JP6158090B2 - 非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子 - Google Patents
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Description
この出願は、2011年10月31日に出願された米国仮特許出願番号第61/553,910号の米国特許法119条(e)項の下での利益を主張し、上記仮出願は、その全容が参照として本明細書に援用される。
上述の承認された治療抗体は、多量体タンパク質である標的に対するものである。このことは、もし両アームで特定の標的分子をつかむことができるとすれば、治療抗体が改善され得ることを示す。残念ながら、この作業は、ヒンジ部が通常Fabアームを互いに離して向けるので簡単明瞭でない。外側に向かうアームは、細菌などの大きい疾患標的をつかむように進化した可能性があるが、内側に向かうアームがあるとすれば、タンパク質(例えば、TNF)などのより小さい標的をつかみやすくなるだろう。後者は、ヒンジ部が柔軟であるだけでなく、Fcから少なくとも数ナノメートルの距離まで伸長可能であること(多くの型のポリマー鎖において見出されるが、ポリペプチドにおいて一般に欠如している性質16)の組合せ)をおそらく必要とする。
本発明は、以下の発明を含む。
一般式(I):XY−Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)−で示される非ペプチドヒンジ部含有基(式中、Xはアミノ酸又は2〜50個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを表し、Yはアルキレンオキシド含有基を表す。)と、前記非ペプチドヒンジ部含有基に結合した抗体Fc断片とを含む、非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子。
前記Xがβアミロイドである、(1)のフレキシブル抗体様分子。
前記Yが重合度2〜50のポリエチレングリコール基である、(1)又は(2)のフレキシブル抗体様分子。
前記Xがβアミロイド(1−15) Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(配列番号2)であり、前記Yが重合度12〜36のポリエチレングリコール基であり、抗体Fc断片が二量体を形成しており、前記前記非ペプチドヒンジ部含有基を2個有している、(1)のフレキシブル抗体様分子。
一般式(II):XY−Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)−COSR(式中、Xはアミノ酸又は2〜50個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを表し、Yはアルキレンオキシド含有基を表し、COSRはアミノ酸配列Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)のC末端トレオニン残基のチオエステル基であり、Rは有機基を表す。)で示される非ペプチドヒンジ部含有チオエステルを用意し、
抗体Fc断片を有し且つN末端にシステイン残基を有する抗体Fc断片含有ペプチドを用意し、
前記非ペプチドヒンジ部含有チオエステルと前記抗体Fc断片含有ペプチドとをネイティブケミカルライゲーションに供することによって、XY−Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)−で示される非ペプチドヒンジ部含有基と、前記非ペプチドヒンジ部含有基が前記システイン残基を介して結合した抗体Fc断片とを有する抗体様分子を得る、非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子を調製する方法。
本発明者らの少なくとも2本の手を持つ分子は、非常に優れた親和性を伴って標的に結合することから、改善された抗体は抗体医薬の将来の開発のために大変有望である。
ゲスト物質としては、様々な生理活性物質が含まれ、疾病関連物質であることが好ましい。具体的にはアミロイドβ(周知の配列であるアミロイドβの全部又は一部からなるペプチド鎖)が挙げられる。より具体的には、アミロイドβのエピトープであるアミロイドβ(3-7)配列EFRHD(配列番号3)を少なくとも含むペプチド鎖であり、アミロイドβ(3-7)配列、アミロイドβ(1-15)配列DAEFRHDSGYEVHHQ(配列番号2)、アミロイドβ(1-42)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号4)からなるペプチド鎖などが挙げられる。
ホスト物質としては、標的分子(生体由来分子及び非生体由来分子を問わない)の分子認識が可能な物質であればよく、例えば、抗体Fab断片やアプタマーなどが挙げられる。
分子認識とは、非共有結合によって分子認識物質の分子認識部位が特定の標的分子のエピトープを認識し相互作用をすることであり、例えば結合速度定数ka(単位1/Ms)が少なくとも103又は104、例えば103〜105又は104〜105の親和性で特異的結合することでありうる。
本発明においては、特に、エチレングリコール基、又は重合度2〜50、より好ましくは12〜36のポリエチレングリコール基が選択されうる。
アルキレンオキシド含有基Yは、本発明の抗体様分子のヒンジ領域に、柔軟性、又は柔軟性及び伸長性を与える。
各ヒンジ領域構成配列は、各ヒンジ領域を構成する一部又は全ての配列である。例えば、上部ヒンジ領域構成配列ZUは、上部ヒンジ領域領域の一部の配列であってよく、例えば3〜5個のアミノ酸残基からなる短い配列であってよい。例えば、上部ヒンジ領域構成配列ZUは、IgG1上部ヒンジ領域の一部の配列であるDKTHT(配列番号1)である。さらにこの場合、本発明の抗体様分子においては、当該DKTHT配列のN末端にシステイン残基が結合していないことが好ましい。
コアヒンジ領域構成配列ZCは、重鎖間に鎖間ジスルフィド架橋を形成している少なくとも2個のシステイン残基を有し、それら2個のシステイン残基のうちN末端側のものが、コアヒンジ領域構成配列ZCのN末端アミノ酸残基に相当することが好ましい。一例として、IgG1コアヒンジ領域の配列であるCPPC(配列番号5)である。
抗体下部ヒンジ領域構成配列ZLとしては、一例として、IgG1抗体下部ヒンジ領域の配列であるPAELLGGP(配列番号6)である。
相手方物質は、単量体分子、分子の二量体以上の多量体又は凝集体であってよい。
相手方物質は、生体由来であってもよいし、非生体由来であってもよい。
相手方物質は、低分子量分子(例えば分子量8万以下、又は3万以下)であってよい。例えば、サイトカインなどの低分子量タンパク質でありうる。
分子認識系構築物質Xと、アルキレンオキシド含有基Yと、抗体上部ヒンジ領域構成配列ZUとを含む、非ペプチドヒンジ部含有チオエステル(XYZU−COSR)を用意する。COSRは抗体上部ヒンジ領域構成配列ZUのC末端アミノ酸残基の(カルボキシル基から誘導されることができる)チオエステル基を表し、Rは有機基(例えば、炭素数1〜18の直鎖又は分岐のアルキル基、炭素数6〜18のアリール基又はそれらが組み合わされたアラルキル基)を表す。
生化学的産生には、酵素学的合成・分解及び遺伝子工学的合成(宿主細胞としては、バクテリア等の原核細胞、及び酵母や動物細胞等の真核細胞を問わない)が含まれる(以下の他の要素においても同様)。
抗体上部ヒンジ領域構成配列ZUは、生体由来又は非生体由来であってよく、当業者に周知の、天然物からの単離、有機化学的合成、生化学的産生、及び半合成等のいずれの方法で取得してもよい。
分子認識系構築物質X及び抗体上部ヒンジ領域構成配列ZUそれぞれの要素がアルキレンオキシド含有基Yを介して連結された状態で得る方法は、当業者に周知の方法で行うことができる。チオエステル基は、抗体上部ヒンジ領域構成配列のC末端カルボキシル基から当業者が適宜誘導することができる。
抗体Fc断片含有ペプチドは、当業者に周知のペプチド調製法により取得することができる。従って、当業者に周知の、天然物からの単離、有機化学的合成、生化学的産生、半合成等、及びそれら方法の組み合わせのいずれの方法で取得してもよい。
ネイティブケミカルライゲーションにおいては、トランスチオエステル化反応によってS−アシル中間体が可逆的に形成され(図1A)、S−アシル中間体においてS−アシルがN−アシルへ自発的に移行し(図1B)、五員環中間体を介してペプチド結合が不可逆的に形成される(図1C)。
[ヒトIgG1 Fcタンパク質]
組換えFcタンパク質(Fc6と呼ばれる)を、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞内で発現させ、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。226CPPCコアヒンジ配列から始まるヒトIgG1重鎖ヒンジ領域に融合したヒトソニックヘッジホッグ相同体(SHH)シグナル配列を含むキメラタンパク質の発現を指示するDNA発現ベクターを設計した(重鎖の残基は、Eu形式3)によって番号付けされる;残基226Cysは、Kabat & Wu形式ではCys239に対応する) 24)。このベクター(pCDNA3-SHH-IgG1-Fc11)の配列は、Capon, D.J.(2008年11月20日)世界特許協力条約、公開番号WO/2008/140477に記載されている。SHHシグナル配列の分泌および切断の後、得られる成熟Fc6ポリペプチドは、222残基の予測された長さを有する。Fc6タンパク質の生成は、無血清懸濁培地にアダプトされたCHO-DG44細胞内における一過性発現によって実施した。一過性トランスフェクションを、以前に記載されたように25)、トランスフェクション剤としてのポリエチレンイミンを用い、高密度条件下で、DNAと複合体を形成させて行った。シードトレイン培養(seed train culture)をTubeSpin(登録商標)バイオリアクターの50本の管内で維持し、トランスフェクション用の十分なバイオマスを生成するために量をスケールアップした。トランスフェクションは、0.5リットル〜1リットルの培養液中で実施した。このスケールでの培養を、換気孔付きキャップを有する2リットルまたは5リットルのSchott瓶内で維持した。加湿して、CO2を5体積%に制御して、Kuhnerインキュベーター振盪機で、180rpmで瓶を振盪した。細胞培養液を10日後に回収し、遠心分離し、滅菌濾過した後、精製した。Ca塩またはMg塩を含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS)(UCSF Cell Culture Facility、San Francisco、CA)で予め平衡化したrProtein A Fast Flow(GE Healthcare Bio-Sciences AB、Uppsala、Sweden)を充填したカラムに培養上清をアプライした。カラムを、PBSを用いて大規模に洗浄し、Fc6タンパク質を、0.1Mのグリシン緩衝液、pH2.7を用いて溶出した。画分を、0.05v/v、1.0MのTris-HCL、pH9.0を含む管の中に収集し(7.5の最終pHを与える)、プールし、PBSに対して透析し、4℃で貯蔵した後使用した。
本研究で使用したすべての合成ペプチドを表1に示す。
表1においては、アミノ酸配列(Sequence)を太字で表示している。チオエステルは、ペプチド(Peptide)1、4及び5においてはチオフェノールに由来し、ペプチド2及び3においてはベンジルメルカプタンに由来する。Mrは相対分子質量を、MH+はモノアイソトピック質量(測定値)を示す。
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)はAcros(Morris Plains、NJ)から購入し、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)はPierce(Rockford、IL)から購入し、4-メルカプトフェニル酢酸(MPAA)はSigma-Aldrich(St. Louis、MO)から購入した。反応物は、pH6.5、50mMのMES緩衝液、0.8mMのTCEP、10mMのMPAA、5mg/mlのペプチドチオエステル、および1mg/mlのFc6タンパク質を含んでいた。室温で15時間インキュベートした後、反応物を、0.05v/vの1MのTris-HCl、pH9.0を用いてpH7.0に調整し、GE Healthcare(Piscataway、NJ)から購入したHiTrap Protein A HPカラム上で精製した。Invitrogen(Carlsbad、CA)から購入したNuPAGE(登録商標)Novex Bis-Tris Midi Gel(10%)を使用して、還元性条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって反応生成物を分析した。Bio-Rad(Hercules、CA)から購入したSilver Stain PlusまたはCoomassie Brilliant Blue R-250を使用してタンパク質を可視化した。
HPLCグレードのアセトニトリル(ACN)およびトリフルオロ酢酸(TFA)はWako Pure Chemical Industries(Osaka、Japan)から購入した。炭酸水素アンモニウム(NH4HCO3)、ジチオトレイトール(dithiotreitol)(DTT)、およびヨードアセトアミド(IAA)はNacalai Tesque(Kyoto、Japan)から購入した。シーケンスグレードのトリプシンはPromega(Madison、WI)から購入した。ゲルからのタンパク質バンドを切り取り、50mMのNH4HCO3水溶液中50% v/vのACNを含む溶液 300μlを用いて、4℃で45分間脱染した。ゲル断片を、100%のACN 150μl中で、室温で10分間脱水し、その後Speed Vac(登録商標)を用いて30分間乾燥した。50mMのNH4HCO3水溶液中10mMのDTTを含む溶液100μl体積量を乾燥したゲルに添加することによって、スルフィド結合を37℃で1時間還元した。溶液を除去した後、50mMのNH4HCO3水溶液中55mMのIAA を含む溶液100μl中で、暗所下で、室温で1時間タンパク質をアルキル化した。その後、ゲル断片を、50mMのNH4HCO3水溶液 150μlを用いて洗浄し、次いで100%のACN中150μl中で脱水した。このステップを2回繰り返した。次いでゲル断片を真空遠心分離機内で30分間乾燥させた。50mMのNH4HCO3水溶液中50ng/μlのトリプシンを含む溶液2μlを用いて乾燥したゲルを再水和し、室温で5分間インキュベートした。次いで、超純水18μlをさらに添加し、タンパク質を37℃で一晩消化した。消化後、0.1% v/vのTFAを含有する50% v/vのACN水溶液 40μlを消化混合物に添加し、ゲル断片を15分間超音波処理した。上清を新しい0.5mlの管内に収集した。
MALDI質量スペクトルは、陽イオンリフレクトロンモードおよびリニアモードで、337nmの窒素レーザーを備えたAXIMA performance MALDI-TOF質量分析計(Shimadzu/KRATOS、Manchester、UK)を使用して得た。α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸(CHCA)およびシナピン酸(SA)は、LaserBio Labs(Sophia-Antipolis Cedex、France)から入手した。MALDIマトリックスとして、CHCAをトリプシン消化した(trysin-digested)タンパク質に使用し、SAをSEC分離したタンパク質に使用した。マトリックス溶液は、0.1% v/vのTFAを含む50% v/vのACN水溶液 0.5ml中にマトリックス化合物5mgを溶解させることによって調製した。試料溶液(0.5μl)をターゲットプレート上で等量のマトリック溶液と混合し、次いでMALDI-TOF MS分析のために室温で乾燥させた。m/z値は、それぞれ2pmolの[アンギオテンシンI+H+](m/z 1296.7)、[アンギオテンシンII+H+](m/z 1046.5)、[[Glu1]-フィブリノペプチドB+H+](m/z 1570.7)、[N-アセチル樹脂基質テトラデカペプチドI+H+](m/z 1800.9)、[ACTH断片1〜17+H+](m/z 2093.1)、および[ACTH断片18〜39+H+](m/z 2464.2)、ならびに3pmolの[ACTH断片7〜38+H+](m/z 3656.9)、7.5pmolの[ウシ血清アルブミン+H+](m/z 66430.09(平均))および[アルドラーゼ+H+](m/z 39212.28(平均))を外部標準物質として用いて較正した。
SECを実施し、Prominence HPLC System(Shimadzu Corp、Kyoto、Japan)またはAKTA Avant FPLC System(GE Healthcare、Piscataway、NJ)を使用して同様の結果を伴った。TSKgelカラムは、TOSOH Bioscience(Tokyo、Japan)から購入した。使用した移動相、流量、カラム温度、および検出波長はそれぞれ、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.4および300mMのNaCl、0.35mL/分、25℃、および214/280nmであった。4つすべてのAβ-PEGx-Fcシンメトロアドヘシン(x=0、12、24、および36)は、各実験において並行して分析した。2本の手を持つ分子の合成の効率を分析するために、プロテインAで精製した各反応生成物5μLをTSKgel SuperSW3000[4.6mm I.D.×30cm L]カラムに注いだ。分子種の比は、各ピーク下面積から計算した。2本の手を持つ分子および1本の手を持つ分子のサブユニット構造をSDS-PAGEによって確認するために、プロテインAで精製した反応生成物を、0.5mlのAmicon Ultracel-3K遠心濾過機(Millipore、Cork、IR)を使用して最初に10倍に濃縮し、次いで各濃縮物50μlを連続して結合された4つのTSKgelカラム(2つのG2000SWXL、および2つのG3000SWXL[7.8mm I.D.×30cm L]カラム)に注いだ。次いで、還元性条件下でNuPAGE(登録商標)Novex Bis-Tris Midi Gel(4〜12%)を使用して画分を分析した。SECによって観察された2つの主要な化学種の分子量を決定するために、プロテインAで精製した各反応物50μLをTSKgel G3000SWXL[7.8mm I.D.×30cm L]カラムに注いだ。ピーク画分を、リニアモードでMALDI TOF MS分析によって分析した。
SPR試験を、Biacore T100計測器(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を使用して実施した。リガンド、ビオチン標識6E10モノクローナル抗体(Covance、Princeton、NJ)を、Biotin CAPture Kit(GE Healthcare、Piscataway、NJ)を使用してCAPセンサーチップ、Series S上に、PBS中10mg/mlの濃度で固定化した。センサーチップにストレプトアビジン捕捉試薬を入れ、30%のアセトニトリル中0.25MのNaOHを用いた追加の再生ステップを含めて、製造者の使用説明書に従って再生した。AβシンメトロアドヘシンおよびAβペプチドの結合は、10mMのHepes緩衝液、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.005体積%のTween-20中で、25℃で実施した。データは、Biacore T100 Evaluation Software、バージョン2.0.3を使用して評価した。
[シンメトロアドヘシンの定量的合成]
Aβシンメトロアドヘシンを化学半合成するための本発明者らのストラテジーを図1に示した。
両N末端でシステイン残基を有するように操作された組換えFcタンパク質(Fc6)を用いてネイティブケミカルライゲーションを実施した。本発明者らは、安定なFc二量体にとって好ましく、且つN末端システインのスルフヒドリル基を還元状態で維持し、Fc6分子をC末端チオエステルと容易に反応させる、穏やかに還元する非変性条件を開発した。求核体としてFc6分子の両N末端スルフヒドリルを伴う求核アシル置換(図1A)は、2つのAβチオエステルを有するチオエステル連結中間体に導く(図1B)。両方のFc6 N末端アミノ基による引き続く求核攻撃とその後の分子内再配列とは、Fc6と2つのAβペプチドとの間の非可逆性ペプチド結合を形成する(図1C)。
Aβ配列とFc6の間の化学結合の正確な性質を確認するために、本発明者らは、質量分析法によって4つのAβシンメトロアドヘシンのモノマー構造を分析した。Aβ-Fc、Aβ-PEG12-Fc、Aβ-PEG24-Fc、およびAβ-PEG36-Fcシンメトロアドヘシン反応生成物を、SDS-PAGEによって精製し、ゲル内トリプシン消化を使用して特徴づけた。MALDI-TOF MSによって検出されたピークを、各シンメトロアドヘシンについて予測された理論的なペプチドとフィッティングしたことで、78.9〜81.8%の間の配列包括度を得た(図3A、図3B、図4C、図4D)。この配列包括度は、シンメトロアドヘシンのそれぞれを一意的に同定するのに十分であった。本発明者らは、2つの配列、すなわち、4つすべてのシンメトロアドヘシンにおいて異なるはずであるAβ-PEGx-DK断片(Aβ-PEGx-DK fragment)と、ケミカルライゲーション部位を代表し且つ4つすべてのシンメトロアドヘシンにおいて同一であるはずであるTHT-Fc6断片(THT-Fc6 fragment)と、に的を絞って分析した(図5E)。これらの5つの予測された配列についての理論的なm/z値(m/z value)を図5Fに示す。観察されたMSスペクトルは、4つすべてのユニークな断片(Aβ-DK、Aβ-PEG12-DK、Aβ-PEG24-DK、Aβ-PEG36-DK)、ならびに共通のライゲーション部位断片(THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(配列番号9))と見事に一致したm/z値でのピークを現した。
Aβシンメトロアドヘシン反応生成物は、親Fc6分子と同様の二量体構造を有することが予期された。さらに、4つすべての反応物において観察された少量(<10%)の見かけ上未反応の物質Fc6を考慮すると(図2、レーン3〜6)、各反応生成物は、2本のAβの「手」を有するホモ二量体、1本のAβの「手」を有するヘテロ二量体、および未反応のFc6ホモ二量体の混合物である場合がある。したがって、4つのAβシンメトロアドヘシンのサブユニット分子構造を調査するために、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用した。Aβ-Fc、Aβ-PEG12-Fc、Aβ-PEG24-Fc、およびAβ-PEG36-Fc反応生成物を、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって未反応のチオエステルから精製し、次いでネイティブな非還元性条件(50mMのリン酸ナトリウム、pH7.4、300mMのNaCl)下でSECによって分析した。図6A、図6B、図7A及び図7Bは、シンメトロアドヘシン反応生成物の4つすべてが2つの主要ピークを示したことを示す。これらの2つの主要ピークのサイズは、Aβ-Fc<Aβ-PEG12-Fc<Aβ-PEG24-Fc<Aβ-PEG36-Fcの順序で増大した。さらに、所与のシンメトロアドヘシン反応生成物について観察された2つの主要ピークの間のサイズ分離は、同じ相対的順序で増大した。さらに、4つすべてのシンメトロアドヘシン反応生成物は、未反応のFc6二量体(No Aβhand)について予期されるサイズを有する、24.4分でのより小さいマイナーピークを呈した。総合すると、これらの観察結果は、より大きい主要ピークおよびより小さい主要ピークはそれぞれ、予期された「2本の手を持つ(Two-handed)」および「1本の手を持つ(One-handed)」シンメトロアドヘシンを表すことを示した。
表2に示したように、2本の手を持つシンメトロアドヘシン候補は、4つの反応物のそれぞれにおいて観察された主要生成物であった(66〜74%)。最後に、反応生成物のうちの3つはまた、マイナーなより高い分子量(HMW)のピークを呈した(図6A、図7C、図7D)。2つの主要ピークに関しては、このピークのサイズは、オキシエチレンオリゴマーの長さとともに増大した。
表3に示した結果は、Aβ-PEGx-Fc反応生成物と見かけ上「未反応の」Fc6との間の分子量の差異(ΔMW)は、予期されたものより一貫して約238ダルトン大きいという意外な知見に至った。4つすべてのAβシンメトロアドヘシンについて、観察されたΔMWは、断片Aβ-PEGx-DKTの分子量に対応する。これらの結果は、1本の手を持つヘテロ二量体中に存在するより小さい鎖は、予期された未反応のFc6モノマー鎖ではなく、代わりに、上部ヒンジ領域(DKTHT(配列番号1))内の223Thr残基と224His残基の間で引き続いて切断されたAβ-PEGx-Fc反応生成物を表すことを強く示す(図11)。
4つすべてのAβシンメトロアドヘシンについて得られた主要反応生成物が2本の手を持つホモ二量体であったので、本発明者らは、そのような調製物が、2本の手を持つ分子として二量体標的に結合する能力を有するかどうかを調査した。この分析は、2本の手を持つシンメトロアドヘシンホモ二量体中に組み込まれたAβ配列の両方と相互作用することができるモノクローナル抗体を使用して実施した。DAEFRHDSGYEVHHQ配列(配列番号2)は、6E1018)、PFA1およびPFA219)、WO220)、ならびに12A11、10D5、および12B421)を含めた、ヒトAβ(1〜42)原線維と反応性であるいくつかのモノクローナル抗体によって認識される主要エピトープ(EFRHD(配列番号3))を含むのでこの目的によく適している。したがって、本発明者らは、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用してこれらの抗体の1つ(6E10)への本発明者らのAβシンメトロアドヘシンの結合を特徴づけた。本発明者らは、1本の手を持つ形で6E10に結合することが予期されたDAEFRHDSGYEVHHQ配列(配列番号2)を含むAβペプチドの結合を比較した。図12〜14は、6E10がSPRチップの表面上に固定化された場合に得られた結果を示す。15アミノ酸のAβ配列を含む、4つすべてのAβシンメトロアドヘシン(図12A、図12B、図13A、図13B)、ならびに2つのAβペプチド、すなわち、pen-AβおよびAβ-pra(表1)(図14E、図14F)で特異的な結合が観察された。Fc6またはDKTHT-Fc6シンメトロアドヘシンで結合はまったく観察されず(図2、レーン2)、これにより結合がAβ配列に特異的であることを確認した。
Aβシンメトロアドヘシンによる6E10の結合は、Aβペプチドの結合と定性的にも定量的にも異なった(図12〜図14)。
Aβペプチドの両方についての速度論的結合曲線は、1:1のLangmuirモデルと良好にフィッティングし(x2<0.1)、1本の手による結合と一致した。対照的に、4つのAβシンメトロアドヘシンは、1:1のLangmuirモデルと良好にフィッティングせず(x2>10)、このことは2つのクラスの結合部位を示した。表4に示したように、2つの指数関数モデルを使用して、4つのAβシンメトロアドヘシンについて良好なフィッティングが得られた(x2<1.1)。pen-Aβ(17nM)およびAβ-pra(20nM)ペプチドによって示された単一の親和性部位は、Aβ-Fc(140nM)、Aβ-PEG12-Fc(93nM)、Aβ-PEG24-Fc(70nM)、およびAβ-PEG36-Fc(62nM)シンメトロアドヘシンについて観察された低親和性部位と同様であった(表4)。この低親和性部位は、シンメトロアドヘシン集団の1つの画分による1本の手による結合機構と一致した。さらに、Aβ-Fc、Aβ-PEG12-Fc、Aβ-PEG24-Fc、およびAβ-PEG36-Fcシンメトロアドヘシンはすべて、対応する低親和性部位に対して2桁〜5桁大きい、はるかに高い親和性部位を呈し、このことは、Aβシンメトロアドヘシンのかなりの画分(19〜27%)による6E10の2本の手による結合の存在の強い証拠を提供した(表4)。
タンパク質は、コンパクトな、球状または繊維性の構造を形成することを好むことで、溶媒へのその曝露を最小限にしている。この傾向(tendency)は、水素結合した二次構造についての傾向(propensity)を有するポリペプチド骨格、および三次の折り畳みを促進する側鎖相互作用の両方において固有である。したがって、ペプチドを使用して抗体に「柔軟性」を導入するための以前の取り組みは、大部分は不十分であった。例えば、溶媒相互作用を好むアミノ酸(例えば、セリン)と、らせん構造を壊すアミノ酸(例えば、グリシン)との組合せを使用することは一般的である。この手法は、単鎖抗体断片(scFv)などの融合タンパク質を作るのに有用であるが、得られる構造はかなりコンパクトであり、伸長性の証拠をまったく伴わない(例えば、参考文献20を参照されたい)。さらに、そのような配列は、内因性の免疫原性およびタンパク質分解の受けやすさのためにさらなる問題の原因となりやすい。
結論として、本発明者らは、Fab領域自体などの大きい結合ドメインまたは受容体細胞外ドメインを組み込む非タンパク質ヒンジ部を有する抗体の完全な化学半合成という本発明者らの目的に向けた重要なステップをここで説明してきた。さらなる進展は、ネイティブケミカルライゲーションと組み合わせることができ、同族タンパク質のネイティブな構造および機能と同様に適合性であり、溶液中のそのようなネイティブタンパク質を用いて達成可能であるマイクロモル濃度で効率的に進めることができる他のタンパク質ライゲーション反応の同定に依存することになる。本発明者らが想定する抗体様分子は、疾患標的に対して結合親和性が改善された治療剤候補として非常に大きい潜在性を有する。
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Claims (6)
- 一般式(I):XY−Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)−で示される非ペプチドヒンジ部含有基(式中、Xはアミノ酸又は2〜50個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを表し、Yは重合度12〜36のポリエチレングリコール基を表す。)2個と、前記2個の非ペプチドヒンジ部含有基に結合し且つ二量体を形成している抗体Fc断片とを含む、非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子。
- 前記Xがβアミロイドである、請求項1のフレキシブル抗体様分子。
- 前記Xがβアミロイド(1−15)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(配列番号2)である、請求項1又は2のフレキシブル抗体様分子。
- 一般式(II):XY−Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)−COSR(式中、Xはアミノ酸又は2〜50個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを表し、Yは重合度12〜36のポリエチレングリコール基を表し、COSRはアミノ酸配列Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)のC末端トレオニン残基のチオエステル基であり、Rは有機基を表す。)で示される非ペプチドヒンジ部含有チオエステルを用意し、
抗体Fc断片を有し且つN末端にシステイン残基を有する抗体Fc断片含有ペプチドを用意し、
前記非ペプチドヒンジ部含有チオエステルと前記抗体Fc断片含有ペプチドとをネイティブケミカルライゲーションに供することによって、XY−Asp-Lys-Thr-His-Thr(配列番号1)−で示される非ペプチドヒンジ部含有基2個と、前記2個の非ペプチドヒンジ部含有基が前記システイン残基を介して結合し且つ二量体を形成している抗体Fc断片とを有する抗体様分子を得る、非ペプチドヒンジ部含有フレキシブル抗体様分子を調製する方法。 - 前記Xがβアミロイドである、請求項4のフレキシブル抗体様分子を調製する方法。
- 前記Xがβアミロイド(1−15)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(配列番号2)である、請求項4又は5のフレキシブル抗体様分子を調製する方法。
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