JP6469590B2 - Kv1.3アンタゴニスト及び使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、Kv1.3アンタゴニスト、これをコードしているポリヌクレオチド、並びにその製造及び使用方法に関する。アンタゴニストは、OdK2ペプチドの変異体に基づくものである。
(i)位置10(G10I)のグリシンがイソロイシンに置換されており、所望により1、2、3、4、5、6又は7つの追加の置換を有する、配列番号1に示す配列、又は
(ii)配列番号1と少なくとも80%同一であり、配列番号1と少なくとも80%同一であり、G10I置換を更に含むアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する、Kv1.3の単離ペプチドアンタゴニストを提供する。
本発明は、
(i)位置10(G10I)のグリシンがイソロイシンに置換されており、所望により1、2、3、4、5、6又は7つの追加の置換を有する、配列番号1に示す配列、又は
(ii)配列番号1と少なくとも80%同一であり、G10I置換を更に含むアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する、Kv1.3の単離ペプチドアンタゴニストを提供する。
a)Xaa1は、I又はT、Q又はEであり、
b)Xaa2は、N又はDであり、
c)Xaa3は、K又はR、E、A又はQであり、
d)Xaa4は、I、E、L、D、Q、H、V、K又はAであり、
e)Xaa5は、E、K、L、Q、D、V又はHであり、
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、所望により4つのアミノ酸からなるC末端延長部分を有する。例えば、Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、配列番号3、13、21、22、24、26、29、30、32、34、38、39、42〜46、49、51、59、63、65、69、71、73、76、78、81〜83、85、87、89、92、96、101、103、104、及び108のアミノ酸配列を含み得る。
Xaa1は、I又はTであり、
Xaa2は、N又はDであり、
Xaa3は、K又はRであり、
Xaa4は、I又はEであり、並びに
Xaa5は、E又はKであり、並びに
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、所望により4つのアミノ酸からなるC末端延長部分を有する。例えば、Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、配列番号3、22、34又は42のアミノ酸配列を含み得る。
本発明のアンタゴニストは、本発明のアンタゴニストペプチドを含む単離融合タンパク質とすることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号1に対し少なくとも80%同一性を有し、かつ配列番号1に対するG10I置換を含む配列を含む。
Xaa1は、I又はT、Q又はEであり、
Xaa2は、N又はDであり、
Xaa3は、K又はR、E、A又はQであり、
Xaa4は、I、E、L、D、Q、H、V、K又はAであり、
Xaa5は、E、K、L、Q、D、V又はHであり、
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、所望により4つのアミノ酸からなるC末端延長部分を有する。
Xaa1は、I又はTであり、
Xaa2は、N又はDであり、
Xaa3は、K又はRであり、
Xaa4は、I又はEであり、並びに
Xaa5は、E又はKであり、並びに
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、所望により4つのアミノ酸からなるC末端延長部分を有する。
配列番号3、22、34、又は42のKv1.3のペプチドアンタゴニスト、
所望により配列番号128、143、155、188、206〜210、212、214、216、219、223、224、227、230、232、235、237、239、240、243、252、261〜263、又は268のC末端延長部分、
配列番号116又は配列番号119のリンカー、
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
配列番号42のKv1.3のペプチドアンタゴニスト、
配列番号116のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
配列番号42のKv1.3のペプチドアンタゴニスト、
配列番号209のC末端延長部分、
配列番号116のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
配列番号3のKv1.3のペプチドアンタゴニスト、
配列番号235のC末端延長部分、
配列番号116のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
配列番号42のKv1.3のペプチドアンタゴニスト、
配列番号235のC末端延長部分、
配列番号116のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、配列番号3〜110のアミノ酸配列を含み、
C末端延長部分は、配列番号123〜268のアミノ酸配列を含み、
リンカーは、配列番号116又は119のアミノ酸配列を含み、
半減期延長部分はヒト血清アルブミンである。
Xaa1は、I又はT、Q又はEであり、
Xaa2は、N又はDであり、
Xaa3は、K又はR、E、A又はQであり、
Xaa4は、I、E、L、D、Q、H、V、K又はAであり、
Xaa5は、E、K、L、Q、D、V又はHであり、
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、所望により4つのアミノ酸からなるC末端延長部分を有する。
Xaa1は、I又はTであり、
Xaa2は、N又はDであり、
Xaa3は、K又はRであり、
Xaa4は、I又はEであり、並びに
Xaa5は、E又はKであり、並びに
Kv1.3のペプチドアンタゴニストは、所望により4つのアミノ酸からなるC末端延長部分を有する。
本発明の別の態様は、生体組織においてKv1.3の活性を調節する方法であり、本方法は、Kv1.3を発現している生体組織を、Kv1.3を調節する量の本発明のOdK2変異体若しくはその融合タンパク質、又はそれらの製薬学的に許容され得る塩と接触させることを含む。
Kv1.3活性を抑制することが望まれる状態の治療に有効な、OdK2変異体及び/又はOdK2変異体融合タンパク質の「治療上の有効量」は、標準的な試験法により決定することができる。例えば、狼瘡、多発性硬化症又は乾癬などの炎症状態又は自己免疫疾患の治療に有効である可能性のある薬剤の投与量は、本明細書に記載のモデルなどの関連する動物モデルに薬剤を投与することにより決定できる。
Kvチャネル発現構築物及び細胞株。常法を用い、様々なKvチャネル及びキメラ構築物をコードしているcDNAを哺乳類発現ベクターにクローニングした。ヒトKv1.3(hKv1.3)(配列番号418)、ヒトKv1.1(hKv1.1)(配列番号420)、ヒトKv1.2(hKv1.2)(配列番号419)、ヒトKv1.5(hKv1.5)(配列番号421)、hKv1.3 E3ループ/hKv1.5キメラ(ヒトKv1.5アミノ酸1〜455及び496〜613、及びKv1.3 E3ループアミノ酸456〜495)(Kv1.3 EC3ループキメラ)、N末端Hisタグを有するhKv1.1 E3ループ/hKv1.5キメラ(Hisタグアミノ酸1〜9、hKv1.5アミノ酸10〜472、及び513〜63、及びhKv1.1 E3ループアミノ酸473〜512を有する)(Kv1.1 EC3ループキメラ)、ラットKv1.3(rKv1.3)(配列番号422)、ラットKv1.1(rKv1.1)(配列番号423)、カニクイザル(Macaca fascicularis)チャネルcynoKv1.3(配列番号424)、hKv1.3/hKv1.5テールキメラ(ヒトKv1.5アミノ酸1〜250及び497〜593、並びにKv1.3アミノ酸配列251〜496を有する)(Kv1.3テールキメラ)、並びにhKv1.1/hKv1.5テールキメラ(ヒトKv1.5アミノ酸1〜250及び492〜588、並びにKv1.1アミノ酸配列251〜491(Kv1.1テールキメラを有する)をコードしているcDNAをクローニングし、発現させた。HEK細胞でチャネルを発現させるため、ネオマイシン耐性マーカーをコードしておりCMVプロモーターにより駆動される発現ベクターにKv遺伝子をクローニングした。標準法を用い、HEK 293−F(Invitrogen,Carlsbad,CA)細胞を安定に形質移入し、DMEM 10% FBS及び600g/mLジェネティシン選択培地で培養して、Kvチャネルを発現するクローン細胞株を作出した。CHOの安定発現のため、標準法を用いpcDNA4/TO−Kv1.xによりCHO−TREx細胞(Invitrogen)を安定に形質移入し、テトラサイクリン誘導性の方法で各カリウムチャネルを発現するクローン細胞株を作出した。10%ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、5μg/mLブラストサイジン及び200μg/mLゼオシンンを添加したHam’s F−12を培養培地とした。いくつかの実験では、Lipofectamine 2000を用いCHO細胞に一過性形質移入を行った。電気生理学的試験の際の発現対照については、切断型CD4を発現する発現ベクター(pMACs4.1,Milteni Biotech)を細胞に同時形質移入した。形質移入から24〜48時間後にアッセイを実施した。
ペプチド−Fc融合体、又はペプチド−HSA融合体としてキメラライブラリを発現させた。このライブラリを最初にHEK 293−E細胞に形質移入し、48ウェル又は96ウェルフォーマットで発現させた。10% FBS、及び選別のための250μg/mLジェネティシンを含有させたDMEMでこの細胞を培養した。48ウェルでの発現については、3.0×105個/mLを0.5mL/wellで48ウェルプレートに播種した。300ngプラスミドDNA、25μL OptiPRO(商標)SFM培地、及び2.4μL Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して、常法によりLipofectamine 2000を用い、ライブラリを形質移入した。翌日、形質移入培地を吸い出し、0.5mLの293 FreeStyle(商標)培地(Invitrogen,Carlsbad,CA)を各ウェルに添加した。次に、細胞を更に96時間インキュベートした後、上清を回収し、0.2μmフィルタ(Varian)により濾過した。
ペプチド−Fc融合タンパク質。細胞培養試薬は全てInvitrogenから得た。様々なKvチャネルを発現するプラスミドにより安定的に形質移入した接着性HEK 293F細胞を、10% FBS及び600μg/mLジェネティシンを添加したDMEMで培養した。KvチャネルHEK細胞の単個細胞懸濁液を調製し、接着性培養物を1倍のPBSですすぎ洗いし、次に培養物を0.25%トリプシンEDTAですすぎ洗いし、最終密度が2×106個/mLになるよう、2% FBS(FACS緩衝液)を添加した1x冷PBSに細胞を再懸濁し、V底ポリプロピレン96ウェルプレート(Costar)に100μL/wellで分注した。これらの手順は、氷上又は4℃にて実施した。細胞を450xgで2分間遠心分離し、上清を廃棄した。Freestyle 293馴化培地又はFACS緩衝液で16nMに規格化したペプチド−Fcサンプル100μLを、記載のウェル中の細胞ペレットに添加し、混合した。特異的な結合と非特異的なバックグラウンドを区別するため、陰性対照に10倍モル過剰のShKペプチド(Bachem)を添加して反応させ、ペプチド−Fc融合タンパク質の結合と競合させた。反応物を4℃で60〜90分間インキュベートした。細胞を200μL FACS緩衝液で洗浄し、次にFACS緩衝液に1:200希釈したヤギFab’2抗ヒトFc Cy5複合抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)100μLにより4℃で1時間インキュベートした。細胞を200μL FACS緩衝液で洗浄し、次に100μLのBD Cytofix(商標)fixation buffer(BD Biosciences)に再懸濁し、4℃で一晩保存した。反応をFACSArray 96 well auto−sampler flow cytometer(BD Biosciences)で読み取った。FlowJoソフトウェア(Treestar)でデータを分析して、各反応について幾何的平均蛍光強度(Geo.MFI)を得た。結合アッセイの初回スクリーニングのため、各変異体のGeo.MFIを、一過性形質移入した野生型OdK2−Fc融合体(Kv1.2)対照と直接比較し、親型に対する割合(%)として記録した。
以下の、4パラメーターによる一般的なロジスティック式を使用し、非線形回帰(Graph Pad Prism,version 4.0)により濃度又は用量応答データを代入した。
応答=最小応答+(最大応答−最小応答)/[1+10(logEC 50 −Logアゴニスト)曲線勾配]
強度は、最大作用の50%を生じる濃度の−log 10として表した(pIC50又はpEC50)。
野生型OdK2及びOsK1ペプチド並びにそれらの融合タンパク質の特性評価
常法及び上記の通りの手法を使用して、野生型OdK2(配列番号1)及びOsK1(配列番号2)ペプチドをクローン化し、リンカーGS(G4S)4(配列番号119)を使用し、IgG4融合タンパク質として発現させた。得られた融合タンパク質をそれぞれKV1C2(OdK2−Fc融合体)及びKV1N2(OsK1−Fc融合体)と命名した。イランサソリ・オドントブタス(Odonthobuthus)の毒液から単離及び生成した未改変のOdK2ペプチドをLeuven大学のJan Tytgat教授から得て、組み換えOsK1ペプチドはAlomone研究所から得た。未改変のペプチド及びそれらの融合タンパク質を、電気生理試験によりKv1.3に対する結合強度及び選択性について、T細胞活性化阻害能について、並びに薬物動態試験において特性評価した。
hKv1.3 EC3ループキメラを発現している安定な細胞において、上記の通り、結合アッセイを実施した。KV1C2(OdK2−Fc融合体)は、FACSアッセイにおいてバックグラウンドの12.8倍のシグナルを生成し、KV1N2(OsK1−Fc融合体)は、バックグラウンドの133.0倍のシグナルを生成し(図2)、発現させたKv1.3チャネルに対する結合強度が高いことを示した。10倍過剰のShKの存在下で、ヒトKv1.3 EC3ループキメラを発現している細胞に対し結合しなかったことから、結合が特異的なものであることは明らかである。KV1C2(OdK2−Fc融合体)及びKV1N2(OsK1−Fc融合体)はヒトKv1.5を発現している細胞に対し結合しなかったことから、結合も選択的であった。
ヒトKv1.3、Kv1.1、Kv1.2及びKv1.5イオンチャネルにより形質移入したCHO細胞に対し、ホールセルパッチクランプ試験を実施した。Osk1及びOdK2のいずれもがKv1.3電流を強力に阻害した。OsK1ペプチドは、Kv1.3に対しOdK2よりも顕著に強力に作用したものの、Kv1.1に対するこれらの2つのペプチドの選択性は同様であった。KV1C2(OdK2−Fc融合体)及びKV1N2(OsK1−Fc融合体)のKv1.3に対する作用強度は、未改変のペプチドと比較して約1/30〜1/100であった。しかしながら、KV1C2選択性(Kv1.1 IC50をKv1.3 IC50により除算したものとして算出)は、未改変のペプチドと比較して約3〜4倍向上した。電気生理試験により求められたIC50値と選択性の比を表1に掲載する。
**IC50(Kv1.1)/1C50(Kv1.3)
NA=実施せず
KV1C2(OdK2−Fc融合体)は、Jurkat T細胞株、初代CD4+ヒトT細胞(健常なヒト提供者から単離)、及びKv1.3形質移入HEK及びCHO細胞において、Kv1.3細胞電流を遮断した。Kv1.2(OdK2−Fc融合体)も、抗CD3/CD28により活性化した初代ヒトCD4+及びCD8+ T細胞によるサイトカイン生成を遮断した。KV1N2(OsK1−Fc融合体)は、Jurkat T細胞株において、Kv1.3の細胞電流を遮断し、hKv1.3 EC3ループキメラを発現している細胞に対するagitoxin2−cys−TAMRA結合が同程度であり、hKv1.3 EC3ループキメラを発現している細胞からのタリウム流を阻害した。この融合体の、CD4+ T細胞活性化阻害能を試験した。表1には、マニュアルでのパッチクランプ電気生理試験から得られたIC50値を掲載する。KV1C2(OdK2−Fc融合体)も、マイトマイシンC処理した、自己抗原を提示している細胞の活性化によりT細胞の増殖を阻害し、上記アッセイにおいて、テタヌス(tetanus)毒抗原を示す(図3)。
2mg/mLのKV1C2(OdK2−Fc融合体)の1xPBS(pH7.0)ストックを5mL/kgでスプラーグドーリーラットに静脈内ボーラス投与し、最終的な投与量を10mg/kgとした。血漿濃度は、上記の通り抗Fc ELISA又はFACSにより求めた。ラットにおけるKV1C2の半減期(T1/2)は60時間であった。
OdK2キメラペプチドFC融合体の生成(「OdK2/OsK1キメラライブラリ」又は「KV1C2L1」)
未改変のOdK2及びOsK1毒素ペプチド配列は、9つのアミノ酸残基が異なる、高度に類似した配列を有する(図1)。Kv1.3の効力及びKv1.xサブタイプの選択性が増強されたペプチド変異体を作出する目的で、GS(G4S)4リンカー(配列番号119)を使用し、ペプチド−リンカー−Fc変異体のコンビナトリアルライブラリを作成した。このライブラリにおいて、OdK2ペプチドアミノ酸配列は、OsK1に由来するOdK2配列と9つ中8つの位置が異なっている(配列番号1のOhK2における位置、3、4、5、9、10、12、16及び20)。この位置ではイソロイシン及びロイシンは類似することから、位置15は、ライブラリの多様性に包含されない。これらの位置は、各位置に存在するOdK2及びOsK1アミノ酸残基を用い多様化させた。したがって、位置3は、PIにより多様化させ、位置4、5、9、10、12、16及び20は、それぞれTI、DN、RK、GI、RP、EQ、及びKDにより多様化させた。同様に、ライブラリの設計には、OsK1ペプチドの効力を増大させる(Mouhat et al.,Biochem J 385:95〜104,2005)と報告されている位置16でのリシン置換による6種の変異と、正確なOdK2アミノ酸配列における初期相違の結果としての位置38でのグルタミン置換とを組み込んだ。したがって、OdK2/OsK1キメラライブラリは、リシン置換変異体、OdK2 K38Q変異体、及びKv1.2(OdK2融合体)及び(OsK1融合体)の両方の親分子の全部で264種のメンバーから構成された。位置付番は、配列番号1の未改変のOdK2ペプチド配列による。
OdK2キメラペプチドFc融合体の特性評価。
実施例2で同定され選択されたOdK2キメラペプチドFc融合タンパク質を上記の通り精製し、2回目の結合アッセイ、電気生理試験、及びT細胞阻害アッセイにより特性評価した。
選択された変異体を、上記の通り安定的に形質移入したCHOを用いてホールセルパッチクランプ試験において効力及び選択性について評価した。単一濃度(Kv1.3については1nM又はKv1.1については100nM)の精製変異体によりヒトKv1.3又はヒトKv1.1の阻害を評価した(表2)。選択した変異体は、親KV1C2と比較してKv1.3に対する活性が大幅に増大していたものの、Kv1.1に対する活性は同程度であった。
**融合タンパク質(10nM)
**選択性=IC50(Kv1.1)/IC50(Kvi3)
「材料及び方法」に記載の通り、抗CD3/C28誘導T細胞からのIL−2分泌の阻害としてT細胞活性化阻害能を測定し、選択されたOdK2キメラペプチドFc融合体を特性評価した。単一濃度(100nM)でOdK2キメラペプチドFc融合体の阻害率を測定した。結果を、最大IL−2産生の阻害率(%)として図5Aに示す。KV1B03は親KV1C2(OdK2融合体)と同一であり、ライブラリの構築中に偶然再生成された。図5Bは、活性化T細胞によるIL−2生産に対するKV1D261による濃度依存性の阻害を示す。KV1D261融合タンパク質によるCD4+ T細胞阻害についてのIC50値は1.66nMであった。
OdK2キメラペプチドFc融合体の阻害特性、並びに選択性がペプチド部分により保有されているかを決定するため、選択されたOdK2キメラ融合体を、対応する合成ペプチドとそれらの特性につい比較した。
*CHO細胞におけるIC50(hKvi.x)/IC50(hxv1.3)比
8.3mg/mLのKV1D261(261−Fc融合体)の1xPBS(pH7.0)ストックを1.2mL/kgでスプラーグドーリーラットに静脈内ボーラス投与し、最終的な投与量を10mg/kgとした。ELISA及びFACSアッセイの両方を用いタンパク質を測定した。半減期は約72時間であるものと評価された。
アミノ酸スキャニングライブラリ(KV1D26L1ライブラリ)の作製
Kv1.3遮断ペプチドの選択性を更に向上させるため、実施例2において記載のOdK2/OsK1で、強力であるものの非選択的な変異体であると同定されたKV1D26(対応するペプチドp26、配列番号111)のペプチド領域の各非システイン残基における9つのアミノ酸(A、R、Q、E、H、L、K、V、D)の単一置換により、スキャニングライブラリを設計した。このアミノ酸スキャニングライブラリは、270の変異体から構成された。
アミノ酸スキャニングライブラリ(Kv1D26L1ライブラリ)から得られた変異体の特性評価
Kv毒素阻害剤との競合
選択された変異体を精製し、公知のKv1.3阻害剤であるagitoxin−2−CysTAMRAとの競合性について、上記の通り一点及び濃度応答性アッセイにおいて評価した。10nMのAgitoxin−2−CysTAMRA、及び単一読み取りについては40nM、又は濃度応答性試験については0.015nM〜4μMのいずれかの各変異体を使用して、ヒトKv1.3 EC3ループキメラを発現している安定的なHEK293細胞において阻害率を評価した。
0:阻害は測定不能
活性化マーカーとしてIL−2分泌を使用して、選択された変異体のT細胞活性化阻害能を上記の通り評価した。
上記の通り、ヒトKv1.3、Kv1.1、又はKv1.6で形質移入したHEK細胞を使用し、ホールセルパッチクランプ試験及びタリウム流入において、KV1D579を試験した。KV1D579についてのIC50値を、親KV1D26、実施例2に置いて単離したOdkキメラ−Fc融合体変異体とともに、表6に掲載する。丸括弧中の値はタリウム流入アッセイに由来するものであり、丸括弧外の値はパッチクランプ試験に由来するものである。
*IC50(Kv1.×)/IC50(Kv1.3)比
C末端延長ライブラリの作製(KV1D819L1ライブラリ)
試験管内での静止期ヒト末梢血単核球の培養により、リンカーGS(G4S)4(配列番号119)を使用して複合させた複数のペプチド−Fc融合タンパク質では望ましくない炎症性サイトカインの放出が誘導されるのに対し、対応する合成ペプチドではそのような誘導はなされないことが判明した。したがって、望ましくないサイトカイン放出は、二価のペプチド−Fc融合体又はそのFcの構造に由来する。
C末端延長ライブラリ(KV1D819L1ライブラリ)の特性評価
C末端延長ライブラリから同定され、選択された候補を精製し、Kv1.3に対する結合を確認した。タリウム流入アッセイについて濃度応答曲線を作成した。表7には、タリウム流入アッセイにおいて求められたIC50値、及び各変異体のC末端延長部分のアミノ酸配列を掲載する。KV1D261_26(GS(G4S)8リンカー(配列番号120)を用いるp261−HSA融合体)をアッセイにおいて対照として使用した。ほとんどのp261 C末端延長ペプチド融合体は、ペプチド部分の延長されていない対照と比較して、タリウム流入において同等の効力を示し又は効力が増強されていた。KV1D261_23よりも長いリンカーを有するKV1D261_26融合体の試験結果は、一貫して、KV2D361_23(Gs(G4S)4リンカーを使用するp261−HSA融合タンパク質(配列番号119)のおよそ5倍超強力であった。
**配列番号119
ペプチドHSA融合タンパク質の設計
様々なリンカーを使用して、ペプチド261を、ヒト血清アルブミン(HSA)との融合タンパク質として設計し、得られた融合タンパク質を、Kv1.3に対する効力及び選択性、並びにT細胞活性化阻害について試験した。各種リンカーによりHSAと複合させたペプチド261によるIL−2分泌の阻害率として測定されたT細胞阻害、並びにタリウム流入阻害の結果を表8に掲載する。
融合タンパク質KV1D261_34、並びに融合タンパク質KV1G49.KV1W720を生成するためAS(AP)20GSリンカー(配列番号116)によりヒトHSAに複合させた対応する合成ペプチドp261及びペプチドp579を、様々な機能アッセイにおいて更に試験した。ヒトKvチャネルに対するそれらの選択性は表9に掲載する通りである。
*IC50 20pM/1% BSA及び13pM/5% FCS
**効力が低いことに起因し濃度応答が不完全。IC50は、試験した最も高濃度のものを超過するものとして報告される。
# CHO細胞におけるIC50(Kv1.1)/IC50(Kv.1.3)の比
更なるC末端延長ペプチド融合体の作製及び特性評価
数種類のC末端延長部分を使用してペプチドp261(配列番号42)及びp579(配列番号3)を延長させて、AS(AP)20GS(配列番号116)又はGS(AP)20ASリンカー(配列番号428)によりHSAと複合させた。選択された融合タンパク質を発現させ、精製し、競合結合アッセイ、タリウム流入アッセイ、in vitroでのヒトCD4+ T細胞活性化、並びに電気生理アッセイなどのアッセイにより特性評価した。
KV1D261薬物動態及びミニブタにおける薬物動態
KV1D261_34(AS(AP)20GSリンカー(配列番号116)により介在される261ペプチドHSA融合タンパク質)を、静脈内注射としてミニブタに単回投与した(30nmoles/Kg)。投与後の各時点でヘパリン添加血漿サンプルを採取し、抗261 capture/抗penta His−HRP ELISAを使用し血漿濃度を求めた。図9には、4頭の実験動物の第36日目までの、並びに2頭の実験動物の第54日目(最終日)の時点での平均±SDとして結果を掲載する。融合体タンパク質の半減期(T1/2)は5〜7日間であり、クリアランス(CL)は0.008〜0.01mL/分/Kgであり、分布容積(Vss)=90〜120mL/Kgであった。
ミニブタキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)誘発性遅発性過敏症(DTH)モデル
ミニブタ遅発性過敏症(DTH)モデルを、KV1D261_34のT細胞機能阻害能を評価するための生体内モデルとして使用した。ミニブタに、溶媒(PBS,n=6)又はKV1D261_34(30nmoles/kg,n=6)のいずれかを投与した。陽性対照として、1日目から、剖検するまでの間、10mg/mL(n=6)濃度で、シクロスポリンAを1日2回1mL/kg皮下投与した。KLH抗原による免疫の1日前に投与を開始した。第0日目に、フロイントの不完全アジュバント(IFAA)に混合した5mg/mL KLH、又は対照群として、IFAに混合したPBS、を1mL皮下注射することにより、ミニブタを免疫した。後肢の尾側の約5箇所に注射した。実験動物には、次に、第7日目に0.1mL/spotのKLH(10、5、2.5、1.25mg/mL)又はPBSを、左脇腹に対して投与毎に1箇所に、右脇腹には二箇所に投与した。投与後1日目及び2日目となる第9日及び第10日目に硬化レベルを測定した。第10日目では、流入領域リンパ節細胞質、抗原に対する抗体力価、投与部位の組織学検査を追加して測定するため、組織及び血液サンプルを採取した。
Claims (18)
- 半減期延長部分と複合させたKv1.3のペプチドアンタゴニストを含む単離された融合タンパク質であり、
該Kv1.3のペプチドアンタゴニストが、
配列GVPXaa1Xaa2VKCXaa3ISRQCXaa4Xaa5PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(配列番号427)を含み、
a)Xaa1は、I又はTであり、
b)Xaa2は、N又はDであり、
c)Xaa3は、K又はRであり、
d)Xaa4は、I又はEであり、
e)Xaa5は、E又はKであり、
Kv1.3を形質移入したCHO細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Kv1.3に対して、約1×10 −8 M以下のIC 50 を有するものであり、
選択度が、Kv1.3又はKv1.1を形質移入したCHO細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Kv1.1のIC 50 値のKv1.3のIC 50 値に対する比として算出される場合に、半減期延長部分に複合させた配列番号1の天然のOdK2ペプチドを含む融合タンパク質と比較して、Kv1.3に対して少なくとも100倍選択的なものである、
前記融合タンパク質。 - 前記Kv1.3のペプチドアンタゴニストが、配列番号3、22、34、又は42のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン(HSA)、アルブミン結合ドメイン(ADB)、又はポリエチレングリコール(PEG)である、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 前記半減期延長部分が、リンカーによりKv1.3のペプチドアンタゴニストと複合されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は428のアミノ配列を含む、請求項5に記載の融合タンパク質。
- a)前記Kv1.3のペプチドアンタゴニストが、配列番号3、22、34、又は42のアミノ酸配列を含み、
b)前記リンカーが、配列番号116又は配列番号119のアミノ酸配列を含み、及び
c)前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、
請求項6に記載の融合タンパク質。 - a)前記Kv1.3のペプチドアンタゴニストが配列番号42のアミノ酸配列を含み、
b)前記リンカーが、配列番号116のアミノ酸配列を含み、及び
c)前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、
請求項6に記載の融合タンパク質。 - a)前記Kv1.3のペプチドアンタゴニストが配列番号42のアミノ酸配列を含み、
b)C末端延長部分が、配列番号209のアミノ酸配列を含み、
c)前記リンカーが、配列番号116のアミノ酸配列を含み、及び
d)前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、
請求項6に記載の融合タンパク質。 - Kv1.3の単離されたペプチドアンタゴニストであって、
配列GVPXaa 1 Xaa 2 VKCXaa 3 ISRQCXaa 4 Xaa 5 PCKDAGMRFGKCMNGKCHCTPK(配列番号427)を含み、
a)Xaa 1 は、I又はTであり、
b)Xaa 2 は、N又はDであり、
c)Xaa 3 は、K又はRであり、
d)Xaa 4 は、I又はEであり、
e)Xaa 5 は、E又はKであり、
Kv1.3を形質移入したCHO細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Kv1.3に対して、約1×10 −8 M以下のIC 50 を有するものであり、
選択度が、Kv1.3又はKv1.1を形質移入したCHO細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Kv1.1のIC 50 値のKv1.3のIC 50 値に対する比として算出される場合に、半減期延長部分に複合させた配列番号1の天然のOdK2ペプチドを含む融合タンパク質と比較して、Kv1.3に対して少なくとも100倍選択的なものである、
前記ペプチドアンタゴニスト。 - 前記アンタゴニストが、半減期延長部分と複合させたKv1.3のペプチドアンタゴニストを含む単離された融合タンパク質である、請求項10に記載のペプチドアンタゴニスト。
- 請求項1〜9に記載の融合タンパク質、又は請求項10若しくは11に記載のペプチドアンタゴニストをコードしている単離ポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項13に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項14に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞により発現された融合タンパク質又はペプチドを回収することとを含む、請求項1〜9に記載の融合タンパク質又は請求項10若しくは11に記載のペプチドアンタゴニストの製造方法。
- 請求項1〜9に記載の融合タンパク質又は請求項10若しくは11に記載のペプチドアンタゴニストと、製薬上許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
- 望ましくないT細胞活性化に関連する状態を治療するためのものである、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記望ましくないT細胞活性化に関連する状態が、炎症状態、免疫及び増殖障害、関節リウマチ(RA)、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、骨粗鬆症、ぶどう膜炎、炎症性線維症、強皮症、肺線維症、硬変、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症、乾癬、接触性皮膚炎、全身性エリテマトーデス(SLE)及びその他の形態のループス、糖尿病、1型糖尿病、肥満、癌、ループス、再狭窄、全身性硬化症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植片拒絶、又は移植片対宿主病である、請求項17に記載の医薬組成物。
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