KR20150108912A - Kv1.3 길항제 및 사용 방법 - Google Patents

Kv1.3 길항제 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150108912A
KR20150108912A KR1020157022631A KR20157022631A KR20150108912A KR 20150108912 A KR20150108912 A KR 20150108912A KR 1020157022631 A KR1020157022631 A KR 1020157022631A KR 20157022631 A KR20157022631 A KR 20157022631A KR 20150108912 A KR20150108912 A KR 20150108912A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cys
lys
pro
gly
arg
Prior art date
Application number
KR1020157022631A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102268830B1 (ko
Inventor
엘렌 치
윌슨 에드워즈
치치 황
와이-핑 륭
로널드 스완슨
알렌 위켄덴
Original Assignee
얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 얀센 바이오테크 인코포레이티드 filed Critical 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Publication of KR20150108912A publication Critical patent/KR20150108912A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102268830B1 publication Critical patent/KR102268830B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

본 발명은 Kv1.3 길항제, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

Kv1.3 길항제 및 사용 방법{Kv1.3 ANTAGONISTS AND METHODS OF USE}
본 출원은 2013년 1월 28일자로 출원된 미국 가출원 제61/757,389호, 및 2013년 1월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/756,777호의 이득을 주장하며, 이들의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 Kv1.3의 길항제, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 이 길항제는 OdK2 펩티드의 변이체를 기반으로 한다.
이온 채널은 심장, CNS, 및 면역 생리학을 비롯한 이온 전류의 생성을 통해 세포 기능의 다양성을 조절한다. 시판되는 약물의 5 내지 30%가 이온 채널 활성을 조절할 수 있는 것으로 추정된다(문헌[Overington et al., Nat Reviews Drug Discovery 5:993-6, 2006]). 현재의 비선택적 약물의 효능 및 안전성을 개선하기 위하여, 서브패밀리 선택성이 새로운 치료제에 대해 요구되는 특징이며, 이는 소분자 및 알려진 천연 발생 펩티드 독소의 경우 상당한 어려움을 제기한다(문헌[Wickenden et al., Future Med Chem 4:661-79, 2012]). 이는 전압-개폐형(voltage-gated) K+, Ca+ 및 Na+ 채널과 같은 큰 상동 패밀리에서 특히 그러하다.
칼륨 전압-개폐형 채널 서브패밀리 A 구성원 3인 Kv1.3은 T 세포 상에서 발현되고 T 세포 활성화를 조절하도록 기능한다. 세포 표면 활성화 마커의 상향조절 및 사이토카인 생산의 증가 및 칼시뉴린 의존성 탈인산화를 통한 증식 및 활성화된 T 세포의 핵 인자(nuclear factor of activated T cell, NFAT)의 핵 전좌를 위하여, 지속된 칼슘 신호전달이 T 세포 활성화에 필요하다. 소포체로부터의 내부 칼슘 저장부위의 이노시톨 삼인산(inositol triphosphate, IP3) 의존성 방출은 세포 표면 상에서 칼슘 방출 활성화 칼슘 채널(calcium release activated calcium channel, CRAC)을 활성화하여, 세포외 칼슘의 유입 및 지속된 칼슘 신호전달을 제공한다(문헌[Cahalan et al., Immunol Rev 231:59-87, 2009]에 개관되어 있음). 세포가 과분극된 상태로 남아 있고 칼슘 유입이 완전 T 세포 활성화를 위해 유지되기 위해서는 칼륨의 유출이 필요하다. 이러한 칼륨 유출은 전압-개폐형 칼륨 채널 Kv1.3 및 칼슘-활성화 칼륨 채널 KCa3.1을 통해 조절되는 것으로 보인다. Kv1.3에 대해 선택적인 차단제는 Kv1.3이, 심지어 KCa3.1의 어떠한 억제의 부재 하에서도, 칼슘 신호전달의 조절을 담당하는 칼륨 채널임을 입증하였다(문헌[Beeton et al., Mol Pharmacol 67:1369-81, 2005]). 시험관내(in vitro)에서, Kv1.3의 차단은 T 세포를 탈분극시키고, 칼슘 진입, 사이토카인 생산, 및 활성화된 T 세포의 증식을 억제한다(문헌[Cahalan et al., Immunol Rev 231:59-87, 2009]에 개관되어 있음).
Kv1.3 차단제는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 실험적 관절염, 지연형 과민증(DTH), 알러지성 접촉 피부염 및 사구체신염과 같은 자가면역 모델에서 T 세포 의존성 질병의 진행을 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Rangaraju et al., Expert Opin Ther Targets 13:909-24, 2009]; 문헌[Beeton et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 103:17414-9, 2006]; 문헌[Koo et al., J Immunol 158:5120-8, 1997]; 문헌[Hyodo et al., Am J Physiol Renal Physiol 299:F1258-69, 2010]). 칼슘 칼시뉴린 NFAT 경로 억제제인 사이클로스포린 A(네오랄(Neoral), 샌디뮨(Sandimmune), 젠그라프(Gengraf)) 및 타크로리무스(Tacrolimus)(FK-506 또는 푸지마이신)가 이식 거부 및 중증 류마티스성 관절염을 비롯한 중증 면역 장애에 대해 승인된 치료제이다. 신장과 같은 조직 내에서의 칼시뉴린의 폭넓은 분포는 이들 화합물에 대해 더 고도의 기전에 기초한(mechanism based) 독성, 좁은 안전성 마진, 및 제한된 치료학적 응용을 초래할 수 있다. 선택적인 Kv1.3 차단제를 사용한 T 세포 억제는, T 세포 매개 염증성 및 자가면역 질병의 치료에서, 증가된 안전성 프로파일 및 더 큰 효능을 가져올 수 있다.
Kv1.3은 체중 증가를 조절하고 인슐린 감수성을 개선하는 역할을 할 수 있다. Kv1.3 결핍 마우스는 감소된 체중 증가, 더 높은 인슐린 감수성, 및 감소된 혈장 글루코스 수준을 나타낸다(문헌[Xu et al., Hum Mol Genet 12:551-9, 2003]). 시험관내에서, Kv1.3 차단제는 골격 근육 및 지방 조직에서 글루코스 수송체 4(glucose transporter 4, GLUT4) 세포 표면 발현을 증가시키고, 정상 및 ob/ob 비만 마우스에서 증가된 인슐린 감수성을 가져오는 것으로, 그리고 1차 지방세포에서 글루코스 흡수를 증가시키는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Xu et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:3112-7, 2004]). 인간에서, Kv1.3 유전자에서의 단일 뉴클레오티드 다형(single nucleotide polymorphism, SNP)은 감소된 인슐린 감수성 및 손상된 글루코스 내성과 관련되어 왔다(문헌[Tschritter, Clin Endocrinol Metab 91:654-8, 2006]).
Kv1.3은 혈관성형술과 같은 혈관 수술 후의 환자에서의 재협착과 같은 평활근 증식성 장애에서 중대한 기능을 가질 수 있다. Kv1.3 발현은 증식성 인간 및 마우스 평활근 세포에서 증가된다. Kv1.3 차단제는, 생체외(ex vivo) 인간 정맥 샘플에서, 칼슘 진입을 억제하고, 평활근 세포 이동을 감소시키고, 신생내막 과형성을 억제한다(문헌[Cheong et al., Cardiovasc Res 89:282-9, 2011]).
증가하는 증거는 Kv1.3 채널이 종양 세포를 비롯한 많은 유형의 세포의 활성화 및/또는 증식(문헌[Bielanska et al., Curr Cancer Drug Targets 9:904-14, 2009]), 소교세포(microglia)(문헌[Khanna et al., Am J Physiol Cell Physiol 280:C796-806, 2001]) 및 신경세포성 전구 세포의 분화(문헌[Wang et al., J Neurosci 30:5020-7, 2010])에 관여한다는 것을 나타내며, 이는 Kv1.3 차단제가 신경염증성 및 신경변성 질병, 및 암의 치료에 유익할 수 있음을 시사한다.
다양한 유기체에 의해 생산된 독소 펩티드는 이온 채널을 표적화하도록 진화되어 왔다. 뱀, 전갈, 거미, 벌, 달팽이, 말미잘, 곤충, 거미, 자포류, 파충류, 및 연체동물은, 강력하게 그리고 선택적으로 이온 채널 및 수용체를 표적화하는 작은 생체활성 독소 펩티드 또는 "독소"의 풍부한 공급원으로서의 역할을 할 수 있는 독액(venom)을 생산하는 유기체의 몇몇 예이다. 대부분의 경우, 이들 독소 펩티드는, 채널 구멍(channel pore)에 결합하고 이온 전도 경로를 물리적으로 차단함으로써, 또는 그 구멍의 외부에 있는 영역(예를 들어, 전압 센서 도메인)에 결합하여 채널 기능에 길항함으로써, 이온 채널의 강력한 길항제 또는 억제제로서 진화되어 왔다. 독소 펩티드들은 별개의 이황화물 결합쌍 형성(disulfide bond pairing)을 갖는 전형적으로 약 20 내지 80개의 아미노산 길이이고, 이황화물 연결 및 펩티드 접힘(fold)에 기초하여 다수의 수퍼패밀리로 세분될 수 있다. 많은 독액 독소들이 선택성과 같은 그들의 특성을 개선하도록 가공되고 있다(문헌[King, Expert Opin Biol Ther 11:1469-84, 2011]; 문헌[Escoubas and King, Expert Review Proteomics 6:221-4, 2009]).
Kv1.3 차단을 나타내는 독액 펩티드는 ShK, OdK2, OsK1, 마르가톡신, 칼리오톡신 등을 포함한다(문헌[Chandy et al., Trends in Pharmacol Sci 25:280-9, 2004] 참조). Kv1.3 차단제인 OdK2 및 OsK1(알파-KTx3.7)은 각각 오돈토부투스 도리아이(Odontobuthus doriae) 및 오르토키루스 스크로비큘로수스(Orthochirus scrobiculosus)의 독액으로부터의 α-KTx3 전갈 독소 패밀리의 상동 구성원이다(문헌[Abdel-Mottaleb et al., Toxicon 51:1424-30, 2008]; 문헌[Mouhat et al., Biochem J 385(Pt 1):95-104, 2005]; 국제 특허 출원 공개 WO2006/002850호). OsK1(알파-KTx3.7)은 Kv1.3, Kv1.1 및 Kv1.2 채널을 강력하게 차단하고, KCa3.1 채널을 보통으로 차단하는 것으로 보고되었다(문헌[Mouhat et al., Biochem J 385(Pt 1):95-104, 2005]). OdK2(알파-KTx3.11)는 Kv1.3은 차단하지만, Kv1.1, Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, 및 Kv1.6에 대한 활성은 갖지 않는 것으로 보고되었다(문헌[Abdel-Mottaleb et al., Toxicon 51:1424-30, 2008]; 문헌[Epub 2008 Mar 29]).
OsK1 및 ShK를 비롯한, 개선된 효력, 선택성 및/또는 반감기를 갖는 가공된 독소 펩티드가 보고되어 있다(국제 특허 출원 공개 WO2006/002850호; 국제 특허 출원 공개 WO2006/042151호; 국제 특허 출원 공개 WO2008/088422호, 국제 특허 출원 공개 WO2006/116156호).
낭창(lupus) 및 다발성 경화증과 같은 T-세포 매개 염증성 및 자가면역 질병과 같은 Kv1.3-매개 질병의 치료학적 치료를 위한 더 강력하고 선택적인 Kv1.3 차단제에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제를 제공하며, 본 길항제는
(i) 위치 10에서 글리신의 아이소류신으로의 치환(G10I)을 갖고, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가 치환을 갖는 서열 번호 1에 나타낸 서열; 또는
(ii) 서열 번호 1과 적어도 80%가 동일하고, G10I 치환을 추가로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 서열 번호 55 또는 86의 서열을 포함하는 Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩디드 길항제를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 길항제 또는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 길항제 또는 융합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 본 방법은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 발현된 길항제 또는 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 길항제 또는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 원치 않는 T 세포 활성화와 관련된 질환을 갖는 대상체에서 T 세포 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 T 세포 활성화를 억제하기에 유효한 양의 본 발명의 길항제 또는 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 천연 OdK2(서열 번호(SEQ ID NO) 1) 및 OsK1(서열 번호 2)(도면에는 OsK-1로 나타나 있음)의 아미노산 서열 정렬. 시스테인 잔기는 회색으로 강조되어 있다. 이황화물 가교 및 시스테인 쌍이 나타나 있다. OdK2와 OsK1 사이에 9개의 상이한 잔기가 검정색으로 강조되어 있다.
도 2는 Kv1.3 E3C 세포(검정색 실선), 10배 과량의 ShK의 존재 하에서의 Kv1.3 E3C 세포(회색 파선), 및 Kv1.5(음성 대조군 세포; 회색 점선)에 대한 a) KV1C2(Odk2-Fc 융합체) 및 b) KV1N2(OsK1-Fc 융합체)의 결합. 결합은 유세포측정(flow cytometry)을 사용하여 항-인간 Fc-Cy5에 의해 검출하였다. 데이터는 기하 평균 형광 강도(Geometric mean fluorescence intensity, GMFI)의 히스토그램 중첩으로서 나타나 있다(문헌[Geom. Mean, Red A: Cy5]).
도 3은 KV1C2(OdK2-Fc 융합체)(▼)에 의한 기억 T 세포 증식의 억제. 각각의 데이터 포인트는 3회 반복된 반응의 평균 ± SD이다. 음성 대조군 IgG4 Fc(○)는 T-세포 증식을 억제하지 않았다.
도 4는 Kv1.3 및 Kv1.1을 발현하는 세포들을 사용한 결합 검정 및 탈륨 플럭스 검정(thallium flux assay)에서 결정된 펩티드 변이체 융합 단백질들의 a) 아미노산 서열, b) 활성 및 선택성.
도 5는 a) 단일 100 nM 농도의 정제된 Odk2 키메라 Fc 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화의 억제. KV1B03(■)은 KV1C2(OdK2 Fc 융합체)(□)와 동일하다. b) KV1D261에 의한 T 세포 활성화의 농도 의존성 억제. 음성 대조군 IgG4 Fc는 T-세포 IL-2 생산을 억제하지 않았다. c) 선택된 변이체들에 있어서의 Kv1.3 E3C 세포에 대한 결합과 T-세포 억제 사이의 상관 관계.
도 6은 p261 C-말단 연장부 HSA 융합 단백질 라이브러리의 활성. C-말단 연장부의 아미노산 서열 및 그 결과 생성된 연장된 p261 아미노산 서열이, 결합 검정 및 탈륨 플럭스 검정에서의 활성과 함께 나타나 있다.
도 7은 a) p261 b) p579 C-말단 연장부 HSA 융합 단백질의 특성화.
도 8은 선택된 OdK2 변이체 융합 단백질의 특성.
도 9는 미니피그에서의 KV1D261_34의 약동학.
도 10은 미니피그에서의 KV1D261_34의 생체내 투여 후의 림프구로부터의 IL-17A 분비의 생체외 억제
도 11은 지연형 과민증(DTH) 미니피그 모델에서의 항원 시험투여 후 10일째에 배출 림프절(draining lymph node)로부터의 세포수.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 개시되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥에서 명확하게 다르게 기술되지 않으면 복수형의 언급을 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 그와 등가인 임의의 조성물 및 방법이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예시적인 조성물 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
용어 "폴리펩티드"는 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 약 80개 미만의 아미노산의 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 "단백질"로 지칭될 수도 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 기타 등가의 공유 결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
용어 "상보성 서열"은 단리된 제1 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 역평행하고 제1 폴리뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있는 또는 그러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체(hybrid)일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형 OdK2" 또는 "OdK2" 또는 "천연 OdK2"는 서열 번호 1(GVPTDVKCRGSPQCIQPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK)에 나타낸 서열을 갖는 전갈 오돈토부투스 도리아이 OdK2 폴리펩티드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형 OsK1" 또는 "OsK1" 또는 "천연 OsK1"은 서열 번호 2(GVIINVKCKISRQCLEPCKKAGMRFGKCMNGKCHCTPK)에 나타낸 서열을 갖는 전갈 오르토키루스 스크로비큘로수스 OsK1 폴리펩티드를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체" 또는 "OdK2 변이체"는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 하나 이상의 변형(modification), 예를 들어 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 서열 번호 1의 야생형 OdK2 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, OdK2 변이체의 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 따른다. 예를 들어, 본 명세서에서의 "G10"은 서열 번호 1의 위치 10에서의 글리신 잔기를 지칭한다. 따라서, OdK2 G10I는 위치 10에서의 글리신이 아이소류신으로 치환된 OdK2 변이체를 지칭하고, OdK2 G10I,P12R은 위치 10에서의 글리신이 아이소류신으로 치환되고, 위치 12에서의 프롤린이 아르기닌으로 치환된 OdK2 변이체를 지칭한다.
주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링은, 임의의 주어진 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치가, 서열 내의 성분의 실제의 수치상의 위치라기보다는 오히려, 선택된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 동일한 또는 등가의 위치를 참고하여 지정될 때, 선택된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링에 "상응"하거나 또는 그와 "관련"된다. 따라서, 예를 들어, 주어진 폴리펩티드 서열 내의 주어진 아미노산 위치의 넘버링은 기준 서열로서 사용된 선택된 폴리펩티드 서열 내의 동일한 또는 등가의 아미노산 위치에 상응한다.
"등가의 위치"(예를 들어, "등가의 아미노산 위치" 또는 "등가의 핵산 위치" 또는 "등가의 잔기 위치")는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 기준 폴리펩티드(또는 기준 폴리뉴클레오티드) 서열의 상응하는 위치와 정렬된 시험 폴리펩티드(또는 시험 폴리뉴클레오티드) 서열의 위치(예컨대, 아미노산 위치 또는 핵산 위치 또는 잔기 위치)로서 본 명세서에서 정의된다. 시험 폴리펩티드의 등가의 아미노산 위치는 기준 폴리펩티드의 상응하는 위치와 동일한 수치상의 위치 번호를 가질 필요는 없으며; 마찬가지로 시험 폴리뉴클레오티드의 등가의 핵산 위치는 기준 폴리뉴클레오티드의 상응하는 위치와 동일한 수치상의 위치 번호를 가질 필요는 없다.
2개의 폴리펩티드 서열은, 규정된 파라미터들, 즉 규정된 아미노산 치환 행렬, 갭 존재 페널티(gap existence penalty)(갭 개방 페널티(gap open penalty)라고도 함), 및 갭 확장 페널티(gap extension penalty)를 사용하여, 그러한 쌍의 서열들에 대해 가능한 최고 유사성 점수(similarity score)에 도달하도록 이들이 정렬될 때, "최적으로 정렬된다". BLOSUM62 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915-10919])이 폴리펩티드 서열 정렬 알고리즘(예컨대, BLASTP)에서 기준 평점 치환 행렬(default scoring substitution matrix)로서 종종 사용된다. 갭 존재 페널티는 정렬된 서열들 중 하나의 서열 내에의 단일 아미노산 갭의 도입에 대해 부과되고, 갭 확장 페널티는 갭 내의 각각의 잔기 위치에 대해 부과된다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 정렬 파라미터는 다음과 같다: BLOSUM62 평점 행렬, 갭 존재 페널티 = 11, 및 갭 확장 페널티 = 1. 정렬 점수는, 정렬이 시작되고 종료되는 각각의 서열의 아미노산 위치들(예를 들어, 정렬 창(alignment window))에 의해, 그리고 선택적으로 하나의 또는 둘 모두의 서열 내로의 하나 또는 다수의 갭의 삽입에 의해, 최고의 가능한 유사성 점수에 도달하도록 규정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Kv1.3"(KCNA3, HPCN3, HGK5, HuKIII, 또는 HLK3으로도 알려짐)은 유니프로트(UniProt) 기탁 번호 P22001 및 서열 번호 418에 나타낸 서열을 갖는 잘 알려진 인간 칼륨 전압-개폐형 채널 서브패밀리 A 구성원 3을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Kv1.3의 길항제" 또는 "길항제"는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 Kv1.3 기능을 억제하거나 차단하는 본 발명의 OdK2 변이체 또는 OdK2 변이체 융합 단백질을 지칭한다. 야생형 OdK2의 아미노산 서열이 서열 번호 1에 나타나 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "융합 단백질"은 하나 초과의 모(parental) 폴리펩티드 또는 펩티드로부터 유도된 폴리펩티드 또는 펩티드 성분들을 포함하는 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "반감기 연장 모이어티"는, OdK2 변이체에 접합될 때, 생성되는 OdK2 변이체 융합 단백질의 생체내 반감기를, 유리(free) 펩티드와 비교할 때, 증가시키는 분자 또는 단백질 또는 도메인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "%결합률" 또는 "결합률(%)"은, 대조군과 비교할 때 OdK2 변이체 융합 단백질에 대한 기하 평균 형광 강도(Geo. MFI 또는 GMFI)의 비를 지칭하며, 이는 Kv1.3 또는 Kv1.1 채널을 발현하는 세포들을 사용한 FACS 검정으로부터 얻어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 선택성"은 Kv1.3에 대해 얻어진 결합률(%) 대 Kv1.1에 대해 얻어진 결합률(%)의 비를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "선택적" 또는 "선택성"은 OdK2 변이체 융합 단백질 또는 OdK2 변이체에 있어서의 Kv1.1에 대한 IC50 값 대 Kv1.3에 대한 IC50 값의 비를 지칭한다. 선택성은 다양한 방법, 예를 들어 본 명세서에 사용된 바와 같은 탈륨 플럭스 검정 또는 전기생리학적 패치 클램프 검정(electrophysiological patch clamp assay)을 사용하여 평가될 수 있다. 선택성은, 측정을 위해 선택된 검정에 따라 약간 변동될 수 있다.
Kv1.3 차단 펩티드인 Odk2(서열 번호 1) 및 Osk1(서열 번호 2)은 9개의 위치에서 아미노산 서열이 상이한 α-KTx3 전갈 독소 패밀리의 구성원이다. OdK2 및 Osk1 둘 모두는 38개의 아미노산 길이이며, 각각 Cys8-Cys28 사이, Cys14-Cys33 사이, 및 Cys18-Cys35 사이에 쌍 형성을 갖는 3개의 이황화물 결합에 의해 안정화된다(문헌[Abdel-Mottaleb et al., Toxicon 51:1424-30, 2008]; 문헌[Mouhat et al., Biochem J. 385(Pt 1):95-104, 2005]; 국제 특허 출원 공개 WO2006/002850호 참조). 접힌 펩티드들은 이황화물 결합에 의해 3 가닥 역평행 β-시트에 근접하여 유지된 α-나선을 형성한다. OdK2 및 OsK1은, 구멍 영역의 외부 연결부(vestibule)에 결합하고, 물 충전된 구멍 내로 라이신 27을 삽입하고, 이온 유동을 폐색함으로써 채널 기능을 억제하는 구멍 차단제이다. OsK1(알파-KTx3.7)은 Kv1.3, Kv1.1 및 Kv1.2 채널을 강력하게 차단하고, KCa3.1 채널을 보통으로 차단하는 것으로 보고되어 있는데, 이때 IC50은 각각 0.014 nM, 0.6 nM, 5.4 nM, 및 225 nM이다(문헌[Mouhat et al., Biochem J 385(Pt 1):95-104, 2005]). OdK2(알파-KTx3.11)는 7.2 nM의 IC50으로 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 난모세포에서 Kv1.3을 차단하는 것으로 보고되어 있으며, 시험된 다른 Kv1.x 아형들(Kv1.1, Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, 및 Kv1.6)에 대해서는 활성을 갖지 않는 것으로 보고되어 있다(문헌[Abdel-Mottaleb et al., Toxicon 51:1424-30, 2008]). 이들 데이터는, OsK1은 매우 강력하지만 충분한 아형 선택성이 결여되어 있으며, 반면 OdK2는 선택적인 것으로 보이지만 그다지 강력하지 않은 것으로 보인다는 것을 나타낸다.
본 발명은 Kv1.3을 억제하는 단리된 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질은, 유지 및/또는 향상된 선택성을 가지면서, 모 분자와 비교할 때 Kv1.3에 대해 더 강력하다. 본 발명의 폴리펩티드는 Kv1.3 활성으로부터 기인되는 칼륨 전류, 탈륨 플럭스 및/또는 T 세포 활성화를 억제하며, 이에 따라, 활성화된 T 세포와 관련된 다양한 질환, 예컨대 염증성 및 자가면역 질병의 치료에 유용할 수 있다.
길항제 펩티드
본 발명은 Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제를 제공하며, 본 길항제는
(i) 위치 10에서 글리신의 아이소류신으로의 치환(G10I)을 갖고, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가 치환을 갖는 서열 번호 1에 나타낸 서열; 또는
(ii) 서열 번호 1과 적어도 80%가 동일하고, G10I 치환을 추가로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 단리된 펩티드 길항제는 서열 번호 1과 관련하여 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 펩티드 길항제는 서열 번호 1과 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 110 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다. 치환 G10I는 Kv1.3에 대한 개선된 선택성 및/또는 개선된 친화성과 관련된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, Kv1.3의 길항제는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 426)를 포함하며; 여기서,
a) Xaa1은 I 또는 T, Q 또는 E이고;
b) Xaa2는 N 또는 D이고;
c) Xaa3은 K 또는 R, E, A 또는 Q이고;
d) Xaa4는 I, E, L, D, Q, H, V, K 또는 A이고;
e) Xaa5는 E K, L, Q, D, V 또는 H이고;
Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는다. 예를 들어, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 13, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 34, 38, 39, 42-46, 49, 51, 59, 63, 65, 69, 71, 73, 76, 78, 81-83, 85, 87, 89, 92, 96, 101, 103, 104 및 108의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, Kv1.3의 길항제는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 427)를 포함하며; 여기서,
Xaa1은 I 또는 T이고;
Xaa2는 N 또는 D이고;
Xaa3은 K 또는 R이고;
Xaa4는 I 또는 E이고;
Xaa5는 E 또는 K이고;
Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는다. 예를 들어, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
도 4a를 참고하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드 길항제는 C8-C28 사이, C14-C33 사이 및 C18-C35 사이에 천연 이황화물 가교를 유지한다. 이 부문 및 어딘가 다른 곳에 기재된 본 발명의 예시적인 길항제는 Kv1.1에 대비하여 Kv1.3에 대한 사실상 향상된 선택성, 예를 들어 서열 번호 1과 비교하여 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 또는 적어도 7000배 개선된 선택성을 가질 수 있다.
융합 단백질
본 발명의 길항제는 본 발명의 길항제 펩티드를 포함하는 단리된 융합 단백질일 수 있다. 본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 서열 번호 1과 관련하여 치환 G10I를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 반감기 연장 모이어티에 접합된 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하며, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 1에 나타낸 서열을 포함하고, G10I의 치환을 추가로 포함하고, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가 치환을 갖는다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 반감기 연장 모이어티에 접합된 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하며, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고, 잔기 위치 10에서 글리신의 아이소류신으로의 치환(G10I)을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 반감기 연장 모이어티에 접합된 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하며, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 426)를 포함하며; 여기서,
Xaa1은 I 또는 T, Q 또는 E이고;
Xaa2는 N 또는 D이고;
Xaa3은 K 또는 R, E, A 또는 Q이고;
Xaa4는 I, E, L, D, Q, H, V, K 또는 A이고;
Xaa5는 E K, L, Q, D, V 또는 H이고;
Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 13, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 34, 38, 39, 42-46, 49, 51, 59, 63, 65, 69, 71, 73, 76, 78, 81-83, 85, 87, 89, 92, 96, 101, 103, 104 및 108의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 길항제는 반감기 연장 모이어티에 접합된 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하는 단리된 융합 단백질이며, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 427)를 포함하며; 여기서,
Xaa1은 I 또는 T이고;
Xaa2는 N 또는 D이고;
Xaa3은 K 또는 R이고;
Xaa4는 I 또는 E이고;
Xaa5는 E 또는 K이고;
Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, C-말단 연장부는 서열 번호 123-268의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, C-말단 연장부는 서열 번호 128, 143, 155, 188, 206-210, 212, 214, 216, 219, 223, 224, 227, 230, 232 -235, 237, 239, 240, 243, 252, 261-263, 또는 268의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 OdK2 변이체 융합 단백질은 천연 OdK2 서열의 융합 단백질, 예컨대 서열 번호 425의 KV1C2(모 KV1C2 융합 단백질)와 비교할 때 더 강력하고 선택적이다. 본 발명의 예시적인 융합 단백질은 링커(linker) AS(AP)20GS(서열 번호 116)를 통해 인간 혈청 알부민(HSA)에 접합된 서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 OdK2 변이체 펩티드를 포함하는 것들이다.
모 KV1C2 융합 단백질은 인간 Kv1.3으로 형질감염된 CHO 세포들에서의 전세포(whole cell) 패치 클램프 연구에서 칼륨 전류를 억제하는 데 약 13 nM(1.3×10-8 M)의 IC50을 갖고, FLIPR® 테트라(Tetra) 기기(몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 Kv1.3을 발현하는 세포들에서 탈륨 플럭스를 억제하는 데 약 21.4 nM(2.14×10-8 M)의 IC50 값을 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 OdK2 변이체 융합 단백질은, 재료 및 방법에 기재된 패치 클램프 검정에서의 IC50 값이 약 13 nM(1.3×10-8 M) 이하, 예를 들어 1.0×10-8 M, 5.0×10-9 M, 1.0 ×10-9 M, 5.0 ×10-10 M, 1.0 ×10-10 M, 5.0 ×10-11 M, 1.0 ×10-11 M, 5.0 ×10-12 M, 1.0 ×10-12 M 이하일 때, 또는 재료 및 방법에 기재된 탈륨 플럭스 검정에서의 IC50 값이 약 21.4 nM(2.14×10-8 M) 이하, 예를 들어 1.0×10-8 M, 5.0×10-9 M, 1.0 ×10-9 M, 5.0 ×10-10 M, 1.0 ×10-10 M, 5.0 ×10-11 M, 1.0 ×10-11 M, 5.0 ×10-12 M, 1.0 ×10-12 M 이하일 때, "동일하게 강력하거나 더 강력한" Kv1.3 억제제이다. 예시적인 융합 단백질들에 대한 패치 클램프 및 탈륨 플럭스에 대한 IC50 값이 도 8에 나타나 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질은 Kv1.3에 대해 선택적이다. 선택성은 OdK2 변이체 융합 단백질 또는 OdK2 변이체에 있어서의 Kv1.1에 대한 IC50 값 대 Kv1.3에 대한 IC50 값의 비를 사용하여 Kv1.1에 대비하여 평가될 수 있다. 선택성은 표준 방법들을 사용하여 다른 Kv 채널들, 예컨대 Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5에 대비하여, 그리고 hERG, KCa3.1, 또는 Nav1.5에 대비하여 추가로 시험될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 예시적인 OdK2 변이체 융합 단백질은 Kv1.1에 대비하여 Kv1.3에 대한 사실상의 선택성, 예를 들어 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 또는 적어도 7000배의 선택성을 가질 수 있다. 모 KV1C2 융합 단백질은, 인간 Kv1.1과 비교할 때, 인간 Kv1.3에 대해 68배 더 선택적이며, 이에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 예시적인 OdK2 변이체 융합 단백질은, KV1C2 융합 단백질과 비교할 때, 사실상 향상된 선택성, 예를 들어 약 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 적어도 105배의 개선된 선택성을 가질 수 있다. 서열 번호 426에서의 Xaa5에 상응하는 위치에서의 글루탐산의 존재는 선택성을 개선하는 것으로 관찰되었다.
생성되는 변이체 및 그의 융합 단백질의 효력 및 선택성 둘 모두를 개선하기 위하여, 천연 OdK2에서 잔기 위치 4, 5, 9, 15 및 16(서열 번호 1의 천연 OdK2 펩티드에 따른 잔기 넘버링)이 치환될 수 있다. 이들 잔기 위치는, 생성되는 OdK2 변이체 또는 그의 융합 단백질이, 상기 전세포 패치 클램프 검정 또는 탈륨 플럭스 검정에서 각각 약 13 nM(1.3×10-8 M) 또는 21.4 nM(2.14×10-8) 또는 그 이하의 IC50을 유지하고, Kv1.1에 대비하여 Kv1.3에 대한 (전술된 바와 같은 패치 클램프를 사용하여 얻어진 IC50 값의 비로서 표현된) 선택성이 적어도 100인 한, 임의의 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 각각의 선택된 위치에서의 다양화(diversification)에 사용될 수 있는 아미노산 세트들은 위치 4에서의 아미노산 잔기 TIQE, 위치 5에서의 ND, 위치 9에서의 REAKQ, 위치 15에서의 ELDIQHVKA, 및 위치 16에서의 KELQDVH를 포함한다. 위치 15에서의 글루탐산(E)은 Kv1.3에 대한 증가된 선택성과 관련된다. 치환 G10I는 Kv1.3에 대한 개선된 선택성 및/또는 개선된 친화성과 관련된다(잔기 넘버링은 서열 번호 1에 따름). 전술된 아미노산 세트들을 사용한 OdK2 및 그의 융합 단백질의 다양화는, 천연 펩티드 또는 그의 융합 단백질과 비교할 때, Kv1.3에 대한 개선된 결합 친화성 및 개선된 결합 선택성을 나타내는 변이체를 생성하게 되었다. 다른 다양화 계획에서, 각각의 선택된 위치에서의 다양화에 사용될 수 있는 아미노산 세트들은 위치 4에서의 아미노산 잔기 IT, 위치 5에서의 ND, 위치 9에서의 KR, 위치 15에서의 IE, 및 위치 16에서의 EK를 포함한다. 생성된 변이체 및/또는 그의 융합 단백질은 잘 알려진 검정 및 본 명세서에 기재된 것을 사용하여 선택성, 효력, 결합 친화성 및 결합 선택성에 대해 평가될 수 있다. 개선된 효력 및 선택성을 갖는 예시적인 OdK2 변이체 및 그의 융합 단백질은 서열 번호 3, 22, 34 및 42의 변이체, 및 이들의 인간 혈청 알부민 또는 Fc 융합 단백질이다. 개선된 결합 친화성 및 결합 선택성(%)을 갖는 예시적인 OdK2 변이체는 서열 번호 3, 13, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 34, 38, 39, 42-46, 49, 51, 59, 63, 65, 69, 71, 73, 76, 78, 81-83, 85, 87, 89, 92, 96, 101, 103, 104 및 108의 변이체이다.
추가의 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질이 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 생성되는 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질이, 모 분자와 비교할 때, Kv1.3에 대해 유사한 선택성 및 효력을 유지하는 한, 천연 OdK2 펩티드에서 위치 4, 5, 9, 15 및 16 이외의 위치에 대해 치환이 이루어질 수 있다. 예시적인 변형은, 예를 들어 모 분자의 특성과 유사한 특성을 갖는 OdK2 변이체 융합 단백질을 생성하게 될 보존적 치환이다. 보존적 대체는 측쇄에서 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전자 코딩된 아미노산은 하기 4개의 패밀리로 나눌 수 있다: (1) 산성(아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘); (3) 비극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 및 (4) 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때로 방향족 아미노산으로 공동으로 분류된다. 대안적으로, 상기 아미노산 레퍼토리(repertoire)는 (1) 산성(아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성(라이신, 아르기닌 히스티딘), (3) 지방족(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌) - 이때, 세린 및 트레오닌은 별도로 지방족-하이드록실로서 선택적으로 분류함; (4) 방향족(페닐알라닌, 티로신, 트립토판); (5) 아미드(아스파라긴, 글루타민); 및 (6) 황-함유(시스테인 및 메티오닌)(문헌[Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981])으로서 분류될 수 있다. 천연 OdK2 펩티드에 대해 비보존적 치환이 이루어질 수 있는데, 비보존적 치환은 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질의 특성을 개선하기 위하여 상이한 아미노산 부류들 사이에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 폴리펩티드 또는 그의 단편의 아미노산 서열의 변화가 기능적 상동체를 생성하는지는 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 변형 폴리펩티드 또는 단편이 비변형 폴리펩티드 또는 단편과 유사한 방식으로 반응을 생성하는 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 하나 초과의 대체가 일어난 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 동일한 방식으로 용이하게 시험될 수 있다. 향상된 결합 또는 결합 특이성을 가져오는 치환을 갖는 예시적인 추가의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질은 서열 번호 4-12, 14-20, 23, 25, 27, 28, 31, 33, 35-37, 40, 41, 47, 48, 50, 52-58, 60-62, 64, 66-68, 70, 72, 74, 75, 77, 79, 80, 84, 86, 88, 90, 91, 93-95, 97-100, 102, 105-107, 109 및 110의 아미노산 서열을 갖는 것들이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 OdK2 변이체(즉, 본 발명에 따른 길항제)는 반감기 연장 모이어티에 융합되어 본 발명의 융합 단백질을 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 반감기 연장 모이어티는 잘 알려진 인간 혈청 알부민, 트랜스티레틴(TTR), 티록신-결합 글로불린(TGB), 알부민-결합 도메인, 또는 이들의 Fc 또는 단편을 포함한다. 생물학적으로 적합한 중합체 또는 공중합체가 또한 사용될 수 있는데, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예컨대 PEG5000 또는 PEG20000, 덱스트란, 폴리라이신, 상이한 쇄 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들어 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄이산, 테트라데칸이산, 옥타데칸이산, 도코산이산 등, 폴리라이신, 옥탄, 또는 탄수화물(덱스트란, 셀룰로스, 올리고당 또는 다당)이다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민, 알부민 결합 도메인(ADB), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민이다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 반감기 연장 모이어티는 링커를 통해 Kv1.3의 펩티드 길항제에 접합된다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 링커는 서열 번호 112-122의 아미노 서열을 포함한다.
반감기 연장 모이어티는 본 발명의 OdK2 변이체 펩티드 길항제에 직접 접합될 수 있거나, 또는 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있는 예시적인 펩티드 링커는 서열 번호 112-122의 아미노산 서열을 갖는 링커이다. 비-펩티드 반감기 연장 모이어티가 잘 알려진 화학적 커플링 방법을 사용하여 OdK2 변이체에 직접 접합될 수 있다. 예를 들어, OdK2 변이체는 알려진 방법 및 미국 특허 제8043829호에 기재된 방법들을 사용하여 페길화될(pegylated) 수 있다. 펩티드 또는 단백질 반감기 연장 모이어티는, 하기에 더 상세히 설명된 바와 같이, 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 번역 동안 펩티드에 연결될 수 있다.
반감기 연장 모이어티를 도입시킨 OdK2 변이체들은 몇몇 잘 알려진 검정에 의해 기능성에 대해 비교될 수 있다. 예를 들어, PEG 또는 인간 혈청 알부민에 커플링된 OdK2 변이체의 약동학적 특성은 잘 알려진 생체내 모델에서 평가될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 OdK2 변이체 융합 단백질은 Odk2 변이체의 C-말단에 4개의 아미노산의 C-말단 연장부를 도입시키도록 가공될 수 있는데, 이는 연장된 펩티드를 반감기 연장 모이어티에 접합하기 전에 행해진다. 어떠한 이론에 의해서도 구애되고자 함이 없이, 융합 단백질에서의 OdK2 변이체 펩티드의 C 말단의 연장은 Kv1.3 채널의 세포외 루프와 펩티드의 증가된 결합 상호작용 및 증가된 효력을 가능하게 할 것으로 여겨진다. C-말단 연장된 펩티드 부분을 갖는 예시적인 OdK2 융합 단백질이 도 6, 도 7a 및 도 8에 나타나 있다. C-말단 연장된 펩티드 부분을 갖는 융합 단백질은, 연장부가 없는 상응하는 융합 단백질과 비교할 때, 전형적으로 더 강력한 Kv1.3 억제제이다. 본 명세서에 기재된 예시적인 C-말단 연장된 변이체에 대한 IC50 값은, 하기에 기재된 탈륨 플럭스 검정에서 측정할 때, 약 1×10-8 M 이하, 예를 들어 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-12 M 이하일 수 있다. 예시적인 C-말단 연장부는 서열 번호 123-268에 나타낸 것들이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은
서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 Kv1.3의 펩티드 길항제;
선택적으로 서열 번호 128, 143, 155, 188, 206- 210, 212, 214, 216, 219, 223, 224, 227, 230, 232, 235, 237, 239, 240, 243, 252, 261-263, 또는 268의 C-말단 연장부;
서열 번호 116 또는 서열 번호119의 링커; 및
반감기 연장 모이어티로서의 인간 혈청 알부민을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은
서열 번호 42의 Kv1.3의 펩티드 길항제;
서열 번호 116의 링커; 및
반감기 연장 모이어티로서의 인간 혈청 알부민을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은
서열 번호 42의 Kv1.3의 펩티드 길항제;
C-말단 연장부 서열 번호 209;
서열 번호 116의 링커; 및
반감기 연장 모이어티로서의 인간 혈청 알부민을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은
서열 번호 3의 Kv1.3의 펩티드 길항제;
서열 번호 235의 C-말단 연장부;
서열 번호 116의 링커; 및
반감기 연장 모이어티로서의 인간 혈청 알부민을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 융합 단백질은
서열 번호 42의 Kv1.3의 펩티드 길항제;
서열 번호 235의 C-말단 연장부;
서열 번호 116의 링커; 및
반감기 연장 모이어티로서의 인간 혈청 알부민을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 단리된 융합 단백질은, Kv1.1 및 Kv1.3으로 각각 형질감염된 세포들에서의 패치 클램프 검정에서 Kv1.1에 대한 단리된 융합 단백질의 IC50 값 대 Kv1.3에 대한 단리된 융합 단백질의 IC50 값의 비로서 선택성이 측정될 때, 인간 Kv1.1에 대해서보다 인간 Kv1.3에 대해서 적어도 100배 더 선택적이다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 단리된 융합 단백질은, 인간 Kv1.3으로 형질감염된 세포들에서의 패치 클램프 검정에서 서열 번호 425의 모 KV1C2 융합 단백질에 대한 IC50 값보다 적어도 약 10배 더 적은 IC50 값으로 칼륨 전류를 억제한다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 단리된 융합 단백질은, 인간 Kv1.3으로 형질감염된 세포들에서의 패치 클램프 검정에서 약 1.5×10-8 M 이하의 IC50 값으로 칼륨 전류를 억제한다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 단리된 융합 단백질은, 인간 Kv1.3으로 형질감염된 세포들에서 약 2.2×10-8 M 이하의 IC50 값으로 시험관내 탈륨 플럭스를 억제한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 링커를 통해 반감기 연장 모이어티에 접합된 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하는 단리된 융합 단백질이며, Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 가지며, 여기서
Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3-110의 아미노산 서열을 포함하고;
C-말단 연장부는 서열 번호 123-268의 아미노산 서열을 포함하고;
링커는 서열 번호 116 또는 119의 아미노산 서열을 포함하고;
반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 426)를 포함하는 Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제이며; 여기서,
Xaa1은 I 또는 T, Q 또는 E이고;
Xaa2는 N 또는 D이고;
Xaa3은 K 또는 R, E, A 또는 Q이고;
Xaa4는 I, E, L, D, Q, H, V, K 또는 A이고;
Xaa5는 E K, L, Q, D, V 또는 H이고;
Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는다.
다른 실시 형태에서, Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 13, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 34, 38, 39, 42-46, 49, 51, 59, 63, 65, 69, 71, 73, 76, 78, 81-83, 85, 87, 89, 92, 96, 101, 103, 104 및 108의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 427)를 포함하는 Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제이며; 여기서,
Xaa1은 I 또는 T이고;
Xaa2는 N 또는 D이고;
Xaa3은 K 또는 R이고;
Xaa4는 I 또는 E이고;
Xaa5는 E 또는 K이고;
Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는다.
다른 실시 형태에서, Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 3-110의 서열을 포함하는 Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제이다.
본 발명의 OdK2 변이체 폴리펩티드 및 그의 융합 단백질은 자동화 펩티드 합성기 상에서 화학적 합성, 예컨대 고상(solid phase) 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 무세포 발현 시스템, 예컨대 망상 적혈구 용해물(lysate) 기반 발현 시스템의 사용에 의해, 또는 표준 재조합 발현 시스템에 의해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 얻어질 수 있다. 당업자라면 본 발명의 폴리펩티드를 얻는 다른 기술을 인지할 것이다.
OdK2 변이체의 생성은 전형적으로 핵산 수준으로 달성된다. 폴리뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드를 축퇴시켜 원하는 변이체를 생성하는 것을 이용하는, 미국 특허 제6521427호 및 제6670127호에 기재된 방법들에 따른 화학적 유전자 합성을 사용하거나, 또는 표준 PCR 클로닝 및 돌연변이생성(mutagenesis)에 의해 합성될 수 있다. OdK2 변이체들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 발현용 벡터 내로 클로닝하는 표준 클로닝 기법에 의해 변이체들의 라이브러리가 생성될 수 있다.
OdK2 변이체 융합 단백질은 전형적으로 표준 분자 생물학 접근에 의해 제조된다.
OdK2 변이체 및 그의 융합 단백질은, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, Kv1.3을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험된다. 예시적인 검정은, FLIPR® 테트라 기기(몰레큘러 디바이시스)를 사용하여 Kv1.3을 과발현하는 세포들에서 세포들 내로의 탈륨 유입의 억제를 측정하는 검정이다. 다른 예시적인 검정은, 본 명세서에 기재되고 잘 알려진 패치 클램프 기법을 사용하여 세포막을 가로지르는 이온 플럭스를 측정하기 위해 전기생리학적 기록을 사용한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 비-코딩 서열, 예를 들어 전사되었지만 번역되지 않은 서열, 종료 신호, 리보솜 결합 부위, mRNA 안정화 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 추가의 아미노산을 코딩하는 추가의 서열을 또한 포함할 수 있다. 이들 추가의 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 마커, 또는 융합 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 잘 알려진 태그 서열, 예컨대 헥사-히스티딘 또는 HA 태그를 코딩할 수 있다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되어 있지만, 주어진 발현 시스템 내에서 유전자 코드의 축퇴성 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 길항제를 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 429-430에 나타낸 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 OdK2 변이체 및 그의 융합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 본 발명의 벡터는 재구성된 생물 시스템을 비롯한 생물 시스템에서 본 발명의 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 유도, 폴리뉴클레오티드의 복제, 또는 폴리뉴클레오티드의 유지에 유용하다. 벡터는 염색체로부터 유래된 것, 에피좀으로부터 유래된 것 및 바이러스로부터 유래된 것, 예를 들어 세균 플라스미드, 박테리오파지(bacteriophage), 트랜스포손(transposon), 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 배큘로바이러스(baculovirus), 파포바 바이러스(papova virus), 예를 들어 SV40, 우두 바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus), 계두 바이러스(fowl pox virus), 가성광견병 바이러스(pseudorabies virus), 피코르나바이러스(picornavirus) 및 레트로바이러스(retrovirus)로부터 유래된 벡터 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어 코스미드 및 파지미드일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 전형적으로 발현 벡터는 그러한 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 제어하거나, 조절하거나, 야기하거나, 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함한다. 그러한 요소는 전사 인핸서(enhancer) 결합 부위, RNA 폴리머라제 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 코딩된 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 기타 부위를 포함할 수 있다. 그러한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려진 세포 기반 시스템 또는 무세포 시스템일 수 있다. 코딩된 폴리펩티드의 발현에서의 사용에 적합한 핵산 서열 요소 및 모 벡터(parent vector) 서열이 또한 잘 알려져 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 유용한 예시적인 플라스미드-유래 발현 벡터는 E. 콜라이(E. coli) 복제 기점, 암피실린 내성(Amp) 유전자, CMV 프로모터, 신호 서열, 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포이다. 예시적인 숙주 세포에는 고세균(Archaea) 세포; 세균 세포, 예컨대 연쇄상구균(Streptococci), 포도상구균(Staphylococci), 장구균(Enterococci), E. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 시아노박테리아(cyanobacteria), B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 S. 아우레우스(S. aureus); 진균 세포, 예컨대 클루베로마이세스(Kluveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 바시도마이세테(Basidomycete), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 아스페르길루스(Aspergillus); 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, CV-1, 보우스(Bowes) 흑색종 및 골수종; 및 식물 세포, 예컨대 겉씨식물 또는 속씨식물 세포가 포함된다. 본 발명의 방법에서의 숙주 세포는 개별 세포, 또는 세포 집단으로서 제공될 수 있다. 세포 집단은 조직과 같이 매트릭스에 존재하는 세포 또는 단리된 또는 배양된 세포 집단을 포함할 수 있다.
숙주 세포 내로의 벡터와 같은 폴리뉴클레오티드의 도입은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 미세주입, 양이온성 지질-매개 형질감염 및 전기천공을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 단리된 융합 단백질의 생산 방법이며, 본 방법은 적어도 하나의 odK2 변이체 융합 단백질을 발현시키기에 충분한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
숙주 세포는 주어진 숙주 세포 유형의 유지 또는 번식에 적합한 그리고 폴리펩티드의 발현에 충분한 임의의 조건 하에서 배양될 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 충분한 관련된 방법, 배지, 및 배양 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 많은 포유류 세포 유형은 적절하게 완충된 DMEM 배지를 사용하여 37℃에서 호기성 배양될 수 있는 반면, 세균, 효모 및 기타 세포 유형은 LB 배지에서 적절한 분위기의 조건 하에서 37℃에서 배양될 수 있다.
본 발명의 방법에서, OdK2 변이체의 발현은 다양한 잘 알려진 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 발현은 검출 시약, 예컨대 항체를 사용하여, 예를 들어 FACS 또는 면역형광 기법을 이용하여, 또는 SDS-PAGE 또는 HPLC를 이용하여 확인될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 다른 태양은 생물학적 조직에서 Kv1.3의 활성을 조절하는 방법이며, 본 방법은 Kv1.3을 발현하는 생물학적 조직을 Kv1.3을 조절하는 양의 본 발명의 OdK2 변이체 또는 그의 융합 단백질, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 OdK2 변이체 및 OdK2 변이체 융합 단백질은 Kv1.3-매개 질병, 예컨대 염증성 및 자가면역 질병, 당뇨병, 비만증 또는 암의 증상을 치료, 감소 또는 경감시킬 것이 요구되는 임의의 요법에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 그러한 동물의 예에는 포유동물, 예컨대 인간, 설치류, 개, 고양이, 동물원의 동물 및 가축이 포함된다.
본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질은 Kv1.3 매개 질환, 예컨대 염증성 질환, 알러지 및 알러지성 질환, 과민증 반응, 자가면역 질병, 중증 감염, 및 기관 또는 조직 이식 거부의 예방 및 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질은 또한 그러한 치료를 위한 약제의 제조에 유용하며, 여기서 약제는 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하도록 제조된다.
본 발명의 일 실시 형태는 원치 않는 T 세포 활성화와 관련된 질환을 갖는 대상체에서 T 세포 활성화를 억제하는 방법이며, 본 방법은 T 세포 활성화를 억제하기에 유효한 양의 본 발명의 단리된 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
T 세포 활성화는 잘 알려진 방법에 의해, 예컨대 T 세포에 의한 IL-2 생산의 감소를 측정함으로써 측정될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "T 세포 활성화를 억제한다는 것"은 본 발명의 OdK2 변이체 및 OdK2 융합 단백질이 T 세포 활성화를 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%로 억제하고 감소시키는 능력을 지칭한다.
다른 실시 형태에서, 원치 않는 T 세포 활성화와 관련된 질환은 염증성 질환, 면역 및 증식성 장애, 류마티스성 관절염(RA), 강직성 척추염, 건선성 관절염, 골관절염, 골다공증, 포도막염, 염증성 섬유증, 피부경화증, 폐섬유증, 경변증(cirrhosis), 염증성 장 질병, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 결장염, 천식, 알러지성 천식, 알러지, 만성 폐색성 폐 질병(COPD), 다발성 경화증, 건선, 접촉-매개 피부염, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 다른 형태의 낭창, 당뇨병, I형 당뇨병, 비만증, 암, 낭창, 재협착, 전신성 경화증, 피부경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 염증성 골 흡수, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질병(graft-versus-host disease)이다.
Kv1.3 채널은 T 세포 및 B 세포의 모든 하위세트 상에서 발현되지만, 효과기 기억 T 세포 및 클래스-전환(class-switched) 기억 B 세포가 특히 Kv1.3에 의존적이다(문헌[Wulff et al., J Immunol 173:776, 2004]). Kv1.3은 새로 발병한 1형 당뇨병(new onset type 1 diabete)을 가진 환자로부터의 Gad5/인슐린-특이적 T 세포에서, MS 환자로부터의 수초-특이적 T 세포에서, 그리고 류마티스성 관절염 환자의 활막으로부터의 T 세포에서(문헌[Beeton et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:17414-9, 2006]), 유방암 검체(문헌[Abdul et al., Anticancer Res 23:3347, 2003]) 및 전립선암 세포주(문헌[Fraser et al., Pflugers Arch 446:559, 2003])에서 과발현된다. Kv1.3 차단제를 갖는 동물 모델에서의 양성 결과가 하기 모델에서 기술되어 왔다: 오브알부민 및 파상풍 톡소이드에 대한 과민증 모델(문헌[Beeton et al., Mol Pharmacol 67:1369, 2005]; 문헌[Koo et al., Clin Immunol 197:99, 1999]), 래트 입양-전달 실험적 자가면역 뇌척수염(adoptive-transfer experimental autoimmune encephalomyelitis, AT-EAE) 모델과 같은 다발성 경화증에 대한 모델(문헌[Beeton et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:17414-9, 2006]), 염증성 골 흡수 모델(문헌[Valverde et al., J Bone Mineral Res 19:155, 2004]), 관절염에 대한 모델(문헌[Beeton et al., Proc Natl Acad Sci 103: 17414, 2006]; 문헌[Tarcha et al., J Pharmacol Exper Therap 342: 642, 2012]), 그리고 비만증, 당뇨병 및 대사성 질병에 대한 모델(문헌[Xu et al., Hum Mol Genet 12:551, 2003]; 문헌[Xu et al., Proc Natl Acad Sci 101: 3112, 2004]).
본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질로 치료될 수 있는 예시적인 Kv1.3 매개 질환은 염증성 질환, 면역 및 증식성 장애, 예컨대 류마티스성 관절염(RA), 강직성 척추염, 건선성 관절염, 골관절염, 골다공증, 포도막염, 염증성 섬유증(예를 들어, 피부경화증, 폐섬유증, 및 경변증), 염증성 장 장애(예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염 및 염증성 장 질병), 천식(알러지성 천식을 포함함), 알러지, COPD, 다발성 경화증, 건선, 접촉-매개 피부염, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 다른 형태의 낭창, 당뇨병, I형 당뇨병, 비만증 및 암, 낭창, 재협착, 전신성 경화증, 피부경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군, 염증성 골 흡수, 이식 거부, 및 이식편-대-숙주 질병이다.
특정 질병의 동물 모델에 대한 본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질의 투여는, 증상을 개선하고 질병의 과정을 변경시키기 위한 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질의 용도를 평가하는 데 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 동물 모델은 잘 알려져 있으며, 전술된 모델 및 하기와 같은 모델을 포함한다: 콜라겐-유도 관절염(CIA) 모델, 식이-유도 비만증 모델, 2,4,6-트라이니트로베네설폰산/에탄올(TNBS)-유도 결장염 모델 또는 옥사잘론 모델 - 이는 결장에서 만성 염증 및 궤양을 유도함(문헌[Neurath et al., Intern Rev Immunol 19:51-62, 2000]), RAG 또는 SCID 마우스에 대한 나이브(
Figure pct00001
) CD45RBhigh CD4 T 세포의 입양 전달 모델 - 공여체 나이브 T 세포는 수용체 장(gut)을 공격하여 인간 염증성 장 질병과 유사한 만성 장 염증 및 증상을 야기시킴(문헌[Read and Powrie, Curr Protoc Immunol Chapter 15 unit 15.13, 2001]), 오브알부민 시험투여 모델 및 메타콜린 감작 모델(문헌[Hessel et al., Eur J Pharmacol 293:401-12, 1995]).
약제학적 조성물
Kv1.3 활성의 억제가 요망되는 질환의 치료에 유효한 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질의 "치료학적 유효량"은 표준 연구 기법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 낭창, 다발성 경화증 또는 건선과 같은 염증성 질환 또는 자가면역 질병의 치료에 유효할 작용제의 투여량은 본 명세서에 기재된 모델과 같은 관련있는 동물 모델에게 작용제를 투여함으로써 결정될 수 있다.
게다가, 시험관내 검정을 선택적으로 사용하여, 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 도울 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은, 몇몇 인자의 고려에 기초하여, 당업자에 의해 (예를 들어, 임상 시험을 통해) 결정될 수 있다. 그러한 인자는 치료 또는 예방하고자 하는 질병, 수반되는 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 도출된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본 발명의 OdK2 펩티드 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질의 치료학적 용도를 위한 투여 방식은 숙주에게 변이체를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 이들 변이체의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하 또는 비강내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 변이체를 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 종래의 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 적어도 약 1 중량% 내지 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 그의 융합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거 용액 및 약 1 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 길항제를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실제의 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 OdK2 변이체 및/또는 OdK2 변이체 융합 단백질은 저장을 위해 동결건조되고 사용하기 전에 적합한 담체 중에서 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
재료 및 방법
Kv 채널 발현 작제물 및 세포주. 다양한 Kv 채널 및 키메라 작제물을 코딩하는 cDNA를 일상적 방법을 사용하여 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 클로닝되고 발현된 cDNA는 하기를 코딩하는 것들이었다: 인간 Kv1.3(hKv1.3)(서열 번호 418), 인간 Kv1.1(hKv1.1)(서열 번호 420), 인간 Kv1.2(hKv1.2)(서열 번호 419), 인간 Kv1.5(hKv1.5)(서열 번호 421), hKv1.3 E3 루프/hKv1.5 키메라(인간 Kv1.5 아미노산 1-455 및 496-613, 및 Kv1.3 E3 루프 아미노산 456-495를 가짐)(Kv1.3 EC3 루프 키메라), N-말단 Hig 태그를 갖는 hKv1.1 E3 루프/hKv1.5 키메라(His 태그 아미노산 1-9, hKv1.5 아미노산 10-472 및 513-63, 및 hKv1.1 E3 루프 아미노산 473-512를 가짐)(Kv1.1 EC3 루프 키메라), 래트 Kv1.3(rKv1.3)(서열 번호 422), 래트 Kv1.1 (rKv1.1)(서열 번호 423), 사이노몰거스 원숭이(마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)) 채널 cynoKv1.3(서열 번호 424), hKv1.3/hKv1.5 테일 키메라(인간 Kv1.5 아미노산 1-250 및 497-593, 및 Kv1.3 아미노산 서열 251-496을 가짐)(Kv1.3 테일 키메라), 및 hKv1.1/hKv1.5 테일 키메라(인간 Kv1.5 아미노산 1-250 및 492-588, 및 Kv1.1 아미노산 서열 251-491을 가짐)(Kv1.1 테일 키메라). HEK 세포에서의 채널 발현의 경우, 네오마이신 내성 마커를 코딩하는 CMV 프로모터 구동 발현 벡터 내로 Kv 유전자를 클로닝하였다. 표준 기법을 사용하여, HEK 293-F(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 세포를 안정하게 형질감염시키고 DMEM 10% FBS 및 600 ㎍/ml 게네티신 선택 배지 중에서 배양하여, Kv 채널을 발현하는 클론 세포주를 생성하였다. CHO 안정한 발현의 경우, 표준 기법을 사용하여 CHO-TREx 세포(인비트로겐)를 pcDNA4/TO-Kv1.x로 안정하게 형질감염시켜, 테트라사이클린-유도성 방식으로 각각의 칼륨 채널을 발현하는 클론 세포주를 생성하였다. 배양 배지는 10% 소태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 5 ㎍/ml 블라스티시딘 및 200 ㎍/ml 제오신으로 보충된 Ham's F-12였다. 일부 실험에서는, CHO 세포에서의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용한 일시적 형질감염을 사용하였다. 전기생리학적 실험의 경우, 발현 대조군을 위한 절두형(truncated) CD4를 발현하는 발현 벡터(pMACs4.1, 밀테니 바이오텍(Milteni Biotec))로 세포를 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 24 내지 48시간째에 검정을 수행하였다.
단백질 발현 및 정제.
키메라 라이브러리를 펩티드-Fc 융합체 또는 펩티드-HSA 융합체로서 발현시켰다. 라이브러리를 초기에 48웰 또는 96웰 포맷으로 HEK 293-E 세포들에서 형질감염시키고 발현시켰다. 이들 세포는 DMEM, 10% FBS 및 250 ㎍/ml의 선택을 위한 게네티신 중에서 배양하였다. 48웰 발현의 경우, 0.5 ml/웰의 3.0 × 105 세포/ml를 48웰 플레이트 내에서 평판배양하였다. 300 ng의 플라스미드 DNA, 25 μl의 옵티프로(OptiPRO)™ SFM 배지, 및 2.4 μl의 리포펙타민 2000(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)을 이용하는 일상적 방법을 사용하여, 리포펙타민 2000을 사용하여 라이브러리를 형질감염시켰다. 다음날, 형질감염 배지를 흡인하고, 0.5 ml의 293 프리스타일(FreeStyle)™ 배지(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포들을 추가 96시간 동안 인큐베이팅한 후, 상층액을 수집하고 0.2 μm 필터(바리안(Varian))를 통해 여과하였다.
96웰 형질감염의 경우, 세포들을 5분 동안 500xg로 스핀 다운하였으며, 상층액을 회수하고 세포들을 293 프리스타일™ 배지 중에 재현탁시키고 0.2 ml/웰 중 0.6 × 106 세포/ml로 96웰 플레이트 내에서 평판배양하였다. 48웰 형질감염과 동일한 방법으로 라이브러리를 형질감염시켰다.
모든 소규모 및 파일롯 규모의 형질감염에 대해서는 HEK 293-F 세포들을 사용하였다.
펩티드-Fc 융합체들의 소규모 발현은, 일상적 방법을 사용하여, 단백질 A 세파로스(Sepharose) 4FF 수지를 사용하여 배치 정제하였다(batch purified). 간략하게 말하면, 20 ml의 청징화된 발현 상층액을, DPBS(pH 7.2) 중에서 평형화된 약 0.5 ml의 수지와 혼합하고, 1시간 이상 동안 실온에서 혼합하였다. 단백질 A 수지를 1 ml의 DPBS(pH 7.2)로 세척하고, 결합된 단백질을 450 μl의 0.1 M 소듐 아세테이트(pH 3.0)로 용출시키고, 50 μl의 2 M Tris(pH 7.0)로 중화시키고, 4℃에서 하룻밤 1x DPBS(pH 7.2)에 대해 투석시켰다.
파일롯 규모 발현은 AKTA 엑스프레스(Xpress)™ 크로마토그래피 시스템(지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상에서 친화성 정제하였다(affinity purified). 일시적으로 형질감염된 HEK 293-F 세포들로부터의 발현 상층액을 형질감염 후 4일째에 수거하고, 6000 rpm으로 원심분리에 의해 청징화하고, 여과하였다(0.2 μm PES 막, 미국 매사추세츠주 악톤 소재의 코닝(Corning)). 옥텟(Octet) 기기(포르테바이오(ForteBio))를 사용하여 펩티드-Fc 융합체의 상대량을 결정하였는데, 이는 폐배지(spent medium) 내로 스파이킹된(spiked) 대조군 독소-Fc 융합 단백질을 사용하여 표준 곡선을 생성하여 결정하였다. 이어서, 샘플들을 10x PBS(pH 7.0)를 사용하여 1x PBS(pH 7.0)의 최종 농도로 희석시키고, 다시 여과하였다(0.2 μm PES 막). 희석된 상층액을, PBS(pH 7.0)로 사전-평형화된 하이트랩 맵셀렉트 슈어(HiTrap MabSelect Sure) 단백질 A 컬럼(지이 헬스케어) 상에 수지 1 ml당 약 10 mg의 단백질의 상대 농도로 로딩하였다. 로딩 후에, 컬럼을 PBS(pH7.0)로 세척하고, 단백질을 10 컬럼 부피의 0.1 M Na-아세테이트(pH 3)를 사용하여 용출시켰다. 단백질 분획들을 20% 분획 부피로 2.0 M Tris(pH 7)가 담긴 튜브 내로 용출시킴으로써 즉시 중화시켰다. 피크 분획들을 풀링하고, 10k MWCO 막을 갖는 원심 한외여과 장치(밀리포어(Millipore))를 사용하여 농축시켰다. 농축된 샘플들을, AKTA FPLC를 사용하여 PBS(pH 7.0) 중에서 평형화되고 거기로 통과된 수퍼덱스(Superdex) 200(16/60) 컬럼(지이 헬스케어) 위로 통과시켰다. 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 피크 분획들을 분석하였으며, 단량체 단백질을 함유하는 분획들을 풀링하였다. 바이오텍(BioTek) 시너지(Synergy) HT™ 분광 광도계 상에서 280 nm 및 310 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 필요에 따라, 정제된 단백질을 10K MWCO 원심분리 농축기(밀리포어)를 사용하여 농축시켰다. 정제된 단백질의 품질을 SDS-PAGE, 분석용 크기 배제 HPLC(디오넥스(Dionex) HPLC 시스템)에 의해 평가하고, 내독소 수준을 측정하였다(LAL 검정). 정제된 단백질을 4℃에서 저장하였다.
펩티드-HSA 융합체의 경우, 상층액을 수거하고, 청징화하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다. 사전-평형화된 1 mL 히스트랩(HisTrap) 컬럼 상에 로딩하기 전에, 10x DPBS를 1x의 최종 농도로 첨가하였다. 이미다졸의 단계 구배를 사용하여 단백질을 용출시켰다. 융합체를 함유하는 분획들을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 관심 있는 단백질을 함유하는 분획들을 풀링하고 농축시키고 수퍼덱스 200 26/60 컬럼 상에서 이동시켰다. 다시, 분획들을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 펩티드-HSA 융합체의 단량체 및 이량체를 함유하는 분획들을 최종 생성물에 대해 따로따로 풀링하였다. 정제된 단백질을 전술된 바와 같이 분석하고, 4℃에서 저장하였다.
펩티드 융합 단백질 직접 결합 검정("결합 검정").
펩티드- Fc 융합 단백질. 모든 세포 배양 시약들은 인비트로겐으로부터 입수하였다. 다양한 Kv 채널들을 발현하는 플라스미드들로 안정하게 형질감염된 부착성(adherent) HEK 293F 세포들을 10% FBS 및 600 ㎍/ml 게네티신으로 보충된 DMEM 중에서 배양하였다. 부착성 배양액들을 1x PBS로 헹구고, 이어서 0.25% 트립신 EDTA로 배양액들을 헹구고, 2% FBS(FACS 완충액)로 보충된 차가운 1x PBS 중에 세포들을 2×106 세포/ml의 최종 밀도로 재현탁시키고, 100 μl/웰을 96웰 V 바닥 폴리프로필렌 플레이트(코스타(Costar)) 내로 분배함으로써, Kv 채널 HEK 세포들의 단일 세포 현탁액들을 제조하였다. 절차상의 이 시점부터는 얼음 상에서 또는 4℃에서 수행하였다. 세포들을 2분 동안 450xg로 원심분리하고, 상층액을 경사분리(decant)하였다. 16 nM로 정규화된 FACS 완충액 중의 또는 프리스타일 293 폐배지 중의 100 μl의 펩티드-Fc 샘플들을 지정된 웰들 내의 세포 펠릿들에 첨가하고 혼합하였다. 특이적 결합과 비특이적 백그라운드를 구별하기 위하여, 10배 몰 과량의 합성 ShK 펩티드(바켐(Bachem))를 음성 대조군 반응물에 첨가하여 펩티드-Fc 융합 단백질의 결합과 경쟁시켰다. 반응물을 4℃에서 60 내지 90분 동안 인큐베이팅하였다. 세포들을 200 μl의 FACS 완충액 중에서 세척하고, 이어서 FACS 완충액 중에 1:200으로 희석된 100 μl의 염소 Fab'2 항 인간 Fc Cy5 접합된 항체(잭슨 이뮤노리서치 인크.(Jackson ImmunoResearch Inc.))와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포들을 200 μl의 FACS 완충액 중에서 세척하고, 이어서 100 μl의 BD 사이토픽스(Cytofix)™ 고정 완충액(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))으로 재현탁시키고 4℃에서 하룻밤 저장하였다. 반응물을 FACSArray 96웰 오토샘플러 유세포측정기(비디 바이오사이언시스) 상에서 판독하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(Treestar))로 분석하여, 각각의 반응물에 대해 기하 평균 형광 강도(Geo. MFI)를 얻었다. 1차 스크리닝 결합 검정의 경우, 각각의 변이체에 대한 Geo. MFI를 일시적으로 형질감염된 야생형 Odk2-Fc 융합체(KV1C2) 대조군에 직접 대비하여 %모(%parent)로서 기록하였다.
펩티드- HSA 융합 단백질. 하기를 제외하고는, 펩티드-Fc 융합체들에 대한 직접 결합 검정과 동일하게 검정들을 수행하였다: 세포들을 1×106 세포/ml의 최종 밀도로 현탁시킨 후, 100 μl/웰을 96웰 V 바닥 폴리프로필렌 플레이트(코스타) 내로 분배하고, 50 μl의 펩티드-HSA 융합 샘플들을 세포에 첨가하였다. 2 ㎍/ml로 희석되고 스트렙타비딘-PE 접합체와 사전혼합된(FACS 완충액 중에 1:200) 50 μl의 염소 항-인간 HSA 비오틴 접합체(에이비캠(AbCam) 카탈로그 번호 ab40378)를 사용하여, HSA 융합체들을 검출하였다. 세포들을 150 μl의 FACS 완충액 중에서 세척하고, 50 μl의 BD 사이토픽스™ 고정 완충액(비디 바이오사이언시스) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 전술된 바와 같이, 반응물들을 판독하고 데이터를 분석하였다. 1차 스크리닝 결합 검정의 경우, 각각의 변이체에 대한 Geo. MFI를 대조군 KV1D261_26 융합 단백질(GS(G4S)8 링커(서열 번호 120)를 통해 HSA에 접합된 펩티드 261)에 직접 대비하여 결합률(%)로서 기록하였다.
경쟁적 결합 검정("경쟁적 결합"). 모든 세포 배양 시약들은 인비트로겐으로부터 입수하였다. Kv 채널 발현 작제물들로 안정하게 형질감염된 부착성 HEK 293F 세포들을 10% FBS 및 600 ㎍/ml 게네티신으로 보충된 DMEM 중에서 배양하였다. 부착성 배양액들을 1x PBS로 헹구고, 이어서 0.25% 트립신 EDTA로 배양액들을 헹구고, 이어서 2% FBS(FACS 완충액)로 보충된 차가운 1x PBS 중에 세포들을 1×106 세포/ml의 최종 밀도로 재현탁시키고, 100 μl/웰을 96웰 V 바닥 폴리프로필렌 플레이트(코스타) 내로 분배함으로써, Kv 채널 HEK 세포들의 단일 세포 현탁액들을 제조하였다. 절차상의 이 시점부터는 얼음 상에서 또는 4℃에서 수행하였다. 세포들을 2분 동안 450xg로 원심분리하고, 상층액을 경사분리하였다. FACS 완충액 중의 또는 프리스타일 293 폐배지 중의 45 μl의 펩티드 또는 펩티드 융합 단백질 샘플들을 지정된 웰들 내의 세포 펠릿들에 첨가하고 혼합하였다. 반응물들을 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. FACS 완충액 또는 세포 배양 배지 중의 5 μl의 100 nM 아지톡신(Agitoxin)-2-Cys-TAMRA(알로몬 랩스(Alomone labs))를 각각의 웰에 첨가한 후 혼합하고, 반응물들을 4℃에서 60분 동안 인큐베이팅하였다. 200 μl의 FACS 완충액을 세척 단계로서 각각의 웰에 첨가하였으며, 세포들을 2분 동안 450xg로 원심분리하고 상층액을 경사분리하였다. 세포들을 50 μl의 FACS 완충액으로 재현탁시키고, 반응물들을 FACSArray 96웰 오토샘플러 유세포측정기(비디 바이오사이언시스) 상에서 판독하였다. 데이터를 플로우조 소프트웨어(트리스타)로 분석하여, 각각의 반응물에 대해 기하 평균 형광 강도(Geo. MFI 또는 GMFI)를 얻었다. 농도 반응 곡선의 경우, 각각의 화합물에 대한 일정 범위의 농도들에 걸친 Geo. MFI 값들의 변화를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)에서 도표로 나타내었으며, IC50 및 Ki 값을 S자형 용량-반응(가변 기울기) 곡선으로 비선형 회귀를 사용하여 도출하였다. Ki를 계산하기 위하여, 0.20 nM의 아지톡신-2-Cys-TAMRA Kv1.3 KD 값을 배정하였다(문헌[David Triggle (eds). Voltage-Gated Ion Channels as Drug Targets, Volume 29, Page 216, Tab. 7.2.2]).
탈륨 플럭스 검정. Kv 작제물들을 G418 선택 하에 HEK293F에서 안정하게 발현시켰다. 배양 배지는 10% FBS 및 600 ㎍/mL G418로 보충된 HyQ DME/고 글루코스였다. 폴리라이신 코팅된 384웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 10K 세포/웰로 세포들을 평판배양하였으며, 이어서 37℃에서 12 내지 36시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포 플레이트를 바이오텍 EL405를 사용하여 검정 완충액으로 세척하였다(4회 사이클, 25 μL/웰로 흡인하고, 이어서 100 μL/웰을 첨가함). 검정 완충액은 하기를 함유하였다(단위: mM): 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM 글루코스. 플럭스오알(FluxOR) 염료(인비트로겐)를 검정 완충액 + 2 mM 프로베네시드 중에 제조자의 사용설명서에 따라 용해시키고, 이어서 세포들에 첨가하였다. 세포들을 암소에서 실온에서 30분 동안 염색하였다. 이어서, 염료를 검정 완충액으로 세척 제거하였다. 시험 화합물들을 검정 완충액 + 0.2% 소혈청 알부민(BSA) 및 2 mM 프로베네시드 중에 2X 시험 농도로 제조하였다. 25 μL/웰의 시험 화합물 용액을 첨가한 후에, 세포들을 암소에서 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 20 μL/웰의 자극 완충액을 첨가함으로써 세포들을 시험투여함에 따라, 탈륨 염료 형광을 테트라(몰레큘러 디바이시스)에서 모니터링하였다. 자극 완충액은 180 mM HEPES, 90 mM KOH, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM 글루코스, 1 mM Tl2SO4를 함유하였다. 효능제(agonist)를 첨가한 후 20초째에 형광 변화를 측정하였다. 데이터를 대조군 웰들(N=16이며, 이들 각각은, 완전 억제 대조군의 경우 10 nM ShK이고, 제로 억제 대조군의 경우 완충액 단독임)의 평균 반응에 대해 정규화하였다.
T 세포 억제 검정("T 세포 억제 검정"). IL-2 분비의 억제를 T 세포 억제에 대한 지표로서 사용하였다. 동결보존된 정제된 1차 정상 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포(올셀즈 엘엘씨(AllCells LLC))를 해동시키고, 1% 정상 인간 A/B 혈청(밸리 바이오메디칼 프로드 앤드 에스알브이 인크.(Valley Biomedical Prod & Srv Inc.))으로 보충된 RPMI 1640(인비트로겐) 중에 2×106 세포/ml의 최종 밀도로 현탁시키고, 100 μl의 세포들을 96웰 편평 바닥 조직 배양 플레이트(눈크(NUNC)) 내로 분배하였다. 펩티드-HSA 융합 단백질의 경우, 농도-반응 실험 내내 일정 HSA 농도를 유지하기 위하여, 정제된 정상 인간 혈청 알부민(시그마(SIGMA))을 3%의 최종 농도로 세포 배양 배지에 첨가하였다. 펩티드 융합 단백질 및 대조군을 세포 배양 배지 중에 희석시켰으며, 50 μl/웰을 T 세포 배양액에 첨가하고, 37℃/5% CO2에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포 배양 배지 중에 1:1 비드(bead) 대 세포 비로 희석된 항-인간 CD3/CD28 T 세포 증가 비드(밀테니 바이오텍)를 사용하여 T 세포들을 활성화하였다. 배양액을 37℃/5% CO2에서 약 16시간 동안 인큐베이팅하였으며, 상층액을 96웰 V 바닥 폴리프로필렌 플레이트(코스타) 내로 수거하고, 원심분리에 의해 청징화하였다. 인간 IL-2 퀀티킨(Quantikine) 키트(알앤디 시스템즈(RnD Systems))로부터 비롯된 화학발광 면역검정에 의해, 청징화된 상층액을 IL-2 수준에 대해 분석하였다. 최종 IL-2 수준을 그래프패드 프리즘에서 도표로 나타내었으며, S자형 용량-반응(가변 기울기) 곡선 피트로 비선형 회귀를 사용하여 IC50 값을 도출하였다. 일부 실험은 단일 포인트 5 nM, 100 nM 또는 250 nM 펩티드 융합 단백질 농도에서 행하였다.
파상풍 톡소이드 ( TTX ) T 세포 검정. 파상풍 톡소이드로 백신접종된 건강한 공여자 혈액으로부터, 피콜 파구에(Ficoll Pague)(지이 헬스케어 라이프 사이언스(GE Healthcare Life Science))를 사용하여 단계 구배 원심분리에 의해 인간 PBMC를 정제하였다. 2% 인간 혈청, 2 mM 글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 10 mM HEPES, 1 mM MEM 비필수 아미노산 용액, 및 각각 100 U/ml의 페니실린 G 및 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 중의 3 ug/ml 파상풍 톡소이드(매사추세츠 대학 생물학과(Univ. of Massachusetts Biologic))로 96웰 편평 바닥 배양 플레이트 내에서 3일 동안 106 세포/웰의 PBMC를 자극하였다. 배양 상층액을 배양 일수 2에 수집하고, 1 uCi/웰의 3H-티미딘(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 사용하여 하룻밤 펄스에 의해 세포 증식을 측정하였다. 도입된 방사성 티미딘을 갖는 증식성 세포들을 유리 섬유 필터 플레이트(퍼킨 엘머) 상에 수거하고, 탑카운트(Topcount)(팩커드(Packard))를 사용하여 방사능을 카운팅하기 위하여 섬광제(퍼킨 엘머) 중에 액침하였다. MSD 검출 기술(메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))을 사용하여 상층액 중의 사이토카인을 측정하였다.
전기생리학. 형질감염된 CHO 또는 HEK 세포, CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 전기생리학에서 사용하였다. 세포들을 유리 커버 슬립 상에 저밀도로 평판배양하였다. 실험 당일날에, 유리 커버 슬립을 도립 현미경의 검경대 상의 배스(bath) 내에 두고 하기 조성의 세포외 용액으로 관류시켰다(대략 1 ml/min): 137 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM 글루코스, 및 10 mM HEPES, 0.1% 소혈청 알부민, pH 7.4. 하기 조성의 세포내 용액으로 피펫을 충전하였다: 40 mM KCl, 100 mM KF, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.3 내지 7.4, 및 2 내지 4 MΩ의 저항을 가짐. 모든 기록은 멀티클램프(Multiclamp) 700A 증폭기 및 피클램프(pClamp) 9 소프트웨어(액손 인스트루먼츠(Axon Instruments))를 사용하여 실온(22 내지 24℃)에서 행해졌다. 일시적으로 형질감염된 CHO 세포들을 항-CD4 코팅된 비드(다이나비즈(Dynabeads), 인비트로겐)를 사용하여 확인하였다. ―80 ㎷의 유지 전위(holding potential)로부터 20 내지 40 ㎷의 시험 전위에서 패치-클램프 기법의 전세포 구성을 사용하여 외향 칼륨 전류를 측정하였다. 액간 전위는 20℃에서 7.1 ㎷인 것으로 계산되었으며, 전압 지령치는 보정되지 않았다. 전류 기록을 2 내지 5 ㎑에서 획득하였으며, 1 내지 2 ㎑에서 필터링하였다. 전류를 매 20초마다 1회 유도하였으며, 기록 전에 5 내지 10분 동안 안정화되게 하였다. SF-77B 패스트-스텝(Fast-Step) 관류 장치(워너 인스트루먼츠(Warner Instruments)를 사용하여 화합물들을 적용하였다. 세포당 1 내지 4개의 농도의 화합물을 시험하였다.
데이터 분석:
농도- 또는 용량-반응 데이터를 하기의 4 파라미터 일반 로지스틱 방정식을 사용하여 비선형 회귀(그래프패드 프리즘, 버전 4.0)에 의해 피팅하였다:
반응 = 기저 + (최대 ―기저) / [1 + 10 ( logEC50 ― Log 효능제 ) 힐 기울기(Hill slope)]
효력은 50% 최대 효과를 생성하는 농도의 -log10(pIC50 또는 pEC50)으로 표현하였다.
펩티드 합성. Fmoc-Lys(Boc)-Wang 수지(0.47 mmol/g 치환)는 펩티드 인터내셔널(Peptide International)로부터 입수하였으며, 유사프롤린 다이펩티드, Fmoc-Ile-Ser(ΨMeMe pro)-OH는 노바바이오켐(Novabiochem)으로부터 입수하였다. 모든 다른 아미노산은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, ABI) 또는 아나스펙(Anaspec)으로부터 입수하였다. 자동화 고상 펩티드 합성(solid phase peptide synthesis, SPPS)에 대한 시약은 ABI로부터 입수하였다. 화학적 합성에 필요한 다른 시약은 시그마/알드리치(Sigma/Aldrich)로부터 구매하였다. ABI 모델 433A 자동화 펩티드 합성기를 사용하여 SPPS를 통해 Fmoc-Lys(Boc)-Wang 수지(222 mg, 0.104 mmol) 상에서 펩티드 합성을 수행하였다. HBTU/HOBt/DIEA 활성화에 대한 표준 0.1-mmol-스케일 FastMoc MonPrevPeak 프로토콜을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 유사프롤린 다이펩티드, Fmoc-Ile-Ser(ΨMeMe pro)-OH를 서열 GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK-수지(서열 번호 42) 내의 볼드 및 밑줄로 나타낸 위치에 도입시켰다. 아미노산 측쇄 작용기는 다음과 같이 보호하였다: Arg(Pmc), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt),Glu(OtBu), Gln(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu) 및 Thr(tBu).
주위 온도에서 6시간 동안 (TFA(20 mL), 페놀(1.5 g), 1,2 에탄다이티올(4.0 mL), 티오아니솔(1.0 mL), 물(1.0 mL) 및 트라이아이소프로필실란(1.0 mL)) 중에서 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 여과를 통해 수지를 제거하고, 추가의 TFA(2 mL)로 헹구었다. 여과액을 합하고, 펩티드를 사전냉각된 에틸 에테르(400 mL)로 침전시켰다. 여과에 의해 단리되고, 다이에틸 에테르로 세척되고, 진공 중에서 건조된 펩티드는 370.0 mg의 조(crude) 선형 생성물을 생성하였다: (GVPINVKCKISRQCIEPCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK; 서열 번호 42). 조 선형 펩티드를 주위 온도에서 0.1 M Tris-HCL, 1.0 M 구아니딘-HCL, 1.0 mM EDTA, 3.0 mM 환원형 글루타티온 및 0.3 mM 산화형 글루타티온 중에서 펩티드 농도 100 ㎍/mL로 산화시켰다. 빙초산을 적가하여 pH를 3.9로 감소시킴으로써 25시간 후에 반응을 정지시키고, 펩티드를 냉동 및 동결건조시켰다. 조 펩티드를 바이닥(Vydac) C-18 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 분석용 RP-HPLC, 모세관 전기영동 및 LC/MC는 순도 및 분자량을 확인시켜 주었다.
실시예 1
야생형 OdK2 및 OsK1 펩티드 및 이들의 융합 단백질의 특성화
야생형 OdK2(서열 번호 1) 및 OsK1(서열 번호 2) 펩티드를, 일상적 방법을 사용하여 그리고 전술된 바와 같이 링커 GS(G4S)4(서열 번호 119)를 사용하여 IgG4 Fc 융합 단백질로서 클로닝하고 발현시켰다. 생성된 융합 단백질들은 각각 KV1C2(OdK2-Fc 융합체) 및 KV1N2(OsK1-Fc 융합체)로 명명하였다. 천연 OdK2 펩티드를 루벤 대학(University of Leuven)의 얀 테이트(Jan Tytgat) 교수로부터 입수된 이란 전갈 오돈토부투스의 독액으로부터 단리하고 정제하였으며, 재조합 OsK1 펩티드는 알로몬 랩스로부터 입수하였다. 천연 펩티드들 및 이들의 융합 단백질을 Kv1.3에 대한 그들의 결합에 대해, 전기생리학을 사용하여 Kv1.3 효력 및 선택성에 대해, T 세포 활성화를 억제하는 능력에 대해, 그리고 약동학적 연구에서 특성화하였다.
Kv1.3 발현 세포들에 대한 결합
hKv1.3 EC3 루프 키메라를 발현하는 안정한 세포들에서 전술된 바와 같이 결합 검정을 수행하였다. KV1C2(OdK2-Fc 융합체)는 FACS 검정에서 백그라운드의 12.8배를 초과하는 신호를 생성하였으며, KV1N2(OsK1-Fc 융합체)는 백그라운드의 133.0배를 초과하는 신호를 생성하였는데(도 2), 이는 발현된 Kv1.3 채널에 대한 고수준의 결합을 시사한다. 이러한 결합은 특이적인 것으로 나타났는데, 그 이유는 10배 과량의 ShK의 존재 하에서는 인간 Kv1.3 EC3 루프 키메라 발현 세포들에 대한 결합이 관찰되지 않았기 때문이다. 이러한 결합은 또한 선택적이었는데, 그 이유는 KV1C2(OdK2-Fc 융합체) 및 KV1N2(OsK1-Fc 융합체)는 인간 Kv1.5 발현 세포에 결합되지 않았기 때문이다.
전기생리학
인간 Kv1.3, Kv1.1, Kv1.2 및 Kv1.5 이온 채널로 형질감염된 CHO 세포들 상에서 전세포 패치 클램프 연구를 수행하였다. Osk1 및 Odk2 둘 모두는 Kv1.3 전류를 강력하게 억제하였다. OsK1 펩티드는 Kv1.3에 대하여 OdK2보다 유의하게 더 강력하였지만, Kv1.1에 대비한 배수 선택성은 2개의 펩티드에 대해 유사하였다. KV1C2(OdK2-Fc 융합체) 및 KV1N2(OsK1-Fc 융합체)는, 이들 천연 펩티드와 비교할 때, Kv1.3에 대해 약 30 내지 100배 덜 강력하였다. 그러나, (Kv1.1 IC50을 Kv1.3 IC50으로 나누어서 계산된) KV1C2 선택성은 천연 펩티드에 비하여 약 3 내지 4배 개선되었다. 전기생리학에 의해 결정된 IC50 값 및 선택성 비가 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
Figure pct00002
T-세포 활성화의 억제
KV1C2(OdK2-Fc 융합체)는 주르카트(Jurkat) T 세포주, 1차 CD4+ 인간 T 세포(정상 인간 공여자로부터 단리됨), 및 Kv1.3 형질감염된 HEK 및 CHO 세포에서 Kv1.3 세포 전류를 차단하였다. KV1C2(OdK2-Fc 융합체)는 또한 항-CD3/CD28로 활성화된 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터의 사이토카인 생산을 차단하였다. KV1N2(OsK1-Fc 융합체)는 주르카트 T 세포주에서 Kv1.3 세포 전류를 차단하였으며, hKv1.3 EC3 루프 키메라를 발현하는 세포들에 결합하는 아지톡신2-cys-TAMRA와 경쟁하였으며, hKv1.3 EC3 루프 키메라를 발현하는 세포들로부터의 탈륨 플럭스를 억제하였으며, CD4+ T 세포 활성화를 억제하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 표 1은 수동 패치-클램프 전기생리학으로부터 얻어진 IC50 값을 나타낸다. KV1C2(OdK2-Fc 융합체)는 또한, 전술된 검정에서 파상풍 톡소이드 항원을 나타내는 미토마이신 C 처리된 자가 항원 제시 세포들에 의한 활성화시에 T 세포 증식을 억제하였다(도 3).
OdK2-Fc 융합 단백질의 반감기
10 mg/㎏의 최종 용량을 위하여 5 ml/㎏으로 1x PBS(pH 7.0) 중의 2 mg/ml 스톡(stock)의 정맥내 볼루스 투여를 통해, 스프라그 돌리 래트(Sparague Dawley Rat)에 KV1C2(OdK2-Fc 융합체)를 투여하였다. 전술된 바와 같이 FACS에 의해 또는 항-Fc ELISA에 의해 혈장 농도를 결정하였다. 래트에서의 KV1C2 반감기(T1/2)는 60시간이었다.
실시예 2
OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합체들("OdK2/Osk1 키메라 라이브러리" 또는 "KV1C2L1")의 생성
천연 OdK2 및 OsK1 독소 펩티드 서열은, 9개의 아미노산 잔기에서 다양성(divergence)을 가지면서, 고도의 서열 유사성을 갖는다(도 1). 향상된 Kv1.3 효력 및 Kv1.x 아형 선택성을 갖는 펩티드 변이체들을 생성하기 위하여, GS(G4S)4 링커(서열 번호 119)를 사용한 펩티드-링커-Fc 변이체들의 조합 라이브러리를 생성하였는데, 여기서는 OdK2 펩티드 아미노산 서열을, OdK2(서열 번호 1) 내의 OsK1과 상이한 OdK2 서열의 9개의 위치 중 8개의 위치(위치 3, 4, 5, 9, 10, 12, 16 및 20)에서 다양하게 하였다. 위치 15는 라이브러리 다양화에 포함시키지 않았는데, 그 이유는 이 위치에서의 아이소류신과 류신 사이의 유사성 때문이다. 이들 위치를, 각각의 위치에 존재하는 OdK2 및 OsK1 아미노산 잔기를 사용하여 다양화하였다. 이렇게 해서, 위치 3은 PI로 다양화하고, 위치 4, 5, 9, 10, 12, 16 및 20은 각각 TI, DN, RK, GI, RP, EQ, 및 KD로 다양화하였다. 라이브러리 설계는 또한, 올바른 OdK2 아미노산 서열에서의 초기 불일치의 결과로서의 위치 38에서의 글루타민 치환, 및 위치 16에서의 라이신 치환을 갖는 6개의 변이체를 도입시켰는데, 이때 위치 16에서 라이신 치환은 이러한 돌연변이가 OsK1 펩티드의 효력을 증가시켰다는 이전의 보고들에 기초한 것이다(문헌[Mouhat et al., Biochem J 385:95-104, 2005]). 이렇게 해서, OdK2/Osk1 키메라 라이브러리는 라이신 치환 변이체들, OdK2 K38Q 변이체, 및 둘 모두의 모 분자 KV1C2(Odk2 융합체) 및 (OsK1 융합체)를 비롯한 총 264개의 구성원으로 이루어졌다. 위치 넘버링은 서열 번호 1의 천연 OdK2 펩티드 서열에 따른다.
일상적인 분자 생물학 방법을 사용하여 그리고 전술된 바와 같이 라이브러리를 생성하고 발현시켰다.
라이브러리를 조 상층액을 사용하여 스크리닝하였는데, 전술된 바와 같이, hKv1.3에 대한 결합에 대해서는 hKv1.3 EC3 루프 키메라로 형질감염된 HEK 세포주를 사용하여 스크리닝하고, 선택성에 대해서는 hKv1.1 EC3 루프 키메라 채널로 형질감염된 HEK 세포주에 대한 결합에 의해 스크리닝하였다. 1차 스크린에서, 결합은 대조군 KV1C2의 결합률(%)(결합률(%))로서, 그리고 선택성은 Kv1.3에 대한 결합률(%) 대 Kv1.1에 대한 결합률(%)의 비로서 측정하였다. 도 4는 OdK2/Osk1 키메라 라이브러리(KV1C2L1 라이브러리)로부터뿐만 아니라 실시예 4에 기재된 아미노산 스캔 라이브러리(KV126L1 라이브러리)로부터 획득된 선택된 변이체들에 대한 아미노산 서열, 결합률(%), 선택성, 및 탈륨 플럭스 검정으로부터의 IC50 값을 나타낸다.
모 KV1C2(OdK2-Fc 융합체)와 비교할 때, Kv1.3에 대한 80% 이상의 결합률 및 Kv1.1에 대비하여 1.3배 이상의 선택성을 보여주는 선택된 융합 단백질들을 추가로 특성화하였다.
실시예 3
OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합체들의 특성화.
실시예 2에서 확인된 선택된 OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합 단백질들을 전술된 바와 같이 정제하고, 2차 결합 검정인 전기생리학 및 T 세포 억제 검정에서 특성화하였다.
전기생리학
선택된 변이체들을, 전술된 바와 같이 안정하게 형질감염된 CHO를 사용하여 전세포 패치-클램프 연구에서 그들의 효력 및 선택성에 대해 평가하였다. 인간 Kv1.3 또는 인간 Kv1.1의 억제율을 정제된 변이체의 단일 농도(Kv1.3에 대해서는 1 nM 또는 Kv1.1에 대해서는 100 nM)로 평가하였다(표 2). 선택된 변이체들은, 모 KV1C2에 비하여, Kv1.3에 대해서는 유의하게 증가된 활성을 가졌지만, Kv1.1에 대해서는 유사한 활성을 가졌다.
재료 및 방법에 기재된 바와 같이 인간 Kv1.3 또는 Kv1.1로 안정하게 형질감염된 CHO 세포들을 사용한, 선택된 OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합체들에 대한 수동 패치-클램프 전기생리학 연구로부터 IC50 값을 도출하였다. 배수 선택성은 IC50(Kv1.1) 대 IC50(Kv1.3)의 비로서 계산하였다. 표 3은 선택된 변이체들 및 모 OdK2 및 OsK1 융합체들, 즉 KV1C2 및 KV1N2 각각에 대한 IC50 값을 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00003
[표 3]
Figure pct00004
패치-클램프 연구에 기초하여, OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합 단백질들은, 모 KV1C2(OdK2-Fc 융합체)와 비교할 때, 약 28 내지 약 87배의 개선된 Kv1.3 효력 및 약 3 내지 9배의 개선된 선택성을 가졌으며, 모 KV1N2(OsK1-Fc 융합체)와 비교할 때, 약 85배의 개선된 선택성을 가졌다.
T 세포 활성화의 억제
선택된 OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합체들을 T 세포 활성화를 억제하는 이들의 능력에 대해 특성화하였는데, 이때 T 세포 활성화의 억제는 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 항-CD3/C28-유도 T 세포들로부터의 IL-2 분비의 억제로서 측정된 것이다. OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합체들의 단일 농도(100 nM)로 억제를 측정하였으며, 결과는 도 5a에 최대 IL-2 생산의 억제율(%)로 제시되어 있다. KV1B03은 모 KV1C2(OdK2 융합체)와 동일하며, 라이브러리 작제 동안 우연히 재생성되었다. 도 5b는 KV1D261에 의한 활성화된 T-세포들에 의한 IL-2 생산의 농도-의존성 억제를 나타낸다. KV1D261 융합 단백질에 대한 CD4+ T 세포 억제에 대한 IC50 값은 1.66 nM이었다.
T 세포 활성화의 억제와 라이브러리의 1차 스크린 동안 수행된 조 상층액을 사용한 Kv1.3에 대한 결합의 상관 관계를 검토하여, 결합 검정에 의해 기능성 Kv1.3 차단제를 확인하는 능력을 평가하였다(도 5c). 2개의 검정 사이에 유의한 상관 관계가 확인되었다(피어슨 상관계수(Pearson's correlation) r 0.9339, p<0.0001).
융합 단백질들의 길항 효과는 펩티드 부분에 기인한다
OdK2 키메라 펩티드 Fc 융합체의 억제 특성뿐만 아니라 선택성도 펩티드 부분에 의해 보유되어 있는지를 결정하기 위하여, 선택된 OdK2 키메라 융합체들을, 그들의 특성에 있어서, 상응하는 합성 펩티드들과 비교하였다.
KV1D261 및 상응하는 합성 펩티드 p261(서열 번호 42)을 Kv1.3 효력 및 선택성, 래트 Kv1.3 채널들에 대한 교차-반응성, 및 T 세포 활성화의 억제에 대해 특성화하였다. 문헌[Dubin et al., J Biomol Screen. 10:168-81, 2005]에 언급된 것들과 같은 일상적 방법을 사용하여 hERG를 평가하였다. 사용된 모든 세포주들은, 래트 Kv1.3 및 hKCa3.1을 제외하고는, 관심 있는 채널을 안정하게 발현하였다. KV1D261 및 상응하는 합성 펩티드 p261에 대한 실험 결과가 표 4에 나타나 있다. 합성 펩티드는, 전기생리학 및 T 세포 억제 둘 모두에 의해 Fc 융합체보다 약 10배 더 강력하였으며, 상응하는 융합 단백질과 비교할 때 선택성을 보유하였는데, 이는 가공된 펩티드 영역이 효력 및 선택성의 특성의 전달을 담당한다는 것을 입증한다. Fc와 융합될 때의 효력의 손실은 증가된 분자량과 함께 증가된 엔트로피로 인한 것으로 예상되었다.
[표 4]
Figure pct00005
KV1D261의 약동학적 특성
10 mg/㎏의 최종 용량을 위하여 1.2 ml/㎏으로 1x PBS(pH 7.0) 중의 8.3 mg/ml 스톡의 정맥내 볼루스 투여를 통해, 스프라그 돌리 래트에 KV1D261(261-Fc 융합체)을 투여하였다. ELISA 및 FACS 검정 둘 모두를 사용하여 단백질을 측정하였다. 반감기는 약 72시간인 것으로 평가되었다.
실시예 4
아미노산 스캐닝 라이브러리(KV1D26L1 라이브러리)의 생성
Kv1.3 차단 펩티드들의 선택성을 추가로 개선하기 위하여, 실시예 2에 기재된 OdK2/Osk1 키메라 라이브러리로부터 확인된, 강력하지만 비선택적인 변이체인 KV1D26(상응하는 펩티드 p26, 서열 번호 111)의 펩티드 영역의 각각의 비-시스테인 잔기에서의 9개의 아미노산(A, R, Q, E, H, L, K, V, D)의 단일 치환들에 의해 스캐닝 라이브러리를 설계하였다. 이러한 아미노산 스캐닝 라이브러리는 270개의 변이체로 이루어졌다.
일상적인 분자 생물학 방법을 사용하여 그리고 전술된 바와 같이 라이브러리를 생성하고 발현시켰다. 간략하게 말하면, 변이체 펩티드들을 코딩하는 유전자들을, 합성 유전자 조립체를 사용하여 합성하고(미국 특허 제6521427호 및 미국 특허 제6670127호), 포유류 발현 벡터 내에서 GS(G4S)4(서열 번호 119) 링커 IgG4 Fc 융합체 파트너와 함께 인 프레임(in frame)으로 클로닝하였다.
라이브러리를 상기에서와 같이 발현시키고 조 상층액으로서 스크리닝하였는데, 전술된 바와 같이, 인간 Kv1.3 EC3 루프 키메라 채널로 형질감염된 HEK 세포주에 대한 결합에 대하여, 그리고 인간 Kv1.1 EC3 루프 키메라 채널로 형질감염된 HEK 세포주에 대한 결합에 의해 선택성에 대하여 스크리닝하였다. 각각의 변이체의 정량화 후에 활성을 정규화하였다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이, Kv1.3 및 Kv1.1에 대한 결합률(%)을 모 KV1C2(OdK2-Fc 융합체)의 백분율로서 표현하였다. 재료 및 방법에 기재된 바와 같이, 2개의 세포주를 사용하여 탈륨 플럭스 검정에서 라이브러리를 또한 스크리닝하였다.
도 4a는 선택된 변이체들의 서열을 나타낸다. 결합 데이터 및 탈륨 플럭스 데이터가 도 4b에 요약되어 있다.
아미노산 스캐닝 라이브러리로부터의 다수의 변이체들은 Kv1.1에 대비하여 Kv1.3에 대한 증가된 결합 및 선택성을 입증하였다. 결합 검정 스크린으로부터, 라이신 내지 글루타민 치환은 일관성 있게 Kv1.1에 대비하여 Kv1.3에 대한 증가된 선택성을 가져왔다. Kv1.3에 대한 80% 이상의 결합률 및 Kv1.1에 대비하여 1.3배 이상의 선택성을 보여주는 선택된 변이체들을 정제하고 추가로 특성화하였다.
실시예 5
아미노산 스캐닝 라이브러리(KV1D26L1 라이브러리)로부터 획득된 변이체들의 특성화
Kv 독소 억제제들과의 경쟁
선택된 변이체들을 정제하고, 전술된 바와 같은 단일 포인트 검정 및 농도-반응 검정에서, 공지된 Kv1.3 억제제인 아지톡신-2-CysTAMRA와 경쟁하게 될 이들의 잠재성에 대해 평가하였다. 10 nM 아지톡신-2-CysTAMRA를 사용하고, 각각의 변이체를 단일 포인트 판독을 위해서는 40 nM로, 또는 농도-반응 연구를 위해서는 0.015 nM 내지 4 μM로 사용하여, 인간 Kv1.3 EC3 루프 키메라를 발현하는 안정한 HEK293 세포들에서 억제를 평가하였다.
아지톡신-2-CysTAMRA 결합의 억제율(%) 및 선택된 변이체들에 대한 IC50 값이 표 5에 나타나 있다. 선택된 변이체들은 KV1D261과 유사한 수준으로 아지톡신-2-CysTAMRA의 Kv1.3에 대한 결합을 억제하였으며, IC50 값은 5 nM 내지 1.3 μM의 범위였으며, 또한 이들 변이체 중 몇몇은 KV1D261의 낮은 나노몰 범위였다.
[표 5]
Figure pct00006
T 세포 활성화의 억제
선택된 변이체들이 T 세포 활성화를 억제하는 능력을, 활성화에 대한 마커로서 IL-2 분비를 사용하여 전술된 바와 같이 평가하였다.
5 nM 또는 250 nM의 단일 변이체 농도로, 또는 농도 반응의 경우 0.015 nM 내지 250 nM 범위를 사용하여 검정을 수행하였다. 선택된 변이체들에 대한 최대 신호로부터의 억제율(%)이 표 5에 나타나 있다.
KV1D579는 강력하고 선택적인 Kv1.3 억제제이다
KV1D579를, 전술된 바와 같이 인간 Kv1.3, Kv1.1, 또는 Kv1.6으로 형질감염된 HEK 세포들을 사용하여 전세포 패치 클램프 연구 및 탈륨 플럭스에서 연구하였다. KV1D579에 대한 IC50 값이 실시예 2에서 단리된 OdK 키메라-Fc 융합 변이체인 모 KV1D26과 함께 표 6에 열거되어 있다. 괄호 안의 값은 탈륨 플럭스 검정으로부터 도출된 것이며, 괄호 밖에 있는 값은 패치 클램프 연구로부터 도출된 것이다.
[표 6]
Figure pct00007
실시예 6
C-말단 연장부 라이브러리(KV1D819L1 라이브러리)의 생성
링커 GS(G4S)4(서열 번호 119)를 사용하여 접합된 몇몇 펩티드-Fc 융합 단백질들은 시험관내의 정지 상태의 인간 말초 혈액 단핵 세포의 배양액으로부터 원치 않는 염증성 사이토카인 방출을 유도하는 반면, 상응하는 합성 펩티드 그 자체는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 원치 않는 사이토카인 방출은 2가 펩티드-Fc 융합체의 포맷 또는 Fc 그 자체에 기인하였다.
원치 않는 사이토카인 방출을 방지하기 위하여, 링커 GS(G4S)4(서열 번호 119)를 사용하여 인간 혈청 알부민 융합 단백질로서 펩티드 261(p261)(서열 번호 42)을 합성하였다.
생성된 융합 단백질(KV1D261_23)의 효력을, KV1D261_23에 기반한 융합 단백질 라이브러리를 생성함으로써 추가로 최적화하였는데, 여기서는 펩티드 p261을 그의 C-말단에서 4개의 아미노산에 의해 연장하였다. KV1D261_23 융합 단백질의 펩티드 영역의 C 말단의 연장은 Kv1.3 채널의 세포외 루프와 펩티드의 증가된 결합 상호작용 및 이에 의한 증가된 효력을 가능하게 할 것이라는 가설을 세웠다.
261 펩티드 내의 새로운 위치 39, 40, 41 및 42에서 완전 조합으로의 위치당 하기의 12개의 잔기(Q, R, P, H, K, T, N, S, E, G, A, 및 D)를 사용하여, 펩티드의 C 말단과 개재하는 GS(G4S)4 링커(서열 번호 119) 사이에 4개의 추가 아미노산을 삽입함으로써 KV1D261_23 융합 단백질을 변형시켰다. 각각의 잔기에 대한 비는, R이 1.5이고, S가 0.5인 것을 제외하고는 1이었으며, 이러한 라이브러리의 가능한 변이체들의 생성된 이론적인 개수는 124(20,736)이었다. 변이체 C 말단 연장부를 갖는 이들 펩티드에 대해 코딩하는 유전자들을 이전에 기재된 바와 같이 합성하고, 일상적인 분자 생물학 방법을 사용하여 포유류 발현 벡터 내에 GS(G4S)4 링커(서열 번호 119) 및 인간 혈청 알부민 융합 파트너와 함께 인 프레임으로 클로닝하였다.
라이브러리를 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포들에서 재조합 발현시켰다. 직접 결합 검정, 및 Kv1.3 효력에 대해서는 인간 Kv1.3 테일 키메라 채널로 형질감염된 HEK 세포주를 사용하고, 인간 Kv1.1 테일 키메라 채널로 형질감염된 HEK 세포주를 사용하는 기능적 탈륨 플럭스 검정을 사용하여 조 상층액을 스크리닝하였다. 이러한 라이브러리로부터의 히트(hit)는 염기성(R, H, 및 K), 산성(T, N 및 G), 및 비극성(A 및 P) 잔기에서 높았다. 도 6은 선택된 융합 단백질들에 대한 결합 검정 및 탈륨 플럭스 검정의 결과를 나타낸다.
실시예 7
C-말단 연장부 라이브러리(KV1D819L1 라이브러리)의 특성화
C-말단 연장부 라이브러리로부터 확인된 선택된 후보자들을 정제하였으며, Kv1.3에 대한 결합을 확인하였다. 농도-반응 곡선을 탈륨 플럭스 검정에 대해 생성하였다. 표 7은 각각의 변이체에 대한 C-말단 연장부의 아미노산 서열 및 탈륨 플럭스 검정에서 결정된 IC50 값을 나타낸다. KV1D261_26(GS(G4S)8 링커(서열 번호 120)를 사용한 p261-HSA 융합체)을 이 검정에서 대조군으로서 사용하였다. 대부분의 p261 C-말단 연장부 펩티드 융합체들은, 비연장 펩티드 모이어티를 갖는 대조군과 비교할 때, 탈륨 플럭스에서 유사하거나 증가된 효력을 보여주었다. KV1D261_23보다 더 긴 링커를 갖는 KV1D261_26 융합체는 일관성 있게, KV1D261_23(Gs(G4S)4 링커(서열 번호 119)를 사용한 p261-HSA 융합 단백질)보다 약 5배 더 강력하다는 결과가 나왔다.
[표 7]
Figure pct00008
실시예 8
펩티드 HSA 융합 단백질 가공
펩티드 261을 다양한 링커들을 사용하여 인간 혈청 알부민(HSA)을 갖는 융합 단백질로서 가공하였으며, 생성된 융합 단백질들을 이들의 Kv1.3 효력 및 선택성, 그리고 T 세포 활성화의 억제에 대해 시험하였다. 다양한 링커들을 통해 HSA에 접합된 펩티드 261에 대한, IL-2 분비의 억제로서 측정된 T 세포 억제뿐만 아니라 탈륨 플럭스 억제의 결과가 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
Figure pct00009
링커 가공은, 더 연성인 글리신 세린(GS) 링커 대신에 융합 단백질 내로의 더 구조화된 알라닌 프롤린(AP) 반복 링커의 삽입이 효력을 유의하게 개선하였으며, 링커 길이의 증가가 효력을 추가로 향상시켰음을 나타내었다. IDC1(13AA)2(서열 번호 113) 및 IDC1(13AA)3(서열 번호 114) 및 (EAAAK)8(서열 번호 118) 링커 또한 효력을 개선하였지만, 정제 후에 존재하는 융합 단백질 단편들에 의해 단백질 생산 동안 덜 안정한 것으로 나타났다. 펩티드 261이 AS(AP)20GS 링커(서열 번호 116)를 통해 HSA에 접합된 융합 단백질 KV1D261_34는, T 세포 억제 검정에서 Kv1.3에 대한 IC50이 약 4 nM이었으며, 탈륨 플럭스 검정에서 IC50이 약 0.4 nM이었다.
p261 및 p579 HSA 융합체의 특성화
융합 단백질 KV1D261_34 및 상응하는 합성 펩티드 p261뿐만 아니라, AS(AP)20GS 링커(서열 번호 116)를 통해 인간 HSA에 접합되어 융합 단백질 KV1G49.KV1W720을 생성한 펩티드 p579도 다양한 기능적 검정에서, 그리고 인간 Kv 채널들에 대한 이들의 선택성에 대해 추가로 시험하였으며, 이는 표 9에 나타낸 바와 같다.
[표 9]
Figure pct00010
KV1D261_34를 또한 인간 및 돼지(유카탄(Yucatan) 미니피그) 전혈로부터 탑시가르긴-유도 IL-17A 생산을 억제하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 인간 및 미니피그 둘 모두에서의 억제에 대한 IC50 값은 0.5 nM이었다. KV1D261_34는 또한 1.6 nM의 IC50 값으로 미니피그 CD4+ T 세포 활성화(IL-2 분비)를 억제하였다.
실시예 9
추가의 C-말단 연장부 펩티드 융합체들의 생성 및 특성화
펩티드 p261(서열 번호 42) 및 p579(서열 번호 3)를, 몇몇 C-말단 연장부들을 사용하여 연장하고, AS(AP)20GS(서열 번호 116) 또는 GS(AP)20AS 링커(서열 번호 428)를 통해 HSA에 접합하였다. 선택된 융합 단백질들을 발현시키고, 정제하고, 경쟁적 결합, 탈륨 플럭스, 시험관내 인간 CD4+ T 세포 활성화의 억제, 및 전기생리학 검정을 포함한 검정들에서 특성화하였다.
도 7a는 펩티드 p261 상에 다양한 C-말단 연장부들을 갖는 융합 단백질들의 특성을 나타낸다. T 세포 억제를 평가하기 위하여, 선택된 변이체들을 1 nM의 단일 농도에서의 항 CD3/CD28 자극 인간 CD4+ T 세포 IL-2 생산의 억제율(%)에 대해 시험하거나(1 nM에서의 T 세포 억제율(%)), 또는 동일한 검정을 사용하여 농도-반응 곡선으로부터 IC50 값을 도출하였다(T 세포 억제 IC50 nM). 탈륨 플럭스 검정으로부터의 값들을 사용하여 IC50(Kv1.1)/IC50(Kv1.3)의 비로서 배수 선택성을 측정하였다.
C-말단 연장된 펩티드 융합 단백질들에 대한 경쟁적 결합 Ki 값은 약 0.15 nM 내지 약 18.0 nM의 범위였으며, 이와 비교하여 모 KV1D261_34 비연장 펩티드 융합체에 대한 Ki는 약 1 nM이었다. 이들 변이체 중 몇몇은 모 KV1D261_34와 비교하여 개선된 효력 및 선택성을 가졌는데, 탈륨 플럭스 IC50 값은 약 10 pM 내지 약 1 nM의 범위이고, Kv1.1에 대비된 배수 선택성은 약 30 내지 약 800의 범위였다.
선택된 펩티드 융합 단백질들에 대해, 전술된 바와 같이 Kv1.3 형질감염된 CHO 세포주들에서 수동 패치-클램프 연구를 수행하였다. AS(AP)20GS 링커(서열 번호 116)를 통해 HSA에 융합된 KV1G15.KV1W686(AHRH(서열 번호 209)를 사용하는 펩티드 p261의 C-말단 연장부))에 대한 IC50 값은 199 pM이었다. C-말단 삽입체들 중 일부는 모 KV1D261_34에 대비하여 효능에 있어서 약 5 내지 10배의 증가를 가져왔다.
개재하는 GS(AP)20AS(서열 번호 116)에 의해 HSA에 접합된, 선택된 C-말단 연장부를 갖는 것과 갖지 않는 것의 p579의 융합 단백질들을 경쟁적 결합(HEK 세포들에 결합하는 10 nM 아지톡신-cys-TAMRA와의 경쟁) 및 T-세포 억제(IL-2 분비)에서 특성화하였으며, 결과가 도 7b에 나타나 있다. C-말단 삽입체들 중 일부는 모 KV1G49.KV1W720에 대비하여 효력에 있어서 약 3 내지 5배의 증가를 가져왔다.
AS(AP)20GS 링커(서열 번호 116)를 사용하여 펩티드 변이체들에 접합된 몇몇 HSA 융합 단백질들을 PBMC로부터의 사이토카인 및 케모카인(IFNγ, IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL12p70 및 IL-13)의 분비를 유도하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 이들 HSA 융합체에 대해 어떠한 유도도 관찰되지 않았다.
실시예 10
미니피그에서의 KV1D261_34 약동학 및 약력학
KV1D261_34(개재하는 AS(AP)20GS 링커(서열 번호 116)를 갖는 261 펩티드 HSA 융합 단백질)를 단일 정맥내 주사(30 nmol/Kg)로서 미니피그에 투여하였다. 투여 후 다양한 시점에서 헤파린화 혈장 샘플들을 수집하고, 항-261 포획/항-펜타 His-HRP ELISA(anti-261 capture / anti-penta His-HRP ELISA)를 사용하여 혈장 수준을 결정하였다. 도 9는 일수 36까지의 4마리 동물의 평균±SD로서, 그리고 최종 54일 시점에서의 2마리 동물의 평균±SD로서 결과를 나타낸다. 융합 단백질의 반감기(T1/2)는 5 내지 7일이었으며, 이때 클리어런스(CL)는 0.008 내지 0.01 ml/min/Kg이고, 분배 부피(Vss)는 90 내지 120 ml/Kg이었다.
생체외에서 전혈 내의 림프구로부터 IL-17A 분비를 측정함으로써 표적 결합(target engagement)을 평가하였다. KV1D261_34(30 nmol/Kg)의 투여 전 -48, -24, -1시간의 시점들에서, 그리고 투여 후 0.017 내지 1296시간(54일)의 시점들에서 각각의 연구 동물로부터 전혈 샘플을 수집하였다. 전혈 샘플을 1 μM 외인성 261 펩티드의 부재 하 또는 존재 하에서 탑시가르긴으로 처리하였으며, 이때 각각의 조건은 샘플당 3회 반복 시험이었다. IL-17 사이토카인 수준을 항-돼지 IL-17A ELISA에서 측정하였으며, 외인성 펩티드 261에 의한 억제율(%)을 다음과 같이 계산하였다:
100 - (+탑시가르긴 + 1 μM 외인성 261 반응물 중의 평균 IL-17 pg/ml 농도 / +탑시가르긴 반응물 중의 평균 IL-17 pg/ml 농도) × 100.
외인성 261 펩티드에 의한 탑시가르긴-유도 IL-17 분비의 억제율(%)(54일째를 제외한 4마리 동물의 평균±SD, 54일째에서는 2마리 동물을 분석하였음)로 표현된 실험 결과가 도 10에 나타나 있다. 모든 사전투여된 샘플들 및 비투여 대조군 동물에 대한 외인성 261에 의한 탑시가르긴-유도 IL-17 분비의 평균 억제율(%)(모든 시점들)은 75.3±14.1%였다. 생체외에서의 전혈 중의 외인성 261에 의한 탑시가르긴-유도 IL-17 분비의 평균 억제율(%)은 KV1D261-34의 IV 투여 후 대략 14일 동안 25% 이하였으며, 이는 순환하는 KV1D261_34에 의한 고수준의 표적 결합을 나타낸다. 이들 시점에서의 혈장 농도는 10 nM 초과였다. 나중의 시점들에서, 외인성 261에 의한 탑시가르긴-유도 IL-17 분비의 억제율(%)은 일수 36에서 65% 초과까지 증가되었고 일수 54까지 80% 이상의 기준선 수준에 도달하였는데, 이는 혈장 수준이 하강됨에 따른 표적 결합의 점차적인 감소를 나타낸다. 이 연구 결과는 KV1D261_34가 생체내 혈장 중에서 안정하고 미니피그에서 긴 혈장 반감기를 가짐을 보여준다. 정맥내 투여 후, 순환하는 KV1D261_34는 생체이용가능하고, 림프구에 대한 탑시가르긴-유도 IL-17 분비를 억제한다. 탑시가르긴-유도 IL-17 분비의 억제는 혈장 농도와 양호하게 상관된 것으로 나타났으며, 유효 혈장 농도는 KV1D261_34의 작용(Kv1.3 차단)의 제안된 기전과 일치하였다.
실시예 11
미니피그 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)-유도 지연형 과민증(DTH) 모델
미니피그 지연형 과민증(DTH) 모델을 생체내 모델로서 사용하여, T 세포 기능을 억제하는 KV1D261_34의 능력을 평가하였다. 미니피그에 비히클(PBS, n = 6) 또는 KV1D261_34(30 nmol/㎏, n = 6)를 IV 투여하였다. 양성 대조군으로서, 사이클로스포린 A를 일수 -1부터 부검시까지 10 mg/ml의 농도로 1 ml/㎏으로 일일 2회 피하 투여하였다(n = 6). KLH 항원으로 면역화하기 1일 전(일수 -1)에 투여가 개시되었다. 불완전 프로인트 애쥬번트(Incomplete Freund Adjuvant, IFA) 중 5 mg/ml KLH의, 또는 대조군을 위한 IFA 중 PBS의 1 ml의 피하 주사에 의해 일수 0에서 KLH로 미니피그들을 면역화하였다. 뒷다리의 꼬리측 상의 약 5 위치에 주사를 실시하였다. 이어서, 동물들에게 일수 7에 10, 5, 2.5, 1.25 mg/ml의 KLH, 또는 PBS를 사용하여 0.1 ml/스폿의 진피내 주사를 시험투여하였는데, 이때 시험투여 용량당 하나의 스폿은 좌측에 있고, 2개의 반복된 시험투여 스폿은 우측에 있었다. 시험투여 후 1일째 및 2일째인 일수 9 및 일수 10에 경결(induration) 수준을 측정하였으며, 일수 10에 배출 림프절 세포충실도(cellularity), 항-항원 항체 역가, 및 시험투여 부위 조직학의 추가 측정을 위하여 조직 및 혈액 샘플들을 수집하였다.
림프절 세포충실도를 결정하기 위하여, 배출 림프절을 시험투여 후 2일째인 일수 10에 수집하였다. 결과가 도 11에 나타나 있다. KV1D261_34 처리된 동물들은, 비히클 처리된 시험투여된 동물들과 비교할 때, 유의하게 감소된 세포충실도를 가졌다. 비면역화 대조군 동물들에서 관찰된 것에 비견되는 수준으로 세포충실도를 감소시켰다.
일수 9 및 일수 10(시험투여 후 1일째 및 2일째)에서 KV1D261_34 투여된 동물에서는, 경결 또는 항-KLH 항체 역가의 유의한 감소가 관찰되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Chi, Ellen Edwards, Wilson Huang, Chichi Leung, Wai-Ping Swanson, Ronald Wickenden, Alan <120> Kv1.3 antagonists and methods of use <130> JBI5021WOPCT <140> To Be Assigned <141> 2014-01-24 <150> 61/757389 <151> 2013-01-28 <150> 61/756777 <151> 2013-01-25 <160> 433 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Odontobuthus doriae <400> 1 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Gly Ser Pro Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Orthochirus scrobiculosus <400> 2 Gly Val Ile Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 3 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Glu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 4 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 4 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Asp Cys Thr Pro Lys 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 5 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Val Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 6 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 6 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Ala Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 7 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 7 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Glu 35 <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 8 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Leu Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 9 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ala Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 10 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met His Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 11 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Asp Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 12 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Glu Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 13 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 13 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Glu Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 14 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 14 Leu Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 15 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 15 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Asp Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 16 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 16 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Asp Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 17 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 17 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Glu Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 18 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 18 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Arg Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 19 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 19 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Lys Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 20 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 20 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Leu Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 21 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 21 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Ala Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 22 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 22 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 23 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 23 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Glu 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 24 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 24 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 25 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 25 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Val Cys Thr Pro Lys 35 <210> 26 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 26 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 27 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 27 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ala Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 28 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 28 His Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 29 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 29 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 30 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 30 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Glu Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 31 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 31 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Val Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 32 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 32 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 33 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 33 Gly Val Pro Thr Asp Val Glu Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 34 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 34 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 35 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 35 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 36 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 36 Gly Val Ile Thr Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 37 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 37 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Leu 35 <210> 38 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 38 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys His Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 39 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 39 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Leu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 40 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 40 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Gln Cys Thr Pro Lys 35 <210> 41 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 41 Val Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 42 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 42 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 43 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 43 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 44 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 44 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 45 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 45 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 46 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 46 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 47 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 47 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Gln Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 48 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 48 Gly Val Pro Thr Asp Val Asp Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 49 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 49 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Asp 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 50 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 50 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Leu Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 51 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 51 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Val 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 52 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 52 Asp Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 53 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 53 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Asp Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 54 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 54 Gln Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 55 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 55 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Gly Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 56 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 56 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Asp Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 57 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 57 Gly Val Pro Thr Asp Val Gln Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 58 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 58 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr His Lys 35 <210> 59 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 59 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Gln Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 60 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 60 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Asp Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 61 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 61 Gly Val Pro Thr Asp Val Ala Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 62 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 62 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro His 35 <210> 63 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 63 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 64 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 64 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Asp 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 65 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 65 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Val Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 66 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 66 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Gln 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 67 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 67 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly His 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 68 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 68 Gly Val Pro Thr Asp Ala Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 69 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 69 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 70 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 70 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 71 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 71 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 72 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 72 Gly Val Ile Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 73 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 73 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 74 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 74 Gly Val Pro Thr Asp Val Leu Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 75 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 75 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Val Lys 35 <210> 76 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 76 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Lys Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 77 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 77 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Arg Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 78 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 78 Gly Val Pro Gln Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 79 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 79 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Glu Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 80 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 80 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala His Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 81 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 81 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ala Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 82 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 82 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 83 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 83 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 84 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 84 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 85 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 85 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 86 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 86 Gly Val Ile Ile Asp Val Lys Cys Arg Gly Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys Asn Cys Thr Pro Lys 35 <210> 87 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 87 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 88 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 88 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 89 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 89 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Pro Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 90 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 90 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Pro Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 91 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 91 Ala Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 92 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 92 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 93 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 93 Gly Val Val Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 94 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 94 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Gln 35 <210> 95 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 95 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Glu Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 96 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 96 Gly Val Pro Glu Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 97 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 97 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 98 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 98 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 99 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 99 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 100 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 100 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 101 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 101 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 102 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 102 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 103 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 103 Gly Val Pro Thr Asn Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 104 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 104 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 105 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 105 Gly Val Ile Thr Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 106 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 106 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 107 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 107 Gly Val Pro Ile Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Pro Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 108 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 108 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu His 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 109 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 109 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Gln Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 110 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 110 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Leu Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 111 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 111 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Leu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys 35 <210> 112 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 112 Ala Ser Leu Asp Thr Thr Ala Glu Asn Gln Ala Lys Asn Glu His Leu 1 5 10 15 Gln Lys Glu Asn Glu Arg Leu Leu Arg Asp Trp Asn Asp Val Gln Gly 20 25 30 Arg Phe Glu Lys Gly Ser 35 <210> 113 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 113 Ala Ser Glu Lys Asn Lys Arg Ser Thr Pro Tyr Ile Glu Arg Ala Glu 1 5 10 15 Lys Asn Lys Arg Ser Thr Pro Tyr Ile Glu Arg Ala Gly Ser 20 25 30 <210> 114 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 114 Ala Ser Glu Lys Asn Lys Arg Ser Thr Pro Tyr Ile Glu Arg Ala Glu 1 5 10 15 Lys Asn Lys Arg Ser Thr Pro Tyr Ile Glu Arg Ala Glu Lys Asn Lys 20 25 30 Arg Ser Thr Pro Tyr Ile Glu Arg Ala Gly Ser 35 40 <210> 115 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 115 Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Gly Ser 20 <210> 116 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 116 Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Gly Ser 35 40 <210> 117 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 117 Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser 20 25 <210> 118 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 118 Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 20 25 30 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser 35 40 45 <210> 119 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 119 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 120 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 120 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 121 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 121 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 122 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 122 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser <210> 123 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 123 His Ala Ala Gly 1 <210> 124 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 124 Arg Arg Pro Thr 1 <210> 125 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 125 Ala Ser Lys Pro 1 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 126 Pro Lys Pro Gln 1 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 127 Gln Asp Gln Thr 1 <210> 128 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 128 Ala His Arg Pro 1 <210> 129 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 129 Gln Pro Thr His 1 <210> 130 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 130 Arg Glu Gln Thr 1 <210> 131 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 131 Pro Pro Lys Pro 1 <210> 132 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 132 Lys Gln Gly Ala 1 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 133 Thr Arg Pro Ala 1 <210> 134 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 134 Ala Pro His Lys 1 <210> 135 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 135 Arg Thr Glu His 1 <210> 136 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 136 Pro Thr His Thr 1 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 137 Arg Ala Glu Lys 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 138 Pro Ala Pro Ala 1 <210> 139 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 139 Ser His Arg Pro 1 <210> 140 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 140 Ser His Arg Pro 1 <210> 141 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 141 Pro Pro Thr Arg 1 <210> 142 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 142 His His Thr Thr 1 <210> 143 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 143 His Arg Pro Ala 1 <210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 144 Lys Ala His Pro 1 <210> 145 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 145 Gln Thr Thr Gln 1 <210> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 146 Pro Thr Pro Thr 1 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 147 Thr Gln Ala Pro 1 <210> 148 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 148 Arg Lys Pro His 1 <210> 149 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 149 His Thr Pro Pro 1 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 150 Thr Lys Pro Pro 1 <210> 151 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 151 Pro Arg Pro Thr 1 <210> 152 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 152 Lys Gln Thr Ala 1 <210> 153 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 153 Pro His Thr Pro 1 <210> 154 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 154 His Thr Pro Pro 1 <210> 155 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 155 His Ala Lys Pro 1 <210> 156 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 156 Thr Arg Arg Pro 1 <210> 157 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 157 Pro Thr Thr Pro 1 <210> 158 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 158 Arg Gln His Ala 1 <210> 159 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 159 Pro Thr Arg Pro 1 <210> 160 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 160 Pro Ala Pro His 1 <210> 161 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 161 Ala Asp Lys Pro 1 <210> 162 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 162 Pro His His Gln 1 <210> 163 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 163 Gly Arg Arg Thr 1 <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 164 Arg Pro Asp Ala 1 <210> 165 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 165 Asn His Arg Pro 1 <210> 166 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 166 Asn His Gln Gly 1 <210> 167 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 167 Thr Ala Pro Pro 1 <210> 168 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 168 Arg His Pro His 1 <210> 169 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 169 Pro Ser Arg Pro 1 <210> 170 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 170 Pro Gln His Gln 1 <210> 171 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 171 Pro Thr Gln His 1 <210> 172 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 172 His Thr Lys Pro 1 <210> 173 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 173 Arg Lys Lys Pro 1 <210> 174 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 174 His Asn Arg Pro 1 <210> 175 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 175 Pro Glu Lys Pro 1 <210> 176 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 176 Arg Ala Gln Thr 1 <210> 177 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 177 Pro Ala Ala Thr 1 <210> 178 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 178 Arg Thr Glu Gln 1 <210> 179 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 179 Pro Pro Ala Lys 1 <210> 180 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 180 Glu Pro Arg Pro 1 <210> 181 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 181 Thr Ala Thr His 1 <210> 182 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 182 Ala Arg Pro Asp 1 <210> 183 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 183 Ala His Pro His 1 <210> 184 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 184 Ala Ala Pro Ser 1 <210> 185 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 185 Arg Pro Arg Pro 1 <210> 186 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 186 Pro Asp Lys Pro 1 <210> 187 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 187 Thr Pro His Pro 1 <210> 188 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 188 Arg Thr Arg Pro 1 <210> 189 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 189 Ala Gln Gln His 1 <210> 190 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 190 Thr Arg Arg Pro 1 <210> 191 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 191 Thr Arg Arg Pro 1 <210> 192 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 192 Arg Gln Pro Pro 1 <210> 193 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 193 Arg Thr Pro Pro 1 <210> 194 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 194 Glu Lys Pro Thr 1 <210> 195 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 195 Gly His Thr Ala 1 <210> 196 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 196 Pro Thr Lys Pro 1 <210> 197 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 197 Pro Thr Thr Pro 1 <210> 198 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 198 Thr Gly His Thr 1 <210> 199 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 199 Gly Gly Pro Gln 1 <210> 200 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 200 His Arg Arg Gln 1 <210> 201 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 201 His Asn Ala Pro 1 <210> 202 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 202 Pro Gln Pro Gln 1 <210> 203 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 203 Asn Arg Arg Pro 1 <210> 204 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 204 Gln Ala Ala Pro 1 <210> 205 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 205 Gln Pro Gln Asp 1 <210> 206 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 206 Ala Thr Arg Pro 1 <210> 207 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 207 Asn Arg Pro Pro 1 <210> 208 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 208 Arg Arg Arg Pro 1 <210> 209 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 209 Ala His Arg His 1 <210> 210 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 210 Ala Gln Arg Pro 1 <210> 211 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 211 Thr Ser Asp Thr 1 <210> 212 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 212 Arg Arg Pro Gly 1 <210> 213 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 213 Gln Ser Lys Ala 1 <210> 214 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 214 Ala Gly Pro Arg 1 <210> 215 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 215 Arg Ser Arg Thr 1 <210> 216 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 216 Arg His Lys Arg 1 <210> 217 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 217 Asn Ala Ala Lys 1 <210> 218 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 218 Ala Pro His Thr 1 <210> 219 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 219 Gly Gly Lys Arg 1 <210> 220 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 220 Arg Arg Glu Pro 1 <210> 221 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 221 His Thr Arg Thr 1 <210> 222 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 222 Asn His Arg Thr 1 <210> 223 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 223 Pro Asn Arg Thr 1 <210> 224 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 224 Pro Lys Thr Ala 1 <210> 225 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 225 Thr Arg Arg Pro 1 <210> 226 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 226 Arg His Asn Thr 1 <210> 227 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 227 Thr Asp Ala Arg 1 <210> 228 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 228 His Arg Gln Gln 1 <210> 229 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 229 Asn Gln Arg Thr 1 <210> 230 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 230 Arg Pro Arg His 1 <210> 231 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 231 His Asn Glu Thr 1 <210> 232 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 232 Ala Arg Asn Ala 1 <210> 233 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 233 Thr Thr Arg Thr 1 <210> 234 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 234 Ala Arg Arg Asn 1 <210> 235 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 235 Thr Gly Arg Lys 1 <210> 236 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 236 Ala Ser Asp Asn 1 <210> 237 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 237 His Glu Arg Thr 1 <210> 238 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 238 Thr Pro His Arg 1 <210> 239 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 239 Arg Arg Thr Ala 1 <210> 240 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 240 Asn Thr Arg Thr 1 <210> 241 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 241 Pro Thr Thr Arg 1 <210> 242 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 242 Gln Arg Asn Gly 1 <210> 243 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 243 Ala His Arg Asn 1 <210> 244 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 244 Pro Arg Ser Ala 1 <210> 245 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 245 Gln Arg Gln Ser 1 <210> 246 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 246 Gln Arg Arg Lys 1 <210> 247 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 247 Ala Arg Ala Lys 1 <210> 248 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 248 Arg Thr Arg Gln 1 <210> 249 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 249 Ala Lys Arg Asp 1 <210> 250 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 250 Asp Asp Gly Ala 1 <210> 251 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 251 Arg Asp Lys Thr 1 <210> 252 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 252 His Arg Arg Lys 1 <210> 253 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 253 Arg Gln Thr Arg 1 <210> 254 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 254 Pro Asn Arg Asp 1 <210> 255 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 255 His Arg His Lys 1 <210> 256 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 256 His Arg Asn Arg 1 <210> 257 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 257 Arg Ala Lys Arg 1 <210> 258 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 258 Gln Arg Thr Arg 1 <210> 259 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 259 Ala Thr Arg His 1 <210> 260 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 260 Ala Arg Arg Ser 1 <210> 261 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 261 Ala Lys Thr Arg 1 <210> 262 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 262 Asn Ala Arg Gln 1 <210> 263 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 263 Asn Arg Gln Arg 1 <210> 264 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 264 Pro Thr Asn Ala 1 <210> 265 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 265 Thr Arg Thr Asp 1 <210> 266 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 266 Ala Asp Thr Arg 1 <210> 267 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 267 Thr Ser Arg Gln 1 <210> 268 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 268 Pro Arg Asn Thr 1 <210> 269 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 269 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Ala Ala Gly 35 40 <210> 270 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 270 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Arg Pro Thr 35 40 <210> 271 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 271 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Ser Lys Pro 35 40 <210> 272 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 272 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Lys Pro Gln 35 40 <210> 273 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 273 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Asp Gln Thr 35 40 <210> 274 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 274 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala His Arg Pro 35 40 <210> 275 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 275 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Pro Thr His 35 40 <210> 276 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 276 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Glu Gln Thr 35 40 <210> 277 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 277 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Pro Lys Pro 35 40 <210> 278 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 278 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Lys Gln Gly Ala 35 40 <210> 279 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 279 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Arg Pro Ala 35 40 <210> 280 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 280 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Pro His Lys 35 40 <210> 281 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 281 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Thr Glu His 35 40 <210> 282 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 282 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr His Thr 35 40 <210> 283 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 283 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Ala Glu Lys 35 40 <210> 284 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 284 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Ala Pro Ala 35 40 <210> 285 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 285 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ser His Arg Pro 35 40 <210> 286 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 286 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ser His Arg Pro 35 40 <210> 287 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 287 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Pro Thr Arg 35 40 <210> 288 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 288 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His His Thr Thr 35 40 <210> 289 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 289 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Arg Pro Ala 35 40 <210> 290 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 290 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Lys Ala His Pro 35 40 <210> 291 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 291 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Thr Thr Gln 35 40 <210> 292 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 292 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Pro Thr 35 40 <210> 293 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 293 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Gln Ala Pro 35 40 <210> 294 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 294 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Lys Pro His 35 40 <210> 295 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 295 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Thr Pro Pro 35 40 <210> 296 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 296 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Lys Pro Pro 35 40 <210> 297 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 297 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Arg Pro Thr 35 40 <210> 298 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 298 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Lys Gln Thr Ala 35 40 <210> 299 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 299 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro His Thr Pro 35 40 <210> 300 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 300 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Thr Pro Pro 35 40 <210> 301 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 301 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Ala Lys Pro 35 40 <210> 302 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 302 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Arg Arg Pro 35 40 <210> 303 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 303 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Thr Pro 35 40 <210> 304 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 304 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Gln His Ala 35 40 <210> 305 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 305 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Arg Pro 35 40 <210> 306 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 306 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Ala Pro His 35 40 <210> 307 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 307 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Asp Lys Pro 35 40 <210> 308 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 308 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro His His Gln 35 40 <210> 309 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 309 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gly Arg Arg Thr 35 40 <210> 310 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 310 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Pro Asp Ala 35 40 <210> 311 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 311 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn His Arg Pro 35 40 <210> 312 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 312 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn His Gln Gly 35 40 <210> 313 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 313 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Ala Pro Pro 35 40 <210> 314 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 314 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg His Pro His 35 40 <210> 315 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 315 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Ser Arg Pro 35 40 <210> 316 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 316 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Gln His Gln 35 40 <210> 317 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 317 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Gln His 35 40 <210> 318 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 318 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Thr Lys Pro 35 40 <210> 319 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 319 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Lys Lys Pro 35 40 <210> 320 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 320 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Asn Arg Pro 35 40 <210> 321 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 321 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Glu Lys Pro 35 40 <210> 322 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 322 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Ala Gln Thr 35 40 <210> 323 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 323 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Ala Ala Thr 35 40 <210> 324 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 324 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Thr Glu Gln 35 40 <210> 325 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 325 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Pro Ala Lys 35 40 <210> 326 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 326 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Glu Pro Arg Pro 35 40 <210> 327 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 327 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Ala Thr His 35 40 <210> 328 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 328 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Arg Pro Asp 35 40 <210> 329 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 329 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala His Pro His 35 40 <210> 330 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 330 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Ala Pro Ser 35 40 <210> 331 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 331 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Pro Arg Pro 35 40 <210> 332 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 332 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Asp Lys Pro 35 40 <210> 333 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 333 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Pro His Pro 35 40 <210> 334 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 334 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Thr Arg Pro 35 40 <210> 335 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 335 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Gln Gln His 35 40 <210> 336 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 336 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Arg Arg Pro 35 40 <210> 337 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 337 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Arg Arg Pro 35 40 <210> 338 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 338 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Gln Pro Pro 35 40 <210> 339 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 339 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Thr Pro Pro 35 40 <210> 340 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 340 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Glu Lys Pro Thr 35 40 <210> 341 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 341 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gly His Thr Ala 35 40 <210> 342 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 342 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Lys Pro 35 40 <210> 343 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 343 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Thr Pro 35 40 <210> 344 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 344 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Gly His Thr 35 40 <210> 345 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 345 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gly Gly Pro Gln 35 40 <210> 346 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 346 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Arg Arg Gln 35 40 <210> 347 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 347 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Asn Ala Pro 35 40 <210> 348 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 348 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Gln 35 40 <210> 349 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 349 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Arg Arg Pro 35 40 <210> 350 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 350 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Ala Ala Pro 35 40 <210> 351 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 351 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Pro Gln Asp 35 40 <210> 352 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 352 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Thr Arg Pro 35 40 <210> 353 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 353 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Arg Pro Pro 35 40 <210> 354 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 354 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Arg Arg Pro 35 40 <210> 355 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 355 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala His Arg His 35 40 <210> 356 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 356 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Gln Arg Pro 35 40 <210> 357 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 357 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Ser Asp Thr 35 40 <210> 358 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 358 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Arg Pro Gly 35 40 <210> 359 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 359 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Ser Lys Ala 35 40 <210> 360 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 360 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Gly Pro Arg 35 40 <210> 361 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 361 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Ser Arg Thr 35 40 <210> 362 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 362 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg His Lys Arg 35 40 <210> 363 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 363 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Ala Ala Lys 35 40 <210> 364 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 364 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Pro His Thr 35 40 <210> 365 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 365 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gly Gly Lys Arg 35 40 <210> 366 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 366 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Arg Glu Pro 35 40 <210> 367 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 367 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Thr Arg Thr 35 40 <210> 368 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 368 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn His Arg Thr 35 40 <210> 369 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 369 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Asn Arg Thr 35 40 <210> 370 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 370 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Lys Thr Ala 35 40 <210> 371 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 371 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Arg Arg Pro 35 40 <210> 372 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 372 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg His Asn Thr 35 40 <210> 373 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 373 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Asp Ala Arg 35 40 <210> 374 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 374 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Arg Gln Gln 35 40 <210> 375 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 375 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Gln Arg Thr 35 40 <210> 376 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 376 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Pro Arg His 35 40 <210> 377 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 377 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Asn Glu Thr 35 40 <210> 378 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 378 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Arg Asn Ala 35 40 <210> 379 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 379 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Thr Arg Thr 35 40 <210> 380 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 380 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Arg Arg Asn 35 40 <210> 381 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 381 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Gly Arg Lys 35 40 <210> 382 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 382 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Ser Asp Asn 35 40 <210> 383 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 383 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Glu Arg Thr 35 40 <210> 384 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 384 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Pro His Arg 35 40 <210> 385 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 385 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Arg Thr Ala 35 40 <210> 386 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 386 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Thr Arg Thr 35 40 <210> 387 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 387 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Thr Arg 35 40 <210> 388 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 388 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Arg Asn Gly 35 40 <210> 389 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 389 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala His Arg Asn 35 40 <210> 390 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 390 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Arg Ser Ala 35 40 <210> 391 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 391 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Arg Gln Ser 35 40 <210> 392 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 392 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Arg Arg Lys 35 40 <210> 393 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 393 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Arg Ala Lys 35 40 <210> 394 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 394 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Thr Arg Gln 35 40 <210> 395 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 395 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Lys Arg Asp 35 40 <210> 396 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 396 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asp Asp Gly Ala 35 40 <210> 397 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 397 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Asp Lys Thr 35 40 <210> 398 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 398 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Arg Arg Lys 35 40 <210> 399 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 399 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Gln Thr Arg 35 40 <210> 400 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 400 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Asn Arg Asp 35 40 <210> 401 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 401 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Arg His Lys 35 40 <210> 402 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 402 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys His Arg Asn Arg 35 40 <210> 403 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 403 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Arg Ala Lys Arg 35 40 <210> 404 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 404 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gln Arg Thr Arg 35 40 <210> 405 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 405 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Thr Arg His 35 40 <210> 406 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 406 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Arg Arg Ser 35 40 <210> 407 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 407 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Lys Thr Arg 35 40 <210> 408 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 408 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Ala Arg Gln 35 40 <210> 409 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 409 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Asn Arg Gln Arg 35 40 <210> 410 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 410 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Thr Asn Ala 35 40 <210> 411 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 411 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Arg Thr Asp 35 40 <210> 412 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 412 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Asp Thr Arg 35 40 <210> 413 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 413 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Ser Arg Gln 35 40 <210> 414 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 414 Gly Val Pro Ile Asn Val Lys Cys Lys Ile Ser Arg Gln Cys Ile Glu 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Pro Arg Asn Thr 35 40 <210> 415 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 415 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Glu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala His Arg His 35 40 <210> 416 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 416 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Glu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Thr Gly Arg Lys 35 40 <210> 417 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <400> 417 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Ile Ser Arg Gln Cys Glu Lys 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Ala Arg Arg Asn 35 40 <210> 418 <211> 575 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 418 Met Asp Glu Arg Leu Ser Leu Leu Arg Ser Pro Pro Pro Pro Ser Ala 1 5 10 15 Arg His Arg Ala His Pro Pro Gln Arg Pro Ala Ser Ser Gly Gly Ala 20 25 30 His Thr Leu Val Asn His Gly Tyr Ala Glu Pro Ala Ala Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Pro Pro Asp Met Thr Val Val Pro Gly Asp His Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Val Ala Asp Gly Gly Gly Ala Pro Pro Gln Gly Gly Cys Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Cys Asp Arg Tyr Glu Pro Leu Pro Pro Ser Leu Pro Ala Ala 85 90 95 Gly Glu Gln Asp Cys Cys Gly Glu Arg Val Val Ile Asn Ile Ser Gly 100 105 110 Leu Arg Phe Glu Thr Gln Leu Lys Thr Leu Cys Gln Phe Pro Glu Thr 115 120 125 Leu Leu Gly Asp Pro Lys Arg Arg Met Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg 130 135 140 Asn Glu Tyr Phe Phe Asp Arg Asn Arg Pro Ser Phe Asp Ala Ile Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gly Gly Arg Ile Arg Arg Pro Val Asn Val Pro 165 170 175 Ile Asp Ile Phe Ser Glu Glu Ile Arg Phe Tyr Gln Leu Gly Glu Glu 180 185 190 Ala Met Glu Lys Phe Arg Glu Asp Glu Gly Phe Leu Arg Glu Glu Glu 195 200 205 Arg Pro Leu Pro Arg Arg Asp Phe Gln Arg Gln Val Trp Leu Leu Phe 210 215 220 Glu Tyr Pro Glu Ser Ser Gly Pro Ala Arg Gly Ile Ala Ile Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Val Ile Leu Ile Ser Ile Val Ile Phe Cys Leu Glu Thr Leu 245 250 255 Pro Glu Phe Arg Asp Glu Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Thr Ser Gln Asp 260 265 270 Ser Phe Glu Ala Ala Gly Asn Ser Thr Ser Gly Ser Arg Ala Gly Ala 275 280 285 Ser Ser Phe Ser Asp Pro Phe Phe Val Val Glu Thr Leu Cys Ile Ile 290 295 300 Trp Phe Ser Phe Glu Leu Leu Val Arg Phe Phe Ala Cys Pro Ser Lys 305 310 315 320 Ala Thr Phe Ser Arg Asn Ile Met Asn Leu Ile Asp Ile Val Ala Ile 325 330 335 Ile Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Thr Glu Leu Ala Glu Arg Gln Gly 340 345 350 Asn Gly Gln Gln Ala Met Ser Leu Ala Ile Leu Arg Val Ile Arg Leu 355 360 365 Val Arg Val Phe Arg Ile Phe Lys Leu Ser Arg His Ser Lys Gly Leu 370 375 380 Gln Ile Leu Gly Gln Thr Leu Lys Ala Ser Met Arg Glu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Leu Ile Phe Phe Leu Phe Ile Gly Val Ile Leu Phe Ser Ser Ala Val 405 410 415 Tyr Phe Ala Glu Ala Asp Asp Pro Thr Ser Gly Phe Ser Ser Ile Pro 420 425 430 Asp Ala Phe Trp Trp Ala Val Val Thr Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly 435 440 445 Asp Met His Pro Val Thr Ile Gly Gly Lys Ile Val Gly Ser Leu Cys 450 455 460 Ala Ile Ala Gly Val Leu Thr Ile Ala Leu Pro Val Pro Val Ile Val 465 470 475 480 Ser Asn Phe Asn Tyr Phe Tyr His Arg Glu Thr Glu Gly Glu Glu Gln 485 490 495 Ser Gln Tyr Met His Val Gly Ser Cys Gln His Leu Ser Ser Ser Ala 500 505 510 Glu Glu Leu Arg Lys Ala Arg Ser Asn Ser Thr Leu Ser Lys Ser Glu 515 520 525 Tyr Met Val Ile Glu Glu Gly Gly Met Asn His Ser Ala Phe Pro Gln 530 535 540 Thr Pro Phe Lys Thr Gly Asn Ser Thr Ala Thr Cys Thr Thr Asn Asn 545 550 555 560 Asn Pro Asn Ser Cys Val Asn Ile Lys Lys Ile Phe Thr Asp Val 565 570 575 <210> 419 <211> 499 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Met Thr Val Ala Thr Gly Asp Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Leu Pro 1 5 10 15 Gly His Pro Gln Asp Thr Tyr Asp Pro Glu Ala Asp His Glu Cys Cys 20 25 30 Glu Arg Val Val Ile Asn Ile Ser Gly Leu Arg Phe Glu Thr Gln Leu 35 40 45 Lys Thr Leu Ala Gln Phe Pro Glu Thr Leu Leu Gly Asp Pro Lys Lys 50 55 60 Arg Met Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg Asn Glu Tyr Phe Phe Asp Arg 65 70 75 80 Asn Arg Pro Ser Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gly Gly 85 90 95 Arg Leu Arg Arg Pro Val Asn Val Pro Leu Asp Ile Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Ile Arg Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Glu Ala Met Glu Met Phe Arg Glu 115 120 125 Asp Glu Gly Tyr Ile Lys Glu Glu Glu Arg Pro Leu Pro Glu Asn Glu 130 135 140 Phe Gln Arg Gln Val Trp Leu Leu Phe Glu Tyr Pro Glu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Ile Ile Ala Ile Val Ser Val Met Val Ile Leu Ile Ser 165 170 175 Ile Val Ser Phe Cys Leu Glu Thr Leu Pro Ile Phe Arg Asp Glu Asn 180 185 190 Glu Asp Met His Gly Ser Gly Val Thr Phe His Thr Tyr Ser Asn Ser 195 200 205 Thr Ile Gly Tyr Gln Gln Ser Thr Ser Phe Thr Asp Pro Phe Phe Ile 210 215 220 Val Glu Thr Leu Cys Ile Ile Trp Phe Ser Phe Glu Phe Leu Val Arg 225 230 235 240 Phe Phe Ala Cys Pro Ser Lys Ala Gly Phe Phe Thr Asn Ile Met Asn 245 250 255 Ile Ile Asp Ile Val Ala Ile Ile Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Thr 260 265 270 Glu Leu Ala Glu Lys Pro Glu Asp Ala Gln Gln Gly Gln Gln Ala Met 275 280 285 Ser Leu Ala Ile Leu Arg Val Ile Arg Leu Val Arg Val Phe Arg Ile 290 295 300 Phe Lys Leu Ser Arg His Ser Lys Gly Leu Gln Ile Leu Gly Gln Thr 305 310 315 320 Leu Lys Ala Ser Met Arg Glu Leu Gly Leu Leu Ile Phe Phe Leu Phe 325 330 335 Ile Gly Val Ile Leu Phe Ser Ser Ala Val Tyr Phe Ala Glu Ala Asp 340 345 350 Glu Arg Glu Ser Gln Phe Pro Ser Ile Pro Asp Ala Phe Trp Trp Ala 355 360 365 Val Val Ser Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Met Val Pro Thr Thr 370 375 380 Ile Gly Gly Lys Ile Val Gly Ser Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Leu 385 390 395 400 Thr Ile Ala Leu Pro Val Pro Val Ile Val Ser Asn Phe Asn Tyr Phe 405 410 415 Tyr His Arg Glu Thr Glu Gly Glu Glu Gln Ala Gln Tyr Leu Gln Val 420 425 430 Thr Ser Cys Pro Lys Ile Pro Ser Ser Pro Asp Leu Lys Lys Ser Arg 435 440 445 Ser Ala Ser Thr Ile Ser Lys Ser Asp Tyr Met Glu Ile Gln Glu Gly 450 455 460 Val Asn Asn Ser Asn Glu Asp Phe Arg Glu Glu Asn Leu Lys Thr Ala 465 470 475 480 Asn Cys Thr Leu Ala Asn Thr Asn Tyr Val Asn Ile Thr Lys Met Leu 485 490 495 Thr Asp Val <210> 420 <211> 495 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 420 Met Thr Val Met Ser Gly Glu Asn Val Asp Glu Ala Ser Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly His Pro Gln Asp Gly Ser Tyr Pro Arg Gln Ala Asp His Asp Asp 20 25 30 His Glu Cys Cys Glu Arg Val Val Ile Asn Ile Ser Gly Leu Arg Phe 35 40 45 Glu Thr Gln Leu Lys Thr Leu Ala Gln Phe Pro Asn Thr Leu Leu Gly 50 55 60 Asn Pro Lys Lys Arg Met Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg Asn Glu Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Asp Arg Asn Arg Pro Ser Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr Tyr 85 90 95 Gln Ser Gly Gly Arg Leu Arg Arg Pro Val Asn Val Pro Leu Asp Met 100 105 110 Phe Ser Glu Glu Ile Lys Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Glu Ala Met Glu 115 120 125 Lys Phe Arg Glu Asp Glu Gly Phe Ile Lys Glu Glu Glu Arg Pro Leu 130 135 140 Pro Glu Lys Glu Tyr Gln Arg Gln Val Trp Leu Leu Phe Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Glu Ser Ser Gly Pro Ala Arg Val Ile Ala Ile Val Ser Val Met Val 165 170 175 Ile Leu Ile Ser Ile Val Ile Phe Cys Leu Glu Thr Leu Pro Glu Leu 180 185 190 Lys Asp Asp Lys Asp Phe Thr Gly Thr Val His Arg Ile Asp Asn Thr 195 200 205 Thr Val Ile Tyr Asn Ser Asn Ile Phe Thr Asp Pro Phe Phe Ile Val 210 215 220 Glu Thr Leu Cys Ile Ile Trp Phe Ser Phe Glu Leu Val Val Arg Phe 225 230 235 240 Phe Ala Cys Pro Ser Lys Thr Asp Phe Phe Lys Asn Ile Met Asn Phe 245 250 255 Ile Asp Ile Val Ala Ile Ile Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Thr Glu 260 265 270 Ile Ala Glu Gln Glu Gly Asn Gln Lys Gly Glu Gln Ala Thr Ser Leu 275 280 285 Ala Ile Leu Arg Val Ile Arg Leu Val Arg Val Phe Arg Ile Phe Lys 290 295 300 Leu Ser Arg His Ser Lys Gly Leu Gln Ile Leu Gly Gln Thr Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ser Met Arg Glu Leu Gly Leu Leu Ile Phe Phe Leu Phe Ile Gly 325 330 335 Val Ile Leu Phe Ser Ser Ala Val Tyr Phe Ala Glu Ala Glu Glu Ala 340 345 350 Glu Ser His Phe Ser Ser Ile Pro Asp Ala Phe Trp Trp Ala Val Val 355 360 365 Ser Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Met Tyr Pro Val Thr Ile Gly 370 375 380 Gly Lys Ile Val Gly Ser Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Leu Thr Ile 385 390 395 400 Ala Leu Pro Val Pro Val Ile Val Ser Asn Phe Asn Tyr Phe Tyr His 405 410 415 Arg Glu Thr Glu Gly Glu Glu Gln Ala Gln Leu Leu His Val Ser Ser 420 425 430 Pro Asn Leu Ala Ser Asp Ser Asp Leu Ser Arg Arg Ser Ser Ser Thr 435 440 445 Met Ser Lys Ser Glu Tyr Met Glu Ile Glu Glu Asp Met Asn Asn Ser 450 455 460 Ile Ala His Tyr Arg Gln Val Asn Ile Arg Thr Ala Asn Cys Thr Thr 465 470 475 480 Ala Asn Gln Asn Cys Val Asn Lys Ser Lys Leu Leu Thr Asp Val 485 490 495 <210> 421 <211> 613 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 421 Met Glu Ile Ala Leu Val Pro Leu Glu Asn Gly Gly Ala Met Thr Val 1 5 10 15 Arg Gly Gly Asp Glu Ala Arg Ala Gly Cys Gly Gln Ala Thr Gly Gly 20 25 30 Glu Leu Gln Cys Pro Pro Thr Ala Gly Leu Ser Asp Gly Pro Lys Glu 35 40 45 Pro Ala Pro Lys Gly Arg Gly Ala Gln Arg Asp Ala Asp Ser Gly Val 50 55 60 Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Asp Pro Gly Val Arg Pro Leu Pro Pro 65 70 75 80 Leu Pro Glu Glu Leu Pro Arg Pro Arg Arg Pro Pro Pro Glu Asp Glu 85 90 95 Glu Glu Glu Gly Asp Pro Gly Leu Gly Thr Val Glu Asp Gln Ala Leu 100 105 110 Gly Thr Ala Ser Leu His His Gln Arg Val His Ile Asn Ile Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Phe Glu Thr Gln Leu Gly Thr Leu Ala Gln Phe Pro Asn Thr 130 135 140 Leu Leu Gly Asp Pro Ala Lys Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg 145 150 155 160 Asn Glu Tyr Phe Phe Asp Arg Asn Arg Pro Ser Phe Asp Gly Ile Leu 165 170 175 Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gly Gly Arg Leu Arg Arg Pro Val Asn Val Ser 180 185 190 Leu Asp Val Phe Ala Asp Glu Ile Arg Phe Tyr Gln Leu Gly Asp Glu 195 200 205 Ala Met Glu Arg Phe Arg Glu Asp Glu Gly Phe Ile Lys Glu Glu Glu 210 215 220 Lys Pro Leu Pro Arg Asn Glu Phe Gln Arg Gln Val Trp Leu Ile Phe 225 230 235 240 Glu Tyr Pro Glu Ser Ser Gly Ser Ala Arg Ala Ile Ala Ile Val Ser 245 250 255 Val Leu Val Ile Leu Ile Ser Ile Ile Thr Phe Cys Leu Glu Thr Leu 260 265 270 Pro Glu Phe Arg Asp Glu Arg Glu Leu Leu Arg His Pro Pro Ala Pro 275 280 285 His Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gly Ala Asn Gly Ser Gly Val Met 290 295 300 Ala Pro Pro Ser Gly Pro Thr Val Ala Pro Leu Leu Pro Arg Thr Leu 305 310 315 320 Ala Asp Pro Phe Phe Ile Val Glu Thr Thr Cys Val Ile Trp Phe Thr 325 330 335 Phe Glu Leu Leu Val Arg Phe Phe Ala Cys Pro Ser Lys Ala Gly Phe 340 345 350 Ser Arg Asn Ile Met Asn Ile Ile Asp Val Val Ala Ile Phe Pro Tyr 355 360 365 Phe Ile Thr Leu Gly Thr Glu Leu Ala Glu Gln Gln Pro Gly Gly Gly 370 375 380 Gly Gly Gly Gln Asn Gly Gln Gln Ala Met Ser Leu Ala Ile Leu Arg 385 390 395 400 Val Ile Arg Leu Val Arg Val Phe Arg Ile Phe Lys Leu Ser Arg His 405 410 415 Ser Lys Gly Leu Gln Ile Leu Gly Lys Thr Leu Gln Ala Ser Met Arg 420 425 430 Glu Leu Gly Leu Leu Ile Phe Phe Leu Phe Ile Gly Val Ile Leu Phe 435 440 445 Ser Ser Ala Val Tyr Phe Ala Glu Ala Asp Asn Gln Gly Thr His Phe 450 455 460 Ser Ser Ile Pro Asp Ala Phe Trp Trp Ala Val Val Thr Met Thr Thr 465 470 475 480 Val Gly Tyr Gly Asp Met Arg Pro Ile Thr Val Gly Gly Lys Ile Val 485 490 495 Gly Ser Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Leu Thr Ile Ala Leu Pro Val 500 505 510 Pro Val Ile Val Ser Asn Phe Asn Tyr Phe Tyr His Arg Glu Thr Asp 515 520 525 His Glu Glu Pro Ala Val Leu Lys Glu Glu Gln Gly Thr Gln Ser Gln 530 535 540 Gly Pro Gly Leu Asp Arg Gly Val Gln Arg Lys Val Ser Gly Ser Arg 545 550 555 560 Gly Ser Phe Cys Lys Ala Gly Gly Thr Leu Glu Asn Ala Asp Ser Ala 565 570 575 Arg Arg Gly Ser Cys Pro Leu Glu Lys Cys Asn Val Lys Ala Lys Ser 580 585 590 Asn Val Asp Leu Arg Arg Ser Leu Tyr Ala Leu Cys Leu Asp Thr Ser 595 600 605 Arg Glu Thr Asp Leu 610 <210> 422 <211> 525 <212> PRT <213> Rattus norvegius <400> 422 Met Thr Val Val Pro Gly Asp His Leu Leu Glu Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Asp Pro Pro Gln Gly Gly Cys Val Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Cys Asp Arg Tyr Glu Pro Leu Pro Pro Ala Leu Pro Ala Ala Gly Glu 35 40 45 Gln Asp Cys Cys Gly Glu Arg Val Val Ile Asn Ile Ser Gly Leu Arg 50 55 60 Phe Glu Thr Gln Leu Lys Thr Leu Cys Gln Phe Pro Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80 Gly Asp Pro Lys Arg Arg Met Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg Asn Glu 85 90 95 Tyr Phe Phe Asp Arg Asn Arg Pro Ser Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Gln Ser Gly Gly Arg Ile Arg Arg Pro Val Asn Val Pro Ile Asp 115 120 125 Ile Phe Ser Glu Glu Ile Arg Phe Tyr Gln Leu Gly Glu Glu Ala Met 130 135 140 Glu Lys Phe Arg Glu Asp Glu Gly Phe Leu Arg Glu Glu Glu Arg Pro 145 150 155 160 Leu Pro Arg Arg Asp Phe Gln Arg Gln Val Trp Leu Leu Phe Glu Tyr 165 170 175 Pro Glu Ser Ser Gly Pro Ala Arg Gly Ile Ala Ile Val Ser Val Leu 180 185 190 Val Ile Leu Ile Ser Ile Val Ile Phe Cys Leu Glu Thr Leu Pro Glu 195 200 205 Phe Arg Asp Glu Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Pro Ser Gln Asp Val Phe 210 215 220 Glu Ala Ala Asn Asn Ser Thr Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ser 225 230 235 240 Phe Ser Asp Pro Phe Phe Val Val Glu Thr Leu Cys Ile Ile Trp Phe 245 250 255 Ser Phe Glu Leu Leu Val Arg Phe Phe Ala Cys Pro Ser Lys Ala Thr 260 265 270 Phe Ser Arg Asn Ile Met Asn Leu Ile Asp Ile Val Ala Ile Ile Pro 275 280 285 Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Thr Glu Leu Ala Glu Arg Gln Gly Asn Gly 290 295 300 Gln Gln Ala Met Ser Leu Ala Ile Leu Arg Val Ile Arg Leu Val Arg 305 310 315 320 Val Phe Arg Ile Phe Lys Leu Ser Arg His Ser Lys Gly Leu Gln Ile 325 330 335 Leu Gly Gln Thr Leu Lys Ala Ser Met Arg Glu Leu Gly Leu Leu Ile 340 345 350 Phe Phe Leu Phe Ile Gly Val Ile Leu Phe Ser Ser Ala Val Tyr Phe 355 360 365 Ala Glu Ala Asp Asp Pro Ser Ser Gly Phe Asn Ser Ile Pro Asp Ala 370 375 380 Phe Trp Trp Ala Val Val Thr Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Met 385 390 395 400 His Pro Val Thr Ile Gly Gly Lys Ile Val Gly Ser Leu Cys Ala Ile 405 410 415 Ala Gly Val Leu Thr Ile Ala Leu Pro Val Pro Val Ile Val Ser Asn 420 425 430 Phe Asn Tyr Phe Tyr His Arg Glu Thr Glu Gly Glu Glu Gln Ala Gln 435 440 445 Tyr Met His Val Gly Ser Cys Gln His Leu Ser Ser Ser Ala Glu Glu 450 455 460 Leu Arg Lys Ala Arg Ser Asn Ser Thr Leu Ser Lys Ser Glu Tyr Met 465 470 475 480 Val Ile Glu Glu Gly Gly Met Asn His Ser Ala Phe Pro Gln Thr Pro 485 490 495 Phe Lys Thr Gly Asn Ser Thr Ala Thr Cys Thr Thr Asn Asn Asn Pro 500 505 510 Asn Ser Cys Val Asn Ile Lys Lys Ile Phe Thr Asp Val 515 520 525 <210> 423 <211> 495 <212> PRT <213> Rattus norvegius <400> 423 Met Thr Val Met Ser Gly Glu Asn Ala Asp Glu Ala Ser Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly His Pro Gln Asp Gly Ser Tyr Pro Arg Gln Ala Asp His Asp Asp 20 25 30 His Glu Cys Cys Glu Arg Val Val Ile Asn Ile Ser Gly Leu Arg Phe 35 40 45 Glu Thr Gln Leu Lys Thr Leu Ala Gln Phe Pro Asn Thr Leu Leu Gly 50 55 60 Asn Pro Lys Lys Arg Met Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg Asn Glu Tyr 65 70 75 80 Phe Phe Asp Arg Asn Arg Pro Ser Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr Tyr 85 90 95 Gln Ser Gly Gly Arg Leu Arg Arg Pro Val Asn Val Pro Leu Asp Met 100 105 110 Phe Ser Glu Glu Ile Lys Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Glu Ala Met Glu 115 120 125 Lys Phe Arg Glu Asp Glu Gly Phe Ile Lys Glu Glu Glu Arg Pro Leu 130 135 140 Pro Glu Lys Glu Tyr Gln Arg Gln Val Trp Leu Leu Phe Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Glu Ser Ser Gly Pro Ala Arg Val Ile Ala Ile Val Ser Val Met Val 165 170 175 Ile Leu Ile Ser Ile Val Ile Phe Cys Leu Glu Thr Leu Pro Glu Leu 180 185 190 Lys Asp Asp Lys Asp Phe Thr Gly Thr Ile His Arg Ile Asp Asn Thr 195 200 205 Thr Val Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Phe Thr Asp Pro Phe Phe Ile Val 210 215 220 Glu Thr Leu Cys Ile Ile Trp Phe Ser Phe Glu Leu Val Val Arg Phe 225 230 235 240 Phe Ala Cys Pro Ser Lys Thr Asp Phe Phe Lys Asn Ile Met Asn Phe 245 250 255 Ile Asp Ile Val Ala Ile Ile Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Thr Glu 260 265 270 Ile Ala Glu Gln Glu Gly Asn Gln Lys Gly Glu Gln Ala Thr Ser Leu 275 280 285 Ala Ile Leu Arg Val Ile Arg Leu Val Arg Val Phe Arg Ile Phe Lys 290 295 300 Leu Ser Arg His Ser Lys Gly Leu Gln Ile Leu Gly Gln Thr Leu Lys 305 310 315 320 Ala Ser Met Arg Glu Leu Gly Leu Leu Ile Phe Phe Leu Phe Ile Gly 325 330 335 Val Ile Leu Phe Ser Ser Ala Val Tyr Phe Ala Glu Ala Glu Glu Ala 340 345 350 Glu Ser His Phe Ser Ser Ile Pro Asp Ala Phe Trp Trp Ala Val Val 355 360 365 Ser Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Met Tyr Pro Val Thr Ile Gly 370 375 380 Gly Lys Ile Val Gly Ser Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Leu Thr Ile 385 390 395 400 Ala Leu Pro Val Pro Val Ile Val Ser Asn Phe Asn Tyr Phe Tyr His 405 410 415 Arg Glu Thr Glu Gly Glu Glu Gln Ala Gln Leu Leu His Val Ser Ser 420 425 430 Pro Asn Leu Ala Ser Asp Ser Asp Leu Ser Arg Arg Ser Ser Ser Thr 435 440 445 Ile Ser Lys Ser Glu Tyr Met Glu Ile Glu Glu Asp Met Asn Asn Ser 450 455 460 Ile Ala His Tyr Arg Gln Ala Asn Ile Arg Thr Gly Asn Cys Thr Ala 465 470 475 480 Thr Asp Gln Asn Cys Val Asn Lys Ser Lys Leu Leu Thr Asp Val 485 490 495 <210> 424 <211> 575 <212> PRT <213> Papio cynocephalus <400> 424 Met Asp Glu His Leu Ser Leu Leu Arg Ser Pro Pro Pro Pro Ser Ala 1 5 10 15 Arg His Arg Ala His Pro Ala Gln Arg Pro Ala Ser Ser Gly Gly Ala 20 25 30 His Thr Leu Val Asn Pro Gly Tyr Ala Glu Pro Ala Ala Gly Pro Glu 35 40 45 Leu Pro Pro Asp Met Thr Val Val Pro Gly Asp His Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Val Ala Asp Gly Gly Gly Ala Pro Pro Gln Gly Gly Cys Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Cys Asp Arg Tyr Glu Pro Leu Pro Pro Ser Leu Pro Ala Ala 85 90 95 Gly Glu Gln Asp Cys Cys Gly Glu Arg Val Val Ile Asn Ile Ser Gly 100 105 110 Leu Arg Phe Glu Thr Gln Leu Lys Thr Leu Cys Gln Phe Pro Glu Thr 115 120 125 Leu Leu Gly Asp Pro Lys Arg Arg Met Arg Tyr Phe Asp Pro Leu Arg 130 135 140 Asn Glu Tyr Phe Phe Asp Arg Asn Arg Pro Ser Phe Asp Ala Ile Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gly Gly Arg Ile Arg Arg Pro Val Asn Val Pro 165 170 175 Ile Asp Ile Phe Ser Glu Glu Ile Arg Phe Tyr Gln Leu Gly Glu Glu 180 185 190 Ala Met Glu Lys Phe Arg Glu Asp Glu Gly Phe Leu Arg Glu Glu Glu 195 200 205 Arg Pro Leu Pro Arg Arg Asp Phe Gln Arg Gln Val Trp Leu Leu Phe 210 215 220 Glu Tyr Pro Glu Ser Ser Gly Pro Ala Arg Gly Ile Ala Ile Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Val Ile Leu Ile Ser Ile Val Ile Phe Cys Leu Glu Thr Leu 245 250 255 Pro Glu Phe Arg Asp Glu Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Pro Ser Gln Asp 260 265 270 Ser Phe Asp Ala Ala Gly Asn Ser Thr Ser Gly Ala Ala Ala Gly Ala 275 280 285 Ser Ser Phe Ser Asp Pro Phe Phe Val Val Glu Thr Leu Cys Ile Ile 290 295 300 Trp Phe Ser Phe Glu Leu Leu Val Arg Phe Phe Ala Cys Pro Ser Lys 305 310 315 320 Ala Thr Phe Ser Arg Asn Ile Met Asn Leu Ile Asp Ile Val Ala Ile 325 330 335 Ile Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Thr Glu Leu Ala Glu Arg Gln Gly 340 345 350 Asn Gly Gln Gln Ala Met Ser Leu Ala Ile Leu Arg Val Ile Arg Leu 355 360 365 Val Arg Val Phe Arg Ile Phe Lys Leu Ser Arg His Ser Lys Gly Leu 370 375 380 Gln Ile Leu Gly Gln Thr Leu Lys Ala Ser Met Arg Glu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Leu Ile Phe Phe Leu Phe Ile Gly Val Ile Leu Phe Ser Ser Ala Val 405 410 415 Tyr Phe Ala Glu Ala Asp Asp Pro Thr Ser Gly Phe Ser Ser Ile Pro 420 425 430 Asp Ala Phe Trp Trp Ala Val Val Thr Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly 435 440 445 Asp Met His Pro Val Thr Ile Gly Gly Lys Ile Val Gly Ser Leu Cys 450 455 460 Ala Ile Ala Gly Val Leu Thr Ile Ala Leu Pro Val Pro Val Ile Val 465 470 475 480 Ser Asn Phe Asn Tyr Phe Tyr His Arg Glu Thr Glu Gly Glu Glu Gln 485 490 495 Ala Gln Tyr Met His Val Gly Ser Cys Gln His Leu Ser Ser Ser Ala 500 505 510 Glu Glu Leu Arg Lys Ala Arg Ser Asn Ser Thr Leu Ser Lys Ser Glu 515 520 525 Tyr Met Val Ile Glu Glu Gly Gly Met Asn His Ser Ala Phe Pro Gln 530 535 540 Thr Pro Phe Lys Thr Gly Asn Ser Thr Ala Thr Cys Thr Thr Asn Asn 545 550 555 560 Asn Pro Asn Ser Cys Val Asn Ile Lys Lys Ile Phe Thr Asp Val 565 570 575 <210> 425 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 fusion protein <400> 425 Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Gly Ser Pro Gln Cys Ile Gln 1 5 10 15 Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys 20 25 30 Cys His Cys Thr Pro Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 65 70 75 80 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 85 90 95 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 100 105 110 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 115 120 125 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 130 135 140 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 145 150 155 160 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 165 170 175 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 180 185 190 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 195 200 205 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 210 215 220 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 225 230 235 240 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 245 250 255 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 260 265 270 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 275 280 <210> 426 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa may be Ile, Thr, Qln or Glu <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa may be Lys, Arg, Glu, Ala or Qln <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa may be Ile, Glu, Leu, Asp, Qln, His, val, Lys or Ala <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa may be Glu, Lys, Leu, Qln, Asp, Val or His <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 426 Gly Val Pro Xaa Ala Ala Xaa Ala Ala Val Lys Cys Xaa Ala Ala Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gln Cys Xaa Ala Ala Xaa Ala Ala Pro Cys Lys Asp Ala Gly 20 25 30 Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 427 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Odk2 variant <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa may be Ile or Thr <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Asn or Asp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa may be Lys or Arg <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Xaa may be Ile or Glu <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa may be Glu or Lys <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 427 Gly Val Pro Xaa Ala Ala Xaa Ala Ala Val Lys Cys Xaa Ala Ala Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gln Cys Xaa Ala Ala Xaa Ala Ala Pro Cys Lys Asp Ala Gly 20 25 30 Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys Cys His Cys Thr Pro Lys 35 40 45 <210> 428 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 428 Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 20 25 30 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser 35 40 <210> 429 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> peptide 261 cDNA <400> 429 ggcgtgccta tcaacgtcaa gtgtaagatc tctcggcaat gtatcgagcc gtgcaaagat 60 gctggaatgc gcttcgggaa atgtatgaat ggcaagtgtc actgcacacc taag 114 <210> 430 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide p579 cDNA <400> 430 ggcgtgccca ccgacgtgaa gtgccggatc agccggcagt gcgagaagcc ctgcaaggac 60 gccggcatgc ggttcggcaa gtgcatgaac ggcaagtgcc actgcacccc caag 114 <210> 431 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 431 Arg Asn Arg Glu 1 <210> 432 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 432 His His Arg Gln 1 <210> 433 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal peptide extension <400> 433 Thr Arg Ala Lys 1

Claims (32)

  1. Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제로서,
    (i) 위치 10에서 글리신의 아이소류신으로의 치환(G10I)을 갖고, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 추가 치환을 갖는 서열 번호 1에 나타낸 서열; 또는
    (ii) 서열 번호 1과 적어도 80%가 동일하고, G10I 치환을 추가로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제.
  2. 제1항에 있어서, 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 426)를 포함하며; 여기서,
    a) Xaa1은 I 또는 T, Q 또는 E이고;
    b) Xaa2는 N 또는 D이고;
    c) Xaa3은 K 또는 R, E, A 또는 Q이고;
    d) Xaa4는 I, E, L, D, Q, H, V, K 또는 A이고;
    e) Xaa5는 E K, L, Q, D, V 또는 H이고;
    상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는, 길항제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 길항제는 반감기 연장 모이어티(half-life extending moiety)에 접합된 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하는 융합 단백질이며, 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(서열 번호 426)를 포함하며; 여기서,
    a) Xaa1은 I 또는 T, Q 또는 E이고;
    b) Xaa2는 N 또는 D이고;
    c) Xaa3은 K 또는 R, E, A 또는 Q이고;
    d) Xaa4는 I, E, L, D, Q, H, V, K 또는 A이고;
    e) Xaa5는 E K, L, Q, D, V 또는 H이고;
    상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는, 길항제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) Xaa1은 I 또는 T이고;
    b) Xaa2는 N 또는 D이고;
    c) Xaa3은 K 또는 R이고;
    d) Xaa4는 I 또는 E이고;
    e) Xaa5는 E 또는 K이고;
    상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 갖는, 길항제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 42, 3, 13, 21, 22, 24, 26, 29, 30, 32, 34, 38, 39, 43, 44, 45, 46, 49, 51, 59, 63, 65, 69, 71, 73, 76, 78, 81, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 96, 101, 103, 104, 및 108의 아미노산 서열을 포함하는, 길항제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 아미노산 서열을 포함하는, 길항제.
  7. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267 또는 268의 아미노산 서열을 포함하는, 길항제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 128, 143, 155, 188, 206- 210, 212, 214, 216, 219, 223, 224, 227, 230, 232 -235, 237, 239, 240, 243, 252, 261, 262, 263, 또는 268의 아미노산 서열을 포함하는, 길항제.
  9. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민, 알부민 결합 도메인(ADB), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 길항제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  11. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 링커(linker)를 통해 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제에 접합된, 길항제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 링커는 서열 번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 또는 428의 아미노산 서열을 포함하는, 길항제.
  13. 제12항에 있어서,
    a) 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3, 22, 34 또는 42의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 선택적으로 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 128, 143, 155, 188, 206- 210, 212, 214, 216, 219, 223, 224, 227, 230, 232 -235, 237, 239, 240, 243, 252, 261, 262, 263, 또는 268의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 상기 링커는 서열 번호 116 또는 서열 번호119의 아미노산 서열을 포함하고;
    d) 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  14. 제12항에 있어서,
    a) 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 상기 링커는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  15. 제12항에 있어서,
    a) 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 상기 링커는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하고;
    d) 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  16. 제12항에 있어서,
    a) 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 235의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 상기 링커는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하고;
    d) 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  17. 제12항에 있어서,
    a) 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 235의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 상기 링커는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하고;
    d) 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  18. 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Kv1.1 및 Kv1.3으로 각각 형질감염된 세포들에서의 패치 클램프 검정(patch clamp assay)에서 Kv1.1에 대한 단리된 융합 단백질의 IC50 값 대 Kv1.3에 대한 단리된 융합 단백질의 IC50 값의 비로서 선택성이 측정될 때, 인간 Kv1.1에 대해서보다 인간 Kv1.3에 대해서 적어도 100배 더 선택적인, 길항제.
  19. 제3항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Kv1.3으로 형질감염된 세포들에서의 패치 클램프 검정에서 서열 번호 425의 모(parent) KV1C2 융합 단백질에 대한 IC50 값보다 적어도 약 10배 더 적은 IC50 값으로 칼륨 전류를 억제하는, 길항제.
  20. 제3항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인간 Kv1.3으로 형질감염된 세포들에서의 패치 클램프 검정에서 약 1.5x10-8 M 이하의 IC50 값으로 전류를 억제하는, 길항제.
  21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인간 Kv1.3으로 형질감염된 세포들에서 약 2.2x10-8 M 이하의 IC50 값으로 시험관내 탈륨 플럭스(in vitro thallium flux)를 억제하는, 길항제.
  22. 제1항에 있어서, 서열 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416 또는 417 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 길항제.
  23. 서열 번호 55 또는 86의 서열을 포함하는, Kv1.3의 단리된 펩티드 길항제.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 길항제는 링커를 통해 반감기 연장 모이어티에 접합된 Kv1.3의 펩티드 길항제를 포함하는 융합 단백질이며, 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 4개의 아미노산의 선택적인 C-말단 연장부를 가지며, 여기서,
    a) 상기 Kv1.3의 펩티드 길항제는 서열 번호 3-110의 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 상기 C-말단 연장부는 서열 번호 123-268의 아미노산 서열을 포함하고;
    c) 상기 링커는 서열 번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 또는 428의 아미노산 서열을 포함하고;
    d) 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민인, 길항제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 길항제를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  27. 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 융합 단백질의 생산 방법으로서, 제27항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포에 의해 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 생산 방법.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 원치 않는 T 세포 활성화와 관련된 질환을 갖는 대상체에서 T 세포 활성화를 억제하는 방법으로서, T 세포 활성화를 억제하기에 유효한 양의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 융합 단백질을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 억제 방법.
  31. 제30항에 있어서, 원치 않는 T 세포 활성화와 관련된 상기 질환은 염증성 질환, 면역 및 증식성 장애, 류마티스성 관절염(RA), 강직성 척추염, 건선성 관절염, 골관절염, 골다공증, 포도막염, 염증성 섬유증, 피부경화증, 폐섬유증, 경변증(cirrhosis), 염증성 장 질병, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 결장염, 천식, 알러지성 천식, 알러지, 만성 폐색성 폐 질병(COPD), 다발성 경화증, 건선, 접촉-매개 피부염, 전신 홍반성 낭창(SLE) 및 다른 형태의 낭창, 당뇨병, I형 당뇨병, 비만증, 암, 낭창, 재협착, 전신성 경화증, 피부경화증, 사구체신염, 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 염증성 골 흡수, 이식 거부, 또는 이식편-대-숙주 질병(graft-versus-host disease)인, 억제 방법.
  32. 요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 길항제.
KR1020157022631A 2013-01-25 2014-01-24 Kv1.3 길항제 및 사용 방법 KR102268830B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361756777P 2013-01-25 2013-01-25
US61/756,777 2013-01-25
US201361757389P 2013-01-28 2013-01-28
US61/757,389 2013-01-28
PCT/US2014/012932 WO2014116937A1 (en) 2013-01-25 2014-01-24 Kv1.3 antagonists and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150108912A true KR20150108912A (ko) 2015-09-30
KR102268830B1 KR102268830B1 (ko) 2021-06-24

Family

ID=51228060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157022631A KR102268830B1 (ko) 2013-01-25 2014-01-24 Kv1.3 길항제 및 사용 방법

Country Status (28)

Country Link
US (2) US10179808B2 (ko)
EP (1) EP2948559B1 (ko)
JP (1) JP6469590B2 (ko)
KR (1) KR102268830B1 (ko)
CN (1) CN104937105A (ko)
AU (1) AU2014209227B2 (ko)
BR (1) BR112015017795A2 (ko)
CA (1) CA2898496A1 (ko)
CY (1) CY1120481T1 (ko)
DK (1) DK2948559T3 (ko)
EA (1) EA037308B1 (ko)
ES (1) ES2671434T3 (ko)
HR (1) HRP20181055T1 (ko)
HU (1) HUE039465T2 (ko)
IL (1) IL239927B (ko)
LT (1) LT2948559T (ko)
MX (1) MX365987B (ko)
NZ (1) NZ709913A (ko)
PH (1) PH12015501627A1 (ko)
PL (1) PL2948559T3 (ko)
PT (1) PT2948559T (ko)
RS (1) RS57422B1 (ko)
SG (1) SG11201505508TA (ko)
SI (1) SI2948559T1 (ko)
TR (1) TR201809377T4 (ko)
UA (1) UA117824C2 (ko)
WO (1) WO2014116937A1 (ko)
ZA (1) ZA201506131B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016023072A1 (en) * 2014-08-15 2016-02-18 Monash University Novel potassium channel blockers and use thereof in the treatment of autoimmune diseases
US10259122B2 (en) 2015-03-05 2019-04-16 President And Fellows Of Harvard College Compliant adaptive robot grasper
CA3022961A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Tetragenetics, Inc. Anti-kv1.3 antibodies, and methods of production and use thereof
US10336812B2 (en) * 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof
TW201808987A (zh) * 2016-06-08 2018-03-16 健生生物科技公司 Ｇｍ－ｃｓｆ變體及使用方法
CN106589092A (zh) * 2016-12-22 2017-04-26 中国科学技术大学先进技术研究院 一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法
CN106957357B (zh) * 2017-04-01 2021-02-19 合肥科生景肽生物科技有限公司 一种蝎毒素多肽及其合成方法
EP4031162A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 Zealand Pharma A/S Kv1.3 blockers
AU2022245193A1 (en) 2021-03-23 2023-09-07 Zealand Pharma A/S Kv1.3 blockers
WO2024083919A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Zealand Pharma A/S Inhibitors

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116156A2 (en) * 2005-04-22 2006-11-02 Amgen Inc. Toxin peptides with extended blood halflife

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
WO1999014318A1 (en) 1997-09-16 1999-03-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
GB0414272D0 (en) 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives
WO2006042151A2 (en) 2004-10-07 2006-04-20 The Regents Of The University Of California Analogs of shk toxin and their uses in selective inhibition of kv1.3 potassium channels
AU2007343796A1 (en) 2006-10-25 2008-07-24 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
MX2009012609A (es) 2007-05-22 2009-12-07 Amgen Inc Composiciones y metodos para producir proteinas de fusion bioactivas.
US8716437B2 (en) 2007-12-07 2014-05-06 Steven A. Goldstein Identification of toxin ligands
US20110236461A1 (en) 2008-08-13 2011-09-29 Underhill T Michael Methods for stimulating chondrogenesis utilizing a potassium channel inhibitor
CA2889453C (en) 2009-03-20 2018-11-06 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
US9695228B2 (en) * 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006116156A2 (en) * 2005-04-22 2006-11-02 Amgen Inc. Toxin peptides with extended blood halflife
KR20080021606A (ko) * 2005-04-22 2008-03-07 암젠 인크 독소 펩티드 치료제
JP2008538506A (ja) * 2005-04-22 2008-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 延長された血液半減期を有するトキシンペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
US10179808B2 (en) 2019-01-15
CN104937105A (zh) 2015-09-23
ZA201506131B (en) 2017-06-28
WO2014116937A1 (en) 2014-07-31
TR201809377T4 (tr) 2018-07-23
HRP20181055T1 (hr) 2018-09-07
MX2015009632A (es) 2015-11-30
AU2014209227A1 (en) 2015-07-30
LT2948559T (lt) 2018-06-25
PT2948559T (pt) 2018-07-24
AU2014209227B2 (en) 2017-11-23
PH12015501627B1 (en) 2015-09-21
US20190062383A1 (en) 2019-02-28
RS57422B1 (sr) 2018-09-28
EP2948559B1 (en) 2018-05-02
BR112015017795A2 (pt) 2017-11-21
IL239927B (en) 2020-10-29
NZ709913A (en) 2019-05-31
KR102268830B1 (ko) 2021-06-24
EP2948559A1 (en) 2015-12-02
EA201591380A1 (ru) 2015-12-30
PL2948559T3 (pl) 2018-09-28
HUE039465T2 (hu) 2019-01-28
EP2948559A4 (en) 2016-10-19
MX365987B (es) 2019-06-20
SG11201505508TA (en) 2015-08-28
JP2016505639A (ja) 2016-02-25
IL239927A0 (en) 2015-08-31
DK2948559T3 (en) 2018-05-28
ES2671434T3 (es) 2018-06-06
SI2948559T1 (en) 2018-08-31
JP6469590B2 (ja) 2019-02-13
CA2898496A1 (en) 2014-07-31
EA037308B1 (ru) 2021-03-10
PH12015501627A1 (en) 2015-09-21
CY1120481T1 (el) 2019-07-10
UA117824C2 (uk) 2018-10-10
US20140255401A1 (en) 2014-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102268830B1 (ko) Kv1.3 길항제 및 사용 방법
US11919931B2 (en) Anti-cancer fusion polypeptide capable of binding both CD137 and glypican-3 (GPC3)
JP7121496B2 (ja) 癌治療で使用するためのペグ化インターロイキン－１０
KR20110112299A (ko) 자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 가용성 폴리펩티드
KR20080021606A (ko) 독소 펩티드 치료제
JP6985151B2 (ja) プロトキシン−ｉｉ変異体及びその使用方法
CN113474367A (zh) 结合cd3和hla-a*02限制性肽的半衰期延长的immtac
KR102352336B1 (ko) 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
ZA200709701B (en) Toxin peptide therapeutic agents
JP2009513124A (ja) 新規ｃｘｃケモカインアンタゴニスト
US20040053249A1 (en) Fas ligand-fused proteins
AU2016204968A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant