BR112015012436B1 - Proteína de ligação recombinante e formulação farmacêutica - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE LIGAÇÃO RECOMBINANTE, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE PELO MENOS UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO E MÉTODO DE TRATAMENTO. A presente invenção se refere a uma proteína de ligação recombinante que compreendem pelo menos um primeiro e um segundo domínio de repetição, em que cada dos referidos dois domínios de repetição se liga à região extracelular de HER2 e em que os referidos domínios de repetição são covalentemente ligados (Figura 1A).

Description

Campo da Invenção

[01] A presente invenção se refere a proteínas de ligação que compreendem pelo menos dois domínios de repetição com especificidade de ligação para receptor de fator de crescimento epidermal humano 2 (HER2), assim como ácidos nucleicos que codificam as referidas proteínas de ligação HER2, composições farmacêuticas que compreendem as referidas proteínas e o uso das referidas proteínas no tratamento de doenças.

Antecedentes da Invenção

[02] Receptor de fator de crescimento epidermal humano 2 (HER2; HER2 humano tem o número UniProtKB/Swiss-Prot P04626) também conhecido como ErbB2 é um proteína que em seres humanos é codificada pelo gene ERBB2. A amplificação ou a superexpressão do referido gene foi mostrada desempenhar um importante papel na patogênese e na progressão de determinados tipos de câncer e em anos recentes ele se desenvolveu para se tornar um importante biomarcador e alvo de terapia de doença. HER2 é um receptor de transmembrana de tirosina quinase (RTK) que pertence a uma família maior de receptores ErbB (Bublila, E.M. e Yarden, Y. Curr. Opin. Cell Biol. 19(2), 124 - 34, 2007). A família do receptor ErbB é conservada através dos vertebrados e também inclui o fundador da família ErbB1 (também denominado de receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) ou HER1; P00533 número em UniProKB/Swiss-Prot para a proteína humana) e os receptores HER3 mais recentemente identificados (também nomeados ErbB3; P21860 número em UniProKB/Swiss-Prot para a proteína humana) e HER4 (também nomeado ErbB4; Q15303 número em UniProKB/Swiss-Prot para a proteína humana). Todos os receptores ErbBes compartilham as extensivas homologias de sequência e de domínio, e formam homodímeros funcionais (por exemplo, ErbB1-ErbB1, HER2-HER2 e HER4-HER4) e heterodímeros em todas as combinações. A homo- e heterodimerização de receptor ocorre com a ligação ao ligante ou a superexpressão do receptor, e por sua vez ativa os domínios de receptor quinase intracelular por autofosforilação. Isso por sua vez engatilha sinalização intracelular à jusante e as respostas biológicas. Em contraste aos outros receptores ErbB, HER2 não tem qualquer ligante conhecido e é capaz de dimerizar, que é fortemente pronunciado após a sua superexpressão e é desse modo ativado sem ligação anterior ao ligante. Ainda importante, HER3 não tem domínio de quinase intracelular ativo e é ativado através de heterodimerização com outros membros da família de receptores ErbB o que leva a uma sinalização muito potente à jusante. A referida heterodimerização e ativação de HER3 ocorrem com a ligação ao ligante a HER3 ou se um receptor de parceria, tal como HER2, é fortemente superexpresso.

[03] HER2 assim como todos os outros membros da família de receptores ErbB são compostos de quatro domínios extracelulares, que são sequencialmente nomeados I, II, III e IV; onde domínio IV é mais próximo da membrana extracelular da célula e domínio I o mais distal. Em condições de privação e ligante, os domínios I e III nos receptores ErbBe compartilham uma interação intramolecular que oclui o domínio II. Isso evita a homo-/heterodimerização e a sinalização do receptor, uma vez que a interação entre os domínios II de dois receptores ErbBe vizinhos é necessária para a dimerização (Burguess A.W., et al., Mol. Cell 12(3), 541 - 552, 2003). A ligação ao ligante rompe a interação entre os domínios I e III, que então causa uma mudança de conformação do receptor de amarrado para estendido e deixa o domínio II exposto. Isso torna o receptor promiscuo para dimerizar com outros receptores ErbBe estendidos e iniciar a sinalização. É interessante ressaltar que, HER2 é o único receptor membro da família ErbB que é constitutivamente encontrado em uma conformação estendida; assim o domínio II é continuamente exposto e accessível para a homo- e a heterodimerização.

[04] A dimerização do receptor ErbB e a autofosforilação leva à ativação de uma abundância de moléculas de sinalização chave à jusante envolvidas em fisiologia normal assim como na doença. A natureza das referidas moléculas de sinalização ativadas depende de algum modo da composição dos dímeros de receptor ErbB ativos. Por exemplo, homodímeros de HER1-HER1 e HER2-HER2 preferivelmente ativam a sinalização e proliferação à jusante de quinase regulada por sinal extracelular (ERK), enquanto que heterodímeros HER2-HER3 também ativam o trajeto de sinalização PI3K (incluindo a ativação da quinase AKT à jusante) e desse modo a sobrevivência da célula. De fato, a ativação de AKT por sinalização de HER2-HER3 em células de tumor promove a sobrevivência e torna as células de tumor resistentes a HER2 que tem como objetivo os fármacos, tal como o anticorpo monoclonal trastuzumab (Berns K. et al., Cancer Cell 12, 395 - 402, 2007). De modo interessante, a inibição da sinalização de PI3K-AKT mediada a HER2-HER3 nas referidas células se torna limitante e resulta em morte da célula. Além de proliferação e sobrevivência da célula, a sinalização de HER2 foi também envolvida em outros processos tais como angiogênese e migração.

[05] HER2 é superexpresso em aproximadamente 20% de todos os cânceres de mama. Em virtude de sua relevância clínica, HER2 se tornou o primeiro RTK contra o qual um biológico objetivado foi desenvolvido, ou seja, trastuzumab (Herceptin®; Genentech). O referido anticorpo se liga ao domínio IV de HER2 e inibe a sinalização de HER2 por diversos mecanismos que não são ainda completamente entendidos. Os referidos incluem a indução de internalização do receptor em células de tumor, o que resulta em níveis de expressão e de sinalização reduzidos de HER2e leads a um fenótipo tumorigênico atenuado. Trastuzumab mudou a vida de dezenas de milhares de mulheres com câncer de mama, expandindo o seu tempo e a sua qualidade de vida. Entretanto, trastuzumab tem principalmente um efeito anti-proliferativo e os tumores podem escapar do referido tratamento em estágios avançados da doença. Em uma tentativa de desenvolver tratamentos mais eficazes, um novo anticorpo foi gerado que reconheceu o domínio II ou HER2, ou seja pertuzumab (Omnitarg®, Perjeta®; Genentech). Diferente de trastuzumab, o referido anticorpo não foi desenvolvido para reduzir os níveis de expressão na membrana de HER2, mas para interferir com a formação de homo- e heterodímero de HER2 ao se ligar a e ocluir o domínio de dimerização II do receptor. O tratamento com pertuzumab tem uma baixa eficácia terapêutica inesperada in vitro e in vivo como agente único; no entanto, a sua combinação com trastuzumab mostra efeitos sinergísticos. Portanto, a combinação com ambos os anticorpos pode se tornar um padrão de terapia de cuidado para os pacientes de câncer de mama (Capelan M., et al., Ann. Oncol., 24, 273 - 82, 2013).

[06] O sucesso pré-clínico e clínico da combinação de trastuzumab e pertuzumab levou ao conceito de que dual que tem como objetivo os de domínios II e IV em HER2 é necessário para a superior eficácia antitumoral. Isso é alinhado com outras moléculas mais recentemente geradas por simultaneamente objetivar HER2 nos domínios II e IV. Por exemplo, a empresa Dinamarquesa Symfogen está desenvolvendo misturas de anticorpos contra os domínios II e IV de HER2 que demonstraram alguma maior eficácia (isto é, superior a trastuzumab isoladamente) em modelos de tumor pré-clínico de rato.

[07] De modo similar, US2011/033460 descreve que a combinação de anticorpos que ligam o domínio I e o domínio IV de HER2 exibe efeitos sinergísticos na síntese de DNA e viabilidade de células BT474. Adicionalmente, US2011/033460 também descreve anticorpos biespecíficos que ligam dois diferentes epítopos de HER2, um epítopo localizado no domínio I de HER2 e o outro epítopo localizado no domínio IV de HER2.

[08] WO 2009/068625 cobre o desenvolvimento de construtores de anticorpo biparatópicos que compreendem um primeiro domínio de anticorpo, que compete com trastuzumab para ligação a HER2, e um segundo domínio de anticorpo, que se liga ao um diferente epítopo ou parte de HER2. De modo interessante, some construtores têm um efeito antagonístico de proliferação de célula SKBR3, enquanto que outros têm um efeito agonístico. Especialmente, WO 2009/068625 cobre o desenvolvimento dos construtores de anticorpo biparatópicos que compreendem um primeiro domínio de anticorpo, que compete com trastuzumab para ligação a HER2 (isto é, domínio de ligação IV de Her2) e um segundo domínio de anticorpo, que compete com pertuzumab para ligação a HER2 (isto é, domínio de ligação II de HER2). Construtores onde o domínio IV que liga o domínio de anticorpo foi clonado no N-término para o domínio II que liga o domínio de anticorpo mostrou o bloqueio da ativação de map quinase, enquanto que o referido bloqueio não foi observado com a outra orientação (isto é, tendo o domínio II que liga o domínio de anticorpo ao N-término). No geral, pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2009/068625 descreve uma variedade de construtores de anticorpo biparatópicos que tem como objetivo o HER2, que tem em extensões variáveis efeitos na proliferação de célula SKBR3 (agonístico ou antagonístico) ou sinalização de célula, mas nenhum efeito citotóxico nem apoptótico foram descritos.

[09] Proteínas de ligação bivalentes, tais como moléculas de diacorpo bivalentes ou anticorpos bivalentes que tem como objetivo o HER2, são descritos também (Nielsen, U.B., et al., Cancer Res., 60, 6434 - 6440, 2000; Steffen, A-C., Cancer Biother. Radiofarmaceut. 20, 239 - 248, 2005). As referidas moléculas combinam duas vezes o mesmo domínio de ligação e assim são diferentes das moléculas biparatópicas que compreendem dois domínios de ligação cada um dos quais se liga um diferente epítopo na mesma molécula alvo.

[10] Como uma alternativa para as terapêuticas derivadas de anticorpo e SMIs, há novas proteínas de ligação ou domínios de ligação que podem ser usados para especificamente se ligar a molécula alvo (por exemplo, Binz, H.K., Amstutz, P. e Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257 - 1268, 2005) e desse modo agir como um antagonista. Uma das referidas novas classes de Proteínas de ligação ou domínios de ligação não possuem um Fc são com base em proteínas de repetição projetadas ou domínios de repetição projetados (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grütter, M.G., e Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575 - 582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K e Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695 - 701, 2008).

[11] O pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2002/020565 descreve o quão extensas as bibliotecas de proteínas de repetição podem ser construídas e sua aplicação geral. Os referidos domínios de repetição projetados protegem a natureza modular de proteínas de repetição e podem possuir módulos de cobertura de N-terminal e C-terminal para evitar que os domínios de repetição projetados se agreguem ao proteger o núcleo hidrófobo do domínio (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. e Plückthun, A., FEBS letters 539, 2 - 6, 2003). A referida nova classe de Proteínas de ligação inclui proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins). A geração de DARPins monoespecíficas que se ligam a HER2 foi anteriormente descrita (por exemplo, Steiner, D., Forrer, P. e Plückthun, A., J. Mol. Biol. 382, 1211 - 1227, 2008; Zahnd, C., Pecorari, F., Straumann, N., Wiler, E. e Plückthun, A., J. Biol. Chem. 281(46), 35167 - 35175, 2006).

[12] Recentemente, uma proteína de repetição de anquirina bioespecífica projetada foi descrita, que tem como objetivo HER2 (Jost, Ch., et al., Estrutura 21, 1 - 13, 2013). Os autores mostram que a ligação de dois domínios de repetição de anquirina conectados por um ligante curto (ligantes mais longos não funcionam tão bem), um que tem como objetivo o domínio I de Her2 e o outro domínio IV de Her2, causa efeitos citotóxicos mais fortes nas células BT474 em comparação ao trastuzumab isoladamente, que tem como objetivo o domínio IV de Her2. A referida proteína de repetição biparatópica funciona por reticulação intramolecular de duas moléculas Her2; isto é, a mesma conecta duas moléculas Her2 ligadas na membrana, distorcendo as mesmas de modo que elas não podem formar dímeros componentes de sinalização com qualquer membro da família EGFR, evitando qualquer dimerização de quinase, e assim levando aos efeitos citotóxicos observados.

[13] Embora a técnica anterior indique que tem como objetivo de que HER2 é benéfica para a terapia de doenças, tal como câncer, há uma clara necessidade de gerar proteínas de ligação que têm como objetivo o HER2 com maior eficácia.

[14] Objetivo da presente invenção

[15] É um objetivo da presente invenção proporcionar novos antagonistas para Her2.

[16] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar um novo mecanismo de inibir sinalização de célula relacionada a HER2.

[17] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar uma nova abordagem para inibir a proliferação de célula mediada a HER2 e/ou para induzir apoptose em uma célula (por exemplo, célula de tumor), tecido, órgão ou paciente.

[18] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar uma abordagem monoterapêutica que vai de encontro a dois domínios de Her2 por usar proteínas de repetição biparatópicas.

[19] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar novas opções terapêuticas para o câncer.

[20] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar um tratamento contra uma doença neoplástica, que tem boa eficácia e/ou poucos efeitos colaterais.

[21] É um outro objetivo da presente invenção proporcionar um tratamento alternativo contra doenças neoplásticas que não (ou apenas parcialmente) responde, ou são resistentes, a, terapias a partir da técnica anterior.

[22] Sumário da Invenção

[23] Os referidos objetivos são alcançados pelo assunto das reivindicações independentes, enquanto as reivindicações dependentes assim como a especificação descrevem modalidades preferidas adicionais.

[24] Embora a presente invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhes nos desenhos e na descrição anterior, as referidas ilustrações e descrições têm que ser consideradas ilustrativas ou exemplificativas e não restritivas; a presente invenção não é limitada às modalidades descritas. Outras variações para as modalidades descritas podem ser entendidas e efetuadas por aqueles versados na técnica na prática da invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da descrição, e das reivindicações em anexo. Nas reivindicações, o termo “que compreendem” não exclui outros elementos ou etapas, e o artigo indefinido “o”, “a” ou “um”, “uma” não exclui uma pluralidade. O mero fato que determinadas medidas são recitadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que a combinação das referidas medidas não pode ser usada com vantagem. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser construídos como limitantes do âmbito.

[25] Breve Descrição dos Desenhos

[26] Figura 1. Ligação dos domínios de DARPin a HER2

[27] A ligação de DARPins monovalentes ao o domínio extracelular HER2 (domínio I-IV) foi testada por competição ELISA usando domínios HER2 purificados (domínio I, domínio III-IV ou domínio I-III) como competidores, como ilustrado nas Figuras 1A e 1B. Na presença de 500 nM de domínio Her2 I, o DARPin #51 e o DARPin #52 não podem mais se ligar a HER2 (domínio I-IV), o que indica que os mesmos se ligam a um epítopo localizado no domínio I. O DARPin #7, o DARPin #53 e o DARPin #54 são domínios de ligação II na medida em que nenhum de 500 nM de domínio Her2 I nem 500 nM de domínio Her2 III-IV pode evitar a sua ligação ao comprimento total Her2 (domínio IIV). A Figura 1.C mostra que os DARPins monovalentes podem se ligar no complexo pré- formado HER2-pertuzumab e são assim se ligando a diferentes epítopos do que pertuzumab no domínio Her2 II. Vide abaixo para as definições dos DARPins. OD, densidade ótica a 450 nM menos OD a 620 nM; C, um DARPin de controle, que não está se ligando a HER2; d1, domínio I de HER2; d1-3; domínio I-III de HER2; d3-4, domínio IIIIV de HER2.

[28] Figura 2. Inibição de proliferação de célula BT474 por proteínas de ligação monovalentes e biparatópicas

[29] A inibição da proliferação de BT474 por DARPins monovalentes (isto é, DARPin # 1 e DARPin #18), uma mistura não covalente dos referidos DARPins monovalentes e proteínas de ligação biparatópicas que compreende os referidos DARPins monovalentes em diferentes orientações (DARPin # 41 e DARPin #49) foi testada. A Figura 2A mostra a inibição de proliferação por várias concentrações de DARPins biparatópicos e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto. O valor de IC50 para o DARPin #41 foi então calculado para ser cerca de 2 nM. Os valores de IC50 para DARPins distintos são listados na Tabela 2. O gráfico na figura 2A mostra a OD, densidade ótica a 450 nM menos a OD a 620 nM traçada em relação a C, a concentração de DARPins em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. A Figura 2B mostra a inibição de proliferação a uma concentração de 100 nM para os DARPins biparatópicos, uma mistura de both DARPins monovalentes e os DARPins monovalentes correspondentes individuais. A OD é traçada no eixo Y. a inibição de proliferação é refletida por uma baixa OD. Vide abaixo para as definições dos DARPins. #41, DARPin #41; #49, DARPin #49; #18, DARPin #18; #1, DARPin #1; n.c., controle negativo.

[30] Figura 3. Inibição de proliferação de célula BT474 por vários DARPins biparatópicos

[31] A inibição de proliferação de BT474 por um subconjunto de DARPins biparatópicos (#23, #24, #33, #37, #43, #44 e #41) que compreendem diferentes domínios de repetição de anquirina N-terminal e/ou C-terminal é mostrada. A inibição de proliferação por várias concentrações de DARPins e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto cada. Os valores das IC50s para os DARPins distintos são listados na Tabela 2. A Figura 3A mostra a inibição de DARPins biparatópicos tendo DARPin #15 e a Figura 3B mostra a inibição de DARPins biparatópicos tendo DARPin #18 no C-término. As Figuras 3C e 3D mostram a inibição de DARPins biparatópicos tendo DARPin #51 ao N-término e DARPin #18 no C- término e a Figura 3D mostra a inibição de DARPins biparatópicos tendo DARPin #51 ao N-término e DARPin #21 no C-término. O gráfico mostra a OD, densidade ótica a 450 nM menos OD a 620 nM traçada em relação a C, concentração de DARPins em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. Vide abaixo para as definições do DARPins. #23, DARPin #23; #24, DARPin #24; .#33, DARPin #33; #37, DARPin #37; #41, DARPin #41; #43, DARPin #43; #44, DARPin #44.

[32] Figura 4. Inibição de proliferação celular por DARPin biparatópico #41 em diferentes linhagens celulares

[33] A inibição da proliferação de NCI-N87 (Figura 4A) e ZR75-30 (Figura 4B) e MDA-MB175 (Figura 4C) por DARPin #41 e trastuzumab foi testada. A inibição de proliferação por várias concentrações de DARPins e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto cada. Os valores das IC50s para linhagens celulares distintas são listados na Tabela 3. O gráfico mostra a OD, densidade ótica a 450 nM menos OD a 620 nM traçada em relação a C, concentração de DARPins em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. Vide abaixo para as definições do DARPins e moléculas de referência. #41, DARPin #41; T, trastuzumab.

[34] Figura 5. Indução de apoptose por DARPin biparatópico #41 em diferentes linhagens celulares

[35] A indução de apoptose em células BT474 (Figura 5A) e NCI-N87 células (Figura 5B) e MDA-MB175 (Figura 5C) por DARPin #41 e trastuzumab foi testada. A indução de apoptose por várias concentrações de DARPins e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto cada. Os valores de EC50 para as linhagens celulares distintas são listados na Tabela 3. O gráfico na figura 5A mostra OD, densidade ótica a 450 nM menos OD a 490 nM traçada em relação a C, concentração de DARPins de trastuzumab em nM. Os gráficos nas figuras 5B e 5C mostram RLU, unidades relativas leves traçadas em relação a C, concentração de DARPins ou trastuzumab em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. Vide abaixo para as definições de DARPins. T, trastuzumab; #41, DARPin #41.

[36] Figura 6. Comparação da eficácia de DARPin #41 com valores de referência em inibição de proliferação celular e indução de apoptose.

[37] A inibição de proliferação (Figura 6A) e a indução de apoptose (Figura 6B) em células BT474 foi testada para o DARPin #41 e os valores de referência trastuzumab e pertuzumab e a combinação de 100 nM trastuzumab e uma titulação de pertuzumab. A Figura 6A mostra a inibição de proliferação por várias concentrações de DARPina, respectivamente concentrações de valores de referência e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto cada. Os valores das IC50s para linhagens celulares distintas são listados na Tabela 3. O gráfico mostra a OD, densidade ótica a 450 nM menos OD a 620 nM traçada em relação a C, concentração de DARPin / valores de referência em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. A Figura 6B mostra a indução de apoptose por várias concentrações de DARPina, respectivamente concentrações de valores de referência e as curvas de ativação adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto cada. Os valores de EC50 para linhagens celulares distintas são listados na Tabela 3. O gráfico mostra unidades relativas leves (RLU) traçadas em relação a C, concentração de DARPin / valores de referência em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. Vide abaixo para as definições de DARPins. T, trastuzumab; P, pertuzumab; #41, DARPin #41.

[38] Figura 7. Inibição de proliferação de célula BT474 por diferentes formatos de proteínas de ligação biparatópicas

[39] A inibição de proliferação de BT474 por diferentes formatos de DARPins biparatópicos compostos de DARPin #1 ao N-término e DARPin #18 no C- término é mostrada. A Figura 7A mostra a inibição de proliferação por várias concentrações de DARPins biparatópicos, que foram trabalhados por engenharia genética para ter uma longa meia vida no soro, e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto. O DARPin biparatópico #63 é Peguilado em seu resíduo Cis em C-término, enquanto que os DARPins biparatópicos #64 e #65 compreendem um domínio de repetição de anquirina que se liga a albumina do soro. A Figura 7B mostra a inibição de proliferação por várias concentrações de DARPins biparatópicos que compreendem diferentes ligantes entre os domínios de repetição que ligam HER2 e as curvas de inibição adaptadas correspondentes são mostradas para um experimento único e distinto. Os valores das IC50s para os DARPins são listados na Tabela 2. O gráfico mostra a OD, densidade ótica a 450 nM menos OD a 620 nM traçada em relação a C, concentração de DARPins em nM. O eixo X é mostrado em escala logarítmica. Vide abaixo para as definições do DARPins. #66, DARPin #66, que compreende um longo ligante GS de dois amino ácidos curtos entre os dois domínios de repetição; #67, DARPin #67, que compreende um longo ligante GS de cinco amino ácidos entre os dois domínios de repetição; #41, DARPin #41, que compreende um longo ligante GS de dez amino ácidos entre os dois domínios de repetição; #68, DARPin #68, que compreende um longo ligante PT de 24 amino ácidos entre os dois domínios de repetição. Descrição Detalhada da Invenção

[40] De acordo com uma modalidade da presente invenção, a proteína de ligação recombinante que compreendem pelo menos um primeiro e um segundo domínio de repetição, em que cada dos referidos dois domínios de repetição se liga à região extracelular de HER2 e em que os referidos domínios de repetição são covalentemente ligados.

[41] Foi surpreendentemente observado que a ligação da parte extracelular de HER2 com a proteína de ligação recombinante que compreendem pelo menos dois domínios de repetição covalentemente ligados, cada um com especificidade para a região extracelular de HER2, tem efeitos vantajosos e inesperados em relação ás abordagens da técnica anterior como delineado acima, que liga HER2 com ligantes distintos e individuais (por exemplo, a combinação de trastuzumab e pertuzumab; Figura 6).

[42] HER2 humana consiste de 1255 amino ácidos com uma sequência de sinal de 21 amino ácidos, uma região extracelular de 631 amino ácidos (por exemplo, o ectodomínio que compreende os domínios I a IV), uma região de transmembrana de 23 amino ácidos, e um domínio citoplasmático de 580 amino ácidos.

[43] Preferivelmente, a referida ligação da região extracelular de HER2 pela referida proteína de ligação recombinante é uma ligação simultânea ou concomitante dos referidos domínios de repetição para a referida região extracelular de HER2. Também preferivelmente, os referidos domínios de repetição se ligam a dois diferentes epítopos da região extracelular de HER2. Também preferivelmente, os referidos domínios de repetição se ligam a dois diferentes e de não sobreposição epítopos da região extracelular de HER2.

[44] Uma razão para essa maior eficácia pode ser aquela de que a proteína de ligação recombinante de acordo com a presente invenção induz uma conformação amarrada até agora não descrita da região extracelular de HER2, o que parece ser a consequência de uma interação intramolecular da proteína de ligação biparatópica da presente invenção com dois diferentes epítopos na região extracelular de HER2 (Exemplo 8); isto é, ambos os domínios de repetição da proteína de ligação parecem se ligar simultaneamente a diferentes epítopos na mesma molécula HER2 e desse modo forçando a região extracelular de HER2 nessa nova conformação amarrada. A referida conformação amarrada não é descrita pela técnica anterior. É importante ressaltar que, os referidos dois domínios de repetição precisam ser ligados por estarem presentes na mesma proteína de ligação; isto é, uma simples mistura dos dois domínios de repetição não mostra a eficácia (A figura 2B). Adicionalmente, a ligação bivalente da referida proteína de ligação à região extracelular de HER2 pode desenvolver efeitos de ligação sinergística por exibir maior avidez, isto é, uma resistência combinada de ligação sincrônica a diferentes epítopos do alvo. A avidez é distinta da afinidade, que corresponde à resistência de uma única interação de ligação. No geral, a referida interação específica da proteína de ligação com HER2 pode explicar a inibição muito eficaz da proliferação e da indução de apoptose pelas referidas moléculas como mostrado nos exemplos.

[45] De acordo com essa teoria os dois diferentes domínios de repetição na mesma proteína suportam de modo sinergístico ao outro na ligação de seus respectivos epítopo, assim levando a um aumento da afinidade geral ao alvo.

[46] A ligação do primeiro domínio de repetição ao seu epítopo em HER2 traz o segundo domínio de repetição para uma posição energeticamente e/ou estericamente favorável o que facilita a sua ligação ao seu respectivo epítopo em HER2.

[47] Como mostrado nos exemplos a ligação covalente do primeiro e do segundo domínio de repetição parece potenciar a sua atividade biológica.

[48] Em uma modalidade preferida da proteína de ligação recombinante de acordo com a presente invenção um primeiro domínio de repetição se liga ao domínio II de HER2 e um segundo domínio de repetição se liga ao domínio IV de HER2.

[49] É importante se entender que o termo “se liga ao domínio II” que dizer que o respectivo domínio de repetição se liga principalmente ao domínio II de HER2. A referida definição, entretanto, não exclui que as partes do referido domínio de repetição podem se ligar, ou se sobrepor, a outros domínios. O mesmo se aplica para o termo “se liga ao domínio IV”.

[50] A objetivação simultânea dos domínios II e IV de HER2 pela proteína de ligação biparatópica de acordo com a presente invenção tem efeitos particulares inesperados em relação ao que foi conhecido a partir da técnica anterior. As respostas celulares em termos de inibição de proliferação e indução de apoptose celular pelas referidas proteínas de ligação foram muito mais dramáticas quando comparadas aos efeitos obtidos pelos anticorpos do estado da técnica. Por exemplo, a extensão das referidas respostas provou ser superior àquela induzida por valores de referência do anticorpo clínico, tal como a combinação de trastuzumab e pertuzumab que tem como objetivo o domínio IV e II de HER2, respectivamente (Figuras 4, 5 e 6). De modo interessante, algumas ligações de proteínas de ligação biparatópicas ao domínio I e ao domínio IV de HER2 não mostram os referidos efeitos inesperados (Figuras 3C e 3D).

[51] Métodos de determinar o domínio da região extracelular de HER2 ao qual um domínio de repetição se liga ao, por exemplo, como mostrado no Exemplo 3, são bem conhecidos daqueles versados na técnica (por exemplo, Jost et al., loc. cit.).

[52] Os achados do Requerente têm importantes implicações para o tratamento de cânceres humanos orientados por HER2, no sentido de que a ligação simultânea que tem como objetivo os domínios II e IV de HER2 com a proteína de ligação biparatópica de acordo com a presente invenção podem ser uma alternativa mais eficaz às abordagens atuais que objetivam os anticorpos.

[53] A proteína de ligação de acordo com a presente invenção é assim preferivelmente a proteína de ligação biparatópica, isto é, a mesma compreende dois domínios de repetição de antígeno que reconhecem dois diferentes epítopos, ou domínios (por exemplo, domínios II e IV) na mesma proteína alvo (ou seja HER2). Entretanto, polipeptídeos que são multiparatópicos, isto é, contendo domínios de repetição de antígeno que reconhecem três, quatro ou mais epítopos na mesma proteína alvo, estão englobados dentro do âmbito da presente invenção, como são os polipeptídeos que são ambos bi- ou multiparatópico e multivalentes, isto é, tendo também domínios de repetição de antígeno que reconhecem uma ou mais outras proteínas alvos.

[54] HER2, como usado aqui, se refere a receptor de fator de crescimento epidermal humano 2, também conhecido como Neu, ErbB-2, CD340 (grupo de diferenciação 340) ou p185. HER2 é um membro da família do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR/ErbB). HER2 é, em humanos, codificada por ERBB2, um proto-oncogene conhecido localizado no braço longo do cromossomo humano 17 (17q12). HER2 tem o número UniProtKB/Swiss-Prot P04626.

[55] De acordo com a modalidade preferida da presente invenção, os primeiro e segundo domínios de repetição são localizados no mesmo polipeptídeo, enquanto o domínio de repetição que tem como objetivo o domínio II de HER2 é localizado no N-término para o domínio de repetição que tem como objetivo o domínio IV de HER2.

[56] As referidas modalidades são, por exemplo, mostradas na figura 2A, e a descrição correspondente. Os inventores, surpreendentemente, mostraram que as proteínas de ligação nas quais o domínio de repetição que tem como objetivo o domínio II de HER2 é localizada em C-terminal para o domínio de repetição que tem como objetivo o domínio IV de HER2 é significativamente menos eficaz do que as proteínas de ligação nas quais o domínio de repetição que tem como objetivo o domínio II de HER2 é localizado no N-término para o domínio de repetição que tem como objetivo o domínio IV de HER2.

[57] Preferivelmente, o domínio de ligação II de HER2 do referido primeiro domínio de repetição não está competindo para ligação a HER2 com pertuzumab. Por exemplo, A figura 1C mostra os referidos domínios de repetição não competindo para a ligação a HER2 com pertuzumab. Da mesma forma preferivelmente, o referido domínio de ligação IV do segundo domínio de repetição de HER2 não está competindo para ligação a HER2 com trastuzumab. Por exemplo, os domínios de repetição de DARPins #18 a 20 não competem para a ligação a HER2 com trastuzumab. Métodos para determinar se um domínio de repetição não compete para a ligação a HER2 com trastuzumab ou pertuzumab, por exemplo, como mostrado no Exemplo 3, são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[58] Isso quer dizer que, na primeira modalidade preferida, o primeiro domínio de repetição se liga a um diferente epítopo de domínio II de HER2 do que o pertuzumab. Da mesma forma, na segunda modalidade preferida, o segundo domínio de repetição se liga ao um diferente epítopo de domínio IV de HER2 do que trastuzumab. Sem estar ligado a uma teoria, os inventores atribuem pelo menos alguns dos efeitos mostrados na seção experimental aos referidos fatos.

[59] De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção o referido primeiro domínio de repetição é um domínio de repetição de anquirina, ou um domínio de repetição de anquirina projetado, e o referido segundo domínio de repetição é um domínio de repetição de anquirina, ou um domínio de repetição de anquirina projetado.

[60] Preferivelmente, os referidos domínios de repetição de anquirina ou domínios de repetição de anquirina projetados compreendem entre 70 e 300 aminoácidos, em particular entre 90 e 200 amino ácidos.

[61] Também preferivelmente, um domínio de repetição da presente invenção é um domínio de repetição de anquirina ou um domínio de repetição de anquirina projetado como descrito em WO 2002/020565. Exemplos de domínios de repetição de anquirina projetados com especificidade de ligação biparatópica para diferentes domínios de Her2 são mostrados nos Exemplos.

[62] De acordo com a modalidade preferida da presente invenção, o primeiro domínio de repetição se liga à região extracelular de HER2 em PBS com uma Kd menor do que 10-7M e o referido segundo domínio de repetição se liga à região extracelular de HER2 em PBS com uma Kd menor do que 10-7M.

[63] Kd é a constante de dissociação e será adicionalmente definida no texto abaixo. A Kd menor do que 10-7M é necessária para proporcionar suficiente afinidade do domínio de repetição ao seu alvo. Preferivelmente, os domínios de repetição ligam os seus domínios alvo em PBS com uma Kd menor do que 10-8M, 10-9M, 10-10M, ou, mais preferivelmente menor do que 10-11M.

[64] Proteínas de ligação recombinantes que compreendem domínio de ligação a proteínas II e/ou domínio IV de Her2 com uma Kd em PBS abaixo de 10-7M são mostradas no Exemplo 2.

[65] De acordo com a modalidade preferida, a referida proteína de ligação inibe a proliferação estimulada de células BT474 com um valor de concentração inibitória meio máxima (IC50) de menos do que 100 nM. Preferivelmente, a referida proteína de ligação inibe a proliferação estimulada de células BT474 com um valor de IC50 de menos do que 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 nM. Também preferivelmente, a referida proteína de ligação inibe a proliferação estimulada de células BT474 em pelo menos 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10%.

[66] As células BT474 podem ser usadas para medir a capacidade funcional das proteínas de ligação da presente invenção para inibir a proliferação por meios padrão bem conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, como mostrado no Exemplo 4. Preferivelmente, células BT474, SKBR-3, NCI-N87, ZR75-30, HCC1419 ou MDA-MB175 podem ser usadas para medir a capacidade funcional dos compostos da presente invenção para inibir a proliferação, por exemplo, como mostrado no Exemplo 5.

[67] Proteínas de ligação recombinantes que inibem a proliferação estimulada de células BT474 com um valor de IC50 de menor do que 100 nM são descritas, e discutidas, no Exemplo 4.

[68] De acordo com outra modalidade preferida, a referida proteína de ligação induz apoptose em células BT474 com um valor de concentração eficaz meio máxima (EC50) de menos do que 100 nM. Preferivelmente, a referida proteína de ligação induz apoptose em células BT474 com um valor de EC50 de menor do que 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 nM.

[69] Células BT474 podem ser usadas para medir a capacidade funcional das proteínas de ligação da presente invenção para induzir apoptose por meios padrão bem conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, como mostrado no Exemplo 5. Preferivelmente, as células BT474, SKBR-3, NCI-N87, ZR75-30, HCC1419 ou MDA-MB175 podem ser usadas para medir a capacidade funcional dos compostos da presente invenção para induzir apoptose, por exemplo, como mostrado no Exemplo 5.

[70] As proteínas de ligação recombinantes que induzem apoptose em células BT474 com um valor de EC50 de menos do que 100 nM são descritas, e discutidas, no Exemplos 5.

[71] De acordo com a modalidade preferida, os referidos primeiro e segundo domínios de repetição são conectados por um polipeptídeo de ligação.

[72] O referido polipeptídeo de ligação pode, por exemplo, ser realizado por mera fusão genética dos cDNAs que codificam os respectivos domínios a serem fundidos. O referido tipo de modalidade qualifica como uma proteína de peptídeo de fusão com dois diferentes domínios de repetição.

[73] O ligante pode, por exemplo, consistir de um oligopeptídeo que compreende os aminoácidos G e S, ou P e T, respectivamente, como determinado em SEQ ID Nos: 7 a 12. De acordo com outra modalidade preferida, a “fração de multimerização” como descrito abaixo pode ser usada. Alternativamente, os dois domínios de repetição podem ser ligados um ao outro, por exemplo, por meios de ligantes químicos com base em não peptídeos.

[74] Preferivelmente, a proteína de ligação recombinante e/ou o domínio de repetição tem um ponto médio de temperatura de desnaturação (Tm) acima de 45°C, mais preferivelmente acima de 50°C, mais preferivelmente acima de 55°C, e ainda mais preferivelmente acima de 60°C com desdobramento térmico em PBS a pH 7.4. A proteína de ligação ou um domínio de repetição da presente invenção possui uma estrutura secundária e terciária definida sob condições fisiológicas. Desdobramento térmico do referido polipeptídeo resulta em uma perda de sua estrutura terciária e secundária, que pode ser seguido, por exemplo, por medições de dicroísmo circular (CD). O ponto médio de temperatura de desnaturação da proteína de ligação ou domínio de repetição com o desdobramento térmico corresponde a temperatura no ponto médio de transição cooperativa em tampão fisiológico com a desnaturação a calor da referida proteína ou domínio por lentamente aumentar a temperatura a partir de 10°C a cerca de 100°C. A determinação de um ponto médio de temperatura de desnaturação com o desdobramento térmico é bem conhecida daqueles versados na técnica. O referido ponto médio de temperatura de desnaturação de uma proteína de ligação ou domínio de repetição com o desdobramento térmico é indicativo de estabilidade térmica do referido polipeptídeo.

[75] Também preferido é a proteína de ligação recombinante e/ou domínio de repetição de anquirina que forma menos do que 5% (peso em peso) de agregados insolúveis em concentrações de até 20 g/L, preferivelmente até 40 g/L, mais preferivelmente até 60 g/L, ainda mais preferivelmente até 80 g/L, e ainda mais preferivelmente até 100 g/L quando incubados por mais de 5 dias, preferivelmente mais de 10 dias, mais preferivelmente mais de 20 dias, mais preferivelmente mais de 40 dias, e ainda mais preferivelmente mais de 100 dias a 37°C em PBS. A formação de agregados insolúveis pode ser detectada pela aparência de precipitações visuais, filtração de gel ou dispersão de luz dinâmica, o que fortemente aumenta com a formação de agregados insolúveis. Agregados insolúveis podem ser removidos a partir da amostra de proteína por centrifugação a 10’000 x g por 10 minutos. Preferivelmente, a proteína de ligação recombinante e/ou o domínio de repetição de anquirina forma menos do que 2%, mais preferivelmente menos do que 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1%, ou ainda mais preferivelmente menos do que 0,05% (peso em peso) de agregados insolúveis sob as condições de incubação mencionados a 37°C em PBS. Os percentuais de agregados insolúveis podem ser determinados por separação dos agregados insolúveis a partir da proteína solúvel, seguido por determinação das quantidades de proteína na fração solúvel e insolúvel por métodos de quantificação padrão.

[76] Também preferida é a proteína de ligação recombinante e/ou o domínio de repetição de anquirina que não perde a sua estrutura nativa tridimensional com a incubação em PBS contendo 100 mM de ditiotreitol (DTT) por 1 ou 10 horas a 37°C.

[77] Em uma modalidade particular a presente invenção se refere a uma proteína de ligação recombinante que compreendem dois domínios de repetição de anquirina, especificamente a ligação a HER2 e tendo o ponto médio de temperatura de desnaturação indicado ou preferido e as propriedades de não agregação como definidas acima.

[78] De acordo com outra modalidade preferida da presente invenção, é proporcionado que

[79] o referido primeiro domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72 e 114 a 121 e/ou

[80] o referido segundo domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 74 a 82.

[81] Os inventores evidenciaram que, fora dos referidos domínios de repetição, o primeiro domínio de repetição se liga ao domínio II de HER2, enquanto que o segundo domínio de repetição se liga ao domínio IV de HER2

[82] Preferivelmente, o referido primeiro domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 67 e 115 a 121. Mais preferivelmente, o referido primeiro domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62, 115, 120, e 121, em particular SEQ ID NO: 115 e 120. Também preferivelmente, o referido primeiro domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com a proteína de ligação selecionada a partir do grupo de DARPins #1 a 6 e 54 a 60; mais preferivelmente, com a proteína de ligação a partir do grupo de DARPins #1, 54, 59 e 60; em particular, com a proteína de ligação a partir do grupo de DARPins #54 e 60.

[83] Adicionalmente preferido, o referido segundo domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID Nos: 79 a 81, em particular SEQ ID NO: 80 e 81. Também preferivelmente, o referido segundo domínio de repetição compete para a ligação a HER2 com a proteína de ligação selecionada a partir do grupo de DARPins #18 a 20; em particular, com a proteína de ligação a partir do grupo de DARPins #19 e 20.

[84] De acordo ainda com outra modalidade preferida da presente invenção, é proporcionado que

[85] um primeiro domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72 e 114 a 121,

[86] um segundo domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 74 a 82,

[87] e em que adicionalmente,

[88] G na posição 1 e/ou S na posição 2 do referido domínio de repetição de anquirina estão opcionalmente faltando; e

[89] L na segunda última posição e/ou N na última posição do referido domínio de repetição de anquirina são opcionalmente trocados por A.

[90] Preferivelmente, o referido primeiro domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 67 e 115 a 121. Mais preferivelmente, o referido primeiro domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62, 115, 120, e 121, em particular SEQ ID NO: 115 e 120. Também preferivelmente, o referido primeiro domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com a proteína de ligação selecionada a partir do grupo que consiste de DARPins #1 a 6 e 54 a 60; mais preferivelmente, com a proteína de ligação a partir do grupo de DARPins #1, 54, 59 e 60; em particular, com a proteína de ligação a partir do grupo de DARPins #54 e 60.

[91] Adicionalmente preferido, o referido segundo domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 79 a 81, em particular SEQ ID NO: 80 e 81. Também preferivelmente, o referido segundo domínio de repetição compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com a proteína de ligação a partir do grupo que consiste de DARPins #18 a 20; em particular, com a proteína de ligação a partir do grupo de DARPins #19 e 20.

[92] Preferivelmente, o primeiro domínio de repetição de anquirina compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 % de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72 e 114 a 121.

[93] Preferivelmente, o segundo domínio de repetição de anquirina compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 % de identidade de sequência de amino ácido com um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 74 a 82.

[94] Também preferivelmente, o primeiro domínio de repetição de anquirina compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 % de identidade de sequência de amino ácido com um, dois ou três módulos de repetição de anquirina presentes entre os módulos de cobertura N-terminal e C-terminal de um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72 e 114 a 121.

[95] Também preferivelmente, o segundo domínio de repetição de anquirina compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 % identidade de sequência de amino ácido com um , dois ou três módulos de repetição de anquirina presentes entre os módulos de cobertura N-terminal e C-terminal de um domínio de repetição de anquirina selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 74 a 82.

[96] De acordo com ainda outra modalidade preferida da presente invenção, é proporcionado que

[97] o referido primeiro domínio de repetição é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72 e 114 a 121,

[98] o referido segundo domínio de repetição é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs:74 a 82

[99] e em que adicionalmente

[100] G na posição 1 e/ou S na posição 2 do referido domínio de repetição de anquirina estão opcionalmente faltando; e

[101] L na segunda última posição e/ou N na última posição do referido domínio de repetição de anquirina são opcionalmente trocados por A.

[102] Preferivelmente, o primeiro domínio de repetição de anquirina é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 67 e 115 a 121; mais preferivelmente, 115, 120, e 121; em particular, SEQ ID NO: 115 e 120.

[103] Preferivelmente, o segundo domínio de repetição de anquirina é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 79 a 81, em particular SEQ ID NO: 80 e 81.

[104] De acordo ainda com outra modalidade preferida da presente invenção, é proporcionado que

[105] o referido primeiro domínio de repetição compreende um módulo de repetição de anquirina tendo uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 15 a 18, 21 a 23, 37, 38, 125, 126, 129, 130, 133 e 134 e sequências, em que até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 15 a 18, 21 a 23, 37, 38, 125, 126, 129, 130, 133 e 134 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e/ou

[106] o referido segundo domínio de repetição compreende um módulo de repetição de anquirina tendo uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 46, 47, 51, 52, 55 e 56, e sequências, em que até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 46, 47, 51, 52, 55 e 56 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido.

[107] Preferivelmente, o referido módulo de repetição de anquirina do primeiro domínio de repetição de anquirina é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 15 a 18, 125, 126, 129, 130, 133 e 134; mais preferivelmente, 15, 125, 129 e 133; e ainda mais preferivelmente, 125 e 133.

[108] Preferivelmente, o referido módulo de repetição de anquirina do segundo domínio de repetição de anquirina é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 46, 47, 55 e 56; mais preferivelmente, 55 e 56.

[109] Também preferivelmente, até 8 aminoácidos nos módulos de repetição de SEQ ID NO: 15 a 18, 21 a 23, 37, 38, 46, 47, 51, 52, 55, 56, 125, 126, 129, 130, 133 e 134 são trocados por outro amino ácido, mais preferivelmente até 7 aminoácidos, mais preferivelmente até 6 amino ácidos, mais preferivelmente até 5 amino ácidos, ainda mais preferivelmente até 4 amino ácidos, mais preferivelmente até 3 amino ácidos, mais preferivelmente até 2 amino ácidos, e ainda mais preferivelmente 1 amino ácido.

[110] Preferivelmente, quando os amino ácidos são trocados em módulos de cobertura, módulos de repetição ou domínios de repetição, domínios de repetição, ou Proteínas de ligação, os referidos amino ácidos são substituídos por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; mais preferivelmente a partir do grupo que consiste de A, D, E, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, e Y. Também preferivelmente, um amino ácido é trocado por um amino ácido homólogo; isto é, um amino ácido é trocado por um amino ácido tendo uma cadeia lateral com propriedades biofísicas similares. Por exemplo, o amino ácido negativo carregado D pode ser substituído pelo amino ácido negativo carregado E, ou um amino ácido hidrófobo tal como L pode ser substituído por A, I ou V. As técnicas de troca de um amino ácido por outro amino ácido em um polipeptídeo são bem conhecidas daqueles versados na técnica.

[111] Preferivelmente, o módulo de repetição de acordo com a presente invenção tem uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de KDFQGITPLHIAATSGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 16 e sequências, nas quais até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 16 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e em que

[112] F na posição 3 é opcionalmente trocado por A

[113] Q na posição 4 é opcionalmente trocado por E;

[114] G na posição 5 é opcionalmente trocado por S;

[115] I na posição 6 é opcionalmente trocado por V;

[116] I na posição 11 é opcionalmente trocado por L;

[117] T na posição 14 é opcionalmente trocado por Q; e/ou

[118] S na posição 15 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de N e W.

[119] Um módulo de repetição mais preferido desse grupo tem uma sequência de amino ácido que consiste de KDFQGVTPLHIAAQSGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 125), SEQ ID NO: 129 ou SEQ ID NO: 133.

[120] Também preferivelmente, o módulo de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção tem uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de KDITGETPLHHAADSGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 18) e sequências, nas quais até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 18 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e em que

[121] I na posição 3 é opcionalmente trocado por V;

[122] E na posição 6 é opcionalmente trocado por D;

[123] H na posição 11 é opcionalmente trocado por L;

[124] D na posição 14 é opcionalmente trocado por Q;

[125] S na posição 15 é opcionalmente trocado por H; e/ou

[126] E na posição 19 é opcionalmente trocado por V.

[127] Um módulo de repetição mais preferido desse grupo tem uma sequência de amino ácido que consiste de KDVTGDTPLHLAAQHGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 126), SEQ ID NO: 130 ou SEQ ID NO: 134.

[128] Também preferivelmente, o módulo de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção tem uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de KDWEGTTPLHLAAHTGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 21) e sequências, nas quais até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 21 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e em que

[129] W na posição 3 é opcionalmente trocado por F;

[130] W na posição 4 é opcionalmente trocado por Q;

[131] T na posição 6 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de I, Y e V; preferivelmente T;

[132] L na posição 11 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de I e V; preferivelmente I e V;

[133] H na posição 14 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de H, Q, Y e W; preferivelmente H; e/ou

[134] T na posição 15 é opcionalmente deletado ou trocados por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de A e D.

[135] Também preferivelmente, o módulo de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção tem uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de KDTVGTTPLHYAAEDGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 22) e sequências, nas quais até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 22 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e em que

[136] T na posição 3 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de S, K, E e I; igual distribuição de amino ácido;

[137] V na posição 4 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de Q, I e Y; preferivelmente Y;

[138] T na posição 6 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de Q, F, R e W;

[139] Y na posição 11 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de L, E e S; preferivelmente S;

[140] E na posição 14 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de S, Q, Y e V; e/ou

[141] D na posição 15 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de S, F e Y.

[142] G na posição 16 é opcionalmente trocado por D.

[143] Também preferivelmente, o módulo de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção tem uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de KDVEGWTPLHYAASSGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 38) e sequências, nas quais até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 38 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e em que

[144] W na posição 6 é opcionalmente trocado por Q;

[145] Y na posição 11 é opcionalmente trocado por L; e/ou

[146] S na posição 15 é opcionalmente trocado por Y.

[147] Também preferivelmente, o módulo de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção tem uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo que consiste de KDWRGFTPLHYAAILGHLEIVEVLLKAGADVNA (SEQ ID NO: 46) e sequências, nas quais até 9 resíduos de amino ácido em SEQ ID NO: 46 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido, e em que

[148] W na posição 3 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de W, T, V e R ; preferivelmente, T e R;

[149] R na posição 4 é opcionalmente trocado por um amino ácido selecionado a partir do grupo que consiste de R, T e I; preferivelmente, I;

[150] F na posição 6 é opcionalmente trocado por F ou H; preferivelmente F;

[151] Y na posição 11 é opcionalmente trocado por R;

[152] Y na posição 14 é opcionalmente trocado por F;

[153] L na posição 15 é opcionalmente trocado por V; e/ou

[154] H na posição 17 é opcionalmente trocado por Q.

[155] Preferivelmente, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 resíduos de amino ácido em SEQ ID NOs: 16, 18, 28, 31. 21, 22, 38 e/ou 46 são substituídos por quaisquer outros resíduos de amino ácido.

[156] Adicionalmente, é particularmente preferido que a referida proteína de ligação compreenda um polipeptídeo, em que o referido polipeptídeo compreende os referidos primeiro e segundo domínios de repetição de anquirina e em que o referido polipeptídeo tem pelo menos 70% de identidade de sequência de amino ácido com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 83 a 98, 102, 103, 122, 123 e 136 a 141.

[157] Preferivelmente, o referido polipeptídeo compreende uma sequência de amino ácido que tem pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 % de identidade de sequência de amino ácido com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 83 a 98, 102, 103, 122, 123 e 136 a 141.

[158] Também preferivelmente, o referido polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 90, 91, 92, 98, 102, 103, 122 e 123; mais preferivelmente, 85, 86, 87, 90, 91, 92, 102, 103, 122 e 123; ainda mais preferivelmente, 86, 87, 91 e 92; e mais preferivelmente, 86 e 87.

[159] De acordo ainda com outra modalidade preferida, um ou mais dos resíduos de amino ácido dos módulos de repetição de anquirina dos referidos primeiro e segundo domínios de repetição de anquirina são trocados por um resíduo de amino ácido encontrado na posição correspondente em alinhamento de uma unidade de repetição de anquirina.

[160] Outra modalidade da presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos uma proteína de ligação ou um domínio de repetição de anquirina particular de acordo com a descrição acima. Ademais, um vetor que compreende a referida molécula de ácido nucleico é considerado.

[161] Nem todas as composições de ligação de acordo com a presente invenção compreendem polipeptídeos ou proteínas. A última modalidade apenas se refere àquelas que sim. Para as referidas, o requerente se abstém de descrever aqui todas as moléculas de ácido nucleico capazes de codificar as mesmas pelo fato que, em virtude da degeneração do código genético, muitas moléculas de ácido nucleico podem codificar um e o mesmo polipeptídeo ou proteína.

[162] Entretanto, pode ser inequivocamente e sem dúvida determinado se um determinado ácido nucleico codifica um determinado polipeptídeo ou proteína. Assim, a presente modalidade é clara para aqueles versados na técnica, e o seu âmbito é facilmente determinado.

[163] Outra modalidade da presente invenção proporciona o uso de uma proteína de ligação de acordo com a descrição acima para inibir pelo menos um de

[164] Dimerização do receptor HER2,

[165] Heterodimerização do receptor HER2/HER3,

[166] Autofosforilação do receptor HER2

[167] Transdução de sinal mediada a receptor de HER

[168] Fosforilação induzida a ligante de receptor de HER3, e/ou

[169] Transdução de sinal mediada a receptor de HER3.

[170] A dimerização do receptor HER2 (também chamada de “homodimerização”) ocorre em tecidos que superexpressam HER2 independente de um ligante. A referida homodimerização leva a uma autofosforilação intracelular que pode eventualmente levar, por exemplo, a uma maior proliferação celular.

[171] Pelo fato de HER3 ser desprovido de atividade intrínseca de quinase, HER3 é fosforilado em câncer de mama que se superexpressa em HER2 após a formação de heterodímeros HER2/HER3, que pode eventualmente resultar, por exemplo, em inibição da apoptose.

[172] O referido uso pode seja ocorrer in vitro seja in vivo. Como determinado acima, todos os referidos processos podem resultar em consequências patogênicas, ou seja, por ativar os respectivos trajetos de transdução de sinal. Os trajetos de transdução de sinal ativados pela dimerização de HER2 e/ou a heterodimerização do receptor HER2/HER3 incluem proteína quinase ativada a nitrogênio (MAPK), fosfoinositide 3-quinase (PI3K/Akt), fosfolipase C Y, proteína quinase C (PKC), Transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT), o trajeto de Ras-Map quinase e o trajeto de mTOR.

[173] O trajeto de fosfoinositide 3-quinase (PI3K/Akt) é, por exemplo, considerado ser um dos trajetos fundamentais que está mantendo a sobrevivência da célula pelo bloqueio da apoptose. A ativação patológica do mesmo, por exemplo, por heterodimerização do receptor HER2/HER3, pode assim levar a proliferação maligna (por exemplo, vide Exemplos)

[174] A ativação patológica de HER2, por exemplo, pela homodimerização de HER2, pode levar a migração, invasão ou proliferação de célula maligna, (por exemplo, vide Exemplos; Hynes NE. e Lane HA., Nat. Rev. Cancer., 5,341 - 54, 2005).

[175] Ainda outra modalidade da presente invenção proporciona uma formulação farmacêutica que compreendem uma proteína de ligação ou uma composição de acordo com a descrição acima, e opcionalmente um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[176] Veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos daqueles versados na técnica e são explicados em mais detalhes abaixo. Ainda adicionalmente, uma composição de diagnóstico que compreende um ou mais das proteínas de ligação recombinantes acima mencionadas, em particular as proteínas de ligação que compreendem domínios de repetição, é considerada.

[177] Uma formulação farmacêutica compreende proteínas de ligação recombinantes como descrito acima e um veículo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, como descrito em Remington's Farmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]. Veículos, excipientes ou estabilizantes adequados conhecidos daqueles versados na técnica são salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, óleos fixos, oleatyo de etila, 5% de dextrose em salina, substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, agentes de tamponamento e conservantes. Outros veículos adequados incluem quaisquer veículos que não induzam em si a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição tal como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, amino ácidos poliméricos e copolímeros de amino ácido.

[178] As formulações a serem usadas para a administração in vivo devem ser assépticas ou estéreis. Isso é prontamente realizado por filtragem através de membranas de filtragem estéreis. A formulação farmacêutica pode ser administrada por qualquer método adequado dentro do conhecimento daqueles versados na técnica.

[179] Ademais, em outra modalidade da presente invenção o uso de pelo menos uma proteína de ligação, composição ou formulação farmacêutica de acordo com a descrição acima como um medicamento é proporcionado. Da mesma forma, um processo que compreende administrar a proteína de ligação, composição ou formulação farmacêutica de acordo com as reivindicações acima mencionadas a um paciente é proporcionado. Em ambos os casos, é preferido que a doença a ser tratada seja uma doença neoplástica, preferivelmente câncer.

[180] Em cada caso, uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação, composição ou formulação farmacêutica de acordo com as reivindicações acima mencionadas é preferivelmente administrada a um paciente para tratar a doença.

[181] O termo “doença neoplástica”, como usado aqui, se refere a um estado anormal ou condição de células ou tecido caracterizada por rapidamente proliferar o desenvolvimento celular ou neoplasma. Em um sentido mais específico, o termo se refere a processos cancerosos, por exemplo, tumores e/ou leucemias.

[182] A Proteínas de ligação de acordo com a presente invenção demonstrou efeitos apoptóticos e anti-proliferativos (vide seção experimental). As doença neoplásticas são com frequência caracterizadas por supressão da apoptose e/ou uma maior proliferação, é plausível se deduzir, a partir dos referidos experimentos, que as proteínas de ligação de acordo com a presente invenção podem ser usadas no tratamento de doença neoplásticas.

[183] Preferivelmente, a referida doença neoplástica é uma doença caracterizada por pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste de

[184] Amplificação do gene que codifica HER2

[185] Superexpressão do gene que codifica HER2,

[186] Expressão da forma em mutação do gene que codifica HER2, e/ou

[187] Superexpressão do gene que codifica Her3 em tumores resistentes a trastuzumab.

[188] Em seres humanos, HER2 é codificada pelo gene ERBB2. As opções acima podem ser atribuídas a mutações no gene ERBB2 que podem ser detectadas por meio de diagnósticos moleculares modernos, como estão atualmente no mercado.

[189] Como usado aqui, o termo “expressão do gene que codifica HER2” está relacionada a células, tecidos ou órgãos que expressam a proteína receptor de HER2, como, por exemplo, detectada por imunohistoquímica (IHC). Como usado aqui, O termo “amplificação ou superexpressão do gene que codifica HER2” está relacionado para indicar um nível anormal de expressão da proteína receptor de HER2 em uma célula, tecido ou órgão, relativa ao nível de expressão em uma célula, tecido ou órgão normal, como, por exemplo, detectado por Imunohistoquímica (IHC).

[190] Os referidos testes de detecção por IHC são conhecidos na técnica e incluem o Clinical Trial Assay (CTA), o teste oferecido no comércio pela LabCorp 4D5, e o HercepTest® oferecido no comércio pela DAKO (DAKO, Carpinteria, Calif.). o último teste usa uma faixa de pontuação específica de coloração de célula de 0 a 3+ (0 sendo a expressão normal, 3+ o que indica a expressão mais forte positiva) para identificar cânceres tendo a superexpressão da proteína HER2. Assim, os pacientes tendo um câncer caracterizado pela superexpressão da proteína HER2 na faixa de 1+, 2+, ou 3+, preferivelmente 2+ ou 3+, mais preferivelmente 3+ se beneficiaria dos métodos de terapia da presente invenção.

[191] Alternativamente, a pontuação da expressão e/ou a superexpressão de Her2 pode também ser detectada por métodos de hibridização In Situ (ISH), RT-PCT e outros métodos.

[192] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, a referida doença neoplástica é pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste

[193] cânceres de mama

[194] câncer de ovário,

[195] câncer gástrico,

[196] câncer de estômago, e/ou

[197] câncer uterino.

[198] câncer colonretal.

[199] Adicionalmente, o referido uso é preferivelmente complementado, em um modo coordenado, pela administração de pelo menos uma substância ativa selecionada a partir do grupo que consiste de

[200] um agente antineoplástico

[201] um fármaco endócrino,

[202] uma vacina de tumor,

[203] imunoterapia, e/ou

[204] terapia celular.

[205] O termo “complementado, em um modo coordenado”, como usado aqui, deve se referir a coadministração, que é realizada sob um determinado regime. Isso inclui a administração sincrônica de diferentes compostos assim como a administração deslocada no tempo de diferentes compostos (por exemplo, o composto A é dado uma vez e o composto B é dado diversas vezes posteriormente, ou vice versa, ou ambos os compostos são dados sincronicamente e um dos dois é também dado em estágios posteriores).

[206] Como usado aqui, o termo “agente antineoplástico” se refere a um fármaco, ou uma combinação de fármacos, que têm efeitos antineoplásticos ou anticancerígenos. Isso se aplica, acima de tudo, a agentes quimioterápicos, que funcionam por prejudicar a mitose, efetivamente que têm como objetivo a rápida divisão das células, ou por fazer com que as células sofram apoptose. A maioria dos fármacos quimioterápicos pode ser dividida em agentes de alquilação, antimetabólitos, antraciclinas, alcaloides vegetais, inibidores de topoisomerase, e outros agentes antitumour.

[207] Agentes antineoplásticos preferidos são 5-fluorouracila, actinomicina, adriamicina, amsacrina, antraciclinas, azatioprina, bendamustina, bleomicina, carboplatina, clorambucila, cisplatina, ciclofosfamida, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, etoposida, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, meclorethamina, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, oxaliplatina, paclitaxel, plicamicina, podofilotoxina, teniposida, topotecan, valrubicina, vinblastina, vincristina, vincristina, vindesina, e/ou vinorelbina.

[208] A imunoterapia envolve o isolamento de proteínas a partir de células de câncer e a subsequente imunização de pacientes com câncer contra as referidas proteínas, na esperança de estimular uma reação imune que irá matar as células de câncer. Outra abordagem par a vacinação terapêutica anticâncer é de gerar a resposta imune in situ no paciente. Isso aumenta a resposta imune anti-tumor aos antígenos de tumor liberados em seguida da replicação do vírus lítico proporcionando uma vacina antitumor específica para o paciente in situ, como um resultado. Ainda outra abordagem é de imunizar o paciente com um composto que desempenha um papel fisiológico na gênese do câncer, de modo que o corpo humano elimine o referido composto.

[209] Os fármacos objetivados são um tipo de medicação que bloqueia o desenvolvimento de células de câncer por interferir com as moléculas objetivadas específicas necessárias para a carcinogênese e desenvolvimento do tumor, em vez de por simplesmente interferir com as células que rapidamente se dividem (por exemplo, com a quimioterapia tradicional). As principais categorias de terapia objetivada são as pequenas moléculas e os anticorpos monoclonais.

[210] As pequenas moléculas que se inserem na referida definição englobam, mas não são limitadas a, Lapatinib, Neratinib, Afatinib, Imatinib, Gefitinib, Erlotinib, Bortezomib, inibidores de Bcl-2 (por exemplo, Obatoclax, ABT-263, e Gossypol), inibidores de PARP (por exemplo, Iniparib, Olaparib), inibidores de Janus quinase, inibidores de PI3K, Apatinib, inibidores de mTOR (Everolimus), AN-152, inibidores de AKT, inibidores de HDAC, inibidores de proteassomo, Doxorubicina ligada a [D-Lis(6)]-LHRH, Pegaptanib, Sunitinib, Sorafenib, Tivozanib e Pazopanib. Anticorpos monoclonais que se inserem na referida definição englobam, mas não são limitadas a, Rituximab, trastuzumab, trastuzumab-TDM1, pertuzumab, cetuximab e bevacizumab.

[211] Fármacos endócrinos, como usados aqui, são fármacos que são antagonísticos a hormônios ou receptores de hormônio e assim interferem com os tipos de câncer que requeiram hormônios para se desenvolver. Um exemplo do referido fármaco endócrino é Tamoxifen, que é um antagonista do receptor de estrogênio no tecido da mama.

[212] O termo “terapia celular”, como usado aqui, deve se referir a terapias com base em célula tais como transferência adotiva de células modificadas, ou não modificadas, citotóxicas, linfócitos ou dendríticas.

[213] O termo “vacina de tumor”, como usado aqui, se refere a vacinas que ou a) evita as infecções com vírus que causam câncer (o modo de ação é similar ao das outras vacinas contra infecções virais), b) tratar câncer existente (vacinas de câncer terapêuticas) ou c) evitar o desenvolvimento de câncer, ou melhorar os seus efeitos (vacinas profiláticas de câncer).

[214] Adicionalmente ou alternativamente ao mesmo, o referido uso é preferivelmente complementado, em um modo coordinado, por pelo menos um outro tratamento selecionado a partir do grupo que consiste de

[215] radioterapia

[216] cirurgia, e/ou

[217] ablação a laser

[218] Adicionalmente, um método de tratamento de um ser humano ou indivíduo animal é proporcionado cujo método compreende o uso de acordo com a descrição acima. Preferivelmente, o referido método de tratamento se refere a uma indicação como determinado na descrição acima. O método compreende administrar, a um ser humano ou animal em necessidade do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação recombinante da presente invenção.

[219] A proteína de ligação recombinante ou domínio de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção pode ser obtida e/ou adicionalmente envolvida por diversos métodos tal como aparecimento na superfície de bacteriofagos (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 1990/002809, WO 2007/006665) ou células bacterianas (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 1993/ 010214), aparecimento no ribossomo (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 1998/048008), aparecimento em plasmídeos (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 1993/008278) ou por usar construtores híbridos de proteína de repetição de RNA covalente (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2000/032823), ou expressão intracelular e seleção / varredura tal como por teste de complementação de proteína (pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 1998/341120). Os referidos métodos são conhecidos daqueles versados na técnica.

[220] Uma biblioteca de proteínas de repetição de anquirina usada para a seleção/varredura de uma proteína de ligação recombinante ou domínio de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção pode ser obtida de acordo com os protocolos conhecidos daqueles versados na técnica (WO 2002/020565, Binz, H.K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489 - 503, 2003, e Binz et al., 2004, loc. cit). O uso das referidas bibliotecas para a seleção de domínios de repetição de anquirina com especificidade para a região extracelular de HER2 é exemplificado no Exemplo 1. Adicionalmente, os domínios de repetição de anquirina da presente invenção podem ser modularmente montados a partir de módulos de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção e módulos de cobertura ou repetições de cobertura apropriados (Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003) usando tecnologias recombinantes de DNA padrão (por exemplo, WO 2002/020565, Binz et al., 2003, loc. cit. e Binz et al., 2004, loc. cit).

[221] A presente invenção não é restrita às modalidades particulares descritas nos Exemplos. Outras fontes podem ser usadas e processadas seguindo os preceitos gerais descritos abaixo.

[222] Definições

[223] O termo “proteína” se refere a um polipeptídeo, em que pelo menos parte do polipeptídeo tem, ou é capaz de adquirir um arranjo tridimensional definido por formar estruturas secundárias, terciárias, ou quaternárias dentro de e/ou entre a(s) sua(s) cadeia(s) de polipeptídeo(s). Se a proteína compreende dois ou mais polipeptídeos, as cadeias de polipeptídeo individuais podem ser ligadas não-covalentemente ou covalentemente, por exemplo, por uma ligação bissulfeto entre dois polipeptídeos. A parte da proteína, que individualmente tem, ou é capaz de adquirir, um arranjo tridimensional definido por formar estruturas secundárias ou terciárias, é denominado de “domínio de proteína”. Os referidos domínios de proteína são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[224] O termo “recombinante” como usado em proteína recombinante, domínio de proteína recombinante, proteína de ligação recombinante e semelhante, quer dizer que os referidos polipeptídeos são produzidos pelo uso de tecnologias de DNA recombinante bem conhecidas daqueles versados na técnica relevante. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante (por exemplo, produzida por síntese de gene) que codifica um polipeptídeo pode ser clonada em um plasmídeo de expressão bacteriana (por exemplo, pQE30, Qiagen), plasmídeo de expressão de levedura ou plasmídeo de expressão de mamífero. Quando, por exemplo, o referido plasmídeo de expressão bacteriana recombinante construído é inserido em uma bactéria apropriada (por exemplo, Escherichia coli), a referida bactéria pode produzir o polipeptídeo codificado pelo referido DNA recombinante. O polipeptídeo produzido de modo correspondente é chamado de um polipeptídeo recombinante.

[225] No contexto da presente invenção, o termo “polipeptídeo” se refere a uma molécula que consiste de uma ou mais cadeias de múltiplos, isto é, dois ou mais, amino ácidos ligados via ligações de peptídeo. Preferivelmente, um polipeptídeo consiste de mais do que oito amino ácidos ligados via ligações de peptídeo.

[226] O termo “marcação de polipeptídeo” se refere a uma sequência de amino ácido fixada a um polipeptídeo/proteína, em que a referida sequência de amino ácido é útil para a purificação, detecção, ou objetivação do referido polipeptídeo/proteína, ou em que a referida sequência de amino ácido aprimora o comportamento físico-químico do polipeptídeo/proteína, ou em que a referida sequência de amino ácido possui uma função efetora. As marcações individuais de polipeptídeos, frações e/ou domínios da proteína de ligação podem ser conectados um ao outro diretamente ou via polipeptídeos de ligação. As referidas marcações de polipeptídeo são todas bem conhecidas na técnica e estão completamente disponíveis para aqueles versados na técnica. Exemplos de marcações de polipeptídeo são pequenas sequências de polipeptídeo, por exemplo, His (por exemplo, a marcação His de SEQ ID NO: 6), myc, FLAG, ou marcações Strep ou frações tais como enzimas (por exemplo enzimas tais como fosfatase alcalina), que permitem a detecção do referido polipeptídeo/proteína, ou frações que podem ser usadas para objetivar moléculas (tais como imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas) e/ou como moléculas efetoras.

[227] O termo “polipeptídeo de ligação” se refere a uma sequência de amino ácido, que é capaz de ligar, por exemplo, dois domínios de proteína, uma marcação de polipeptídeo e um domínio de proteína, um domínio de proteína e uma fração não polipeptídeo tal como polietileno glicol ou duas marcações de sequência. Os referidos domínios adicionais, marcações, frações não polipeptídeo e ligantes são conhecidos daqueles versados na técnica relevante. Uma lista de exemplos é proporcionada na descrição do pedido de patente WO 2002/020565. Exemplos particulares dos referidos ligantes são ligantes de glicina-serina e ligantes de prolina-treonina de comprimentos variáveis; preferivelmente, os referidos ligantes têm um comprimento entre 2 e 24 amino ácidos; mais preferivelmente, os referidos ligantes têm um comprimento entre 2 e 16 amino ácidos. Exemplos de ligantes de glicina-serina são proporcionados em SEQ ID NO: 7 a 10 e exemplos de ligantes de prolina-treonina são proporcionados em SEQ ID NO: 11 e 12. Preferivelmente, o ligante de prolina-treonina de SEQ ID NO: 11 é precedido por GS e/ou seguido por GS.

[228] O termo “fração de polímero” se refere ou a uma fração de polímero proteica ou a fração de polímero não proteica. A “fração de polímero proteica” preferivelmente é um polipeptídeo que não forma uma estrutura terciária estável. Exemplos de frações de polímero proteicas são XTEN® (uma marca registrada de Amunix; pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2007/103515) polipeptídeos, ou polipeptídeos que compreendem resíduos de prolina, alanina e serina como descrito em pedido de patente internacional publicado sob o No. WO 2008/155134. As referidas frações de polímero proteicas podem ser covalentemente fixadas a, por exemplo, um domínio de repetição da presente invenção pela geração de polipeptídeos de fusão genética usando tecnologias de clonagem de DNA padrão, seguido pela expressão e purificação padrão dos mesmos. Uma “fração de polímero não proteica” é uma fração de polímero não construída a partir de polipeptídeos. Exemplos de frações de polímero não proteicas são amido de hidroxietila (HES), polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquileno. O termo “Peguilado” quer dizer que a fração PEG é covalentemente fixada a, por exemplo, um polipeptídeo da presente invenção. A fração de polímero da presente invenção pode variar amplamente em peso molecular. Preferivelmente, a referida fração de polímero é conectada por um polipeptídeo de ligação a um domínio de repetição.

[229] Em uma modalidade específica, a fração PEG ou qualquer outro polímero não proteico pode, por exemplo, ser acoplada a uma cisteína tiol via um ligante de maleimida com a cisteína sendo acoplada via um peptídeo ligante ao N- ou C-término de um domínio de repetição como descrito aqui.

[230] O termo “proteína de ligação” se refere a uma proteína que compreendem um ou mais domínios de ligação, um ou mais compostos bioativos e uma ou mais frações de polímero como adicionalmente explicado abaixo. Preferivelmente, a referida proteína de ligação compreende até quatro domínios de ligação. Adicionalmente, qualquer referida proteína de ligação pode compreender domínios de proteína adicionais que não são domínios de ligação, frações de multimerização, marcações de polipeptídeo, polipeptídeos de ligação e/ou um único resíduo Cis.

[231] Exemplos de “frações de multimerização” são regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina cujo par proporciona domínios Fc de imunoglobulina funcional, e zippers de leucina ou polipeptídeos que compreendem um tiol livre que forma uma ligação bissulfeto intermolecular entre dois dos referidos polipeptídeos. O único resíduo Cis pode ser usado para conjugar outras frações em polipeptídeo, por exemplo, por usar a química de maleimida bem conhecida daqueles versados na técnica. Preferivelmente, a referida proteína de ligação é uma proteína de ligação recombinante. Também preferivelmente, os domínios de ligação de proteína de ligação possuem diferentes especificidades alvo.

[232] O termo “compete para ligação” quer dizer a incapacidade de dois diferentes domínios de ligação da presente invenção de se ligar simultaneamente ao mesmo alvo, enquanto ambos são capazes de se ligar ao mesmo alvo individualmente. Assim, os referidos dois domínios de ligação competem para a ligação ao referido alvo. Preferivelmente, os referidos dois domínios de ligação que competem se ligam a uma sobreposição ou ao mesmo epítopo de ligação no referido alvo. Métodos, tais como a competição do Teste de Imunoabsorção Ligado a Enzima (ELISA) ou competição de medições SPR (por exemplo, por usar o instrumento Proteon da BioRad), para determinar se dois domínios de ligação competem para a ligação a um alvo, são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[233] O termo “proteína de ligação multiparatópica” quer dizer uma proteína de ligação direcionada contra dois ou mais diferentes epítopos localizados na mesma proteína alvo. Por exemplo, a proteína de ligação multiparatópica que tem como objetivo o HER2 compreende pelo menos um primeiro domínio de ligação que tem como objetivo um primeiro epítopo em HER2, um segundo domínio de ligação que tem como objetivo um diferente segundo epítopo em HER2, e opcionalmente um domínio de ligação adicional que tem como objetivo epítopos adicionais em HER2.

[234] O termo “proteína de ligação biparatópica” quer dizer uma proteína de ligação direcionada contra dois diferentes epítopos localizados na mesma proteína alvo. Por exemplo, a proteína de ligação biparatópica que tem como objetivo o HER2 compreende pelo menos um primeiro domínio de ligação que tem como objetivo um primeiro epítopo em HER2 e um segundo domínio de ligação que tem como objetivo um diferente segundo epítopo em HER2. De modo correspondente, um “DARPin biparatópico” compreende um primeiro domínio de ligação contra um primeiro epítopo e um segundo domínio de ligação contra um diferente segundo epítopo na mesma molécula alvo.

[235] O termo “composto bioativo” se refere a um composto que é modificador de doença quando aplicado a um mamífero tendo a referida doença. Um composto bioativo pode ter propriedades antagonísticas ou agonísticas e pode ser um composto bioativo proteico ou um composto bioativo não proteico. Os referidos compostos bioativos proteicos podem ser covalentemente fixados a, por exemplo, um domínio de ligação da presente invenção pela geração de polipeptídeos de fusão genética usando tecnologias de clonagem de DNA padrão, seguido pela expressão e purificação padrão dos mesmos. Os referidos compostos bioativos não proteicos podem ser covalentemente fixados a, por exemplo, um domínio de ligação da presente invenção por meios químicos, por exemplo, por acoplar a cisteína tiol por meio de um ligante maleimida com a cisteína sendo acoplada por meio de um peptídeo ligante ao N- ou C-término de um domínio de ligação como descrito aqui. Exemplos de compostos bioativos proteicos são domínios de ligação tendo uma especificidade alvo distinta (por exemplo, neutralizando um fator de crescimento ao se ligar a mesma), citocinas (por exemplo, interleucinas), fatores de crescimento (por exemplo, hormônio de crescimento humano), anticorpos e fragmentos do mesmo, hormônios (por exemplo, GLP-1) e qualquer fármaco proteico possível. Exemplos de compostos bioativos não proteicos são, toxinas (por exemplo, DM1 a partir de ImmunoGen), moléculas pequenas que têm como objetivo o GPCRs, antibióticos e qualquer fármaco não proteico possível.

[236] O termo “domínio de ligação” quer dizer um domínio de proteína que exibe as mesmas “vezes” (arranjo tridimensional) como uma armação de proteína e tendo uma predeterminada propriedade, como definida abaixo. O referido domínio de ligação pode ser obtido por técnicas de engenharia racional, ou mais comumente, de proteína combinatorial, conhecidas daqueles versados na técnica (Binz et al., 2005, loc. cit.). Por exemplo, um domínio de ligação tendo uma predeterminada propriedade pode ser obtido por um método que compreende as etapas de (a) proporcionar uma coleção diversa de domínios de proteína que exibem a mesma duplicação que a armação de proteína como definida adicionalmente abaixo; e (b) varrer a referida coleção diversa e/ou selecionar a partir da referida coleção diversa para se obter pelo menos um domínio de proteína tendo a referida predeterminada propriedade. A coleção diversa de domínios de proteína pode ser proporcionada por diversos métodos de acordo com o sistema de varredura e/ou de seleção sendo usado, e pode compreender o uso de métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica, tal como fage display ou ribossomo display. Preferivelmente, o referido domínio de ligação é um domínio de ligação recombinante. Também preferivelmente, o referido domínio de ligação é uma proteína de repetição ou uma proteína de repetição projetada.

[237] Desse modo, O termo “se liga ao”, como usado aqui, se refere a um domínio de ligação que reconhece e se liga a um determinado alvo, mas não substancialmente reconhece ou se liga a outros alvos. Preferivelmente, a constante de dissociação em PBS de menos do que 10-7M é necessária para um candidato para quantificar como um domínio de ligação no significado da presente invenção.

[238] O termo “Kd” se refere a constante de dissociação, que é um tipo específico de constante de equilíbrio que mede a propensão de um objeto maior de se separar (dissociar) de modo reversível em componentes menores, como quando um complexo se separa em suas moléculas componentes.

[239] Métodos para determinar as constantes de dissociação das interações de proteína-proteína, tal como ressonância de plasmon de superfície (SPR) com base em tecnologias (por exemplo, análise de equilíbrio SPR) ou calorimetria de titulação isotermal (ITC) são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Os valores Kd medidos de uma interação proteína-proteína particular podem variar se medidos sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, as medições de dos valores de Kd são preferivelmente produzidas com soluções padronizadas de proteína e um tampão padronizado, tal como PBS.

[240] O termo “PBS” quer dizer uma solução de água tamponada a fosfato contendo 137 mM de NaCl, 10 mM de fosfato e 2,7 mM de KCl e tendo um pH de 7.4.

[241] O termo “armação de proteína” quer dizer uma proteína com áreas de superfície expostas nas quais as inserções de amino ácido; substituições ou deleções são altamente toleráveis. Exemplos de armações de proteína que podem ser usadod para gerar domínios de ligação da presente invenção são anticorpos ou fragmentos dos mesmos tal como Fv de cadeia única ou fragmentos de Fab, proteína A a partir de Stafilococcus aureus, a proteína de ligação bilina a partir de Pieris brassicae ou outras lipocalinas, proteínas de repetição de anquirina ou outras proteínas de repetição, e fibronectina humana. Armações de proteína são conhecidas daqueles versados na técnica (Binz et al., 2005, loc. cit.; Binz et al., 2004, loc. cit.).

[242] O termo “alvo” se refere a uma molécula individual tal como uma molécula de ácido nucleico, um polipeptídeo ou proteína, um carbohidrato, ou qualquer outra molécula de ocorrência natural, incluindo qualquer parte da referida molécula individual, ou complexos de duas ou mais das referidas moléculas. O alvo pode ser uma célula total ou uma amostra de tecido, ou o mesmo pode ser qualquer molécula ou fração não natural. Preferivelmente, o alvo é um polipeptídeo que ocorre naturalmente ou um polipeptídeo não natural ou um polipeptídeo contendo modificações químicas, por exemplo, modificado por fosforilação natural ou não natural, acetilação, ou metilação. Na aplicação particular da presente invenção, o alvo é a região extracelular de HER2.

[243] O termo “predeterminada propriedade” se refere a uma propriedade tal como a ligação a um alvo, o bloqueio de um alvo, ativação de uma reação mediada a alvo, atividade enzimática, e propriedades adicionais relacionadas. Dependendo do tipo de propriedade desejada, aqueles versados na técnica serão capazes de identificar o formato e as etapas necessárias para realizar a varredura e/ou a seleção de um domínio de ligação com a propriedade desejada. Preferivelmente, a referida predeterminada propriedade é a ligação a um alvo.

[244] As definições daqui em diante para as proteínas de repetição são com base naquelas dos pedidos de patente WO 2002/020565. O pedido de patente WO 2002/020565 adicionalmente contém uma descrição geral de características de proteína de repetição, técnicas e aplicações.

[245] O termo “proteína de repetição” se refere a uma proteína que compreende um ou mais domínios de repetição. Preferivelmente, cada uma das referidas proteínas de repetição compreende até quatro domínios de repetição. Mais preferivelmente, cada uma das referidas proteínas de repetição compreende até dois domínios de repetição. Mais preferivelmente, cada uma das proteínas de repetição compreende apenas um domínio de repetição. Adicionalmente, a referida proteína de repetição pode compreender domínios de proteína de não repetição adicionais, marcações de polipeptídeo e/ou polipeptídeos de ligação.

[246] O termo “domínio de repetição” se refere a um domínio de proteína que compreende duas ou mais unidades de repetição consecutivas (módulos) como unidades estruturais, em que as referidas unidades estruturais têm a mesma duplicação, e se empilham apertadamente para criar uma estrutura superhelicoidal tendo um núcleo de junta hidrófobo. Preferivelmente, um domínio de repetição adicionalmente compreende uma unidade de cobertura N-terminal e/ou a C-terminal (ou módulo). Ainda mais preferivelmente, as referidas Unidades de cobertura N-terminal e/ou C-terminal (ou módulos) são repetição de coberturas.

[247] O termo “proteína de repetição projetada” e “domínio de repetição projetado” se refere a uma proteína de repetição ou domínio de repetição, respectivamente, obtido como o resultado do procedimento da presente invenção explicado no pedido de patente WO 2002/020565. Proteínas de repetição projetadas e domínios de repetição projetados são sintéticos e não a partir da natureza. Os mesmos são proteínas ou domínios produzidos pelo homem, respectivamente, obtidos por expressão de ácidos nucleicos projetados de modo correspondente. Preferivelmente, a expressão é realizada em células eucariótica ou procarióticas, tais como células bacterianas, ou por usar um sistema de expressão in vitro livre de célula. Desse modo, uma proteína de repetição de anquirina projetada (isto é, um DARPin) corresponde a uma proteína de ligação recombinante da presente invenção que compreende pelo menos um domínio de repetição de anquirina.

[248] O termo “unidade estrutural” se refere a uma parte de um polipeptídeo localmente ordenad, formada por interações tridimensionais entre dois ou mais segmentos de estrutura secundaria que estão próximas uma da outra ao longo de uma cadeia de polipeptídeo. A referida unidade estrutural exibe um motivo estrutural. O termo “motivo estrutural” se refere a um arranjo tridimensional de elementos de estrutura secuhdária presentes em pelo menos uma unidade estrutural. Motivos estruturais são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Unidades estruturais isoladamente não são capazes de adquirir um arranjo tridimensional definido; entretanto, os seus arranjos consecutivos, por exemplo, como módulos de repetição em um domínio de repetição, levam a uma mútua estabilização de unidades vizinhas que resultam em uma estrutura superhelicoidal.

[249] O termo “unidade de repetição” se refere uma sequências de amino ácido que compreende motivos de sequência de repetição de uma ou mais proteínas de repetição que ocorrem naturalmente, em que as referidas “unidades de repetição” são encontradas em múltiplas copias, e que exibem uma topologia de duplicação definida comum a todos os referidos motivos que determinam a duplicação da proteína. As referidas unidades de repetição correspondem às “unidades estruturais de repetição (repetições)” de proteínas de repetição como descrito por Forrer et al., 2003, loc. cit. ou the “unidades estruturais homólogas consecutivas (repetições)” de proteínas de repetição como descrito por Binz et al, 2004, loc. cit.. As referidas unidades de repetição compreendem resíduos de estrutura e resíduos de interação. Exemplos das referidas unidades de repetição são unidades de repetição de armadillo, unidades de repetição ricas em leucina, unidades de repetição de anquirina, unidades de repetição de tetratricopeptídeo, unidades de repetição de HEAT, e unidades de repetição variantes ricas em leucina. As proteínas de ocorrência natural contendo duas ou mais das referidas unidades de repetição são referidas como as “proteínas de repetição que ocorrem naturalmente”. As sequências de amino ácido das unidades de repetição individuais de uma proteína de repetição pode ter um número significante de mutações, substituições, adições e/ou deleções quando comparado um ao outro, ao mesmo tempo em que ainda retém o padrão geral, ou o motivo, das unidades de repetição.

[250] Desse modo, O termo “unidade de repetição de anquirina” deve significar que a unidade de repetição, que é uma repetição de anquirina como descrito, por exemplo, por Forrer et al., 2003, loc. cit.. as repetições de anquirina são bem conhecidas daqueles versados na técnica. O termo “domínio de repetição de anquirina” se refere a um domínio de repetição que compreende duas ou mais unidades de repetição de anquirina consecutivas (módulos) como unidades estruturais, e, preferivelmente, uma unidade de cobertura N-terminal e/ou C-terminal (ou módulo).

[251] O termo “resíduos de estrutura” se refere a resíduos de amino ácido das unidades de repetição, ou os resíduos de amino ácido correspondentes dos módulos de repetição, que contribuem para a topologia de duplicação, isto é, que contribui para a duplicação da referida unidade de repetição (ou módulo) ou que contribui para a interação com a unidade vizinha (ou módulo). A referida contribuição deve ser a interação com outros resíduos na unidade de repetição (ou módulo), ou a influência na conformação da estrutura do polipeptídeo como encontrado em a-hélices ou ß-folhas, ou estiramentos de amino ácido que formam polipeptídeos lineares ou alças.

[252] O termo “resíduos de interação alvo” se refere a resíduos de amino ácido das unidades de repetição, ou os resíduos de amino ácido correspondentes dos módulos de repetição, que contribuem para a interação com substâncias alvo. A referida contribuição deve ser a direta interação com as substâncias alvo, ou a influência nos outros resíduos que interagem diretamente, por exemplo, por estabilizar a conformação do polipeptídeo da unidade de repetição (ou módulo) para permitir ou aumentar a interação de resíduos de interação direta com o referido alvo. A referida estrutura e os resíduos de interação alvo podem ser identificados por análise dos dados estruturais obtidos por métodos físico-químicos, tal como cristalografia de raio X, nMR e/ou espectroscopia de CD, ou por comparação com informação conhecida e estrutural relacionada bem conhecida daqueles versados na técnica de biologia estrutural e/ou bioinformáticas.

[253] Preferivelmente, as unidades de repetição usadas para a dedução de um motivo de sequência de repetição são unidades de repetição homólogas, em que as unidades de repetição compreendem o mesmo motivo estrutural e em que mais do que 70% dos resíduos de estrutura das referidas unidades de repetição são homólogas um com relação ao outro. Preferivelmente, mais do que 80% dos resíduos de estrutura das referidas unidades de repetição são homólogas. Ainda mais preferivelmente, mais do que 90% dos resíduos de estrutura das referidas unidades de repetição são homólogas. Programas de computação para determinar o percentual de homologia entre os polipeptídeos, tal como Fasta, Blast ou Gap, são conhecidos daqueles versados na técnica. Ainda preferivelmente, as unidades de repetição usadas para a dedução de um motivo de sequência de repetição são unidades de repetição homólogas obtidas a partir de domínios de repetição selecionados em um alvo definido.

[254] O termo “motivo de sequência de repetição” se refere a uma sequência de amino ácido, que é deduzido a partir de uma ou mais unidades de repetição ou módulos de repetição. Preferivelmente, as referidas unidades de repetição ou módulos de repetição são a partir de domínios de repetição tendo especificidade de ligação para o mesmo alvo. Os referidos motivos de sequência de repetição compreendem uma posição de resíduo de estrutura e posição de resíduo de interação alvo. A referida posição de resíduo de estrutura corresponde às posições de resíduos de estrutura das unidades de repetição (ou módulos). Da mesma forma, a referida posição de resíduo de interação alvo corresponde às posições de resíduos de interação alvo das unidades de repetição (ou módulos). Motivos de sequência de repetição compreendem posições fixas e posições aleatórias. O termo “posição fixa” se refere a uma posição de amino ácido em um motivo de sequência de repetição, em que a referida posição é ajustada a um amino ácido particular. Com mais frequência, as referidas posições fixas correspondem às posições de resíduos de estrutura e/ou às posições de resíduos de interação alvo que são específicas para um determinado alvo. O termo “posição aleatória” se refere a uma posição de amino ácido em um motivo de sequência de repetição, em que dois ou mais amino ácidos são permitidos na referida posição de amino ácido, por exemplo, em que qualquer um dos vinte aminoácidos usuais de ocorrência natural são permitidos, ou em que a maioria dos vinte aminoácidos de ocorrência natural são permitidos, tal como amino ácidos diferentes de cisteína, ou amino ácidos diferentes de glicina, cisteína e prolina. Ainda mais frequentemente, as referidas posições aleatórias correspondem às posições de resíduos de interação alvo. Entretanto, algumas posições de resíduos de estrutura podem também ser aleatórias.

[255] O termo “topologia de duplicação” se refere à estrutura terciária das referidas unidades de repetição ou módulos de repetição. A topologia de duplicação será determinada por estiramentos de amino ácidos que formam pelo menos partes de a- hélices ou ß-folhas, ou estiramentos de amino ácido que formam polipeptídeos lineares ou alças, ou qualquer combinação de a-hélices, ß-folhas e/ou polipeptídeos lineares/alças. Por exemplo, uma unidade de repetição de anquirina/módulo consiste de uma ß-volta, seguido por duas a-h^lices antiparalelas e uma alça que alcança a volta da próxima unidade de repetição/módulo.

[256] O termo “consecutivo” se refere a um arranjo, em que as unidades de repetição ou módulos de repetição são arranjados em tandem. Em proteínas de repetição projetadas, há pelo menos 2, em geral cerca de 2 a 6, em particular pelo menos cerca de 6, frequentemente 20 ou mais unidades de repetição (ou módulos). Na maior parte dos casos, as unidades de repetição (ou módulos) de um domínio de repetição irão exibir um alto grau de identidade de sequência (mesmos resíduos de amino ácido em posições correspondentes) ou similaridade de sequência (resíduos de amino ácido sendo diferentes, mas tendo propriedades físico-químicas similares), e alguns dos resíduos de amino ácido devem ser resíduos chave sendo fortemente conservados. Entretanto, um alto grau de variabilidade de sequência por inserções e/ou deleções de amino ácidos, e/ou substituições entre as diferentes unidades de repetição (ou módulos) de um domínio de repetição pode ser possível desde que a topologia de duplicação comum das unidades de repetição (ou módulos) seja mantida.

[257] Métodos para diretamente determinar a topologia de duplicação de proteínas de repetição por meios físico-químicos tal como cristalografia de raio X, espectroscopia de nMR ou CD, são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Métodos para identificar e determinar as unidades de repetição ou motivos de sequência de repetição ou para identificar as famílias de proteínas relacionadas que compreendem as referidas unidades de repetição ou motivos, tal como pesquisas de homologia (BLAST etc.), são bem estabelecidas no campo de bioinformáticas, e são bem conhecidas daqueles versados na técnica. A etapa de refinar um motivo inicial de sequência de repetição pode compreender um processo interativo.

[258] O termo “módulos de repetição” se refere às sequências repetidas de amino ácido dos domínios de repetição projetados, que são originalmente derivadas a partir das unidades de repetição de proteínas de repetição que ocorrem naturalmente. Cada módulo de repetição compreendido em um domínio de repetição é derivado a partir de uma ou mais unidades de repetição da família ou subfamília de proteínas de repetição que ocorrem naturalmente, por exemplo, a família de proteínas de repetição de armadillo ou proteínas de repetição de anquirina. Ainda preferivelmente, cada módulo de repetição compreendido em um domínio de repetição compreende um motivo de sequência de repetição deduzido a partir de unidades de repetição homólogas obtidas a partir de domínios de repetição selecionados em um alvo, por exemplo, como descrito no Exemplo 1 e tendo a mesma especificidade de alvo.

[259] Desse modo, O termo “módulo de repetição de anquirina” deve significar que um módulo de repetição, que é originalmente derivado a partir das unidades de repetição de proteínas de repetição de anquirina que ocorrem naturalmente. Proteínas de repetição de anquirina são bem conhecidas daqueles versados na técnica.

[260] “Módulos de repetição” podem compreender posições com resíduos de amino ácido presentes em todas as cópias de módulos de repetição correspondentes (“posições fixas”) e posições com diferentes ou “aleatórios” resíduos de amino ácido (“posições aleatórias”).

[261] O termo “módulo de cobertura” se refere a um polipeptídeo fundido ao módulo de repetição N- ou C-terminal de um domínio de repetição, em que o referido módulo de cobertura forma estritas interações terciárias (isto é, estrutura interações terciárias) com o referido módulo de repetição desse modo proporcionando uma cobertura que protege o núcleo hidrófobo do referido módulo de repetição no lado não em contato com o módulo de repetição consecutivo a partir do solvente. O referido Módulo de cobertura N- e/ou C-terminal pode ser, ou pode ser derivado a partir de, uma unidade de cobertura ou de outra unidade estrutural encontrada em uma proteína de repetição de ocorrência natural adjacente à unidade de repetição. O termo “unidade de cobertura” se refere a um polipeptídeo duplicado de ocorrência natural, em que o referido polipeptídeo define uma unidade estrutural particular que é N- ou C-terminal fundida à unidade de repetição, em que o referido polipeptídeo forma estritas interações estruturais terciárias com a referida unidade de repetição desse modo proporcionando uma cobertura que protege o núcleo hidrófobo da referida unidade de repetição em um lado a partir do solvente. Preferivelmente, os módulos de cobertura ou as unidades de cobertura são repetição de coberturas. O termo “repetição de cobertura” se refere um módulo de cobertura ou unidade de cobertura tendo uma similar ou de mesma duplicação que a referida unidade de repetição adjacente (ou módulo) e/ou similaridades de sequência para a referida unidade de repetição adjacente (ou módulo). Módulos de cobertura e repetição de coberturas são descritos em WO 2002/020565 e por Interlandi et al., 2008 (loc. cit.).

[262] Exemplos de Módulos de cobertura de anquirina N-terminal (isto é, Repetições de cobertura N-terminal) são SEQ ID NO: 1, 2, 3, 13, 14, 20, 26, 27 36, 40, 44, 45, 50, 54, 124, 128 e 132 e exemplos de módulos de cobertura de anquirina C-terminal (isto é, Repetições de cobertura C-terminal) são SEQ ID NO: 4, 5, 19, 24, 25, 33, 34, 35, 39, 43, 48, 49, 53,57, 127, 131 e 135.

[263] Por exemplo, o Módulo de cobertura de anquirina N-terminal de SEQ ID NO: 13 é codificado pelos amino ácidos a partir das posições 1 a 32 e o Módulo de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 19 é codificado pelos amino ácidos a partir das posições 99 a 126.

[264] A proteína de ligação recombinante de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um domínio de repetição de anquirina, em que o referido domínio de repetição de anquirina tem especificidade de ligação para região extracelular de mamífero de HER2.

[265] O termo “tem especificidade de ligação para a alvo”, “especificamente ligação a um alvo” ou “especificidade de alvo” e semelhante quer dizer que a proteína de ligação ou domínio de ligação se liga ao PBS a um alvo com uma constante de dissociação mais baixa do que a uma proteína não relacionada tal como a proteína de ligação maltose de E. coli (MBP). Preferivelmente, a constante de dissociação em PBS para o alvo é pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 102, ainda mais preferivelmente pelo menos 103, ou ainda mais preferivelmente pelo menos 104 vezes mais baixa do que a constante de dissociação correspondente para MBP.

[266] O termo “sequência de consenso” se refere a uma sequência de amino ácido, em que a referida sequência de consenso é obtida por alinhamento estrutural e/ou de sequência de múltiplas unidades de repetição. Usando duas ou mais unidades de repetição de sequência alinhada e/ou estrutural, e permitindo espaços no alinhamento, é possível se determinar o resíduo de amino ácido mais frequente em cada posição. A sequência de consenso é aquela sequência que compreende os amino ácidos que são mais frequentemente representados em cada posição. No caso de que dois ou mais amino ácidos são representados acima dda média em uma única posição, a sequência de consenso pode incluir um subconjunto dos amino ácidos. As referidas duas ou mais unidades de repetição podem ser tidas a partir das unidades de repetição compreendidas em uma única proteína de repetição, ou a partir de duas ou mais diferentes proteínas de repetição.

[267] Sequências de consenso e métodos para determinar as mesmas são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[268] Um “resíduo de amino ácido de consenso” é o amino ácido encontrado em uma determinada posição em uma sequência de consenso. Se dois ou mais, por exemplo, três, quatro ou cinco, resíduos de amino ácido são encontrados com uma probabilidade similar nas referidas duas ou mais unidades de repetição, o amino ácido de consenso pode ser um dos amino ácidos mais frequentemente encontrados ou uma combinação dos referidos dois ou mais resíduos de amino ácido.

[269] Adicionalmente preferidas são os módulos de cobertura de ocorrência não natural, módulos de repetição, Proteínas de ligação ou domínios de ligação.

[270] O termo “ocorrência não natural” quer dizer sintético ou não a partir da natureza, mais especificamente, o termo quer dizer produzido a partir da mão do homem. O termo “proteína de ligação de ocorrência não natural” ou “domínio de ligação de ocorrência não natural” quer dizer que a referida proteína de ligação ou o referido domínio de ligação é sintético (isto é, produzidos por sínteses químicas a partir de amino ácidos) ou recombinante e não a partir de natureza. “Proteína de ligação de ocorrência não natural” ou “domínio de ligação de ocorrência não natural” é uma proteína ou domínio produzido pelo homem, respectivamente, obtido por expressão de ácidos nucleicos projetados de modo correspondente. Preferivelmente, a expressão é realizada em células eucarióticas ou bacterianas, ou por usar um sistema de expressão in vitro livre de células. Ademais, o termo quer dizer que a sequência da referida proteína de ligação ou do referido domínio de ligação não está presente como uma entrada de sequência não artificial em um banco de dados de sequência, por exemplo, em GenBank, EMBL-Bank ou Swiss-Prot. Os referidos bancos de dados e outros bancos de dados similares de sequências são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[271] Modificações e derivados gerais dos domínios de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção; particularmente dos módulos de repetição de anquirina e módulos de cobertura de acordo com a presente invenção:

[272] Adicionalmente preferido é um módulo de cobertura C-terminal ou N-terminal de anquirina que compreende uma Repetição de cobertura de anquirina N- terminal ou C-terminal, respectivamente, em que um ou mais dos resíduos de amino ácidos na referida repetição de cobertura são substituídos por um resíduo de amino ácido encontrado na posição correspondente em alinhamento da unidade de cobertura de anquirina correspondente ou unidade de repetição de anquirina.

[273] A substituição de amino ácidos pode ser por qualquer um dos 20 amino ácidos de ocorrência natural ainda mais frequentes, preferivelmente por amino ácidos selecionado a partir do grupo que consiste de A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; e mais preferivelmente a partir do grupo que consiste de A, D, E, H, I, K, L, Q, R, S, T, V, e Y. Também preferivelmente, a substituição de amino ácidos é por um amino ácido homólogo; isto é, um amino ácido é substituído por um amino ácido tendo uma cadeia lateral com propriedades biofísicas similares. Por exemplo, o amino ácido negativo carregado D pode ser substituídos pelo amino ácido negativo carregado E, ou a amino ácido hidrófobo tal como L pode ser substituído por A, I ou V. A substituição de um amino ácido por um amino ácido homólogo é bem conhecida daqueles versados na técnica.

[274] Também preferido é um módulo de cobertura C-terminal de anquirina que compreende o amino ácido A na posição 27 e 28 de qualquer dos módulos de cobertura C-terminal acima com base em SEQ ID NO: 4, 5, 19, 24, 25, 33, 34, 35, 39, 43, 48, 49, 53, 57, 127, 131 ou 135

[275] Também preferido é um módulo de cobertura C-terminal que compreende os amino ácidos a partir das posições 1 a 26 ou a partir de posição 1 a 27 de qualquer um dos módulos de cobertura C-terminal acima com base em SEQ ID NO: 4, 5, 19, 24, 25, 33, 34, 35, 39, 43, 48, 49, 53, 57, 127, 131 ou 135.

[276] Amino ácidos G na posição 1 e/ou S na posição 2 de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 13, 14, 20, 26, 27, 36, 40, 44, 45, 50, 54, 124, 128 ou 132 podem ser removidos a partir dos módulos de cobertura de anquirina N-terminal sem qualquer influência aparente nas propriedades. Os referidos dois aminoácidos servem como ligantes para conectar o domínio de repetição de anquirina a amino ácidos e proteínas adicionais. A presente invenção também compreende os referidos domínios de repetição de anquirina que compreendem módulos de cobertura de anquirina N-terminal em que G na posição 1 e/ou S na posição 2 são removidos. É entendido que as posições de amino ácido (por exemplo, “posição 33”) em um domínio de repetição de anquirina como definida aqui são adaptadas desse modo, resultando em a número de desvio, por exemplo, “posição 33” se tornará “posição 32”, se um amino ácido estiver faltando, ou “posição 33” se tornará a “posição 31”, se dois aminoácidos estiverem faltando.

[277] Um módulo de cobertura de anquirina de um domínio de repetição de anquirina da presente invenção pode ser trocado por um módulo de cobertura de anquirina por combinação de técnicas, tal como alinhamento de sequências de amino ácido, mutagênese e síntese de gene, conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, a repetição de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 79 pode ser substituída pela repetição de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 5 por (i) determinar a repetição de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 79 (isto é, sequência posição 99 a 126) por alinhamento de sequência com SEQ ID NO: 5, (ii) substituir a sequência da determinada repetição de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 79 com a sequência de SEQ ID NO: 5, (iii) gerar um gene que codifica o domínio de repetição que codifica o módulo de cobertura C-terminal trocado, (iv) expressar o domínio de repetição modificado no citoplasm de E. coli e (v) purificar o domínio de repetição modificado por meios padrão. Como um exemplo adicional, a repetição de cobertura N-terminal de SEQ ID NO: 79 pode ser substituída pela repetição de cobertura N-terminal de SEQ ID NO: 3 por (i) determinar a repetição de cobertura N-terminal de SEQ ID NO: 79 (isto é, sequência posição 1 a 32) por alinhamento de sequência com SEQ ID NO: 3, (ii) substituir a sequência da determinada repetição de cobertura N-terminal de SEQ ID NO: 79 com a sequência de SEQ ID NO: 3, (iii) gerar um gene que codificam o domínio de repetição que codifica o módulo de cobertura N-terminal trocado, (iv) expressar o domínio de repetição modificado no citoplasm de E. coli e (v) purificar o domínio de repetição modificado por meios padrão.

[278] Adicionalmente, um domínio de repetição de anquirina da presente invenção pode ser construído geneticamente por montar um módulo de cobertura de anquirina N-terminal (por exemplo, a repetição de cobertura N-terminal de SEQ ID NO: 3) seguido por um ou mais módulos de repetição (por exemplo, os dois módulos de repetição de anquirina que compreendem os resíduos de amino ácido a partir de posição 33 a 99 de SEQ ID NO: 79) e um módulo de cobertura C-terminal (por exemplo, a repetição de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 5) por meio de síntese de gene. O gene domínio de repetição geneticamente montado pode então ser expresso em E. coli como descrito acima.

[279] Adicionalmente preferido é uma proteína de ligação recombinante, domínio de repetição, módulo de repetição, módulo de cobertura Módulo de cobertura C- terminal ou N-terminal tendo uma sequência de amino ácido desprovida de amino ácidos C, M ou N.

[280] Adicionalmente preferido é uma proteína de ligação recombinante, domínio de repetição, módulo de repetição, módulo de cobertura Módulo de cobertura C- terminal ou N-terminal tendo uma sequência de amino ácido desprovida de amino ácido N seguido por G.

[281] Adicionalmente preferido é uma proteína de ligação recombinante ou domínio de repetição que compreendem qualquer um referido Módulo de cobertura C- terminal ou N-terminal.

[282] Em uma modalidade adicional preferida da proteína de ligação recombinante que compreende um domínio de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção, um ou mais dos resíduos de amino ácido do módulo de cobertura N- terminal do referido domínio de repetição é trocado por um resíduo de amino ácido encontrado na posição correspondente no alinhamento de uma unidade de cobertura N- terminal. Preferivelmente, até 30% dos resíduos de amino ácido são trocados, mais preferivelmente, até 20%, e ainda mais preferivelmente, até 10% dos resíduos de amino ácido são trocados. Ainda mais preferivelmente, a referida unidade de cobertura N-terminal é uma unidade de cobertura N-terminal de ocorrência natural.

[283] Em uma modalidade adicional preferida de uma proteína de ligação recombinante que compreende um domínio de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção, um ou mais dos resíduos de amino ácido do módulo de cobertura C- terminal do referido domínio de repetição é trocado por um resíduo de amino ácido encontrado na posição correspondente no alinhamento da unidade de cobertura C- terminal. Preferivelmente, até 30% dos resíduos de amino ácido são trocados, mais preferivelmente, até 20%, e ainda mais preferivelmente, até 10% dos resíduos de amino ácido são trocados. Ainda mais preferivelmente, a referida unidade de cobertura C-terminal é uma unidade de cobertura C-terminal de ocorrência natural.

[284] Em ainda outra modalidade particular, até 30% dos resíduos de amino ácido, mais preferivelmente, até 20%, e ainda mais preferivelmente, até 10% dos resíduos de amino ácido são trocados com amino ácidos que não são encontrados nas posições correspondentes de unidades de repetição, unidades de cobertura N-terminal ou unidades de cobertura C-terminal.

[285] Em uma modalidade adicional preferida da proteína de ligação recombinante que compreende um domínio de repetição de anquirina de acordo com a presente invenção, um ou mais dos resíduos de amino ácido dos módulos de repetição do referido domínio de repetição de anquirina são trocados por um resíduo de amino ácido encontrado na posição correspondente no alinhamento da unidade de repetição. Preferivelmente, até 30% dos resíduos de amino ácido são trocados, mais preferivelmente, até 20%, e ainda mais preferivelmente, até 10% dos resíduos de amino ácido são trocados. Ainda mais preferivelmente, a referida unidade de repetição é uma unidade de repetição de ocorrência natural.

[286] Em ainda outra modalidade particular, até 30% dos resíduos de amino ácido, mais preferivelmente, até 20%, e ainda mais preferivelmente, até 10% dos resíduos de amino ácido são trocados com amino ácidos que não são encontrados nas posições correspondentes de unidades de repetição.

[287] Em modalidade adicional, qualquer uma das proteínas de ligação recombinantes HER2 ou domínios descritos aqui pode ser covalentemente ligada a uma ou mais frações adicionais, incluindo, por exemplo, a fração que se liga a um diferente alvo para criar um agente de ligação com especificidade dupla, um composto bioativo, uma fração de marcação (por exemplo, uma marca fluorescente tal como fluoresceina, ou um traçador radioativo), uma fração que facilita a purificação da proteína (por exemplo, uma pequena marcação de peptídeo, tal como a His- ou strep-marcação), uma fração que proporciona função efetora para aprimorada eficácia terapêutica (por exemplo, a parte Fc de um anticorpo proporcionando citotoxicidade mediada a célula dependente de anticorpo, uma fração de proteína tóxica tal como endotoxina de Pseudomonas aeruginosa A (ETA) ou um pequeno agente tóxico molecular tal como agentes maitansinoides ou de alquilação de DNA) ou uma fração que proporciona aprimorada farmacocinética. Aprimorada farmacocinética pode ser avaliada de acordo com a necessidade terapêutica percebida. Com frequência é desejável se aumentar a biodisponibilidade e/ou se aumentar o tempo entre doses, possivelmente ao aumentar o tempo que a proteína permanece disponível no soro após a dosagem. Em alguns casos, é desejável se aprimorar a continuidade da concentração da proteína no soro com o tempo (por exemplo, reduzir a diferença na concentração da proteína no soro entre a concentração logo após a administração e a concentração logo antes da próxima administração). Frações que tendem a reduzir a depuração da proteína a partir do sangue incluem amido de hidroxietila (HES), polietileno glicol (PEG), açúcares (por exemplo, ácido siálico), frações de proteína bem toleradas (por exemplo, fragmentos de Fc ou albumina do soro), e domínios de ligação ou peptídeos com especificidade e afinidade para proteínas abundantes no soro, tal como fragmentos de anticorpo Fc ou albumina do soro. Exemplos dos referidos domínios de ligação ou domínios de repetição com afinidade para albumina do soro são proporcionados em WO 2012/069654. A proteína de ligação recombinante da presente invenção pode ser fixada à fração que reduz o coeficiente de depuração de polipeptídeos em um mamífero (por exemplo, em camundongo, rato, ou ser humano) por mais do que três vezes relativas aos polipeptídeos não modificados.

[288] Em uma modalidade particular a presente invenção se refere a uma proteína de ligação recombinante que compreende o primeiro domínio de repetição que se liga a HER2, o segundo domínio de repetição que se liga a HER2 e adicionalmente que compreende um ou mais domínios de repetição de anquirina especificamente que se liga a albumina do soro humano. Exemplos de domínios de repetição com especificidade for HER2 são aqui e exemplos de domínios de repetição de anquirina com especificidade para albumina do soro humano são descritos em WO 2012/069654. Os referidos domínios podem ser ligados por um polipeptídeo de ligação por meios genéticos por métodos conhecidos daqueles versados na técnica.

[289] Outra modalidade preferida é uma proteína de ligação recombinante em que o primeiro domínio de repetição e o segundo domínio de repetição são domínios de repetição de anquirina com especificidade de ligação para HER2 que compreende um, dois, três ou mais módulos de repetição internos que irão participar na ligação a HER2. Preferivelmente, os referidos domínios de repetição de anquirina compreendem um módulo de cobertura N-terminal, um a quatro módulos de repetição internos, e um módulo de cobertura C-terminal. Preferivelmente, os referidos módulos de cobertura são repetição de coberturas. Também preferivelmente, os referidos módulos de cobertura irão participar na ligação a HER2.

[290] Ademais, qualquer uma das composições farmacêuticas acima mencionadas é considerada para o tratamento de uma desordem.

[291] A presente invenção proporciona adicionalmente métodos de tratamento. O método compreende administrar, a um paciente em necessidade do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação recombinante da presente invenção.

[292] Adicionalmente, um método de tratar uma condição patológica em a mamífero incluindo o ser humano, que compreende administrar a um paciente em necessidade da mesma uma quantidade eficaz da composição farmacêutica acima mencionada é considerado.

[293] Exemplos

[294] Todos os materiais de partida e os reagentes descritos abaixo são conhecidos daqueles versados na técnica, e são oferecidos no comércio ou podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas.

[295] Materials

[296] Produtos químicos foram adquiridos da Fluka (Switzerland). Oligonucleotídeos foram da Microsynth (Switzerland). A não ser que determinado de outro modo, DNA polimerases, enzimas de restrição e tampões foram da New England Biolabs (USA) ou Fermentas (Lithuania). A clonagem e a cepa de produção de proteína foi E. coli XL1-blue (Stratagene, USA) ou BL21 (Novagen, USA). Ectodomínio humano HER2 recombinante (ErbB2 S22-N530-Flag e ErbB2 S22-E645-Flag produzidos em células CHO por meios padrão) foi comprado da CSIRO Enquiries (Australia). Ectodomínio Her2 Biotinilado foi obtido quimicamente por meio de acoplamento da fração de biotina às aminas primárias da proteína usando reagentes e métodos de biotinilação padrão (Pierce, USA). Linhagens celulares foram compradas da LGC/ATCC (France/USA; Cat. No: BT474 -HTB-20, SKBR-3 -HTB-30, NCI-N87 - CRL5822, ZR75-30 -CRL1504, HCC1419 - CRL2326, MDA-MB175 VII-HTB-25). Os meios de cultura celular foram da Invitrogen / Lubio (Switzerland). Soro bovino fetal foi da PAA. O reagente de teste para a detecção de proliferação celular, Proliferação celular ELISA, BrdU (colorimetric) (Cat. No. 1164722900) foi da Roche, Switzerland e o reagente de teste para a detecção de apoptose, Caspase Glo 3/7 (Cat. No. G8091) foi da Promega e the Switzerland e o sistema de detecção de morte celular ELISAPLUS (11 774 425 001) da Roche, Switzerland. O reagente de transfecção de Célula, Lipofectamin 2000 (11668027) foi da Invitrogen Switzerland. As análises de FACS foram realizadas usando o sistema FACS Canto II da Becton-Dickinson (Switzerland). A ligação de DARPins a Her2 foi detectada usando um conjugado anti- Penta-His Alexa Fluor 647 (Cat. No. A21445; Lubio Switzerland). Accutase (Cat. No: L-11- 007) foi da PAA. Trastuzumab foi comprado da Kantonal Apotheke Zurich e pertuzumab foi sintetizado por Evitra (Switzerland). Um vetor de expressão para Her2 marcada com GFP (Cat. No. RG212583) foi da Origene USA.

[297] Biologia Molecular

[298] A não ser que determinado de oturo modo, métodos são realizados de acordo com os protocolos descritos (Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York).

[299] Análise de Proliferação

[300] Os efeitos de DARPins na proliferação celular foram determinados ao se medir as sínteses de DNA usando BrdU-labeling (BrdU, Proliferação celular ELISA, Roche). Em suma, 10000 células BT474 foram semeadas por cavidade em uma placa de 96 cavidades em 100 µL de meio completo e incubado for 24h. DARPins e valores de referência foram adicionados por mais 72h. BrdU para marcação celular foi adicionado pelas últimas 24h. as células marcadas (proliferantes) foram detectadas de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados foram analisados usando o programa GraphPad prism, log de plotagem [c] no eixo x contra OD450-602 nM no eixo Y. os dados foram adaptados usando uma adaptação de regressão não linear (log(antagonista) vs. resposta - inclinação variável (quatro parâmetros)).

[301] Análise de Apoptose

[302] Indução de apoptose por DARPins foi determinada ao se medir a ativação de Caspase3/7 usando os sistemas Caspase 3/7-Glo (Promega, Switzerland). Em suma, 10000 células BT474 foram semeadas por cavidade em uma placa de 96 cavidades em 100 µL de meio completo e incubadas por 24h. DARPins e valores de referência foram adicionado por mais 24 horas adicionais. O reagente Caspase Glo foi adicionado de acordo com o protocolo do fabricante por 1 hora. A ativação de Caspase 3/7 foi monitorada ao se medir a atividade de luciferase.

[303] Alternativamente a indução de apoptose foi determinada usando o sistema de detecção de morte celular ELISAPLUS (Roche, Switzerland). O teste foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. O número de célula e os tempos de incubação foram similares aos da leitura de Caspase Glo.

[304] Os dados foram analisados usando o programa GraphPad prism, o traçado da concentração no eixo X contra OD405/490 nM ou RLU no eixo Y. os dados foram adaptados usando uma adaptação de regressão não linear (log(agonista) vs. resposta - inclinação variável (quatro parâmetros)).

[305] Bibliotecas de Proteína de repetição de anquirina projetada

[306] Métodos de gerar bibliotecas de proteína de repetição de anquirina projetada são descritos (WO 2002/020565; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit.). Pelos referidos métodos bibliotecas de proteína de repetição de anquirina projetada tendo módulos aleatórios de repetição de anquirina e/ou módulos aleatórios de cobertura podem ser construídas. Por exemplo, as referidas bibliotecas podem desse modo ser montadas com base no módulo fixo de cobertura N-terminal (por exemplo, o módulo de cobertura N-terminal de SEQ ID NO: 2) ou um módulo aleatório de cobertura N-terminal de acordo com um motivo de sequência de SEQ ID NO: 60, um ou mais módulos aleatórios de repetição de acordo com o motivo de sequência de SEQ ID NO: 58 ou 59, e um módulo fixo de cobertura C-terminal (por exemplo, o módulo de cobertura C-terminal de SEQ ID NO: 5) ou um módulo aleatório de cobertura C-terminal de acordo com a motivo de sequência de SEQ ID NO: 61. Preferivelmente, as referidas bibliotecas são montadas para não ter os aminoácidos C, G, M, N (em frente de um resíduo G) ou P nas posições aleatórias de repetição ou módulos de cobertura. Adicionalmente, módulos aleatórios de repetição de acordo com a motivo de sequência de SEQ ID NO: 58 ou 59 podem ser adicionalmente aleatórios na posição 10 e/ou posição 17; o módulo aleatório de cobertura N-terminal de acordo com a motivo de sequência de SEQ ID NO: 60 pode ser adicionalmente aleatório na posição 7 e/ou posição 9; e os módulos aleatórios de cobertura C-terminal de acordo com um motivo de sequência de SEQ ID NO: 61 pode ser adicionalmente aleatório nas posições 10, 11 e/ou 17.

[307] Adicionalmente, os referidos módulos aleatórios nas referidas bibliotecas podem compreender inserções de alça de polipeptídeo adicionais com posições aleatórias de amino ácido. Exemplos das referidas inserções de alça de polipeptídeo são região de determinação de complemento (CDR) de bibliotecas de alça de anticorpos ou de bibliotecas de peptídeo novo gerado. Por exemplo, a referida inserção de alça pode ser projetada usando a estrutura do domínio de repetição de anquirina N- terminal de ribonuclease L humana (Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929 - 3938, 2004) como guia. Em analogia ao referido domínio de repetição de anquirina onde dez aminoácidos são inseridos na betavolta presente próxima à margem das duas repetições de anquirina, bibliotecas de proteínas de repetição de anquirina podem conter alças aleatórias (com posições aleatórias e fixas) de comprimento variável (por exemplo, 1 a 20 amino ácidos) inseridos em um ou mais beta-voltas de um domínio de repetição de anquirina.

[308] Qualquer referido módulo de cobertura N-terminal de uma biblioteca de proteína de repetição de anquirina preferivelmente possui o motivo RELLKA ou RILKAA em vez do motivo RILLAA (por exemplo, presente a partir de posição 21 a 26 em SEQ ID NO: 65) e qualquer referido Módulo de cobertura C-terminal de uma biblioteca de proteína de repetição de anquirina preferivelmente possui o motivo KAA ou KLA em vez do motivo KLN (por exemplo, os últimos três aminoácidos em SEQ ID NO: 65).

[309] A configuração da referida biblioteca de proteína de repetição de anquirina pode ser guiado por conhecidas estruturas de um domínio de repetição de anquirina que interage com um alvo. Exemplos das referidas estruturas, identificadas por seu acesso único ao Banco de Dados de Proteína (PDB) ou aos códigos de identificação (PDB-IDs), são 1WDY, 3V31, 3V30, 3V2X, 3V2O, 3UXG, 3TWQ-3TWX, 1N11, 1S70 e 2ZGD.

[310] Exemplos de bibliotecas de proteína de repetição de anquirina projetada, tal como as bibliotecas de proteína de repetição de anquirina projetada N2C e N3C, são descritas (WO 2002/020565; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit.). O dígito em N2C e N3C descreve o número de módulos aleatórios de repetição presentes entre os módulos de cobertura N-terminal e C-terminal.

[311] A nomenclatura usada para definir as posições dentro das unidades de repetição e módulos é com base em Binz et al. 2004, loc. cit. com a modificação que margeia os módulos de repetição de anquirina e as unidades de repetição de anquirina são desviadas por uma posição de amino ácido. Por exemplo, a posição 1 de um módulo de repetição de anquirina de Binz et al. 2004 (loc. cit.) corresponde a posição 2 de um módulo de repetição de anquirina da descrição atual e consequentemente a posição 33 de um módulo de repetição de anquirina de Binz et al. 2004, loc. cit. corresponde à posição 1 de um módulo de repetição de anquirina a seguir da descrição atual.

[312] Todas as sequências de DNA foram confirmadas por sequenciamento, e o peso molecular calculado de todas as proteínas descritas foi confirmado por espectrometria de massa.

[313] Exemplo 1: Seleção de Proteínas de ligação que compreendem domínios de repetição de anquirina com especificidade de ligação para HER2

[314] Usando display de ribossomo (Hanes, J. e Plückthun, A., PNAS 94, 4937 - 42, 1997) muitas proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) com especificidade de ligação para o ectodomínio de HER2 foram selecionadas a partir das bibliotecas de DARPin como descrito por Binz et al. 2004 (loc. cit.). A sua especificidade de ligação foi avaliada por ELISA extrato bruto (vide abaixo) o que indica que centenas de proteínas de ligação específicas para HER2 foram selecionadas. A inibição de proliferação específica de HER2 e a indução de apoptose dos clones selecionados foram medidas por testar DARPins biparatópicos quanto a sua habilidade para inibir a proliferação de células BT474.

[315] Por exemplo, os domínios de repetição de anquirina de SEQ ID NO: 62 a 82, 112 a 121 constituem sequências de amino ácido de Proteínas de ligação selecionadas que compreendem um domínio de repetição de anquirina com especificidade de ligação para HER2. Módulos de repetição de anquirina individuais a partir dos referidos domínios de repetição de anquirina com especificidade de ligação a HER2 são proporcionados em SEQ ID NO: 15 a 18, 21 a 23, 28 a 32, 37, 38, 41, 42, 46, 47, 51, 52, 55, 56, 125, 126, 129, 130, 133 e 134. Módulos de cobertura individuais dos referidos domínios de repetição de anquirina com especificidade de ligação a HER2 são proporcionados em SEQ ID NO: 13, 14, 19, 20, 24 a 27, 33 a 36, 39, 40, 43 a 45, 48 a 50, 53, 54, 57, 124, 127, 128, 131, 132 e 135.

[316] Seleção de proteínas de repetição de anquirina específicas de HER2 por display de ribossomo

[317] A seleção de proteínas de repetição de anquirina específica de HER2 foi realizada por display de ribossomo (Hanes e Plückthun, loc. cit.) usando HER2 humana como proteína alvo, bibliotecas de proteínas de repetição de anquirina projetadas como descrito acima e protocolos estabelecidos (Zahnd, C., Amstutz, P. e Plückthun, A., Nat. Métodos 4, 69-79, 2007). O número de transcrição reversa (RT)-PCR ciclos após cada rodada de seleção foi constantemente reduzida a partir de 45 a 30, ajustando para o rendimento em virtude de enriquecimento de ligantes. As primeiro quatro rodadas de seleção empregaram seleção padrão de display de ribossomo, usando concentração de redução de alvo e maior rigor de lavagem para aumentar a pressão da seleção a partir da rodada 1 a rodada 4 (Binz et al. 2004, loc. cit.). Para enriquecer a alta afinidade anti-HER2 DARPins, a saída a partir da quarta rodada de seleção padrão de display de ribossomo (acima) foi individuada a uma seleção de rodada de dissociação com maior rigor na seleção (Zahnd, 2007, loc. cit.). uma rodada de seleção padrão final foi realizada para amplificar e recuperar as proteínas de ligação selecionadas dissociadas.

[318] Os clones selecionados se ligam especificamente a HER2 como mostrado por extrato bruto ELISA

[319] DARPins selecionados individuais que especificamente se ligam ao ectodomínio de HER2 foram identificados por teste de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) usando extratos brutos de Escherichia coli de células que expressam DARPin usando protocolos padrão. DARPins selecionados por display de ribossomo foram clonados no vetor de expressão pQE30 (Qiagen), transformados em E. coli XL1-Blue (Stratagene) e então desenvolvidos durante a noite a 37°C em uma placa de 96 cavidades profundas (cada clone em uma única cavidade) contendo 1 mL de meio de desenvolvimento (2YT contendo 1% de glicose e 100 µg/mL de ampicilina). 1 mL de 2YT fresco contendo 50 µg/mL de ampicilina foi inoculado com 100 µL da cultura de durante a noite em uma placa fresca de 96 cavidades profundas. Após a incubação por 2 horas a 37°C, a expressão foi induzida com IPTG (1 mM de concentração final) e continuada por 3 h. Células foram coletadas, ressuspensas em 100 µL de B-PERII (Pierce) e incubadas por 15 min a temperatura ambiente com agitação. Então, 900 µL de PBS-TC (PBS suplementado com 0,25% de Hidrolisado de caseína, 0,1% de Tween 20®, pH 7.4) foram adicionados e os resíduos da célula foram removidos por centrifugação. 100 µL de cada clone lisado foram aplicados a uma cavidade de uma placa MaxiSorp revestida com Neutravidina contendo seja HER2 seja a MBP não relacionada imobilizada por meio de sua fração biotina e incubados por 1 h a RT. Após extensa lavagem com PBS-T (PBS suplementado com 0,1% de Tween 20®, pH 7.4) a placa foi desenvolvida usando procedimentos de ELISA padrão usando o anticorpo monoclonal anti-RGS(His)4 marcado com peroxidase de rábano silvestre (34650, Qiagen) a ligação foi então detectada por substrato POD (Roche). O desenvolvimento da cor foi medido a 405 nM. A varredura de diversas centenas de clones por para o referido extrato de célula bruta ELISA revelou mais do que uma centena de diferentes DARPins com especificidade for HER2. As referidas proteínas de ligação foram escolhidas por análise adicional. Exemplos de sequências de amino ácido de domínios de repetição de anquirina selecionados que especificamente se ligam ao ectodomínio HER2 são proporcionados em SEQ ID NO: 62 a 82 e 112 a 121.

[320] Os referidos domínios de repetição de anquirina com especificidade de ligação para HER2 e um controle negativo de domínio de repetição de anquirina sem nenhuma especificidade de ligação para HER2 (isto é, SEQ ID NO: 111) foram clonados em um pQE (QIAgen, Germany) com base no vetor de expressão proporcionando um N- terminal His-tag para facilitar a simples purificação de proteína como descrito abaixo. Assim, vetores de expressão que codificam os DARPins a seguir foram construídos:

[321] DARPin #1 (SEQ ID NO: 62 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[322] DARPin #2 (SEQ ID NO: 63 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[323] DARPin #3 (SEQ ID NO: 64 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[324] DARPin #5 (SEQ ID NO: 66 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[325] DARPin #6 (SEQ ID NO: 67 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[326] DARPin #7 (SEQ ID NO: 68 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[327] DARPin #8 (SEQ ID NO: 69 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[328] DARPin #9 (SEQ ID NO: 70 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[329] DARPin #10 (SEQ ID NO: 71 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[330] DARPin #11 (SEQ ID NO: 72 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[331] DARPin #12 (SEQ ID NO: 73 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[332] DARPin #13 (SEQ ID NO: 74 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[333] DARPin #14 (SEQ ID NO: 75 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[334] DARPin #15 (SEQ ID NO: 76 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[335] DARPin #16 (SEQ ID NO: 77 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[336] DARPin #17 (SEQ ID NO: 78 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[337] DARPin #18 (SEQ ID NO: 79 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[338] DARPin #19 (SEQ ID NO: 80 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[339] DARPin #20 (SEQ ID NO: 81 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[340] DARPin #21 (SEQ ID NO: 82 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[341] DARPin #50 (SEQ ID NO: 111 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término).

[342] DARPin #51 (SEQ ID NO: 112 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[343] DARPin #52 (SEQ ID NO: 113 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[344] DARPin #53 (SEQ ID NO: 114 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[345] DARPin #54 (SEQ ID NO: 115 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[346] DARPin #55 (SEQ ID NO: 116 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[347] DARPin #56 (SEQ ID NO: 117 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[348] DARPin #57 (SEQ ID NO: 118 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[349] DARPin #58 (SEQ ID NO: 119 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[350] DARPin #59 (SEQ ID NO: 120 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[351] DARPin #60 (SEQ ID NO: 121 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[352] Exemplos de sequências de amino ácido de selecionado proteínas biparatópicas de repetição de anquirina são proporcionados em SEQ ID NO: 83 a 110, 122, 123, e 136 a 141. Os referidos DARPins biparatópicos foram clonados em um pQE (QIAgen, Germany) com base no vetor de expressão proporcionando um N-terminal His- tag para facilitar a simples purificação de proteína como descrito abaixo. Assim, vetores de expressão que codificam os DARPins a seguir foram construídos:

[353] DARPin #22 (SEQ ID NO: 83 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[354] DARPin #23 (SEQ ID NO: 84 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[355] DARPin #24 (SEQ ID NO: 85 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[356] DARPin #25 (SEQ ID NO: 86 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[357] DARPin #26 (SEQ ID NO: 87 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[358] DARPin #27 (SEQ ID NO: 88 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[359] DARPin #28 (SEQ ID NO: 89 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[360] DARPin #29 (SEQ ID NO: 90 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[361] DARPin #30 (SEQ ID NO: 91 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[362] DARPin #31 (SEQ ID NO: 92 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[363] DARPin #32 (SEQ ID NO: 93 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[364] DARPin #33 (SEQ ID NO: 94 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[365] DARPin #34 (SEQ ID NO: 95 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[366] DARPin #35 (SEQ ID NO: 96 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[367] DARPin #36 (SEQ ID NO: 97 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[368] DARPin #37 (SEQ ID NO: 98 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[369] DARPin #38 (SEQ ID NO: 99 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[370] DARPin #39 (SEQ ID NO: 100 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[371] DARPin #40 (SEQ ID NO: 101 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[372] DARPin #41 (SEQ ID NO: 102 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[373] DARPin #42 (SEQ ID NO: 103 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[374] DARPin #43 (SEQ ID NO: 104 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[375] DARPin #44 (SEQ ID NO: 105 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[376] DARPin #45 (SEQ ID NO: 106 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[377] DARPin #46 (SEQ ID NO: 107 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[378] DARPin #47 (SEQ ID NO: 108 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[379] DARPin #48 (SEQ ID NO: 109 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[380] DARPin #49 (SEQ ID NO: 110 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término)

[381] DARPin #61 (SEQ ID NO: 122 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[382] DARPin #62 (SEQ ID NO: 123 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[383] DARPin #63 (SEQ ID NO: 136 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[384] DARPin #64 (SEQ ID NO: 137 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[385] DARPin #65 (SEQ ID NO: 138 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[386] DARPin #66 (SEQ ID NO: 139 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[387] DARPin #67 (SEQ ID NO: 140 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término);

[388] DARPin #68 (SEQ ID NO: 141 com a His-tag (SEQ ID NO: 6) fundidos ao seu N-término).

[389] Alto nível e expressão solúvel de DARPins monovalentes

[390] Para uma análise adicional, DARPins #1 a 50 foram expressos em E. coli BL21 ou células XL1-Blue e purificados usando suas His-tag usando os protocolos padrão. 25 mL de culturas estacionárias durante a noite (LB, 1% de glicose, 100 mg/l de ampicilina; 37°C) foram usados para inocular 1 L de culturas (mesmo meio). A uma absorção de 0,7 a 600 nM, as culturas foram induzidas com 0,5 mM de IPTG e incubadas a 37°C por 4-5 h. As culturas foram centrifugadas e os grânulos resultantes foram resuspensos em 40 mL de TBS500 (50 mM de Tris-HCl, 500 mM de NaCl, pH 8) e sonicados. O lisato foi recentrifugado, e glicerol (10% (v/v) de concentração final) e imidazola (20 mM de concentração final) foram adicionados ao sobrenadante resultante. Proteínas foram purificadas sobre uma coluna de ácido Ni-nitrilotriacético (2,5 mL de volume de coluna) de acordo com as instruções do fabricante (QIAgen, Germany). Alternativamente, DARPins ou domínios de repetição selecionados desprovidos da 6xHis- tag foram purificados por cromatografia de troca de ânion seguido por cromatografia de exclusão de tamanho de acordo com as resinas padrão e os protocolos conhecidos daqueles versados na técnica. Até 200 mg de DARPins altamente solúvel com especificidade de ligação a HER2 pode ser purificado a partir de um litro de cultura de E. coli com uma pureza > 95% como estimado a partir de SDS-15% PAGE. Os referidos DARPins purificados são usados para caracterizações adicionais.

[391] Exemplo 2: Caracterização do DARPins com ligação para especificidade para HER2 por Análise de Ressonância de plasmon de superfície

[392] As cinéticas da ligação a proteína do interessante DARPins de ligação a HER2 purificado foram testadas por Análise de Ressonância de plasmon de superfície (SPR) com um sistema de estrutura ProteOn (BioRad) usando um ajuste, onde a HER2 humana biotinilada foi imobilizada por meio de neutravidina e a interação foi medida ao se adicionar DARPin monovalente livre. A determinação dos valores de Kd foi realizada de acordo com procedimentos padrão.

[393] Molécula biotinilada de ectodomínio de HER2 humana foi imobilizada em uma célula de fluxo através da ligação a Streptavidina revestida e a interação com vários DARPins selecionados foi analisada.

[394] Análise de Ressonância de plasmon de superfície (SPR)

[395] SPR foi medido usando um instrumento ProteOn (BioRad) e a medição foi realizada de acordo com procedimentos padrão conhecidos daqueles versados na técnica. O tampão em uso foi PBS, pH 7.4, contendo 0,005% de Tween 20®. Neutravidina foi covalentemente imobilizada em um chip de GLC (BioRad) a um nível de cerca de 8000 unidades de ressonância (RU). Imobilização de HER2 no chip revestido de neutravidina foi então realizada. A interação de DARPin HER2 foi então medida por injetar 100 µL de tampão de uso (PBS contendo 0,005% de Tween®) contendo diluições em série de DARPins de concentração de 50, 25, 12.5, 6.25 e 3.125 nM (medição de associação), seguido por um fluxo de tampão em uso entre 10 minutos e até 3 horas a um coeficiente de fluxo constante de 100 µL/min (medição de dissociação). Os sinais (isto é, valores de unidade de ressonância (RU)) de uma célula de referência não revestida e a injeção de referência (isto é, a injeção de tampão em uso apenas) foram subtraídos a partir dos traços de RU obtidos após a injeção de HER2 (duplo referenciamento). A partir dos traços de SRP obtidos a partir das medições de associação e de dissociação a associação e a dissociação da interação de HER2 em DARPin correspondente pode ser determinada.

[396] Os resultados são resumidos na Tabela 1. As Constantes de dissociação (Kd) foram calculadas a partir das associações e dissociações usando procedimentos padrão conhecidos daqueles versados na técnica.

[397] Exemplo 3: Mapeamento da ligação do domínio de repetição a epítopos HER2 extracelulares específicos

[398] A interação dos domínios de repetição com o domínio extracelular Her2s foi analisada por métodos padrão conhecidos daqueles versados na técnica, tal como análise de estrutura quaternária dos complexes por cristalografia de raio X ou espectroscopia de NMR, ou mapeamento de epítopo por usar mutagênese de alanina de resíduos potenciais de interação ou por usar espectrometria de massa e marcação covalente. Adicionalmente, vários testes de competição, tal como teste de competição de imunoabsorção ligado a enzimas (ELISAs) conhecidos daqueles versados na técnica foram realizados para identificar os domínios extracelulares aos quais a proteína de repetição selecionada se liga ou se as mesmas têm epítopos de sobreposição nos domínios extracelulares de HER2 com outras proteínas de ligação, por exemplo, anticorpos tal como trastuzumab ou pertuzumab.

[399] Os domínios extracelulares de HER2 foram seja comprados seja produzidos como descrito (Jost et. al., loc. cit.)

[400] A competição de DARPins de ligação a HER2 purificado de interesse foi realizada por análise de Ressonância de plasmon de superfície (SPR) com um sistema de estrutura ProteOn (BioRad) usando um ajuste, onde ErbB2 S22-N530 e ErbB2 S22-E645 biotinilado humano foram imobilizados por meio de neutravidina e a competição foi medida ao se adicionar o primeiro DARPin monovalente a uma saturação (1 uM), seguido por uma mistura de 1:1 do primeiro e do segundo DARPin (100 nM cada). Se o segundo DARPin se ligou, apesar da presença do primeiro DARPina, o segundo DARPin foi considerado se ligar a um diferente epítopo.

[401] Por exemplo, os dados de competição ELISA (Fig 1A e 1B) sugerem que o DARPin #54 se liga ao domínio II em Her2 e DARPin #51 se liga ao domínio I de HER2. Anteriormente foi mostrado que DARPin #18 se liga ao domínio IV de HER2 (Jost et al., loc. cit.). O DARPins (20 nM) foram pré-incubados com domínio Her2 I, domínio I-III ou domínio III-IV (em cada caso a um domínio de concentração de 500 nM) em PBS por 45 min a temperatura ambiente. A mistura foi adicionada a 20 nM de Her2 de comprimento total revestido em uma placa F96 MaxiSorb Nunc (Cat. 442404). DARPins ligados foram especificamente detectados usando um anticorpo anti RGS-His de rato monoclonal (Qiagen Cat.34650) como o anticorpo principal e um anticorpo anti-rato marcado com peroxidase de rábano silvestre (Pierce, Cat.31438) como o anticorpo secundário. O anticorpo primário (antiocorpo anti RGS-His de rato) foi substituído por um anticorpo anti- DARPin de rato monoclonal para a ELISA ilustrada na figura 1B.

[402] A leitura foi produzida a 450 nM. Todas as etapas de incubações foram realizadas em PBS a pH 7.4 contendo 0,1% de Tween 20® e 0,25% de Caseína a temperatura ambiente por 2 horas em um agitador Heidolph Titramax 1000 a 450 rpm exceto pelo revestimento de placa, que foi realizado durante a noite a 4°C usando PBS a pH 7.4.

[403] Os referidos achados foram confirmados por competir a ligação dos referidos DARPins a Her2 que superexpressam células (BT474) com domínio I recombinante, domínio I-II-III e domínio III-IV de Her2 por Citometria de Fluxo (FACS). DARPins (100 nM) foram pré-incubados com os construtores individuais Her2 (1 uM) a 25°C por 30 minutos. A mistura foi aplicada a células (100,000 células em 100 µL) por 20 minutos em gelo. A ligação de DARPin a células foi monitorada usando um anticorpo anti- Penta-His marcado com Alexa 647 (Qiagen Cat. No: 35370). As análises confirmaram a ligação de DARPin #51 um domínio I de HER2 e DARPin #1 um domínio II em HER2 e DARPin#18 ao domínio IV de HER2.

[404] A competição de DARPin #1 com pertuzumab e DARPin #18 com trastuzumab foi também testada usando Citometria de Fluxo. Às referidas células finais de BT474 foram pré-incubados com pertuzumab, respectivamente trastuzumab (ambos com 1 uM) antes da incubação com o respectivo DARPin (1 uM). A ligação de DARPin às células foi monitorada usando um anticorpo anti-Penta-His marcado com Alexa 647 (Qiagen Cat. No: 35370) e a ligação de pertuzumab ou trastuzumab foi monitorada usando um anticorpo anti-human-IgG marcado com Alexa 546 (Invitrogen Cat. No: A-21089). O experimento mostrou que nenhum dos DARPins compete com a ligação de pertuzumab ou trastuzumab a HER2 expresso por células BT474.

[405] Esse achado foi também observado por ELISA (A figura 1C), onde pertuzumab (revestido em a F96 MaxiSorb Nunc (Cat. 442404) a 20 nM) foi pré-incubado com 20 nM de Her2 (domínio I-IIII) antes da incubação com os respectivos DARPins (20 nM). A ligação específica do DARPin ao complexo Her2-Pertuzumab foi detectada usando um antiocorpo anti RGS-His de rato monoclonal (Qiagen, Cat.34650) e um anticorpo antirato marcado com peroxidase de rábano silvestre (Pierce, Cat.31438) (pré-misturada por 45 minutos a temperatura ambiente). Todas as etapas de incubações foram realizadas a temperatura ambiente por 2 horas em um agitador agotador Heidolph Titramax 1000 a 450 rpm exceto pelo revestimento da placa, realizado durante a noite a 4°C. PBS, 0,1% de Tween 20® pH7.4, 0,25% de Caseína foi usado ao agente de bloqueio. Todos os DARPins N-terminais testados nesse teste (DARPin #7, DARPin #52, DARPin #53, e DARPin #54) são a ligação de Her2 na presença de pertuzumab, mostrando que os mesmos se ligam a um diferente epítopo do que o anticorpo.

[406] No geral os referidos experimentos mostraram que os domínios de repetição monovalentes codificados por SEQ ID NO: 62 a 68, 72, e 114 a 121 se ligam ao domínio II de HER2, os domínios de repetição monovalentes codificados por SEQ ID NO: 69-71, 73, 112 e 113 se ligam ao domínio I de HER2 e os domínios de repetição monovalentes codificados por SEQ ID NO: 74 a 82 se ligam ao domínio IV de HER2. Nenhum dos referidos domínios de repetição monovalentes que liga ao domínio II de HER2 (SEQ ID NO: 62 a 68, 72, e 114 a 121 compete com pertuzumab na ligação a HER2. Entre o domínio de repetição monovalente que liga ao domínio IV de HER2, os domínios de repetição codificados pela SEQ ID NO: 77, 78 e 82 competem com trastuzumab para ligação a HER2 enquanto que os domínios de repetição codificados pelas SEC ID NO: 74 a 76 e 79 a 81 não competem com trastuzumab.

[407] Exemplo 4: DARPins de ligação a Her2 biparatópicos bloqueiam o crescimento das células de tumor que expressam Her2.

[408] DARPins monovalentes, misturas de DARPins e DARPins de ligação a Her2 biparatópicos foram testados para a inibição de proliferação de célula BT474. A Figura 2 mostra que DARPins monovalentes e misturas de DARPins monovalentes não são capazes de bloquear a proliferação de BT474. De modo diferente, um subconjunto de DARPins biparatópicos induz a inibição da proliferação (Figura 2, e Tabela 2). De modo interessante, DARPins domínio de repetição IV de HER2 têm que ser localizados no C-término da molécula (Figura 2). Múltiplas combinações de DARPins monovalentes em um formato biparatópico resulta na inibição da proliferação de DARPins biparatópicos. Entretanto, nem todas as combinações são capazes de blouear a proliferação de BT474 a 90-100% (Figura 3), o que permite a classificação de determinadas combinações de DARPin. Os referidos achados indicam que a objetivação de subconjuntos distintos de determinados epítopos em HER2 em um formato biparatópico é chave para alcançar a potência. A indução de internalização e degradação do receptor HER2 como reportado por trastuzumab não é suficiente para induzir a potente inibição de proliferação celular de tumor (Figuras 3 e 5). Não só o DARPin #41 mas também o DARPin #43 induzem a degradação de Her2 similar ao trastuzumab, mas apenas os DARPins tal como DARPin #41 inibe a proliferação celular do tumor.

[409] Experimentos foram realizados como descrito na seção dos métodos. Exemplo dos resultados são resumidos na Tabela 2. Os valores de IC50 foram calculados a partir das curvas de titulação obtidas como descrito acima usando procedimentos padrão conhecidos daqueles versados na técnica. Exemplos de curvas de titulação são dados para o DARPin #41 na figura 2 e 3. [1] n.i.: nenhuma inibição observada [2] Exemplo 5: Her2-que biparatópico que tem como objetivo a inibição da proliferação de DARPins de várias linhagens celulares que superexpressam Her2 e induz apoptose

[410] A potência do DARPin biparatópico #41 foi testada. O DARPin inibiu a proliferação em linhagens celulares que superexpressam Her2 na faixa a partir de Her2 IHC 3+ a 1+ e não em células que expressam os níveis do tipo selvagem de HER2 (Figura 4; Tabela 3). Ademais o DARPin induz robustamente a apoptose dentro de 24 horas de incubação nas linhagens celulares listadas (Figura 5, Tabela 3).

[411] Experimentos foram realizados como descrito na seção dos métodos. Exemplos dos resultados são resumidos na Tabela 3. Os valores de IC50 e de EC50 foram calculados a partir das curvas de titulação obtidas como descrito acima usando procedimentos padrão conhecidos daqueles versados na técnica. Exemplos de curvas de titulação são dados para o DARPin #41 em três diferentes linhagens celulares nas figuras 4 e 5. Os valores de IC50 e EC50 variam entre 0,2 - 10 nM, dependendo do DARPin testado e da linhagem celular. Por exemplo, foi mostrado que os DARPins #41, #45 e #46 induzem apoptose em células BT474, MDA-MB175 e NCI-N87 (Tabela 3). Resultados similares foram obtidos usando outras proteínas de ligação biparatópicas da presente invenção.

[412] Exemplo 6: Her2 Biparatópico que tem como objetivo a inibição da proliferação de DARPins e induz apoptose em células BT474 diferente das terapias de cuidados padrão atuais

[413] A potência do DARPin biparatópico #41 foi comparada aos fármacos aprovados para o tratamento de cânceres de mama positivos para Her2, trastuzumab e pertuzumab. O DARPin inibe de modo eficiente a proliferação e é um indutor de apoptose diferente do trastuzumab, Pertuzumab ou uma combinação de trastuzumab e pertuzumab (Figura 6).

[414] Experimentos foram realizados como descrito na seção dos métodos. Exemplos dos resultados são mostradas na figura 6. Os valores de IC50 e de EC50 (Tabela 3) foram calculados a partir das curvas de titulação obtidas como descrito acima usando procedimentos padrão conhecidos daqueles versados na técnica. Resultados similares foram obtidos usando outras proteínas de ligação biparatópicas da presente invenção.

[415] Exemplo 7: Geração de vários formatos de DARPin

[416] Como um exemplo, a potência de diferentes formatos do DARPin biparatópico #41 foi comparada ao DARPin #41 em inibição de proliferação de célula BT474 (Figura 7, Tabela 2). A PEGilação ou fusão a DARPin que se liga a albumina do soro humano (DARPin #41, #63, #64, #65) ao N- ou C-término não afetou a potência (Figura 7A). Adicionalmente, a variação dos ligantes entre as frações de DARPin não afetou a potência (Figura 7B). Os valores das IC50s variam entre 1.5 - 5.5 nM. Resultados correspondentes foram obtidos usando formatos correspondentes dos DARPins biparatópicos #41, #66, #67, #68 foram obtidos. De modo geral, isso sugere com clareza que os DARPins biparatópicos podem ser modificados (por métodos conhecidos daqueles versados na técnica, tal como PEGilação ou fusão a domínios de ligação a albumina do soro) para aumentar a sua meia vida in vivo sem a perda da potência. Adicionalmente, os referidos experimentos sugerem que o ligante entre os dois domínios de repetição que liga a HER2 em um construtor biparatópico pode ser variado pelo menos a partir de dois a 24 amino ácidos sem significativamente influenciar na eficácia do construtor biparatópico.

[417] Exemplo 8: mapeamento da interação de DARPin/Her2

[418] A interação dos DARPins biparatópicos da presente invenção com o ectodomínio HER2 foi adicionalmente analisada por reticulação química do complexo formado por essas duas moléculas em solução (isto é, em PBS pH 7.4), seguido por uma digestão do complexo com a protease, e análise dos peptídeos resultantes por espectroscopia de massa. No referido experimento as regiões do DARPin podem ser covalentemente reticuladas às regiões de HER2 apenas se as mesmas estiverem em proximidade com o último. A detecção de peptídeos a partir do DARPin que são covalentemente reticulados ao peptídeo de HER2 correspondente pela referida análise de espectroscopia de massa indica que os referidos peptídeos estão em proximidade no complexo de HER2/DRAPin. Os referidos métodos de análise de proximidade são bem conhecidos daqueles versados na técnica (por exemplo, Birch, C., et al., Anal. Chem., 82, 172 - 179, 2010) e são oferecidos por várias empresas como um serviço (por exemplo, CovalX AG, Zürich, Switzerland).

[419] Por exemplo, nos referidos experimentos foi encontrado que o DARPin biparatópico #41, que se liga ao domínio II e ao domínio IV de HER2, pode formar um complexo 1 a 1 com HER2. De modo surpreendente, reticulações covalentes entre o domínio de repetição C-terminal (que liga ao domínio IV de HER2) e o domínio I de HER2 foram observadas, o que indica proximidade do referido domínio de repetição com o domínio I de HER2 no complexo, embora o mesmo se ligue ao domínio IV. As referidas reticulações não seriam esperadas acontecer se o HER2 estivesse em uma conformação como descrito na técnica anterior (por exemplo, Bublil e Yarden, loc. cit). É importante ressaltar que, quando o ectodomínio HER2 foi analisado no complexo com o referido domínio de repetição C-terminal que liga ao domínio IV isoladamente então nenhuma das referidas reticulações ao domínio I de HER2 pode ser observada, o que indica que no caso do complexo formado por HER2 e o domínio de repetição monomérico que liga ao domínio IV, nenhuma proximidade do referido domínio de repetição ao domínio I existe. Assim, os arranjos de domínio tridimensionais para HER2 devem ser diferentes no complexo formado com a proteína de ligação biparatópica da presente invenção comparada ao complexo formado com o domínio de repetição individual do domínio de ligação IV de HER2.

[420] De modo interessante, as estruturas conhecidas do ectodomínio de HER2 não permitem a simultânea ligação a ambos os domínios de repetição de uma proteína de ligação biparatópica da presente invenção à mesma molécula HER2, quando considerando os ligantes curtos na faixa de 2 a 24 amino ácidos entre dois domínios de repetição. Isso indica que HER2 pode estar ainda em uma conformação desconhecida permitindo a simultânea ligação a ambos os domínios de repetição.

[421] De modo geral, os referidos experimentos indicam que as proteínas de ligação biparatópicas da presente invenção podem ser capazes de interagir intramolecularmente com o ectodomínio de HER2, e que as mesmas desse modo fixam o ectodomínio HER2 em uma nova conformação não conhecida na técnica anterior, ou seja por trazer o domínio I e o domínio IV em um arranjo estérico que permite a reticulação observada entre o domínio de repetição (que liga ao domínio IV de HER2) e o domínio I ocorra. Assim, a referida nova conformação de HER2 parece ser estabilizada pela proteína de ligação biparatópica da presente invenção por simultaneamente ligar o domínio de ligação II e o domínio IV de HER2 em um modo intramolecular.

Claims (11)

1. Proteína recombinante que compreende um primeiro e um segundo domínio de repetição de anquirina, caracterizada pelo fato que cada um dos referidos primeiro e segundo domínios de repetição de anquirina se liga à região extracelular do receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), referido primeiro domínio de repetição de anquirina se liga ao domínio II de HER2 e referido segundo domínio de repetição de anquirina se liga ao domínio IV de HER 2, em que referidos primeiro e segundo domínios de repetição de anquirina estão localizados no mesmo polipeptídio, e referido primeiro domínio de repetição de anquirina está localizado no terminal N com relação ao referido segundo domínio de repetição de anquirina, e em que (a) referido primeiro domínio de repetição de anquirina compreende uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72, e 114 a 121 e (b) referido segundo domínio de repetição de anquirina compreende uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 74 a 82.

2. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato que o referido primeiro domínio de repetição de anquirina não compete para ligação a HER2 com pertuzumab.

3. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato que o referido segundo domínio de repetição de anquirina não compete para ligação a HER2 com trastuzumab.

4. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato que os referidos primeiro e segundo domínios de repetição de anquirina estão conectados por um ligante polipeptídio.

5. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato que (a) referido primeiro domínio de repetição de anquirina é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NOs: 62 a 68, 72 e 114 a 121; (b) referido segundo domínio de repetição de anquirina é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID Nos. 74 a 82, e adicionalmente (c) G na posição 1 e/ou S na posição 2 dos referidos domínios de repetição de anquirina estão opcionalmente faltando; e (d) L na segunda última posição e/ou N na última posição dos referidos domínios de repetição de anquirina são opcionalmente trocados por A.

6. Proteína recombinante compreendendo um primeiro e um segundo domínio de repetição de anquirina, caracterizada pelo fato que cada um dos referidos dois domínios de repetição se liga uma região extracelular de receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), em que referidos domínios de repetição estão covalentemente ligados, e em que a referida proteína recombinante compreende um polipeptídio, em que referido polipeptídio tem uma sequência de amino ácido com um polipeptídio selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 83 a 98, 102, 103, 122, 123, e 136 a 141.

7. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato que compreende uma proteína recombinante conforme reivindicada na reivindicação 1 e um suporte farmaceuticamente aceitável.

8. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato que o referido primeiro domínio de repetição se liga ao domínio II de HER2 e o referido segundo domínio de repetição se liga ao domínio IV de HER2, em que o referido primeiro e segundo domínios estão localizados sobre o mesmo polipeptídio, e em que o referido primeiro domínio de repetição é localizado no terminal N com relação ao referido segundo domínio de repetição.

9. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato que compreende a proteína recombinante conforme reivindicada na reivindicação 6 e um suporte farmaceuticamente aceitável.

10. Proteína recombinante compreendendo um primeiro e um segundo domínio de repetição de anquirina, caracterizada pelo fato que cada um dos referidos dois domínios de repetição se liga a região extracelular de receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), em que referidos domínios de repetição são covalentemente ligados, e em que a referida proteína recombinante compreende um polipeptídio, em que o referido polipeptídio compreende os referidos primeiro e segundo domínios de repetição de anquirina e tem a sequência de amino ácido da SEQ ID NO: 87.

11. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato que compreende a proteína recombinante conforme reivindicada na reivindicação 10 e um suporte farmaceuticamente aceitável.