KR102352336B1 - 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이를 이용한 대사성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 융합단백질 이량체가 GLP-1 호르몬으로서 유의미하게 작용함과 동시에 IL-1 수용체와 효율적으로 결합하여 인플라마솜에 의해 생성되는 IL-1β에 대한 신호 억제 효과 또한 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 융합단백질 이량체는 GLP-1과 IL-1 수용체 길항제의 효능이 복합적으로 작용하므로, 당뇨병, 비만, 고지혈증과 같은 대사성 질환의 치료 및 예방에 효과적으로 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

글루카곤-유사 펩타이드-1 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 AND IL-1 RECEPTOR ANTAGONIST AND USE THEREOF}

본 발명은 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이를 이용한 대사성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

현대사회는 가공식품 및 외식 증가에 따른 과다 영양 섭취, 자동화에 따른 신체활동량 감소 등 다양한 원인으로 인해 비만 인구가 빠르게 증가하고 있으며, 이에 따라 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증, 고지혈증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증과 같은 대사성 질환이 증가되고 있다.

대사성 질환(metabolic disease)은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환의 총칭으로, 그 질환의 원인이 다양하고 복합적으로 작용하기 때문에 명확한 치료법을 개발하기 어려운 실정이다.

한편, 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)은 장관 내 L 세포에서 음식물 등의 자극을 받아 분비되는 인크레틴(incretin) 호르몬으로, 당뇨병, 비만, 심장병, 뇌혈관 질환 및 신경세포 염증, 동맥경화증 치료 효과 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 GLP-1 유사체로 승인을 받은 비만 치료제인 리라글루티드(liraglutide)는 체중 조절을 위한 저칼로리 식이 요법 및 운동의 보조 요법으로 허가 받았다. 이 약물은 비만, 고혈압, 제2형 당뇨병 또는 이상지질혈증을 갖는 비만 또는 과체중인 성인에서 사용이 승인되었다. 그러나, 여전히 안전성 및 부작용의 문제가 존재한다.

IL-1 수용체 길항제(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)는 IL-1α와 IL-1β 두 가지 형태로 존재하는 염증성 사이토카인인 IL-1을 억제하는 물질로서, IL-1이 IL-1 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하여 IL-1의 효과를 억제한다. 한편, 염증반응에 중요한 매개체인 IL-1β는 인플라마솜(inflammasome)에 의해 생성되며, 최근 연구 결과에 의하면 여러 대사성 질환이 인플라마솜과 관련되어 있음이 밝혀졌다(Dominic De Nardo et.al., Trends Immunol., 32(8):373-379, 2011). 이에, 인플라마솜 및 그 대사산물인 IL-1β를 억제함으로써 이와 관련된 대사성 질환과 같은 여러 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Charles A Dinarello et.al., Nat Rev Drug Discov., 11(8):633-652, 2012).

Dominic De Nardo et.al., Trends Immunol., 32(8):373-379, 2011 Charles A Dinarello et.al., Nat Rev Drug Discov., 11(8):633-652, 2012

이에 본 발명자들은 대사성 질환을 효과적으로 치료 및 예방하기 위한 새로운 조합의 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, GLP-1 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체가 GLP-1 호르몬으로서 작용함과 동시에 IL-1 수용체와 효율적으로 결합하여 염증성 사이토카인인 IL-1 신호를 억제함을 확인하였다. 이를 기반으로, 상기 융합단백질 이량체가 당뇨병, 비만 등과 같은 대사성 질환 치료제로 유용하게 활용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(Interleukin-1 receptor antagonist) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 및 이의 이량체를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 GLP-1 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체는 혈중의 포도당 농도에 따라 인슐린 분비를 촉진시키고, 비만 억제 효과가 있는 것으로도 알려진 GLP-1 호르몬으로서 유의미하게 작용할 수 있다. 뿐만 아니라, IL-1 수용체(IL-R)와 결합하여, 인플라마솜에 의해 생성되는 IL-1β에 대한 신호 억제 효과 또한 우수하다. 따라서, 기능적 측면에 있어서 상기 융합단백질 이량체는 GLP-1과 IL-1 수용체 길항제의 효능이 복합적으로 작용하여 당뇨병, 비만, 고지혈증과 같은 대사성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 융합단백질 이량체인 GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 제조된 GI-210B1을 SDS-PAGE로 확인한 도면이다.
도 3은 제조된 GI-210B1을 웨스턴 블롯으로 확인한 도면이다.
도 4는 GI-210B1의 IL-1Rα(interleukin-1 receptor alpha)에 대한 결합능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 GI-210B1의 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로서의 효능을 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도면이다.
도 5b는 GI-210B1의 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로서의 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 GI-210B1의 GLP-1 호르몬으로서의 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 GI-210B1의 팔미테이트와 올레익산에 의한 간세포 내 지방축적억제능 확인한 결과를 나타낸 도면 및 그래프이다.

GLP-1 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질

본 발명의 일 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체; 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-1(glucagon-like peptide-1)" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-1"은 전구호르몬인 전구글루카곤(proglucagon) 유전자의 전사 산물로부터 유래한 인크레틴(incretin)으로서, 장의 L 세포에서 장관 내 영양분 또는 혈당 농도에 자극을 받아 분비되는 호르몬이다.

GLP-1은 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며 GLP-1의 아미노산 서열은 모든 포유류에서 100% 동일한 것으로 알려져 있다. 전구글루카곤으로부터 전사 후 과정에 의해 췌도 α 세포에서는 글루카곤이 만들어지며 회장과 대장의 L-세포에서는 GLP-1이 만들어지는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 GLP-1은 서열번호 1의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서는 GLP-1 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "GLP-1"의 용어로 표현하기도 한다. GLP-1 및 GLP-1 변이체는 예를 들어 GLP-1 수용체(GLP-1R, glucagon-like peptide-1 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-1 변이체"는 전장(full-length) GLP-1의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1과 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "GLP-1 활성"은 예를 들어 GLP-1 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.

구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 결실, 변형, 치환 및/또는 부가된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1 서열의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 또는 적어도 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 치환 및 결실된 것일 수 있다. 아미노산 치환 및 결실에 의한 GLP-1 변이체의 일 구체예로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 1개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다.

또한, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 치환 및 부가된 것일 수 있다. 아미노산 치환 및 부가에 의한 GLP-1 변이체의 일 구체예로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째, 10번째, 12번째, 13번째, 14번째, 16번째, 17번째, 19번째, 20번째, 21번째, 24번째, 27번째, 28번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 9개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다. 더 나아가, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 1개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다.

이때, 상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 글리신(glycine, G), 류신(leucine, L), 리신(lysine, K), 글루타민(glutamine, Q), 메티오닌(methionine, M), 글루탐산(glutamic acid, E), 발린(valine, V), 아르기닌(arginine, R), 아스파라긴(asparagine, N), 프롤린(proline, P), 세린(serine, S) 및 알라닌(alanine, A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구체예로, 상기 GLP-1 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A2G, R30G로 치환이 일어나고, C-말단에 1개의 아미노산 서열 G가 부가된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A2G, V10L, S12K, Y13Q, L14M, G16E, Q17E, A19V, K20R, E21L, A24E, V27K, K28N 및 R30G로 치환이 일어나고, C-말단에 9개의 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 21)이 부가된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 상기 GLP-1 변이체는 생체 내에서 작용 시간이 연장된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 야생형 GLP-1은 생체 내에서 DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단되어 불활성화되는 등 약물로 개발하는 데에 많은 어려움이 있다. 이에, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1에 변이를 일으켜 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄인 것으로, 야생형 GLP-1의 생물학적 반감기(1 내지 2분)에 비하여 현저히 길어진 생물학적 반감기를 갖는 특징을 지닌 것일 수 있다.

한편, 상기 야생형 GLP-1은 처음 6개의 아미노산이 분자로부터 절단되도록 생체 내에서 가공된다. 따라서, 당업계에서의 관행에 의해, GLP-1의 아미노 말단은 7번으로, 카르복시-말단은 37번으로 지정된다. 상기 가공에 따라 인슐린 분비 기능이 없는 형태인 GLP-1(1-37)에서 GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 될 수 있으며, C-말단 글리신 잔기가 제거되고 아미드기로 대체되도록 생체 내에서 추가로 변형되어 GLP-1(7-36) 아미드(서열번호 1의 아미노산 서열)의 형태가 될 수 있다.

상기 "GLP-1" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-1"은 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 GLP-1을 의미한다. 상기 GLP-1은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, GLP-1을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 GLP-1은 야생형 GLP-1 또는 이의 변이체일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist)" 또는 "IL-1Ra"는 IL-1α, IL-1β의 두 가지 형태로 존재하는 IL-1을 억제하는 길항제로, IL-1Ra는 구조적으로 IL-1α, IL-1β와 비슷하여 IL-1 수용체(IL-1R)에 경쟁적으로 결합하여 염증성 사이토카인인 IL-1을 억제한다. 따라서, IL-1Ra는 IL-1으로 야기되는 질환에서 이를 막는 데 중요한 역할을 담당하는 것으로 인식된다. 한편, 상기 IL-1Ra는 제2형 당뇨병과 죽상동맥경화증에서 병태생리적으로 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 IL-1Ra는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서는 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 혹은 이의 단편을 총칭하여 "IL-1Ra"의 용어로 표현하기도 한다. IL-1Ra 및 IL-1Ra 단편은 예를 들어 IL-1 수용체(IL-1R, interleukin-1 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-1Ra 단편"은 IL-1Ra의 절단형을 의미하는 것으로, 전장(full-length) IL-1Ra의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 IL-1Ra 단편은 "IL-1Ra 변이체"와 동일한 맥락으로 사용 가능하며, 이는 전장 IL-1Ra의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra와 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-1Ra 활성"은 예를 들어 IL-1 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.

구체적으로, 상기 IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra의 아미노산 일부가 결실, 변형, 치환 및/또는 부가된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 적어도 20개 이상, 적어도 30개 이상, 적어도 40개 이상, 적어도 50개 이상, 적어도 60개 이상, 적어도 70개 이상, 적어도 80개 이상, 적어도 90개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 "IL-1Ra" 또는 "IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-1Ra를 의미한다. 상기 IL-1Ra은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-1Ra을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-1Ra은 야생형 IL-1Ra 또는 이의 단편일 수 있다.

이때, 상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다.

또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylated)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.

또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:

N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-Y-C' (I)

N'-Y-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-X-C' (II)

이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,

상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,

상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,

상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,

상기 Y는 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편이며,

상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,

상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.

이때, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체와 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편은 전술한 바와 같다.

이때, 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 10 내지 70개의 연속된 아미노산, 15개 내지 60개의 연속된 아미노산, 20 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)은 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.

상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 링커(2)는 (G₄S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)를 포함할 수 있고, (G)n을 추가로 더 포함할 수 있다. 이때, (G₄S)n 및 (G)n에서 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(2)는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.

상기 융합단백질의 각각의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)의 아미노산 서열의 일 구체예는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

구분	아미노산 서열	서열번호
hGLP-1	HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR	1
GLP-1 변이체-1	HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGG G	2
GLP-1 변이체-2	HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS	3
GLP-1 변이체-3	HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVRGR G	4
제1 링커	GGGGSGGGGS GGGGSGGAES KYGPPCPPCP	5
hIgG4Fc	APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG	6
제2 링커	GGGGSGGGGSGGGGSGG	7
IL-1Ra	RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE	8
GI-210B1 (GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)	HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGG G GGGGSGGGGSGGGGSGGAESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG GGGGSGGGGSGGGGSGG RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE	10

융합단백질 이량체

본 발명의 다른 측면은, 전술한 융합단백질이 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다. 이때, 상기 융합단백질은 GLP-1 또는 이의 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커에 포함된 시스테인에 의해 결합될 수 있다. 이때, 상기 링커는 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다.

융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드의 일 구체예는 서열번호 18 또는 서열번호 20을 포함할 수 있다.

상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편은 전술한 바와 같다.

상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 본원 발명의 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드이다.

신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.

개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), IgG 신호서열 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다.

본원 발명에서 유용한 신호서열은 항체 경쇄 신호서열, 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), 항체 중쇄 신호서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다. 일 실시예로 신호서열로서 서열번호 9의 아미노산으로 구성된 신호서열이 이용되었다.

폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 이때, 벡터는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결된 것일 수 있으며, 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터, 미니-염색체 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.

융합단백질을 발현하는 형질전환 세포

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "형질전환 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 세포 및 진핵 세포를 나타낸다. 상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 또한, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있다.

상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다.

또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주 세포 역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 진행 세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있다. 상기 원핵 세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵 세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, SP2/0 세포, 인간 림프아구(human lymphoblastoid), NSO 세포, HT-1080 세포, PERC.6 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.

융합단백질의 생산방법

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체의 제조 방법을 제공한다.

상기 융합단백질의 생산방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "배양"이란, 미생물을 인공적으로 적당히 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

또한, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 회수 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법일 수 있다.

융합단백질 이량체의 용도

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 약학 조성물의 용도는 대사성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 융합단백질은 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "대사성 질환"은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환의 총칭으로, 이에 제한되지는 않으나, 당뇨병, 비만, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화 및 고인슐린혈증으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 대사성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 상기 융합단백질 이량체는 대사성 질환 치료 활성을 나타내거나, 특히, 당뇨병, 비만 등의 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 당뇨병, 비만 등과 같은 대사성 질환의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.

생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 대사성 질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 "치료학적으로 유효한 양"으로 투여한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구현예에서 치료학적으로 유효한 양은 대사성 질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.

이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물은 대사성 질환 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 융합단백질 이량체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 대사성 질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 융합단백질 이량체의 대사성 질환 예방 또는 치료용 용도를 제공한다. 여기서 융합단백질 이량체, 대사성 질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 여기서 융합단백질 이량체, 투여, 대사성 질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 대사성 질환을 앓는 환자이거나 대사성 질환을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.

상기 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 바작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 이량체는 대사성 질환 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

제조예 1. GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra 융합단백질 이량체의 제조: GI-210B1

GLP-1(glucagon-like peptide-1), Fc 도메인 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위하여 GLP-1(서열번호 2), NL028 힌지 링커(서열번호 5), IgG4 Fc 도메인(서열번호 6), 링커(서열번호 7) 및 IL-1Ra(서열번호 8)를 포함하는 융합단백질(도 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 20)를 pcDNA3.4 벡터(Genscript)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO₂ 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHO^TM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.

상기 정제된 융합단백질에 대하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하여 분자량 및 순도를 확인하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과, 비환원(non-reducing) 조건 및 환원(reducing) 조건하에서 단백질이 검출되는 것으로 확인되었다. 이를 통해 상기 정제된 융합단백질이 이량체를 형성하고 있음을 알 수 있었다(도 2 및 도 3). 상기 융합단백질 이량체를 "GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra로도 칭함)"으로 명명하였다.

제조예 2. GLP-1-IgG4 Fc 융합단백질 이량체의 제조

대조군으로서 GLP-1(glucagon-like peptide-1) 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위하여 GLP-1(서열번호 2), NL028 힌지 링커(서열번호 5) 및 IgG4 Fc 도메인(서열번호 6)을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 23)를 pcDNA3.4 벡터(Genscript)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO₂ 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHO^TM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.

실험예 1. GI-210B1 융합단백질 이량체의 IL-1Rα 결합능 확인

상기 제조예 1의 방법을 통해 수득한, GI-210B1의 IL-1Rα(interleukin-1 receptor alpha)에 대한 결합능을 측정하였다. 이때, IL-1Rα 결합능은 Octet RED 384(ForteBio)를 이용하여 확인하였다. AR2G(Amine Reactive 2^nd generation) 바이오센서를 10분간 1Х 카이네틱 버퍼(kinetic buffer)에 침지시켜 사용하였다. IL-1Rα(R&D systems)를 1 ㎍/㎖로 만들어 바이오센서에 코팅하고, GI-210B1을 15.6~1,000 nM로 단계 희석시킨 다음 각각의 농도에서 결합능을 확인하였다. GI-210B1와 IL-1Rα의 결합력은 도 4 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

Ka (Association rate, 1/Ms)	Kd (Dissociation rate, 1/s)	KD (Kd/Ka, M)
2.20E+04	9.30E-03	423 nM

실험예 2. GI-210B1 융합단백질 이량체의 IL-1Ra 효능 확인

GI-210B1의 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로서의 효능을 확인하였다. 첫째날, THP-1 세포(ATCC)를 배양 배지(RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 0.05 nM 2-머캅토에탄올)에서 배양하였다. 분석에 앞서, THP-1 세포를 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 배지를 제거한 다음 세포를 재현탁시켰다. 세포를 96-웰(well) 플레이트의 각 웰에 3Х10⁵ 개의 세포를 접종한 후, LPS(1 ㎍/㎖)를 추가하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 염증 반응의 매개물질인 인플라마솜(Inflammasome)의 유도물질로서 ATP(adenosine triphosphate)를 5 mM 처리하여 밤새 배양하였다. 상층액을 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 보관하였다.

둘째 날, HEK-Blue^TM-IL-1β 세포(Invitrogen)를 배양 배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 100 ㎍/㎖ 노르모신(normocin))에서 배양하였다. 분석에 앞서, HEK-Blue^TM-IL-1β 세포를 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고 배지를 제거한 다음 분석 배지(RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 세포를 재현탁시켰다. 세포를 분석 배지내 96-웰 플레이트의 각 웰에 4.5Х10⁴ 개의 세포를 접종한 후, 다양한 농도(0.2 ng/㎖, 2 ng/㎖, 20 ng/㎖ 및 200 ng/㎖)의 GI-210B1 융합단백질 및 THP-1 상층액을 50 ㎕ 추가하여 밤새 배양하였다.

셋째 날, 상층액을 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 상층액 20 ㎕와 QUANTI-Blue 용액 180 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주한 후, 3시간 동안 반응시켰다. 그 다음 플레이트 판독기를 사용하여 650 ㎚ 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 그 결과, GI-210B1 융합단백질이 농도 의존적으로 IL-1 신호를 억제함을 확인할 수 있었다(도 5a 및 도 5b).

실험예 3. GI-210B1 융합단백질 이량체의 GLP-1 효능 확인

GI-210B1에 포함된 GLP-1의 효능을 확인하고자, 세포 성장에 있어서 GLP-1에 의존적인 세포주인 PC-12 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 즉, PC-12 세포 내에서 GI-210B1 융합단백질에 포함된 GLP-1에 의해 매개되는 세포 증식을 측정하였다.

먼저, PC-12 세포(ATCC, #CRL-1721^TM)를 배양 배지(RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양하였다. 분석에 앞서, PC-12 세포를 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 배지를 제거한 다음 세포를 FBS가 불포함된 분석 배지에 재현탁시켰다. 세포를 분석 배지 내에서 96-웰 플레이트의 각 웰에 5Х10⁴ 개의 세포를 접종하였다. 다양한 농도(0.1 nM, 0.2 nM, 0.4 nM, 0.8 nM, 1.6 nM, 3.1 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM)의 GI-210B1 융합단백질을 웰에 첨가하였다. 분석 플레이트를 5% CO₂, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 4시간 동안 WST-1(Roche)을 각 웰에 10 ㎕씩 추가하여 배양하였다. 그 기간 후에, 플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 그 결과, GI-210B1 융합단백질이 PC-12 세포 성장을 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 6).

실험예 4. GI-210B1 융합단백질 이량체의 팔미테이트와 올레익산에 의한 간세포 내 지방축적억제능 확인

GI-210B1이 팔미테이트 및 올레익산에 의해 유도되는 간세포 내 지방축적을 억제하는지 확인하고자, 간세포인 Huh1 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. Huh1 세포는 배양 배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 이용하여 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 실험을 위해 세포를 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 떼어낸 후, 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시켰다. 그 후, 새 배지에 재현탁시켜 96-웰 플레이트의 각 웰에 1Х10⁴개의 세포를 접종하고 24시간 배양하였다. 지방 축적을 유도하기 위해, 100 μM 팔미테이트(palmitate)와 200 μM 올레익산(oleic acid)을 2% BSA-serum free DMEM에 섞어 55℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 세포에 처리할 때 1 ㎍/㎖ IL-1Ra(peprotech, 200-01RA), 3.6 ㎍/㎖ GLP-1-Fc 또는 4.6 ㎍/㎖ GI-210B1을 각각 처리하였다. 24시간 처리 후, 지방 축적 정도를 확인하기 위해 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 BODIPY 493/503과 DAPI로 염색한 후 cytation 5 이미지 장비를 사용하여 세포당 지방 축적 정도를 수치화하였다. 그 결과, GI-210B1 융합단백질이 IL-1Ra 또는 GLP-1-Fc에 비해 팔미테이트와 올레익산에 의해 유도되는 지방 축적을 유의하게 억제함을 확인하였다(도 7).

<110> GI Innovation, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 AND IL-1 RECEPTOR ANTAGONIST AND USE THEREOF <130> SPD21-059-GII <150> KR 10-2020-0085355 <151> 2020-07-10 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLP-1 <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLP-1 mt-1 <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLP-1 mt-2(exendin-4) <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLP-1 mt-3(liraglutide) <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NL028 hinge linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 6 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG4Fc <400> 6 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 210 215 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3GG linker <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1Ra <400> 8 Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp 1 5 10 15 Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala 20 25 30 Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val 35 40 45 Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys 50 55 60 Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu 65 70 75 80 Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys 85 90 95 Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu 100 105 110 Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp 115 120 125 Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr 130 135 140 Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 145 150 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIgG signal <400> 9 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 10 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra) <400> 10 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 65 70 75 80 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 85 90 95 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 100 105 110 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 115 120 125 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 130 135 140 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 145 150 155 160 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 165 170 175 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 180 185 190 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 195 200 205 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 210 215 220 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 225 230 235 240 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 245 250 255 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met 290 295 300 Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg 305 310 315 320 Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu 325 330 335 Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu 340 345 350 Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp 355 360 365 Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu 370 375 380 Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly 385 390 395 400 Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys 405 410 415 Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp 420 425 430 Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 435 440 445 <210> 11 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLP-1 <400> 11 catgccgagg gcacctttac ctccgacgtg tcctcctact tggaggaaca ggccgccaaa 60 gagtttatcg cctggctggt caaaggtagg 90 <210> 12 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGLP-1 mt-1 <400> 12 catggcgagg gcacctttac ctccgacgtg tcctcctact tggaggaaca ggccgccaaa 60 gagtttatcg cctggctggt caaaggtggc ggc 93 <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NL028 hinge linker <400> 13 ggaggcggag gatccggtgg tggtggatct ggtggcggag gttctggcgg agctgagtct 60 aagtatggcc ctccttgtcc tccatgtcct 90 <210> 14 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG4Fc <400> 14 gctccagaag ctgctggcgg gccctccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggaccag 60 ctgatgatct ctcggacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tcgatgtgtc ccaagaggac 120 cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180 cctagagagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 240 caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccttcc 300 agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacacc 360 ctgcctccaa gccaagagga aatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag 420 ggcttctacc cttccgacat tgccgtggaa tgggagagca atggccagcc tgagaacaac 480 tacaagacca cacctcctgt gctggactcc gacggctcct tctttctgta ctcccgcctg 540 accgtggaca agtccagatg gcaagagggc aacgtgttct cctgctctgt gctgcacgag 600 gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc ctcagcctgt cccttgga 648 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3GG linker <400> 15 ggtggtggcg gctctggcgg tggcggaagt ggcggaggtg gatccggagg t 51 <210> 16 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1Ra <400> 16 agaccttctg gccggaagtc ctctaagatg caggccttca gaatctggga cgtgaaccag 60 aaaaccttct acctgcggaa caaccagctc gtggccggct atctccaggg acctaacgtg 120 aacctggaag agaagatcga cgtggtgccc atcgagcccc acgctctgtt tttgggaatc 180 cacggcggca agatgtgcct gtcctgtgtg aagtctggcg acgagacacg gttgcagctg 240 gaagccgtga acatcaccga cctgtccgag aaccggaagc aggacaagag attcgccttc 300 atcagatccg acagcggccc taccacctcc ttcgagtctg ctgcttgtcc aggctggttc 360 ctgtgcaccg ccatggaagc tgaccagcct gtgtctctga ccaacatgcc tgacgagggc 420 gtgatggtca ccaagttcta cttccaagag gatgag 456 <210> 17 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIgG signal <400> 17 atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtccgtga ccaccggcgt gcactct 57 <210> 18 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotides coding GI-210B1 with signal peptide <400> 18 atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtccgtga ccaccggcgt gcactctcat 60 ggcgagggca cctttacctc cgacgtgtcc tcctacttgg aggaacaggc cgccaaagag 120 tttatcgcct ggctggtcaa aggtggcggc ggaggcggag gatccggtgg tggtggatct 180 ggtggcggag gttctggcgg agctgagtct aagtatggcc ctccttgtcc tccatgtcct 240 gctccagaag ctgctggcgg gccctccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggaccag 300 ctgatgatct ctcggacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tcgatgtgtc ccaagaggac 360 cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 420 cctagagagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 480 caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccttcc 540 agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacacc 600 ctgcctccaa gccaagagga aatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag 660 ggcttctacc cttccgacat tgccgtggaa tgggagagca atggccagcc tgagaacaac 720 tacaagacca cacctcctgt gctggactcc gacggctcct tctttctgta ctcccgcctg 780 accgtggaca agtccagatg gcaagagggc aacgtgttct cctgctctgt gctgcacgag 840 gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc ctcagcctgt cccttggagg tggtggcggc 900 tctggcggtg gcggaagtgg cggaggtgga tccggaggta gaccttctgg ccggaagtcc 960 tctaagatgc aggccttcag aatctgggac gtgaaccaga aaaccttcta cctgcggaac 1020 aaccagctcg tggccggcta tctccaggga cctaacgtga acctggaaga gaagatcgac 1080 gtggtgccca tcgagcccca cgctctgttt ttgggaatcc acggcggcaa gatgtgcctg 1140 tcctgtgtga agtctggcga cgagacacgg ttgcagctgg aagccgtgaa catcaccgac 1200 ctgtccgaga accggaagca ggacaagaga ttcgccttca tcagatccga cagcggccct 1260 accacctcct tcgagtctgc tgcttgtcca ggctggttcc tgtgcaccgc catggaagct 1320 gaccagcctg tgtctctgac caacatgcct gacgagggcg tgatggtcac caagttctac 1380 ttccaagagg atgag 1395 <210> 19 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GI-210B1 with signal peptide <400> 19 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Glu Glu Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 65 70 75 80 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 85 90 95 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 100 105 110 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 115 120 125 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 130 135 140 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 145 150 155 160 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 165 170 175 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 180 185 190 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 195 200 205 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 210 215 220 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 225 230 235 240 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 245 250 255 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 260 265 270 Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 275 280 285 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser 305 310 315 320 Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe 325 330 335 Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn 340 345 350 Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala 355 360 365 Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys 370 375 380 Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp 385 390 395 400 Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser 405 410 415 Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp 420 425 430 Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn 435 440 445 Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp 450 455 460 Glu 465 <210> 20 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotides coding GI-210B1 <400> 20 catggcgagg gcacctttac ctccgacgtg tcctcctact tggaggaaca ggccgccaaa 60 gagtttatcg cctggctggt caaaggtggc ggcggaggcg gaggatccgg tggtggtgga 120 tctggtggcg gaggttctgg cggagctgag tctaagtatg gccctccttg tcctccatgt 180 cctgctccag aagctgctgg cgggccctcc gtgtttctgt tccctccaaa gcctaaggac 240 cagctgatga tctctcggac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtcgatgt gtcccaagag 300 gaccctgagg tgcagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 360 aagcctagag aggaacagtt caactccacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 420 caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct 480 tccagcatcg aaaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac 540 accctgcctc caagccaaga ggaaatgacc aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc 600 aagggcttct acccttccga cattgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac 660 aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac tccgacggct ccttctttct gtactcccgc 720 ctgaccgtgg acaagtccag atggcaagag ggcaacgtgt tctcctgctc tgtgctgcac 780 gaggccctgc acaatcacta cacccagaag tccctcagcc tgtcccttgg aggtggtggc 840 ggctctggcg gtggcggaag tggcggaggt ggatccggag gtagaccttc tggccggaag 900 tcctctaaga tgcaggcctt cagaatctgg gacgtgaacc agaaaacctt ctacctgcgg 960 aacaaccagc tcgtggccgg ctatctccag ggacctaacg tgaacctgga agagaagatc 1020 gacgtggtgc ccatcgagcc ccacgctctg tttttgggaa tccacggcgg caagatgtgc 1080 ctgtcctgtg tgaagtctgg cgacgagaca cggttgcagc tggaagccgt gaacatcacc 1140 gacctgtccg agaaccggaa gcaggacaag agattcgcct tcatcagatc cgacagcggc 1200 cctaccacct ccttcgagtc tgctgcttgt ccaggctggt tcctgtgcac cgccatggaa 1260 gctgaccagc ctgtgtctct gaccaacatg cctgacgagg gcgtgatggt caccaagttc 1320 tacttccaag aggatgag 1338 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Additional peptides <400> 21 Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1-IgG4 Fc <400> 22 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 65 70 75 80 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 85 90 95 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 100 105 110 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 115 120 125 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 130 135 140 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 145 150 155 160 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 165 170 175 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 180 185 190 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 195 200 205 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 210 215 220 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 225 230 235 240 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 245 250 255 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Ser Leu Gly 275 <210> 23 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotides coding GLP-1-IgG4 Fc <400> 23 catggcgagg gcacctttac ctccgacgtg tcctcctact tggaggaaca ggccgccaaa 60 gagtttatcg cctggctggt caaaggtggc ggcggaggcg gaggatccgg tggtggtgga 120 tctggtggcg gaggttctgg cggagctgag tctaagtatg gccctccttg tcctccatgt 180 cctgctccag aagctgctgg cgggccctcc gtgtttctgt tccctccaaa gcctaaggac 240 cagctgatga tctctcggac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtcgatgt gtcccaagag 300 gaccctgagg tgcagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 360 aagcctagag aggaacagtt caactccacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 420 caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct 480 tccagcatcg aaaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac 540 accctgcctc caagccaaga ggaaatgacc aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc 600 aagggcttct acccttccga cattgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac 660 aactacaaga ccacacctcc tgtgctggac tccgacggct ccttctttct gtactcccgc 720 ctgaccgtgg acaagtccag atggcaagag ggcaacgtgt tctcctgctc tgtgctgcac 780 gaggccctgc acaatcacta cacccagaag tccctcagcc tgtcccttgg a 831

Claims (14)

1. GLP-1의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist)를 포함하는 단량체 두 개를 포함하는 융합단백질 이량체로서,
   상기 융합단백질 이량체의 단량체는 하기 구조식 (I)로 이루어진 것인, 융합단백질 이량체:
   N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편의 변이체-[링커(2)]m-Y-C' (I)
   이때, 상기 구조식 (I)에 있어서,
   상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
   상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
   상기 X는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 GLP-1의 변이체이고,
   상기 Fc 영역 단편의 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지며,
   상기 Y는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 IL-1 수용체 길항제이고,
   상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이며,
   상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항의 융합단백질 이량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
11. 제10항의 벡터가 도입된 형질전환 세포주.
12. i) 제11항의 형질전환 세포주를 배양하는 단계; 및
    ii) 융합단백질 이량체를 회수하는 단계;
    를 포함하는 GLP-1의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist)를 포함하는 융합단백질 이량체의 제조 방법.
13. 제1항의 융합단백질 이량체를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서,
    상기 대사성 질환은 지방간, 비만 및 고지혈증으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 질환인 것인, 약학 조성물.
14. 제1항의 융합단백질 이량체를 포함하는 간세포 지방 축적 억제용 약학 조성물.

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