라는 것을 제안한다 (POC = 억제제의 부재 하에서의 반응 대조군의 비율).
인간 Kv1.3을 과발현하는 HEK 293 세포에 대한 Fc-L10-ShK[1-35] 결합성에 관한 면역조직화학 분석. 인간 Kv1.3을 과발현하는 HEK 293 세포 (HEK Kv1.3)는 공급처 [BioFocus plc (Cambridge, UK)]로부터 수득하였고, 제조업자의 권고안에 따라 유지시켰다. 모 HEK 293 세포주를 대조군으로서 사용하였다. 세포를 폴리-D-리신 24 웰 판 (#35-4414; 공급처: Becton-Dickinson, Bedford, MA) 상으로 도말하고, 대략 70% 밀집도가 되도록 성장시켰다. HEK KV1.3을 배지 1 ml/웰 중에서 0.5 x 105개 세포/웰로 도말하였다. HEK 293 세포를 배지 1 ml/웰 중에서 0.5 x 105개 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 염색하기 전에, 세포 성장 배지를 꺼내고, 0.2 ml/웰 포르말린 용액을 부가한 다음, 실온에서 10분 동안 항온 배양함으로써, 세포를 포르말린 (사용하기 전에 PBS/0.5% BSA로 1:1 희석시킨 Sigma HT50-1-1 포르말린 용액)으로 고정시켰다. 세포를 실온에서 30초 동안 PBS/BSA 중의 5 ㎍/ml의 Fc-L10-ShK[1-35] 0.2 ml/웰과 함께 항온 배양함으로써 염색시켰다. Fc-L10-ShK[1-35]를 흡인시킨 다음, 세포를 PBS/0.5% BSA로 1회 세척하였다. 탐지 항체 [염소 F(ab)2 항-인간 IgG-피코에리트린; 공급처: Southern Biotech Associates, Birmingham, AL]를 상기 웰에 PBS/0.5% BSA 중의 5 ㎍/ml으로 가하고, 실온에서 30초 동안 항온 배양하였다. 세포를 PBS/0.5% BSA로 1회 세척하고, 공촛점 현미경 (LSM 510 Meta Confocal Microscope; 공급처: Carl Zeiss AG, Germany)를 이용하여 조사하였다. 도 33B는 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가 Kv1.3 과발현성 HEK 293 세포와는 결합을 유지하고 있지만, 형질감염시키지 않은 세포와는 거의 결합하지 않는데 (도 33A), 이는 Fc-L10-ShK[1-35] 펩티보디가 Kv1.3 채널을 과발현하는 세포를 탐지하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다는 지표이다. 활성화 T 효과기 기억 세포가 Kv1.3을 과생성시키는 것으로 보고된 질병 환경 하에서는, 상기 시약이 이들 세포의 표적화와 그들의 탐지 둘 다에 유용할 수 있다.
Kv1.3을 과발현하는 고정된 HEK 293 세포에 대한 Fc-L10-ShK[1-35] 결합성을 입증하는 ELISA 검정. 도 34A는 Kv1.3을 과발현하는 고정된 세포에 대한 상기 펩티보디 결합성의 용량 의존적 증가를 도시하고 있는데, 이는 상기 펩티보디가 그의 표적에 대한 고 친화도 결합을 나타내고, 상기 채널을 발현하는 세포를 탐지하는데 있어서의 Fc-L10-ShK[1-35] 분자의 유용성을 입증해준다. 다발성 경화증 환자에게서 질병을 유발시키는 항원 특이적 T 세포는 완전 세포 패치 클램프 전기생리학 (힘든 접근 방식)에 의해 Kvl.3을 과발현하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들의 펩티보디 시약은 환자에게서 Kvl.3 채널 발현을 모니터링하는데 유용하고 편리한 도구일 수 있고 진단 적용에도 유용하였다. 도 34A 및 도 34B에 제시된 과정은 다음과 같다.
도 34A. 완전 세포 면역검정을 수행하여 본래의 Fc-L10-ShK[1-35]가 Kv1.3 형질감염된 HEK 293 세포 (공급처: BioFocus plc, Cambridge, UK)와 결합한다는 것을 밝혀내었다. 모 HEK 293 세포 또는 HEK Kv1.3 세포를 폴리-D-리신 피복된 96 웰 판 (#35-4461; 공급처: Becton-Dickinson, Bedford, MA)에서 3 x 104개 세포/웰로 도말하였다. 세포 성장 배지를 꺼내고, 0.2 ml/웰 포르말린 용액을 부가하며, 실온에서 25분 동안 항온 배양한 다음, 100 ㎕/웰의 PBS/0.5% BSA로 1회 세척함으로써, 세포를 포르말린 (사용하기 전에 PBS/0.5% BSA로 1:1 희석시킨 Sigma HT50-1-1 포르말린 용액)으로 고정시켰다. 0.3 ml/웰의 BSA 차단제 (50-61-00; PBS를 이용하여 1:1로 희석시킨 KPL 10% BSA 희석제/차단 용액; 공급처: KPL, Gaithersburg, MD)를 부가한 다음, 3시간 동안 진탕시키면서 실온 하에 항온 배양함으로써 웰을 차단시켰다. 판을 1x KP 세척 완충액 (50-63-00; 공급처: KPL)로 2회 세척하였다. 샘플을 희석 완충액 (PBS/0.5% Tween-20) 또는 1% 숫컷 루이스 랫트 혈청을 수반한 희석 완충액 (RATSRM-M; 공급처: Bioreclamation Inc., Hicksville, NY)에서 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 항온 배양하면서 0.1 ml/웰을 상기 차단된 판에 가하였다. 판을 1xKP 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, PBS/0.1% Tween-20 중에서 1:5000으로 희석시킨 HRP-염소 항-인간 IgG Fc (#31416; 공급처: Pierce, Rockford, IL)와 함께, 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 1xKP 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 0.1 ml/웰 TMB 기질 (52-00-01; 공급처: KPL)을 가하였다. 0.1 ml/웰 2 N 황산을 부가함으로써 반응을 중지시켰다. 다음 장치 [Molecular Devices SpectroMax 340 (Sunnyvale, CA)] 상에서 450 nm 하에 흡광도를 판독하였다.
도 34B. 완전 세포 면역검정을 다음의 변형을 수반하여 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. HEK 293 세포를 폴리-D-리신 피복된 96 웰 판에서 1 x 105개 세포/웰로 도말하고, HEK Kv1.3 세포를 6 x 104개 세포/웰로 도말하였다. Fc 대조군을 0.05 ml/웰의 용적에서 500 ng/ml로 가하였다. HRP-염소 항-인간 IgG Fc (#31416; 공급처: Pierce, Rockford, IL)를 PBS/0.1% Tween-20에서 1:10,000으로 희석시켰다. ABTS (50-66-00, KPL)를 기질로서 사용하였다. 0.1 ml/웰의 1% SDS를 부가함으로써 상기 반응을 중지시킨 후에, 405 nm 하에서의 흡광도를 판독하였다.
실시예 38
Fc-L10-ShK[1-35]의 정제
Fc-L10-ShK[1-35]의 발현은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같았다. 동결된 이. 콜라이 페이스트 (18 g)를 200 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 15분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 15분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 15분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 (3.2 g)을 32 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이러한 펠릿 용액을 실온에서 15분 동안 27,000 g으로 원심분리시킨 다음, 5 ml의 상등액을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 500 ml의 리폴딩 완충액 (3 M 우레아, 20% 글리세롤, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 5 mM EDTA, 1 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 9.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 2일 동안 지속하였다. 그 다음, 리폴딩 용액을 -70℃ 하에 저장하였다.
이와 같이 저장한 리폴딩물을 녹인 다음, 2 L의 물로 희석시키고, 1 M H3PO4를 사용하여 pH를 7.3으로 조정하였다. pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 7℃ 하에 20 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.3) 중의 60 ml 아머샴 SP-FF (2.6 cm I.D.) 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 0% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 7℃에서 10 ml/min으로 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다. 이어서, 상기 풀을 7℃에서 1 ml/min으로 PBS 중의 1 ml 아머샴 단백질 A 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이 컬럼을 20 mM NaH2PO4 pH 6.5, 1 M NaCl의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 100 mM 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. 용출 피크에, 0.0125 용적 (25 ml)의 3 M 나트륨 아세테이트를 가하였다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ 물에서 희석시킨 상기 합한 풀 50 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 46A). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,410 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 2.56 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 46B). 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 20 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 46C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ml)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다. 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
"Fc-L-ShK[1-35]"로서 지칭되기도 하는 정제된 이. 콜라이-유래된 Fc-L10-ShK[1-35]에 의한 인간 Kv1.3의 차단에 대한 IC50이 표 35 (하기 실시예 50)에 제시되었다.
실시예 39
세균성 발현된 Fc-L10-ShK(2-35)의 정제
Fc-L10-ShK[2-35]의 발현은 상기 실시예 4에 기재된 바와 같았다. 동결된 이. 콜라이 페이스트 (16.5 g)를 200 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 15분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 15분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 200 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 15분 동안 22,000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 (3.9 g)을 39 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이러한 펠릿 용액을 실온에서 15분 동안 27,000 g으로 원심분리시킨 다음, 5 ml의 상등액을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 500 ml의 리폴딩 완충액 (3 M 우레아, 20% 글리세롤, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 5 mM EDTA, 1 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 9.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 2일 동안 지속하였다. 그 다음, 리폴딩 용액을 -70℃ 하에 저장하였다.
이와 같이 저장한 리폴딩물을 녹인 다음, 2 L의 물로 희석시키고, 1 M H3PO4를 사용하여 pH를 7.3으로 조정하였다. pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 7℃ 하에 20 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.3) 중의 60 ml 아머샴 SP-FF (2.6 cm I.D.) 칼럼 상으로 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 0% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 7℃에서 10 ml/min으로 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 목적 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시켰다. 이어서, 상기 풀을 7℃에서 2 ml/min으로 PBS 중의 1 ml 아머샴 단백질 A 하이트랩 칼럼 상으로 부하하였다. 이 컬럼을 20 mM NaH2PO4 pH 6.5, 1 M NaCl의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 100 mM 글리신 pH 3.0으로 용출시켰다. 용출 피크에, 0.0125 용적 (18 ml)의 3 M 나트륨 아세테이트를 가하고, 샘플을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시켰다.
그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ 물에서 희석시킨 상기 합한 풀 20 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 40A). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 29,282 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 3.20 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 40B). 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 50 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 40C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ml)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다 (도 40D). 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
"Fc-L-ShK[2-35]"로서 지칭되기도 하는 정제된 이. 콜라이-유래된 Fc-L10-ShK[2-35]에 의한 인간 Kv1.3의 차단에 대한 IC50이 표 35 (하기 실시예 50)에 제시되었다.
실시예 40
세균성 발현된 Fc-L10-OSK1의 정제
동결된 이. 콜라이 페이스트 (129 g; 실시예 10 참고)를 1290 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 7.8와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 15분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 1290 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 15분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 1290 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 15분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 8 g (총 16.3 g)을 160 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이러한 펠릿 용액 100 ml을 37℃ 하에 60분 동안 1 ml의 1 M DTT와 함께 항온 배양하였다. 환원된 물질을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 2 ml/min으로 5000 ml의 리폴딩 완충액 (1 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 2.5 mM EDTA, 1.2 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 10.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 3일 동안 지속하였다.
상기 리폴딩물의 pH를 아세트산을 사용하여 8.0으로 조정하였다. pH 조정시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 8℃ 하에 10 ml/min으로 인라인 50 아머샴 단백질 A 칼럼 (2.6 cm I.D.)과 함께 Q-완충액 A (20 mM 트리스, pH 8.5) 중의 50 ml 아머샴 Q 세파로스-FF (2.6 cm I.D.) 칼럼 상으로 부하하였다. 부하 후, Q 세파로스 칼럼을 회로로부터 꺼내고, 나머지 크로마토그래피를 단백질 A 칼럼 상에서 수행하였다. 이 칼럼을 Q-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 8℃에서 20 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.3) 중의 50 ml 아머샴 SP-세파로스 HP 칼럼 (2.6 cm I.D.) 칼럼 상으로 즉시 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하였다. 목적 생성물 벌크를 함유하는 분획을 모은 다음, 8℃ 하에 MEP 완충액 A (20 mM 트리스, 200 mM NaCl, pH 8.0) 중에서 5 ml/min으로 75 ml MEP 하이퍼셀 (Hypercel) 칼럼 (2.6 cm I.D.)에 적용하였다. 칼럼을 5% 내지 50% MEP 완충액 B (50 mM 나트륨 시트레이트 pH 4.0)의 선형 구배로 용출시킨 다음, 100% MEP 완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 목적 생성물 벌크를 함유하는 분획을 모았다.
이어서, 10 kDa 막을 수반한 폴 점보 (Pall Jumbo)-Sep를 사용한 다음, 동일한 막을 이용한 제형 완충액 (20 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, pH 7.0)으로의 완충액 교환을 사용하여, MEP 풀을 약 20 ml로 농축시켰다. 그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ 정제 완충액에서 희석시킨 상기 합한 풀 50 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 41A). 상기 물질의 농도는 분자량 계산치 30,558 g/mol과 흡광 계수 35,720 M-1cm-1를 이용하여 4.12 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 상기 물질의 순도를 평가하였다 (도 41B). 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 123 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 41C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여, 대략 4 ㎍의 샘플을 RP-HPLC 칼럼 (Vydac C4, 1 x 150 mm)을 통하여 크로마토그래피함으로써 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 용매 A는 수중 0.1% 트리플루오로아세트산이었고, 용매 B는 90% 아세토니트릴, 10% 수중의 0.1% 트리플루오로아세트산이었다. 칼럼을 80 ㎕/min의 유속으로 10% 용매 B 중에서 예비평형시켰다. 단백질을 30분에 걸쳐 10% 내지 90% 용매 B의 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. 용출액 일부를 LCQ 이온 트랩 질량 분광계 내로 지시하였다. 질량 분광계 제조업자에 의해 공급된 바이오워크스 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼을 풀어내었다 (도 41D). 생성물을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, -80℃ 하에 저장하였다.
이. 콜라이 발현된 Fc-L10-OSK1 프렙에 대한 수득량은 40 g의 세포 페이스트로부터 81 mg였고 [129 g x (8g / 16.3g) x (100 ml / 160 ml) = 39.6 g (이는 40 g으로 반올림하였다], 순도는 SDS-PAGE에 의해 판단해서 80%를 초과하였으며, 이는 SEC-HPLC에 의해 판단하여 예측 이량체로서 수행되고, 질량은 MS에 의해 판단한 예측 분자량 범위 내였다.
"Fc-L-OSK1"로서 지칭되기도 하는 정제된 이. 콜라이-유래된 Fc-L10-OSK1에 의한 인간 Kv1.3의 차단에 대한 IC50이 표 35 (하기 실시예 50)에 제시되었다.
실시예 41
포유류 세포에 의해 발현된 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]
Kv1.3의 억제제인 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]를 포유류 세포에서 발현시켰다. Kv1.3 억제제 펩티드 OSK1, OSK1[K7S], OSK1[E16K,K20D] 또는 OSK1[K7S,E16K,K20D]의 단량체 및 링커 서열과 동일 프레임 내에서 융합된 인간 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 DNA 서열을 다음에 기재된 바와 같이 구축하였다. 포유류 세포 (HEK 293 및 중국산 햄스터 난소 세포)로부터 펩티보디를 발현 및 정제하는 방법은 본원에 기재되었다.
Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D] 발현 벡터를 구축하기 위해, PCR 전략을 이용하여 완전한 길이의 유전자 OSK1, OSK1[K7S], OSK1[E16K,K20D] 및 OSK1[K7S,E16K,K20D]를 생성시켰는데, 각각은 2개의 중지 코돈을 수반한 4개 글리신 및 1개 세린 아미노산 링커에 연결되었고 다음에 제시된 바와 같이 BamHI 및 NotI 제한 부위에 의해 플랭킹되었다.
다음에 제시된 바와 같은 서열을 수반한 각각의 OSK1, OSK1[K7S], OSK1[E16K,K20D] 및 OSK1[K7S,E16K,K20D]에 대한 2개 올리고를, 95℃-30초, 55℃-30초, 및 75℃-45초 하에 35주기 동안 다음 폴리머라제 [PfuTurbo HotStart DNA 폴리머라제 (공급처: Stratagene)]를 이용한 PCR 반응에 사용하였다; BamHI (ggatcc) 및 NotI (gcggccgc) 제한 부위가 밑줄처져 있다.
이로써 생성된 PCR 생성물은 4% 아가로스 겔 상에서 155 bp 밴드로서 용해되었다. 이러한 155 bp PCR 생성물을 PCR 정제용 키트 (공급처: Qiagen)을 사용하여 정제한 다음, BamHI 및 NotI (공급처: Roche) 제한 효소로 분해시키고, 겔 추출용 키트 (공급처: Qiagen)에 의해 아가로스 겔을 정제하였다. 이와 동시에, pcDNA3.1(+)CMVi-hFc-ShK[2-35] 벡터를 BamHI 및 NotI 제한 효소로 분해시키고, 큰 단편을 겔 추출용 키트에 의해 정제하였다. 이와 같이 겔 정제된 PCR 단편을 상기 정제된 큰 단편에 연결시키고, 원 샷 (One Shot®) Top10F' (공급처: Invitrogen) 내로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 세균성 집락으로부터 DNAs를 분리하고, BamHI 및 NotI 제한 효소로 분해시킨 다음, 2% 아가로스 겔 상에서 용해시켰다. 예상 패턴을 나타내는 DNAs을 서열 분석용으로 제출하였다. 클론의 몇 가지 서열을 분석한 결과 상기 서열과의 100% 정합물이 산출되긴 하였지만, 각 유전자로부터 단지 1개의 클론 만이 대규모 플라스미드 정제를 위해 선별되었다. pCMVi 벡터 중의 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 DNA를 재서열 분석하여 Fc와 링커 영역을 확증하였는데, 이 서열은 상기 서열과 100% 동일하였다. Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 서열 및 그림으로 나타낸 것이 도 42A-B, 도 43A-B, 도 44A-B 및 도 45A-B에 각각 도시되었다.
pCMVi 단백질 중의 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 일시적 형질감염 발현에 사용된 HEK-293 세포를, DMEM 고 글루코스 (공급처: Gibco), 10% 태아 소 혈청 (FBS; 공급처: Gibco), 1X 비-필수 아미노산 (NEAA; 공급처: Gibco) 및 1X 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Pen/Strep/Glu; 공급처: Gibco)을 함유하는 성장 배지에서 배양하였다. 페놀/클로로포름 추출시킨 pCMVi 플라스미드 중의 5.6 ㎍의 각각의 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]를, 푸젠 6 (공급처: Roche)을 이용하여 HEK-293 세포 내로 형질감염시켰다. 세포를 24시간 동안 회수한 다음, DMEM 고 글루코스, 1x NEAA 및 1X Pen/Strep/Glu 배지에 48시간 동안 놓아두었다. 하기 실시예 50에 기재된 프로토콜을 사용하여 Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]를 상기 형질감염된 HEK-293 세포에 의해 적응시킨 배지로부터 정제하였다.
15 ㎕의 적응용 배지를 자가 4x 부하 완충액 (β-머캅토에탄올을 수반하지 않음)과 혼합하고, 20 ㎕의 벤크마크 예비염색된 단백질 래더 (공급처: Invitrogen)와 함께 1x 겔 수행 용액 (25 mM 트리스 기제, 192 mM 글리신, 3.5 mM SDS) 중에서 2시간 동안 101 V/46 mA 하의 노벡스 엑셀 II 장치를 이용하여 노벡스 4-20% 트리스-글리신 겔 상에서 전기영동하였다. 이어서, 상기 겔을 전기블롯 완충액 (25 mM 트리스 기제, 192 mM 글리신, 20% 메탄올)에 5분 동안 침지시켰다. 인비트로젠 (Invitrogen)으로부터의 니트로셀룰로스 막 (Cat. No. LC200, 0.2 ㎛ 공극 크기)를 전기블롯 완충액에 침지시켰다. 예비-침지된 겔을, 300 mA 하에 2시간 동안 제조업자의 지시 (Bio-Rad Laboratories)에 따라서 미니 트랜스-블롯 셀 (Mini Trans-Blot Cell) 모듈을 사용하여 니트로셀룰로스 막에 블롯팅하였다. 상기 블롯을, 0.1% 트윈20을 수반한 트리스 완충 식염수 용액 pH 7.5 (TBST)에서 세정시켰다. 이어서, 상기 블롯을 먼저, 실온에서 1시간 동안 TBST 중의 5% 우유 (Carnation)에 침지시킨 다음, 세척당 10분 동안 TBST 중에서 3회 세척하였다. 이어서, 실온에서 1시간 진탕시키는 동안 5% 우유 완충액을 수반한 TBST 중의 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG, (Fcγ) 항체 (공급처: Pierece Biotechnology Cat, no. 31413)의 1:1000 희석물과 함께 항온 배양하였다. 이어서, 상기 블롯을 실온에서 세척당 15분 동안 TBST 중에서 3회 세척하였다. 제조업자의 지시에 따라서 아머샴 파마시아 바이오텍 ECL 웨스턴 블롯팅 탐지 시약을 사용하여 일차 항체를 탐지하였다. ECL 탐지시, 웨스턴 블롯 분석은 비-환원성 겔 조건 하에서 예상 크기가 66 kDa이라고 표시하였다 (도 46).
pCMVi 벡터 중의 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D] 삽입물을 함유하는 플라스미드를 XbaI 및 NotI (공급처: Roche) 제한 효소로 분해시키고 겔 정제하였다. 상기 삽입물을 SpeI 및 NotI (공급처: Roche) 분해된 pDSRα24 (공급처: Amgen Proprietary) 발현 벡터 내로 개별적으로 연결시켰다. 이로써 생성된 구조물의 완전성은 DNA 서열 분석함으로써 확증하였다. 클론의 몇 가지 서열을 분석한 결과 상기 서열과의 100% 정합물이 산출되긴 하였지만, 단지 1개의 클론 만이 대규모 플라스미드 정제를 위해 선별되었다.
Fc-L10-OSK1 단백질의 안정한 발현에 사용된 AM1 CHOd- (공급처: Amgen Proprietary) 세포를, DMEM 고 글루코스, 10% 태아 소 혈청, 1x 히포크산틴/티미딘 (HT; 공급처: Gibco), 1X NEAA 및 1X Pen/Strep/Glu를 함유하는 AM1 CHOd- 성장 배지에서 배양하였다. 5.6 ㎍의 pDSRα-24-Fc-L10-OSK1 플라스미드를, 푸젠 6을 사용하여 AM1 CHOd- 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간 후, 세포를 집락 선별을 위해 1:50 희석율 하에 DHFR 선별 배지 [DMEM 고 글루코스 + 10% 투석된 태아 소 혈청 (dFBS), 1x NEAA 및 1X Pen/Strep/Glu] 내로 1:11로 분할하였다. 세포를 DHFR 선별 배지에서 13일 동안 선별하였다. 이로써 생성된 집락의 10개 10-㎠ 풀을 10개 T-175 플라스크 내로 팽창시킨 다음, 10개 롤러 병으로 확대한 다음, AM1 CHOd- 생성 배지 [DMEM/F12 (1:1), 1X NEAA, 1X 나트륨 피루베이트 (Na 피루베이트), 1X Pen/Strep/Glu 및 1.5% DMSO] 하에 배양하였다. 이러한 적응용 배지를 1주 간격으로 수거 및 대체하였다. 이로써 생성된 6 리터의 적응용 배지를 0.45 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터 (Corning, Acton, MA)를 통하여 여과시킨 다음, 도 47에 도시된 바와 같은 SDS-PAGE 분석에 의해 성상 확인하였다. 이어서, 정제를 위해 단백질 화학으로 옮겼다.
DHFR 선별 배지 상에서 13일 후에 12개 집락을 선별하고 1개의 24-웰 판 내로 골라내었다. 이 판을 1주 동안 성장시킨 다음, 48 내지 72시간 동안 AM1 CHOd- 성장 배지로 옮기고, 이와 같이 적응시킨 배지를 수거하였다. 동일한 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG, (Fcγ) 항체에 의한 탐지를 나타내는 일시적 웨스턴 블롯 분석과 유사한 웨스턴 블롯 분석에 의해 발현 수준을 평가하여 5 ㎕의 적응용 배지를 스크리닝하였다. 12개의 안정한 클론 모두가 예상 크기 66 kDa에서 발현을 나타내었다. 2개 클론 A3 및 C2를 선별하고, 일차 클론 C2에 대한 백업으로서 A3과 함께 동결시키기 위해 T175 플라스크로 확장하였다 (도 48).
이러한 C2 클론은 선별 배지를 사용하여 50개 롤러 병 (공급처: Corning) 내로 확대하였고, 밀집도를 나타낼 때까지 성장시켰다. 이어서, 상기 배지를 생성 배지로 교환하고, 1주 동안 항온 배양하였다. 이러한 적응용 배지를 1주 간격으로 수거 및 대체하였다. 이로써 생성된 50 리터의 적응용 배지를 0.45 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터 (공급처: Corning, Acton, MA)를 통하여 여과시킨 다음, SDS-PAGE 분석에 의해 성상 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음). 추가의 정제는 하기 실시예 42에 기재된 바와 같이 달성하였다.
실시예 42
포유류 세포에 의해 발현된 Fc-L10-OSK1, Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 정제
Fc-L10-OSK1의 정제. 대략 6 L의 CHO (AM1 CHOd-) 세포-적응용 배지 (상기 실시예 41 참고)를 7℃ 하에 10 ml/min으로 35 ml MAb 선별 칼럼 (공급처: GE Healthcare) 상으로 부하하고, 이 칼럼을 2가 양이온을 수반하지 않은 둘벡코 인산염 완충 식염수 (PBS)의 여러 칼럼 용적으로 세척하고, 샘플을 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. MAb 선별 용출물을 7℃ 하에 10 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 인라인 65 ml SP-HP 칼럼 (공급처: GE Healthcare) 상으로 직접 부하하였다. MAb 선별 칼럼을 단절시킨 후, SP-HP 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 10 ml/min으로 5% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 전개시킨 다음, 7℃에서 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 이들 데이터에 기초하여 목적 생성물을 함유하는 분획을 모았다. 이어서, 이와 같이 모은 물질을 다음 원심분리형 한외 여과 장치 (Pall Life Sciences Jumbosep 1OK Omega 원심분리형 한외 여과 장치)를 사용하여 약 20 ml가 되도록 농축시켰다. 이어서, 이와 같이 농축시킨 물질을 20 ml의 20 mM NaH2PO4, pH 7.0으로 희석시킴으로써 완충액 교환시키고, 점보셉 10K 오메가 필터를 사용하여 20 ml가 되도록 재농축시켰다. 이어서, 상기 물질을 20 ml의 20 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, pH 7.0로 희석시킨 다음, 22 ml가 되도록 재농축시켰다. 그 다음, 완충액 교환 물질을 실온 하에 1 ml/min으로 0.22 ㎛, 25 mm 머스탕 E 막을 수반한 폴 라이프 사이언스 아크로디스크를 통하여 여과시켰다. 그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 여과시킨 물질 50 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 49A, 검은 흔적). 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,371 g/mol과 흡광 계수 35,410 M-1cm-1를 이용하여 4.96 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 49B). 그 다음, 1.8 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 레보라토리즈 내독소 특이적 완충제 중의 샘플 30배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 149 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 49C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ml)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다 (도 49D). 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
포유류 Fc-L10-OSK1 프렙에 대한 수득량은 6 L로부터 115 mg였고, 순도는 SDS-PAGE에 의해 판단해서 >90%였으며; Fc-L10-OSK1은 SEC-HPLC에 의해 판단하여 예측 이량체로서 수행되었고, 질량은 MS에 의해 판단한 예측 분자량 범위 내였다.
인간 Kv1.3 및 인간 Kv1.1을 차단하는데 있어서의 정제된 Fc-L10-OSK1의 활성이 하기 실시예 43에 기재되었다.
Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 정제. 형질감염시킨 HEK-293에 의해 적응시킨 대략 500 mL의 배지 (상기 실시예 41 참고)를 65% 슬러리의 MAb 선별 수지 (1.5 ml) (공급처: GE Healthcare) 및 500 ㎕ 20% NaN3와 합하였다. 이어서, 상기 슬러리를 4℃ 하에 3일 동안 온화하게 진탕시킨 다음, 브레이크를 전혀 사용하지 않으면서 4℃ 하에 5분 동안 1000 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 대다수의 상등액을 흡인시키고, 펠릿 중의 나머지 슬러리를 14 ml 원뿔형 튜브에 옮긴 다음, 2가 양이온을 수반하지 않는 둘벡코 인산염 완충 식염수 (PBS) 12 ml와 합하였다. 이 슬러리를 저 브레이크를 사용하여 4℃ 하에 1분 동안 2000 g으로 원심분리시키고 상등액을 흡인하였다. PBS 세척 주기를 3회 더 반복하였다. 1 ml의 100 mM 글리신 pH 3.0을 가하고 실온에서 5분 동안 온화하게 진탕시킴으로써, 상기 결합된 단백질을 용출시켰다. 그 다음, 슬러리를 저 브레이크를 사용하여 4℃ 하에 1분 동안 2000 g으로 원심분리시키고 상등액을 제1 용출물로서 흡인하였다. 용출 주기를 2회 더 반복하고, 3개 상등액 모두를 단일 풀로 합하였다. 나트륨 아세테이트 (37.5 ㎕의 3 M 용액)를 상기 용출 풀에 가하여 pH를 상승시킨 다음, 10 kDa SlideAlyzer (공급처: Pierce)를 사용하여 실온 하에 2시간 동안 10 mM 아세트산, 5% 솔비톨, pH 5.0에 대항하여 투석시켰다. 투석 완충액을 변화시키고, 투석을 4℃ 하에 밤새 지속하였다. 이어서, 이와 같이 투석시킨 물질을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 주사기 필터를 통하여 여과시켰다. 이어서, 상기 여과시킨 물질의 농도는 분자량 계산치 30,330 g/mol과 흡광 계수 35,410 M-1cm-1를 이용하여 1.27 mg/ml인 것으로 결정되었다 (도 50A). 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 여과시킨 물질의 순도를 평가하였다 (도 50B). 그 다음, <1 EU/mg 단백질 결과를 산출하는 찰스 리버 레보라토리즈 내독소 특이적 완충제 중의 샘플 25배 희석물을 이용하고 찰스 리버 레보라토리즈 엔도세이프-PTS 시스템 (0.05 - 5 EU/ml 민감도)을 사용하여 내독소 수준을 결정하였다. 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 50 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 50C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 샘플 1 ㎕을 10 ㎕의 시나핀산으로 희석시킴으로써 (0.05% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴 중의 1 ml 당 10 mg) 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 이로써 생성된 용액 (1 ml)을 MALDI 샘플 판 상으로 스폿하였다. 샘플을 건조시킨 후, 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 분석하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다. 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다 (도 50D). 이어서, 생성물을 -80℃ 하에 저장하였다.
도 51A-D는 다음을 제외하고는 Fc-L10-OsK1(K7S) 분자 (상기 언급됨)에 대해서와 동일한 프로토콜을 사용하여 수행한, Fc-L10-OsK1(E16K,K20D)에 대한 정제 및 분석 결과를 도시한 것이다: 농도는 분자량 계산치 30,357 g/mol과 흡광 계수 계산치 35,410 M-1cm-1를 이용하여 1.59 mg/ml인 것으로 밝혀졌고; 발열원 수준은 32배 희석물을 사용하여 <1 EU/mg인 것으로 밝혀졌다.
도 52A-D는 다음을 제외하고는 Fc-L10-OsK1(K7S) 분자 (상기 언급됨)에 대해서와 동일한 프로토콜을 사용하여 수행한, Fc-L10-OsK1(K7S,E16K,K20D)에 대한 정제 및 분석 결과를 도시한 것이다: 농도는 분자량 계산치 30,316 g/mol과 흡광 계수 계산치 35,410 M-1cm-1를 이용하여 0.81 mg/ml인 것으로 밝혀졌고; 발열원 수준은 16배 희석물을 사용하여 <1 EU/mg인 것으로 밝혀졌다.
인간 Kv1.3 및 인간 Kv1.1을 차단하는데 있어서의 정제된 Fc-L10-OSK1[K7S], Fc-L10-OSK1[E16K,K20D] 및 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]의 활성이 하기 실시예 43에 기재되었다.
실시예 43
OSK1 및 OSK1 펩티보디 유사체의 전기생리학
아시아산 전갈 오르토키루스 스크로비쿨로수스 (Orthochirus scrobiculosus) 독 (OSK1)의 38개 잔기 펩티드 독소를 합성하여 (실시예 41 참고), 칼륨 채널 계열의 아유형인 인간 Kv1.1 및 Kv1.3 채널에 대한 그의 영향력을 평가하였다. 인간 Kv1.1 및 Kv1.3 채널을 억제하는데 있어서의 합성 OSK1의 효력과 선택성은 HEK293 세포 발현 시스템과 전기생리학을 사용함으로써 평가하였다 (도 53). 안정적으로 발현된 Kv1.3 채널을 완전 세포 패치 클램프 기록한 결과, 합성 OSK1 펩티드가 Kv1.1과 비교해서 인간 Kv1.3을 억제하는데 더 효력이 있는 것으로 나타났다 (표 33).
OSK1 펩티드 독소를 항체와 융합시켜 OSK1 펩티보디를 생성시킴. 혈장 반감기를 개선시키고 OSK1 펩티드 독소가 CNS로 침투되는 것을 방지하기 위해, OSK1 펩티드 독소를 본원 실시예 41에 기재된 바와 같이, 10개 아미노산 잔기 길이의 링커 쇄를 통하여 인간 항체 IgG1의 Fc-단편과 융합시켰다 (Fc-L10-OSK1). 이러한 융합으로 인해, 합성 OSK1 펩티드와 비교해서 Kv1.3의 효력이 5배 정도 저하되었다. 그러나, Kv1.1에 대항한 OSK1의 선택성은 상기 합성 펩티드 단독 (4배)과 비교해서 210배 정도로 상당히 개선되었다 (표 33 및 도 54).
OSK1-펩티보디 (Fc-L1O-OSK1)의 변형. 0SK1은 기타 전갈 독소 구성원 (이는 집합적으로 α-KTx3으로서 지칭됨)과의 서열 상동률이 60 내지 80%이다. OSK1과 α-KTx3 계열의 기타 구성원을 서열 정렬한 결과, 위치 12, 16, 20, 및 36에서 4가지 별개의 구조적 차이가 있는 것으로 나타났다. 이들 OSK1의 구조적 차이는 α-KTx3 계열의 기타 구성원을 이용해서는 관찰할 수 없는, 기타 칼륨 채널에 대항한 광범위한 활성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 주장되었다. 따라서, 위치 16 및 20에서의 2개의 아미노산 잔기가 OSK1 서열 내의 보다 보존된 아미노산 잔기로 복원되어, Kv1.2와의 이종-사량체로서 CNS에서 주로 발견되는 Kv1.1 등의 기타 칼륨 채널에 대항한 선택도에 대한 그들의 영향력을 평가하였다. 위치 16에서의 글루탐산 및 위치 20에서의 리신을 각각 보존된 리신 및 아스파르트산으로 치환시킴으로써 (즉, Fc-L10-OSK1[E16K,K20D]), 본 발명자들은 Fc-L10-OSK1과 비교해서 효력 면에서 상당한 변화를 관찰하지 못하였다 (1.3배 차이; 도 56 및 표 33). 그러나, 이러한 이중 돌연변이는 Kv1.1에 대항한 차단 활성을 없앴다. Kv1.1/Kv1.3의 선택도 비는 403배였는데, 이는 Fc-L10-OSK1에 대한 선택도 비 (210배)에 비해 상당히 개선된 것이었다. 위치 7에서의 단일 아미노산 돌연변이 (리신에서 세린으로 돌연변이됨; Fc-L1O-OSK1[K7S])는 Fc-L10-OSK1과 비교해서 효력 및 선택도 상의 약간의 변화 (각각 2배 및 3배)를 가져다 주었다 (도 55 및 표 33). 상기 3개 잔기 모두를 돌연변이시켜 Fc-L10-OSK1[K7S,E16K,K20D]를 생성시킨 경우에는, 선택도 뿐만 아니라 효력이 상당히 저하되었다 (도 57 및 표 33).
표 33의 결과로써 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 OSK1 펩티드 독소를 인간 항체 IgG1의 Fc-단편과 융합시킴으로써 Kv1.1에 대항한 선택도를 현저하게 개선시켰지만, Kv1.3에 대항한 표적 효력은 저하되었다. Kv1.1에 대항한 선택도는 2개의 주요 위치에서의 2개 잔기를 α-KTx3 계열의 기타 구성원에서 발견된 보존된 잔기로 복원시킬 경우에 추가로 개선되었다.
표 33은 hKv1.3 및 hKv1.1 채널에 대항한 0SK1 및 OSK1 유사체에 대한 IC50 값에 관한 요약을 제시한 것이다. 모든 유사체는 hKv1.3에 대항한 그들의 효력을 기준으로 하여 순위를 정하였다. 또한 상기 표에는 모든 OSK1 유사체에 대한 hKv1.1/hKv1.3의 선택도 비가 제시되었다.
실시예 44
랫트에서 PEG-ShK[1-35] 분자의 약동학적 연구
정맥내 (IV) 약동학적 프로파일은 약 24-kDa 2OK PEG-ShK[1-35] 분자를 결정하였고, 약 4-kDa 저분자 본래의 ShK 펩티드는 스프라크 돌리 (Spraque Dawley) 랫트에서 결정하였다. 본래의 ShK 펩티드 및 본 발명의 신규한 2OK PEG-ShK[1-35] 분자에 대한 IV 용량은 1 mg/kg였다. 이 용량은 이들 두 분자의 등 몰량을 나타내었다. 랫트의 평균 체중은 약 0.3 kg였고, 2마리 랫트를 각 용량 & 분자에 사용하였다. IV 주사 후 각종 시점에, 혈액을 채취하고 약 0.1 ml의 혈청을 수집하였다. 혈청 샘플을 분석할 때까지 -80℃ 하에 동결 저장하였다.
전기생리학을 알아보기 위한 검정 판 제조. 약동학적 연구로부터의 2OK PEG-ShK[1-35] 분자 또는 본래의 ShK 펩티드를 함유하는 랫트 혈청 샘플을 동결시켰다. 실험하기 전에, 각 샘플을 실온 하에 해동시키고, 분취액 (70 내지 80 ㎕)을 96-웰 폴리프로필렌 판 중의 웰에 옮겼다. 검정 판을 제조하기 위해, 약동학적 혈청 샘플로부터 몇 가지 희석물을 만들어 시험 용액을 생성시켰다. 약동학적 연구로부터의 혈청 샘플을 10% 인산염 완충 식염수 (Ca2+ 및 Mg2+를 수반한 PBS) 내로 희석시켰다. 약동학적 연구로부터의 혈청 샘플 중의 본 발명의 신규한 2OK PEG-ShK[1-35] 분자 양을 결정하기 위한, 시험 용액 중의 최종 혈청 농도는 90%, 30%, 10%, 3.3% 및 1.1%였다. 정제된 2OK PEG-Shk[1-35] 표준 억제 곡선을 또한, 상기 검정 판에서 제조하였다. 이를 위해, 정제된 2OK PEG-ShK[1-35] 분자 (표준물)의 8-포인트 일련의 희석물을 90%, 30%, 10%, 3.3% 또는 1.1% 랫트 혈청에서 제조하였고, 표준물의 최종 농도는 50, 16.7, 5.5, 1.85, 0.62, 0.21, 0.068 및 0.023 nM였다.
전기생리학을 알아보기 위한 세포 제조. 전압 활성화 K+ 채널, Kv1.3을 안정적으로 발현하는 CHO 세포를 실험하기 2일 전에 T-175 조직 배양 플라스크에 (5x106의 밀도로) 도말하고, 대략 95% 밀집도로 될 때까지 성장시켰다. 실험하기 직전에, 세포를 PBS로 세척한 다음, 37℃ 하에 (3분 동안) 트립신 (0.25%)과 베르센 (versene) (1:5000)의 2 ml 혼합물 (1:1 용적비)을 이용하여 박리시켰다. 그 후, 상기 세포를 10% FBS, 1x NEAA 및 750 ㎍/ml의 G418을 수반한 10 ml의 조직 배양 배지 [글루타맥스 (Glutamax)를 수반한 HAM's F-12; 공급처: InVitrogen, Cat#31765] 중의 상기 플라스크에서 재현탁시키고, 1분 30초 동안 약 1000 rpm으로 원심분리시켰다. 이로써 생성된 세포 펠릿을 PBS에서 3-5x106개 세포/ml로 재현탁시켰다.
이온워크스 전기생리학 및 데이터 분석. CHO-Kv1.3 세포에서 K+ 전류를 억제할 수 있는, 혈청 중의 시험 용액 또는 표준물의 능력은 자동화 전기생리학 시스템 이온워크스 쿼트로 (IonWorks Quattro)를 사용하여 연구 조사하였다. 재현탁시킨 세포, 검정 판, 집단 패치 클램프 (PPC) 패치판 뿐만 아니라 적당한 세포내 (90 mM K-글루코네이트, 2O mM KF, 2 mM NaCl, 1 mM MgC12, 1O mM EGTA, 1O mM HEPES, pH 7.35) 및 세포외 (Ca2+ 및 Mg2+를 수반한 PBS) 완충액을 이온워크스 쿼트로에 배치하였다. 암포테리신에 의거한 천공 패치-클램프 방법을 사용하여 CHO-Kv1.3 세포로부터 전기생리학 기록물을 만들었다. 상기 이온워크스 쿼트로의 전압-클램프 회로를 이용하여, 세포를 -80 mV의 막 전위에 유지시키고, 막 전위를 400 ms 동안 +30 mA로 진전시킴으로써 전압 활성화 K+ 전류를 유발시켰다. K+ 전류를 제어 조건 하에, 즉 실험 초기에 억제제의 부재 하에 그리고 시험 용액 또는 표준물의 존재 하에 10분 동안 항온 배양한 후에, 유발시켰다. 평균 K+ 전류 진폭을 430과 440 ms 사이에 측정하였고, 데이터를 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 (Microsoft Excel spreadsheet)로 외수송하였다. 각 농도의 시험 용액 또는 표준물의 존재 하에서의 K+ 전류의 진폭은 동일한 웰에서의 제어 조건 하의 K+ 전류 비율(%)로서 표현하였다.
표준 억제 곡선을 각종 랫트 혈청 수준의 각 표준물에 대해 생성시키고, 이를 대조군의 전류 비율 (POC) 대 nM 농도의 log로서 표현하였다. 대조군 비율 (POC)은 억제와 반비례하는데, 100 POC는 억제를 전혀 나타내지 않고 0 POC는 100% 억제이다. 선택된 곡선 영역 전반에 걸친 선형 회귀를 사용하여 시험 용액 내의 약물 농도를 계산할 수 있게 해주는 방정식을 유도시켰다. 표준 곡선의 선형 부분 내의 전류 값만을 사용하여 시험 용액 중의 약물 농도를 계산하였다. 소정의 혈청 수준 내의 상응하는 표준 곡선은, 약물 수준을 계산하는 경우에 시험 화합물의 동일한 혈청 수준과 항상 비교하였다. ShK 및 2OK PEG-ShK[1-35]에 대한 표준 곡선이 도 58A 및 도 58B에 각각 도시되었고, 각 도면은 소정의 혈청 비율에서 각 표준물에 대한 선형 회귀 방정식을 함유하고 있다. 2OK PEG-ShK[1-35] 표준 곡선의 경우, 표준 곡선의 선형 부분은 20 POC에서 70 POC까지였고, 이러한 범위 내에 속하는 시험 용액으로부터 유래된 전류 값만을 사용하여, 시험 용액 내의 약물 농도를 계산하였다.
IV 주사 후 본 발명의 신규한 20K PEG-ShK[1-35] 분자의 약동학적 프로파일이 도 59에 도시되었다. 이러한 분자의 말단 반감기 (t1/2 b)를 상기 곡선으로부터 추정한 결과, 6 내지 12시간인 것으로 나타났다. 48시간이 지나면, 약물 수준은 표준 곡선의 선형 범위를 벗어나게 되고, 계산하지 못한다. 본 발명의 신규한 20K PEG-ShK[1-35] 분자의 6 내지 12시간의 반감기 계산치는 기존에 문헌 [참고: C. Beeton et al. (2001) Proc. Natl Acad, Sci. 98, 13942-13947]에 보고된 본래의 ShK 분자의 반감기 대략 0.33 시간 (또는 20분)보다 상당히 더 길었고, 이는 치료적 분자의 바람직한 특징이다. ShK 대 2OK PEG-ShK[1-35]를 등 몰량으로 IV 주사한 후 Kv1.3 억제제의 상대적 수준을 비교한 결과가 도 60에 도시되었다. 이러한 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 5% 혈청 시험 용액을 조사한 결과, 2OK PEG-ShK[1-35] 분자는 24시간 초과 동안 Kv1.3 전류를 상당히 억제시킨 것으로 나타난 반면 (<70 POC), 본래의 ShK 펩티드는 처음 1시간 동안은 Kv1.3 전류를 상당한 수준으로 억제시켰지만, 1시간이 지나면서 부터는 상당한 차단을 나타내지 못하였다. 이들 데이터는 2OK PEG-ShK[1-35]가 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료제로서의 바람직한 특징을 지니고 있다는 것을 다시 입증해준다.
실시예 45
PEG화 독소 펩티드는 동물 모델에서 중증의 자가면역성 뇌척수염을 저해하였다
Kv1.3의 20K PEG-ShK 억제제는 랫트에서 중증의 자가면역성 뇌척수염을 저해하는데 있어서 개선된 효능을 지니고 있다. 기존에 문헌 [참고: C. Beeton et al. (2001) J. Immunol. 166, 936]에 보고된 다발성 경화증의 적응 전이 실험용 자가면역성 뇌척수염 (AT-EAE) 모델을 이용하여, 본 발명자들은 본 발명의 신규한 20K PEG-ShK 분자의 생체내 활성을 조사하였고, 그의 효능을 ShK 독소 펩티드 단독의 효능과 비교하였다. 이러한 연구 계획이 도 61에 예시되었다. 이러한 생체내 연구로부터의 결과가 도 62 및 도 63에 제공되었다. -1일째부터 3일째까지 1일 10 ㎍/kg으로 피하 (SC) 전달된 20K PEG-ShK 분자는 질병 중증도를 상당히 저하시켰고 생존율을 증가시킨 반면, 등 몰 용량 (10 ㎍/kg)의 저분자 ShK 펩티드로 치료한 동물은 중증 질병이 발생하여 사망하였다.
35개 아미노산 독소 펩티드 ShK [스티코닥틸라 헬리안투스 (Stichodactyla helianthus) 신경독]은 공급처 [Bachem Bioscience lnc]로부터 구입하였고, 전기생리학에 의해 Kv1.3을 강력하게 차단시키는 것으로 확증되었다 (본원 실시예 36 참고). 20K PEG-ShK 분자의 합성, PEG화 및 정제가 상기 본원에 기재된 바와 같았다. 미엘린-염기성 단백질 (MBP)에 대해 특이적인 뇌척수원성 CD4+ 랫트 T 세포주 PAS는 공급처 [Dr. Evelyne Beraud]로부터 유래되었다. 이들 세포를 시험관 내에서 유지시키고, 이들 세포를 AT-EAE 모델에 사용하는 것은 기존에 보고되었다 [참고: C. Beeton et al. (2001) PNAS 98, 13942]. PAS T 세포는 MBP 및 조사된 흉선세포를 이용한 항원 자극 또는 활성화 (2일)와, T 세포 성장 인자를 이용한 증식 (5일)을 교대로 수행함으로써 시험관 내에서 유지시켰다. PAS T 세포 (3 x 105/ml)의 활성화는 상기 세포를 2일 동안 10 ㎍/ml MBP 및 15 x 106/ml 동계 조사된 (3500 rad) 흉선세포와 함께 항온 배양하는 것을 포함하였다. 시험관내 활성화 후 2일째에, 10-15 x 106개의 살아있는 PAS T 세포를 6 내지 12주생 암컷 루이스 (Lewis) 랫트 (공급처: Charles River Laboratories)의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. -1일째부터 3일째까지 비히클 (PBS 중의 2% 루이스 랫트 혈청), 20K PEG-ShK 또는 ShK의 1일 피하 주사제를 제공하였는데 (도 61), -1일은 PAS T 세포을 주사 (0일)하기 1일 전을 나타낸다. 비히클 처리된 랫트에서는, PAS T 세포를 주사한지 4 내지 5일 후에 급성 EAE가 발생하였다 (도 62). 혈청을 4일째에 눈뒤 출혈시킴으로써 수집하고, 억제제 수준을 분석하기 위해 8일째에 (연구 마지막날) 심장 천자에 의해 수집하였다. -1, 4, 6, 및 8일째에 랫트 체중을 쟀다. 동물을 대상으로 하여, 세포 전이 당일 (0일째)부터 3일째까지는 1일 1회씩 그 내용을 알리지 않고 스코어링하였고, 4일째부터 8일째까지는 1일 2회 스코어링하였다. 임상 징후를 각 사지 및 꼬리의 부전마비 정도의 총 스코어로서 평가하였다. 임상 스코어링: 0 = 징후가 전혀 없음, 0.5 = 말단 미부에 기운이 없음, 1.0 = 미부에 기운이 없음, 2.0 = 순한 정도의 하반신 부전마비, 운동실조, 3.0 = 중간 정도의 하반신 부전마미, 3.5 = 1개 뒷다리 부전마비, 4.0 = 전체 뒷다리 부전마비, 5.0 = 전체 뒷다리 부전마비 및 실금, 5.5 = 사지마비, 6.0 = 빈사 상태 또는 사망. 스코어가 5.5인 랫트는 안락사시켰다.
EAE가 발병하기 전에 랫트를 Kv1.3 차단제 PEG-ShK로 처치하면, 용량 의존적 방식으로 상기 질병의 발생이 지연되었고, 질병 진행이 억제되었으며, 사망이 예방되었다 (도 62). 비히클 단독, 10 ㎍/kg ShK 또는 1 ㎍/kg PEG-ShK로 처치한 랫트에게서의 질병 발생은 4일째에 관찰되었는데, 10 ㎍/kg PEG-ShK 또는 100 ㎍/kg PEG-ShK으로 처치한 랫트에게서는 4.5일째에 관찰되었다. 또한, 비히클 단독, 10 ㎍/kg ShK 또는 1 ㎍/kg PEG-ShK로 처리한 랫트 모두에게서, 연구가 끝날 무렵 중증의 질병이 발생하였는데, EAE 스코어는 5.5 이상이었다. 이와는 달리, 10 ㎍/kg PEG-ShK 또는 100 ㎍/kg PEG-ShK으로 처치한 랫트는 <2의 피크 임상 중증도 스코어 평균에 도달하였고, 1마리를 제외한 모든 랫트가 연구 말기까지 생존하였다. 더우기, 본 발명자들은 랫트 체중이 질병 중증도와 상관이 있다는 것을 밝혀내었다 (도 63). 비히클 단독, 10 ㎍/kg ShK 또는 1 ㎍/kg PEG-ShK으로 처치한 랫트는 모두 평균 각각 31 g, 30 g 및 30 g을 상실한 반면, 10 ㎍/kg PEG-ShK 또는 100 ㎍/kg PEG-ShK으로 처치한 랫트는 각각 18 g 및 11 g을 상실하였다. 후자 2개 군 랫트는 연구가 끝날 무렵 회복의 징후인 체중 증가를 나타내기도 하였다. 10 ㎍/kg ShK 및 10 ㎍/kg PEG-ShK으로 처치한 랫트에게는 몰 당량의 ShK 펩티드를 투여하였다는 것을 인지해야 한다. PEG-ShK 분자의 효능이 접합되지 않은 ShK의 효능에 비해 상당히 더 큰 것은 PEG-ShK 분자의 안정성이 보다 크고 생체내 반감기가 더 길기 때문인 것으로 예상된다 (실시예 44 참고).
실시예 46
Kv1.3 길항제 펩티드를 포함하는 화합물은 인간 전혈에서의 염증을 차단시킨다
IL-2 및 IFN-g의 분비에 대한 Kv1.3 억제제의 영향력을 조사하기 위한 생체외 검정
인간 전혈은 헤파린 진공채혈관에서 약물 치료를 받지 않은 건강한 공여자로부터 수득하였다. DMEM 완전 배지는 0.1% 인간 알부민 (Bayer #68471), 55 μM 2-머캅토에탄올 (공급처: Gibco), 및 1X Pen-Strep-Gln (PSG, Gibco, Cat#10378-016)를 함유하는 이스코브스 (Iscoves) DMEM (L-글루타민 및 25 mM 헤르페스 완충제를 수반함)였다. 탑시가르긴은 공급처 [Alomone Labs (Israel)]로부터 수득하였다. 100% DMSO 중의 탑시가르긴 10 mM 원액을 DMEM 완전 배지로 희석시켜 40 μM, 4X 용액으로 만들어 칼슘 이동을 위한 4X 탑시가르긴 자극을 제공하였다. Kv1.3 억제제 펩티드 ShK [스티코닥틸라 헬리안투스 독소, Cat# H2358] 및 BKCa1 억제제 펩티드 IbTx (이베리오톡신, Cat# H9940)는 공급처 [Bachem Biosciences]로부터 구입한 반면, Kv1.1 억제제 펩티드 DTX-k (덴드로톡신-K)는 공급처 [Alomone Labs (Israel)]로부터 구입하였다. Kv1.3의 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[2-35] 펩티보디 억제제는 본원 실시예 4 및 실시예 39에 기재된 바와 같이 수득하였다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A는 공급처 [Amgen 샘플 은행]로부터 수득하였지만, 각종 판매인에 의해 시판되기도 한다. 3배 일련의 억제제 희석물을 DMEM 완전 배지에서 4X 최종 농도로 제조하였고, 각 50 ㎕을 96-웰 팔콘 (Falcon) 3075 평저 미세역가 판의 웰에 가하였다. 이러한 미세역가 판의 칼럼 1-5 및 7-11은 억제제를 함유한 반면 (각 열은 별개의 억제제 희석 시리즈를 수반한다), 50 ㎕의 DMEM 완전 배지 단독은 칼럼 6 중의 8 웰에 가하였고, 100 ㎕의 DMEM 완전 배지 단독은 칼럼 12 중의 8 웰에 가하였다. 실험을 개시하기 위해, 100 ㎕의 전혈을 미세역가 판의 각 웰에 가하였다. 이어서, 상기 판을 37℃, 5% CO2 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 1시간 후, 상기 판을 꺼내고, 50 ㎕의 4X 탑시가르긴 자극 (40 μM)을 상기 판의 모든 웰 (칼럼 12 중의 8 웰은 제외한다)에 가하였다. 상기 판을 48시간 동안 37℃, 5% CO2 하에 다시 놓아두었다. 전혈에 분비된 IL-2 및 IFN-g의 양을 결정하기 위해, 96-웰 판의 각 웰로부터의 100 ㎕의 상등액 (적응용 배지)을 저장 판에 옮겼다. 사이토킨 생성을 MSD 전기화학발광 분석하기 위해, 20 ㎕의 상등액 (적응용 배지)을 다음 판 [MSD Multi-Spot Custom Coated 판] (www.meso-scale.com)에 가하였다. 이들 판 상의 작동 전극을 미리 4개의 포획 항체 (hIL-5, hIL-2, hIFNg 및 hIL-4)로 피복시켰다. 20 ㎕의 적응용 배지를 MSD 판에 가한 후, 탐지 항체와 P4 완충제의 150 ㎕ 칵테일을 각 웰에 가하였다. 이러한 150 ㎕의 칵테일은 20 ㎕의 4개 탐지 항체 (hIL-5, hIL-2, hIFNg 및 hIL-4) (각각 1 ㎍/ml)와 130 ㎕의 2X P4 완충제를 함유하였다. 상기 판을 덮고 진탕 플랫폼 위에 밤새 놓아두었다 (암실 하에). 그 다음날 아침에 상기 판을 MSD 섹터 영상화기 상에서 판독하였다. 각 판의 칼럼 6 중의 8 웰에는 탑시가르긴 자극만을 투여하고 억제제는 전혀 투여하지 않았기 때문에, 평균 MSD 반응을 이용하여 특정 판에 대한 "높은" 값을 계산하였다. 이러한 판에 대해 계산된 "낮은" 값은 탑시가르긴 자극을 전혀 함유하지 않고 억제제도 함유하지 않은 칼럼 12 중의 8 웰로부터의 평균 MSD 반응으로부터 유래되었다. 대조군 비율 (POC)은 자극되지 않은 대조군 대 자극된 대조군에 대한 상대적 반응 측정치인데, 100 POC는 탑시가르긴 자극 단독의 평균 반응 또는 "높은" 값에 대해 등가이다. 따라서, 100 POC는 해당 반응의 0% 억제를 나타낸다. 이와는 달리, 0 POC는 해당 반응의 100% 억제를 나타내고 자극이 전혀 제공되지 않거나 "낮은" 값인 반응에 대해 등가일 것이다. 대조군 비율 (POC)을 계산하기 위해, 다음 식을 사용하였다: [(웰의 MSD 반응) - ("낮은")] / [("높은") - ("낮은")] x 100. 전혈 중의 해당 분자의 효력은 억제제 곡선 (IC)으로부터의 곡선 피팅 후에 계산하였고, IC50은 표준 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 유도되었다. 본 발명자들이 고 처리량 MSD 전기화학발광 검정을 이용하여 사이토킨 생성을 측정하였다고 본원에 기재하였지만, 당업자는 보다 낮은 처리량 ELISA 검정이 사이토킨 생성을 측정하는데 동등한 수준으로 적용 가능하다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.
Kv1.3 억제제가 CD40L & IL-2R의 세포 표면 활성화를 차단시킨다는 것을 입증해주는 생체외 검정. 인간 전혈은 헤파린 진공채혈관에서 약물 치료를 받지 않은 건강한 공여자로부터 수득하였다. DMEM 완전 배지는 0.1% 인간 알부민 (Bayer #68471), 55 μM 2-머캅토에탄올 (공급처: Gibco), 및 1X Pen-Strep-Gln (PSG, Gibco, Cat#10378-016)를 함유하는 이스코브스 DMEM (L-글루타민 및 25 mM 헤르페스 완충제를 수반함)였다. 탑시가르긴은 공급처 [Alomone Labs (Israel)]로부터 수득하였다. 100% DMSO 중의 탑시가르긴 10 mM 원액을 DMEM 완전 배지로 희석시켜 40 μM, 4X 용액으로 만들어 칼슘 이동을 위한 4X 탑시가르긴 자극을 제공하였다. Kv1.3 억제제 펩티드 ShK [스티코닥틸라 헬리안투스 독소, Cat# H2358] 및 BKCa1 억제제 펩티드 IbTx (이베리오톡신, Cat# H9940)는 공급처 [Bachem Biosciences]로부터 구입한 반면, Kv1.1 억제제 펩티드 DTX-k (덴드로톡신-K)는 공급처 [Alomone Labs (Israel)]로부터 구입하였다. Kv1.3의 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[2-35] 펩티보디 억제제는 본원 실시예 4 및 실시예 39에 기재된 바와 같이 수득하였다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A는 공급처 [Amgen 샘플 은행]로부터 수득하였지만, 각종 판매인에 의해 시판되기도 한다. 이온 채널 억제제 ShK, IbTx 또는 DTK-k를 DMEM 완전 배지 내로 희석시켜 4X의 목적하는 최종 농도 (최종 = 50 또는 100 nM)로 만들었다. 칼시네우린 억제제 시클로스포린 A를 또한 DMEM 완전 배지 내로 희석시켜 4X의 최종 농도 (최종 = 10 μM)로 만들었다. 96-웰 팔콘 3075 평저 미세역가 판의 적당한 웰에, 50 ㎕의 DMEM 완전 배지 또는 4X 억제제 용액을 가하였다. 이어서, 100 ㎕의 인간 전혈을 가하고, 상기 판을 37℃, 5% CO2 하에 1시간 동안 항온 배양하였다. 1시간 후, 상기 판을 꺼내고, 50 ㎕의 4X 탑시가르긴 자극 (40 μM)을, 억제제를 함유하는 상기 판의 모든 웰에 가하였다. 억제제는 함유하지 않지만 DMEM 완전 배지만을 함유하는 몇몇 웰에 탑시가르긴을 또한 부가한 반면, DMEM 완전 배지만을 수반한 기타 웰에는 50 ㎕의 DMEM 완전 배지를 더 가하였다. 억제제를 함유하지 않고 탑시가르긴 자극도 함유하지 않는 웰은 처리되지 않은 "낮은" 대조군을 나타내었다. 억제제를 함유하지는 않았지만, 탑시가르긴 자극이 투여된 웰은 최대 자극을 위한 대조군 또는 "높은" 대조군을 나타내었다. 판을 24시간 동안 37℃, 5% CO2 하에 다시 놓아두었다. 24시간 후, 판을 꺼내고 웰을 FACS 분석을 위해 처리하였다. 세포를 웰로부터 꺼내고, 염색 완충액 (2% 열 불활성화 태아 송아지 혈청을 함유하는 인산염 완충 식염수)에서 세척하였다. 적혈구를, 제조업자에 의해 지시된 바와 같이 1.5% 포름알데히드를 함유하는 BD FACS 용해 용액 (공급처: BD Biosciences)을 사용하여 용해시켰다. 세포를 1개 튜브당 염색 완충액 100 마이크로리터당 1백만개 세포 농도로 분배하였다. 세포를 먼저, 1 마이크로리터의 바이오틴-표지된 항-인간 CD4로 염색하고, 세척한 다음, 동시에 1 마이크로리터의 각각의 스트렙타비딘-APC, FITC-표지된 항-인간 CD45RA, 및 피코에리트린 (PE)-표지된 항-인간 CD25 (IL-2Ra) 또는 PE-표지된 항-인간 CD40L로 염색하였다. 세포를 항체 부가 단계 사이에 염색 완충액으로 세척하였다. 모든 항체는 공급원 [BD Biosciences (San Diego, CA)]으로부터 수득하였다. 각 샘플에 대해 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) FACS 칼리버 (공급처: Mountain View, CA) 유동 세포계수기 상에서 2만 내지 5만개의 살아있는 이벤트를 수집하고, 플로우조 (FlowJo) 소프트웨어 (공급처: Tree Star Inc., San Carlos, CA)를 사용하여 분석하였다. 사멸 세포, 단구, 및 과립구는 전반 및 측면 스캐터 특성에 기초하여 분석으로부터 배제시켰다.
도 64 및 도 67은 Kv1.3 억제제 ShK 및 Fc-L10-ShK[2-35]가 CD4+ T 세포 상에서 IL-2R의 활성화를 저해시키는 것 이외에도, 인간 전혈 중에서의 IL-2 분비를 강력하게 차단시켰다는 것을 입증해준다. Kv1.3 억제제 Fc-L10-ShK[2-35]는 IC50으로써 반영된 바와 같이 시클로스포린 A보다 인간 전혈에서의 IL-2 생성을 200배 더 강력하게 차단시켰다. 도 65는 Kv1.3 억제제가 인간 전혈에서의 IFNg의 분비를 또한 강력하게 차단시켰다는 것을 도시한 것이고, 도 66은 T 세포 상에서의 CD40L의 상향 조절이 부가적으로 차단되었다는 것을 입증해준다. 도 64 내지 67의 데이터는 Fc-L10-ShK[2-35] 분자가 37℃에서 48시간 이하 동안 전혈에서 안정적이어서, 염증 반응을 강력히 차단시켰다는 것을 도시한 것이다. Kv1.3을 표적으로 하고 연장된 반감기가 갖는 독소 펩티드 치료제는 시간이 지남에 따라 생체 내에서 이들 반응을 지속적으로 차단시켜 주고자 하였다. 이와는 달리, Kv1.3 억제제 펩티드 ShK가 전혈에서의 강력한 차단을 나타내었다는 사실에도 불구하고, 이러한 ShK 펩티드는 생체 내에서 짧은 (약 20분) 반감기를 나타내므로 [참고: C. Beeton et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 13942], 지속적인 차단을 제공할 수가 없다. 전혈은 동물에서의 반응을 예측하기 위한 생리학적으로 관련된 검정을 나타낸다. 본원에 기재된 전혈 검정을, 환자 투약 후 표적 적용 범위와 약물 노출을 측정하기 위한 약력학적 (PD) 검정으로서 사용할 수도 있다.. 이들 인간 전혈 데이터는 본 발명의 화합물이 각종 면역 장애, 예를 들어 다발성 경화증, 유형 1 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉 매개성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재발 협착증, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질환 및 루푸스를 치료하는데 있어서 치료적 유용성을 지니고 있다는 것을 뒷받침해준다.
실시예 47
PEG화 펩티보디
예를 들어, 본 발명의 PEG화 펩티보디는 다음 방법에 의해 제조하였다. 19.2 ml A5S, 2O mM NaBH3CN, pH 5 중의 CHO-발현된 FcL10-OsK1 (19.2 mg; MW 30,371 Da, 0.63 마이크로몰)을 38 mg PEG 알데히드 (MW 20 kDa; 3x, Lot 104086)로 처리하였다. 밀봉시킨 반응 혼합물을 냉방에서 밤새 교반시켰다. 반응 과정 동안 단백질 변형 정도는, 0.05 M 인산염 완충제, 0.5 M NaCl, pH 7.0으로 0.4 ml/min으로 용출시킨 슈퍼로스 (Superose) 6 HR 10/30 칼럼 (공급처: Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 SEC HPLC함으로써 모니터링하였다. 반응 혼합물을 A5S, pH 5로 밤새 투석하였다. 이와 같이 투석시킨 물질을 A5S pH 5 중의 SP HP FPLC 칼럼 (16/10) 상으로 부하하고 1 M NaCl 구배로 용출시켰다. 수집한 분획을 SEC HPLC에 의해 분석하고, 3개 풀로 모으며, DPBS로 교환시키고, 농축시킨 다음, 기능적 시험을 위해 제출하였다 (표 34).
또 다른 예에서는, 16.5 ml A5S, 2O mM NaBH3CN, pH 5 중의 FcL10-ShK1 (16.5 mg; MW 30,065 Da, 0.55 마이크로몰)을 44 mg PEG 알데히드 (MW 20 kDa; 4x, Lot 104086)로 처리하였다. 밀봉시킨 반응 혼합물을 냉방에서 밤새 교반시켰다. 반응 과정 동안 단백질 변형 정도는, 0.05 M 인산염 완충제, 0.5 M NaCl, pH 7.0으로 0.4 ml/min으로 용출시킨 슈퍼로스 6 HR 10/30 칼럼 (공급처: Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 SEC HPLC함으로써 모니터링하였다. 반응 혼합물을 A5S, pH 5로 밤새 투석하였다. 이와 같이 투석시킨 물질을 A5S pH 5 중의 SP HP FPLC 칼럼 (16/10) 상으로 부하하고 1 M NaCl 구배로 용출시켰다. 수집한 분획을 SEC HPLC에 의해 분석하고, 3개 풀로 모으며, DPBS로 교환시키고, 농축시킨 다음, 기능적 시험을 위해 제출하였다 (표 34).
표 34의 데이터는 Kv1.3 억제제로서의 PEG화 펩티보디 분자의 효력을 입증해준다.
표 34는 상기 실시예 36에 기재된 바와 같이 HEK 293을 이용하여 완전 세포 패치 클램프 전기생리학에 의해 만든 IC50 결정치를 나타낸다. 지속된 IC50은 전압 램프 -8O mV부터 +30 mV까지 후 전류 400 ms로부터 유래되었다. 풀 #2 샘플은 디-PEG화 펩티보디를 포함하였고, 풀 #3 샘플은 모도-PEG화 펩티보디를 포함하였다.
실시예 48
PEG화 독소 펩티드
Shk 및 Osk-1 PEG화, 정제 및 분석. 합성 Shk 또는 OSK-1 독소 펩티드를 그들의 N-말단에서 환원적 알킬화함으로써 선택적으로 PEG화하였다. 2O mM 나트륨 시아노보로히드라이드 및 2 몰 과량의 20 kDa 모노메톡시-PEG-알데히드를 함유하는 5O mM NaH2PO4, pH 4.5 반응 완충액 (공급처: Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) 중에서 2 mg/ml으로, Shk 또는 OSK-1 독소 펩티드를 이용하여 접합을 달성하였다. 접합 반응물을 실온에서 밤새 교반시키고, 그들의 진행 과정을 RP-HPLC에 의해 모니터링하였다. 완료된 반응물을 2O mM NaOAc, pH 4를 이용하여 4배 희석시킴으로써 켄칭하고, pH 3.5로 조정한 다음, 4℃로 냉각시켰다. 이어서, PEG-펩티드를, 2O mM NaOAc, pH 4.0 중의 선형 0-1 M NaCl 구배로 용출시킨 SP 세파로스 HP 칼럼 (공급처: GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 4℃ 하에 크로마토그래피적으로 정제하였다 (도 68A 및 68B). 용출된 피크 분획을 SDS-PAGE 및 RP-HPLC에 의해 분석하였고, 순도 >97%로써 풀링을 결정하였다. 관찰된 주요 오염물은 디-PEG화 독소 펩티드와 변형되지 않은 독소 펩티드였다. 선택된 풀을 3 kDa MWCO 막에 대항하여 원심분리성 여과시킴으로써 2 내지 5 mg/ml이 되도록 농축시키고, 5% 솔비톨을 이용하여 1O mM NaOAc, pH 4 내로 투석하였다. 이어서, 투석시킨 풀을 0.2 마이크론 필터를 통하여 멸균성 여과시키고, SDS-PAGE 및 RP-HPLC에 의해 분석한 결과, 순도가 >97%인 것으로 결정되었다 (도 69A 및 도 69B). 역상 HPLC를, 40℃ 하에 유지시킨 칼럼 온도 및 1 ml/min에서 0.1% TFA/H2O 중의 조르박스 5 ㎛ 300SB-C8 4.6 x 50 mm 칼럼 (공급처: Phenomenex)에서 수행하는 아질런트 1100 모델 HPLC 상에서 수행하였다. PEG-펩티드 샘플 (20 ㎍)을 주사하고, 파장 215 nm 및 280 nm을 모니터링하면서 선형 6-60% 구배로 용출시켰다.
완전 세포 상에서 패치 클램프에 의해 수행된 전기생리학 (실시예 36 참고)은, 인간 Kv1.3 채널을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로부터 기록된 외측 칼륨 전류의 농도 의존적 차단으로, PEG-OSK1에 대해서는 피크 IC50 1.285 nM을 산출하였고 PEG-ShK[1-35]에 대해서는 피크 IC50 0.169 nM을 산출하였다 (도 74). "2OK PEG-ShK[1-35]" 및 "PEG-ShK"로서 지칭되기도 한 정제된 PEG-ShK[1-35] 분자는 저분자 ShK 펩티드보다 훨씬 더 긴 생체내 반감기를 갖고 있었다 (도 59 및 도 60). PEG-ShK[1-35]는 랫트에서 중증의 자가면역성 뇌척수염을 저해하였고 (실시예 45, 도 61-63), 저분자 본래 ShK 펩티드보다 더 큰 효능을 나타내었다.
실시예 49
ShK 및 OSK1 독소 펩티드의 Fc 루프 삽입
도 70, 도 71, 도 72 및 도 73에 예시된 바와 같이, 디설파이드-제한된 독소 펩티드를 문헌 [참고: Gegg et al., Modified Fc molecules, WO 2006/036834 A2 (PCT/US2005/034273)]의 실시예 1에 공개된 방법에 따라서 서열 D137E138L139T140K141로서 규정된 인간 IgG1 Fc-루프 도메인 내로 삽입하였다. 3개의 연결된 도메인을 갖는 예시적 Fc루프-L2-OsK1-L2, Fc루프-L2-ShK-L2, Fc루프-L2-ShK-L4, 및 Fc루프-L4-OsK1-L2을 만들었다. 이들을 수집하고, 정제한 다음, 기능적 시험을 위해 제출하였다.
이들 실시예에 대한 펩티드 삽입은 Fc 잔기 Leu139와 Thr140 간에 이루어졌고, 삽입된 펩티드의 어느 한 측면을 플랭킹하는 링커로서 2 내지 4개의 Gly 잔기를 포함하였다. 그러나, 인간 IgG1 Fc 서열에 대한 대체 삽입 부위, 또는 상이한 링커가 또한, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 문헌 [참고: Gegg et al., Modified Fc molecules, WO 2006/036834 A2 (PCT/US2005/034273)]의 실시예 13에 기재된 바와 같이 본 발명의 실시에 유용하다.
실시예 50
이. 콜라이로부터 ShK(2-35)-L-Fc의 정제
상기 실시예 16에 기재된 바와 같이 수득한 동결된 이. 콜라이 페이스트 (117 g)를 1200 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 30분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 1200 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 30분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 1200 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 30분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 6.4 g (총 14.2 g)을 128 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이러한 펠릿 용액 120 ml을 37℃ 하에 60분 동안 0.67 ml의 1 M DTT와 함께 항온 배양하였다. 환원된 물질을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 2 ml/min으로 5500 ml의 리폴딩 완충액 (3 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 2.5 mM EDTA, 2.5 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 9.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 3일 동안 지속하였다.
상기 리폴딩물을 5.5 L의 물로 희석시키고, pH를 아세트산을 사용하여 8.0으로 조정시킨 다음, 용액을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 8℃ 하에 10 ml/min으로 인라인 35 ml 아머샴 Mab 선택 칼럼 (2.6 cm I.D.)과 함께 Q-완충액 A (20 mM 트리스, pH 8.5) 중의 35 ml 아머샴 Q 세파로스-FF (2.6 cm I.D.) 칼럼 상으로 부하하였다. 부하 후, Q 세파로스 칼럼을 회로로부터 꺼내고, 나머지 크로마토그래피를 Mab 선택 칼럼 상에서 수행하였다. 이 칼럼을 Q-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 8℃에서 5.0 ml/min으로 S-완충액 A (10 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 5.0 ml 아머샴 SP-세파로스 HP 칼럼 상으로 즉시 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5% 내지 60% S-완충액 B (10 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하였다. 목적 생성물 벌크를 함유하는 분획을 모은 다음, 8℃ 하에 MEP 완충액 A (20 mM 트리스, 200 mM NaCl, pH 8.0) 중에서 10 ml/min으로 50 ml MEP 하이퍼셀 칼럼 (2.6 cm I.D.)에 적용하였다. 칼럼을 5% 내지 50% MEP 완충액 B (50 mM 나트륨 시트레이트 pH 4.0)의 선형 구배로 용출시킨 다음, 100% MEP 완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하고, 목적 생성물 벌크를 함유하는 분획을 모았다.
이어서, 10 kDa 막을 수반한 폴 점보-Sep를 사용하여, MEP 풀을 약 10 ml로 농축시켰다. 그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 50 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 76A). 상기 물질의 농도는 분자량 계산치 30,253 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 3.7 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 상기 물질의 순도를 평가하였다 (도 76B). 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 70 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 76C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여, 대략 4 ㎍의 샘플을 RP-HPLC 칼럼 (Vydac C4, 1 x 150 mm)을 통하여 크로마토그래피함으로써 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 용매 A는 수중 0.1% 트리플루오로아세트산이었고, 용매 B는 90% 아세토니트릴, 10% 수중의 0.1% 트리플루오로아세트산이었다. 칼럼을 80 ㎕/min의 유속으로 10% 용매 B 중에서 예비평형시켰다. 단백질을 30분에 걸쳐 10% 내지 90% 용매 B의 선형 구배를 이용하여 용출시켰다. 용출액 일부를 LCQ 이온 트랩 질량 분광계 내로 지시하였다. 질량 분광계 제조업자에 의해 공급된 바이오워크스 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼을 풀어내었다 (도 76D). 생성물을 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, -80℃ 하에 저장하였다.
표 35에서는 정제된 이. 콜라이-유래된 ShK[2-35]-L-Fc에 대한 IC50 데이터를 본 발명의 화합물의 기타 몇몇 양태들과 비교하였다.
표 35. N-말단 또는 C-말단에 Fc를 함유하는, 이. 콜라이 유래된 재조합 Fc-L-ShK[1-35], Fc-L-ShK[2-35], Fc-L-OSK1, ShK[1-35]-L-Fc 및 ShK[2-35]-L-Fc 펩티보디는 인간 Kv1.3의 강력한 차단을 나타내었다. CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] R1Q 돌연변이체의 활성이 또한 제시되었다. 실시예 36에 기재된 방법에 의한 완전 세포 패치 클램프 전기생리학 (WCVC)을, HEK293/Kv1.3 세포를 사용하여 수행하였고, 제시된 IC50은 3개 이상의 세포로부터의 용량-반응 곡선으로부터의 평균치이다. 실시예 44에 기재된 방법에 의한 이온워크스 (IWQ) 평면 패치 클램프 전기생리학을 CHO/Kv1.3 세포 상에서 수행하였고 평균 IC50이 제시되었다. 본 발명의 분자는 지시된 실시예에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득하였다: 이. 콜라이-유래된 Fc-L-ShK[1-35] (실시예 3 및 실시예 38), 이. 콜라이-유래된 Fc-L-ShK[2-35] (실시예 4 및 실시예 39), 이. 콜라이 Fc-L-OSK1 (실시예 10 및 실시예 40), ShK[1-35]-L- Fc (실시예 15 및 실시예 51), 및 ShK[2-35]-L-Fc (실시예 16 및 본 실시예 50). CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35] R1Q 분자는 CHO-유래된 Fc-L10-ShK[1-35]에 대해 기재된 바와 유사한 방법을 사용하여 생성시켰다.
실시예 51
이. 콜라이로부터 Met-ShK(1-35)-Fc의 정제
상기 실시예 15에 기재된 바와 같이 수득한 동결된 이. 콜라이 페이스트 (65 g)를 660 ml의 실온 5O mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5와 합하고, 약 0.1 mg/ml 닭 난백 리소자임과 합하였다. 현탁된 페이스트를 12,000 PSI로 냉각 미세유동화기 내로 2회 통과시켰다. 이어서, 세포 용해물을 4℃ 하에 30분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 660 ml 1% 데옥시콜산에 재현탁시킨 후, 4℃에서 30분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 이어서, 조직 연마기를 이용하여 펠릿을 660 ml 물에 재현탁시킨 후, 4℃에서 30분 동안 17,700 g으로 원심분리시켰다. 그 다음, 펠릿 13 g을 130 ml 8 M 구아니딘 HCl, 50 mM 트리스 HCl, pH 8.0에 용해시켰다. 이러한 펠릿 용액 10 ml을 37℃ 하에 60분 동안 0.1 ml의 1 M DTT와 함께 항온 배양하였다. 환원된 물질을 격렬하게 교반시키면서 4℃ 하에 2 ml/min으로 1000 ml의 리폴딩 완충액 (2 M 우레아, 50 mM 트리스, 160 mM 아르기닌 HCl, 2.5 mM EDTA, 1.2 mM 시스타민 HCl, 4 mM 시스테인, pH 8.5)에 옮겼다. 이어서, 교반 속도를 느리게 하고, 항온 배양을 4℃에서 3일 동안 지속하였다.
상기 리폴딩물을 1 L의 물로 희석시키고, 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과시키고, 8℃ 하에 10 ml/min으로 인라인 35 ml 아머샴 Mab 선택 칼럼 (2.6 cm I.D.)과 함께 Q-완충액 A (20 mM 트리스, pH 8.5) 중의 35 ml 아머샴 Q 세파로스-FF (2.6 cm I.D.) 칼럼 상으로 부하하였다. 부하 후, Q 세파로스 칼럼을 회로로부터 꺼내고, 나머지 크로마토그래피를 Mab 선택 칼럼 상에서 수행하였다. 이 칼럼을 Q-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 100 mM 글리신 pH 3.0로의 단계로 진행시켜 용출시켰다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 8℃에서 5.0 ml/min으로 S-완충액 A (20 mM NaH2PO4, pH 7.0) 중의 5.0 ml 아머샴 SP-세파로스 HP 칼럼 상으로 즉시 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 S-완충액 A의 여러 칼럼 용적으로 세척한 후, 5% 내지 60% S-완충액 B (20 mM NaH2PO4, 1 M NaCl, pH 7.0)의 선형 구배를 이용하여 용출시킨 다음, 100% S-완충액 B로의 단계를 진행시켰다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여 분획들을 분석하였다. 목적 생성물 벌크를 함유하는 분획을 모았다.
이어서, 10 kDa 막을 수반한 폴 점보-Sep를 사용하여, S-풀을 약 10 ml로 농축시켰다. 그 다음, 휴렛 패카드 8453 분광광도계를 사용하여 700 ㎕ PBS에서 희석시킨 상기 합한 풀 20 ㎕ 상에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다 (도 77A). 상기 물질의 농도는 분자량 계산치 30,409 g/mol과 흡광 계수 36,900 M-1cm-1를 이용하여 3.1 mg/ml인 것으로 결정되었다. 이어서, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 트리스-글리신 4-20% SDS-PAGE을 사용하여, 상기 물질의 순도를 평가하였다 (도 77B). 이어서, 280 nm 하의 흡광도를 관찰하면서 1 ml/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9 중의 페노메넥스 바이오셉 SEC 3000 칼럼 (7.8 x 300 mm) 상으로 주사한 생성물 93 ㎍ 상에서 크기 배제 크로마토그래피함으로써, 생성물의 거대분자 상태를 결정하였다 (도 77C). 이어서, 생성물을 대상으로 하여 MALDI 질량 분광법에 의해 질량 스펙트럼 분석하였다. 샘플 분취액을 샘플 판 상에서 MALDI 매트릭스 시나핀산으로 스폿하였다. 질소 레이저 (337 nm, 3 ns 펄스)가 장착된 보야거 DE-RP 비행 시간 질량 분광계를 사용하여 스펙트럼을 수집하였다. 25 kV의 가속 전압을 이용한 양성 이온/선형 모드를 사용하였다. 대략 200개 레이저 숏으로부터의 데이터를 축적함으로써 각 스펙트럼을 생성시켰다 (도 77D). 공지된 분자량의 정제된 단백질을 사용하여 외부 질량 구경 측정을 달성하였다.
"ShK[1-35]-L-Fc"로서 지칭되기도 하는 정제된 이. 콜라이-유래된 Met-ShK[1-35]-Fc에 의한 인간 Kv1.3의 차단에 대한 IC50이 상기 표 35에 제시되었다.
실시예 52
Kv1.3의 OsK1-L-Fc 억제제의 세균성 발현
펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-pep-Fc이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 OsK1-L-Fc를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 하기 제시된 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
실시예 53
Kv1.3의 Gly-ShK(1-35)-L-Fc 억제제의 세균성 발현
펩티보디를 세균에서 클로닝 및 발현시키는 방법이 실시예 3에 기재되었다. 사용된 벡터는 pAMG21ampR-pep-Fc이고, 다음에 열거된 올리고를 사용하여 Gly-ShK(1-35)-L-Fc를 세균에서 클로닝 및 발현시키기 위한 이중체 (하기 참고)를 생성시켰다.
이중체를 형성하기 위해 사용된 올리고가 다음에 제시된다:
상기 제시된 올리고를 사용하여 하기 제시된 이중체를 형성시켰다:
펩티보디의 세균성 발현은 실시예 3에 기재된 바와 같았고, 페이스트는 동결 저장하였다.
약어
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 약어는 특정한 상황 하에서 달리 정의되지 않는 한은, 다음에 정의된 바와 같다:
Ac 아세틸 (아세틸화 잔기를 지칭하기 위해 사용됨)
AcBpa 아세틸화 p-벤조일-L-페닐알라닌
ADCC 항체-의존성 세포성 세포독성
Aib 아미노이소부티르산
bA 베타-알라닌
Bpa p-벤조일-L-페닐알라닌
BrAc 브로모아세틸 (BrCH2C(O)
BSA 소 혈청 알부민
Bzl 벤질
Cap 카프로산
COPD 만성 폐쇄성 폐 질환
CTL 세포독성 T 림프구
DCC 디시클로헥실카보디이미드
Dde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소-시클로헥실리덴)에틸
ESI-MS 전기 분무 이온화 질량 분광법
Fmoc 플루오레닐메톡시카보닐
HOBt 1-히드록시벤조트리아졸
HPLC 고 성능 액체 크로마토그래피
HSL 호모세린 락톤
IB 봉입체
KCa 칼슘-활성화 칼륨 채널 (IKCa, BKCa, SKCa 포함)
Kv 전압 의존형 칼륨 채널
Lau 라우르산
LPS 지질다당류
LYMPH 림프구
MALDI-MS 매트릭스-이용 레이저 탈착 이온화 질량 분광법
Me 메틸
MeO 메톡시
MHC 주요 조직적합성 복합체
MMP 매트릭스 메탈로프로테이나제
1-Nap 1-나프틸알라닌
NEUT 호중구
Nle 노르루이신
NMP N-메틸-2-피롤리돈
PAGE 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
PBMC 말초혈 단핵 세포
PBS 인산염 완충 식염수
Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
Pec 피페콜산
PEG 폴리(에틸렌 글리콜)
pGlu 피로글루탐산
Pic 피콜린산
pY 포스포티로신
RBS 리보솜 결합 부위
RT 실온 (25℃)
Sar 사르코신
SDS 나트륨 도데실 설페이트
STK 세린-트레오닌 키나제
t-Boc 3급-부톡시카보닐
tBu 3급-부틸
THF 흉선 체액성 인자
Trt 트리틸
본 출원은 2005년 4월 22일자로 출원된 미국 가특허출원 제60/672,342호에 기초한 우선권을 청구하고 있는, 2006년 4월 17일자로 출원된 미국 비-가특허출원 (출원 번호가 아직 입수 가능하지 않음)에 기초한 우선권을 주장하고 있다 (상기 특허출원 모두의 내용은 본원에 포함시키기로 한다).
2006년 4월 17일자로 생성된 파일명 A-1006.ST25.txt (이 파일의 크기는 744 KB이다)로써 식별되는, 컴팩트 디스크에 담긴 모든 사항을 본원에 포함시키기로 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 각종 공개 문헌이 괄호 () 또는 각괄호 [] 내에 표기된다. 이들 공개 문헌의 전문은 본 발명이 속하는 분야의 기술 내용을 보다 상세히 기재하기 위해 본 명세서에 포함시키기로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. <120> Toxin Peptide Therapeutic Agents <130> A-1006 PCT <140> WO 2006/116156 <141> 2006-04-18 <150> 60/674,342 <151> 2005-04-22 <150> 11/406,454 <151> 2006-04-17 <160> 1390 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 738 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(738) <400> 1 atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 96 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 144 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 192 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 240 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 288 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 336 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 384 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 432 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 528 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 576 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 624 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 672 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 720 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 tcc ctg tct ccg ggt aaa 738 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 2 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <400> 3 atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 96 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 144 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 192 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 240 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 288 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa 684 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 4 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 5 <211> 35 <212> PRT <213> Stichodactyla helianthus <400> 5 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Heteractis magnifica <400> 6 Arg Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg 1 5 10 15 Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Ser Cys 35 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Actinia equina <400> 7 Gly Cys Lys Asp Asn Phe Ser Ala Asn Thr Cys Lys His Val Lys Ala 1 5 10 15 Asn Asn Asn Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Thr Asn Cys Ala Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Lys Cys 35 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Anemonia sulcata <400> 8 Ala Cys Lys Asp Asn Phe Ala Ala Ala Thr Cys Lys His Val Lys Glu 1 5 10 15 Asn Lys Asn Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Thr Asn Cys Ala Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Lys Cys 35 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Bunodosoma granulifera <400> 9 Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 10 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino acid alignment of ShK to other members of the sea anemone family of toxins. Disulfide linkages are found between positions 3-35, 12-28, and 17-32. <400> 10 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 11 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmKK1-precursor <400> 11 Met Lys Ile Phe Phe Ala Ile Leu Leu Ile Leu Ala Val Cys Ser Met 1 5 10 15 Ala Ile Trp Thr Val Asn Gly Thr Pro Phe Ala Ile Lys Cys Ala Thr 20 25 30 Asp Ala Asp Cys Ser Arg Lys Cys Pro Gly Asn Pro Ser Cys Arg Asn 35 40 45 Gly Phe Cys Ala Cys Thr 50 <210> 12 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmKK4-precursor <400> 12 Met Lys Phe Ile Ile Val Leu Ile Leu Ile Ser Val Leu Ile Ala Thr 1 5 10 15 Ile Val Pro Val Asn Glu Ala Gln Thr Gln Cys Gln Ser Val Arg Asp 20 25 30 Cys Gln Gln Tyr Cys Leu Thr Pro Asp Arg Cys Ser Tyr Gly Thr Cys 35 40 45 Tyr Cys Lys Thr Thr Gly Lys 50 55 <210> 13 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kvt1.3 peptide inhibitor sequence - Tc32 <400> 13 Thr Gly Pro Gln Thr Thr Cys Gln Ala Ala Met Cys Glu Ala Gly Cys 1 5 10 15 Lys Gly Leu Gly Lys Ser Met Glu Ser Cys Gln Gly Asp Thr Cys Lys 20 25 30 Cys Lys Ala 35 <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PBTx1 <400> 14 Asp Glu Glu Pro Lys Glu Ser Cys Ser Asp Glu Met Cys Val Ile Tyr 1 5 10 15 Cys Lys Gly Glu Glu Tyr Ser Thr Gly Val Cys Asp Gly Pro Gln Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Ser Asp 35 <210> 15 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmKK6-precursor <400> 15 Met Ser Arg Leu Phe Thr Leu Val Leu Ile Val Leu Ala Met Asn Val 1 5 10 15 Met Met Ala Ile Ile Ser Asp Pro Val Val Glu Ala Val Gly Cys Glu 20 25 30 Glu Cys Pro Met His Cys Lys Gly Lys Asn Ala Lys Pro Thr Cys Asp 35 40 45 Asp Gly Val Cys Asn Cys Asn Val 50 55 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - P01 <400> 16 Val Ser Cys Glu Asp Cys Pro Glu His Cys Ser Thr Gln Lys Ala Gln 1 5 10 15 Ala Lys Cys Asp Asn Asp Lys Cys Val Cys Glu Pro Ile 20 25 <210> 17 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - Pi2 <400> 17 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 18 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - Pi3 <400> 18 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Glu Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 19 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - Pi4 <400> 19 Ile Glu Ala Ile Arg Cys Gly Gly Ser Arg Asp Cys Tyr Arg Pro Cys 1 5 10 15 Gln Lys Arg Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Thr Cys 20 25 30 Lys Cys Tyr Gly Cys Ser 35 <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IKCa1 peptide inhibitor sequence - MTX <400> 20 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 21 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - Pi1 <400> 21 Leu Val Lys Cys Arg Gly Thr Ser Asp Cys Gly Arg Pro Cys Gln Gln 1 5 10 15 Gln Thr Gly Cys Pro Asn Ser Lys Cys Ile Asn Arg Met Cys Lys Cys 20 25 30 Tyr Gly Cys 35 <210> 22 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmKTX-precursor <400> 22 Met Lys Val Phe Phe Ala Val Leu Ile Thr Leu Phe Ile Cys Ser Met 1 5 10 15 Ile Ile Gly Ile His Gly Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser 20 25 30 Gly Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys 35 40 45 Cys Ile Asn Gly Lys Cys Asp Cys Thr Pro Lys Gly 50 55 60 <210> 23 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - AgTx2 <400> 23 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 24 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kaliotoxin 1 (KTX1) peptide sequence <400> 24 Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 25 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - OSK1 <400> 25 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kvt1.3 peptide inhibitor sequence - BmKTX <400> 26 Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys 20 25 30 Asp Cys Thr Pro Lys Gly 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kvt1.3 peptide inhibitor sequence - HgTx1 <400> 27 Thr Val Ile Asp Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Leu Pro Pro 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gln Phe Gly Ile Arg Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Pro His 35 <210> 28 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MgTx peptide sequence - MgTx <400> 28 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Leu Pro Pro 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gln Phe Gly Gln Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Pro His 35 <210> 29 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BKCa peptide inhibitor sequence - BllTx1 <400> 29 Ile Thr Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Gln Gln Cys Leu Arg Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Arg Phe Gly Gln His Ala Gly Gly Lys Cys Ile Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Pro 35 <210> 30 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin peptide sequence - NTX <400> 30 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 31 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tc30 <400> 31 Val Phe Ile Asn Val Lys Cys Arg Gly Ser Lys Glu Cys Leu Pro Ala 1 5 10 15 Cys Lys Ala Ala Val Gly Lys Ala Ala Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Pro 35 <210> 32 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TsTX-Ka <400> 32 Val Phe Ile Asn Ala Lys Cys Arg Gly Ser Pro Glu Cys Leu Pro Lys 1 5 10 15 Cys Lys Glu Ala Ile Gly Lys Ala Ala Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Pro 35 <210> 33 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PBTx3 <400> 33 Glu Val Asp Met Arg Cys Lys Ser Ser Lys Glu Cys Leu Val Lys Cys 1 5 10 15 Lys Gln Ala Thr Gly Arg Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys 20 25 30 Lys Cys Tyr Pro Arg 35 <210> 34 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lgh 15-1 <400> 34 Gly Leu Ile Asp Val Arg Cys Tyr Asp Ser Arg Gln Cys Trp Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Thr Gln Gly Lys Cys Gln Asn Lys Gln 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 35 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BKCa peptide inhibitor sequence - MartenTx <400> 35 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 36 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kvt1.3 peptide inhibitor sequence - ChTx <400> 36 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 37 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MartenTx-precursor <400> 37 Met Lys Ile Phe Ser Ile Leu Leu Val Ala Leu Ile Ile Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ile Cys Thr Glu Ala Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala 20 25 30 Ser Ser Glu Cys Trp Thr Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln 35 40 45 Gly Lys Cys Gln Asn Asn Gln Cys Arg Cys Tyr 50 55 <210> 38 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BKCa peptide inhibitor sequence - IbTx <400> 38 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 39 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BKCa peptide inhibitor sequence - Slotoxin (SloTx) <400> 39 Thr Phe Ile Asp Val Asp Cys Thr Val Ser Lys Glu Cys Trp Ala Pro 1 5 10 15 Cys Lys Ala Ala Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Val 35 <210> 40 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kvt1.3 peptide inhibitor sequence - BmTx1 <400> 40 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 41 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BKCa peptide inhibitor sequence - BuTx <400> 41 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 42 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-Lg2 <400> 42 Met Lys Ile Leu Ser Val Leu Leu Leu Ala Leu Ile Ile Cys Ser Ile 1 5 10 15 Val Gly Trp Ser Glu Ala Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser 20 25 30 Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly 35 40 45 Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Ser 50 55 <210> 43 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmTx1-precursor <400> 43 Met Lys Ile Ser Phe Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Cys Ser Ile Gly 1 5 10 15 Trp Ser Glu Ala Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln 20 25 30 Cys Trp Pro Val Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys 35 40 45 Met Asn Gly Lys Cys Arg Cys Tyr Ser 50 55 <210> 44 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AmmTX3 <400> 44 Gln Ile Glu Thr Asn Lys Lys Cys Gln Gly Gly Ser Cys Ala Ser Val 1 5 10 15 Cys Arg Lys Val Ile Gly Val Ala Ala Gly Lys Cys Ile Asn Gly Arg 20 25 30 Cys Val Cys Tyr Pro 35 <210> 45 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AaTX1 <400> 45 Met Lys Phe Ser Ser Ile Ile Leu Leu Thr Leu Leu Ile Cys Ser Met 1 5 10 15 Ser Ile Phe Gly Asn Cys Gln Ile Glu Thr Asn Lys Lys Cys Gln Gly 20 25 30 Gly Ser Cys Ala Ser Val Cys Arg Arg Val Ile Gly Val Ala Ala Gly 35 40 45 Lys Cys Ile Asn Gly Arg Cys Val Cys Tyr Pro 50 55 <210> 46 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmTX3 <400> 46 Met Lys Phe Ser Ser Ile Ile Leu Leu Thr Leu Leu Ile Cys Ser Met 1 5 10 15 Ser Lys Phe Gly Asn Cys Gln Val Glu Thr Asn Val Lys Cys Gln Gly 20 25 30 Gly Ser Cys Ala Ser Val Cys Arg Lys Ala Ile Gly Val Ala Ala Gly 35 40 45 Lys Cys Ile Asn Gly Arg Cys Val Cys Tyr Pro 50 55 <210> 47 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - TsK <400> 47 Val Val Ile Gly Gln Arg Cys Tyr Arg Ser Pro Asp Cys Tyr Ser Ala 1 5 10 15 Cys Lys Lys Leu Val Gly Lys Ala Thr Gly Lys Cys Thr Asn Gly Arg 20 25 30 Cys Asp Cys 35 <210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tc1 <400> 48 Ala Cys Gly Ser Cys Arg Lys Lys Cys Lys Gly Ser Gly Lys Cys Ile 1 5 10 15 Asn Gly Arg Cys Lys Cys Tyr 20 <210> 49 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK2 <400> 49 Ala Cys Gly Pro Gly Cys Ser Gly Ser Cys Arg Gln Lys Gly Asp Arg 1 5 10 15 Ile Lys Cys Ile Asn Gly Ser Cys His Cys Tyr Pro 20 25 <210> 50 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - BmP05 <400> 50 Ala Val Cys Asn Leu Lys Arg Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Cys Ile Gly Asp Lys Cys Glu Cys Val Lys His Gly 20 25 30 <210> 51 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - ScyTx <400> 51 Ala Phe Cys Asn Leu Arg Met Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Cys Ile Gly Asp Lys Cys Glu Cys Val Lys His 20 25 30 <210> 52 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - P05 <400> 52 Thr Val Cys Asn Leu Arg Arg Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Cys Ile Gly Val Lys Cys Glu Cys Val Lys His 20 25 30 <210> 53 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - Tamapin <400> 53 Ala Phe Cys Asn Leu Arg Arg Cys Glu Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Cys Ile Gly Glu Glu Cys Lys Cys Val Pro Tyr 20 25 30 <210> 54 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TsK-precursor <400> 54 Met Lys Val Leu Tyr Gly Ile Leu Ile Ile Phe Ile Leu Cys Ser Met 1 5 10 15 Phe Tyr Leu Ser Gln Glu Val Val Ile Gly Gln Arg Cys Tyr Arg Ser 20 25 30 Pro Asp Cys Tyr Ser Ala Cys Lys Lys Leu Val Gly Lys Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Cys Thr Asn Gly Arg Cys Asp Cys 50 55 <210> 55 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CoTx1 <400> 55 Met Glu Gly Ile Ala Lys Ile Thr Leu Ile Leu Leu Phe Leu Phe Val 1 5 10 15 Thr Met His Thr Phe Ala Asn Trp Asn Thr Glu Ala Ala Val Cys Val 20 25 30 Tyr Arg Thr Cys Asp Lys Asp Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Arg Ser Gly 35 40 45 Lys Cys Ile Asn Asn Ala Cys Lys Cys Tyr Pro Tyr Gly Lys 50 55 60 <210> 56 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1 <400> 56 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Arg Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 57 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2 <400> 57 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 58 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Folded Des-Arg1-ShK. <220> <221> DISULFID <222> (2)..(34) <223> Folded Des-Arg1-Shk with disulfide bonds between 2-34, 51-67, and 56-71. <220> <221> DISULFID <222> (11)..(27) <223> Folded Des-Arg1-Shk with disulfide bonds between 2-34, 11-27, and 16-31. <220> <221> DISULFID <222> (16)..(31) <223> Folded Des-Arg1-Shk with disulfide bonds between 2-34, 11-27, and 16-31. <400> 58 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 59 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Charybdotoxin (ChTx)peptide sequence - ChTx-E32 <400> 59 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Glu 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 60 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BmPo5-precursor <400> 60 Met His Asn Tyr Tyr Lys Ile Val Leu Ile Met Val Ala Phe Phe Ala 1 5 10 15 Val Ile Ile Thr Phe Ser Asn Ile Gln Val Glu Gly Ala Val Cys Asn 20 25 30 Leu Lys Arg Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly Leu Leu Gly Lys 35 40 45 Cys Ile Gly Asp Lys Cys Glu Cys Val Lys His Gly Lys 50 55 60 <210> 61 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1. <400> 61 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 62 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - Anuroctoxin <400> 62 Glx Lys Glu Cys Thr Gly Pro Gln His Cys Thr Asn Phe Cys Arg Lys 1 5 10 15 Asn Lys Cys Thr His Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Phe 20 25 30 Asn Cys Lys 35 <210> 63 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKm1 <400> 63 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 64 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N type Ca channel peptide inhibitor sequence - GVIA <400> 64 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr 20 25 <210> 65 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N type Ca channel peptide inhibitor sequence - MVIIA <400> 65 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 66 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N type Ca channel peptide inhibitor sequence - Ptu1 <400> 66 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 67 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX <400> 67 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SKCa peptide inhibitor sequence - Apamin <400> 68 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 69 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid and amino acid sequences of pAMG21ampR-Fc-pep <220> <221> CDS <222> (4)..(702) <400> 69 cat atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1 5 10 15 ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 96 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 144 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 192 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 240 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 288 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 80 85 90 95 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 336 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 100 105 110 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 384 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 432 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 130 135 140 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 480 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 528 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 160 165 170 175 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 576 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 180 185 190 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 624 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 672 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 ctg tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tgagacgctg caggacgt 720 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly 225 230 <210> 70 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly 225 230 <210> 71 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid and amino acid sequences of pAMG21ampR-Fc-pep. Fc domain sequences exclude the five C-terminal glycine residues. <220> <221> CDS <222> (4)..(687) <400> 71 cat atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1 5 10 15 ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 96 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 144 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 192 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 240 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 288 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 80 85 90 95 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 336 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 100 105 110 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 384 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 432 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 130 135 140 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 480 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 528 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 160 165 170 175 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 576 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 180 185 190 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 624 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 672 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 ctg tct ccg ggt aaa 687 Leu Ser Pro Gly Lys 225 <210> 72 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 73 <211> 709 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid and amino acid sequences of pAMG21ampR-Pep-Fc. <220> <221> CDS <222> (4)..(699) <400> 73 tca ggt ggt ggt ggt ggt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 48 Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 96 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 144 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 192 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 240 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 288 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 80 85 90 95 cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 336 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 384 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 432 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 480 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 528 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 160 165 170 175 tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 576 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 624 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 672 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatggatcc 709 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 74 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 75 <211> 691 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid and amino acid sequences of pAMG21ampR-Pep-Fc. The Fc domain sequences exclude the five N-terminal glycine residues. <220> <221> CDS <222> (1)..(681) <400> 75 gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 48 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 96 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 144 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 192 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 240 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 288 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 336 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 384 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 432 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 480 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 528 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 576 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 624 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 672 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 ccg ggt aaa taatggatcc 691 Pro Gly Lys 225 <210> 76 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 77 <211> 879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide and amino acid sequences of molecule Fc-L10-ShK [1-35]. <220> <221> CDS <222> (1)..(879) <400> 77 atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 96 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 144 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 192 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 240 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 288 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 336 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 384 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 432 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 528 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 576 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 624 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 672 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 720 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 tcc ctg tct ccg ggt aaa gga gga gga gga tcc gga gga gga gga agc 768 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 cgc agc tgc atc gac acc atc ccc aag agc cgc tgc acc gcc ttc cag 816 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 260 265 270 tgc aag cac agc atg aag tac cgc ctg agc ttc tgc cgc aag acc tgc 864 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 275 280 285 ggc acc tgc taa tga 879 Gly Thr Cys 290 <210> 78 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 260 265 270 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 275 280 285 Gly Thr Cys 290 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L10 linker amino acid sequence used in Fc-L10-ShK [1-35]. <400> 79 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 80 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide and amino acid sequences of molecule Fc-L10-ShK [2-35]. <220> <221> CDS <222> (1)..(873) <400> 80 atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 96 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 144 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 192 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 240 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 288 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 336 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 384 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 432 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 528 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 576 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 624 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 672 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 720 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 tcc ctg tct ccg ggt aaa gga gga gga gga tcc gga gga gga gga agc 768 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 agc tgc atc gac acc atc ccc aag agc cgc tgc acc gcc ttc cag tgc 816 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 260 265 270 aag cac agc atg aag tac cgc ctg agc ttc tgc cgc aag acc tgc ggc 864 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 275 280 285 acc tgc taa 873 Thr Cys 290 <210> 81 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 260 265 270 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg 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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 336 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 384 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 432 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 528 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 576 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 624 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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 210 215 220 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 225 230 235 240 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 260 265 270 Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys 275 280 285 His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr 290 295 300 Cys 305 <210> 84 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-25 linker amino acid sequence used in Fc-L25-ShK [2-35]. <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 85 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv1.3 peptide inhibitor sequence - AgTx1 <400> 85 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile 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<400> 89 Arg Ser Ser Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Ser 35 <210> 90 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-S1 <400> 90 Ser Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 91 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-N-acetylarg1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> N-acetylarginine <400> 91 Xaa Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 92 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-d1 <400> 92 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 93 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-d2 <400> 93 Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys 1 5 10 15 His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr 20 25 30 Cys <210> 94 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A1 <400> 94 Ala Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 95 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A4 <400> 95 Arg Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 96 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A4/A15 <400> 96 Arg Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 97 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A4/A15/A25 <400> 97 Arg Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Ala Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 98 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A6 <400> 98 Arg Ser Cys Ile Asp Ala Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 99 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A7 <400> 99 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ala Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 100 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - Shk-A8 <400> 100 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Ala Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 101 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A9 <400> 101 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Ala Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 102 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E9 <400> 102 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Glu Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 103 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Q9 <400> 103 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Gln Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 104 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A10 <400> 104 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ala Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 105 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A11 <400> 105 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Ala Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 106 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E11 <400> 106 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Glu Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 107 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Q11 <400> 107 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Gln Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 108 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A13 <400> 108 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Ala Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 109 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A15 <400> 109 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 110 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-W15 <400> 110 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Trp Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 111 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X15 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Any nonfunctional amino acid residue <400> 111 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Xaa Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 112 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A15/A25 <400> 112 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Ala Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 113 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A16 <400> 113 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Ala 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 114 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E16 <400> 114 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Glu 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 115 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A18 <400> 115 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Ala His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 116 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E18 <400> 116 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Glu His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 117 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A19 <400> 117 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys Ala Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 118 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-K19 <400> 118 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys Lys Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 119 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A20 <400> 119 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ala Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 120 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A21 <400> 120 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Ala Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 121 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X21 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Any nonfunctional amino acid residue. <400> 121 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Xaa Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 122 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Nle21 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is norleucine. <400> 122 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Xaa Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 123 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A22 <400> 123 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 124 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E22 <400> 124 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Glu Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 125 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-R22 <400> 125 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Arg Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 126 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Any nonfunctional amino acid residue <400> 126 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 127 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Nle22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is Norleucine. <400> 127 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 128 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Orn22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is Ornithine. <400> 128 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 129 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Homocit22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is homocitrulline. <400> 129 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 130 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Diaminopropionic22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is diaminopropionic acid. <400> 130 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 131 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A23 <400> 131 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Ala Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 132 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-S23 <400> 132 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Ser Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 133 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-F23 <400> 133 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Phe Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 134 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Any nonfunctional amino acid residue. <400> 134 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 135 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Nitrophe23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Nitrophenylalanine <400> 135 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 136 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-aminopheala23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is aminophenylalanine. <400> 136 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 137 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence -ShK-Benzoylpheala23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is benzoylphenylalanine. <400> 137 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 138 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A24 <400> 138 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Ala Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 139 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E24 <400> 139 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Glu Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 140 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A25 <400> 140 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Ala Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 141 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A26 <400> 141 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ala Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 142 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A27 <400> 142 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Ala Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 143 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is any nonfunctional amino acid residue. <400> 143 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Xaa Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 144 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A29 <400> 144 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Ala Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 145 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A30 <400> 145 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Ala Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 146 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A31 <400> 146 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Ala Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 147 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A34 <400> 147 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Ala Cys 35 <210> 148 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A4d1 <400> 148 Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 149 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A4/A15d1 <400> 149 Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 150 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A4/A15/A25 d1 <400> 150 Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Ala Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 151 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A6 d1 <400> 151 Ser Cys Ile Asp Ala Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 152 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A7 d1 <400> 152 Ser Cys Ile Asp Thr Ala Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 153 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A8 d1 <400> 153 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Ala Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 154 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A9 d1 <400> 154 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Ala Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 155 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E9 d1 <400> 155 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Glu Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 156 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Q9 d1 <400> 156 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Gln Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 157 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A10 d1 <400> 157 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ala Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 158 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A11 d1 <400> 158 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Ala Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 159 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E11 d1 <400> 159 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Glu Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 160 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Q11 d1 <400> 160 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Gln Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 161 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A13 d1 <400> 161 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Ala Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 162 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A15 d1 <400> 162 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 163 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-W15 d1 <400> 163 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Trp Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 164 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X15 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is any nonfunctional amino acid residue. <400> 164 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Xaa Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 165 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A15/A25 d1 <400> 165 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Ala Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 166 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A16 d1 <400> 166 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Ala Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 167 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E16 d1 <400> 167 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Glu Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 168 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A18 d1 <400> 168 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Ala His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 169 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E18 d1 <400> 169 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Glu His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 170 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A19 d1 <400> 170 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys Ala Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 171 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-K19 d1 <400> 171 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys Lys Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 172 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A20 d1 <400> 172 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ala Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 173 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A21 d1 <400> 173 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Ala Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 174 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X21 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is any nonfunctional amino acid residue. <400> 174 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Xaa Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 175 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Nle21 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is norleucine. <400> 175 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Xaa Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 176 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A22 d1 <400> 176 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 177 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E22 d1 <400> 177 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Glu Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 178 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-R22 d1 <400> 178 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Arg Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 179 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X22 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is any nonfunctional amino acid residue. <400> 179 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 180 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Nle22 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is norleucine. <400> 180 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 181 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Orn22 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is ornithine. <400> 181 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 182 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Homocit22 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is homocitrulline. <400> 182 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 183 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Diaminopropionic22 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is diaminopropionic acid. <400> 183 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Xaa Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 184 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A23 d1 <400> 184 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Ala Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 185 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-S23 d1 <400> 185 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Ser Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 186 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-F23 d1 <400> 186 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Phe Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 187 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X23 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is any nonfunctional amino acid residue. <400> 187 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 188 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - - ShK-Nitrophe23 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is nitrophenaylalanine. <400> 188 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 189 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Aminopheala23 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is aminophenylalanine. <400> 189 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 190 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Benzoylpheala23 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is benzoylphenylalanine. <400> 190 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Xaa Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 191 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A24 d1 <400> 191 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Ala Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 192 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-E24 d1 <400> 192 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Glu Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 193 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - - ShK-A25 d1 <400> 193 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Ala Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 194 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A26 d1 <400> 194 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ala Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 195 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A27 d1 <400> 195 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Ala Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 196 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-X27 d1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is any nonfunctional amino acid residue. <400> 196 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Xaa Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 197 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A29 d1 <400> 197 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Ala Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 198 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A30 d1 <400> 198 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Ala Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 199 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A31 d1 <400> 199 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Ala Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 200 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-A34 d1 <400> 200 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ala Cys <210> 201 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-A1 <400> 201 Ala Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg 1 5 10 15 Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Ser Cys 35 <210> 202 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-S1 <400> 202 Ser Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg 1 5 10 15 Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Ser Cys 35 <210> 203 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1 <400> 203 Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 204 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/S2 <400> 204 Ser Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 205 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/l4 <400> 205 Thr Cys Ile Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 206 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1T6 <400> 206 Thr Cys Lys Asp Thr Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 207 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/K9 <400> 207 Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Lys Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 208 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/R11 <400> 208 Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Arg Cys Thr Asp Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 209 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/A14 <400> 209 Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Ala Ile Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 210 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/F15 <400> 210 Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu Cys Thr Asp Phe Arg Cys 1 5 10 15 Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 211 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HmK peptide sequence - HmK-d1/Q16 <400> 211 Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val Ser Glu 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independently nonfunctional amino acid residues. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in positions 7, 23, and 27 are each independently nonfunctional amino acid residues. <400> 225 Ala Thr Cys Lys Asp Leu Xaa Pro Val Ser Arg Cys Thr Asp Ile Arg 1 5 10 15 Cys Arg Thr Ser Met Lys Xaa Arg Leu Asn Xaa Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Ser Cys 35 <210> 226 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgK peptide sequence - BhK-A1 <400> 226 Ala Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 227 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgK peptide sequence - BgK-A3 <400> 227 Val Cys Ala Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 228 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgK peptide sequence - BgK-A5 <400> 228 Val Cys Arg Asp Ala Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 229 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgK peptide sequence - BgK-A8 <400> 229 Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Ala Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 230 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgK peptide sequence - BgK-A9 <400> 230 Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Ala Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 231 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BgK peptide sequence - BgK-A12 <400> 231 Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Ala His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 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Sequence <220> <223> MgTx peptide sequence - MgTx-Z3 <400> 260 Gly Val Ile Ile Asn Val Ser Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Leu Pro 1 5 10 15 Pro Cys Lys Ala Gln Phe Gly Gln Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn 20 25 30 Gly Lys Cys Lys Cys Tyr Pro His 35 40 <210> 261 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A5 <400> 261 Gly Val Pro Ile Ala Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 262 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A16 <400> 262 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Ala 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 263 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A19 <400> 263 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Ala Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 264 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A24 <400> 264 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Ala Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 265 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A27 <400> 265 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Ala Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 266 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A31 <400> 266 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Ala Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 267 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A32 <400> 267 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Ala 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 268 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A38 <400> 268 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Ala 35 <210> 269 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-A5/A38 <400> 269 Gly Val Pro Ile Ala Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Ala 35 <210> 270 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-G31 <400> 270 Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 271 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-OSK_z1 <400> 271 Gly Val Pro Ile Ile Val Ser Cys Lys Gly Ser Arg Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 272 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-OSK_z2 <400> 272 Gly Val Pro Ile Ile Val Ser Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 273 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-OSK_z3 <400> 273 Gly Val Pro Ile Ile Val Lys Cys Lys Gly Ser Arg Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 274 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-OSK_z4 <400> 274 Gly Val Pro Ile Ile Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 275 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgTx2 peptide sequence - AgTx2-OSK_z5 <400> 275 Gly Val Pro Ile Ile Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 276 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 276 Ala Ser Cys Xaa Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 277 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A4 <400> 277 Ala Ser Cys Ala Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 278 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 278 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Xaa Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 279 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A7 <400> 279 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Ala Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 280 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X14 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 280 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Xaa Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 281 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A14 <400> 281 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Ala Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 282 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X15 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 282 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Xaa Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 283 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A15 <400> 283 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Ala Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 284 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 284 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Xaa Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 285 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A23 <400> 285 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Ala Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 286 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 286 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Xaa Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 287 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A27 <400> 287 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Ala Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 288 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X28 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is any amino acid residue. <400> 288 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Xaa Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 289 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A28 <400> 289 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Ala Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 290 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X30 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 290 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Xaa Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 291 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HxTx1-A30 <400> 291 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Ala Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 292 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-X33 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 292 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Xaa Cys <210> 293 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heteromitrus spinnifer peptide sequence - HsTx1-A33 <400> 293 Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Ala Cys <210> 294 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K16 <400> 294 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 295 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-D20 <400> 295 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 296 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K16,D20 <400> 296 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 297 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - PSL1-P12,K16,D20 <400> 297 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 298 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,Y36 <400> 298 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 299 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X8 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 299 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Xaa Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 300 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A8 <400> 300 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Ala Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 301 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X15 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 301 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Xaa Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 302 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A15 <400> 302 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Ala Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 303 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X16 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 303 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Xaa 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 304 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A16 <400> 304 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Ala 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 305 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 305 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Xaa Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 306 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A24 <400> 306 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Ala Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 307 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X28 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 307 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Xaa Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 308 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A28 <400> 308 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Ala Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 309 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X29 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 309 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Xaa Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 310 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A29 <400> 310 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Ala Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 311 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X31 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 311 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Xaa Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 312 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A31 <400> 312 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Ala Cys 20 25 30 Phe Gly Arg 35 <210> 313 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-X35 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 313 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Xaa 35 <210> 314 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-A35 <400> 314 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly Ala 35 <210> 315 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pi2 peptide sequence - Pi2-d35 <400> 315 Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys 20 25 30 Phe Gly <210> 316 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anuroctoxin peptide sequence - AnTx-d1 <400> 316 Lys Glu Cys Thr Gly Pro Gln His Cys Thr Asn Phe Cys Arg Lys Asn 1 5 10 15 Lys Cys Thr His Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Phe Asn 20 25 30 Cys Lys <210> 317 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anuroctoxin peptide sequence - AnTx-d1, X2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 317 Xaa Glu Cys Thr Gly Pro Gln His Cys Thr Asn Phe Cys Arg Lys Asn 1 5 10 15 Lys Cys Thr His Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Phe Asn 20 25 30 Cys Lys <210> 318 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anuroctoxin peptide sequence - AnTxd1,A2 <400> 318 Ala Glu Cys Thr Gly Pro Gln His Cys Thr Asn Phe Cys Arg Lys Asn 1 5 10 15 Lys Cys Thr His Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Phe Asn 20 25 30 Cys Lys <210> 319 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-A6 <400> 319 Thr Ile Ile Asn Val Ala Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 320 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-R25 <400> 320 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Arg Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 321 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-S10 <400> 321 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Ser Lys Gln Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 322 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-W14 <400> 322 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Trp Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 323 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-A25d <400> 323 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 324 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-lbTx1 <400> 324 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 <210> 325 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noxiustoxin (NTX) peptide sequence - NTX-lBTX2 <400> 325 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Trp Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Glu Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Asn 35 <210> 326 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kaliotoxin 1 (KTX1) peptide sequence - KTX2 <400> 326 Val Arg Ile Pro Val Ser Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 Asp Cys Thr Pro Lys 35 <210> 327 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kaliotoxin 1 (KTX1) peptide sequence - KTX1-S7 <400> 327 Gly Val Glu Ile Asn Val Ser Cys Ser Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 328 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kaliotoxin 1 (KTX1) peptide sequence - KTX1-A7 <400> 328 Gly Val Glu Ile Asn Val Ala Cys Ser Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 329 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IKCa1 peptide inhibitor sequence - ChTx-Lq2 <400> 329 Gln Phe Thr Gln Glu Ser Cys Thr Ala Ser Asn Gln Cys Trp Ser Ile 1 5 10 15 Cys Lys Arg Leu His Asn Thr Asn Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 330 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A4 <400> 330 Val Ser Cys Ala Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 331 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A6 <400> 331 Val Ser Cys Thr Gly Ala Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 332 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A7 <400> 332 Val Ser Cys Thr Gly Ser Ala Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 333 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A10 <400> 333 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Ala Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 334 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-Q14 <400> 334 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Gln Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 335 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-Q15 <400> 335 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Gln Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 336 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-Q14,15 <400> 336 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Gln Gln Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 337 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A33 <400> 337 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Ala Cys <210> 338 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-HsTx1 <400> 338 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn 20 25 30 Arg Cys <210> 339 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A12,20 <400> 339 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Ala Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Ala Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 340 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-X19,34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in positions 19 and 34 are each independently nonfuctional residues. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa in positions 19 and 34 are each independently nonfuctional residues. <400> 340 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Xaa Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Xaa <210> 341 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-S19,34 <400> 341 Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Ser Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Ser <210> 342 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - MTX-A7 <400> 342 Val Ser Cys Thr Gly Ser Ala Asp Cys Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln 1 5 10 15 Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr 20 25 30 Gly Cys <210> 343 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maurotoxin (MTx) peptide sequence - Tsk-MTX <400> 343 Val Val Ile Gly Gln Arg Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys Tyr Ala Pro 1 5 10 15 Cys Arg Lys Gln Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile Asn Lys Ser 20 25 30 Cys Lys Cys Tyr Gly Cys 35 <210> 344 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Charybdotoxin (ChTx)peptide sequence - ChTx-D32 <400> 344 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Asp 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 345 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Charybdotoxin (ChTx)peptide sequence - ChTx_d1-d6 <400> 345 Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu His Asn 1 5 10 15 Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Ser 20 25 30 <210> 346 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Charybdotoxin (ChTx)peptide sequence - ChTx-lbTx <400> 346 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 347 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N type Ca channel peptide inhibitor sequence - SVIB <400> 347 Cys Lys Leu Lys Gly Gln Ser Cys Arg Lys Thr Ser Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Ser Gly Ser Cys Gly Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 348 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apamin peptide inhibitor sequence - Ap-X4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 348 Cys Asn Cys Xaa Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 349 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apamin peptide inhibitor sequence - Ap-A4 <400> 349 Cys Asn Cys Ala Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 350 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apamin peptide inhibitor sequence - Ap-X13 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 350 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Xaa Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 351 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apamin peptide inhibitor sequence - Ap-A13 <400> 351 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Ala Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 352 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apamin peptide inhibitor sequence - Ap-X14 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 352 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Xaa Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 353 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apamin peptide inhibitor sequence - Ap-A14 <400> 353 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Ala Cys Gln 1 5 10 15 Gln His Gly <210> 354 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Scyllatoxin (ScyTx), BMP05, PO5, Tamapin, P01 peptide inhibitor sequence - ScyTx-R7 <400> 354 Ala Phe Cys Asn Leu Arg Arg Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Cys Ile Gly Asp Lys Cys Glu Cys Val Lys His 20 25 30 <210> 355 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Scyllatoxin (ScyTx), BMP05, PO5, Tamapin, P01 peptide inhibitor sequence - ScyTx-lbTx <400> 355 Ala Phe Cys Asn Leu Arg Met Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys Cys Arg Cys Val Lys His 20 25 30 <210> 356 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Scyllatoxin (ScyTx), BMP05, PO5, Tamapin, P01 peptide inhibitor sequence - ScyTx-C/S <400> 356 Ala Phe Ser Asn Leu Arg Met Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Lys Ser Ile Gly Asp Lys Cys Glu Cys Val Lys His 20 25 30 <210> 357 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-X11 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 357 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Xaa Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 358 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A11 <400> 358 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Ala Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 359 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-X18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 359 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Xaa Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 360 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A18 <400> 360 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Ala Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 361 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-X25 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 361 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Xaa Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 362 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A25 <400> 362 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Ala Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 363 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 363 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Xaa Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 364 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx, (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A27 <400> 364 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Ala Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 365 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-X31 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 365 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Xaa Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 366 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A31 <400> 366 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Ala Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 367 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-X32 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 367 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Xaa 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 368 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A32 <400> 368 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Ala 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Gln 35 <210> 369 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx peptide inhibitor sequence - IbTx-X34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 369 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Xaa Cys Tyr Gln 35 <210> 370 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IbTx (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - IbTx-A34 <400> 370 Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gln 35 <210> 371 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx <400> 371 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 372 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 372 Gln Phe Thr Asp Val Xaa Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 373 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A6 <400> 373 Gln Phe Thr Asp Val Ala Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 374 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X11 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 374 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Xaa Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 375 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A11 <400> 375 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Ala Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 376 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 376 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Xaa Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 377 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A18 <400> 377 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Ala Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 378 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 378 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Xaa Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 379 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A23 <400> 379 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Ala Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 380 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 380 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Xaa Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 381 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A27 <400> 381 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Ala Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 382 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X32 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 382 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Xaa 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 383 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A32 <400> 383 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Ala 20 25 30 Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 384 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-X34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 384 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Xaa Tyr Ser 35 <210> 385 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Slotoxin peptide inhibitor sequence - SloTx-A34 <400> 385 Gln Phe Thr Asp Val Lys Cys Thr Gly Ser Lys Gln Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Gln Met Phe Gly Lys Pro Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Tyr Ser 35 <210> 386 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx <400> 386 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 387 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-X14 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 387 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Xaa Cys Tyr 1 5 10 15 Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 388 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-A14 <400> 388 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Ala Cys Tyr 1 5 10 15 Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 389 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BiTx-X22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 389 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Xaa Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 390 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-A22 <400> 390 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Ala Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met Asn Asn 20 25 30 Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 <210> 391 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-X26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 391 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Xaa His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 392 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-A26 <400> 392 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Ala His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 393 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-X30 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 393 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Xaa Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 394 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-A30 <400> 394 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Ala Met Asn 20 25 30 Asn Lys Cys Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 395 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-X35 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 395 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Asn Xaa Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 396 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-A35 <400> 396 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Asn Ala Arg Cys Tyr Thr Asn 35 40 <210> 397 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-X37 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 397 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Asn Lys Cys Xaa Tyr Thr Asn 35 40 <210> 398 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BuTX (Slotoxin family) peptide inhibitor sequence - BuTx-A37 <400> 398 Trp Cys Ser Thr Cys Leu Asp Leu Ala Cys Gly Ala Ser Arg Glu Cys 1 5 10 15 Tyr Asp Pro Cys Phe Lys Ala Phe Gly Arg Ala His Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Asn Lys Cys Ala Tyr Thr Asn 35 40 <210> 399 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - Marten Tx-X7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 399 Phe Gly Leu Ile Asp Val Xaa Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 400 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - Marten Tx-A7 <400> 400 Phe Gly Leu Ile Asp Val Ala Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 401 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - Marten Tx-X19 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 401 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Xaa Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 402 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - MartenTx-A19 <400> 402 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Ala Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 403 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - MartenTx-X20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 403 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Xaa Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 404 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - Marten Tx-A20 <400> 404 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Ala Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 405 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - MartenTx-X28 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 405 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Xaa Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 406 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - MartenTx-A28 <400> 406 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Ala Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Arg Cys Tyr 35 <210> 407 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - MartenTx-X35 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 407 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Xaa Cys Tyr 35 <210> 408 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Martentoxin peptide inhibitor sequence - MartenTx-A35 <400> 408 Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn 20 25 30 Gln Cys Ala Cys Tyr 35 <210> 409 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N type Ca channel peptide inhibitor sequence - CVIA <400> 409 Cys Lys Ser Lys Gly Ala Lys Cys Ser Lys Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Ser Gly Thr Val Gly Arg Cys 20 25 <210> 410 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-X2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 410 Cys Xaa Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 411 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-A2 <400> 411 Cys Ala Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 412 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-X4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 412 Cys Lys Gly Xaa Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 413 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-A4 <400> 413 Cys Lys Gly Ala Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 414 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-X7 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 414 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Xaa Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 415 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-A7 <400> 415 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Ala Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 416 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-X10 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 416 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Xaa Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 417 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-A10 <400> 417 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Ala Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 418 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-X21 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 418 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Xaa Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 419 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-A21 <400> 419 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Ala Ser Gly Lys Cys 20 25 <210> 420 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-X24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 420 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Xaa Cys 20 25 <210> 421 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wMVIIA peptide inhibitor sequence - MVIIA-A24 <400> 421 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Ala Cys 20 25 <210> 422 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-X2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 422 Cys Xaa Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr 20 25 <210> 423 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-A2 <400> 423 Cys Ala Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr 20 25 <210> 424 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-X17 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 424 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Xaa Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr 20 25 <210> 425 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-A17 <400> 425 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Ala Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg Cys Tyr 20 25 <210> 426 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-X24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 426 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Xaa Arg Cys Tyr 20 25 <210> 427 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-A24 <400> 427 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Ala Arg Cys Tyr 20 25 <210> 428 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-X25 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 428 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Xaa Cys Tyr 20 25 <210> 429 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wGVIA peptide inhibitor sequence - GVIA-A25 <400> 429 Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Ala Cys Tyr 20 25 <210> 430 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-X3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 430 Ala Glu Xaa Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 431 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-A3 <400> 431 Ala Glu Ala Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 432 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-X17 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 432 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Xaa Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 433 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-A17 <400> 433 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Ala Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 434 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 434 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Xaa Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 435 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-A23 <400> 435 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Ala Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys 20 25 30 Cys Leu <210> 436 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-X32 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 436 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Xaa 20 25 30 Cys Leu <210> 437 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ptu1 peptide inhibitor sequence - Ptu1-A32 <400> 437 Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp 1 5 10 15 Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Ala 20 25 30 Cys Leu <210> 438 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-X3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 438 Glu Cys Xaa Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Arg Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 439 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-A3 <400> 439 Glu Cys Ala Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Arg Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 440 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-X17 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 440 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Xaa His Leu Val Cys Ser Arg Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 441 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-A17 <400> 441 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Ala His Leu Val Cys Ser Arg Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 442 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 442 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Xaa Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 443 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-A23 <400> 443 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Ala Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 444 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-X24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 444 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Arg Xaa His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 445 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T type Ca channel peptide inhibitor sequence - ProTx1-A24 <400> 445 Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Val Cys Ser Arg Ala His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 446 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-d1 <400> 446 Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val Cys 1 5 10 15 Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe Cys 20 25 30 Asp Cys Phe 35 <210> 447 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-X1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 447 Xaa Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 448 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-A1 <400> 448 Ala Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 449 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-X6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 449 Arg Pro Thr Asp Ile Xaa Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 450 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-A6 <400> 450 Arg Pro Thr Asp Ile Ala Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 451 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-X18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 451 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Xaa Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 452 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-A18 <400> 452 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Ala Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 453 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-X20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 453 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Xaa Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 454 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-A20 <400> 454 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Ala Phe Gly Lys Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 455 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKm1-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 455 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Xaa Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 456 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-A23 <400> 456 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Ala Thr Asn Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 457 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 457 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Xaa Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 458 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M current peptide inhibitor sequence - BeKM1-A27 <400> 458 Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val 1 5 10 15 Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn Gly Ala Cys Val Asn Gly Phe 20 25 30 Cys Asp Cys Phe 35 <210> 459 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - Smllla <400> 459 Gln Arg Cys Cys Asn Gly Arg Arg Gly Cys Ser Ser Arg Trp Cys Arg 1 5 10 15 Asp His Ser Arg Cys Cys 20 <210> 460 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - mu-GIIIA <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6, 7, and 17. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6, 7, and 17. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6, 7, and 17. <400> 460 Arg Asp Cys Cys Thr Xaa Xaa Lys Lys Cys Lys Asp Arg Gln Cys Lys 1 5 10 15 Xaa Gln Arg Cys Cys Ala 20 <210> 461 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - mu-GIIIB <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6, 7, and 17. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6, 7, and 17. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6, 7, and 17. <400> 461 Arg Asp Cys Cys Thr Xaa Xaa Arg Lys Cys Lys Asp Arg Arg Cys Lys 1 5 10 15 Xaa Met Arg Cys Cys Ala 20 <210> 462 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - mu-PIIIA <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 8 and 18. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 8 and 18. <400> 462 Glx Arg Leu Cys Cys Gly Phe Xaa Lys Ser Cys Arg Ser Arg Gln Cys 1 5 10 15 Lys Xaa His Arg Cys Cys 20 <210> 463 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - mu-SmIIIA <400> 463 Glx Arg Cys Cys Asn Gly Arg Arg Gly Cys Ser Ser Arg Trp Cys Arg 1 5 10 15 Asp His Ser Arg Cys Cys 20 <210> 464 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - muO-MrVIA <400> 464 Ala Cys Arg Lys Lys Trp Glu Tyr Cys Ile Val Pro Ile Ile Gly Phe 1 5 10 15 Ile Tyr Cys Cys Pro Gly Leu Ile Cys Gly Pro Phe Val Cys Val 20 25 30 <210> 465 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - muO-MrVIB <400> 465 Ala Cys Ser Lys Lys Trp Glu Tyr Cys Ile Val Pro Ile Ile Gly Phe 1 5 10 15 Ile Tyr Cys Cys Pro Gly Leu Ile Cys Gly Pro Phe Val Cys Val 20 25 30 <210> 466 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - delta-PVIA <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6 and 14. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 6 and 14. <400> 466 Glu Ala Cys Tyr Ala Xaa Gly Thr Phe Cys Gly Ile Lys Xaa Gly Leu 1 5 10 15 Cys Cys Ser Glu Phe Cys Leu Pro Gly Val Cys Phe Gly 20 25 <210> 467 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - delta-SVIE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is hydroxyproline. <400> 467 Asp Gly Cys Ser Ser Gly Gly Thr Phe Cys Gly Ile His Xaa Gly Leu 1 5 10 15 Cys Cys Ser Glu Phe Cys Phe Leu Trp Cys Ile Thr Phe Ile Asp 20 25 30 <210> 468 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - delta-TxVIA <400> 468 Trp Cys Lys Gln Ser Gly Glu Met Cys Asn Leu Leu Asp Gln Asn Cys 1 5 10 15 Cys Asp Gly Tyr Cys Ile Val Leu Val Cys Thr 20 25 <210> 469 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Na channel peptide inhibitor sequence - delta-GmVIA <400> 469 Val Lys Pro Cys Arg Lys Glu Gly Gln Leu Cys Asp Pro Ile Phe Gln 1 5 10 15 Asn Cys Cys Arg Gly Trp Asn Cys Val Leu Phe Cys Val 20 25 <210> 470 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-X14 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 470 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Xaa Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 471 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-A14 <400> 471 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Ala Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 472 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-X15 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 472 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Xaa Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 473 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-A15 <400> 473 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Ala Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 474 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-X23 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 474 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Xaa Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 475 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-A23 <400> 475 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Ala Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 476 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-X25 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 476 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Xaa Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 477 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-A25 <400> 477 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Ala Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 478 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 478 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Xaa Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 479 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-A27 <400> 479 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Ala Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 480 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-X36 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa in position 36 is any amino acid. <400> 480 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Xaa 35 <210> 481 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-A36 <400> 481 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Ala 35 <210> 482 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - CTX-d36 <400> 482 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys 35 <210> 483 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b <400> 483 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 484 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-X17 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 484 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Xaa Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 485 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-A17 <400> 485 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Ala Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 486 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-X18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 486 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Xaa Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 487 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-A18 <400> 487 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Ala Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 488 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-X20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 488 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Xaa Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 489 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm12b-A20 <400> 489 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Ala Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 490 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-X28 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 490 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Xaa Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 491 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-A28 <400> 491 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Ala Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Arg Glu 35 <210> 492 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-X38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 492 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Xaa Glu 35 <210> 493 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CI channel peptide inhibitor sequence - Bm-12b-A38 <400> 493 Gln Thr Asp Gly Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala 1 5 10 15 Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Pro 20 25 30 Gln Cys Leu Cys Asn Ala Glu 35 <210> 494 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1 <400> 494 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 495 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-X3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 495 Glu Cys Xaa Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 496 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-A3 <400> 496 Glu Cys Ala Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 497 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-X10 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 497 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Xaa Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 498 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-A10 <400> 498 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Ala Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 499 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-X17 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 499 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Xaa His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 500 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-A17 <400> 500 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Ala His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 501 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-X22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 501 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Xaa Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 502 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-A22 <400> 502 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Ala Phe Arg Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 503 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-X24 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 503 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Xaa Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 504 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-A24 <400> 504 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Ala Asp Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 505 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-X26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 505 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Xaa Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 506 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv2.1 peptide inhibitor sequence - HaTx1-A26 <400> 506 Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp Ala Tyr Cys Ala Trp Asp Phe 20 25 30 Thr Phe Ser 35 <210> 507 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-X4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 507 Tyr Cys Gln Xaa Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 508 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-A4 <400> 508 Tyr Cys Gln Ala Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 509 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-X13 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 509 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Xaa Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 510 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-A13 <400> 510 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Ala Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 511 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-X14 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 511 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Xaa Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 512 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-A14 <400> 512 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Ala Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 513 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-X22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 513 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Xaa Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 514 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-A22 <400> 514 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Ala Leu Trp Cys Lys Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 515 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-X26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 515 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Xaa Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 516 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-A26 <400> 516 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Ala Arg Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 517 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-X27 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any amino acid residue. <400> 517 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Xaa Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 518 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv4.3 & Kv4.2 peptide inhibitor sequence - PaTx2-A27 <400> 518 Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys 1 5 10 15 Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Ala Ile Ile Asn Met 20 25 30 <210> 519 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - PnIA <400> 519 Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Ala Asn Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 520 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - PnIA-L10 <400> 520 Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Leu Asn Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 521 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - PnIA-S11 <400> 521 Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Ala Ser Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 522 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - PnIB <400> 522 Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Leu Ser Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 523 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - PnIB-A10 <400> 523 Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Ala Ser Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 524 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - PnIB-N11 <400> 524 Gly Cys Cys Ser Leu Pro Pro Cys Ala Leu Asn Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 525 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - MII <400> 525 Gly Cys Cys Ser Asn Pro Val Cys His Leu Glu His Ser Asn Leu Cys 1 5 10 15 <210> 526 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-MI <400> 526 Gly Arg Cys Cys His Pro Ala Cys Gly Lys Asn Tyr Ser Cys 1 5 10 <210> 527 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-EI <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is hydroxyproline. <400> 527 Arg Asp Xaa Cys Cys Tyr His Pro Thr Cys Asn Met Ser Asn Pro Gln 1 5 10 15 Ile Cys <210> 528 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-AuIB <400> 528 Gly Cys Cys Ser Tyr Pro Pro Cys Phe Ala Thr Asn Pro Asp Cys 1 5 10 15 <210> 529 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-PIA <400> 529 Arg Asp Pro Cys Cys Ser Asn Pro Val Cys Thr Val His Asn Pro Gln 1 5 10 15 Ile Cys <210> 530 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-ImI <400> 530 Gly Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Ala Trp Arg Cys 1 5 10 <210> 531 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-ImII <400> 531 Ala Cys Cys Ser Asp Arg Arg Cys Arg Trp Arg Cys 1 5 10 <210> 532 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alpha-GI <400> 532 Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Gly Arg His Tyr Ser Cys 1 5 10 <210> 533 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alphaA-PIVA <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 7, 13, and 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 7, 13, and 20. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 7, 13, and 20. <400> 533 Gly Cys Cys Gly Ser Tyr Xaa Asn Ala Ala Cys His Xaa Cys Ser Cys 1 5 10 15 Lys Asp Arg Xaa Ser Tyr Cys Gly Gln 20 25 <210> 534 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - alphaA-EIVA <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is hydroxyproline in positons 6, 12, 20, 21, and 26. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is hydroxyproline in positons 6, 12, 20, 21, and 26. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is hydroxyproline in positons 6, 12, 20, 21, and 26. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is hydroxyproline in positons 6, 12, 20, 21, and 26. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is hydroxyproline in positons 6, 12, 20, 21, and 26. <400> 534 Gly Cys Cys Pro Tyr Xaa Asn Ala Ala Cys His Xaa Cys Gly Cys Lys 1 5 10 15 Val Gly Arg Xaa Xaa Tyr Cys Asp Arg Xaa Ser Gly Gly 20 25 <210> 535 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - psi-PIIIE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 2, 3, and 14. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 2, 3, and 14. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is hydroxyproline in positions 2, 3, and 14. <400> 535 His Xaa Xaa Cys Cys Leu Tyr Gly Lys Cys Arg Arg Tyr Xaa Gly Cys 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Cys Cys Gln Arg 20 <210> 536 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - EpI <400> 536 Gly Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Asn Met Asn Asn Pro Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 537 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - GIC <400> 537 Gly Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Ala Gly Asn Asn Gln His Ile Cys 1 5 10 15 <210> 538 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - GID <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in position 4 is gamma carboxy glutamic acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is hydroxyproline. <400> 538 Ile Arg Asp Xaa Cys Cys Ser Asn Pro Ala Cys Arg Val Asn Asn Xaa 1 5 10 15 His Val Cys <210> 539 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - AnIB <400> 539 Gly Gly Cys Cys Ser His Pro Ala Cys Ala Ala Asn Asn Gln Asp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 540 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - AuIA <400> 540 Gly Cys Cys Ser Tyr Pro Pro Cys Phe Ala Thr Asn Ser Asp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 541 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nACHR channel peptide inhibitor sequence - AuIC <400> 541 Gly Cys Cys Ser Tyr Pro Pro Cys Phe Ala Thr Asn Ser Gly Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 542 <211> 74 <212> PRT <213> Heteractis magnifica <220> <221> MISC_FEATURE <223> The HmK peptide toxin sequence shows the immature precursor peptide. The mature HmK peptide toxin would be predicted to be 35 amino acids in length and span residues 40 through 74. <400> 542 Met Lys Ser Gln Met Ile Ala Ala Val Leu Leu Ile Ala Phe Cys Leu 1 5 10 15 Cys Val Val Val Thr Ala Arg Met Glu Leu Gln Asp Val Glu Asp Met 20 25 30 Glu Asn Gly Phe Gln Lys Arg Arg Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val 35 40 45 Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu 50 55 60 Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly Ser Cys 65 70 <210> 543 <211> 74 <212> PRT <213> Heteractis magnifica <220> <221> DISULFID <222> (42)..(74) <223> With predicted disulfide linkages between 47-74, 51-67, and 56-71. <220> <221> DISULFID <222> (51)..(67) <223> With predicted disulfide linkages between 47-74, 51-67, and 56-71. <220> <221> DISULFID <222> (56)..(71) <223> With predicted disulfide linkages between 47-74, 51-67, and 56-71. <400> 543 Met Lys Ser Gln Met Ile Ala Ala Val Leu Leu Ile Ala Phe Cys Leu 1 5 10 15 Cys Val Val Val Thr Ala Arg Met Glu Leu Gln Asp Val Glu Asp Met 20 25 30 Glu Asn Gly Phe Gln Lys Arg Arg Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val 35 40 45 Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu 50 55 60 Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly Ser Cys 65 70 <210> 544 <211> 36 <212> PRT <213> Actinia equina <220> <221> DISULFID <222> (2)..(36) <223> With predicted disulfide linkages between 2-36, 11-29, and 20-33. <220> <221> DISULFID <222> (11)..(29) <223> With predicted disulfide linkages between 2-36, 11-29, and 20-33. <220> <221> DISULFID <222> (20)..(33) <223> With predicted disulfide linkages between 2-36, 11-29, and 20-33. <400> 544 Gly Cys Lys Asp Asn Phe Ser Ala Asn Thr Cys Lys His Val Lys Ala 1 5 10 15 Asn Asn Asn Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Thr Asn Cys Ala Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Lys Cys 35 <210> 545 <211> 36 <212> PRT <213> Anemonia sulcata <220> <221> DISULFID <222> (2)..(36) <223> With predicted disulfide linkages between 2-36, 11-29, and 20-33. <220> <221> DISULFID <222> (11)..(29) <223> With predicted disulfide linkages between 2-36, 11-29, and 20-33. <220> <221> DISULFID <222> (20)..(33) <223> With predicted disulfide linkages between 2-36, 11-29, and 20-33. <400> 545 Ala Cys Lys Asp Asn Phe Ala Ala Ala Thr Cys Lys His Val Lys Glu 1 5 10 15 Asn Lys Asn Cys Gly Ser Gln Lys Tyr Ala Thr Asn Cys Ala Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Lys Cys 35 <210> 546 <211> 37 <212> PRT <213> Bunodosoma granulifera <220> <221> DISULFID <222> (2)..(37) <223> With predicted disulfide linkages between 2-37, 11-30, and 20-34. <220> <221> DISULFID <222> (11)..(30) <223> With predicted disulfide linkages between 2-37, 11-30, and 20-34. <220> <221> DISULFID <222> (20)..(34) <223> With predicted disulfide linkages between 2-37, 11-30, and 20-34. <400> 546 Val Cys Arg Asp Trp Phe Lys Glu Thr Ala Cys Arg His Ala Lys Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Cys Arg Thr Ser Gln Lys Tyr Arg Ala Asn Cys Ala Lys 20 25 30 Thr Cys Glu Leu Cys 35 <210> 547 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified form of the peptide ChTx-Lg2 <220> <221> MISC_FEATURE <223> The CHTx-Lg2 sequence shows the immature or modified form of the peptide. <400> 547 Met Lys Ile Leu Ser Val Leu Leu Leu Ala Leu Ile Ile Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ile Asp Trp Ser Glu Gly Gln Phe Thr Gln Glu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 30 Asn Gln Cys Trp Ser Ile Cys Lys Arg Leu His Asn Thr Asn Arg Gly 35 40 45 Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Ser 50 55 <210> 548 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Y1 <400> 548 Tyr Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 549 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-K1 <400> 549 Lys Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 550 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-H1. <400> 550 His Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 551 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Q1. <400> 551 Gln Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 552 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - PP-ShK. <400> 552 Pro Pro Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala 1 5 10 15 Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys 20 25 30 Thr Cys Gly Thr Cys 35 <210> 553 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - M-ShK. <400> 553 Met Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Cys 35 <210> 554 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - G-ShK. <400> 554 Gly Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Cys 35 <210> 555 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-K1/A22. <400> 555 Tyr Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 556 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-K1/A22. <400> 556 Lys Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 557 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-H1/A22 <400> 557 His Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 558 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - ShK-Q1/A22. <400> 558 Gln Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 559 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - PP-ShK-A22. <400> 559 Pro Pro Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala 1 5 10 15 Phe Gln Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys 20 25 30 Thr Cys Gly Thr Cys 35 <210> 560 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - M-ShK-A22. <400> 560 Met Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 Gln Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Cys 35 <210> 561 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK peptide sequence - G-ShK-A22. <400> 561 Gly Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 Gln Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Cys 35 <210> 562 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-P12,K16,D20 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 562 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 563 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-P12,K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 563 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 564 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-P12,K16,D20-NH2. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 564 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 565 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K16,D20,Y36-NH2. <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 565 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 566 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16,D20,Y36 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 566 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 567 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16,D20,Y36-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 567 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 568 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K16-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 568 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 569 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 569 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 570 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 570 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 571 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-D20. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 571 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 572 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 572 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 573 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 573 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 574 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 574 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 575 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 575 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 576 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 576 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 577 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-peptide sequence - OSK1-K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 577 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 578 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16,D20 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 578 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 579 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 579 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 580 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Delta1-OSK1. <400> 580 Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu Pro 1 5 10 15 Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 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15 Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 584 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-A34. <400> 584 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 585 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-A34. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 585 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 586 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-A34-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 586 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg 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MOD_RES <222> (34)..(34) <223> AMIDATION <400> 595 Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp 1 5 10 15 Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr 20 25 30 Pro Lys <210> 596 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - (Delta1-6)-OSK1-K16,D20. <400> 596 Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly 1 5 10 15 Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 20 25 30 <210> 597 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-peptide sequence - Ac-(Delta1-6)-OSK1-K16,D20. <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 597 Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly 1 5 10 15 Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 20 25 30 <210> 598 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - (Delta1-6)-OSK1-K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> AMIDATION <400> 598 Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly 1 5 10 15 Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 20 25 30 <210> 599 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-(Delta1-6)-OSK1-K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> AMIDATION <400> 599 Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly 1 5 10 15 Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 20 25 30 <210> 600 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - (Delta1-7)-OSK1-K16,D20 <400> 600 Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met 1 5 10 15 Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 20 25 30 <210> 601 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-(Delta1-7)-OSK1-K16,D20 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 601 Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys 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<222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 607 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Asn Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 608 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K16,D20,R31 <400> 608 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 609 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequences - OsK1-K16,D20,R31-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 609 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 610 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16,D20,R31 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 610 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 611 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K16,D20,R31-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 611 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 612 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K12,K16,R19,D20 <400> 612 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Lys Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Arg Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 613 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K12,K16,R19,D20 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 613 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Lys Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Arg Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 614 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequences - OSK1-K12,K16,R19,D20,NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 614 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Lys Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Arg Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 615 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K12,K16,R19, D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 615 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Lys Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Arg Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 616 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Delta1-OSK1-T2,K16,D20 <400> 616 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 617 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-Delta1-OSK1-T2,K16,D20 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 617 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 618 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Delta1-OSK1-T2,K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> AMIDATION <400> 618 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 619 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-Delta1-OSK1-T2,K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> AMIDATION <400> 619 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys 20 25 30 His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 620 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequences - OSK1-K3 <400> 620 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 621 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 621 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 622 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 622 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 623 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - AC-OSK1-K3-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 623 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 624 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3, A34 <400> 624 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 625 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3, K16,D20 <400> 625 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 626 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3,K16,D20,A34 <400> 626 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 627 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3,A34 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 627 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 628 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3,A34-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 628 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 629 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3,A34,NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 629 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 630 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3,K16,D20,A34 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 630 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 631 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3,K16,D20,A34-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 631 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 632 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3,K16,D20,A34-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 632 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 633 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3,K16,D20 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 633 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 634 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - OSK1-K3,K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 634 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 635 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Ac-OSK1-K3,K16,D20-NH2 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 635 Gly Val Lys Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 636 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 peptide sequence - Delta36-38-OSK1-K16,D20 <400> 636 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr 35 <210> 637 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid linker sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <400> 637 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 638 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L5 linker amino acid sequence. <400> 638 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 639 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 639 Gly Gly Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 640 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 640 Gly Gly Glu Glu Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 641 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 641 Gly Glu Glu Glu Gly 1 5 <210> 642 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 642 Gly Glu Glu Glu 1 <210> 643 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 643 Gly Gly Asp Gly Gly Gly 1 5 <210> 644 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 644 Gly Gly Asp Asp Asp Gly Gly 1 5 <210> 645 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 645 Gly Asp Asp Asp Gly 1 5 <210> 646 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 646 Gly Asp Asp Asp 1 <210> 647 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 647 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Ser Asp Glu Gly Ser Asp Gly Glu Asp 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 648 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 648 Trp Glu Trp Glu Trp 1 5 <210> 649 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 649 Phe Glu Phe Glu Phe 1 5 <210> 650 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 650 Glu Glu Glu Trp Trp Trp 1 5 <210> 651 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 651 Glu Glu Glu Phe Phe Phe 1 5 <210> 652 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 652 Trp Trp Glu Glu Glu Trp Trp 1 5 <210> 653 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <400> 653 Phe Phe Glu Glu Glu Phe Phe 1 5 <210> 654 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <400> 654 Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 655 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <400> 655 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 656 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker sequence. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa in positions 1, 2, 4, and 5 are each independently any amino acid residue. <400> 656 Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 657 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid linker <220> <221> misc_feature <223> Full length ShK gene linked to four glycine and one serine amino acid linker in positions 7, 8, 9, 10, and 11. <220> <221> CDS <222> (7)..(132) <400> 657 ggatcc gga gga gga gga agc cgc agc tgc atc gac acc atc ccc aag 48 Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys 1 5 10 agc cgc tgc acc gcc ttc cag tgc aag cac agc atg aag tac cgc ctg 96 Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu 15 20 25 30 agc ttc tgc cgc aag acc tgc ggc acc tgc taa tga gcggccgc 140 Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 658 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 658 Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg 1 5 10 15 Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe 20 25 30 Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 659 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide (3632-93) <400> 659 catggatccg gaggaggagg aagccgcagc tgcatcgaca ccatccccaa gagccgctgc 60 accgccttcc agtgcaagca c 81 <210> 660 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide (3632-95) <400> 660 catgcggccg ctcattagca ggtgccgcag gtcttgcggc agaagctcag gcggtacttc 60 atgctgtgct tgcactggaa gg 82 <210> 661 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence [4101-57] <400> 661 catggatcca gctgcatcga caccatc 27 <210> 662 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence [3632-96] <400> 662 catgcggccg ctcattagc 19 <210> 663 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence [4101-58] <400> 663 catggatccg gaggaggagg aagcagctgc a 31 <210> 664 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence [4101-61] <400> 664 catgcggccg ctcattagca ggtgc 25 <210> 665 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence [4101-59] <400> 665 catggatccg ggggtggggg ttctgggggt gggggttctg gaggaggagg aagcggagga 60 ggaggaagca gctgca 76 <210> 666 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence [4101-61] <400> 666 catgcggccg ctcattagca ggtgc 25 <210> 667 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 3008-05. <400> 667 ccaacacact tcgaaagacg ttgatcggca c 31 <210> 668 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 3008-06. <400> 668 cacccaacaa tgcatcctta aaaaaattac gccc 34 <210> 669 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4142-87: Oligonucleotide. <400> 669 tggttccggt ggtggtggtt cccgttcctg catcgacacc at 42 <210> 670 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4142-88: Oligonucleotide. <400> 670 cccgaaatcc cgttgcaccg ctttccagtg caaacactcc atgaaatacc gtctgtcctt 60 ctgccgtaaa acctgcggta cctgc 85 <210> 671 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4142-89: Oligonucleotide. <400> 671 cttagcaggt accgcaggtt ttacggcaga aggacagacg gt 42 <210> 672 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4142-90: Oligonucleotide. <400> 672 atttcatgga gtgtttgcac tggaaagcgg tgcaacggga tttcgggatg gtgtcgatgc 60 aggaacggga accaccacca ccgga 85 <210> 673 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in position 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 673 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc cgt tcc tgc atc gac acc atc ccg aaa 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys 1 5 10 15 tcc cgt tgc acc gct ttc cag tgc aaa cac tcc atg aaa tac cgt ctg 97 Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu 20 25 30 tcc ttc tgc cgt aaa acc tgc ggt acc tgc 127 Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 674 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 674 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys 1 5 10 15 Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu 20 25 30 Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 675 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in position 1-4. <400> 675 cttagcaggt accgcaggtt ttacggcaga aggacagacg gtatttcatg gagtgtttgc 60 actggaaagc ggtgcaacgg gatttcggga tggtgtcgat gcaggaacgg gaaccaccac 120 caccgga 127 <210> 676 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4154-78: Oligonucleotide duplex. <400> 676 tggttccggt ggtggtggtt cctgcatcga caccatcccg aaatcccgtt gcaccgcttt 60 ccagtgcaaa cactccatga aat 83 <210> 677 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4154-79: Oglionucleotide duplex. <400> 677 accgtctgtc cttctgccgt aaaacctgcg gtacctgc 38 <210> 678 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4154-8O: Oligonucleotide duplex. <400> 678 cttagcaggt accgcaggtt ttacggcaga aggacagacg gtatttcatg gagtgtttgc 60 actggaaagc ggtgcaacgg ga 82 <210> 679 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4154-81: Oligonucleotide duplex. <400> 679 tttcgggatg gtgtcgatgc aggaaccacc accaccgga 39 <210> 680 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(121) <400> 680 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tgc atc gac acc atc ccg aaa tcc cgt 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg 1 5 10 15 tgc acc gct ttc cag tgc aaa cac tcc atg aaa tac cgt ctg tcc ttc 97 Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe 20 25 30 tgc cgt aaa acc tgc ggt acc tgc 121 Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 681 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 681 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg 1 5 10 15 Cys Thr Ala Phe Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe 20 25 30 Cys Arg Lys Thr Cys Gly Thr Cys 35 40 <210> 682 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded in positions 1-4. <400> 682 caggtaccgc aggttttacg gcagaaggac agacggtatt tcatggagtg tttgcactgg 60 aaagcggtgc aacgggattt cgggatggtg tcgatgcagg aaccaccacc accgga 116 <210> 683 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 683 tggttgagac g 11 <210> 684 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 684 tccaccacca 10 <210> 685 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 685 taaggatccg 10 <210> 686 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 686 gcagagaatt c 11 <210> 687 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 687 tatgcgagac g 11 <210> 688 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 688 ttattgtata c 11 <210> 689 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 689 gcagagtcca c 11 <210> 690 <211> 42 <212> DNA <213> 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Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4 on both strands. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 695 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc cgt acc tgc aaa gac ctg atc ccg gtt 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val 1 5 10 15 tcc gaa tgc acc gac atc cgt tgc cgt acc tcc atg aaa tac cgt ctg 97 Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu 20 25 30 aac ctg tgc cgt aaa acc tgc ggt tcc tgc 127 Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly Ser Cys 35 40 <210> 696 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 696 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Cys Lys Asp Leu Ile Pro Val 1 5 10 15 Ser Glu Cys Thr Asp Ile Arg Cys Arg Thr Ser Met Lys Tyr Arg Leu 20 25 30 Asn Leu Cys Arg Lys Thr Cys Gly Ser Cys 35 40 <210> 697 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 697 cttagcagga accgcaggtt ttacggcaca ggttcagacg gtatttcatg gaggtacggc 60 aacggatgtc ggtgcattcg gaaaccggga tcaggtcttt gcaggtacgg gaaccaccac 120 caccgga 127 <210> 698 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-77] <400> 698 tggttccggt ggtggtggtt ccggtgttga aatcaacgtt aaatgct 47 <210> 699 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-78] <400> 699 ccggttcccc gcagtgcctg aaaccgtgca aagacgctgg tatgcgtttc ggtaaatgca 60 tgaaccgtaa atgccactgc accccgaaa 89 <210> 700 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-79] <400> 700 cttatttcgg ggtgcagtgg catttacggt tcatgcattt accgaaa 47 <210> 701 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-80] <400> 701 cgcataccag cgtctttgca cggtttcagg cactgcgggg aaccggagca tttaacgttg 60 atttcaacac cggaaccacc accaccgga 89 <210> 702 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(136) <400> 702 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc ggt gtt gaa atc aac gtt aaa tgc tcc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser 1 5 10 15 ggt tcc ccg cag tgc ctg aaa ccg tgc aaa gac gct ggt atg cgt ttc 97 Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 ggt aaa tgc atg aac cgt aaa tgc cac tgc acc ccg aaa 136 Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 703 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 703 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Glu Ile Asn Val Lys Cys Ser 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 704 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 704 cttatttcgg ggtgcagtgg catttacggt tcatgcattt accgaaacgc ataccagcgt 60 ctttgcacgg tttcaggcac tgcggggaac cggagcattt aacgttgatt tcaacaccgg 120 aaccaccacc accgga 136 <210> 705 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-85] <400> 705 tggttccggt ggtggtggtt ccgcttcctg ccgtaccccg aaagac 46 <210> 706 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-86] <400> 706 tgcgctgacc cgtgccgtaa agaaaccggt tgcccgtacg gtaaatgcat gaaccgtaaa 60 tgcaaatgca accgttgc 78 <210> 707 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-87] <400> 707 cttagcaacg gttgcatttg catttacggt tcatgcattt accgtacg 48 <210> 708 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-88] <400> 708 ggcaaccggt ttctttacgg cacgggtcag cgcagtcttt cggggtacgg caggaagcgg 60 aaccaccacc accgga 76 <210> 709 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(124) <400> 709 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc gct tcc tgc cgt acc ccg aaa gac tgc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys 1 5 10 15 gct gac ccg tgc cgt aaa gaa acc ggt tgc ccg tac ggt aaa tgc atg 97 Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met 20 25 30 aac cgt aaa tgc aaa tgc aac cgt tgc 124 Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 40 <210> 710 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 710 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys 1 5 10 15 Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met 20 25 30 Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn Arg Cys 35 40 <210> 711 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 711 cttagcaacg gttgcatttg catttacggt tcatgcattt accgtacggg caaccggttt 60 ctttacggca cgggtcagcg cagtctttcg gggtacggca ggaagcggaa ccaccaccac 120 cgga 124 <210> 712 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-59] <400> 712 tggttccggt ggtggtggtt ccaccatcat caacgttaaa tgcacctc 48 <210> 713 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-60] <400> 713 cccgaaacag tgcctgccgc cgtgcaaagc tcagttcggt cagtccgctg gtgctaaatg 60 catgaacggt aaatgcaaat gctacccgca c 91 <210> 714 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-61] <400> 714 cttagtgcgg gtagcatttg catttaccgt tcatgcattt agcaccag 48 <210> 715 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-62] <400> 715 cggactgacc gaactgagct ttgcacggcg gcaggcactg tttcggggag gtgcatttaa 60 cgttgatgat ggtggaacca ccaccaccgg a 91 <210> 716 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(139) <400> 716 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc acc atc atc aac gtt aaa tgc acc tcc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser 1 5 10 15 ccg aaa cag tgc ctg ccg ccg tgc aaa gct cag ttc ggt cag tcc gct 97 Pro Lys Gln Cys Leu Pro Pro Cys Lys Ala Gln Phe Gly Gln Ser Ala 20 25 30 ggt gct aaa tgc atg aac ggt aaa tgc aaa tgc tac ccg cac 139 Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys Lys Cys Tyr Pro His 35 40 45 <210> 717 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 717 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Cys Leu Pro Pro Cys Lys Ala Gln Phe Gly Gln Ser Ala 20 25 30 Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys Lys Cys Tyr Pro His 35 40 45 <210> 718 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 718 cttagtgcgg gtagcatttg catttaccgt tcatgcattt agcaccagcg gactgaccga 60 actgagcttt gcacggcggc aggcactgtt tcggggaggt gcatttaacg ttgatgatgg 120 tggaaccacc accaccgga 139 <210> 719 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-89] <400> 719 tggttccggt ggtggtggtt ccggtgttcc gatcaacgtt tcctgcaccg gt 52 <210> 720 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-90] <400> 720 tccccgcagt gcatcaaacc gtgcaaagac gctggtatgc gtttcggtaa atgcatgaac 60 cgtaaatgcc actgcacccc gaaa 84 <210> 721 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-91] <400> 721 cttatttcgg ggtgcagtgg catttacggt tcatgcattt accgaaacgc ata 53 <210> 722 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-92] <400> 722 ccagcgtctt tgcacggttt gatgcactgc ggggaaccgg tgcaggaaac gttgatcgga 60 acaccggaac caccaccacc gga 83 <210> 723 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(136) <400> 723 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc ggt gtt ccg atc aac gtt tcc tgc acc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr 1 5 10 15 ggt tcc ccg cag tgc atc aaa ccg tgc aaa gac gct ggt atg cgt ttc 97 Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 ggt aaa tgc atg aac cgt aaa tgc cac tgc acc ccg aaa 136 Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 724 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 724 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Pro Ile Asn Val Ser Cys Thr 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gln Cys Ile Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 725 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 725 cttatttcgg ggtgcagtgg catttacggt tcatgcattt accgaaacgc ataccagcgt 60 ctttgcacgg tttgatgcac tgcggggaac cggtgcagga aacgttgatc ggaacaccgg 120 aaccaccacc accgga 136 <210> 726 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-82] <400> 726 tggttccggt ggtggtggtt ccggtgttat catcaacgtt aaatgcaaaa tctcccgtca 60 gtgcctggaa ccgtgcaaaa aag 83 <210> 727 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-83] <400> 727 ctggtatgcg tttcggtaaa tgcatgaacg gtaaatgcca ctgcaccccg aaa 53 <210> 728 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-84] <400> 728 cttatttcgg ggtgcagtgg catttaccgt tcatgcattt accgaaacgc ataccagctt 60 ttttgcacgg ttccaggcac tga 83 <210> 729 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-85] <400> 729 cgggagattt tgcatttaac gttgatgata acaccggaac caccaccacc gga 53 <210> 730 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(136) <400> 730 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc ggt gtt atc atc aac gtt aaa tgc aaa 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys 1 5 10 15 atc tcc cgt cag tgc ctg gaa ccg tgc aaa aaa gct ggt atg cgt ttc 97 Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 ggt aaa tgc atg aac ggt aaa tgc cac tgc acc ccg aaa 136 Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 731 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 731 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys 1 5 10 15 Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 732 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 732 cttatttcgg ggtgcagtgg catttaccgt tcatgcattt accgaaacgc ataccagctt 60 ttttgcacgg ttccaggcac tgacgggaga ttttgcattt aacgttgatg ataacaccgg 120 aaccaccacc accgga 136 <210> 733 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-86] <400> 733 tggttccggt ggtggtggtt ccggtgttat catcaacgtt aaatgcaaaa tctcccgtca 60 gtgcctgaaa ccgtgcaaag acg 83 <210> 734 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-83] <400> 734 ctggtatgcg tttcggtaaa tgcatgaacg gtaaatgcca ctgcaccccg aaa 53 <210> 735 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-87] <400> 735 cttatttcgg ggtgcagtgg catttaccgt tcatgcattt accgaaacgc ataccagcgt 60 ctttgcacgg tttcaggcac tga 83 <210> 736 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-85] <400> 736 cgggagattt tgcatttaac gttgatgata acaccggaac caccaccacc gga 53 <210> 737 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA strand in position 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(136) <400> 737 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc ggt gtt atc atc aac gtt aaa tgc aaa 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys 1 5 10 15 atc tcc cgt cag tgc ctg aaa ccg tgc aaa gac gct ggt atg cgt ttc 97 Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 ggt aaa tgc atg aac ggt aaa tgc cac tgc acc ccg aaa 136 Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 738 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 738 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys 1 5 10 15 Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe 20 25 30 Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 739 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 739 cttatttcgg ggtgcagtgg catttaccgt tcatgcattt accgaaacgc ataccagcgt 60 ctttgcacgg tttcaggcac tgacgggaga ttttgcattt aacgttgatg ataacaccgg 120 aaccaccacc accgga 136 <210> 740 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-88] <400> 740 tggttccggt ggtggtggtt ccaaagaatg caccggtccg cagcactgca ccaacttctg 60 ccgtaaaaac aaatgcaccc acg 83 <210> 741 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-89] <400> 741 gtaaatgcat gaaccgtaaa tgcaaatgct tcaactgcaa a 41 <210> 742 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-90] <400> 742 cttatttgca gttgaagcat ttgcatttac ggttcatgca tttaccgtgg gtgcatttgt 60 ttttacggca gaagttggtg cag 83 <210> 743 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-91] <400> 743 tgctgcggac cggtgcattc tttggaacca ccaccaccgg a 41 <210> 744 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(124) <400> 744 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc aaa gaa tgc acc ggt ccg cag cac tgc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Glu Cys Thr Gly Pro Gln His Cys 1 5 10 15 acc aac ttc tgc cgt aaa aac aaa tgc acc cac ggt aaa tgc atg aac 97 Thr Asn Phe Cys Arg Lys Asn Lys Cys Thr His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 cgt aaa tgc aaa tgc ttc aac tgc aaa 124 Arg Lys Cys Lys Cys Phe Asn Cys Lys 35 40 <210> 745 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 745 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Glu Cys Thr Gly Pro Gln His Cys 1 5 10 15 Thr Asn Phe Cys Arg Lys Asn Lys Cys Thr His Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Arg Lys Cys Lys Cys Phe Asn Cys Lys 35 40 <210> 746 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4 <400> 746 cttatttgca gttgaagcat ttgcatttac ggttcatgca tttaccgtgg gtgcatttgt 60 ttttacggca gaagttggtg cagtgctgcg gaccggtgca ttctttggaa ccaccaccac 120 cgga 124 <210> 747 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-92] <400> 747 tggttccggt ggtggtggtt ccaccatcat caacgttaaa tgcacctccc cgaaacagtg 60 ctccaaaccg tgcaaagaac tgt 83 <210> 748 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-93] <400> 748 acggttcctc cgctggtgct aaatgcatga acggtaaatg caaatgctac aacaac 56 <210> 749 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-94] <400> 749 cttagttgtt gtagcatttg catttaccgt tcatgcattt agcaccagcg gaggaaccgt 60 acagttcttt gcacggtttg gag 83 <210> 750 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-95] <400> 750 cactgtttcg gggaggtgca tttaacgttg atgatggtgg aaccaccacc accgga 56 <210> 751 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(139) <400> 751 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc acc atc atc aac gtt aaa tgc acc tcc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser 1 5 10 15 ccg aaa cag tgc tcc aaa ccg tgc aaa gaa ctg tac ggt tcc tcc gct 97 Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala 20 25 30 ggt gct aaa tgc atg aac ggt aaa tgc aaa tgc tac aac aac 139 Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 40 45 <210> 752 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 752 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gln Cys Ser Lys Pro Cys Lys Glu Leu Tyr Gly Ser Ser Ala 20 25 30 Gly Ala Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys Lys Cys Tyr Asn Asn 35 40 45 <210> 753 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 753 cttagttgtt gtagcatttg catttaccgt tcatgcattt agcaccagcg gaggaaccgt 60 acagttcttt gcacggtttg gagcactgtt tcggggaggt gcatttaacg ttgatgatgg 120 tggaaccacc accaccgga 139 <210> 754 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-81] <400> 754 tggttccggt ggtggtggtt ccaccatctc ctgcaccaac ccg 43 <210> 755 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-82] <400> 755 aaacagtgct acccgcactg caaaaaagaa accggttacc cgaacgctaa atgcatgaac 60 cgtaaatgca aatgcttcgg tcgt 84 <210> 756 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-83] <400> 756 cttaacgacc gaagcatttg catttacggt tcatgcattt agcg 44 <210> 757 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 757 ttcgggtaac cggtttcttt tttgcagtgc gggtagcact gtttcgggtt ggtgcaggag 60 atggtggaac caccaccacc gga 83 <210> 758 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in postions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 758 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc acc atc tcc tgc acc aac ccg aaa cag 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln 1 5 10 15 tgc tac ccg cac tgc aaa aaa gaa acc ggt tac ccg aac gct aaa tgc 97 Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys 20 25 30 atg aac cgt aaa tgc aaa tgc ttc ggt cgt 127 Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Phe Gly Arg 35 40 <210> 759 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 759 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ile Ser Cys Thr Asn Pro Lys Gln 1 5 10 15 Cys Tyr Pro His Cys Lys Lys Glu Thr Gly Tyr Pro Asn Ala Lys Cys 20 25 30 Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Phe Gly Arg 35 40 <210> 760 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 760 cttaacgacc gaagcatttg catttacggt tcatgcattt agcgttcggg taaccggttt 60 cttttttgca gtgcgggtag cactgtttcg ggttggtgca ggagatggtg gaaccaccac 120 caccgga 127 <210> 761 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide [4154-96] <400> 761 tatgcgttct tgtattgata ctattccaaa atctcgttgt actgcttttc aatgtaaaca 60 ttctatgaaa tatcgtcttt ctt 83 <210> 762 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo nucleotide [4154-97] <400> 762 tttgtcgtaa aacttgtggt acttgttctg gtggtggtgg ttct 44 <210> 763 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 763 caccagaacc accaccacca gaacaagtac cacaagtttt acgacaaaaa gaaagacgat 60 atttcataga atgtttacat tga 83 <210> 764 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-99] <400> 764 aaagcagtac aacgagattt tggaatagta tcaatacaag aacg 44 <210> 765 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 765 t atg cgt tct tgt att gat act att cca aaa tct cgt tgt act gct ttt 49 Met Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 caa tgt aaa cat tct atg aaa tat cgt ctt tct ttt tgt cgt aaa act 97 Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 tgt ggt act tgt tct ggt ggt ggt ggt tct 127 Cys Gly Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 766 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 766 Met Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 Cys Gly Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 767 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 767 caccagaacc accaccacca gaacaagtac cacaagtttt acgacaaaaa gaaagacgat 60 atttcataga atgtttacat tgaaaagcag tacaacgaga ttttggaata gtatcaatac 120 aagaacg 127 <210> 768 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4155-01] <400> 768 tatgtcttgt attgatacta ttccaaaatc tcgttgtact gcttttcaat gtaaacattc 60 tatgaaatat cgtctttctt 80 <210> 769 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-97] <400> 769 tttgtcgtaa aacttgtggt acttgttctg gtggtggtgg ttct 44 <210> 770 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4154-98] <400> 770 caccagaacc accaccacca gaacaagtac cacaagtttt acgacaaaaa gaaagacgat 60 atttcataga atgtttacat tga 83 <210> 771 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4155-02] <400> 771 aaagcagtac aacgagattt tggaatagta tcaatacaag a 41 <210> 772 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(124) <400> 772 t atg tct tgt att gat act att cca aaa tct cgt tgt act gct ttt caa 49 Met Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 tgt aaa cat tct atg aaa tat cgt ctt tct ttt tgt cgt aaa act tgt 97 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 ggt act tgt tct ggt ggt ggt ggt tct 124 Gly Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 773 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 773 Met Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 774 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 774 caccagaacc accaccacca gaacaagtac cacaagtttt acgacaaaaa gaaagacgat 60 atttcataga atgtttacat tgaaaagcag tacaacgaga ttttggaata gtatcaatac 120 aaga 124 <210> 775 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-69] <400> 775 tggttccggt ggtggtggtt cccagttcac caacgtt 37 <210> 776 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-70] <400> 776 tcctgcacca cctccaaaga atgctggtcc gtttgccagc gtctgcacaa cacctcccgt 60 ggtaaatgca tgaacaaaaa atgccgttgc tactcc 96 <210> 777 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-71] <400> 777 cttaggagta gcaacggcat tttttgttca tgcattta 38 <210> 778 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-72] <400> 778 ccacgggagg tgttgtgcag acgctggcaa acggaccagc attctttgga ggtggtgcag 60 gaaacgttgg tgaactggga accaccacca ccgga 95 <210> 779 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(133) <400> 779 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc cag ttc acc aac gtt tcc tgc acc acc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr 1 5 10 15 tcc aaa gaa tgc tgg tcc gtt tgc cag cgt ctg cac aac acc tcc cgt 97 Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg 20 25 30 ggt aaa tgc atg aac aaa aaa tgc cgt tgc tac tcc 133 Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Ser 35 40 <210> 780 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 780 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg 20 25 30 Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Ser 35 40 <210> 781 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 781 cttaggagta gcaacggcat tttttgttca tgcatttacc acgggaggtg ttgtgcagac 60 gctggcaaac ggaccagcat tctttggagg tggtgcagga aacgttggtg aactgggaac 120 caccaccacc gga 133 <210> 782 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-65] <400> 782 tggttccggt ggtggtggtt ccgtttcctg caccggt 37 <210> 783 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-66] <400> 783 tccaaagact gctacgctcc gtgccgtaaa cagaccggtt gcccgaacgc taaatgcatc 60 aacaaatcct gcaaatgcta cggttgc 87 <210> 784 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-67] <400> 784 cttagcaacc gtagcatttg caggatttgt tgatgcat 38 <210> 785 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-68] <400> 785 ttagcgttcg ggcaaccggt ctgtttacgg cacggagcgt agcagtcttt ggaaccggtg 60 caggaaacgg aaccaccacc accgga 86 <210> 786 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(124) <400> 786 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc gtt tcc tgc acc ggt tcc aaa gac tgc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys 1 5 10 15 tac gct ccg tgc cgt aaa cag acc ggt tgc ccg aac gct aaa tgc atc 97 Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile 20 25 30 aac aaa tcc tgc aaa tgc tac ggt tgc 124 Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr Gly Cys 35 40 <210> 787 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 787 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Cys Thr Gly Ser Lys Asp Cys 1 5 10 15 Tyr Ala Pro Cys Arg Lys Gln Thr Gly Cys Pro Asn Ala Lys Cys Ile 20 25 30 Asn Lys Ser Cys Lys Cys Tyr Gly Cys 35 40 <210> 788 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 788 cttagcaacc gtagcatttg caggatttgt tgatgcattt agcgttcggg caaccggtct 60 gtttacggca cggagcgtag cagtctttgg aaccggtgca ggaaacggaa ccaccaccac 120 cgga 124 <210> 789 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-73] <400> 789 tggttccggt ggtggtggtt cccagttcac caacgtttcc tg 42 <210> 790 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-74] <400> 790 caccacctcc aaagaatgct ggtccgtttg ccagcgtctg cacaacacct cccgtggtaa 60 atgcatgaac aaagaatgcc gttgctactc c 91 <210> 791 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-75] <400> 791 cttaggagta gcaacggcat tctttgttca tgcatttacc acg 43 <210> 792 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-76] <400> 792 ggaggtgttg tgcagacgct ggcaaacgga ccagcattct ttggaggtgg tgcaggaaac 60 gttggtgaac tgggaaccac caccaccgga 90 <210> 793 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(133) <400> 793 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc cag ttc acc aac gtt tcc tgc acc acc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr 1 5 10 15 tcc aaa gaa tgc tgg tcc gtt tgc cag cgt ctg cac aac acc tcc cgt 97 Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg 20 25 30 ggt aaa tgc atg aac aaa gaa tgc cgt tgc tac tcc 133 Gly Lys Cys Met Asn Lys Glu Cys Arg Cys Tyr Ser 35 40 <210> 794 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 794 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr 1 5 10 15 Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg 20 25 30 Gly Lys Cys Met Asn Lys Glu Cys Arg Cys Tyr Ser 35 40 <210> 795 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 795 cttaggagta gcaacggcat tctttgttca tgcatttacc acgggaggtg ttgtgcagac 60 gctggcaaac ggaccagcat tctttggagg tggtgcagga aacgttggtg aactgggaac 120 caccaccacc gga 133 <210> 796 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-63] <400> 796 tggttccggt ggtggtggtt cctgcaactg caaagctccg gaaaccgctc tgtgcgctcg 60 tcgttgccag cagcacggt 79 <210> 797 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-64] <400> 797 cttaaccgtg ctgctggcaa cgacgagcgc acagagcggt ttccggagct ttgcagttgc 60 aggaaccacc accaccgga 79 <210> 798 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(79) <400> 798 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tgc aac tgc aaa gct ccg gaa acc gct 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala 1 5 10 15 ctg tgc gct cgt cgt tgc cag cag cac ggt 79 Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln Gln His Gly 20 25 <210> 799 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 799 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln Gln His Gly 20 25 <210> 800 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 800 cttaaccgtg ctgctggcaa cgacgagcgc acagagcggt ttccggagct ttgcagttgc 60 aggaaccacc accaccgga 79 <210> 801 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-18] <400> 801 tggttccggt ggtggtggtt ccgctttctg caacctgcg 39 <210> 802 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-19] <400> 802 tatgtgccag ctgtcctgcc gttccctggg tctgctgggt aaatgcatcg gtgacaaatg 60 cgaatgcgtt aaacac 76 <210> 803 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-20] <400> 803 cttagtgttt aacgcattcg catttgtcac cgatgcattt 40 <210> 804 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-21] <400> 804 acccagcaga cccagggaac ggcaggacag ctggcacata cgcaggttgc agaaagcgga 60 accaccacca ccgga 75 <210> 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<400> 807 cttagtgttt aacgcattcg catttgtcac cgatgcattt acccagcaga cccagggaac 60 ggcaggacag ctggcacata cgcaggttgc agaaagcgga accaccacca ccgga 115 <210> 808 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4194-44] <400> 808 tggttccggt ggtggtggtt cccagttcac cgacgttgac tgctccgt 48 <210> 809 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4194-45] <400> 809 ttccaaagaa tgctggtccg tttgcaaaga cctgttcggt gttgaccgtg gtaaatgcat 60 gggtaaaaaa tgccgttgct accag 85 <210> 810 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4194-46] <400> 810 cttactggta gcaacggcat tttttaccca tgcatttacc acggtcaa 48 <210> 811 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4194-47] <400> 811 caccgaacag gtctttgcaa acggaccagc attctttgga aacggagcag tcaacgtcgg 60 tgaactggga accaccacca ccgga 85 <210> 812 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(133) <400> 812 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc cag ttc acc gac gtt gac tgc tcc gtt 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val 1 5 10 15 tcc aaa gaa tgc tgg tcc gtt tgc aaa gac ctg ttc ggt gtt gac cgt 97 Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg 20 25 30 ggt aaa tgc atg ggt aaa aaa tgc cgt tgc tac cag 133 Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Gln 35 40 <210> 813 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 813 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Thr Asp Val Asp Cys Ser Val 1 5 10 15 Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Lys Asp Leu Phe Gly Val Asp Arg 20 25 30 Gly Lys Cys Met Gly Lys Lys Cys Arg Cys Tyr Gln 35 40 <210> 814 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 814 cttactggta gcaacggcat tttttaccca tgcatttacc acggtcaaca ccgaacaggt 60 ctttgcaaac ggaccagcat tctttggaaa cggagcagtc aacgtcggtg aactgggaac 120 caccaccacc gga 133 <210> 815 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-06] <400> 815 tggttccggt ggtggtggtt ccgaatgccg ttacctgttc ggtggttg 48 <210> 816 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-07] <400> 816 caaaaccacc tccgactgct gcaaacacct gggttgcaaa ttccgtgaca aatactgcgc 60 ttgggacttc accttctcc 79 <210> 817 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-08] <400> 817 cttaggagaa ggtgaagtcc caagcgcagt atttgtcacg gaatttgc 48 <210> 818 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-09] <400> 818 aacccaggtg tttgcagcag tcggaggtgg ttttgcaacc accgaacagg taacggcatt 60 cggaaccacc accaccgga 79 <210> 819 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 819 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc gaa tgc cgt tac ctg ttc ggt ggt tgc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys 1 5 10 15 aaa acc acc tcc gac tgc tgc aaa cac ctg ggt tgc aaa ttc cgt gac 97 Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp 20 25 30 aaa tac tgc gct tgg gac ttc acc ttc tcc 127 Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe Thr Phe Ser 35 40 <210> 820 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 820 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Arg Tyr Leu Phe Gly Gly Cys 1 5 10 15 Lys Thr Thr Ser Asp Cys Cys Lys His Leu Gly Cys Lys Phe Arg Asp 20 25 30 Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Phe Thr Phe Ser 35 40 <210> 821 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 821 cttaggagaa ggtgaagtcc caagcgcagt atttgtcacg gaatttgcaa cccaggtgtt 60 tgcagcagtc ggaggtggtt ttgcaaccac cgaacaggta acggcattcg gaaccaccac 120 caccgga 127 <210> 822 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-14] <400> 822 tggttccggt ggtggtggtt cctactgcca gaaatgga 38 <210> 823 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-15] <400> 823 tgtggacctg cgacgaagaa cgtaaatgct gcgaaggtct ggtttgccgt ctgtggtgca 60 aacgtatcat caacatg 77 <210> 824 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-16] <400> 824 cttacatgtt gatgatacgt ttgcaccaca gacggcaaa 39 <210> 825 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-17] <400> 825 ccagaccttc gcagcattta cgttcttcgt cgcaggtcca catccatttc tggcagtagg 60 aaccaccacc accgga 76 <210> 826 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(115) <400> 826 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tac tgc cag aaa tgg atg tgg acc tgc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys 1 5 10 15 gac gaa gaa cgt aaa tgc tgc gaa ggt ctg gtt tgc cgt ctg tgg tgc 97 Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys 20 25 30 aaa cgt atc atc aac atg 115 Lys Arg Ile Ile Asn Met 35 <210> 827 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 827 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys 1 5 10 15 Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys 20 25 30 Lys Arg Ile Ile Asn Met 35 <210> 828 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 828 cttacatgtt gatgatacgt ttgcaccaca gacggcaaac cagaccttcg cagcatttac 60 gttcttcgtc gcaggtccac atccatttct ggcagtagga accaccacca ccgga 115 <210> 829 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-93] <400> 829 tggttccggt ggtggtggtt cctgcaaatc cccgggtt 38 <210> 830 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-94] <400> 830 cctcctgctc cccgacctcc tacaactgct gccgttcctg caacccgtac accaaacgtt 60 gctacggt 68 <210> 831 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-95] <400> 831 cttaaccgta gcaacgtttg gtgtacgggt tgcaggaa 38 <210> 832 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-96] <400> 832 cggcagcagt tgtaggaggt cggggagcag gaggaacccg gggatttgca ggaaccacca 60 ccaccgga 68 <210> 833 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(106) <400> 833 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tgc aaa tcc ccg ggt tcc tcc tgc tcc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser 1 5 10 15 ccg acc tcc tac aac tgc tgc cgt tcc tgc aac ccg tac acc aaa cgt 97 Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg 20 25 30 tgc tac ggt 106 Cys Tyr Gly 35 <210> 834 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 834 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Lys Ser Pro Gly Ser Ser Cys Ser 1 5 10 15 Pro Thr Ser Tyr Asn Cys Cys Arg Ser Cys Asn Pro Tyr Thr Lys Arg 20 25 30 Cys Tyr Gly 35 <210> 835 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 835 cttaaccgta gcaacgtttg gtgtacgggt tgcaggaacg gcagcagttg taggaggtcg 60 gggagcagga ggaacccggg gatttgcagg aaccaccacc accgga 106 <210> 836 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-02] <400> 836 tggttccggt ggtggtggtt cctgcaaagg taaa 34 <210> 837 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-03] <400> 837 ggtgctaaat gctcccgtct gatgtacgac tgctgcaccg gttcctgccg ttccggtaaa 60 tgcggt 66 <210> 838 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-04] <400> 838 cttaaccgca tttaccggaa cggcaggaac cggt 34 <210> 839 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-05] <400> 839 gcagcagtcg tacatcagac gggagcattt agcaccttta cctttgcagg aaccaccacc 60 accgga 66 <210> 840 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(100) <400> 840 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc tgc aaa ggt aaa ggt gct aaa tgc tcc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser 1 5 10 15 cgt ctg atg tac gac tgc tgc acc ggt tcc tgc cgt tcc ggt aaa tgc 97 Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 30 ggt 100 Gly <210> 841 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 841 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser 1 5 10 15 Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys 20 25 30 Gly <210> 842 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 842 cttaaccgca tttaccggaa cggcaggaac cggtgcagca gtcgtacatc agacgggagc 60 atttagcacc tttacctttg caggaaccac caccaccgga 100 <210> 843 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-97] <400> 843 tggttccggt ggtggtggtt ccgctgaaaa agactgcatc 40 <210> 844 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-98] <400> 844 gctccgggtg ctccgtgctt cggtaccgac aaaccgtgct gcaacccgcg tgcttggtgc 60 tcctcctacg ctaacaaatg cctg 84 <210> 845 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4128-99] <400> 845 cttacaggca tttgttagcg taggaggagc accaagcacg 40 <210> 846 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-01] <400> 846 cgggttgcag cacggtttgt cggtaccgaa gcacggagca cccggagcga tgcagtcttt 60 ttcagcggaa ccaccaccac cgga 84 <210> 847 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(124) <400> 847 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc gct gaa aaa gac tgc atc gct ccg ggt 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly 1 5 10 15 gct ccg tgc ttc ggt acc gac aaa ccg tgc tgc aac ccg cgt gct tgg 97 Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp 20 25 30 tgc tcc tcc tac gct aac aaa tgc ctg 124 Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys Cys Leu 35 40 <210> 848 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 848 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Cys Ile Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Cys Phe Gly Thr Asp Lys Pro Cys Cys Asn Pro Arg Ala Trp 20 25 30 Cys Ser Ser Tyr Ala Asn Lys Cys Leu 35 40 <210> 849 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 849 cttacaggca tttgttagcg taggaggagc accaagcacg cgggttgcag cacggtttgt 60 cggtaccgaa gcacggagca cccggagcga tgcagtcttt ttcagcggaa ccaccaccac 120 cgga 124 <210> 850 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-22] <400> 850 tggttccggt ggtggtggtt ccgaatgccg ttactggctg g 41 <210> 851 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-23] <400> 851 gtggttgctc cgctggtcag acctgctgca aacacctggt ttgctcccgt cgtcacggtt 60 ggtgcgtttg ggacggtacc ttctcc 86 <210> 852 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-24] <400> 852 cttaggagaa ggtaccgtcc caaacgcacc aaccgtgacg a 41 <210> 853 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-25] <400> 853 cgggagcaaa ccaggtgttt gcagcaggtc tgaccagcgg agcaaccacc cagccagtaa 60 cggcattcgg aaccaccacc accgga 86 <210> 854 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 854 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc gaa tgc cgt tac tgg ctg ggt ggt tgc 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys 1 5 10 15 tcc gct ggt cag acc tgc tgc aaa cac ctg gtt tgc tcc cgt cgt cac 97 Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys Lys His Leu Val Cys Ser Arg Arg His 20 25 30 ggt tgg tgc gtt tgg gac ggt acc ttc tcc 127 Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly Thr Phe Ser 35 40 <210> 855 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 855 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys Lys His Leu Val Cys Ser Arg Arg His 20 25 30 Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly Thr Phe Ser 35 40 <210> 856 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4 <400> 856 cttaggagaa ggtaccgtcc caaacgcacc aaccgtgacg acgggagcaa accaggtgtt 60 tgcagcaggt ctgaccagcg gagcaaccac ccagccagta acggcattcg gaaccaccac 120 caccgga 127 <210> 857 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-10] <400> 857 tggttccggt ggtggtggtt cccgtccgac cgacatcaaa tg 42 <210> 858 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-11] <400> 858 ctccgaatcc taccagtgct tcccggtttg caaatcccgt ttcggtaaaa ccaacggtcg 60 ttgcgttaac ggtttctgcg actgcttc 88 <210> 859 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-12] <400> 859 cttagaagca gtcgcagaaa ccgttaacgc aacgaccgtt gg 42 <210> 860 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-13] <400> 860 ttttaccgaa acgggatttg caaaccggga agcactggta ggattcggag catttgatgt 60 cggtcggacg ggaaccacca ccaccgga 88 <210> 861 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(130) <400> 861 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc cgt ccg acc gac atc aaa tgc tcc gaa 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu 1 5 10 15 tcc tac cag tgc ttc ccg gtt tgc aaa tcc cgt ttc ggt aaa acc aac 97 Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn 20 25 30 ggt cgt tgc gtt aac ggt ttc tgc gac tgc ttc 130 Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe Cys Asp Cys Phe 35 40 <210> 862 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 862 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Thr Asp Ile Lys Cys Ser Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Gln Cys Phe Pro Val Cys Lys Ser Arg Phe Gly Lys Thr Asn 20 25 30 Gly Arg Cys Val Asn Gly Phe Cys Asp Cys Phe 35 40 <210> 863 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 863 cttagaagca gtcgcagaaa ccgttaacgc aacgaccgtt ggttttaccg aaacgggatt 60 tgcaaaccgg gaagcactgg taggattcgg agcatttgat gtcggtcgga cgggaaccac 120 caccaccgga 130 <210> 864 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-26] <400> 864 tggttccggt ggtggtggtt ccatgtgcat gccgtgcttc ac 42 <210> 865 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-27] <400> 865 caccgaccac cagatggctc gtaaatgcga cgactgctgc ggtggtaaag gtcgtggtaa 60 atgctacggt ccgcagtgcc tgtgccgt 88 <210> 866 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-28] <400> 866 cttaacggca caggcactgc ggaccgtagc atttaccacg ac 42 <210> 867 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex [4129-29] <400> 867 ctttaccacc gcagcagtcg tcgcatttac gagccatctg gtggtcggtg gtgaagcacg 60 gcatgcacat ggaaccacca ccaccgga 88 <210> 868 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(130) <400> 868 t ggt tcc ggt ggt ggt ggt tcc atg tgc atg ccg tgc ttc acc acc gac 49 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp 1 5 10 15 cac cag atg gct cgt aaa tgc gac gac tgc tgc ggt ggt aaa ggt cgt 97 His Gln Met Ala Arg Lys Cys Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg 20 25 30 ggt aaa tgc tac ggt ccg cag tgc ctg tgc cgt 130 Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln Cys Leu Cys Arg 35 40 <210> 869 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 869 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp 1 5 10 15 His Gln Met Ala Arg Lys Cys Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg 20 25 30 Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln Cys Leu Cys Arg 35 40 <210> 870 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 870 caccacggca caggcactgc ggaccgtagc atttaccacg acctttacca ccgcagcagt 60 cgtcgcattt acgagccatc tggtggtcgg tggtgaagca cggcatgcac atggaaccac 120 caccaccgga 130 <210> 871 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CoTx2 <400> 871 Val Ala Cys Val Tyr Arg Thr Cys Asp Lys Asp Cys Thr Ser Arg Lys 1 5 10 15 Tyr Arg Ser Gly Lys Cys Ile Asn Asn Ala Cys Lys Cys Tyr Pro Tyr 20 25 30 <210> 872 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-NotI fragment containing partial linker sequence and SmIIIA peptide. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> BamHI site <220> <221> CDS <222> (22)..(81) <220> <221> misc_feature <222> (85)..(92) <223> NotI site <400> 872 ggatccggag gaggaggaag c tgc tgc aac ggc cgc cgc ggc tgc agc agc 51 Cys Cys Asn Gly Arg Arg Gly Cys Ser Ser 1 5 10 cgc tgg tgc cgc gac cac agc cgc tgc tgc tgagcggccg c 92 Arg Trp Cys Arg Asp His Ser Arg Cys Cys 15 20 <210> 873 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 873 Cys Cys Asn Gly Arg Arg Gly Cys Ser Ser Arg Trp Cys Arg Asp His 1 5 10 15 Ser Arg Cys Cys 20 <210> 874 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence [3654-50] <400> 874 ggaggaggat ccggaggagg aggaagctgc tgcaacggcc gccgcggctg cagcagccgc 60 <210> 875 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence [3654-51] <400> 875 attattgcgg ccgctcagca gcagcggctg tggtcgcggc accagcggct gctgcagccg 60 c 61 <210> 876 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 - Primer Sequence [4210-35] <400> 876 catggatccg gaggaggagg aagcggcgtg atcatcaacg tgaagtgcaa gatcagccgc 60 cagtgcctgg agccctgcaa gaaggccg 88 <210> 877 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1 - Primer Sequence [4210-36] <400> 877 catgcggccg cttactactt gggggtgcag tggcacttgc cgttcatgca cttgccgaag 60 cgcatgccgg ccttcttgca gggctcca 88 <210> 878 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1[K7S] - Primer Sequence [4210-37] <400> 878 catggatccg gaggaggagg aagcggcgtg atcatcaacg tgagctgcaa gatcagccgc 60 cagtgcctgg agccctgcaa gaaggccg 88 <210> 879 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1[K7S] - Primer Sequence [4210-36] <400> 879 catgcggccg cttactactt gggggtgcag tggcacttgc cgttcatgca cttgccgaag 60 cgcatgccgg ccttcttgca gggctcca 88 <210> 880 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1[E16K,K20D] - Primer Sequence [4210-38] <400> 880 catggatccg gaggaggagg aagcggcgtg atcatcaacg tgaagtgcaa gatcagccgc 60 cagtgcctga agccctgcaa ggacgccg 88 <210> 881 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1[E16K,K20D] - Primer Sequence [4210-39] <400> 881 catgcggccg cttactactt gggggtgcag tggcacttgc cgttcatgca cttgccgaag 60 cgcatgccgg cgtccttgca gggcttca 88 <210> 882 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1[K7S,E16K,K20D] - Primer Sequence [4210-40] <400> 882 catggatccg gaggaggagg aagcggcgtg atcatcaacg tgagctgcaa gatcagccgc 60 cagtgcctga agccctgcaa ggacgccg 88 <210> 883 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1[K7S,E16K,K20D] - Primer Sequence [4210-39] <400> 883 catgcggccg cttactactt gggggtgcag tggcacttgc cgttcatgca cttgccgaag 60 cgcatgccgg cgtccttgca gggcttca 88 <210> 884 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shk Peptide Sequence - ShK-A9/A22 <400> 884 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Ala Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 885 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shk Peptide Sequence - ShK-A9/A22 d1 <400> 885 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Ala Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 886 <211> 35 <212> 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Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 890 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shk Peptide Sequence - ShK-E9/A22 <400> 890 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Glu Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 891 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shk Peptide Sequence - ShK-E9/A22 d1 <400> 891 Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Glu Ser Arg Cys Thr Ala Phe Gln Cys 1 5 10 15 Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys Gly 20 25 30 Thr Cys <210> 892 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shk Peptide Sequence - ShK-A11/A22 <400> 892 Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Ala Cys Thr Ala Phe Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Ala Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr Cys 20 25 30 Gly Thr Cys 35 <210> 893 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shk Peptide Sequence - ShK-A11/A22 d1 <400> 893 Ser Cys Ile Asp 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Fc-L10-OSK1 <220> <221> CDS <222> (1)..(888) <400> 951 atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ttc ctg tca gta acg act ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tcc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 96 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 144 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 192 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 240 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 288 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 336 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 384 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 432 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 528 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 576 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 624 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 195 200 205 ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 672 Leu Thr Val Asp 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 954 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 145 150 155 160 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 165 170 175 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 180 185 190 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 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Lys Asp 35 40 45 acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 192 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 240 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 288 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 336 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 384 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 432 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 130 135 140 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 480 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 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Ser Arg Gln Cys Leu Lys 260 265 270 ccc tgc aag gac gcc ggc atg cgc ttc ggc aag tgc atg aac ggc aag 864 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 275 280 285 tgc cac tgc acc ccc aag tag taa 888 Cys His Cys Thr Pro Lys 290 <210> 956 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 956 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 20 25 30 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 35 40 45 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 50 55 60 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 65 70 75 80 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 85 90 95 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 100 105 110 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 115 120 125 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 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Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 992 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,D20,Y36 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 992 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 993 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,D20,Y36 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 993 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 994 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,A34,Y36 <400> 994 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 995 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,G34,Y36 <400> 995 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Gly Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 996 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,A34,F36 <400> 996 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Phe Pro Lys 35 <210> 997 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,A34,W36 <400> 997 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Trp Pro Lys 35 <210> 998 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,E20,A34,Y36 <400> 998 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 999 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 999 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1000 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1000 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1001 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1001 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1002 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1002 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1003 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1003 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1004 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1004 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Arg Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn 20 25 30 Gly Lys Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 40 <210> 1005 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1005 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1006 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-O16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1006 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1007 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hLys 16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1007 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1008 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hArg 16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1008 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1009 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Cit 16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1009 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1010 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hCit 16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1010 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1011 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dpr 16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1011 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1012 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dab 16,D20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1012 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1013 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-O16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1013 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1014 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hLys 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1014 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1015 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hArg 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1015 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1016 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Cit 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1016 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1017 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hCit 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1017 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1018 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dpr 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1018 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1019 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dab 16,D20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1019 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1020 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,G34,Y36,G37,G38 <400> 1020 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Gly Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1021 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,D20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1021 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1022 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,D20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1022 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1023 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,D20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1023 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1024 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,D20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1024 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1025 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,D20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1025 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1026 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,D20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1026 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1027 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,A34,Y36,G37,G38 <400> 1027 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1028 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,D20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1028 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1029 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1029 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1030 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1030 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1031 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1031 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1032 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,D20,A34,Y3,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1032 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1033 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1033 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1034 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1034 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1035 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta38, OSK1-K16,D20,A34,Y36,G37 <400> 1035 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly 35 <210> 1036 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,D20,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1036 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1037 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,D20,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1037 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1038 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,D20,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1038 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1039 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,D20,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1039 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1040 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,D20,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1040 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1041 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,D20,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1041 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1042 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,D20,A34,F36,G37,G38 <400> 1042 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Phe Gly Gly 35 <210> 1043 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1043 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1044 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1044 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1045 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1045 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1046 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1046 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1047 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1047 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1048 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1048 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1049 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,D20,A34,G36-38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1049 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1050 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta38, OSK1-K16,D20,A34,G36-37 <400> 1050 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly 35 <210> 1051 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta38, OSK1-K16,D20,A35,Y36,G37 <400> 1051 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly 35 <210> 1052 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta38, OSK1-O16,D20,A35,Y36,G37 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1052 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly 35 <210> 1053 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1053 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1054 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1054 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1055 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1055 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1056 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1056 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1057 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1057 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 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Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 1064 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,Y36 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1064 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 1065 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,E20,Y36 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1065 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 1066 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1066 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1067 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1067 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1068 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1068 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1069 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1069 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1070 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1070 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1071 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1071 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1072 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1072 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro Lys 35 <210> 1073 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-O16,E20, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1073 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1074 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hLys 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <400> 1074 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1075 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hArg 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <400> 1075 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1076 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Cit 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1076 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1077 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hCit16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1077 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1078 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dpr 16,E20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1078 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser 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Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1082 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Cit 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <400> 1082 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1083 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-hCit 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <400> 1083 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys 35 <210> 1084 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dpr 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1084 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1085 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38, OSK1-Dab 16,E20,A34 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1085 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1086 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,E20,Y36,G37,G38 <400> 1086 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1087 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,E20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <400> 1087 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 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Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1094 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <400> 1094 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1095 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,E20,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <400> 1095 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1096 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta38, OSK1-K16,E20,A34,Y36,G37 <400> 1096 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly 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OSK1-hLys 16,E20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1221 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1222 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,E20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1222 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1223 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,E20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1223 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1224 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,E20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1224 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1225 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1225 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1226 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1226 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1227 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1227 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1228 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1228 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1229 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1229 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1230 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1230 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1231 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1231 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1232 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1- hCit 16,E20,A34,Y3,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1232 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1233 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1233 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1234 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,E20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1234 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1235 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,E20,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1235 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1236 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,E20,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1236 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1237 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,E20,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1237 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1238 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,E20,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1238 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1239 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hCit 16,E20,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1239 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1240 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1240 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1241 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-O16,E20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Ornithine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1241 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1242 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hLys 16,E20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homolysine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1242 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1243 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-hArg 16,E20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homoarginine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1243 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1244 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Cit 16,E20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Citrulline <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1244 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1245 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta38 OSK1-hCit 16,E20,A34-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Homocitrulline <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> AMIDATION <400> 1245 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Thr Pro 35 <210> 1246 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dpr 16,E20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,beta-diaminopropionoic acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1246 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1247 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-Dab 16,E20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Alpha,gamma-diaminobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1247 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Xaa 1 5 10 15 Pro Cys Lys Glu Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1248 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,CPA20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> p-carboxyl-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1248 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Xaa Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1249 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,CPA20,A34,G36-38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> p-carboxyl-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1249 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Xaa Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1250 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta37-38OSK1-K 16,CPA20,A34,Y36-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> p-carboxyl-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> AMIDATION <400> 1250 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Xaa Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr 35 <210> 1251 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-OSK1-K 16,D20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1251 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1252 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16, Aad20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Alpha-aminoadipic acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1252 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Xaa Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1253 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16, Aad20,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Alpha-aminoadipic acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1253 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Xaa Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1254 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16, Aad20,A34,Y36,G37,G38 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Alpha-aminoadipic acid <400> 1254 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Xaa Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1255 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1255 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1256 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <400> 1256 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1257 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta37-38-OSK1-H 16,D20,A34,Y36-amide <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> AMIDATION <400> 1257 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Tyr 35 <210> 1258 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1258 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1259 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34,Y36,G37,G38 <400> 1259 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1260 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34,Y36, <400> 1260 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Tyr Pro Lys 35 <210> 1261 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta36-38 OSK1-H 16,D20,A34,Y36, <400> 1261 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys 35 <210> 1262 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20,A34,1Nal36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Beta-(1-Naphthyl)-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1262 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1263 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20,A34,1Nal36-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Beta-(1-Naphthyl)-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1263 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Pro Lys 35 <210> 1264 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20,A34,2Nal36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Beta-(2-Naphthyl)-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1264 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1265 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20,A34,Cha36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Cyclohexylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1265 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1266 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20,A34, MePhe36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> 4-methyl-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1266 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1267 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20,A34, BiPhA36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Beta,beta-diphenyl-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1267 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1268 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20, Aib34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Alpha-amino-isobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1268 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Xaa Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1269 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K 16,D20, Abu34,Y36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Aminobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1269 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Xaa Cys Tyr Gly Gly 35 <210> 1270 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta37-38 OSK1-H 16,D20,A34,1Nal36, -amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Beta-(1-Naphthyl)-alanine <400> 1270 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa 35 <210> 1271 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34, 1Nal36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Beta-(1-Naphthyl)-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1271 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1272 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Delta37-38 OSK1-H 16,D20,A34, 4Bip 36,-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> 4-phenyl-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> AMIDATION <400> 1272 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa 35 <210> 1273 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-H 16,D20,A34, 4Bip 36,G37,G38-amide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> 4-phenyl-phenylalanine <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> AMIDATION <400> 1273 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Ala Cys Xaa Gly Gly 35 <210> 1274 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OSK1-K16,E20,G36-38 <400> 1274 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Gly Gly Gly 35 <210> 1275 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> �Aga-3 <400> 1275 Ala Asp Cys Val Gly Asp Gly Gln Arg Cys Ala Asp Trp Ala Gly Pro 1 5 10 15 Tyr Cys Cys Ser Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Ser Met Pro Tyr Cys 20 25 30 Arg Cys Arg Ser Asp Ser 35 <210> 1276 <211> 63 <212> PRT <213> Parabuthus transvaalicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Kurtoxin <400> 1276 Lys Ile Asp Gly Tyr Pro Val Asp Tyr Trp Asn Cys Lys Arg Ile Cys 1 5 10 15 Trp Tyr Asn Asn Lys Tyr Cys Asn Asp Leu Cys Lys Gly Leu Lys Ala 20 25 30 Asp Ser Gly Tyr Cys Trp Gly Trp Thr Leu Ser Cys Tyr Cys Gln Gly 35 40 45 Leu Pro Asp Asn Ala Arg Ile Lys Arg Ser Gly Arg Cys Arg Ala 50 55 60 <210> 1277 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tx-1 <400> 1277 Ala Glu Leu Thr Ser Cys Phe Pro Val Gly His Glu Cys Asp Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ser Asn Cys Asn Cys Cys Gly Asp Asp Val Tyr Cys Gly Cys Gly 20 25 30 Trp Gly Arg Trp Asn Cys Lys Cys Lys Val Ala Asp Gln Ser Tyr Ala 35 40 45 Tyr Gly Ile Cys Lys Asp Lys Val Asn Cys Pro Asn Arg His Leu Trp 50 55 60 Pro Ala Lys Val Cys Lys Lys Pro Cys Arg Arg Glu Cys 65 70 75 <210> 1278 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tx3-3 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1278 Gly Cys Ala Asn Ala Tyr Lys Ser Cys Asn Gly Pro His Thr Cys Cys 1 5 10 15 Trp Gly Tyr Asn Gly Tyr Lys Lys Ala Cys Ile Cys Ser Gly Xaa Asn 20 25 30 Trp Lys <210> 1279 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tx3-4 <400> 1279 Ser Cys Ile Asn Val Gly Asp Phe Cys Asp Gly Lys Lys Asp Cys Cys 1 5 10 15 Gln Cys Asp Arg Asp Asn Ala Phe Cys Ser Cys Ser Val Ile Phe Gly 20 25 30 Tyr Lys Thr Asn Cys Arg Cys Glu 35 40 <210> 1280 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> omega-PtXIIA <400> 1280 Ser Cys Ile Asn Val Gly Asp Phe Cys Asp Gly Lys Lys Asp Asp Cys 1 5 10 15 Gln Cys Cys Arg Asp Asn Ala Phe Cys Ser Cys Ser Val Ile Phe Gly 20 25 30 Tyr Lys Thr Asn Cys Arg Cys Glu Val Gly Thr Thr Ala Thr Ser Tyr 35 40 45 Gly Ile Cys Met Ala Lys His Lys Cys Gly Arg Gln Thr Thr Cys Thr 50 55 60 Lys Pro Cys Leu Ser Lys Arg Cys Lys Lys Asn His 65 70 75 <210> 1281 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dw13.3 <400> 1281 Ala Glu Cys Leu Met Ile Gly Asp Thr Ser Cys Val Pro Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Arg Cys Cys Tyr Gly Ala Trp Cys Tyr Cys Asp Gln Gln Leu Ser 20 25 30 Cys Arg Arg Val Gly Arg Lys Arg Glu Cys Gly Trp Val Glu Val Asn 35 40 45 Cys Lys Cys Gly Trp Ser Trp Ser Gln Arg Ile Asp Asp Trp Arg Ala 50 55 60 Asp Tyr Ser Cys Lys Cys Pro Glu Asp Gln 65 70 <210> 1282 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Agelenin <400> 1282 Gly Gly Cys Leu Pro His Asn Arg Phe Cys Asn Ala Leu Ser Gly Pro 1 5 10 15 Arg Cys Cys Ser Gly Leu Lys Cys Lys Glu Leu Ser Ile Trp Asp Ser 20 25 30 Arg Cys Leu 35 <210> 1283 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> omega-GTx-SIA <400> 1283 Asp Cys Val Arg Phe Trp Gly Lys Cys Ser Gln Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Pro His Leu Ala Cys Lys Ser Lys Trp Pro Arg Asn Ile Cys Val Trp 20 25 30 Asp Gly Ser Val 35 <210> 1284 <211> 31 <212> PRT <213> Conus pennaceus <220> <221> MISC_FEATURE <223> omega-conotoxin PnVIA <400> 1284 Gly Cys Leu Glu Val Asp Tyr Phe Cys Gly Ile Pro Phe Ala Asn Asn 1 5 10 15 Gly Leu Cys Cys Ser Gly Asn Cys Val Phe Val Cys Thr Pro Gln 20 25 30 <210> 1285 <211> 30 <212> PRT <213> Conus pennaceus <220> <221> MISC_FEATURE <223> omega-conotoxin PnVIB <400> 1285 Asp Asp Asp Cys Glu Pro Pro Gly Asn Phe Cys Gly Met Ile Lys Ile 1 5 10 15 Gly Pro Pro Cys Cys Ser Gly Trp Cys Phe Phe Ala Cys Ala 20 25 30 <210> 1286 <211> 11 <212> PRT <213> Conus marmoreus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Lambda-conotoxin CMrVIA <400> 1286 Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys 1 5 10 <210> 1287 <211> 61 <212> PRT <213> Conus marmoreus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Lambda-conotoxin CMrVIB <400> 1287 Met Arg Cys Leu Pro Val Leu Ile Ile Leu Leu Leu Leu Thr Ala Ser 1 5 10 15 Ala Pro Gly Val Val Val Leu Pro Lys Thr Glu Asp Asp Val Pro Met 20 25 30 Ser Ser Val Tyr Gly Asn Gly Lys Ser Ile Leu Arg Gly Ile Leu Arg 35 40 45 Asn Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys 50 55 60 <210> 1288 <211> 77 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <220> <221> MISC_FEATURE <223> Tx1 <400> 1288 Ala Glu Leu Thr Ser Cys Phe Pro Val Gly His Glu Cys Asp Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ser Asn Cys Asn Cys Cys Gly Asp Asp Val Tyr Cys Gly Cys Gly 20 25 30 Trp Gly Arg Trp Asn Cys Lys Cys Lys Val Ala Asp Gln Ser Tyr Ala 35 40 45 Tyr Gly Ile Cys Lys Asp Lys Val Asn Cys Pro Asn Arg His Leu Trp 50 55 60 Pro Ala Lys Val Cys Lys Lys Pro Cys Arg Arg Glu Cys 65 70 75 <210> 1289 <211> 34 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <220> <221> MISC_FEATURE <223> Tx3-3 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1289 Gly Cys Ala Asn Ala Tyr Lys Ser Cys Asn Gly Pro His Thr Cys Cys 1 5 10 15 Trp Gly Tyr Asn Gly Tyr Lys Lys Ala Cys Ile Cys Ser Gly Xaa Asn 20 25 30 Trp Lys <210> 1290 <211> 40 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <220> <221> MISC_FEATURE <223> Tx3-4 <400> 1290 Ser Cys Ile Asn Val Gly Asp Phe Cys Asp Gly Lys Lys Asp Cys Cys 1 5 10 15 Gln Cys Asp Arg Asp Asn Ala Phe Cys Ser Cys Ser Val Ile Phe Gly 20 25 30 Tyr Lys Thr Asn Cys Arg Cys Glu 35 40 <210> 1291 <211> 76 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <220> <221> MISC_FEATURE <223> omega-PtXIIA <400> 1291 Ser Cys Ile Asn Val Gly Asp Phe Cys Asp Gly Lys Lys Asp Asp Cys 1 5 10 15 Gln Cys Cys Arg Asp Asn Ala Phe Cys Ser Cys Ser Val Ile Phe Gly 20 25 30 Tyr Lys Thr Asn Cys Arg Cys Glu Val Gly Thr Thr Ala Thr Ser Tyr 35 40 45 Gly Ile Cys Met Ala Lys His Lys Cys Gly Arg Gln Thr Thr Cys Thr 50 55 60 Lys Pro Cys Leu Ser Lys Arg Cys Lys Lys Asn His 65 70 75 <210> 1292 <211> 74 <212> PRT <213> Filistata hibernalis <220> <221> MISC_FEATURE <223> Dw13.3 <400> 1292 Ala Glu Cys Leu Met Ile Gly Asp Thr Ser Cys Val Pro Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Arg Cys Cys Tyr Gly Ala Trp Cys Tyr Cys Asp Gln Gln Leu Ser 20 25 30 Cys Arg Arg Val Gly Arg Lys Arg Glu Cys Gly Trp Val Glu Val Asn 35 40 45 Cys Lys Cys Gly Trp Ser Trp Ser Gln Arg Ile Asp Asp Trp Arg Ala 50 55 60 Asp Tyr Ser Cys Lys Cys Pro Glu Asp Gln 65 70 <210> 1293 <211> 35 <212> PRT <213> Agelena opulenta <220> <221> MISC_FEATURE <223> Agelenin <400> 1293 Gly Gly Cys Leu Pro His Asn Arg Phe Cys Asn Ala Leu Ser Gly Pro 1 5 10 15 Arg Cys Cys Ser Gly Leu Lys Cys Lys Glu Leu Ser Ile Trp Asp Ser 20 25 30 Arg Cys Leu 35 <210> 1294 <211> 36 <212> PRT <213> Grammostola spatulata <220> <221> MISC_FEATURE <223> omega-GTx-SIA <400> 1294 Asp Cys Val Arg Phe Trp Gly Lys Cys Ser Gln Thr Ser Asp Cys Cys 1 5 10 15 Pro His Leu Ala Cys Lys Ser Lys Trp Pro Arg Asn Ile Cys Val Trp 20 25 30 Asp Gly Ser Val 35 <210> 1295 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ShK Q1/A4/A15 <400> 1295 Gln Ser Cys Ala Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Ala Gln 1 5 10 15 Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser 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His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 185 190 195 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac 729 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 200 205 210 aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 777 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 215 220 225 230 tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc 825 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 235 240 245 cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 873 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 250 255 260 gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag 921 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 265 270 275 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac 969 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 280 285 290 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 1017 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 295 300 305 310 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 1065 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 315 320 325 aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca 1113 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 330 335 340 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc 1161 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 345 350 355 ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatggatcc 1192 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 360 365 <210> 1340 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1340 Tyr Asp Lys Val Arg Asn 1 5 <210> 1341 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1341 Thr Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp 1 5 10 15 Val Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg 20 25 30 Asp Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr 35 40 45 Leu Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu 50 55 60 Ala Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser 65 70 75 80 Glu Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr 85 90 95 Glu Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro 100 105 110 Ala Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp 115 120 125 <210> 1342 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1342 Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 1343 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 1343 aataacatat 10 <210> 1344 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 1344 gggtcgagac g 11 <210> 1345 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 1345 ttattgtata ccca 14 <210> 1346 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide duplex <400> 1346 gcagagtcca c 11 <210> 1347 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 1347 gggtgttatc atcaacgtta aatgcaaaat ctcccgtcag tgcctggaac cgtgcaaaaa 60 agctggtatg cgt 73 <210> 1348 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 1348 ttcggtaaat gcatgaacgg taaatgccac tgcaccccga aatctggtgg tggtggttct 60 <210> 1349 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 1349 caccagaacc accaccacca ccagatttcg gggtgcagtg gcatttaccg ttcatgcatt 60 taccgaaacg cat 73 <210> 1350 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(133) <400> 1350 g ggt gtt atc atc aac gtt aaa tgc aaa atc tcc cgt cag tgc ctg gaa 49 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 ccg tgc aaa aaa gct ggt atg cgt ttc ggt aaa tgc atg aac ggt aaa 97 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 tgc cac tgc acc ccg aaa tct ggt ggt ggt ggt tct 133 Cys His Cys Thr Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 1351 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1351 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 1352 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <400> 1352 caccagaacc accaccacca gatttcgggg tgcagtggca tttaccgttc atgcatttac 60 cgaaacgcat accagctttt ttgcacggtt ccaggcactg acgggagatt ttgcatttaa 120 cgttgatgat aac 133 <210> 1353 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 1353 caccagaacc accaccacca gaacaagtac cacaagtttt acgacaaaaa gaaagacgat 60 atttcataga atgtttacat tga 83 <210> 1354 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <400> 1354 aaagcagtac aacgagattt tggaatagta tcaatacaag aacg 44 <210> 1355 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide duplex <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Single-stranded DNA in positions 1-4. <220> <221> CDS <222> (2)..(127) <400> 1355 g ggt cgt tct tgt att gat act att cca aaa tct cgt tgt act gct ttt 49 Gly Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 caa tgt aaa cat tct atg aaa tat cgt ctt tct ttt tgt cgt aaa act 97 Gln Cys Lys His Ser Met Lys Tyr Arg Leu Ser Phe Cys Arg Lys Thr 20 25 30 tgt ggt act tgt tct ggt ggt ggt ggt tct 127 Cys Gly Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 1356 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1356 Gly Arg Ser Cys Ile Asp Thr Ile Pro Lys Ser Arg Cys Thr Ala Phe 1 5 10 15 Gln Cys Lys His Ser Met 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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 192 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 240 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 288 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 80 85 90 95 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 336 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 100 105 110 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 384 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 432 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 130 135 140 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 480 Val Ser Leu 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Tyr Thr Thr Val Asp Ile Ser Gln Trp His Arg Lys Glu His 240 245 250 ttt gag gca ttt cag tca gtt gct caa tgt acc tat aac cag acc gtt 934 Phe Glu Ala Phe Gln Ser Val Ala Gln Cys Thr Tyr Asn Gln Thr Val 255 260 265 270 cag ctg gat att acg gcc ttt tta aag acc gta aag aaa aat aag cac 982 Gln Leu Asp Ile Thr Ala Phe Leu Lys Thr Val Lys Lys Asn Lys His 275 280 285 aag ttt tat ccg gcc ttt att cac att ctt gcc cgc ctg atg aat gct 1030 Lys Phe Tyr Pro Ala Phe Ile His Ile Leu Ala Arg Leu Met Asn Ala 290 295 300 cat ccg gaa ttc cgt atg gca atg aaa gac ggt gag ctg gtg ata tgg 1078 His Pro Glu Phe Arg Met Ala Met Lys Asp Gly Glu Leu Val Ile Trp 305 310 315 gat agt gtt cac cct tgt tac acc gtt ttc cat gag caa act gaa acg 1126 Asp Ser Val His Pro Cys Tyr Thr Val Phe His Glu Gln Thr Glu Thr 320 325 330 ttt tca tcg cta tgg agt gaa tac cac gac gat tcc cgg cag ttt cta 1174 Phe Ser Ser Leu Trp Ser Glu Tyr His Asp Asp Ser Arg Gln Phe Leu 335 340 345 350 cac ata tat tcg caa gat gtg gcg tgt tac ggt gaa aac ctg gcc tat 1222 His Ile Tyr Ser Gln Asp Val Ala Cys Tyr Gly Glu Asn Leu Ala Tyr 355 360 365 ttc cct aaa ggg ttt att gag aat atg ttt ttc gtt tca gcc aat ccc 1270 Phe Pro Lys Gly Phe Ile Glu Asn Met Phe Phe Val Ser Ala Asn Pro 370 375 380 tgg gtg agt ttc acc agt ttt gat tta aac gtg gcc aat atg gac aac 1318 Trp Val Ser Phe Thr Ser Phe Asp Leu Asn Val Ala Asn Met Asp Asn 385 390 395 ttc ttc gcc ccc gtt ttc acc atg ggc aaa tat tat acg caa ggc gac 1366 Phe Phe Ala Pro Val Phe Thr Met Gly Lys Tyr Tyr Thr Gln Gly Asp 400 405 410 aag gtg ctg atg ccg ctg gcg att cag gtt cat cat gcc gtt tgt gat 1414 Lys Val Leu Met Pro Leu Ala Ile Gln Val His His Ala Val Cys Asp 415 420 425 430 ggc ttc cat gtc ggc aga atg ctt aat gaa tta caa cag tac tgc gat 1462 Gly Phe His Val Gly Arg Met Leu Asn Glu Leu Gln Gln Tyr Cys Asp 435 440 445 gag tgg cgg ggc ggg gcg taattttttt aaggcagtta ttggtggcgc 1510 Glu Trp Arg Gly Gly Ala 450 gcccgtctct taaggatccg 1530 <210> 1359 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly 225 230 <210> 1360 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1360 Met Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Val Asp Ile Ser Gln Trp 1 5 10 15 His Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gln Ser Val Ala Gln Cys Thr 20 25 30 Tyr Asn Gln Thr Val Gln Leu Asp Ile Thr Ala Phe Leu Lys Thr Val 35 40 45 Lys Lys Asn Lys His Lys Phe Tyr Pro Ala Phe Ile His Ile Leu Ala 50 55 60 Arg Leu Met Asn Ala His Pro Glu Phe Arg Met Ala Met Lys Asp Gly 65 70 75 80 Glu Leu Val Ile Trp Asp Ser Val His Pro Cys Tyr Thr Val Phe His 85 90 95 Glu Gln Thr Glu Thr Phe Ser Ser Leu Trp Ser Glu Tyr His Asp Asp 100 105 110 Ser Arg Gln Phe Leu His Ile Tyr Ser Gln Asp Val Ala Cys Tyr Gly 115 120 125 Glu Asn Leu Ala Tyr Phe Pro Lys Gly Phe Ile Glu Asn Met Phe Phe 130 135 140 Val Ser Ala Asn Pro Trp Val Ser Phe Thr Ser Phe Asp Leu Asn Val 145 150 155 160 Ala Asn Met Asp Asn Phe Phe Ala Pro Val Phe Thr Met Gly Lys Tyr 165 170 175 Tyr Thr Gln Gly Asp Lys Val Leu Met Pro Leu Ala Ile Gln Val His 180 185 190 His Ala Val Cys Asp Gly Phe His Val Gly Arg Met Leu Asn Glu Leu 195 200 205 Gln Gln Tyr Cys Asp Glu Trp Arg Gly Gly Ala 210 215 <210> 1361 <211> 1189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid and amino acid sequences of pAMG21ampR-pep-Fc <220> <221> CDS <222> (4)..(6) <220> <221> CDS <222> (87)..(458) <220> <221> CDS <222> (484)..(1179) <400> 1361 cat atg cgagacgggg cggtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata 56 Met 1 gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc atg gcc aag ttg acc agt gcc gtt 110 Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val 5 ccg gtg ctc acc gcg cgc gac gtc gcc gga gcg gtc gag ttc tgg acc 158 Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr 10 15 20 25 gac cgg ctc ggg ttc tcc cgg gac ttc gtg gag gac gac ttc gcc ggt 206 Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly 30 35 40 gtg gtc cgg gac gac gtg acc ctg ttc atc agc gcg gtc cag gac cag 254 Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln 45 50 55 gtg gtg ccg gac aac acc ctg gcc tgg gtg tgg gtg cgc ggc ctg gac 302 Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp 60 65 70 gag ctg tac gcc gag tgg tcg gag gtc gtg tcc acg aac ttc cgg gac 350 Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp 75 80 85 gcc tcc ggg ccg gcc atg acc gag atc ggc gag cag ccg tgg ggg cgg 398 Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg 90 95 100 105 gag ttc gcc ctg cgc gac ccg gcc ggc aac tgc gtg cac ttc gtg gcc 446 Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala 110 115 120 gag gag cag gac tgacacgtcc gacggcggcg tctca ggt ggt ggt ggt ggt 498 Glu Glu Gln Asp Gly Gly Gly Gly Gly 125 130 gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 546 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 135 140 145 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 594 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 150 155 160 atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 642 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 165 170 175 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 690 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 180 185 190 cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 738 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 195 200 205 210 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 786 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 215 220 225 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 834 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 230 235 240 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 882 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 245 250 255 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 930 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 260 265 270 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 978 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 275 280 285 290 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 1026 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 295 300 305 gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1074 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 310 315 320 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1122 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 325 330 335 cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 1170 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 340 345 350 ccg ggt aaa taatggatcc 1189 Pro Gly Lys 355 <210> 1362 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1362 Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val 1 5 10 15 Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp 20 25 30 Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu 35 40 45 Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala 50 55 60 Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu 65 70 75 80 Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu 85 90 95 Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala 100 105 110 Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp 115 120 <210> 1363 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1363 Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 1364 <211> 25 <212> PRT <213> Conus catus <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> AMIDATION <400> 1364 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Ser Cys Arg Lys Thr Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Arg Gly Ser Cys Arg Ser Gly Arg Cys 20 25 <210> 1365 <211> 26 <212> PRT <213> Conus catus <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> AMIDATION <400> 1365 Cys Lys Gly Lys Gly Gln Ser Cys Ser Lys Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ser Cys Ser Arg Arg Gly Lys Cys 20 25 <210> 1366 <211> 27 <212> PRT <213> Conus catus <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> AMIDATION <400> 1366 Cys Lys Ser Lys Gly Ala Lys Cys Ser Lys Leu Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Ser Gly Ser Cys Ser Gly Thr Val Gly Arg Cys 20 25 <210> 1367 <211> 27 <212> PRT <213> Conus tulipa <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Ornithine <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> AMIDATION <400> 1367 Cys Leu Ser Xaa Gly Ser Ser Cys Ser Xaa Thr Ser Tyr Asn Cys Cys 1 5 10 15 Arg Ser Cys Asn Xaa Tyr Ser Arg Lys Cys Tyr 20 25 <210> 1368 <211> 26 <212> PRT <213> Conus magus <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> AMIDATION <400> 1368 Cys Lys Gly Lys Gly Ala Pro Cys Arg Lys Thr Met Tyr Asp Cys Cys 1 5 10 15 Ser Gly Ser Cys Gly Arg Arg Gly Lys Cys 20 25 <210> 1369 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-G31 <400> 1369 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1370 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-L14 <400> 1370 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Leu Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1371 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A14 <400> 1371 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Ala Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1372 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A15 <400> 1372 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ala Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1373 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-P15 <400> 1373 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Pro Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1374 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A16 <400> 1374 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Ala 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1375 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-P16 <400> 1375 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Pro 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1376 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A25 <400> 1376 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Ala Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1377 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A6 <400> 1377 Gln Phe Thr Asn Val Ala Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1378 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-K6 <400> 1378 Gln Phe Thr Asn Val Lys Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1379 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A10 <400> 1379 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ala Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1380 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-P10 <400> 1380 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Pro Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1381 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A12 <400> 1381 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Ala Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1382 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-Q12 <400> 1382 Gln Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Gln Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1383 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A1 <400> 1383 Ala Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1384 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-T1 <400> 1384 Thr Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1385 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A2 <400> 1385 Gln Ala Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1386 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-I2 <400> 1386 Gln Ile Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1387 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-A3 <400> 1387 Gln Phe Ala Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1388 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-I3 <400> 1388 Gln Phe Ile Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val 1 5 10 15 Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser 35 <210> 1389 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-MgTx <400> 1389 Thr Ile Ile Asn Val Lys Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Leu Pro Pro 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gln Phe Gly Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser Pro 35 <210> 1390 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ChTx-MgTx-b <400> 1390 Thr Ile Ile Asn Val Ser Cys Thr Ser Pro Lys Gln Cys Leu Pro Pro 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gln Phe Gly Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys 20 25 30 Cys Arg Cys Tyr Ser Pro 35

Claims (134)

  1. 다음 화학식 I 또는 그의 다량체로 표시되는 화합물:
    <화학식 I>
    (X1)a-(F1)d-(X2)b-(F2)e-(X3)c
    상기 식에서,
    F1 및 F2는 반감기 연장성 부분이고, d 및 e는 각각 독립적으로 0 또는 1인데, 단 d 및 e 중의 적어도 하나는 1이며;
    X1, X2, 및 X3은 각각 독립적으로 -(L)f-P-(L)g-이고, f 및 g는 각각 독립적으로 0 또는 1이며;
    P는 2개 이상의 펩티드내 디설파이드 결합을 포함하는, 길이가 약 80 아미노산 잔기 이하인 독소 펩티드이고;
    L은 링커이며;
    a, b, 및 c는 각각 독립적으로 0 또는 1인데, 단 a, b 및 c 중의 적어도 하나는 1이다.
  2. 제1항에 있어서, 식 P-(L)g-F1로 표시되는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 식 F1-(L)f-P로 표시되는 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 식 P-(L)g-F1-(L)f-P로 표시되는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 식 F1-(L)f-P-(L)g-F2로 표시되는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 식 F1-(L)f-P-(L)g-F2-(L)f-P로 표시되는 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 식 F1-F2-(L)f-P로 표시되는 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 식 P-(L)g-F1-F2로 표시되는 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 식 P-(L)g-F1-F2-(L)f-P로 표시되는 화합물.
  10. 제1항에 있어서, F1 또는 F2, 또는 둘 다가 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜의 공중합체, 폴리프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산, 덱스트란 n-비닐 피롤리돈, 폴리 n-비닐 피롤리돈, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 프로필렌 옥사이드 중합체, 에틸렌 옥사이드 중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알코올, 선형 또는 분지된 당화 쇄, 폴리아세탈, 장쇄 지방산, 장쇄 소수성 지방족 기, 면역글로불린 Fc 도메인 또는 그의 일부, Fc의 CH2 도메인, Fc 도메인 루프, 알부민, 알부민 결합성 단백질, 트랜스티레틴, 티록신 결합성 글로불린, 또는 반감기가 긴 혈청 단백질에 대한 친화성을 지닌 리간드 (상기 리간드는 펩티드 리간드 및 소분자 리간드로 이루어진 군에서 선택됨); 또는 이들 구성원의 조합물인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, F1 또는 F2, 또는 둘 다가 인간 IgG Fc 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 것인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 인간 IgG Fc 도메인이 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  13. 제11항에 있어서, 인간 IgG Fc 도메인이 인간 IgG2 Fc 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, F1 및 F2가 상이한 반감기 연장성 부분인 화합물.
  15. 제1항에 있어서, F1 또는 F2, 또는 둘 다가 도 3, 4, 11A-C, 12A-C, 및 12E-F에 제시된 서열 2, 4, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 1340 내지 1342, 및 1359 내지 1363으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 것인 화합물.
  16. 제1항에 있어서, F1 또는 F2, 또는 둘 다가 인간 혈청 알부민 단백질 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, F1 또는 F2, 또는 둘 다가 트랜스티레틴 단백질 도메인을 포함하는 것인 화합물.
  18. 제1항에 있어서, F1 또는 F2, 또는 둘 다가 생물학적으로 적합한 중합체 또는 공중합체를 포함하는 것인 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 생물학적으로 적합한 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, PEG가 5 kD 및 20 kD PEG로 이루어진 군에서 선택된 것인 화합물.
  21. 제5항, 제6항, 제8항 또는 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, F1이 인간 IgG Fc 도메인 또는 HSA이고, F2가 PEG인 화합물.
  22. 제5항, 제6항, 제7항 또는 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, F2가 인간 IgG Fc 도메인 또는 HSA이고, F1이 PEG인 화합물.
  23. 제1항에 있어서, 비-PEG F1 또는 비-PEG F2에 접합되거나, P에 접합되거나 또는 이들의 조합에 접합된 하나 이상의 PEG 부분을 추가로 포함하는 화합물.
  24. 제1항에 있어서, 독소 펩티드가 인간 IgG1 Fc 도메인 루프 내로 삽입되어 있는 화합물.
  25. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 Kv1.3 길항제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  26. 제25항에 있어서, Kv1.3 길항제 펩티드가 ShK, HmK, MgTx, AgTx1, AgTx2, HsTx1, 0SK1, 아누록톡신 (Anuroctoxin), 녹시우스톡신 (Noxiustoxin), 혼고톡신 (Hongotoxin), HsTx1, ChTx, 티티스톡신 (Titystoxin), BgK, BmKTX, BmTx, Tc30, Tc32, Pi1, Pi2, 및 Pi3 독소 펩티드, 또는 이들의 유사체로 이루어진 군에서 선택된 것인 화합물.
  27. 제25항에 있어서, Kv1.3 길항제 펩티드가 표 1에 제시된 서열 21, 17, 18, 19, 61, 23, 85, 25, 62, 30, 27, 36, 86, 9, 26, 40, 87, 및 13으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  28. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 ShK 펩티드 또는 ShK 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  29. 제28항에 있어서, ShK 펩티드 또는 ShK 펩티드 유사체가 표 2에 제시된 서열 5, 88 내지 200, 548 내지 561, 884 내지 950, 및 1295 내지 1300으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  30. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 HmK 펩티드, BgK 펩티드, AeK 펩티드 또는 AsKS 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  31. 제30항에 있어서, HmK 펩티드, BgK 펩티드, AeK 펩티드 또는 AsKS 펩티드, 또는 펩티드 유사체가 표 3에 제시된 서열 6 내지 9, 201 내지 241로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  32. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 MgTx 펩티드 또는 MgTx 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  33. 제32항에 있어서, MgTx 펩티드 또는 MgTx 펩티드 유사체가 표 4에 제시된 서열 28 및 242 내지 260으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  34. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 AgTx2 펩티드 또는 AgTx2 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  35. 제34항에 있어서, AgTx2 펩티드 또는 AgTx2 펩티드 유사체가 표 5에 제시된 서열 23 및 261 내지 275로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  36. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 HsTx1 펩티드 또는 HsTx1 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  37. 제36항에 있어서, HsTx1 펩티드 또는 HsTx1 펩티드 유사체가 표 6에 제시된 서열 61 및 276 내지 293으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  38. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 0SK1 펩티드 또는 0SK1 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  39. 제38항에 있어서, 0SK1 펩티드 또는 0SK1 펩티드 유사체가 표 7에 제시된 서열 25, 294 내지 298, 562 내지 636, 980 내지 1274, 1303, 및 1308로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  40. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 Pi2 펩티드 또는 Pi2 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  41. 제40항에 있어서, Pi2 펩티드 또는 Pi2 펩티드 유사체가 표 8에 제시된 서열 17 및 299 내지 315로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  42. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 AnTx 펩티드 또는 AnTx 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  43. 제42항에 있어서, AnTx 펩티드 또는 AnTx 펩티드 유사체가 표 9에 제시된 서열 62 및 316 내지 318로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  44. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 NTX 펩티드 또는 NTX 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  45. 제44항에 있어서, NTX 펩티드 또는 NTX 펩티드 유사체가 표 10에 제시된 서열 30 및 319 내지 325로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  46. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 KTX1 펩티드 또는 KTX1 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  47. 제46항에 있어서, KTX1 펩티드 또는 KTX1 펩티드 유사체가 표 11에 제시된 서열 24 및 326 내지 328로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  48. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 IKCa1 길항제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  49. 제48항에 있어서, IKCa1 길항제 펩티드가 MTx 펩티드, ChTx 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  50. 제49항에 있어서, MTx 펩티드, ChTx 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체가 표 12에 제시된 서열 20, 36, 및 329로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  51. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 MTX 펩티드 또는 MTX 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  52. 제51항에 있어서, MTX 펩티드 또는 MTX 펩티드 유사체가 표 13에 제시된 서열 20, 330 내지 343, 및 1301, 1302, 1304 내지 1307, 1309, 1311, 1312, 및 1315 내지 1336으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  53. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 ChTx 펩티드 또는 ChTx 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  54. 제53항에 있어서, ChTx 펩티드 또는 ChTx 펩티드 유사체가 표 14에 제시된 서열 36, 59, 344 내지 346, 및 1369 내지 1390으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  55. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 SKCa 길항제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  56. 제55항에 있어서, SKCa 길항제 펩티드가 아파민 (apamin) 펩티드, ScyTx 펩티드, BmP05 펩티드, P05 펩티드, 타마핀 (tamapin) 펩티드, P01 펩티드 또는 TsK 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  57. 제55항에 있어서, SKCa 길항제 펩티드가 표 15에 제시된 서열 16, 47, 50 내지 53, 및 68로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  58. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 아파민 펩티드 또는 아파민 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  59. 제58항에 있어서, 아파민 펩티드 또는 아파민 펩티드 유사체가 표 16에 제시된 서열 68 및 348 내지 353으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  60. 제56항에 있어서, ScyTx 펩티드, 타마핀 펩티드 또는 펩티드 유사체가 표 17에 제시된 서열 51, 53 및 354 내지 356으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  61. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 BKCa 길항제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  62. 제61항에 있어서, BKCa 길항제 펩티드가 표 18에 제시된 서열 29, 35, 및 38 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  63. 제61항에 있어서, 하나 이상의 P가 IbTx 펩티드, 슬로톡신 (Slotoxin) 펩티드, BmTx1 펩티드 또는 BuTx 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  64. 제63항에 있어서, IbTx 펩티드, 슬로톡신 펩티드, BmTx1 펩티드, BuTx 펩티드, 또는 펩티드 유사체가 표 19에 제시된 서열 38 및 357 내지 398로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  65. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 마르텐톡신 (Martentoxin) 펩티드 또는 마르텐톡신 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  66. 제65항에 있어서, 마르텐톡신 펩티드 또는 마르텐톡신 펩티드 유사체가 표 20에 제시된 서열 35 및 399 내지 408로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  67. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 N-유형 칼슘 채널 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  68. 제67항에 있어서, N-유형 칼슘 채널 억제제 펩티드가 표 21에 제시된 서열 64 내지 66, 347, 409, 1364 내지 1367로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  69. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 ωMVIIA 펩티드 또는 ωMVIIA 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  70. 제69항에 있어서, ωMVIIA 펩티드 또는 ωMVIIA 펩티드 유사체가 표 22에 제시된 서열 65 및 410 내지 421로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  71. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 GVIA 펩티드 또는 GVIA 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  72. 제71항에 있어서, GVIA 펩티드 또는 GVIA 펩티드 유사체가 표 23에 제시된 서열 64 및 422 내지 429로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  73. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 Ptu1 펩티드 또는 Ptu1 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  74. 제73항에 있어서, Ptu1 펩티드 또는 Ptu1 펩티드 유사체가 표 24에 제시된 서열 66 및 430 내지 437로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  75. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 T-유형 칼슘 채널, P2X, 또는 TRP 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  76. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 ProTx1 펩티드 또는 ProTx1 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  77. 제76항에 있어서, ProTx1이 표 25에 제시된 서열 56, 및 438 내지 445로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 화합물.
  78. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 BeKM1 펩티드 또는 BeKM1 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  79. 제78항에 있어서, BeKM1 펩티드 또는 BeKM1 펩티드 유사체가 표 26에 제시된 서열 63, 및 446 내지 458로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  80. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 나트륨 채널 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  81. 제80항에 있어서, 나트륨 채널 억제제 펩티드가 표 27에 제시된 서열 459 내지 469로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  82. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 클로라이드 채널 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  83. 제82항에 있어서, 클로라이드 채널 억제제 펩티드가 표 28에 제시된 서열 67 및 470 내지 493으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  84. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 Kv2.1 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  85. 제84항에 있어서, Kv2.1 억제제 펩티드가 표 29에 제시된 서열 494 내지 506으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  86. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 Kv4.3 및 Kv4.2의 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  87. 제86항에 있어서, Kv4.3 및 Kv4.2의 억제제 펩티드가 표 30에 제시된 서열 57 및 507 내지 518로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  88. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 nACHR 채널 억제제 펩티드를 포함하는 것인 화합물.
  89. 제88항에 있어서, nACHR 채널 억제제 펩티드가 표 31에 제시된 서열 519 내지 541로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  90. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 아가톡신 (Agatoxin) 펩티드 또는 아가톡신 펩티드 유사체를 포함하는 것인 화합물.
  91. 제1항에 있어서, 하나 이상의 P가 표 32에 제시된 서열 959 내지 975, 1275 내지 1287, 및 1368로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 화합물.
  92. 제1항의 화합물을 암호화하는 DNA.
  93. 제92항의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
  94. 제93항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  95. 제94항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  96. 제94항에 있어서, 포유류 세포인 숙주 세포.
  97. 제94항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  98. 제94항에 있어서, 원핵 세포인 숙주 세포.
  99. 제94항에 있어서, 이. 콜라이 (E. coli) 세포인 숙주 세포.
  100. 제1항에 있어서, 부가의 약리학적으로 활성이고 공유 결합된 펩티드를 추가로 포함하는 화합물.
  101. 제100항에 있어서, 부가의 펩티드가 F1 또는 F2에 결합되어 있는 화합물.
  102. 제100항에 있어서, 부가의 펩티드가 P에 결합되어 있는 화합물.
  103. 제1항에 있어서, 독소 펩티드의 활성과 관련하여 작동성 펩티드 또는 길항성 펩티드, 또는 표적화 펩티드를 추가로 포함하는 화합물.
  104. 표 2에 제시된 서열 88, 89, 92, 148 내지 200, 548 내지 561, 884 내지 949, 및 1295 내지 1300으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  105. 표 3에 제시된 서열 201 내지 225로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  106. 표 4에 제시된 서열 242 내지 248 및 250 내지 260으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  107. 표 5에 제시된 서열 261 내지 275로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  108. 표 6에 제시된 서열 276 내지 293으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  109. 표 7에 제시된 서열 980 내지 1274, 1303, 및 1308로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  110. 표 8에 제시된 서열 299 내지 315로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  111. 표 9에 제시된 서열 316 내지 318로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  112. 표 10에 제시된 서열 319의 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  113. 표 11에 제시된 서열 327 및 328로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  114. 표 13에 제시된 서열 330 내지 337, 341, 1301, 1302, 1304 내지 1307, 1309, 1311, 1312, 및 1315 내지 1336으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  115. 표 14에 제시된 서열 1369 내지 1390으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  116. 표 16에 제시된 서열 348 내지 353으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  117. 표 19에 제시된 서열 357 내지 362, 364 내지 368, 370, 372 내지 385, 및 387 내지 398로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  118. 표 20에 제시된 서열 399 내지 408로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  119. 표 22에 제시된 서열 410 내지 421로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  120. 표 23에 제시된 서열 422, 424, 426, 및 428로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  121. 표 24에 제시된 서열 430 내지 437로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  122. 표 25에 제시된 서열 438 내지 445로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  123. 표 26에 제시된 서열 447, 449, 451, 453, 455, 및 457로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  124. 표 28에 제시된 서열 470 내지 482 및 484 내지 493으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  125. 표 29에 제시된 서열 495 내지 506으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  126. 표 30에 제시된 서열 507 내지 518로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 독소 펩티드 유사체를 포함하는 화합물.
  127. 제1항, 제104항, 제105항, 제106항, 제107항, 제108항, 제109항, 제110항, 제111항, 제112항, 제113항, 제114항, 제115항, 제116항, 제117항, 제118항, 제119항, 제120항, 제121항, 제122항, 제123항, 제124항, 제125항, 또는 제126항 중의 어느 한 항에 따른 화합물과 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  128. 기존에 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상을 경험한 적이 있는 환자에게, 예방적 유효량의 제1항, 제38항, 제39항, 제48항, 제49항, 제50항, 제51항, 제52항, 제53항, 제54항, 제104항, 제109항, 제114항 또는 제115항 중의 어느 한 항에 따른 화합물을 투여함으로써, 다발성 경화증의 한 가지 이상 증상이 재발되는 것을 예방하거나 완화시키는 것을 포함하는, 다발성 경화증의 증상 재발을 예방하거나 완화시키는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 화합물이 Kv1.3 길항제 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  130. 제128항에 있어서, 화합물이 ShK 펩티드, OSK1 펩티드, ChTx 펩티드 또는 마우로톡신 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체를 포함하는 것인 방법.
  131. 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 건선, 염증성 장 질환, 접촉성 피부염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 천식, 알레르기, 재협착, 전신성 경화증, 섬유증, 피부 경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 염증성 골 흡수, 이식조직 거부, 이식편 대 숙주 질병, 및 루푸스로 이루어진 군에서 선택된 자가면역 질환이 있는 것으로 진단된 환자에게, 치료적 유효량의 제1항, 제38항, 제39항, 제48항, 제49항, 제50항, 제51항, 제52항, 제53항, 제54항, 제104항, 제109항, 제114항 또는 제115항 중의 어느 한 항에 따른 화합물을 투여함으로써, 상기 질환의 한 가지 이상 증상을 경감시키는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법.
  132. 제131항에 있어서, 화합물이 Kv1.3 길항제 펩티드 또는 IKCa1 길항제 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  133. 제131항에 있어서, 화합물이 ShK 펩티드, OSK1 펩티드, ChTx 펩티드 또는 마우로톡신 펩티드, 또는 이들의 펩티드 유사체를 포함하는 것인 방법.
  134. 제1항에 있어서, 모든 f 또는 모든 g가 1이고, L이 서열 79, 84, 및 637 내지 656으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커인 화합물.
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