CN114945584A - 重组肽-mhc复合物结合蛋白及其生成和用途 - Google Patents

重组肽-mhc复合物结合蛋白及其生成和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产对肽‑MHC(pMHC)复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法。本发明还涉及包含一个、两个或更多个对pMHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)的重组结合蛋白，并且还涉及这样的结合蛋白：其还包含对在免疫细胞(优选T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。此外，本发明涉及编码此类结合蛋白或重复结构域的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于治疗或诊断疾病(包括癌症、感染性疾病和自体免疫疾病)的方法中的用途。

Description

重组肽-MHC复合物结合蛋白及其生成和用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2019年12月11日提交的EP19215436.7的优先权的权益。本专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明涉及一种生产对肽-MHC(pMHC)复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法。本发明还涉及包含一个、两个或更多个对pMHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)的重组结合蛋白，并且还涉及这样的结合蛋白：其还包含对在免疫细胞(优选T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。此外，本发明涉及编码此类结合蛋白或重复结构域的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于治疗或诊断疾病(包括癌症、感染性疾病和自体免疫疾病)的方法中的用途。
背景技术
主要组织相容性复合物(MHC)I类分子在细胞内的异常或外来蛋白质的监视中起关键作用。来源于内源性蛋白的肽被装载到MHC I类分子的肽结合槽上，然后显示在细胞表面上。此类MHC I类复合物在所有有核细胞(包括恶性细胞)中表达。肽-MHC(pMHC)复合物被CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上的T细胞受体(TCR)识别。肽-MHC复合物的呈递提供了细胞内环境对循环CTL的快照(Reeves和James，Immunology 150:16-24(2016))。CTL响应于检测到异常或外来抗原(例如癌蛋白，或者细菌蛋白或病毒蛋白)而被激活，导致对呈递细胞的破坏。CTL在某些自体免疫疾病中，在误识别“自身”抗原时也被激活(Bodis等人，Rheumatol.Ther.5:5-20(2018))。
呈递肿瘤特异性或感染因子特异性肽的MHC I类复合物代表了一类独特且有前景的用于癌症和感染性疾病的免疫疗法的细胞表面靶标。已经开发了不同的方法来尝试利用这类靶标，包括疫苗、过继性细胞疗法和TCR样抗体。在这些感染因子特异性肽中，乙型肝炎病毒(HBV)核衣壳抗原的序列18-27被具有急性自限性HBV感染的HLA-A2阳性患者的CTL广泛识别，并且代表基于肽的治疗性疫苗的主要成分，该疫苗旨在刺激慢性乙型肝炎患者的抗病毒CTL应答(Hepatology.1997年10月；26(4):1027-34.c)。
一直以来，治疗性开发病毒或肿瘤特异性肽-MHC复合物的一个障碍是胸腺选择后TCR对肽-MHC复合物的亲和力天生就低。这种低亲和力造成了限制，尤其是考虑到病毒或肿瘤特异性肽-MHC复合物通常以低密度存在于病毒感染细胞或肿瘤细胞的表面上。为了克服该障碍，已开发了亲和力增强的TCR，并且在临床研究中测试了表达此类亲和力增强的TCR的工程化T细胞。据报道，亲和力增强的TCR可能缺乏特异性，并且在一些情况下，表达亲和力增强的TCR的工程化T细胞已经引起严重的、有时甚至致命的医疗并发症，这是由于TCR对来源于无关蛋白质的表位的意外识别(参见例如Linette等人，Blood 122(6):863-871(2013))。亲和力增强的TCR也正被开发为可溶性TCR，但可溶性TCR的表达具有挑战性。
已经报道了许多对呈递病毒或肿瘤特异性肽的MHC I类复合物具有结合特异性的TCR样抗体。其中一些用杂交瘤技术分离。然而，通过杂交瘤技术分离pMHC特异性TCR样抗体一直以来受到许多因素的阻碍，包括需要筛选数百个或甚至数千个克隆、低免疫原性、由于免疫优势造成独特克隆很少，以及对精细特异性的控制很差(参见例如，Porgador等人，Immunity 6:715-726(1997)；Bernardeau等人，Eur.J.Immunol.，35(10):2864-2875(2005)；Skora等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112(32):9967-9972(2015))。更多的TCR样抗体已使用噬菌体展示技术分离。然而，从噬菌体展示文库分离的TCR样抗体的亲和力通常相对低，并且通常不足以用于治疗目的(参见例如Chames等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:7969-7974(2000))。为了生成具有足够高亲和力的TCR样抗体，已经开发了用于亲和力成熟的系统。例如，一种这样的用于TCR样抗体亲和力成熟的系统将诱变、文库和酵母展示、结构测定和分子建模结合起来(Zhao等人，Leukemia 29(11):2238-2247(2015))。Zhao等人只有采用这种复杂且劳动密集型的亲和力成熟方法，才能够将TCR样抗体的结合亲和力提高到约100倍，以获得具有足够大亲和力的pMHC特异性结合蛋白。综上所述，开发以足够大亲和力特异性地结合疾病相关肽-MHC复合物的分子迄今为止一直具有挑战性，并且目前的方法通常涉及难以获得的表达系统和/或耗时费力的过程，诸如筛选大量杂交瘤克隆或亲和力成熟。
因此，仍然需要生产pMHC特异性结合蛋白的新方法、需要新的pMHC特异性结合蛋白，并且需要用于治疗和表征受益于pMHC特异性结合的疾病(包括癌症、自体免疫疾病和感染性疾病)的治疗和诊断方法。
发明内容
本发明提供一种生产对肽-MHC(pMHC)复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法。本发明还提供包含一个、两个或更多个对pMHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)的重组结合蛋白，并且还提供这样的结合蛋白：其还包含对在免疫细胞(优选T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。此外，本发明提供编码此类结合蛋白或重复结构域的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于治疗或诊断哺乳动物(包括人)的疾病(诸如癌症、自体免疫疾病和感染性疾病)的方法中的用途。
本发明的生产对pMHC复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法在生成以高亲和力和/或特异性结合到所选择的靶标pMHC复合物的结合蛋白方面令人惊奇地有效果且有效率。开发以足够大亲和力特异性地结合疾病相关pMHC复合物的分子迄今为止一直具有挑战性，并且目前的方法通常涉及难以获得的表达系统和/或耗时费力的过程，诸如筛选大量杂交瘤克隆或亲和力成熟。本文所公开的本发明方法既不涉及难以获得的表达系统，也不需要耗时费力的过程，诸如上文提到的那些。此外，本发明的结合蛋白与靶标肽-MHC复合物之间的结合相互作用出乎意料地涉及靶标肽中相对大量的氨基酸残基。据信，靶标肽中的大量相互作用残基反映了在不同pMHC复合物的大范围内与靶标肽-MHC复合物的高选择性或特异性结合相互作用。似乎本发明的结合蛋白的pMHC特异性重复结构域可以提供在空间上与复合肽-MHC表面以特异性结合相互作用很好地匹配的结合表面。本发明的方法和结合蛋白还提供了这样的优点：即两个或更多个相同和/或不同的pMHC特异性重复结构域可以容易地组合在一个结合蛋白中(生成例如二价结合蛋白、双互补位结合蛋白或双特异性结合蛋白)，从而允许适应和优化结合蛋白的结合亲合力、结合亲和力、结合特异性和/或效力。此外，本发明的结合蛋白甚至可以还包含对在免疫细胞的表面上表达的蛋白(诸如，作为在细胞毒性T细胞中表达的T细胞受体复合物的一部分的蛋白)具有结合特异性的结合因子。这种免疫细胞接合剂形式(例如，T细胞接合剂形式)的本发明的结合蛋白可以有利地用于激活免疫细胞(例如T细胞)的方法和/或以定位和靶向方式接合免疫系统的方法中。此外，本发明的方法和结合蛋白允许特异性地靶向细胞内蛋白及其他对象，从而促进许多新的诊断和治疗机会，例如针对癌症、感染性疾病和自体免疫疾病。在一个方面，本发明提供了一种生产肽-MHC(pMHC)特异性结合蛋白的方法，其中所述结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域，该方法包括以下步骤：
(a)提供经设计的重复结构域的集合；
(b)提供重组的靶标肽-MHC复合物；以及
(c)筛选所述经设计的重复结构域的集合的对所述靶标肽-MHC复合物的特异性结合，以获得至少一个对所述靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。在一个优选的实施方案中，所述经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
在另一方面，本发明提供了一种重组结合蛋白，其包含可通过上述方法获得的经设计的重复结构域。
在另一方面，本发明提供了一种重组结合蛋白，其包含第一经设计的重复结构域，其中所述第一重复结构域对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性。在一个优选的实施方案中，所述第一靶标肽来源于与疾病或疾患相关联的蛋白质。作为示例，在一个特定的优选实施方案中，所述第一靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽；(ii)来源于感染因子(优选病毒感染因子)的蛋白的肽；以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。
在一个特定方面，所述第一靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白，诸如HBV核心抗原(HBcAg)。在一个优选方面，来源于HBcAg的靶标肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:51或由该氨基酸序列组成。
在一个优选方面，本发明提供这样的重组结合蛋白：其包含对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第一经设计的重复结构域，其中所述第一重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。在一个特定方面，本发明提供这样的重组结合蛋白：其包含对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第一锚蛋白重复结构域，其中所述第一靶标肽来源于HBcAg，并且其中所述第一锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个特定的实施方案中，本发明提供这样的重组结合蛋白：其包含对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第一锚蛋白重复结构域，其中所述第一靶标肽来源于HBcAg，并且其中所述第一锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个特定方面，本发明提供这样的重组结合蛋白：其还包含对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第二经设计的重复结构域。在一个优选的实施方案中，所述第二靶标肽来源于与疾病或疾患相关联的蛋白质。作为示例，在一个特定的优选实施方案中，所述第二靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽；(ii)来源于感染因子(优选病毒感染因子)的蛋白的肽；以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。
在一个特定方面，所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽相同的蛋白。在一个实施方案中，所述第二靶标肽具有与所述第一靶标肽相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述第二重复结构域具有与所述第一重复结构域相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第一重复结构域相比具有不同的氨基酸序列。在一个实施方案中，与所述第一靶标肽相比，所述第二靶标肽具有不同的氨基酸序列。
在一个特定方面，所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽所来源的蛋白不同的蛋白。
在一个优选方面，本发明提供这样的重组结合蛋白：其还包含对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第二经设计的重复结构域，其中所述第二重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。在一个特定方面，本发明提供这样的重组结合蛋白：其还包含对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第二锚蛋白重复结构域，其中所述第二靶标肽来源于HBcAg，并且其中所述第二锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个特定的实施方案中，本发明提供这样的重组结合蛋白：其还包含对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第二锚蛋白重复结构域，其中所述第二靶标肽来源于HBcAg，并且其中所述第二锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个优选方面，重复结构域与其靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，重复结构域与其靶标肽-MHC复合物的结合替代性地包括或还包括所述重复结构域与所述MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
在一个特定方面，本发明提供此类pMHC特异性重组结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含对在免疫细胞(优选T细胞，更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。在一个实施方案中，在T细胞表面上表达的所述蛋白是作为T细胞受体复合物的一部分的蛋白。作为一个示例，在一个特定的实施方案中，本发明提供此类pMHC特异性重组结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含对CD3具有结合特异性的结合因子。
在一个优选方面，本发明提供这样的重组结合蛋白：其还包含对免疫细胞的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子，其中所述结合因子是经设计的重复结构域，优选经设计的锚蛋白重复结构域。
在另一方面，本发明提供编码本发明的经设计的重复结构域或编码本发明的pMHC特异性重组结合蛋白的核酸，以及包含本发明的pMHC特异性重组结合蛋白或核酸和药学上可接受的载剂和/或稀释剂的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物(优选人)中感染定位激活T细胞的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的pMHC特异性重组结合蛋白或核酸的步骤，其中所述结合蛋白还包含对免疫细胞的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子，并且其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于感染因子的蛋白。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的pMHC特异性重组结合蛋白或核酸，其用于在哺乳动物(优选人)中感染定位激活T细胞的方法中，其中所述结合蛋白还包含对在免疫细胞的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子，并且其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于感染因子的蛋白。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗医学病症的方法，该方法包括向对该治疗有需要的患者施用治疗有效量的本发明的pMHC特异性重组结合蛋白、核酸或药物组合物的步骤。
在另一方面，本发明提供了本发明的pMHC特异性重组结合蛋白、核酸或药物组合物，其用于治疗医学病症的方法中。
在另一方面，本发明提供了一种诊断哺乳动物(优选人)中的医学病症的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使从所述哺乳动物获得的细胞或组织样品与本发明的pMHC特异性重组结合蛋白接触；以及
(ii)检测所述结合蛋白与所述细胞或组织样品的特异性结合。
在一个特定方面，所述医学病症是癌症、感染性疾病(优选病毒感染性疾病)或自体免疫疾病。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。在一个实施方案中，所述医学病症是感染性疾病，优选病毒感染性疾病。在一个实施方案中，所述医学病症是自体免疫疾病。
在另一方面，本发明提供了一种靶向患有病毒感染性疾病的患者中的受感染细胞以破坏所述受感染细胞的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的本发明的pMHC特异性重组结合蛋白、核酸或药物组合物的步骤，其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述结合蛋白还包含能够杀死受感染细胞的毒性因子。
在另一方面，本发明提供了本发明的pMHC特异性重组结合蛋白、核酸或药物组合物，其用于靶向患有病毒感染性疾病的患者中的受感染细胞以破坏所述受感染细胞的方法中，其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述结合蛋白还包含能够杀死受感染细胞的毒性因子。
附图说明
图1A至图1J：本发明的结合蛋白与靶标肽-MHC复合物的高亲和力结合。以下
Figure BDA0003747473990000081
蛋白的多迹线SPR测量：#16(A)、#17(B)、#18(C)、#20(D)、#21(E)、#22(F)、#23(G)、#24(H)、#25(I)和#26(J)。测试的这些
Figure BDA0003747473990000082
蛋白以高亲和力结合到HBVc18pMHC。
图2A至图2J：使用经HBVc18脉冲处理(10nM)的T2细胞作为靶标细胞的T细胞激活测定(黑色条)，与之对比的是使用未经脉冲处理的T2细胞的T细胞激活(深灰色条)或仅使用HLA-A*02+T细胞作为对照的T细胞激活(浅灰色条)。使用了三个DARPin浓度(10,000pM、100pM和1pM)。测试的TCE
Figure BDA0003747473990000083
蛋白为：(A)TCE
Figure BDA0003747473990000084
蛋白#16、(B)TCE
Figure BDA0003747473990000085
蛋白#17、(C)TCE
Figure BDA0003747473990000086
蛋白#18、(D)TCE
Figure BDA0003747473990000087
蛋白#20、(E)TCE
Figure BDA0003747473990000088
蛋白#21、(F)TCE
Figure BDA0003747473990000089
蛋白#22、(G)TCE
Figure BDA00037474739900000810
蛋白#23、(H)TCE
Figure BDA00037474739900000811
蛋白#24、(I)TCE
Figure BDA00037474739900000812
蛋白#25和(J)TCE
Figure BDA00037474739900000813
蛋白#26。通过FACS检测这些T细胞中的细胞内干扰素-γ(IFN-γ)。
图3A至图3J：通过丙氨酸扫描诱变分析靶标肽结合。在T细胞激活测定中，使用经脉冲处理的T2细胞作为靶标细胞并且使用BK112 T细胞作为效应细胞，测试结合蛋白与HBVc18肽(c18)及其一系列丙氨酸突变变体的功能性结合。指示了HBVc18肽中被丙氨酸替代的氨基酸残基和位置。使用未经脉冲处理的T2细胞作为对照。测试的TCE
Figure BDA0003747473990000091
蛋白为：(A)TCE
Figure BDA0003747473990000092
蛋白#16、(B)TCE
Figure BDA0003747473990000093
蛋白#17、(C)TCE
Figure BDA0003747473990000094
蛋白#18、(D)TCE
Figure BDA0003747473990000095
蛋白#20、(E)TCE
Figure BDA0003747473990000096
蛋白#21、(F)TCE
Figure BDA0003747473990000097
蛋白#22、(G)TCE
Figure BDA0003747473990000098
蛋白#23、(H)TCE
Figure BDA0003747473990000099
蛋白#24、(I)TCE
Figure BDA00037474739900000910
蛋白#25和(J)TCE
Figure BDA00037474739900000911
蛋白#26。检测细胞内IFN-γ作为T细胞激活的量度。
图4和图5：TCE形式的pMHC特异性结合蛋白引起的T细胞激活取决于将pMHC特异性结合结构域与CD3特异性结合因子连接的接头的长度。将HLA-A2+/NY-ESO-1+肿瘤细胞(IM9)(实线)或HLA-A2+/NY-ESO-1-肿瘤细胞(MCF-7)(虚线)与PBMC一起温育48小时，该温育过程存在或不存在具有不同接头长度的TCE
Figure BDA00037474739900000912
蛋白#78(图4)或具有不同接头长度的TCE
Figure BDA00037474739900000913
蛋白#79(图5)。48小时后，测量CD8+T细胞的CD25表达。示出了在存在TCE
Figure BDA00037474739900000914
蛋白的情况下获得的结果。在不存在TCE
Figure BDA00037474739900000915
蛋白的情况下没有观察到T细胞激活。Ag：抗原/NY-ESO-1。接头长度：标准、XXS、XS、S和L(参见实施例5)。
图6和图7：TCE形式的pMHC特异性结合蛋白引起的T细胞激活取决于将pMHC特异性结合结构域与CD3特异性结合因子连接的接头的长度。将HLA-A2+/NY-ESO-1+肿瘤细胞(U266B1)(实线)或HLA-A2+/NY-ESO-1-肿瘤细胞(Colo205)(虚线)与PBMC一起温育48小时，该温育过程存在或不存在具有不同接头长度的TCE
Figure BDA00037474739900000916
蛋白#78(图6)或具有不同接头长度的TCE
Figure BDA00037474739900000917
蛋白#79(图7)。48小时后，测量CD8+T细胞的CD25表达。示出了在存在TCE
Figure BDA00037474739900000918
蛋白的情况下获得的结果。在不存在TCE
Figure BDA00037474739900000919
蛋白的情况下没有观察到T细胞激活。Ag：抗原/NY-ESO-1。接头长度：标准、XXS、XS、S和L(参见实施例5)。
具体实施方式
如本文所公开和举例说明的，本公开提供了特异性靶向肽-MHC复合物的经设计的重复蛋白，优选经设计的锚蛋白重复蛋白。经设计的重复蛋白文库(包括经设计的锚蛋白重复蛋白文库)(WO2002/020565；Binz等人，Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp等人，Drug Discov.Today 13,695-701,2008)可以用于选择以高亲和力结合到其靶标的靶标特异性的经设计的重复结构域。此类靶标特异性的经设计的重复结构域进而可以用作用于治疗疾病的重组结合蛋白的有价值的组分。尚未显示经设计的重复蛋白文库是否可以用于鉴定以高亲和力特异性地结合到复合表位的蛋白，诸如肽-MHC复合物所呈递的蛋白。一直以来众所周知的是，很难生成以足够大亲和力特异性地结合疾病相关肽-MHC复合物的分子。
经设计的锚蛋白重复蛋白是一类结合分子，其具有克服单克隆抗体限制的潜力，从而允许新型治疗方法。此类锚蛋白重复蛋白可以包含单个经设计的锚蛋白重复结构域，或者可以包含两个、三个、四个、五个或更多个具有相同或不同靶标特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的组合(Stumpp等人，Drug Discov.Today 13,695-701,2008；美国专利9,458,211)。仅包含单个经设计的锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白为小蛋白质(14kDa)，其可被选择为以高亲和力和特异性结合给定靶蛋白。这些特征以及在一种蛋白中组合两个、三个、四个、五个或更多个经设计的锚蛋白重复结构域的可能性使得经设计的锚蛋白重复蛋白成为理想的激动性、拮抗性和/或抑制性药物候选物。此外，此类锚蛋白重复蛋白可被工程化以携带各种效应子功能，例如细胞毒性剂或半衰期延长剂，从而实现全新的药物形式。总之，经设计的锚蛋白重复蛋白为具有超过现有抗体药物的潜力的下一代蛋白质治疗剂的示例。
Figure BDA0003747473990000101
是Molecular Partners AG(Switzerland)拥有的商标。
在一个方面，本发明提供了一种生产肽-MHC(pMHC)特异性结合蛋白的方法，其中所述结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域，该方法包括以下步骤：
(a)提供经设计的重复结构域的集合；
(b)提供重组的靶标肽-MHC复合物；以及
(c)筛选所述经设计的重复结构域的集合的对所述靶标肽-MHC复合物的特异性结合，以获得至少一个对所述靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。
在一个实施方案中，所述经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域，并且所述经设计的重复结构域的集合是经设计的锚蛋白重复结构域的集合。
在一个实施方案中，所述集合包括含有固定位置和随机化位置的经设计的重复结构域，并且其中所述集合的经设计的重复结构域在至少一个随机化位置上彼此不同。
在一个实施方案中，所述经设计的重复蛋白的集合由核糖体展示技术提供。
在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(i)提供第二重组肽-MHC复合物，其中所述第二肽-MHC复合物的所述肽包含与所述靶标肽有至少一个氨基酸残基差异的氨基酸序列；以及(ii)通过负选择从所述集合中去除对所述第二重组肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。
在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M、或低于5×10-9M、或低于3×10-9M、或低于2×10-9M、或低于10-9M、或低于5×10-10M、或低于3×10- 1M、或低于2×10-10M、或低于10-10M的解离常数(KD)结合到所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合到所述靶标肽-MHC复合物。
在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。因此，在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少一个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少两个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少三个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少四个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少五个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少六个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少七个氨基酸残基的相互作用。在一个另外的或替代性的实施方案中，对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
用于确定参与蛋白之间或蛋白与肽之间的结合相互作用的氨基酸残基的方法(诸如丙氨酸扫描诱变)是本领域技术人员熟知的。作为一个示例，参与对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的本发明的结合蛋白或经设计的重复结构域与该靶标肽-MHC复合物之间的结合相互作用的靶标肽的氨基酸残基可以通过丙氨酸扫描诱变来确定。
在本发明的上下文中，参与对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的结合蛋白或经设计的重复结构域与该靶标肽-MHC复合物之间的结合相互作用的靶标肽的氨基酸残基的典型和优选的确定如实施例4所述通过丙氨酸扫描诱变来进行。因此，在一个实施方案中，参与对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的本发明的结合蛋白或经设计的重复结构域与该靶标肽-MHC复合物之间的结合相互作用的靶标肽的所述氨基酸残基通过丙氨酸扫描诱变来确定。在一个实施方案中，参与对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的本发明的结合蛋白或经设计的重复结构域与该靶标肽-MHC复合物之间的结合相互作用的靶标肽的所述氨基酸残基如实施例4所述通过丙氨酸扫描诱变来确定。
在本发明的上下文中，用语“对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用”或类似的用语，是指靶标肽的下述任何氨基酸残基：其突变为丙氨酸导致在如实施例4所述的丙氨酸扫描诱变测定(或类似测定)中T细胞激活与野生型肽相比降低至少50％。
本发明的发明人已经发现，要获得本发明的包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的结合蛋白与该HBVc18pMHC复合物中的HBVc18靶标肽之间的特异性相互作用，重要的是存在数量大得惊人的肽残基。例如，在所附的实施例中，已经鉴定了对于获得本发明的包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的结合蛋白与该HBVc18pMHC复合物中的HBVc18靶标肽之间的特异性相互作用很重要的几个肽残基(参见图3A至图3J)。发明人推论出，该发现可以反映由本发明的经设计的锚蛋白重复结构域形成的结合表面与由其他结合蛋白(诸如抗体和T细胞受体(TCR))形成的结合表面之间的结构差异。不受任何理论的束缚，据信参与重复结构域与其靶标肽的结合的氨基酸残基的数量越多，结合特异性就越高。
在一个实施方案中，所述靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽；(ii)来源于感染因子(诸如细菌感染因子或病毒感染因子，优选病毒感染因子)的蛋白的肽；以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。在一个实施方案中，所述靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述靶标肽来源于HBcAg。在一个实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，所述MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述MHC I类是HLA-A*02。在一个实施方案中，所述HLA-A*02是HLA-A*0201。在一个实施方案中，所述HLA-A*0201具有氨基酸序列SEQ ID NO:69。替代性地，在另一个实施方案中，所述MHC不是HLA-A*02。
在另一方面，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包含可通过如本文所述的本发明方法之一获得的经设计的重复结构域。
在另一方面，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包含第一经设计的重复结构域，其中所述第一重复结构域对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性。
在一个优选的实施方案中，本发明的结合蛋白包含对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第一经设计的重复结构域，其中所述第一靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽；(ii)来源于感染因子(诸如细菌感染因子或病毒感染因子，优选病毒感染因子)的蛋白的肽；以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。
在一个实施方案中，所述第一靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述第一靶标肽来源于病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述第一靶标肽来源于HBcAg。在一个实施方案中，所述第一靶标肽具有氨基酸序列SEQ IDNO:51。
在一个优选的实施方案中，所述第一MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述第一MHC I类是HLA-A*02。在一个实施方案中，所述HLA-A*02是HLA-A*0201。在一个实施方案中，所述HLA-A*0201具有氨基酸序列SEQ ID NO:69。替代性地，在另一个实施方案中，所述第一MHC不是HLA-A*02。
在一个实施方案中，所述第一重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合到所述第一靶标肽-MHC复合物。
在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。因此，在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少一个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少两个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少三个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少四个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少五个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少六个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少七个氨基酸残基的相互作用。在一个另外的或替代性的实施方案中，所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
在一个优选的实施方案中，所述第一经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。在一个特别优选的实施方案中，所述第一经设计的锚蛋白重复结构域是如本文的任何方面或任何实施方案中更具体地描述的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ IDNO:27至50中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:27至50组成的组的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50，以及(2)其中SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:29、30、37至43和48至50，以及(2)其中SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50，以及(2)其中SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50，以及(2)其中SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50组成的组的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37、38、42和43，以及(2)其中SEQ ID NO:37、38、42和43中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37、38、42和43，以及(2)其中SEQ ID NO:37、38、42和43中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37、38、42和43，以及(2)其中SEQ ID NO:37、38、42和43中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37、38、42和43，以及(2)其中SEQ IDNO:37、38、42和43中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:37、38、42和43组成的组的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和任选地第三锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块、所述第二锚蛋白重复模块和(如果存在)所述第三锚蛋白重复模块中的每一者独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块、所述第二锚蛋白重复模块和(如果存在)所述第三锚蛋白重复模块中的每一者独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50，以及(2)其中SEQ ID NO:29、30、37至43和48至50中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块、所述第二锚蛋白重复模块和(如果存在)所述第三锚蛋白重复模块中的每一者独立地包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37、38、42和43，以及(2)其中SEQ ID NO:37、38、42和43中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQID NO:37中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ ID NO:38中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQ ID NO:37中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ ID NO:38中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQ ID NO:37中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ IDNO:38中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQ ID NO:37中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ ID NO:38中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQ ID NO:37中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ ID NO:38中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQ ID NO:37中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ ID NO:38中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:37，以及(2)其中SEQ ID NO:37中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:38，以及(2)其中SEQ ID NO:38中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:37，并且所述第二锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQID NO:42中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ ID NO:43中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQ ID NO:42中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ ID NO:43中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQ ID NO:42中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ IDNO:43中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQ ID NO:42中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ ID NO:43中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQ ID NO:42中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ ID NO:43中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQ ID NO:42中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ ID NO:43中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:42，以及(2)其中SEQ ID NO:42中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:43，以及(2)其中SEQ ID NO:43中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:42，并且所述第二锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:43。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQID NO:29中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ ID NO:30中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQ ID NO:29中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ ID NO:30中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQ ID NO:29中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ IDNO:30中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQ ID NO:29中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ ID NO:30中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQ ID NO:29中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ ID NO:30中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQ ID NO:29中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ ID NO:30中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:29，以及(2)其中SEQ ID NO:29中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:30，以及(2)其中SEQ ID NO:30中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且所述第二锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:30。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ ID NO:39中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:40，以及(2)其中SEQ ID NO:40中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ ID NO:41中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ ID NO:39中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:40，以及(2)其中SEQ ID NO:40中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ ID NO:41中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ IDNO:39中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:40，以及(2)其中SEQ ID NO:40中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ ID NO:41中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ ID NO:39中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:40，以及(2)其中SEQ ID NO:40中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ ID NO:41中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ ID NO:39中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:40，以及(2)其中SEQID NO:40中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ ID NO:41中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ ID NO:39中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:40，以及(2)其中SEQ ID NO:40中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ IDNO:41中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:39，以及(2)其中SEQ ID NO:39中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:40，以及(2)其中SEQ ID NO:40中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:41，以及(2)其中SEQ IDNO:41中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，并且所述第二锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，并且所述第三锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:41。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ ID NO:48中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:49，以及(2)其中SEQ ID NO:49中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ ID NO:50中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ ID NO:48中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:49，以及(2)其中SEQ ID NO:49中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ ID NO:50中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ IDNO:48中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:49，以及(2)其中SEQ ID NO:49中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ ID NO:50中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ ID NO:48中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:49，以及(2)其中SEQ ID NO:49中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ ID NO:50中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ ID NO:48中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:49，以及(2)其中SEQID NO:49中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ ID NO:50中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ ID NO:48中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:49，以及(2)其中SEQ ID NO:49中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ IDNO:50中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:48，以及(2)其中SEQ ID NO:48中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:49，以及(2)其中SEQ ID NO:49中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:50，以及(2)其中SEQ IDNO:50中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在这样的锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述第二锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，并且所述第三锚蛋白重复模块包含氨基酸序列SEQ ID NO:50。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个优选的实施方案中，如本文所述和所提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常所述模块的总体结构不受这些取代的影响。
在一个优选的实施方案中，如本文所述和所提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的除SEQ ID NO:27至50的随机化位置3、4、6、14和15之外的位置中。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:16至26的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至18和20至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至18和20至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至18和20至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至18和20至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:17、21、22、23和26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17、21、22、23和26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:17、21、22、23和26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:17、21、22、23和26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17、21、22、23和26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ IDNO:17、21、22、23和26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:17、21、22、23和26中的任一者。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ IDNO:17、21、22、23和26的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:17、21、22、23和26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17、21、22、23和26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:17、21、22、23和26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21和23中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:21和23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21和23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21和23的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21和23中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:21和23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21和23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21和23的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21和23中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21和23中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21和23中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21和23中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:21和23中的任一者。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:21和23的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:21和23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21和23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21和23的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:17的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQID NO:17的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:17的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:17的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:17具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:17。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，其中SEQ ID NO:17的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:17的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:21的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQID NO:21的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:21的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:21具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:21。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，其中SEQ ID NO:21的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:22的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:22的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQID NO:22的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:22的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:22的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:22的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:22具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:22。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:22，其中SEQ ID NO:22的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:22的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:22的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQID NO:23的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:23的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:23具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:23。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，其中SEQ ID NO:23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:23的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个特定的实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQID NO:26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:26具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ IDNO:26。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，其中SEQ ID NO:26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10- 8M、或低于10-8M、或低于5×10-9M、或低于3×10-9M、或低于2×10-9M、或低于10-9M、或低于5×10-10M、或低于3×10-10M、或低于2×10-10M、或低于10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于3×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于3×10-9M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于2×10-9M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于3×10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于2×10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者，其中SEQID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至18和20至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至18和20至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至18和20至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至18和20至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合所述第一靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于2×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:16至26中的任一者，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10- 8M、或低于10-8M、或低于5×10-9M、或低于3×10-9M、或低于2×10-9M、或低于10-9M、5×10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:17的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:17的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:17具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M、或低于5×10-9M、或低于3×10-9M、或低于2×10-9M、或低于10-9M、5×10-10M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，其中SEQ ID NO:17的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:17的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:17的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10- 8M、或低于10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:21的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:21具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，其中SEQID NO:21的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:21的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:21的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10- 8M的解离常数(KD)结合所述第一靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:22的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ IDNO:22的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:22的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:22具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:22。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:22，其中SEQ ID NO:22的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:22的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:22的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:23的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:23具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，其中SEQ ID NO:23的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:23的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:23的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10- 8M、或低于10-8M的解离常数(KD)结合所述靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:26的最后一个位置处的A任选地被N取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:26具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:26。因此，在一个实施方案中，根据本发明的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M的解离常数(KD)结合所述第一靶标肽-MHC复合物，并且所述经设计的锚蛋白重复结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，其中SEQ ID NO:26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:26的最后一个位置处的A任选地被N取代。在一个优选的实施方案中，所述靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
在本发明的上下文中，在实施例2中描述了通过表面等离子体共振(SPR)分析进行的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的本发明的重组结合蛋白或经设计的重复结构域的解离常数(KD)的典型和优选的确定。因此，在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白或经设计的重复结构域的靶标肽-MHC复合物的所述结合特异性在PBS中通过表面等离子体共振(SPR)测定。在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白或经设计的重复结构域的靶标肽-MHC复合物的所述结合特异性如实施例2中所述在PBS中通过表面等离子体共振(SPR)测定。
在本发明的一个方面，本发明的重组结合蛋白还包含对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第二经设计的重复结构域。
在一个优选的实施方案中，所述第二靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽；(ii)来源于感染因子(诸如细菌感染因子或病毒感染因子，优选病毒感染因子)的蛋白的肽；以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。
在一个实施方案中，所述第二靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述第二靶标肽来源于病毒特异性蛋白。
在一个实施方案中，对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述第二重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于5×10-8M、或低于3×10-8M、或低于2×10-8M、或低于10-8M、或低于5×10-9M、或低于3×10-9M、或低于2×10-9M、或低于10-9M、或低于5×10-10M、或低于3×10-10M、或低于2×10-10M、或低于10-10M的解离常数(KD)结合到所述第二靶标肽-MHC复合物。在一个实施方案中，对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述第二重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合到所述第二靶标肽-MHC复合物。
在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。因此，在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少一个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少两个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少三个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少四个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少五个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少六个氨基酸残基的相互作用。在一个实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少七个氨基酸残基的相互作用。在一个另外的或替代性的实施方案中，所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的所述结合包括所述第二重复结构域与所述第二MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
在一个实施方案中，所述第二MHC是MHC I类。在一个实施方案中，所述第二MHC是HLA-A*02。在一个实施方案中，所述HLA-A*02是HLA-A*0201。在一个实施方案中，所述HLA-A*0201具有氨基酸序列SEQ ID NO:69。替代性地，在另一个实施方案中，所述第二MHC不是HLA-A*02。
在一个实施方案中，所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽相同的蛋白。在一个实施方案中，所述第二靶标肽具有与所述第一靶标肽相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述第二重复结构域具有与所述第一重复结构域相同的氨基酸序列。替代性地，在另一个实施方案中，与所述第一重复结构域相比，所述第二重复结构域具有不同的氨基酸序列。在一个实施方案中，与所述第一靶标肽相比，所述第二靶标肽具有不同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽所来源的蛋白不同的蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述第二经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。在一个特别优选的实施方案中，所述第二经设计的锚蛋白重复结构域是如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
在本发明的一个方面，本发明的重组结合蛋白还包含对第三靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第三经设计的重复结构域。在一个优选的实施方案中，所述第三经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。在一个特别优选的实施方案中，所述第三经设计的锚蛋白重复结构域是如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
在本发明的上下文中，当本发明的重组结合蛋白包含第一经设计的重复结构域和第二经设计的重复结构域时，并且当所述第一重复结构域和所述第二重复结构域对相同的靶标肽-MHC复合物具有结合特异性时，即第二靶标肽具有与第一靶标肽相同的氨基酸序列时，并且当所述第一重复结构域和所述第二重复结构域在序列上相同时，所述重组结合蛋白是二价的。在本发明的上下文中，当本发明的重组结合蛋白包含第一经设计的重复结构域和第二经设计的重复结构域时，并且当所述第一重复结构域和所述第二重复结构域对相同的靶标肽-MHC复合物具有结合特异性时，即第二靶标肽具有与第一靶标肽相同的氨基酸序列时，并且当所述第一重复结构域和所述第二重复结构域在序列上不同时，所述重组结合蛋白是双互补位的。在本发明的上下文中，当本发明的重组结合蛋白包含第一经设计的重复结构域和第二经设计的重复结构域时，并且当所述第一重复结构域和所述第二重复结构域对不同的靶标肽-MHC复合物具有结合特异性时，即第二靶标肽与第一靶标肽相比具有不同的氨基酸序列时，所述重组结合蛋白是双特异性的。不同的靶标肽可以来源于相同的蛋白或不同的蛋白。在本发明的上下文中，相同的定义类似地适用于本发明的包含第一经设计的重复结构域、第二经设计的重复结构域和第三经设计的重复结构域的重组结合蛋白，其中第一经设计的重复结构域、第二经设计的重复结构域和第三经设计的重复结构域中的每一者对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白是单价、二价、三价、多价、单互补位、双互补位、三互补位、多互补位、单特异性、双特异性、三特异性或多特异性的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是单价的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是二价的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是三价的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是多价的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是单互补位的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是双互补位的，在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是三互补位的，在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是多互补位的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是单特异性的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是双特异性的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是三特异性的。在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是多特异性的。应当理解，上述实施方案能够彼此组合。作为一个示例，本发明的包含对第一种pMHC复合物具有特异性的两个相同重复结构域并且还包含对第二种不同的pMHC复合物具有特异性的第三重复结构域的重组结合蛋白将同时是二价和双特异性的。因此，在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白是单价、二价、三价或多价和单互补位、双互补位、三互补位或多互补位和/或单特异性、双特异性、三特异性或多特异性的任何组合。
在一个实施方案中，当本发明的重组结合蛋白包含两个或更多个锚蛋白重复结构域时，例如当本发明的重组结合蛋白包含两个或三个锚蛋白重复结构域时，所述两个或更多个锚蛋白重复结构域(例如所述两个或三个锚蛋白重复结构域)可以用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头SEQ ID NO:1或2。在一个实施方案中，所述两个或更多个锚蛋白重复结构域(例如所述两个或三个锚蛋白重复结构域)用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头SEQ ID NO:1或2连接。在另一个实施方案中，所述肽接头是富含甘氨酸-丝氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是富含甘氨酸-丝氨酸的肽接头SEQ ID NO:3。在一个实施方案中，所述两个或更多个锚蛋白重复结构域(例如所述两个或三个锚蛋白重复结构域)用富含甘氨酸-丝氨酸的肽接头SEQ ID NO:3连接。在一个实施方案中，当本发明的重组结合蛋白包含三个或更多个锚蛋白重复结构域时，所述三个或更多个锚蛋白重复结构域可以用不同的肽接头(例如富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头和富含丝氨酸-甘氨酸的肽接头，诸如肽接头SEQ ID NO:1至3)连接。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的锚蛋白重复模块。
在一个实施方案中，该重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的锚蛋白重复模块。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个均包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个均包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的恰好两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的三个锚蛋白重复结构域，其中所述三个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的恰好三个锚蛋白重复结构域，其中所述三个锚蛋白重复结构域中的每一个独立地包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的单个经设计的锚蛋白重复结构域，或者包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的两个、三个、四个、五个或更多个经设计的锚蛋白重复结构域的组合。
在本发明的一个方面，本发明的重组结合蛋白还包含结合因子。
在一个特定的实施方案中，所述结合因子对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性。在另一个实施方案中，在T细胞表面上表达的所述蛋白是作为T细胞受体复合物的一部分的蛋白。作为一个示例，在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含对分化簇3(CD3)具有结合特异性的结合因子。
在本发明的上下文中，结合因子可以是抗体、抗体模拟物(包括支架蛋白或重复蛋白)、经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)，或者本领域已知的任何其他合适的结合分子。在一个实施方案中，所述结合因子是抗体。在另一个实施方案中，所述结合因子是经设计的重复结构域，优选经设计的锚蛋白重复结构域。
在一个特定的实施方案中，所述结合因子包含对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的抗体，或者由该抗体组成。在另一个实施方案中，在T细胞表面上表达的所述蛋白是作为T细胞受体复合物的一部分的蛋白。作为一个示例，在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含对CD3具有结合特异性的抗体。
在一个特定的实施方案中，所述结合因子包含对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)，或者由该经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)组成。在另一个实施方案中，在T细胞表面上表达的所述蛋白是作为T细胞受体复合物的一部分的蛋白。作为一个示例，在一个特定的实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含对CD3具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述结合因子连接、缀合、融合或以其他方式物理附接到所述pMHC特异性锚蛋白重复结构域或者所述两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述结合因子共价连接到所述pMHC特异性锚蛋白重复结构域或者所述两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述结合因子用肽接头共价连接到所述pMHC特异性锚蛋白重复结构域或者所述两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头SEQ ID NO:1或2。在一个实施方案中，所述结合因子用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头SEQ ID NO:1或2共价连接到所述pMHC特异性锚蛋白重复结构域或者所述两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域。在另一个实施方案中，所述肽接头是富含甘氨酸-丝氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是富含甘氨酸-丝氨酸的肽接头SEQ ID NO:3。在一个实施方案中，所述结合因子用富含甘氨酸-丝氨酸的肽接头SEQ ID NO:3共价连接到所述pMHC特异性锚蛋白重复结构域或者所述两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域。
本发明的发明人惊奇且意外地发现，所述结合因子与所述pMHC特异性锚蛋白重复结构域(或者所述两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域)之间的接头越短，T细胞接合剂形式的构建体的效力越高(参见实施例5)。因此，在另一个优选的实施方案中，本文所述的肽接头的氨基酸序列的长度小于38个氨基酸，优选至多37个、更优选至多24个、甚至更优选至多18个、甚至更优选至多11个、最优选至多6个氨基酸。在另一个优选的实施方案中，所述肽接头的氨基酸序列的长度为1个至37个、1个至24个、1个至23个、1个至18个、1个至17个、1个至11个、1个至10个、1个至6个、6个至37个、6个至24个、6个至23个、6个至18个、6个至17个或6个至11个氨基酸残基。优选地，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在另一个优选的实施方案中，所述肽接头的氨基酸序列的长度少于18个氨基酸并且为至少1个氨基酸，即，所述肽接头的长度为1个至17个氨基酸。在一个实施方案中，所述接头具有如以SEQ ID NO:1和74至77中的任一者提供的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述肽接头具有如以SEQ ID NO:75提供的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，所述肽接头具有如以SEQ ID NO:76提供的氨基酸序列。在一个最优选的实施方案中，所述肽接头具有如以SEQ ID NO:77提供的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，本发明的重组结合蛋白(其中所述结合蛋白包含如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的一个、两个、三个或更多个pMHC特异性锚蛋白重复结构域，并且其中所述结合蛋白还包含CD3特异性结合因子)能够促进T细胞的感染定位激活或肿瘤定位激活。在此类情况下，本发明的重组结合蛋白能够以T细胞接合剂形式用于针对呈递靶标肽-MHC复合物的肿瘤细胞和/或呈递靶标肽-MHC复合物的感染性细胞局部激活T细胞。
在本发明的一个方面，本发明的重组结合蛋白能够抑制所述第一靶标肽-MHC复合物和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽-MHC复合物被T细胞受体识别。换句话讲，本发明的重组结合蛋白能够抑制免疫系统识别靶标肽-MHC复合物的能力。在此类情况下，本发明的重组结合蛋白可以用于治疗自体免疫疾病。可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法或通过合适的T细胞激活测定来测量T细胞受体对靶标肽-MHC复合物的识别。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含多肽标签。在本发明的上下文中，多肽标签为附接到多肽/蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或靶向所述多肽/蛋白，或者其中所述氨基酸序列改善所述多肽/蛋白的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的单个多肽标签可直接或经由肽接头连接到结合蛋白的其他部分。多肽标签在本领域中是众所周知的，并且是本领域技术人员完全可用的。多肽标签的示例为小的多肽序列，例如His、HA、myc、FLAG或Strep标签；或多肽，诸如允许检测所述多肽/蛋白质的酶(例如，碱性磷酸酶)或可用于靶向的多肽(诸如，免疫球蛋白或其片段)和/或可用作效应分子的多肽。
在一个实施方案中，本发明的重组结合蛋白还包含肽接头。在本发明的上下文中，肽接头为能够连接例如两个蛋白结构域、多肽标签和蛋白结构域、蛋白结构域和非蛋白质化合物或聚合物(诸如聚乙二醇)、蛋白结构域和生物活性分子、蛋白结构域和T细胞特异性锚蛋白重复结构域、或者两个序列标签的氨基酸序列。肽接头是本领域技术人员已知的。示例的列表在专利申请WO2002/020565的说明书中提供。此类接头的具体示例为可变长度的甘氨酸-丝氨酸接头和脯氨酸-苏氨酸接头。甘氨酸-丝氨酸接头的示例为氨基酸序列GS和氨基酸序列SEQ ID NO:3，并且脯氨酸-苏氨酸接头的示例为氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的经设计的重复结构域或本发明的pMHC特异性重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的pMHC特异性重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的经设计的重复结构域的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自由SEQID NO:16至26组成的组的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自由SEQ ID NO:16至18以及20至26组成的组的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自由SEQ ID NO:17、21、22、23和26组成的组的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自由SEQ ID NO:21和23组成的组的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码氨基酸序列SEQ ID NO:17的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码氨基酸序列SEQ ID NO:21的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码氨基酸序列SEQ ID NO:22的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码氨基酸序列SEQ ID NO:23的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码氨基酸序列SEQ ID NO:26的核酸。此外，本发明涉及包含本发明的任何核酸的载体。核酸是本领域技术人员熟知的。在实施例中，使用核酸在大肠杆菌中产生本发明的经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白。
在另一个方面，本发明涉及一种包含本发明的pMHC特异性重组结合蛋白和/或本发明的核酸以及任选地药学上可接受的载剂和/或稀释剂的药物组合物。
药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并且将在下文更详细地说明。更进一步，提供了一种诊断组合物，其包含上文提到的重组结合蛋白和/或核酸(特别是本发明的重组结合蛋白)中的一者或多者。
药物组合物包含重组结合蛋白和/或核酸，优选如本文的任何方面或任何实施方案中更具体地描述的重组结合蛋白和/或核酸，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，例如，如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编辑，1980中所述。
本领域技术人员已知的合适载体、赋形剂或稳定剂包括例如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液、固定油，油酸乙酯、5％右旋糖盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其它合适载体包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含另外的活性剂，诸如抗癌剂或抗血管生成剂，或另外的生物活性化合物。
待用于体内给药的制剂必须是无菌的或经过消毒的。这很容易通过无菌过滤膜过滤实现。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种如本文所述的重组结合蛋白和洗涤剂(诸如非离子洗涤剂)、缓冲剂(诸如磷酸盐缓冲剂)，以及糖(诸如蔗糖)。在一个实施方案中，此类组合物包含如上所述的重组结合蛋白和PBS。
在另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物(优选人)中感染定位激活免疫细胞(优选T细胞)的方法，该方法包括以下步骤：向所述哺乳动物施用本发明的pMHC特异性重组结合蛋白，该pMHC特异性重组结合蛋白包含对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第一重复结构域并且任选地包含对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的第二重复结构域，并且还包含对在免疫细胞(优选T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子，其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于感染因子的蛋白。在一个实施方案中，所述感染是病毒感染。在一个实施方案中，所述第一靶标肽和/或(如果存在)所述第二靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白。在一个实施方案中，所述第一靶标肽和/或(如果存在)所述第二靶标肽来源于病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述第一靶标肽和/或(如果存在)所述第二靶标肽来源于HBcAg。在一个实施方案中，所述第一靶标肽和/或(如果存在)所述第二靶标肽具有氨基酸序列SEQ IDNO:51。在一个实施方案中，所述结合因子对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性。在一个实施方案中，所述结合因子是对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，所述结合因子是对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的经设计的重复结构域。在一个实施方案中，所述结合因子是对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域。在一个优选的实施方案中，在免疫细胞的表面上表达的所述蛋白是作为T细胞受体复合物的一部分的蛋白，诸如CD3。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复结构域和/或(如果存在)所述第二锚蛋白重复结构域是如本文的任何方面和任何实施方案中更具体地描述的经独立设计的对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
还提供了本发明的包含对在免疫细胞(优选T细胞，甚至更优选CD8+细胞毒性T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子的pMHC特异性重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物，其用于如本文所述的感染定位激活免疫细胞的方法中。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗医学病症的方法，该方法包括向对该治疗有需要的患者施用治疗有效量的本发明的pMHC特异性重组结合蛋白、本发明的核酸或者本发明的药物组合物的步骤。
还提供了本发明的pMHC特异性重组结合蛋白、核酸或药物组合物，其用于如本文所述的治疗医学病症的方法中。
在另一方面，本发明提供了一种诊断哺乳动物(优选人)中的医学病症的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使从所述哺乳动物获得的细胞或组织样品与本发明的重组结合蛋白接触；以及
(ii)检测所述结合蛋白与所述细胞或组织样品的特异性结合。在一个实施方案中，所述组织是肿瘤组织。
在本发明的上下文中，术语“医学病症”、“疾病”和“疾患”可互换使用，包括但不限于癌症、感染性疾病和自体免疫疾病。在一个优选的实施方案中，所述医学病症是癌症、感染性疾病(优选病毒感染性疾病)或自体免疫疾病。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。在一个实施方案中，这种癌症选自由以下项组成的组：上皮恶性肿瘤(原发性和转移性)，包括但不限于肺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌；血细胞恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤；肉瘤，包括但不限于骨和软组织肉瘤；以及黑素瘤。在一个优选的实施方案中，这种癌症选自由以下项组成的组：脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、滑膜肉瘤、黑素瘤和卵巢癌。在另一个最优选的实施方案中，这种癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、皮肤癌、成神经细胞瘤、软组织肉瘤、膀胱癌、睾丸癌和卵巢癌。在一个实施方案中，所述医学病症是感染性疾病，优选病毒感染性疾病。在一个优选的实施方案中，这种感染性疾病是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒感染。在另一个优选的实施方案中，这种感染性疾病是由EB病毒(EBV)引起的病毒感染。在一个实施方案中，所述医学病症是自体免疫疾病。在一个优选的实施方案中，这种自体免疫疾病选自由以下项组成的组：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和I型糖尿病。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的药物组合物、核酸或重组结合蛋白用于治疗疾病的用途。为此目的，将根据本发明的药物组合物、核酸或重组结合蛋白以治疗有效量施用给对其有需要的患者。给药可包括局部给药、口服给药和肠胃外给药。典型的给药途径是肠胃外给药。在肠胃外给药中，本发明的药物组合物将与上述药学上可接受的赋形剂联合被配制成单位剂量可注射形式，诸如溶液、混悬液或乳液。给药的剂量和模式将取决于待治疗的个体和具体疾病。
另外，考虑将上文提到的药物组合物或重组结合蛋白中的任一种用于治疗疾患。
在一个实施方案中，静脉内应用如本文所述的本发明的所述重组结合蛋白或药物组合物。对于肠胃外应用，所述重组结合蛋白或药物组合物能够以治疗有效量快速浓注或缓慢输注。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白、核酸或药物组合物的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、核酸或药物组合物用于治疗医学病症的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、核酸或药物组合物，其用于治疗医学病症。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物、重组结合蛋白或核酸作为用于治疗医学病症的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物、重组结合蛋白或核酸用于制造药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物、重组结合蛋白或核酸用于制造用于治疗医学病症的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于制造用于治疗医学病症的药物的方法，其中本发明的药物组合物、重组结合蛋白或核酸是该药物的活性成分。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用本发明的药物组合物、重组结合蛋白或核酸来治疗医学病症的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白、核酸或药物组合物用于制造用于治疗医学病症(优选感染性疾病，更优选病毒感染性疾病)的药物的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗目的的包含上文提到的经设计的锚蛋白重复结构域中的任一者的重组结合蛋白。
在一个方面，本发明涉及一种包括本发明的重组结合蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种包括编码本发明的重组结合蛋白的核酸的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种包括本发明的药物组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种包括本发明的重组结合蛋白、和/或编码本发明的重组结合蛋白的核酸、和/或本发明的药物组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其包括：重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含一个或多个本发明的肽-MHC特异性锚蛋白重复结构域，例如一个或多个独立地具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26的肽-MHC特异性锚蛋白重复结构域；和/或编码重组结合蛋白的核酸，所述重组结合蛋白包含一个或多个本发明的肽-MHC特异性锚蛋白重复结构域，例如一个或多个独立地具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26的肽-MHC特异性锚蛋白重复结构域；和/或药物组合物，所述药物组合物包含重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含一个或多个本发明的肽-MHC特异性锚蛋白重复结构域，例如一个或多个独立地具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26的肽-MHC特异性锚蛋白重复结构域。
在另一方面，本发明提供了一种靶向患有病毒感染性疾病的患者中的受感染细胞以破坏所述受感染细胞的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的本发明的结合蛋白、核酸或药物组合物的步骤，其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述结合蛋白还包含能够杀死受感染细胞的毒性因子。
还提供了本发明的重组结合蛋白、核酸或药物组合物，其用于靶向患有病毒感染性疾病的患者中的受感染细胞以破坏所述受感染细胞的方法中，其中所述第一靶标肽和/或(如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域)所述第二靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白。在一个实施方案中，所述结合蛋白还包含能够杀死受感染细胞的毒性因子。
在一个优选的实施方案中，将通过本发明的治疗方法或者通过本发明的结合蛋白、核酸或药物组合物治疗的医学病症是由乙型肝炎病毒引起的病毒感染性疾病。
本说明书涉及在所附序列表中公开的许多氨基酸序列、核酸序列和SEQ ID NO，该序列表全文以引用方式并入本文。
定义
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
在本发明的上下文中，术语“集合”是指包含至少两个不同的实体或成员的群体。优选地，这样的集合包括至少105个、更优选地超过107个并且最优选地超过109个不同的成员。“集合”也可以称为“文库”或“多个”。
术语“核酸分子”是指多核苷酸分子，其可以是单链或双链的核糖核酸(RNA)分子或脱氧核糖核酸(DNA)分子，包括DNA或RNA的经修饰形式和人造形式。核酸分子可以以分离的形式存在，或者被包含在重组核酸分子或载体中。
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指包含多肽的分子，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或多个多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则各个多肽链可非共价连接或共价连接，例如通过两个多肽之间的二硫键连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。
在重组蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”是指所述蛋白质或多肽是通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术产生的。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pQE30，QIAgen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的DNA中。如果例如将此类重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))中，则这些细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。
在本发明的上下文中，术语“结合蛋白”是指包含结合结构域的蛋白质。结合蛋白还可包含两个、三个、四个、五个或更多个结合结构域。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。更优选地，本发明的结合蛋白包含对pMHC复合物具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
此外，任何此类结合蛋白均可以包含附加多肽(诸如多肽标签、肽接头、与其他具有结合特异性的蛋白质结构域的融合、细胞因子、激素或拮抗剂)，或者本领域技术人员熟知的化学修饰(诸如偶联到聚乙二醇、毒素、小分子、抗生素等)。在一些实施方案中，该结合蛋白还包含对免疫细胞表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。在一些实施方案中，该结合蛋白还包含能够杀死肿瘤细胞和/或受感染细胞的毒性因子。毒性因子的示例包括但不限于长春碱、多柔比星、拓扑异构酶I抑制剂、卡奇霉素、倍癌霉素-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(DUBA)、吡咯并苯并二氮杂
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二聚体(PBD)和微管抑制剂家族的衍生物，诸如耳他汀和美登素，例如单甲基耳他汀E(MMAE)、单甲基耳他汀F(MMAF)、药物美登木素生物碱1(DM1)和药物美登木素生物碱4(DM4)。
术语“结合结构域”意指对靶标表现出结合特异性的蛋白质结构域。优选地，所述结合结构域是重组结合结构域。
术语“靶标”是指单独的分子，诸如核酸分子、肽、多肽或蛋白、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单独的分子的任何部分；或者两种或更多种此类分子的复合物；或者整个细胞或组织样品；或者任何非天然化合物。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化)的多肽或蛋白质。在本发明的上下文中，肽-MHC复合物以及肽-MHC呈递细胞和组织是pMHC特异性结合蛋白的靶标。此外，CD3细胞和表达CD3的细胞(诸如T细胞)是本发明的还包含对免疫细胞的表面上表达的蛋白(诸如CD3)具有结合特异性的结合因子的pMHC特异性结合蛋白的靶标。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的S-S桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
专利申请WO2002/020565和Forrer等人，2003(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.,Plückthun,A.,2003.FEBS Letters 539,2-6)包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，重复蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个或六个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含附加的非重复蛋白质结构域、多肽标签和/或肽接头。重复结构域可以是结合结构域。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端的封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。本领域从业人员根据以下各项的示例熟知此类重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性：锚蛋白重复结构域(Binz等人，J.Mol.Biol.332,489–503,2003；Binz等人，2004年，同前；WO2002/020565；WO2012/069655)、富含亮氨酸的重复结构域(WO2002/020565)、三角形四肽重复结构域(Main,E.R.,Xiong,Y.,Cocco,M.J.,D'Andrea,L.,Regan,L.,Structure11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(WO2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤连蛋白的FN3结构域)。
术语“锚蛋白重复结构域”是指包含两个或更多个连续锚蛋白重复模块作为结构单元的重复结构域，其中所述锚蛋白重复模块具有结构同源性和序列同源性。
如在经设计的重复蛋白、经设计的重复结构域等中所用，术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的性质。本发明的结合蛋白是经设计的重复蛋白，并且它们包含至少一个经设计的重复结构域。优选地，所述经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
术语“靶标相互作用残基”是指有助于与靶标直接相互作用的重复模块的氨基酸残基。
术语“框架残基”或“框架位置”是指重复模块的以下氨基酸残基：其有助于折叠拓扑结构，即有助于所述重复模块的折叠或有助于与相邻模块的相互作用。此类贡献可为与重复模块中其他残基的相互作用，或是对如α-螺旋或β-片层中存在的多肽主链构象的影响，或是参与形成直链多肽或环的氨基酸延伸。
此类框架和靶标相互作用残基可通过分析由物理化学方法(诸如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域从业者熟知的已知和相关结构信息进行比较来鉴定。
术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白家族或亚家族(优选锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。此外，包含在重复结构域中的每个重复模块可以包含从同源重复模块导出的“重复序列基序”，所述同源重复模块从靶标上选择的重复结构域获得并且具有相同的靶标特异性。
因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员熟知的。
重复模块可以包含具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中未被随机化的氨基酸残基的位置(“非随机化位置”或“固定位置”在本文中可互换使用)和具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中已被随机化的氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。非随机化位置包含框架残基。随机化位置包含靶标相互作用残基。“已被随机化”意指在重复模块的氨基酸位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸中的任一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中的大多数，诸如除半胱氨酸之外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。出于本专利申请的目的，SEQID NO:27至50的氨基酸残基3、4、6、14和15是本发明的锚蛋白重复模块的随机化位置。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复模块导出的氨基酸序列。优选地，所述重复模块来自对相同靶标具有结合特异性的重复结构域。此类重复序列基序包含框架残基位置和靶标相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复模块的框架残基位置。同样，所述靶标相互作用残基位置对应于重复模块的靶标相互作用残基的位置。重复序列基序包含非随机化位置和随机化位置。
术语“重复单元”是指包含一种或多种天然存在的蛋白质的序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在于多个拷贝中，并且表现出确定蛋白质折叠的所有所述基序共有的限定的折叠拓扑结构。此类重复单元的示例包括富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、犰狳重复单元、三十四肽重复单元、HEAT重复单元和富含亮氨酸的变体重复单元。
术语“结合特异性”、“对靶标具有结合特异性”、“特异性地结合到靶标”、“以高特异性结合到靶标”、“特异于靶标”或“靶标特异性”等意指，结合蛋白或结合结构域在PBS中以比其结合到不相关蛋白(诸如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP))更低的解离常数结合(即，其以更高的亲和力结合)到靶标。优选地，在PBS中对靶标的解离常数(“KD”)为至少102；更优选地，至少103；更优选地，至少104；或更优选地，比对MBP的对应解离常数低至少105倍。确定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，诸如基于表面等离子共振(SPR)的技术(例如，SPR均衡分析)或等温滴定量热法(ITC)是本领域技术人员熟知的。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下进行测量，则具体蛋白质-蛋白质相互作用的测量KD值可以是变化的。因此，优选地利用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(诸如，PBS)来进行KD值的测量。通过表面等离子体共振(SPR)分析进行的对pMHC具有结合特异性的本发明重组结合蛋白的解离常数(KD)的典型和优选的确定描述于实施例2中。
术语“约”意指所提及的值+/-20％；例如，“约50”应意指40至60。
术语“PBS”意指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
主要组织相容性复合物(MHC)是一组基因，其编码在细胞表面上发现的帮助免疫系统识别外来物质的蛋白。由主要组织相容性复合物编码的蛋白或此类蛋白的复合物被称为“MHC蛋白”或“MHC分子”。MHC蛋白存在于所有高等脊椎动物中。最值得注意的是将肽呈递给免疫细胞受体(诸如T细胞受体)的MHC I类和II类糖蛋白。在人类中，主要组织相容性复合物也被称为人白细胞抗原(HLA)系统。
如本文所用，术语“MHC”是指主要组织相容性复合物，优选哺乳动物的主要组织相容性复合物，甚至更优选人的主要组织相容性复合物。如本文所用，术语“HLA”是指人白细胞抗原系统。MHC分子展示肽并将其呈递给脊椎动物的免疫系统。术语“肽抗原”和“MHC肽抗原”在本文中可互换使用，并且是指可以结合在MHC分子的肽结合槽中的MHC配体。肽抗原通常具有经由肽键连接的介于8个至25个之间的氨基酸。MHC肽抗原可以是自身肽或非自身肽。该肽抗原通常可以通过MHC分子呈递给免疫系统。MHC I类分子通常将该肽抗原呈递给CD8阳性T细胞，而MHC II类分子通常将该肽抗原呈递给CD4阳性T细胞。在本发明的上下文中，被本发明的结合蛋白特异性结合的肽抗原(当该肽抗原结合到MHC分子时)也被称为“靶标肽”。因此，术语“肽-MHC复合物”、“pMHC复合物”、“肽-MHC”和“pMHC”在本申请中可互换使用，并且是指通过肽抗原与MHC分子结合而形成的复合物。优选地，MHC分子是MHC I类分子。还优选地，肽是来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽、来源于感染因子(例如病毒感染因子)的蛋白的肽，或者来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。在一个优选的实施方案中，在肿瘤细胞中表达的所述蛋白是肿瘤特异性蛋白。
术语“肿瘤特异性蛋白”意指在肿瘤细胞中表达并且在许多或所有非肿瘤发生组织中不表达或仅以较低水平表达、或者除在肿瘤组织中表达之外仅还在有限数量的非肿瘤发生组织中表达的蛋白。优选地，肿瘤特异性蛋白具有引发癌症特异性免疫应答的能力。肿瘤特异性蛋白的示例是本领域技术人员已知的，包括但不限于MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、NY-ESO-1、PRAME、CT83、SSX2等。
在一个优选的实施方案中，所述感染因子的蛋白或者所述在受感染细胞中表达的蛋白是病毒特异性蛋白。
术语“病毒特异性蛋白”意指在病毒感染的细胞中从病毒基因组表达而在未感染的宿主细胞中不表达的蛋白。病毒特异性蛋白的示例是本领域技术人员已知的，包括但不限于EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2、NSP1、NSP2、NSP4、NSP5、NSP6、E1、E2、HBx、HBsAg、HBcAg等。与自体免疫疾患相关联的蛋白的示例是本领域技术人员已知的，包括但不限于羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、胰岛素、β-抑制蛋白、水通道蛋白-4、瓜氨酸化蛋白等。
“靶标肽-MHC复合物”是指肽-MHC复合物，其中肽抗原是靶标肽。
更优选地，肽抗原来源于感染因子的蛋白，甚至更优选地来源于病毒感染因子的蛋白。甚至更优选地，病毒感染因子是乙型肝炎病毒(HBV)。最优选地，所述HBV蛋白是病毒特异性蛋白。
最优选地，肽抗原来源于乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。优选地，来源于HBcAg的肽抗原是HBV核心抗原的序列18-27，在本文中缩写为“HBVc18”或“c18肽”，并且具有氨基酸序列FLPSDFFPSV(SEQ ID NO:51)。
如在“来源于肿瘤特异性蛋白的肽”、“来源于细胞内蛋白的肽”、“来源于感染因子的蛋白的肽”、“来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽”等中所使用的术语“来源于…的肽”是指相应蛋白的分子部分或肽片段。这种肽片段可以由正常蛋白或致病蛋白的降解产生，以便与细胞表面上的MHC分子缔合而被呈递(即展示)，以便被某些淋巴细胞(诸如T细胞)识别。所呈递的肽可以是自身肽或非自身肽，并且生物体的免疫系统通常可以区分自身肽与非自身肽，从而阻止生物体的免疫系统靶向其自身的细胞。替代性地，这种肽片段可以通过本领域已知的方法产生。优选地，肽来源于细胞内蛋白。
术语“结合因子”是指能够特异性地结合靶标分子的任何分子，包括例如抗体、抗体片段、适体、肽(例如，Williams等人，J Biol Chem266:5182-5190(1991))、抗体模拟物、重复蛋白(例如，经设计的锚蛋白重复蛋白)、受体蛋白和靶标分子的任何其他天然存在的相互作用配偶体，并且可以包括天然蛋白和经修饰或经遗传工程化(例如以包括非天然残基和/或以缺少天然残基)的蛋白。
结合结构域的术语“负选择”或“反选择”意指从结合结构域的集合中选择性去除不适合或较不适合本发明目的的结合结构域。在本发明的上下文中，负选择或反选择优选地意指从经设计的重复结构域的集合中选择性去除对肽-MHC复合物而非靶标肽-MHC复合物具有结合特异性或者对不同pMHC复合物的共同HLA-A支架具有结合特异性的不需要的经设计的重复结构域。用于负选择或反选择集合中不需要的成员(诸如结合结构域集合中不需要的结合结构域)的方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“肽-MHC呈递细胞”是指能够在细胞表面上表达或展示肽-MHC的任何细胞。这包括但不限于肿瘤细胞、受感染细胞、与自体免疫疾患相关联的细胞、经典的抗原呈递细胞(诸如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)，以及已被制备用于展示结合到外源施用肽的MHC分子的细胞(诸如经肽脉冲处理的T2细胞)。
如本文所用，术语“表达CD3的细胞”是指在细胞表面上表达CD3(分化簇3)的任何细胞，包括但不限于T细胞诸如细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)和T辅助细胞(CD4+T细胞)。
术语“T细胞的肿瘤定位激活”意指与非肿瘤组织相比，T细胞优先在肿瘤组织中被激活。
术语“T细胞的感染定位激活”意指与未感染组织相比，T细胞优先在受感染组织中被激活。
术语“医学病症”(或“疾患”或“疾病”)包括但不限于自体免疫疾患、炎性疾患、视网膜病变(特别是增殖性视网膜病变)、神经退行性疾患、感染性疾病、代谢疾病和肿瘤性疾病。本文所述的重组结合蛋白中的任一种可以用于制备用于治疗这种疾患，特别是选自由以下项组成的组的疾患的药物：自体免疫疾患、炎性疾患、免疫疾患、感染性疾病(例如病毒性或细菌性感染性疾病)和肿瘤性疾病。“医学病症”可能是以不适当的细胞增殖为特征的病症。医学病症可能是过度增生病症。本发明具体涉及一种治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白或药物组合物的步骤。在一个优选的实施方案中，所述医学病症是肿瘤性疾病。如本文所用，术语“肿瘤性疾病”是指以细胞生长或肿瘤快速增殖为特征的细胞或组织的异常状态或病症。在一个实施方案中，所述医学病症是恶性肿瘤性疾病。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。在另一个优选的实施方案中，所述医学病症是感染性疾病。在另一个优选的实施方案中，所述医学病症是自体免疫疾病。术语“治疗有效量”是指足以对患者产生期望效应的量。
术语“抗体”不仅意指完整的抗体分子，而且意指保留免疫原结合能力的抗体分子的任何片段和变体。此类片段和变体也是本领域熟知的，并且经常在体外和体内使用。因此，术语“抗体”涵盖完整免疫球蛋白分子、抗体片段(诸如Fab、Fab’、F(ab')2和单链V区片段(scFv))、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合多肽和非常规抗体。
术语“癌症”和“癌性”在本文中用来指或描述哺乳动物中通常以未受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症涵盖实体瘤和液体瘤，以及原发性肿瘤和转移。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。实体瘤通常还包含肿瘤基质。癌症的示例包括但不限于原发性和转移性癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、骨髓瘤、黑素瘤和白血病，以及任何其他上皮和血细胞恶性肿瘤。此类癌症的更具体的示例包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌，卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、恶性黑素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、上皮癌、鳞状细胞癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)、三阴性乳腺癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、慢性髓细胞性白血病(CML)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤、成神经细胞瘤或滑膜肉瘤。
术语“治疗有效量”是指足以在受试者中诱导期望的生物学结果、药理学结果或治疗结果的量。在本发明的上下文中，治疗有效量意指以适用于任何医学治疗的合理的效/险比治疗或预防疾病或疾患的结合蛋白的足够的量。
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施。需要治疗的那些患者包括已经患有疾患的那些患者，以及要预防疾患的那些患者。
用于治疗目的的术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、非人灵长类动物，以及动物园动物、运动型动物或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。术语“自体免疫疾病”和“自体免疫疾患”在本文中用于指代或描述以下疾患：其中哺乳动物的免疫系统针对哺乳动物的自身组织或者本质上对哺乳动物无害的抗原产生体液或细胞免疫应答，从而在这种哺乳动物中产生组织损伤。自体免疫疾患的示例有许多，包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和I型糖尿病。自体免疫疾病还包括急性肾小球肾炎、阿狄森氏病、成年发作型特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、全秃、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、强直性脊柱炎、自体免疫再生障碍性贫血、自体免疫溶血性贫血、白塞氏病、乳糜泻、慢性活动性肝炎、CREST综合征、克隆氏病、皮肌炎、扩张性心肌病、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、巨细胞动脉炎、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯氏病、吉兰-巴雷综合征、血色素沉着病、亨-舍二氏紫癜、特发性IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、幼年型类风湿性关节炎、兰伯特-伊顿综合征、线性IgA皮肤病、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、心肌炎、发作性嗜睡症、坏死性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病综合征、类天疱疮、天疱疮、多肌炎、原发性硬化性胆管炎、银屑病、急进性肾小球肾炎(RPGN)、瑞特综合征、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、甲状腺炎和溃疡性结肠炎。
术语“感染性疾病”和“感染”在本文中用于指代或描述微生物在身体组织中的侵入和增殖，尤其是引起病理症状。感染性疾病的示例包括但不限于病毒性疾病和细菌性疾病，诸如HIV感染、西尼罗河病毒感染，甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎，天花、结核病、水疱性口炎病毒(VSV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、SARS、流感、埃博拉病毒、病毒性脑膜炎、疱疹、炭疽、莱姆病和大肠杆菌感染，等等。
实施例
下文公开的起始材料和试剂是本领域技术人员已知的，是可商购获得的和/或可使用熟知的技术制备。
材料
化学品购自Sigma-Aldrich(USA)。寡核苷酸得自Microsynth(Switzerland)。除非另有说明，否则DNA聚合酶、限制酶和缓冲液得自New England Biolabs(USA)或Fermentas/Thermo Fisher Scientific(USA)。诱导型大肠杆菌表达菌株用于克隆和蛋白质生产，例如大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，USA)或BL21(Novagen，USA)。
分子生物学
除非另有说明，否则根据已知方案执行方法(参见例如Sambrook J.、FritschE.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)。
经设计的锚蛋白重复蛋白文库
用于生成经设计的锚蛋白重复蛋白文库的方法已经描述于下列文献中：例如，美国专利号7,417,130；Binz等人，2003年，同前；Binz等人，2004年，同前。通过此类方法，可构建具有随机化锚蛋白重复模块和/或随机化封端模块的经设计的锚蛋白重复蛋白文库。例如，此类文库可以因此基于固定的N-末端封端模块(例如N-末端封端模块SEQ ID NO:5、6或7)或根据SEQ ID NO:8的随机化N-末端封端模块、根据序列基序SEQ ID NO:9、10或11的一个或多个随机化重复模块以及固定的C-末端封端模块(例如C-末端封端模块SEQ ID NO:12、13或14)或根据SEQ ID NO:15的随机化C-末端封端模块进行组装。优选地，此类文库被组装成在重复或封端模块的随机化位置处不具有氨基酸C、G、M、N(在G残基前面)和P中的任一者。此外，根据序列基序SEQ ID NO:9、10或11的随机化重复模块可以在位置10和/或位置17处进一步随机化；根据序列基序SEQ ID NO:8的随机化N-末端封端模块可以在位置7和/或位置9处进一步随机化；并且根据序列基序SEQ ID NO:15的随机化C-末端封端模块可以在位置10、11和/或17处进一步随机化。
此外，此类文库中的此类随机化模块可包含具有随机化氨基酸位置的附加的多肽环插入。此类多肽环插入的示例是抗体的互补决定区(CDR)环文库或从头生成的肽文库。例如，可使用人核糖核酸酶L的N-末端锚蛋白重复结构域的结构(anaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为指导来设计此类环插入。类似于其中将十个氨基酸插入在靠近两个锚蛋白重复的边界存在的β-转角中的这种锚蛋白重复结构域，锚蛋白重复蛋白文库可以包含插入在锚蛋白重复结构域的一个或多个β-转角中的可变长度(例如，1个至20个氨基酸)的随机化环(具有固定位置和随机化位置)。
锚蛋白重复蛋白文库的任何这种N-末端封端模块优选地具有RELLKA、RILLKA或RILLAA基序(例如，存在于SEQ ID NO:16中的位置21至26)，并且锚蛋白重复蛋白文库的任何这种C-末端封端模块优选地具有KLN、KLA或KAA基序(例如，存在于SEQ ID NO:16中的最后三个氨基酸处)。
此类锚蛋白重复蛋白文库的设计可由与靶标相互作用的锚蛋白重复结构域的已知结构来指导。由其蛋白质数据库(PDB)唯一登录号或识别码(PDB-ID)识别的此类结构的示例为1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
已经描述了经设计的锚蛋白重复蛋白文库(诸如N2C和N3C经设计的锚蛋白重复蛋白文库)的示例(美国专利号7,417,130；Binz等人，2003年，同前；Binz等人，2004年，同前)。N2C和N3C中的数字描述了存在于N-末端和C-末端封端模块之间的随机化重复模块的数量。
用于定义重复单元和模块内部的位置的命名法基于Binz等人，2004(同前)，修改之处在于，锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界移位一个氨基酸位置。例如，Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置1对应于本公开的锚蛋白重复模块的位置2，因而Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置33对应于本公开的以下锚蛋白重复模块的位置1。
通过Sanger测序法确认所有DNA序列。
实施例1：选择包含对HBVc18肽-MHC复合物(HBVc18pMHC)具有结合特异性的锚蛋 白重复结构域的结合蛋白
概述
使用核糖体展示技术(Hanes,J.和Plückthun,A.，PNAS 94,4937-42,1997)，以类似于Binz等人，2004(同前)描述的方式从
Figure BDA0003747473990000682
文库中选择对HBVc18肽-MHC复合物(HBVc18pMHC)具有结合特异性的多个锚蛋白重复结构域，具体条件和附加的反选择步骤如下所述。通过大肠杆菌粗提物均相时间分辨荧光(HTRF)评估所选择的克隆对重组HBVc18pMHC和其他pMHC复合物的结合和特异性，表明成功选择了多种HBVc18pMHC特异性结合蛋白。例如，锚蛋白重复结构域SEQ ID NO:16至26构成所选择的结合蛋白的氨基酸序列，所述结合蛋白包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。来自此类对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的单独锚蛋白重复模块以例如SEQ IDNO:27至50提供。
生产生物素酰化pMHC复合物作为靶标和选择材料
根据已确立的方案(Garboczi等人，1992；Celie等人，2009)生产HLA-A*0201(SEQID NO:69)、人β2-微球蛋白(hβ2m；SEQ ID NO:70)和表1中列出的肽之一的生物素酰化三联体复合物。
表1：用于生成pMHC复合物以选择和筛选经设计的锚蛋白重复蛋白的肽
Figure BDA0003747473990000681
Figure BDA0003747473990000691
与HBVc18肽同源的氨基酸用下划线标出。
实验中使用的所有pMHC复合物均进行先前的质量控制测试。
通过核糖体展示技术选择HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复蛋白
pMHC特异性锚蛋白重复蛋白的选择使用HBVc18pMHC复合物(作为靶标)、如上所述的锚蛋白重复蛋白文库和已建立的方案(参见例如Zahnd,C.、Amstutz,P.和Plückthun,A.，Nat.Methods 4,69-79,2007)通过核糖体展示技术(Hanes和Plückthun，同前)进行。每轮选择后，逆转录(RT)-PCR循环数不断减少，从而由于结合物的富集而调整收率。前四轮或前五轮选择采用标准核糖体展示选择，使用降低靶标浓度和增加洗涤严格性来增加从第1轮到第4轮的选择压力(Binz等人，2004年，同前)。如下所述，将不寻常的反选择步骤结合到该选择策略中。
在多轮核糖体展示期间，结合了反选择(或负选择)步骤，其中将三元复合物与含有另一种肽的相应同种型HLA分子一起预温育，然后仅转移到靶标HBVc18pMHC复合物中，以便将锚蛋白重复蛋白的结合导向嵌入肽表位并远离共同的HLA-A支架。换句话讲，进行反选择(或负选择)是为了反选择主要结合到pMHC复合物的共同HLA-A支架而不是结合到由嵌入肽提供的特定表位的锚蛋白重复蛋白。此外，还对与由用于反选择的嵌入肽提供的表位交叉反应的锚蛋白重复蛋白进行反选择。此处，将肽HBe183(FLLTRILTI)、HBe183mut(FLLRILTI)、EBNA-1(FMVFLQTHI)和NY-ESO-1(SLLMWITQV)用于反选择。
详细地讲，用100μl 66nM中性亲和素的PBS溶液包被Nunc MaxiSorp板，并且在4℃下温育过夜。第二天，在反选择步骤之前，用每孔300μl PBST将MaxiSorp 96孔微板洗涤三次，然后用300μl PBST-BSA在4℃下以700rpm旋转阻断1小时。在将孔排空后，将100μl的50nM生物素酰化pMHC反选择靶标的PBST-BSA溶液添加到每个孔中，在4℃下以700rpm旋转1小时。在该温育步骤期间，进行mRNA体外翻译。在翻译和生成三元复合物混合物之后不久，弃去pMHC-PBST-BSA溶液，用300μl PBST将Nunc MaxiSorp微板孔洗涤三次，最后与WBT-BSA一起温育。对于实际的反选择步骤，弃去WBT-BSA溶液，随后将翻译的三元复合物的100μl(对于第2至第5轮选择分别为该体积，对于第一轮选择为150μl)等分试样分三次转移，以制备容纳固定的反选择pMHC靶标的Nunc MaxiSorp孔，并且在这三个孔中的每个孔中在4℃下温育20分钟。在反选择过程结束时，将每个选择池的100μl三元复合物等分试样再次合并，并且将相应体积带入实际靶标的选择中。
在第4轮和第5轮核糖体展示选择之后，将所述池与BamHI和PstI一起克隆到细菌表达载体中，然后转化到大肠杆菌XL-1Blue中，并铺板在LB/Glu/Amp琼脂平板上。
如通过粗提物HTRF所确定的(数据未显示)，选择的克隆特异性地结合到HBVc18pMHC复合物。
此外，用常规层析方法将蛋白纯化。
实施例2：通过表面等离子体共振(SPR)分析确定对HBVc18pMHC具有结合特异性的 锚蛋白重复蛋白的解离常数(KD)
为了测试对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域以免疫细胞接合剂形式起作用并且以该形式结合到HBVc18pMHC的能力，使用常规克隆方法将选择的锚蛋白重复结构域遗传连接到对免疫细胞表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。通过该过程，生成了包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域并且还包含对CD3具有结合特异性的结合因子的结合蛋白。用常规层析方法将这些蛋白纯化。
使用ProteOn表面等离子体共振(SPR)仪器(BioRad)分析经纯化的锚蛋白重复蛋白对HBVc18pMHC靶标的结合亲和力，并且根据本领域技术人员已知的标准程序进行测量。
简言之，将生物素酰化的HBVc18pMHC稀释在PBST(PBS，pH 7.4，含有0.005％
Figure BDA0003747473990000701
)中，并且在NLC芯片(BioRad)上包被至约1000个共振单位(RU)的水平。然后通过以下方式来测量锚蛋白重复蛋白与pMHC复合物的相互作用：注射含有锚蛋白重复蛋白的系列稀释液的150μl运行缓冲液(PBS，pH 7.4，含有0.005％
Figure BDA0003747473990000711
)，所述系列稀释液覆盖介于1.2nM与100nM之间、介于2.5nM与200nM之间或者介于6.2nM与500nM之间的浓度范围，用于多迹线SPR测量(结合率测量)，随后以100μl/min的恒定流速注射运行缓冲液流至少60分钟(解离率测量)。未进行靶标再生。从注射锚蛋白重复蛋白后获得的共振单位(RU)迹线中减去点间的信号(即RU值)。基于从结合率测量和解离率测量获得的SPR迹线，测定相应锚蛋白重复蛋白相对于pMHC复合物的结合率和解离率。
作为代表性示例，图1A至图1J示出了
Figure BDA0003747473990000712
蛋白#16至#18和#20至#26分别结合到HBVc18pMHC所获得的SPR迹线。
使用本领域技术人员已知的标准程序，由估计的结合率和解离率计算解离常数(KD)。选择的锚蛋白重复蛋白与HBVc18pMHC的结合相互作用的KD值被确定为在低纳摩尔范围内或为更低的值。这些选择的锚蛋白重复蛋白中没有一个显示出可测量的与对照肽的结合相互作用。表2提供了作为示例的一些选择的锚蛋白重复蛋白的KD值。
表2
Figure BDA0003747473990000713
这些实验数据证明，已经使用如实施例1中所述的筛选和选择过程生成了对特异性pMHC复合物(即HBVc18pMHC复合物)具有高结合亲和力和特异性的经设计的锚蛋白重复蛋白。
实施例3：使用经脉冲处理的T2细胞，通过包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚 蛋白重复结构域的结合蛋白实现T细胞激活
为了测试对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域以免疫细胞接合剂形式起作用的能力，使用常规克隆方法将选择的锚蛋白重复结构域遗传连接到对免疫细胞表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。通过该过程，生成了包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域并且还包含对CD3具有结合特异性的结合因子的结合蛋白。
在T细胞激活测定中分析了T细胞接合剂(TCE)形式的HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复结构域在结合到HBVc18pMHC展示靶标细胞时激活T细胞的能力。
将用HBVc18肽脉冲处理的T2细胞用作HBVc18pMHC展示靶标细胞。效应细胞是BK112 T细胞，其为从健康供体扩增的单克隆CD8+T细胞(Levitsky等人，J.Immunol.161:594-601(1998))。对于T细胞激活测定，将T2细胞在37℃下用10μM肽脉冲处理过夜。在不同浓度(例如1pM)的TCE
Figure BDA0003747473990000721
蛋白的存在下，以1:5的效应细胞与靶标细胞比率添加效应BK112 T细胞，并且在37℃下温育4小时至5小时。然后通过荧光激活细胞分选(FACS)测定CD8+T细胞中的细胞内IFN-γ，作为T细胞激活的量度。用于FACS的试剂包括APC小鼠抗人IFN-γ和来自BD Biosciences的Pacific BlueTM小鼠抗人CD8。
图2A至图2J示出了在该T细胞激活测定中测试一组TCE形式的不同HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复结构域(以1pM、100pM和10,000pM的浓度)的结果。TCE形式的HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复结构域为(对应于图2中的附图编号)：(A)TCE
Figure BDA0003747473990000722
蛋白#16、(B)TCE
Figure BDA0003747473990000723
蛋白#17、(C)TCE
Figure BDA0003747473990000724
蛋白#18、(D)TCE
Figure BDA0003747473990000725
蛋白#20、(E)TCE
Figure BDA0003747473990000726
蛋白#21、(F)TCE
Figure BDA0003747473990000727
蛋白#22、(G)TCE
Figure BDA0003747473990000728
蛋白#23、(H)TCE
Figure BDA0003747473990000729
蛋白#24、(I)TCE
Figure BDA00037474739900007210
蛋白#25和(J)TCE
Figure BDA00037474739900007211
蛋白#26。作为对照，还使用了未经脉冲处理的T2细胞和仅T细胞(HLA-A*02+)进行实验。温育4小时之后，通过FACS确定T细胞中的细胞内IFN-γ。
所有10种TCE
Figure BDA0003747473990000731
蛋白在经脉冲处理的T2细胞中存在靶标肽-MHC复合物的情况下均特异性地介导T细胞激活，但在未经脉冲处理的T2细胞中不存在靶标肽-MHC复合物或在仅存在T细胞的情况下没有(或以低得多的水平)特异性地介导T细胞激活。所有这些TCE形式的HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复结构域在经脉冲处理的T2细胞存在下实现的效应T细胞激活相比未经脉冲处理的T2细胞为其至少100倍。因此，所有这些TCE形式的HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复结构域均能够特异性地激活效应T细胞，这取决于HBVc18pMHC展示靶标细胞的存在。
实施例4：通过丙氨酸扫描诱变分析包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白 重复结构域的结合蛋白对靶标肽的结合特异性
为了分析对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域与HBVc18pMHC靶标之间的特异性相互作用，进行丙氨酸扫描诱变。为此目的，在T细胞激活测定中测试了HBVc18(HBV核心抗原蛋白18至27)(SEQ ID NO:51)肽及其一系列变体，在这些变体的每一者中，该HBVc18肽的一个氨基酸被丙氨酸替代。该测定使用经脉冲处理的T2细胞作为靶标细胞，并且使用BK112 T细胞作为效应细胞，基本上如实施例3中所述。如果HBVc18肽中的氨基酸残基对于对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域与HBVc18pMHC靶标之间的结合相互作用很重要，则如果该氨基酸残基被丙氨酸替代，则将观察到T细胞激活减少或观察不到T细胞激活。
从Genscript获得丙氨酸突变肽，它们具有以下序列：ALPSDFFPSV(SEQ ID NO:61；位置1处的F变为A)、FLASDFFPSV(SEQ ID NO:62；位置3处的P变为A)、FLPADFFPSV(SEQ IDNO:63；位置4处的S变为A)、FLPSAFFPSV(SEQ ID NO:64；位置5处的D变为A)、FLPSDAFPSV(SEQ ID NO:65；位置6处的F变为A)、FLPSDFAPSV(SEQ ID NO:66；位置7处的F变为A)、FLPSDFFASV(SEQ ID NO:67；位置8处的P变为A)和FLPSDFFPAV(SEQ ID NO:68；位置9处的S变为A)。用HBVc18肽和每种突变肽(10μM)对T2细胞进行脉冲处理。在TCE
Figure BDA0003747473990000732
蛋白存在下，将经脉冲处理的T2细胞与效应BK112 T细胞以1:5的效应细胞与靶标细胞比率一起温育。
丙氨酸扫描诱变分析显示哪些肽残基对于TCE
Figure BDA0003747473990000741
蛋白与HBVc18pMHC靶标之间的结合相互作用很重要(图3A至图3J)。这些数据证明，在每种情况下，至少2个肽残基对于该结合相互作用很重要，从而当突变为丙氨酸时，与HBVc18肽相比导致T细胞激活降低至少50％。令人惊讶的是，在一些情况下，具有至少4个肽残基时的相互作用对于锚蛋白重复结构域与靶标肽-MHC复合物的结合很重要，即，与野生型肽相比，这些肽残基突变为丙氨酸导致T细胞激活降低至少50％。作为一个示例，对于
Figure BDA0003747473990000742
蛋白#23，HBVc18靶标肽的至少位置5、6、7和8对于导致T细胞激活的功能性结合相互作用很重要(图3G)。作为另一个示例，对于
Figure BDA0003747473990000743
蛋白#21，HBVc18靶标肽的至少位置5、6、7和8对于导致T细胞激活的功能性结合相互作用很重要(图3E)。作为另一个示例，对于
Figure BDA0003747473990000744
蛋白#22，HBVc18靶标肽的至少位置3、6、7和8对于导致T细胞激活的功能性结合相互作用很重要(图3F)。
总而言之，这些数据表明，要获得包含对HBVc18pMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的结合蛋白与HBVc18靶标肽之间的特异性相互作用，重要的是存在数量大得惊人的肽残基。该发现可以反映由经设计的锚蛋白重复结构域形成的结合表面与由其他结合蛋白(诸如抗体和T细胞受体(TCR))形成的结合表面之间的结构差异。
实施例5：接头长度对通过包含对NYESOpMHC具有结合特异性的锚蛋白重复结构域 的结合蛋白实现的免疫细胞激活的影响
为了测试T细胞接合剂(TCE)形式的本发明结合蛋白中的pMHC特异性结合结构域与CD3特异性结合因子之间的接头的长度对TCE形式的此类结合蛋白的效力的影响，在T细胞激活测定中使用不同的肿瘤细胞系测试了包含用不同长度的接头连接到CD3结合结构域的NYESOpMHC结合结构域的不同构建体。
接头长度设计与缩写
生成了TCE形式的以下结合蛋白，其包含
Figure BDA0003747473990000746
蛋白#78(SEQ ID NO:78)或
Figure BDA0003747473990000745
蛋白#79(SEQ ID NO:79)作为NYESOpMHC特异性结合结构域：
表3：TCE结合蛋白和使用的接头
Figure BDA0003747473990000751
表4：在表3的结合蛋白中测试的接头的概述
Figure BDA0003747473990000752
T细胞激活测定中TCE形式的结合蛋白的效力和特异性
在T细胞激活测定中使用不同的肿瘤细胞系测试了用不同接头生成的TCE形式的结合蛋白的效力和特异性。一些肿瘤细胞系(IM9和U266B1)内源性地表达NY-ESO-1并且在它们的细胞表面上以pMHC复合物的形式呈递NY-ESO-1靶标肽。其他肿瘤细胞系(MCF7和Colo205)不表达NY-ESO-1，因此不在其细胞表面上以pMHC复合物的形式呈递NY-ESO-1靶标肽。
通过本领域已知的方法进行T细胞激活测定。简言之，将靶标肿瘤细胞与效应PBMC以5:1的效应细胞与靶标细胞比率组合，以不同浓度添加TCE形式的NYESOpMHC特异性锚蛋白重复结构域(参见表3中的构建体)，并且将混合物在37℃下温育48小时。通过FACS(使用CD25单克隆抗体(BC96)，PerCP-Cyanine5.5，eBioscienceTM；和来自BD Biosciences的Alexa
Figure BDA0003747473990000761
488小鼠抗人CD8)确定CD8+T细胞上的激活标记物CD25的水平。使用内源性地表达HLA-A2和NY-ESO-1并且在其表面上展示NYESOpMHC的肿瘤细胞系(IM9)以及表达HLA-A2但不表达NY-ESO-1并且在其表面上不展示NYESOpMHC的肿瘤细胞系(MCF-7)来比较免疫细胞激活。将从供体分离的PBMC用作效应细胞。还使用内源性地表达HLA-A2和NY-ESO-1并且在其表面上展示NYESOpMHC的另一种肿瘤细胞系(U266B1)以及表达HLA-A2但不表达NY-ESO-1并且在其表面上不展示NYESOpMHC的另一种肿瘤细胞系(Colo205)进行了类似的T细胞激活测定。作为对照，对效应PBMC进行相同的处理，不同的是不添加靶标细胞。
在结合蛋白的存在下获得的T细胞激活水平示于图4至图7中。随着接头长度缩短，观察到增强的效力。对于用最短接头(XXS)设计的构建体观察到最高的效力，用第二最短接头(XS)设计的构建体的效力与用较长接头设计的构建体相比也显著增强。对于所测试的任何细胞系，均未观察到非特异性激活水平的增加。
从图4所示数据获得的EC50值列于下表5中。
表5：从图4所示数据获得的EC50值
Figure BDA0003747473990000762
从图5所示数据获得的EC50值列于下表6中。
表6：从图5所示数据获得的EC50值
Figure BDA0003747473990000763
Figure BDA0003747473990000771
从图6所示数据获得的EC50值列于下表7中。
表7：从图6所示数据获得的EC50值
Figure BDA0003747473990000772
从图7所示数据获得的EC50值列于下表8中。
表8：从图7所示数据获得的EC50值
Figure BDA0003747473990000773
从数据可以得出结论，对于TCE形式的pMHC特异性结合结构域，优选使用至少与L接头一样短、更优选至少与标准接头一样短、更优选至少与S接头一样短、更优选至少与XS接头一样短、更优选至少与XXS接头一样短并且最优选与XXS接头一样短或大约一样短的接头。在该实施例中提供的特定接头是具有优选长度的此类接头的示例。
在用本发明的TCE形式的HBVc18pMHC和HBVc18pMHC特异性锚蛋白重复结构域(TCE结合蛋白)进行的类似实验中，观察到接头长度的类似作用。
序列表
<110> 分子合作伙伴股份公司(Molecular Partners AG)
<120> 重组肽-MHC复合物结合蛋白及其生成和用途
<130> AC2401 PCT S3
<150> EP19 21 5436.7
<151> 2019-12-11
<160> 79
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头
<400> 1
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头
<400> 2
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Pro Thr Pro Thr Pro Thr
20
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 共有GS连接基
<220>
<221> 变体
<222> 1..5
<223> [Gly-Gly-Gly-Ser]n，其中n为1、2、3、4、5或6
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> His-标签
<400> 4
Met Arg Gly Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N-封端
<400> 5
Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N-封端
<400> 6
Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N-封端
<400> 7
Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N-封端 （随机）
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 8
Gly Ser Asp Leu Gly Xaa Lys Leu Leu Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 随机化重复模块
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 27
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 9
Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 10
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 随机化重复模块
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 10
Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 随机化重复模块
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 11
Lys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Xaa Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 12
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C-封端
<400> 12
Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Asn Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 13
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C-封端
<400> 13
Gln Asp Gln Phe Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 14
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C-封端
<400> 14
Gln Asp Tyr Thr Gly His Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu Ile Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
20 25
<210> 15
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C-封端（随机）
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa can be any naturally occurding amino acid
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa can be any naturally occurding amino acid
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa can be any naturally occurding amino acid
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa can be any naturally occurding amino acid
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa can be any naturally occurding amino acid
<400> 15
Gln Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn
20 25
<210> 16
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 16
Gly Ser Asp Leu Gly His Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ser Ala Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr
100 105 110
Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 17
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 17
Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ile Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Ser Gly His Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Asp Val Asn Ala
50 55 60
Lys Asp His Arg Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Ile Gly
65 70 75 80
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
85 90 95
Ala Gln Asp Asn Trp Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Trp Trp
100 105 110
Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 18
Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Gln Phe Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala
100 105 110
Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 19
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 19
Gly Ser Asp Leu Gly Tyr Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Trp Leu Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp His Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ile Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Ser Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Trp
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Thr Thr Gly Asn Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala His
100 105 110
Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 20
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 20
Gly Ser Asp Leu Gly Phe Lys Leu Leu Glu Ala Ala Leu Glu Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr
100 105 110
Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 21
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 21
Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Asn Phe Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Gln Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Trp Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Val Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Phe
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Val Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Tyr Thr Gly His Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Ile Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 22
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 22
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Ser Ala Ala Gln Ser Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Gly Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Lys Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Lys Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Glu Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Lys Asp Lys Lys Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Val Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Val Ala Asp
115 120 125
Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala
130 135 140
Arg Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 23
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 23
Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Thr Ala Ala Ile Val Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Gln Phe Gly Ile Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Ala
100 105 110
Val Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 24
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 24
Gly Ser Asp Leu Gly Trp Lys Leu Leu His Ala Ala Thr Thr Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr
100 105 110
Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 25
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 25
Gly Ser Asp Leu Gly Ser Lys Leu Leu Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gln
1 5 10 15
Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Thr
100 105 110
Phe Gly His Glu Asp Ile Ala Val Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120 125
<210> 26
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对HBVc18 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 26
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln
1 5 10 15
Leu Asp Glu Val His Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
20 25 30
Lys Asp Gln His Gly Lys Thr Pro Met His Leu Ala Ala Gln Ile Gly
35 40 45
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp His Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Val
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
85 90 95
Asn Ala Lys Asp Gln Glu Gly Trp Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln
100 105 110
Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
115 120 125
Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala
130 135 140
Arg Ala Gly His Gln Asp Ser Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155
<210> 27
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 27
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 28
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 28
Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 29
Lys Asp Glu Ser Gly His Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala His Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Asp Val Asn Ala
20 25 30
<210> 30
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 30
Lys Asp His Arg Gly Phe Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Ile Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 31
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 31
Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 32
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 32
Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 33
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 33
Lys Asp His Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ile Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 34
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 34
Lys Asp Ser Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Trp Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 35
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 35
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 36
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 36
Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 37
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 37
Lys Asp Gln Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Trp Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 38
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 38
Lys Asp Val Phe Gly Leu Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Thr Phe Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Val Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 39
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 39
Lys Asp Lys Trp Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 40
Lys Asp Glu Trp Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 41
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 41
Lys Asp Lys Lys Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Val Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 42
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 42
Lys Asp Gln Ser Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Tyr Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 43
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 43
Lys Asp Lys His Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Glu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 44
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 44
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 45
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 45
Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 46
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 46
Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Phe Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 47
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 47
Lys Asp Gln Trp Gly His Thr Pro Leu His Val Ala Ala Thr Phe Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 48
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 48
Lys Asp Gln His Gly Lys Thr Pro Met His Leu Ala Ala Gln Ile Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 49
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 49
Lys Asp His Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 50
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 锚蛋白重复模块
<400> 50
Lys Asp Gln Glu Gly Trp Thr Pro Leu His Val Ala Ala Gln Leu Gly
1 5 10 15
His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn
20 25 30
Ala
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBV核心抗原蛋白18-27
<400> 51
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBV包膜蛋白183-191
<400> 52
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBe183突变肽
<400> 53
Phe Leu Leu Arg Ile Leu Thr Ile
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NY-ESO-1肽
<400> 54
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 艾巴氏病毒
<220>
<223> 艾巴氏核抗原（EBNA）-1
<400> 55
Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 肽（人脱靶）
<400> 56
Ala Leu Pro Thr Leu Ile Pro Ser Val
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 肽（人脱靶）
<400> 57
Phe Leu Pro Asp Ala Asn Ser Ser Val
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 肽（人脱靶）
<400> 58
Phe Leu Pro Gln Gly Phe Pro Asp Ser Val
1 5 10
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 肽（人脱靶）
<400> 59
Arg Leu Pro Pro Asp Phe Phe Gly Val
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 肽（人脱靶）
<400> 60
Tyr Leu Asp Leu Phe Gly Asp Pro Ser Val
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 61
Ala Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 62
Phe Leu Ala Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 63
Phe Leu Pro Ala Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 64
Phe Leu Pro Ser Ala Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 65
Phe Leu Pro Ser Asp Ala Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 66
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Ala Pro Ser Val
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 67
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Ala Ser Val
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBc18肽（丙氨酸突变）
<400> 68
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ala Val
1 5 10
<210> 69
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> HLA-A*0201
<400> 69
Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro
1 5 10 15
Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr
20 25 30
Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro
35 40 45
Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu
50 55 60
Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly
65 70 75 80
Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val
85 90 95
Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys
115 120 125
Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr
130 135 140
Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly
165 170 175
Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His
180 185 190
His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser
195 200 205
Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp
210 215 220
Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly
225 230 235 240
Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln
245 250 255
Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr
260 265 270
Leu Arg Trp Glu Pro
275
<210> 70
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> beta-2-microglobulin
<400> 70
Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala
1 5 10 15
Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His
20 25 30
Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu
35 40 45
Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr
50 55 60
Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala
65 70 75 80
Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp
85 90 95
Asp Arg Asp Met
100
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽接头
<400> 71
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly
1 5 10
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Avi标签
<400> 72
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<210> 73
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro
35 40 45
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50 55 60
Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly
65 70 75 80
Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val
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225 230 235 240
Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln
245 250 255
Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr
260 265 270
Leu Arg Trp Glu Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Gly
275 280 285
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
290 295 300
<210> 74
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对NY-ESO-1 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 78
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Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
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Lys Asp Leu Ile Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ser Gly
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His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Ser Ala Asp Val Asn
50 55 60
Ala Lys Asp Val Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Val Ala Ala Lys His
65 70 75 80
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 对NY-ESO-1 pMHC具有特异性的锚蛋白重复结构域
<400> 79
Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Gly Gln
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Leu Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
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50 55 60
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100 105 110
Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
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Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Arg
130 135 140
Ala Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
145 150 155

Claims (67)

1.一种生产肽-MHC(pMHC)特异性结合蛋白的方法，其中所述结合蛋白包含对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域，所述方法包括以下步骤：
(a)提供经设计的重复结构域的集合；
(b)提供重组的靶标肽-MHC复合物；以及
(c)筛选所述经设计的重复结构域的集合的对所述靶标肽-MHC复合物的特异性结合，以获得至少一个对所述靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述集合包括含有固定位置和随机化位置的经设计的重复结构域，并且其中所述集合的经设计的重复结构域在至少一个所述随机化位置上彼此不同。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经设计的重复蛋白的集合由核糖体展示技术提供。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：(i)提供第二重组肽-MHC复合物，其中所述第二肽-MHC复合物的所述肽包含与所述靶标肽有至少一个氨基酸残基差异的氨基酸序列；以及(ii)通过负选择从所述集合中去除对所述第二重组肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合到所述靶标肽-MHC复合物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽-MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MHC是MHC I类。
11.一种重组结合蛋白，其包含能够通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的经设计的重复结构域。
12.一种重组结合蛋白，其包含第一经设计的重复结构域，其中所述第一重复结构域对第一靶标肽-MHC复合物具有结合特异性，其中优选地所述第一靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽，(ii)来源于感染因子优选病毒感染因子的蛋白的肽，以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。
13.根据权利要求12所述的结合蛋白，其中所述第一靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。
14.根据权利要求12或13所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合到所述第一靶标肽-MHC复合物。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域与所述第一靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一MHC是MHCI类。
18.根据权利要求17所述的结合蛋白，其中所述MHC I类是HLA-A*02。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一靶标肽来源于HBV核心抗原(HBcAg)。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
22.根据权利要求21所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
23.根据权利要求21或22所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:16至26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。
24.根据权利要求11至23中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含第二经设计的重复结构域，其中所述第二重复结构域对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性，其中优选地所述第二靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽，(ii)来源于感染因子优选病毒感染因子的蛋白的肽，以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。
25.根据权利要求24所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。
26.根据权利要求24或25所述的结合蛋白，其中对第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的所述第二重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合到所述第二靶标肽-MHC复合物。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域与所述第二靶标肽-MHC复合物的结合包括所述第二重复结构域与所述第二MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二MHC是MHCI类。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽相同的蛋白。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽具有与所述第一靶标肽相同的氨基酸序列。
32.根据权利要求24至31中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域具有与所述第一重复结构域相同的氨基酸序列。
33.根据权利要求24至31中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域与所述第一重复结构域相比具有不同的氨基酸序列。
34.根据权利要求24至30中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽与所述第一靶标肽相比具有不同的氨基酸序列。
35.根据权利要求24至29中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽所来源的蛋白不同的蛋白。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二MHC是HLA-A*02。
37.根据权利要求24至35中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二MHC不是HLA-A*02。
38.根据权利要求24至37中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。
39.根据权利要求38所述的结合蛋白，其中所述第二锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ IDNO:27至50中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
40.根据权利要求38或39所述的结合蛋白，其中所述第二锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:16至26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。
41.根据权利要求11至40中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含对免疫细胞的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。
42.根据权利要求41所述的结合蛋白，其中所述免疫细胞是T细胞。
43.根据权利要求42所述的结合蛋白，其中所述T细胞是CD8+细胞毒性T细胞。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的结合蛋白，其中在免疫细胞的所述表面上表达的所述蛋白是作为所述T细胞受体复合物的一部分的蛋白。
45.根据权利要求44所述的结合蛋白，其中作为所述T细胞受体复合物的一部分的所述蛋白是分化簇3(CD3)。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合因子是抗体、抗体模拟物、支架蛋白、重复蛋白或经设计的重复结构域。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合因子是经设计的锚蛋白重复结构域。
48.根据权利要求41至47中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合因子用肽接头共价连接到所述第一重复结构域，如果所述第二重复结构域存在的话，以及/或者共价连接到所述第二重复结构域。
49.根据权利要求48所述的结合蛋白，其中所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。
50.根据权利要求48至49中任一项所述的结合蛋白，其中所述肽接头的所述氨基酸序列具有1个至17个氨基酸的长度。
51.根据权利要求11至50中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够抑制T细胞受体对所述第一靶标肽-MHC复合物的识别，如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域的话，以及/或者对所述第二靶标肽-MHC复合物的识别。
52.一种核酸，其编码对如权利要求11至51中任一项所定义的第一或第二靶标肽-MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域，或者编码权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白。
53.一种药物组合物，其包含权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白或权利要求52所述的核酸，以及药学上可接受的载剂和/或稀释剂。
54.一种在哺乳动物优选人中感染定位激活T细胞的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用权利要求11至50中任一项所述的结合蛋白或权利要求52所述的核酸的步骤，其中所述第一靶标肽来源于感染因子的蛋白，如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域的话，并且/或者所述第二靶标肽来源于感染因子的蛋白。
55.根据权利要求11至50中任一项所述的结合蛋白或根据权利要求52所述的核酸，其用于在哺乳动物优选人中感染定位激活T细胞的方法中，其中所述第一靶标肽来源于感染因子的蛋白，如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域的话，并且/或者所述第二靶标肽来源于感染因子的蛋白。
56.一种治疗医学病症的方法，所述方法包括向对所述治疗有需要的患者施用治疗有效量的权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白、权利要求52所述的核酸或权利要求53所述的药物组合物的步骤。
57.根据权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白、根据权利要求52所述的核酸，或者根据权利要求53所述的药物组合物，其用于治疗医学病症的方法中。
58.一种诊断哺乳动物的医学病症的方法，所述哺乳动物优选为人，所述方法包括以下步骤：
(i)使从所述哺乳动物获得的细胞或组织样品与权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白接触；以及
(ii)检测所述结合蛋白与所述细胞或组织样品的特异性结合。
59.根据权利要求56或58所述的方法或者根据权利要求57所述使用的结合蛋白，其中所述医学病症是癌症、感染性疾病或自体免疫疾病，所述感染性疾病优选为病毒感染性疾病。
60.根据权利要求56或58所述的方法或者根据权利要求57所述使用的结合蛋白，其中所述医学病症是癌症。
61.根据权利要求56或58所述的方法或者根据权利要求57所述使用的结合蛋白，其中所述医学病症是感染性疾病，优选病毒感染性疾病。
62.根据权利要求56或58所述的方法或者根据权利要求57所述使用的结合蛋白，其中所述医学病症是自体免疫疾病。
63.一种靶向患有病毒感染性疾病的患者中的受感染细胞以破坏所述受感染细胞的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白、权利要求52所述的核酸或者权利要求53所述的药物组合物的步骤，其中所述第一靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白，如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域的话，并且/或者所述第二靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白。
64.根据权利要求63所述的靶向受感染细胞的方法，其中所述结合蛋白还包含能够杀死受感染细胞的毒性因子。
65.根据权利要求11至51中任一项所述的结合蛋白、根据权利要求52所述的核酸或者根据权利要求53所述的药物组合物，其用于靶向患有病毒感染性疾病的患者中的受感染细胞以破坏所述受感染细胞的方法中，其中所述第一靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白，如果所述结合蛋白包含所述第二重复结构域的话，并且/或者所述第二靶标肽来源于在所述受感染细胞中表达的蛋白，优选病毒特异性蛋白。
66.根据权利要求65所述使用的结合蛋白、核酸或药物组合物，其中所述结合蛋白还包含能够杀死受感染细胞的毒性因子。
67.根据权利要求56、58至60、62和63中任一项所述的方法，或者根据权利要求57、65和66中任一项所述的结合蛋白、核酸或药物组合物，其中所述医学病症是由乙型肝炎病毒引起的病毒感染性疾病。
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