KR20230127297A - 인간 glp-1 폴리펩티드 변이체 및 그 응용 - Google Patents

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수조우 알파맵 씨오., 엘티디.
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Abstract

본 출원은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 제공하며, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 사용하여 구축된 융합 단백질 또는 면역접합체는 GLP-1 관련 대사 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 그 응용
본 출원은 생물 의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 그 응용에 관한 것이다.
글루카곤유사펩티드(glucagon-like peptide-1, GLP-1)는 소장 상피 L-세포에서 분비되는 인크레틴으로, 건강한 개체의 경우 GLP-1은 체내 영양소 섭취에 반응하여 인슐린 방출을 촉진하고 글루카곤 분비를 억제할 수 있다. II형 당뇨병을 앓고 있는 환자의 경우 생리적 농도를 상회하는 용량의 GLP-1을 주입하면 내인성 인슐린 분비를 회복시키고, 혈당을 떨어뜨리게 된다.
디펩티딜 펩티데이즈 IV(DPPIV)의 가수분해 및 신장의 제거 작용으로 인해, 천연 GLP-1의 혈장 반감기는 짧다. 반감기를 연장하기 위해 수식받은 여러 GLP-1R 작용제(예컨대, 둘라글루타이드(Dulaglutide))가 II형 당뇨병의 치료를 위해 개발되었지만, 최소한의 부작용을 유지하면서도 효과적인 장기 치료 방안을 개발해야 할 필요는 여전하다.
본 출원은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 제공하는 것으로, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 W31, K26, Q23 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치된다.
본 출원은 또한 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 면역접합체를 제공하는 것으로, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 이하 성질 중 적어도 하나의 성질을 갖는다. (1) GLP-1 수용체와 결합 가능, (2) GLP-1 수용체를 활성화시킴으로써, cAMP 수준 제고 가능, (3) 비교적 긴 혈액 반감기, (4) 비교적 높은 체내외 안정성, (5) 비교적 높은 혈장 농도, 및 (6) 혈당 감소 가능.
한편으로, 본 출원은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 제공하는 것으로, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 W31, K26, Q23 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치된다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 인간 GLP-1의 적어도 부분 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Q23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Q23 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Q23 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Q23 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31K, W31R 또는 W31A이다. 예를 들어, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31K 또는 W31R이다. 또 예를 들어, 상기 아미노산 치환은 W31Y이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 상기 Y19에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 상기 Q23에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Q23E, Q23T, Q23S 및 Q23N로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 상기 K26에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 K26R이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 29, 31-53 및 61-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 29, 32-53 및 61-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 29에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 32-53 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 61-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 면역접합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 면역글로불린 Fc 영역을 또한 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG 유래의 Fc 영역이다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체의 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 유래의 Fc 영역이다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 139-143 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 면역글로불린 Fc 영역은 프레임 내 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 링커 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 링커 펩티드를 통해 상기 면역글로불린 Fc 영역에 연결된다.
일부 실시양태에서, 상기 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 144-149 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 링커 펩티드와 상기 면역글로불린 Fc 영역은 프레임 내 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 96, 98-120 및 128-138 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 96, 97-120 및 128-138 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 96에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 99-122 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 128-138 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 융합단백질 또는 면역접합체, 상기 분리된 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하거나 또는 발현하는 세포를 제공한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 융합단백질 또는 면역접합체, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터 또는 상기 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체의 약물 제조에 있어서의 용도를 제공하는 것으로, 상기 약물은 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다.
다른 한편으로, 본 출원은 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용되는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 수요가 있는 피시험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 상기 피시험자에게 유효량의 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 수요가 있는 피시험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 데 사용되는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체를 제공한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체의 약물 제조에 있어서의 용도를 제공하는 것으로, 상기 약물은 수요가 있는 피험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 데 사용된다.
당업자는 이하 상세한 설명으로부터 본 출원의 기타 방면 및 우세를 용이하게 알아낼 수 있을 것이다. 이하 상세한 설명은 단지 본 출원의 예시적인 실시양태를 보여주고 서술하였을 뿐이다. 당업자가 알아낼 수 있는 바와 같이, 본 출원의 내용은 당업자로 하여금 그 개시된 구체적인 실시양태에 대한 변형을 하되 본 출원과 관련된 발명의 사상 및 범위는 벗어나지 않도록 할 수 있다. 이와 상응하게, 본 출원의 도면 및 명세서 설명은 단지 예시적인 것일 뿐 제한적인 것은 아니다.
이하, 특정한 구체적 실시예로 본 출원 발명의 실시양태를 설명할 것이며, 해당 기술을 숙지한 자는 본 명세서에 개시된 내용으로부터 본 출원 발명의 기타 장점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
용어에 대한 정의
본 출원에서, 용어 "GLP-1"이란 통상적으로 글루카곤유사펩티드-1(glucagon like peptide 1)를 가리킨다. 천연 GLP-1 분자는 체내에서 가공을 거치면서 앞 6개 아미노산이 절단되므로, 당업계에서는 GLP-1의 아미노산 서열의 N단의 첫 번째 아미노산을 7번째 위치로 정하고, C단 마지막 아미노산을 37번째 위치로 정하는 것이 관례이다. 가공을 거친 펩티드는 체내에서 한층 더 수식을 받을 수 있고, C단의 글리신 잔기를 제거하고 아미드기로 대체한다. GLP-1은 통상적으로 두 가지 생물학적 활성 형식을 갖는데, 이는 각각 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1 (7-36)NH2이다. 본 출원에 기재된 "GLP-1"은 천연적, 인공합성 또는 수식을 거친 GLP-1 단백질을 포함하며, 또한 온전한 GLP-1 단백질 또는 그 기능성 프래그먼트, 및 상이한 생물학적 활성 형식의 GLP-1 단백질을 포함한다. 예를 들어, 야생형 인간 GLP-1은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그 N말단의 아미노산 잔기 H를 7번째 위치로 표기한다. 따라서, 본 출원의 용어 "K26"이란 통상적으로 GLP-1 단백질 N단 7번째 위치의 H부터 기산하여, 26번째 위치의 아미노산의 위치를 가리키며, SEQ ID NO: 1에 제시되는 아미노산 서열에서 26번째 위치의 아미노산은 K이고; 용어 "W31"이란 통상적으로 GLP-1 단백질 N단 7번째 위치의 H부터 기산하여, 31번째 위치의 아미노산의 위치를 가리키며, SEQ ID NO: 1에 제시되는 아미노산 서열에서 31번째 위치의 아미노산은 W이다.
상기 인간 GLP-1은 개조될 수 있고, 개조된 후의 GLP-1의 변이체는 개조 전의 인간 GLP-1의 적어도 부분 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 예시적인 야생형 인간 GLP-1의 개조된 후 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "인간 GLP-1의 적어도 부분 활성"이란 통상적으로 인간 GLP-1 단백질의 하나 이상의 활성을 갖거나, 또는 인간 GLP-1 단백질의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 또는 그 이상) 활성을 갖는 것을 가리킨다. 상기 "인간 GLP-1의 적어도 부분 활성"의 인간 GLP-1은 야생형일 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 1에 제시되는 아미노산 서열이다. 상기 "인간 GLP-1의 적어도 부분 활성" 중, 인간 GLP-1은 야생형 인간 GLP-1 개조된 후의 GLP-1 변이체일 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열이다. 예를 들어, 본 출원의 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1의 적어도 부분 활성을 가질 수 있다. 일부 다른 상황에서, 본 출원의 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1의 적어도 부분 활성을 가질 수 있다.
상기 활성은 인간 GLP-1 단백질과 동일한 수준의 활성을 가져야 하는 것을 강요하지 않고, 인간 GLP-1 단백질의 활성보다 높거나 근사하거나 또는 낮을 수 있다. 일부 상황에서, "인간 GLP-1의 적어도 부분 활성"이란 GLP-1 수용체와 결합하는 활성, GLP-1 수용체를 활성화시키는 활성, 아데닐사이클라제 활성화시키는 활성, 세포내 고리형 아데노신 일인산(cAMP, Cyclic adenosine monophosphate) 수준 향상을 촉진시키는 활성, 세포내 Ca2+ 수준을 양성 조절하는 활성, 인슐린 분비를 자극시키는 활성, 간 글리코겐 저장량을 증가시키는 활성, 위 배출을 지연시키는 활성, 위 활력을 억제시키는 활성, 식욕을 저하시키는 활성, β세포 사멸을 억제시키는 활성, 식후 글루카곤 분비를 억제시키는 활성, 저혈당을 완화시키는 활성 및 체중을 감소시키는 활성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 가리킬 수 있다. 예를 들어, GLP-1 수용체와의 결합 능력, cAMP와의 발현 수준을 측정함으로써 이를 측정할 수 있다. 상기 "인간 GLP-1의 적어도 부분 활성"은 인간 GLP-1의 융합단백질(예를 들어, Fc 영역의 융합단백질)의 적어도 부분 활성을 포함한다.
본 출원에서, 용어 "GLP-1R"이란 통상적으로 글루카곤유사펩티드-1 수용체(glucagon like peptide 1 receptor)를 가리킨다. GLP-1R과 GLP-1의 결합은 신호전달 연쇄반응을 활성화시킬 수 있고, 아데닐사이클라제의 활성화 및 세포내 cAMP 수준의 증가를 초래하게 된다. 본 출원에 기재된 GLP-1R은 GLP-1R의 활성만 보유한다면 천연 GLP-1R의 전장 분자, 변이체, 프래그먼트, 합성물을 다 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 GLP-1R은 NCBI 데이터베이스 등록 번호가 NP_002053.3에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "폴리펩티드"란 통상적으로 아미드 결합(펩티드 결합이라고도 칭함)을 통해 선형 연결된 단량체(아미노산)로 구성되는 분자를 가리킨다. 용어 "폴리펩티드"는 두 개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 사슬이며, 특정 길이의 생성물을 가리키지는 않는다. 본 출원에 기재된 폴리펩티드는 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 사슬, 또는 두 개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 기타 사슬을 포함하며, 용어 "폴리펩티드"란 이러한 용어 중 임의의 하나를 대체 가능하거나 또는 서로 교환해서 사용할 수 있다. 용어 "폴리펩티드"란 또한 폴리펩티드의 발현 후 수식되는 생성물을 가리킬 수 있으며, 이는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아실화, 공지된 보호성/차단성 원자단에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 또는 비천연적으로 존재하는 아미노산에 의한 수식을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술을 통해 생성될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "변이체"란 통상적으로 천연 생물 활성 단백질과 서열 상동성을 갖는 단백질 분자를 가리킨다. 본 출원에 기재된 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 첨가(삽입 포함), 결실, 수식 및/또는 치환을 통해 바뀐 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이는 동시에 부모 서열의 적어도 하나 치료 및/또는 생물 활성을 보유하고 있으므로 부모 서열과는 상이하다. 예를 들어, 변이체는 부모 단백질과 적어도 0%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체는 천연적 또는 비천연적으로 존재할 수 있다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 비천연적으로 존재하는 변이체를 생성할 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 보존적 또는 비보존적인 아미노산 치환, 삭제 또는 첨가를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "돌연변이"는 통상적으로 임의 형태의 서열(핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 변경 또는 수식을 포함하며, 아미노산 또는 뉴클레오티드의 결실, 절단, 비활성화, 파괴, 치환 또는 전위를 포함한다. 본 출원에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있고, 용어 "치환"이란 통상적으로 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 미리 결정된 부모 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 잔기를 대체하는 것을 가리킨다. 상기 하나 이상의 대체된 아미노산 잔기는 "천연적으로 존재하는 아미노산 잔기"(즉 유전자 코드로 넘버링)일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "힌지 영역"이란 통상적으로 면역글로불린 중쇄 CHl 및 CH2 기능 영역 사이의 영역을 가리킨다. 힌지 영역은 통상적으로 IgG, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "융합단백질"이란 통상적으로 아미노산 서열이 직접 또는 간접적(예를 들어, 링커 펩티드와 같은 링커를 통해)으로 이질성 폴리펩티드(예를 들어, 앞의 폴리펩티드 또는 그 도메인과 무관한 폴리펩티드)의 아미노산 서열에 융합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이러한 폴리펩티드로 이루어지는 보다 긴 폴리펩티드를 가리킨다. 일부 상황에서, 융합단백질은 상기 폴리펩티드 변이체, 및 상기 폴리펩티드 변이체와 직접 또는 간접적으로 연결(예를 들어, 링커 펩티드를 통해 연결)되는 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 링커 펩티드는 GS, GAP, G4S, (G4S)2, (G4S)3 또는 (G4S)4일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "면역접합체"란 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질이 관심 있는 활성 물질(예를 들어 단백질, 핵산, 약물 또는 표지 분자 등)이 직접 또는 간접적으로 연결(예를 들어, 링커를 통한 공유 연결)됨으로써 형성되는 접합체를 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "면역글로불린"이란 통상적으로 대체로 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 가리킨다. 공지된 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α(IgA1 및 IgA2), γ(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε 및 μ 고정 영역 유전자, 및 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25KD와 214개 아미노산)의 NH2-말단(약 110개 아미노산)은 가변 영역 유전자에 의해 코딩되고, COOH-말단은 κ 또는 λ 고정 영역 유전자에 의해 코딩된다. 일반적으로, 면역글로불린은 약 150,000돌턴의 이종사량체 당단백질일 수 있으며, 이는 두 개의 동일한 경쇄(L) 및 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 천연 면역글로불린은 대체로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결되는 두 개의 Fab 분자와 Fc 영역으로 구성된다.
본 출원에서, 용어 "Fc 영역"이란 통상적으로 면역글로불린 중쇄의 C단 영역을 가리키고, 상기 C단 영역은 파파인을 통해 온전한 항체를 소화시킴으로써 생성될 수 있다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 통상적으로 2개의 불변 도메인(CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함하며, CH4 도메인을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "프레임 내 융합"이란 통상적으로 두 개 이상의 개방형 해독틀(ORF)이 원시 ORF의 정확한 해독틀을 유지하는 방식으로 연결됨으로써 연속적이고 보다 긴 ORF를 형성하는 것을 가리킨다. 따라서, 얻어진 재조합 융합단백질은 원시 ORF에 의해 코딩된 폴리펩티드를 함유하는 두 개 이상의 구간에 상응하는 단일 단백질이다.
본 출원에서, 용어 "핵산 분자"란 통상적으로 천연 환경으로부터 분리되거나 또는 인공합성되는 임의의 길이의 분리형식 뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체를 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "벡터"란 통상적으로 적합한 숙주세포에서 자기 복제 가능한 핵산 분자를 가리키며, 이는 삽입된 핵산 분자를 숙주세포 내 및/또는 숙주세포 사이에 전이시킨다. 상기 벡터는 주로 DNA 또는 RNA를 세포에 삽입하기 위한 벡터, 주로 DNA 또는 RNA를 복제하기 위한 벡터, 및 주로 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역의 발현을 위한 벡터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 또한 여러 가지의 이상 기능을 구비한 벡터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 적합한 숙주세포에 도입될 때 전사되어 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 통상적으로, 상기 벡터를 포함하는 적합한 숙주세포를 배양함으로써, 상기 벡터가 원하는 발현 생성물을 생성할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "세포"란 통상적으로 본 출원에 기재된 핵산 분자를 포함 가능하거나 또는 이미 포함한 플라스미드 또는 벡터, 또는 본 출원에 기재된 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 발현할 수 있는 개체 세포, 세포계 또는 세포 배양물을 가리킨다. 상기 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함할 수 있다. 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이로 인해 자손 세포와 원시 부모 세포는 형태 또는 유전체 면에서 완전히 일치하지는 않을 수 있으나, 본 출원에 기재된 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 발현할 수만 있으면 충분하다. 상기 숙주세포는 본 출원에 기재된 벡터를 사용하여 체외에서 세포를 형질전환시킴으로써 얻을 수 있다. 상기 숙주세포는 원핵 세포(예를 들어, 대장균)일 수 있고, 진핵 세포(예를 들어, 효모세포, 예를 들면 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, COS-1 세포, NS0 세포 또는 골수종 세포)일 수도 있다. 상기 재조합 숙주세포는 어떤 특정 세포뿐만 아니라 이들 세포의 자손도 포함한다.
본 출원에서, 용어 "대사성 질환 또는 병증"이란 통상적으로 체내의 정상적인 대사 과정을 방해하여 기체로 하여금 에너지를 정상적으로 사용 및/또는 저장할 수 없게 만드는 질환 또는 병증을 가리킨다. 상기 대사성 질환 또는 병증은 당질대사 장애인 질환, 지방 대사 장애인 질환 및/또는 세포 사립체 장애인 질환을 가리킬 수 있다. 상기 대사성 질환 또는 병증은 음식, 독소 또는 감염과 관련될 수도 있고, 유전성 질환일 수도 있다. 상기 대사성 질환 또는 병증은 대사 관련 효소의 결핍, 또는 대사 관련 효소의 기능 이상으로 인해 일으킨 질환 또는 병증을 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병, 비만 및 기타 GLP-1 관련 대사성 병증으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서, "둘라글루타이드(dulaglutide)"란 통상적으로 GLP-1 유사체를 포함하는 이질성 융합단백질을 가리키며, 이는 GLP-1 유사체(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같음)와 인간 IgG4 유래 Fc 영역(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 143에 제시된 바와 같음)이 소분자 펩티드(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 148에 제시된 바와 같음)를 통해 공유 결합되어 형성된다. 둘라글루타이드의 상품명은 TRULICITY® 또는 트루리시티®라고 한다. 둘라글루티드는 SEQ ID NO: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다(PCT 특허 WO2009009562 및 미국 특허 US7452966 참조).
본 출원에서, 용어 "포함"이란 통상적으로 명시된 특징을 포함하나 기타 요소를 배제하지 않다는 것을 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "약"이란 통상적으로 지정된 수치 이상 또는 이하 0.5%-10%의 범위 내에서 변동되며, 예를 들어 지정 수치 이상 또는 이하 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%의 범위 내에서 변동되는 것이다.
폴리펩티드 변이체
한편으로, 본 출원은 인간 GLP-1의 적어도 부분 활성을 갖는 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 제공한다. 일부 상황에서, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 GLP-1 수용체와 결합하는 활성, GLP-1 수용체를 활성화시키는 활성, 아데닐사이클라제 활성화시키는 활성, 세포내 고리형 아데노신 일인산(cAMP, Cyclic adenosine monophosphate) 수준 향상을 촉진시키는 활성, 세포내 Ca2+ 수준을 양성 조절하는 활성, 인슐린 분비를 자극시키는 활성, 간 글리코겐 저장량을 증가시키는 활성, 위 배출을 지연시키는 활성, 위 활력을 억제시키는 활성, 식욕을 저하시키는 활성, β세포 사멸을 억제시키는 활성, 식후 글루카곤 분비를 억제시키는 활성, 저혈당을 완화시키는 활성 및 체중을 감소시키는 활성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, GLP-1 수용체와의 결합 능력, cAMP와의 발현 수준을 측정함으로써 이를 측정할 수 있다. 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 활성은 인간 GLP-1 활성의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 또는 그 이상)일 수 있다.
SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG(SEQ ID NO: 2), 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2-4개(예를 들어 2-3개, 3개 또는 2개)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 K26, W31, Y19 및 Q23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
본 출원에서, 상기 아미노산 위치 "Xn"이란 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열 중 n번째 위치에 상응하는 잔기 X에서 발생하는 아미노산 치환을 가리키는 것으로, 여기서 n은 양의 정수(GLP-1의 경우, n은 7부터 기산)이고, X는 임의의 아미노산 잔기의 약자이다. 예를 들어, 아미노산 위치 "W31"이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열의 31번째 위치에 상응하는 위치를 표시한다. SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열에 대하여, 아미노산 잔기 X와 위치 n의 대응 관계는 도 32에 도시된 바와 같다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Q23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31 및 K26 아미노산 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 29에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Y19 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31 및 Y26 아미노산 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 47-53 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Q23 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 43-46 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, K26 및 Y19 아미노산 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 36-42 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Q23 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, K26 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 32-35 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 Y19 및 Q23 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, Y19 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 3개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 3개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Q23 아미노산 위치에서의 3개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 3개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31, K26 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 Y19, K26 및 Q23 아미노산 위치에서의 3개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 3개의 아미노산 돌연변이를 가지며, Y19, K26 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, Y19 및 Q23 아미노산 위치에서의 3개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 3개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31, Y19 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26, Y19 및 Q23 아미노산 위치에서의 4개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 4개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31, K26, Y19 및 Q23 아미노산 위치에 위치될 수 있다.
본 출원에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 돌연변이는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체로 하여금 여전히 인간 GLP-1(예를 들어, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1 단백질)의 적어도 부분 활성을 갖도록 한다. 상기 아미노산 돌연변이는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 융합단백질로 하여금 여전히 인간 GLP-1(예를 들어, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1 단백질)의 융합단백질의 적어도 부분 활성을 갖도록 한다. 상기 아미노산 돌연변이는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 Fc 영역의 융합단백질로 하여금 여전히 인간 GLP-1(예를 들어, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1 단백질)과 Fc 영역의 융합단백질의 적어도 부분 활성을 갖도록 한다.
본 출원에서, 상기 K26에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 K26R일 수 있다.
본 출원에서, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31A, W31R 또는 W31K일 수 있다. 본 출원에서, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31K 또는 W31R일 수 있다. 예를 들어, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 W31Y일 수 있다.
본 출원에서, 상기 Y19에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 또는 Y19S일 수 있다.
본 출원에서, 상기 Q23에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 Q23E, Q23T, Q23S 또는 Q23N일 수 있다.
본 출원에서, 아미노산 치환 "XnY"란 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열 중 n번째 위치에 상응하는 잔기 X가 아미노산 잔기 Y에 의해 치환되는 것을 가리키는 것으로, 여기서 n은 양의 정수(GLP-1의 경우, n은 7부터 기산)이고, X 및 Y는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기의 약자이며, X와 Y는 다르다. 예를 들어, 아미노산 치환 "W31Y"란 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열 중 31번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기 W가 아미노산 잔기 Y에 의해 치환되는 것을 가리킨다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 치환은 1) K26R; 2) W31Y, W31R, W31K 및 W31A로부터 선택되는 임의의 하나; 3) Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로부터 선택되는 임의의 하나; 및 4) Q23N, Q23T, Q23S 및 Q23E로부터 선택되는 임의의 하나;로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 1) K26R; 2) W31Y, W31R, W31K 및 W31A로부터 선택되는 임의의 하나; 및 3) Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로부터 선택되는 임의의 하나;로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 1) K26R; 2) W31Y, W31R, W31K 및 W31A로부터 선택되는 임의의 하나; 및 3) Q23N, Q23T, Q23S 및 Q23E로부터 선택되는 임의의 하나;로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 상기 K26에 있는 아미노산 치환은 K26R일 수 있고, 상기 W31에 있는 아미노산 치환은 W31Y, W31R, W31K 및 W31A일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31Y 및 K26R의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 Q23E를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 Y19A를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y 및 Q23E를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y 및 Y19A를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y 및 K26R을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 29, 31 및 61-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 29 및 61-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열의 아미노산 치환은 W31Y 및 K26R일 수 있으며, 예를 들어 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 29에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 Q23E 및 K26R을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 Y19A 및 K26R을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, W31에 있는 아미노산 치환 및 Q23에 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 Q23에 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 61-64 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 Y19에 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 65-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Q23N을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 61에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Q23T를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 62에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Q23S를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 63에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Q23E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 64에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19A를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 71에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19L을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 66에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19T를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 67에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19F를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 65에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19I를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 68에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19V를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 69에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19S를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 70에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 153에 제시되는 아미노산 서열 HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAX26EFIAX31LVKGGG를 포함할 수 있으며; 여기서, X19=Y, A, L, T, F, I, V 또는 S; X23=Q, E, T, S 또는 N; X26=K 또는 R; X31=W, A, R, K 또는 Y이다. 여기서, X19=Y, X23=Q, X26=K 및 X31=W는 전부 동시에 존재하는 것이 아니고, 또는 X19=Y, X23=Q, X26=K 및 X31=W 중 적어도 세 가지는 동시에 존재하는 것이 아니다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 153에 제시되는 아미노산 서열 HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAX26EFIAX31LVKGGG를 포함할 수 있으며; 여기서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산과 비교하면 X19, X23, X26 및/또는 X31에 있는 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 X19에 있는 아미노산 Y는 A, L, T, F, I, V 또는 S로 치환될 수 있고; X23에 있는 아미노산 Q는 E, T, S 또는 N으로 치환될 수 있고; X26에 있는 아미노산 K는 R로 치환될 수 있고; X31에 있는 아미노산 W는 Y, K, R 또는 A로 치환될 수 있다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 150에 제시되는 아미노산 서열 HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAREFIAYLVKGGG를 포함할 수 있으며; 여기서, X19=Y, A, L, T, F, I, V 또는 S; X23=Q, E, T, S 또는 N이다. 여기서, X19=Y 및 X23=Q는 동시에 존재하는 것이 아니다. 본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 150에 제시되는 아미노산 서열: HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAREFIAYLVKGGG를 포함할 수 있는 것으로, 여기에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 X19 및 X23 부위에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기에서, X19에 있는 아미노산 Y는 A, L, T, F, I, V 또는 S로 치환될 수 있고; X23에 있는 아미노산 Q는 E, T, S 또는 N으로 치환될 수 있다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 151에 제시되는 아미노산 서열 HGEGTFTSDVSSYLEEX23AAREFIAYLVKGGG를 포함할 수 있으며; 여기서, X23=E, T, S 또는 N이다. 본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 151에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 X23에 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X23에 있는 아미노산 Q는 E, T, S 또는 N으로 치환될 수 있다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 152에 제시되는 아미노산 서열 HGEGTFTSDVSSX19LEEQAAREFIAYLVKGGG를 포함할 수 있으며; 여기서, X19=A, L, T, F, I, V 또는 S이다. 본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 151에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 X19에 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 여기서 X19에 있는 아미노산 Y는 A, L, T, F, I, V 또는 S로 치환될 수 있다.
융합단백질 또는 면역접합체
다른 한편으로, 본 출원은 본 출원에 기재된 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 포함할 수 있는 융합단백질 또는 면역접합체를 제공한다. 본 출원에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 1개, 2개 또는 그 이상(예를 들어, 3개, 4개, 5개)의 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 면역글로불린 Fc 영역을 또한 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄 고정 영역 2(CH2) 및 중쇄 고정 영역 3(CH3)을 포함할 수 있고, 통상적으로 해당 항체 유래의 두 개의 항원 결합 영역(Fab 프래그먼트)은 함유하지 않는다. 이외, 본 출원의 면역글로불린 Fc 영역은 천연 단백질과 유사한 생리학적 활성을 갖기만 한다면 전부 또는 부분의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 본 출원의 Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 유래의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG 유래의 Fc 영역일 수 있다. 상기 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역은 인간 IgG4로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체의 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역을 또한 포함할 수 있다. 상기 힌지 영역은 IgG로부터 유래될 수 있다. 상기 힌지 영역은 인간 IgG로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 C단에 위치될 수 있으며, 예를 들어, 상기 힌지 영역은 상기 Fc 영역 CH2의 N단에 위치될 수 있다.
예를 들어, 상기 Fc 영역은 SEQ ID N: 139-143에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질 또는 면역접합체의 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 142 또는 143에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 예를 들어, 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 143에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 일단은 상기 Fc 영역의 일단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 프레임 내 융합을 통해 이루어진다. 일부 상황에서, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 C단은 상기 Fc 영역의 N단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 상황에서, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 상기 Fc 영역은 링커(예를 들어, 링커 펩티드)를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 링커 펩티드는 GS, GAP, G4S, (G4S)2, (G4S)3 또는 (G4S)4로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 144-149 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 N단에서 C단으로, 순차적으로 본 출원에 기재된 임의의 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 기재된 링커 펩티드 및 기재된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 상기 융합단백질 또는 면역접합체는 N단에서 C단으로, 순차적으로 본 출원에 기재된 임의의 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 기재된 링커 펩티드(G4S)3(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 148과 같음) 및 IgG4 유래의 Fc 영역(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 143과 같음)을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 본 출원에 기재된 융합단백질 또는 면역접합체는 SEQ ID NO: 96, 98-120 및 128-138 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 융합단백질 또는 면역접합체는 생물학적 활성을 갖는다. 생물학적 활성이란 체내 또는 체외 결합을 통해 GLP-lR을 활성화시키고 반응을 일으키는 능력을 가리킨다. 상기 반응은 인슐린의 분비, 글루카곤의 억제, 식욕 억제, 체중 감소, 포만감 유도, 아폽토시스 억제, 췌장 β세포 증식 유도 및 췌장 β세포 분화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표성 있는 일부 융합단백질에 대해 체외 및 체내 활성을 테스트한다.
본 출원에 기재된 융합단백질 또는 면역접합체는, 실시예 2에서 본 출원에 기재된 융합단백질의 인간 GLP-lR과의 상호작용 능력을 반영한 것으로, 이는 예를 들어 ELISA 방법을 사용하여 측정한다. 실시예 3은 본 출원에 기재된 융합단백질의 GLP-1R에 대한 체외 활성화 능력을 반영하였고, GLP-1R의 활성화가 아데닐사이클라제의 활성화를 일으키고, 효소의 이 활성화가 또한 cAMP 반응요소 결합단백질(CREB)에 의해 구동되는 보고 유전자의 발현을 유도하며, 예를 들어, 루시페라제 보고 유전자의 형광 강도 또는 cAMP 발현량으로 반영된다. 실시예 4는 상기 융합단백질이 비교적 긴 혈액 반감기를 갖는 다는 것을 반영하였다. 실시예 5는 본 출원에 기재된 융합단백질이 향상된 혈당 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 반영하였다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 GLP-1-XX라고 명명하며, 여기서, "XX"는 아미노산 치환을 의미하고, 예를 들어 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 GLP-WY의 경우, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 GLP-WY의 아미노산 돌연변이가 31번째 아미노산 잔기 W가 아미노산 잔기 Y에 의해 치환된 것임을 의미하고; 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 GLP-KRWYYA의 경우, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 GLP- KRWYYA의 아미노산 돌연변이가 19번째 아미노산 잔기 Y가 아미노산 잔기 A에 의해 치환되고, 26번째 아미노산 잔기 K가 아미노산 잔기 R에 의해 치환되고, 및 31번째 아미노산 잔기 W가 아미노산 잔기 Y에 의해 치환된 것임을 의미한다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 Fc 영역의 융합단백질을 GM-XX라고 명명하며, 여기서, "XX"는 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 상응 아미노산 치환을 의미한다.
핵산 분자, 벡터, 세포 및 제조방법
다른 한편으로, 본 출원은 또한 본 출원에 기재된 폴리펩티드 변이체 또는 기재된 융합단백질 또는 면역접합체를 코딩할 수 있는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 핵산 분자 중 각각의 핵산 분자는 온전한 폴리펩티드 변이체 또는 상기 융합단백질 또는 면역접합체를 코딩할 수 있으며, 이들의 일부를 코딩할 수도 있다.
본 출원에 기재된 핵산 분자는 분리 가능한 것이다. 예를 들어, 이하 방법을 통해 생성 또는 합성될 수 있다. (i) 체외에서의 증폭, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하여 생성됨, (ii) 클로닝 재조합에 의한 생성, (iii) 예를 들어 효소 분해 및 겔 전기영동 분리에 의한 정제, 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성에 의한 합성. 일부 실시양태에서, 상기 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 핵산 분자이다. 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) 및 T. J. Silhavy, M. L. Bennan 및 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) 및 by Ausubel, F. M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, pub. Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience(1987)에 기재된 기술들을 포함한다. 요컨대, 유전체 DNA 프래그먼트, cDNA 및 RNA로부터 상기 핵산을 제조할 수 있는 것으로, 모든 이러한 핵산은 세포로부터 직접 추출하거나 또는 여러 가지 증폭 방법(PCR 및 RT-PCR을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 통해 재조합하여 생성할 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 예를 들어, 상기 벡터는 하나 이상의 상기 핵산 분자를 포함할 수 있다. 이외, 상기 벡터에는 또한 기타 유전자가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 적당한 숙주세포 및 적당한 조건 하에서 해당 벡터의 표지 유전자를 선택하도록 허용한다. 이외, 상기 벡터는 또한 코딩 영역이 적당한 숙주에서 정확하게 발현되도록 허용하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 제어 요소는 당업자에게 공지된 것이며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 유전자 전사 또는 mRNA 번역을 조절하는 기타 제어 요소를 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산 분자는 상기 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 기타 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
다른 한편으로, 본 출원은 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 본 출원에 기재된 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 각종 또는 각각의 숙주세포는 하나 이상의 본 출원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각종 또는 각각의 숙주세포는 다수 개(예를 들어, 2개 이상) 또는 여러 가지(예를 들어, 2가지 이상)의 본 출원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 벡터를 상기 세포, 예를 들어 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포), CHO 세포, NS0 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293A 세포, 또는 식물 유래의 세포와 같은 기타 진핵 세포, 진균 세포 또는 효모 세포 등 내에 도입시킬 수 있다. 본 출원에 기재된 벡터는 당업계에서 공지된 방법(예를 들어 전기천공법, 리포펙션 등)에 의해 상기 세포 내에 도입시킬 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은 본 출원에 기재된 폴리펩티드 변이체, 기재된 융합단백질 또는 면역접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드 변이체, 상기 융합단백질 또는 면역접합체로 하여금 발현하게 만든 조건 하에서, 본 출원에 기재된 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적당한 배지, 적당한 온도 및 배양 시간 등을 사용하는 것을 통해 이루어질 수 있으며, 이러한 방법은 당업자에게 공지된 것이다.
일부 상황에서, 상기 방법은 또한 본 출원에 기재된 폴리펩티드 변이체, 기재된 융합단백질 또는 면역접합체를 수확(예를 들어, 분리 및/또는 정제)하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 G-아가로스 또는 단백질 A-아가로스를 택하여 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있고, 또한 겔 전기영동 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피 등으로 본 출원에 기재된 폴리펩티드 변이체, 기재된 융합 단백질 또는 면역접합체를 정제 및 분리시킬 수 있다.
약학 조성물 및 용도
다른 한편으로, 본 출원은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 융합단백질 또는 면역접합체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 또는 상기 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
예를 들어, 상기 약학적으로 허용 가능한 보조제는 완충제, 항산화제, 방부제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 당, 킬레이트제, 반대이온, 금속 복합물 및/또는 비이온성 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 약학 조성물은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 종양 부위에서의 제자리 투여, 흡입, 직장 투여, 질 투여, 경피 투여 또는 피하 저장고를 통한 투여를 위해 배합될 수 있다.
본 출원에 기재된 약학 조성물은 대사성 질환 또는 병증을 치료할 수 있다. 상기 약학 조성물은 당뇨병(예를 들어 고혈당증, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 내당능 장애, 인슐린 비의존성 당뇨병, MODY(저연령대 성숙기발병당뇨병), 임신성 당뇨병의 치료 및/또는 글리코실화 헤모글로빈(HbAlC)), 당뇨병 전단계, 고혈압, 고혈당증 및/또는 이상지질혈증(또는 이러한 대사 위험 요소의 조합)의 완화에 사용될 수 있다. 당뇨병의 급성 증상에는 과도한 소변 생성, 과도한 소변 생성으로 인한 보상적 갈증 및 수분 섭취 증가, 시야 흐림, 원인불명의 체중 감소, 기면 및 에너지 대사 변화가 포함된다. 당뇨병의 만성 고혈당증은 대혈관 및 미세혈관 합병증과 관련되는 것으로, 상기 합병증은 여러 기관(특히 눈(특히 당뇨병성 망막병증의 형태), 신장(당뇨병성 신병증의 형태), 신경학적(당뇨병성 신경병증의 형태), 심장 및 혈관)의 장기적인 손상, 기능성 장애 및 일부 상황 하에서의 최종 쇠약을 초래할 수 있다. 상기 약학 조성물은 또한 체중 증가에 대한 치료, 체중 감소 촉진, 과체중 감소 및/또는 비만 치료(예를 들어 식욕, 급식, 음식 섭취, 칼로리 섭취 및/또는 에너지 소비를 조절하는 것을 통함) (병적 비만 포함) 및 관련 질환, 이상 및 건강 상태(비만 관련 염증, 비만 관련 담낭 질환 및 비만 유발 수면 무호흡증을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 대한 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병, 비만 및 기타 GLP-1 관련 대사성 병증으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 빈도 및 투여량은 다수 개 관련 요소에 의해 결정될 수 있는 것으로, 상기 요소는 치료받을 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 및 활성 성분으로서의 약물 유형을 포함한다. 상기 약학 조성물은 체내 효능 및 농축 지속시간이 양호하므로, 상기 약물의 투여 빈도 및 투여량을 유의하게 줄일 수 있다.
본 출원은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 제공하며, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 사용하여 구축된 융합 단백질 또는 면역접합체는 GLP-1 관련 대사 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 출원과 관련된 발명의 구체적 특징이 첨부된 청구범위에 나타나는 바와 같다. 이하 상세하게 설명될 예시적인 실시양태 및 도면을 통해 본 출원과 관련된 발명의 특징 및 우세를 보다 잘 이해할 수 있다. 도면의 간단한 설명은 다음과 같다.
도 1은 융합단백질 GM-WY 및 GM-FY와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 2는 융합단백질 GM-WY와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 3은 융합단백질 GM-WR 및 GM-FH와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 4는 융합단백질 GM-WY, GM-QN, GM-QT, GM-QS, GM-YL, GM-YT 및 GM-YF와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 5는 융합단백질 GM-WY, GM-YI, GM-YV, GM-YS, GM-QE 및 GM-YA와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 6은 융합단백질 GM-FT, GM-FN, GM-FS 및 GM-FQ와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 7은 융합단백질 GM-FE, GM-FV, GM-FK 및 GM-FI와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8은 융합단백질 GM-WY, GM-KRFY, GM-KRWY 및 GM-KRWYFY와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 9는 융합단백질 GM-WY, GM-KRQN, GM-KRQT, GM-KRQS, GM-KRYL, GM-KRYT 및 GM-KRYF와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 10은 융합단백질 GM-KRWY, GM-KRYI, GM-KRYV, GM-KRYS, GM-KRQE, 및 GM-KRYA와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 11은 융합단백질 GM-WY, GM-WYQN, GM-WYQS 및 GM-WYQT와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 12는 융합단백질 GM-WY, GM-WYYL, GM-WYYT, GM-WYYF, GM-WYYI, GM-WYYV 및 GM-WYYS와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 13은 융합단백질 GM-WYYA 및 GM-WYQE와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 14A 내지 도 14B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-WYYA의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 15A 내지 도 15B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-WYQE의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 16은 융합단백질 GM-WYFL 및 GM-WY와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 17은 융합단백질 GM-WIFL, GM-WA, GM-WL 및 GM-WLFL과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 18은 융합단백질 GM-KRWYYF, GM-KRWYYL, GM-KRWYYT, GM-KRWYQN, GM-KRWYQT 및 GM-KRWYQS와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 19는 융합단백질 GM-KRWYYI, GM-KRWYYV, GM-KRWYYS, GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 20은 융합단백질 GM-KRWYYA 및 GM-KRWYQN과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 21A 내지 도 21B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-KRWY 및 GM-KRWYQE의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 22A 내지 도 22B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-KRWYYA 및 GM-KRWYYL의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 23A 내지 도 23B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-KRWYYS 및 GM-KRWYYI의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 24A 내지 도 24B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-KRWYYT 및 GM-KRWYQN의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 25A 내지 도 25B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-KRWYQT 및 GM-KRWYQS의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 26A 내지 도 26B는 6h(A) 및 24h(B)에 융합단백질 GM-KRWYYA 및 GM-KRWYQN의 cAMP/PKA 신호통로에 대한 활성화 작용을 도시하였다.
도 27은 융합단백질 GM-KRWY의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 28은 융합단백질 GM-KRWYYL, GM-KRWYYI 및 GM-KRWYYA의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 29는 융합단백질 GM-KRWYQN, GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 30A 내지 도 30B는 융합단백질 GM-KRWY의 경구 당부하 시험에서의 혈당감소 활성을 도시하였다.
도 31A 내지 도 31B는 융합단백질 GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA의 경구 당부하 시험에서의 혈당감소 활성을 도시하였다.
도 32는 본 출원의 아미노산 서열에 대한 넘버링 예시를 도시하였다.
도 33은 융합단백질 GM-KRWY, GM-KAWA, GM-KAWY 및 GM-KRWA와 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
이하 실시예는 그 어떠한 이론에 의해서도 제한되지 않고, 단지 본 출원의 융합 단백질, 제조 방법 및 용도 등을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 출원의 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
본 출원의 실시예에서 사용된 양성 대조 둘라글루타이드(Dulaglutide)는 Eli Lilly & Co의 당뇨병 약물로서, 코드 번호는 LY-2189265이고, 이 둘라글루타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 바와 같으며, 본 출원에서는 GLP-1-Fc 또는 KN042라고 칭한다.
실시예 1: 융합단백질의 제조
GLP-1 폴리펩티드 변이체 GLP-1-XX 및 Fc의 융합단백질을 제조하는 것으로, N단에서 C단으로, 순차적으로는 GLP-1 폴리펩티드 변이체(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5-71 중 임의의 하나에 제시된 바와 같음), 링커 펩티드(G4S)3 및 IgG4 유래의 Fc 영역을 포함한다.
융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 세포에 주입하고, 발현시켜 정제하여 융합단백질 GM-XX를 얻는다. 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 72-138 중 임의의 하나에 제시된 바와 같다. 본 출원의 융합단백질과 대응 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 돌연변이 및 서열은 표 1에 나타난 바와 같다.
실시예에서 사용된 융합단백질, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 돌연변이 및 서열
융합단백질 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체
명칭 아미노산 돌연변이 SEQ ID NO
GM-WY GLP-1-WY W31Y 5
GM-WR GLP-1-WR W31R 6
GM-WK GLP-1-WK W31K 7
GM-FY GLP-1-FY F28Y 8
GM-FH GLP-1-FH F28H 9
GM-FT GLP-1-FT F28T 10
GM-FN GLP-1-FN F28N 11
GM-FS GLP-1-FS F28S 12
GM-FQ GLP-1-FQ F28Q 13
GM-FE GLP-1-FE F28E 14
GM-FV GLP-1-FV F28V 15
GM-FK GLP-1-FK F28K 16
GM-FI GLP-1-FI F28I 17
GM-QN GLP-1-QN Q23N 18
GM-QT GLP-1-QT Q23T 19
GM-QS GLP-1-QS Q23S 20
GM-QE GLP-1-QE Q23E 21
GM-YL GLP-1-YL Y19L 22
GM-YT GLP-1-YT Y19T 23
GM-YF GLP-1-YF Y19F 24
GM-YI GLP-1-YI Y19I 25
GM-YV GLP-1-YV Y19V 26
GM-YS GLP-1-YS Y19S 27
GM-YA GLP-1-YA Y19A 28
GM-KRWY GLP-1-KRWY W31Y, K26R 29
GM-KRFY GLP-1-KRFY F28Y, K26R 30
GM-KRWYFY GLP-1-KRWYFY W31Y, K26R, F28Y 31
GM-KRQN GLP-1-KRQN K26R, Q23N 32
GM-KRQT GLP-1-KRQT K26R, Q23T 33
GM-KRQS GLP-1-KRQS K26R, Q23S 34
GM-KRQE GLP-1-KRQE K26R, Q23E 35
GM-KRYL GLP-1-KRYL K26R, Y19L 36
GM-KRYT GLP-1-KRYT K26R, Y19T 37
GM-KRYF GLP-1-KRYF K26R, Y19F 38
GM-KRYI GLP-1-KRYI K26R, Y19I 39
GM-KRYV GLP-1-KRYV K26R, Y19V 40
GM-KRYS GLP-1-KRYS K26R, Y19S 41
GM-KRYA GLP-1-KRYA K26R, Y19A 42
GM-WYQN GLP-1-WYQN W31Y, Q23N 43
GM-WYQS GLP-1-WYQS W31Y, Q23S 44
GM-WYQT GLP-1-WYQT W31Y, Q23T 45
GM-WYQE GLP-1-WYQE W31Y, Q23E 46
GM-WYYL GLP-1-WYYL W31Y, Y19L 47
GM-WYYT GLP-1-WYYT W31Y, Y19T 48
GM-WYYF GLP-1-WYYF W31Y, Y19F 49
GM-WYYI GLP-1-WYYI W31Y, Y19I 50
GM-WYYV GLP-1-WYYV W31Y, Y19V 51
GM-WYYS GLP-1-WYYS W31Y, Y19S 52
GM-WYYA GLP-1-WYYA W31Y, Y19A 53
GM-WYFY GLP-1-WYFY W31Y, F28Y 54
GM-WYFL GLP-1-WYFL W31Y, F28L 55
GM-WA GLP-1-WA W31A 56
GM-WL GLP-1-WL W31L 57
GM-FL GLP-1-FL F28L 58
GM-WIFL GLP-1-WIFL W31I, F28L 59
GM-WLFL GLP-1-WLFL W31L, F28L 60
GM-KRWYQN GLP-1-KRWYQN W31Y, K26R, Q23N 61
GM-KRWYQT GLP-1-KRWYQT W31Y, K26R, Q23T 62
GM-KRWYQS GLP-1-KRWYQS W31Y, K26R, Q23S 63
GM-KRWYQE GLP-1-KRWYQE W31Y, K26R, Q23E 64
GM-KRWYYF GLP-1-KRWYYF W31Y, K26R, Y19F 65
GM-KRWYYL GLP-1-KRWYYL W31Y, K26R, Y19L 66
GM-KRWYYT GLP-1-KRWYYT W31Y, K26R, Y19T 67
GM-KRWYYI GLP-1-KRWYYI W31Y, K26R, Y19I 68
GM-KRWYYV GLP-1-KRWYYV W31Y, K26R, Y19V 69
GM-KRWYYS GLP-1-KRWYYS W31Y, K26R, Y19S 70
GM-KRWYYA GLP-1-KRWYYA W31Y, K26R, Y19A 71
GM-KAWA GLP-1-KAWA W31A, K26A 154
실시예 2: 본 출원 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 친화력
ELISA를 사용하여 실시예 1의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 친화력을 측정한다. GLP-1 수용체와 마우스 Fc를 발현하는 융합단백질을 GLP1R-muFc(SEQ ID NO: 3)라고 칭하고, GLP1R-muFc를 5μg/ml로 희석시켜, 96웰 플레이트에 플레이팅시키고, 실온에서 30min 동안 고정시킨다. PBS로 1회 세척 후 1% BSA로, 37℃에서 30min 동안 밀폐하고, 0.05% PBST20으로 3회 세척한다. 각 웰에 50μl, 10μg/ml의 4배 농도 구배로 희석한 검사대상 샘플을 첨가하고, KN042를 양성 대조로 한다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 5회 세척한다. 각 웰에 50μl의 1% BSA가 함유된 0.05% PBST20으로 2000배 희석된 마우스 단클론 HP6023 항 인간 IgG4Fc-HRP(abcam, ab99817)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 5회 세척한다. 각 웰에 50μl TMB를 첨가하여 3min 동안 발색하고, 50μl/웰 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 종료하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)를 사용하여 OD값을 측정한다. KN042를 양성 대조로 한다.
결과는 도 1-13 및 도 16-20 및 도 33에 도시된 바와 같다.
도 1은 아미노산 돌연변이 W31Y 후의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성이 F28Y의 돌연변이보다 나음을 보여준다.
도 2는 아미노산 돌연변이 W31Y 후의 융합단백질과 양성 대조 KN042가 근사함을 보여준다.
도 3은 W31에 있는 아미노산 돌연변이 후의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성이 F28에 있는 아미노산 돌연변이 후의 융합단백질의 결합 활성보다 나음을 보여준다.
도 4 및 도 5는 Q23에 있는 여러 가지 아미노산 돌연변이 후, 및 Y19에 있는 여러 가지 아미노산 돌연변이 후의 융합단백질 모두가 GLP-1 수용체와의 결합 활성을 유지하고 있음을 보여준다.
도 6 및 도 7은 F28에 있는 아미노산 돌연변이 후의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성이 유의하게 감소됨을 보여준다.
도 1 내지 도 7로부터 알 수 있듯이, W31, Q23, Y19에 있는 아미노산 돌연변이 후의 융합단백질은 여전히 GLP-1 수용체와의 결합 활성을 유지하고 있고, 반면 F28에 있는 아미노산 돌연변이는 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 유의하게 감소되게 하는 것이다.
도 8은 K26R-W31Y 이중 돌연변이의 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 K26R-F28Y 이중 돌연변이보다 나음을 보여준다.
도 9는 K26R-W31Y, K26R-Q23T, K26R-Q23S, K26R-Q23N, K26R-Y19L, K26R-Y19T 및 K26R-Y19F 이중 돌연변이의 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호하고, 양성 대조 KN042와는 근접함을 보여준다.
도 10은 K26R-W31Y, K26R-Q23E, K26R-Y19I, K26R-Y19V, K26R-Y19A 및 K26R-Y19S 이중 돌연변이의 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호하고, 양성대조 KN042와는 근접함을 보여준다.
도 11은 K26R-W31Y, K26R-Q23N, K26R-Q23S 및 K26R-Q23T 이중 돌연변이의 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호함을 보여준다.
도 12는 W31Y 및 Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 이중 돌연변이 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호함을 보여준다.
도 13은 W31Y-Y19A 및 W31Y-Q23E의 아미노산 이중 돌연변이의 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호함을 보여준다.
도 8 내지 도 13으로부터 알 수 있듯이, K26, W31, Y19 및 Q23 중 2개 위치에 있는 아미노산 돌연변이를 포함하는 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호하다는 것이다.
도 16은 GM-WY 및 GM-WYFL 모두가 GLP-1 수용체와 결합할 수 있음을 보여준다.
도 17은 GM-WIFL, GM-WA, GM-WL 및 GM-WLFL 모두가 GLP-1 수용체와 결합할 수 있음을 보여준다.
도 16 및 도 17은 W31, Y19, Q23 및 K26로부터 선택되는 적어도 2개의 아미노산 위치에 있는 아미노산 돌연변이를 포함하지 않는 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 융합단백질의 결합 활성은 비교적 약함을 보여준다.
도 18은 W31Y-K26R-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이 융합단백질, 또는 W31Y-K26R-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호함을 보여준다.
도 19는 W31Y-K26R-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이 융합단백질, 또는 W31Y-K26R-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호함을 보여준다.
도 20은 W31Y-K26R-Q23N 삼중 돌연변이의 융합단백질, 또는 W31Y-K26R-Y19A 삼중 돌연변이의 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호함을 보여준다.
도 18 내지 도 20으로부터 알 수 있듯이, K26, W31, Y19 및 Q23 중 3개 위치에 있는 아미노산 돌연변이를 포함하는 융합단백질은 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 양호하다는 것이다.
본 출원의 시험결과는 또한 K26R-W31Y 이중 돌연변이를 갖는 융합단백질의 체외 생물 활성(예를 들어, GLP-1 수용체와의 결합 활성, cAMP/PKA 신호경로를 자극시키는 활성)이 K26R-W31A 및 K26A-W31Y 이중 돌연변이보다 나음을 보여준다. 예를 들어, 도 33의 결과는, K26R-W31Y 이중 돌연변이를 갖는 융합단백질의 GLP-1 수용체와의 결합 활성이 K26R-W31A, K26A-W31Y 및 K26A-W31A 이중 돌연변이보다 우수함을 보여준다.
실시예 3: 루시페라제 방법으로 본 출원 융합단백질의 cAMP/PKA 신호경로에 대한 활성화 작용 측정
GLP-1 폴리펩티드 변이체의 융합단백질이 GLP-1 수용체에 결합하여 아데닐사이클라제를 활성화시키고, 세포내 고리형 아데노신 일인산(cAMP) 수준을 향상시키는 원리를 이용하여, CREB(cAMP 반응요소 결합 단백질) 보고 유전자에 기반하여 본 출원 융합단백질의 cAMP/PKA 신호경로에 대한 활성화 작용을 측정한다. 인간 GLP-1R 플라스미드 및 CREB에 의해 구동된 루시퍼라제 보고 플라스미드를 이용하여 HER293 세포를 형질감염시킨다. 형질감염 후, HER293-GLP1R-CREB-D4 세포를 소화 및 수집하여, 계수하고, 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 4x105세포/ml로 조정하여, 각 웰당 50μl로 96웰 플레이트에 접종시킨다. 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 검사대상 샘플을 1000ng/ml에서 시작하여 9개의 농도로 희석시키고; KN042를 양성 대조로 한다. 상기 96웰 플레이트 각 웰에 다시 50μl의 일련의 검사대상 샘플을 첨가하고, 37℃에서 6시간 또는 24시간 동안 인큐베이션한다. 상청액을 폐기하고, 각 웰에 루시페라제 기질을 첨가한다. 실온에서 5min 동안 방치한 후, 50μl를 취하여, 루시페라제 분석 시스템 Bio-Glo™ Luciferase Assay System(Promega, G7940)을 사용하여 루시페라제의 활성을 측정하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)로 수치를 판독한다. 형광 강도는 cAMP의 수준을 보여주는데, 이로써 GLP-1 수용체 활성화 정도를 반영하게 된다.
결과는 도 14-15 및 도 21-26에 도시된 바와 같이, 본 출원의 융합단백질 모두가 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있고, 이로써 cAMP/PKA 신호 경로를 활성화시키게 된다. 이는 본 출원의 융합단백질 GM-WYYA, GM-WYQE, GM-KRWY, GM-KRWYQE, GM-KRWYYA, GM-KRWYYL, GM-KRWYYS, GM-KRWYYI, GM-KRWYYT, GM-KRWYQN, GM-KRWYQT, GM-KRWYQS의 체외 안정성이 낫다는 것을 설명한다.
도 14는 W31Y-Y19A 이중 돌연변이의 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 Fc 영역의 융합단백질이 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있고, 이로써 cAMP 수준을 높이고, 인큐베이션 시간은 6시간(14A)에서 24시간(14B)으로 연장시키게 되어, 활성화 능력이 더 강함을 보여준다. 활성화 능력이 양성 대조에 비해 상대적으로 향상되었다는 것은, 본 출원의 융합단백질 GM-WYYA가 보다 나은 체외 안정성을 나타낸다는 것을 설명한다.
도 15는 W31Y-Q23E 이중 돌연변이의 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 Fc 영역의 융합단백질이 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있고, 이로써 cAMP 수준을 높이고, 인큐베이션 시간은 6시간(15A)에서 24시간(15B)으로 연장시키게 되어, 활성화 능력이 더 강함을 보여준다. 활성화 능력이 양성 대조에 비해 상대적으로 향상되었다는 것은, 본 출원의 융합단백질 GM-WYQE가 보다 나은 체외 안정성을 나타낸다는 것을 설명한다.
도 21은 K26R-W31Y 이중 돌연변이 및 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 모두가 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
도 22 및 도 23은 K26R-W31Y-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 모두가 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
도 24 및 도 26은 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 및 K26R-W31Y-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 모두가 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
도 25는 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 모두가 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 약물동태학 시험
GLP-1-Fc 융합단백질의 체내 약물동태학을 고찰한다. 실험은 SPF 동물실에서 진행하고, 동물실 환경 온도는 23±2℃이고, 상대 습도는 40-70%이며, 12시간 동안 명암 교대한다. 실험동물은 자유롭게 음식을 섭취시키고, 실험 전 최소 3일 동안 적응시킨다. 체중이 180-220g인 SPF급 SD 래트를 무작위로 그룹을 나눈다. 각 그룹의 래트에 대응되는 시험용 샘플을 피하 주사하고, 둘라글루타이드(dulaglutide)를 대조군으로 사용한다. 투여 전, 투여 후 6h, 24h, 48h, 72h, 96h 및 120h에 경정맥으로부터 약 100ul의 혈액을 채취한다. 채취한 혈액을 원심분리 튜브에 넣고 실온에서 30-60min 동안 방치해 둔다. 그 다음, 4℃에서, 2시간 이내에 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 신속하게 혈청을 분리한다. -80℃에서 보관한다. 샘플에 대해 ELISA 측정을 수행한다. DAS(3.2.8) 소프트웨어를 사용하여 약물동태학 파라미터를 계산한다.
결과는, 대조군과 비교하면 본 출원의 융합단백질은 양호한 약물동태학적 성질을 갖음을 보여준다. 도 27은 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY의 반감기가 16.199h인 것으로 둘라글루타이드보다 길고, 또한 약물 노출량은 둘라글루타이드보다 높으며, 혈장 농도는 근접함을 보여준다. 도 28은 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYYL, GM-KRWYYA 및 GM-KRWYYI의 반감기가 13h 내지 16.5h인 것으로 둘라글루타이드보다 길고, 또한 약물 노출량 및 혈장 농도는 둘라글루타이드보다 높음을 보여준다. 도 29는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYQN, GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA의 반감기가 22h 내지 25h인 것으로 둘라글루타이드보다 길고, 또한 약물 노출량 및 혈장 농도는 둘라글루타이드보다 높음을 보여준다.
실시예 5: 경구 당부하 시험(OGTT)
GLP-1-Fc 융합단백질의 체내 혈당감소 활성을 고찰한다. 마우스를 하룻밤 동안 금식시키고, 실험 전 혈당과 체중을 측정한 후 무작위로 그룹을 나눈다. 각 그룹의 마우스에 대응되는 시험용 샘플을 복강내 주사하고, 둘라글루타이드를 대조군으로 사용한다. 투여 후 0.5h, 각 마우스에 1.5g/kg의 포도당을 경구 투여한다. 포도당 부하 전, 부하 후 10min, 20min, 30min, 60min 및 120min에 마우스의 꼬리 끝 혈당 수치를 휴대용 로슈 혈당 측정기(Roche, Accu-chek)로 측정한다. 마우스 꼬리 끝 약 1mm를 절제하여, 꼬리 뿌리부터 꼬리 끝으로 향하여 정맥을 가압하면서 채혈하여 혈당 수치를 측정한다.
결과는, 대조군과 비교하면, 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY(도 30A 및 30B), GM-KRWYYA 및 GM-KRWYQE(도 31A 및 31B)는 동등 수준의 체내 혈당감소 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Suzhou Alphamab Co., Ltd. <120> HUMAN GLP-1 POLYPEPTIDE VARIANT AND USE THEREOF <130> P23413720KR <150> CN2020116051738 <151> 2020-12-29 <160> 154 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal GLP-1 sequence in dulaglutide <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1R-muFc <400> 3 Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu Trp Glu Thr Val Gln Lys Trp 1 5 10 15 Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg Ser Leu Thr Glu Asp Pro Pro 20 25 30 Pro Ala Thr Asp Leu Phe Cys Asn Arg Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys 35 40 45 Trp Pro Asp Gly Glu Pro Gly Ser Phe Val Asn 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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 134 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-KRWYYT <400> 134 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 135 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-KRWYYI <400> 135 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Ile Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 136 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-KRWYYV <400> 136 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Val Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 137 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-KRWYYS <400> 137 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Ser Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 138 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GM-KRWYYA <400> 138 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Ala Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 139 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 140 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 141 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 142 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 143 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc of dulaglutide <400> 143 Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 100 105 110 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Gly 225 <210> 144 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker peptide <400> 144 Gly Ser 1 <210> 145 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAP linker peptide <400> 145 Gly Ala Pro 1 <210> 146 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G4S linker peptide <400> 146 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 147 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)2 linker peptide <400> 147 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 148 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)3 linker peptide <400> 148 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 149 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)4 linker peptide <400> 149 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 150 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 variant general formula 2 <220> <221> X19 <222> (13)..(13) <223> X19 may be Y, A, L, T, F, I, V or S <220> <221> X23 <222> (17)..(17) <223> X23 may be Q, E, T, S or N <400> 150 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Xaa Leu Glu Glu 1 5 10 15 Xaa Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 151 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 variant general formula 3 <220> <221> X23 <222> (17)..(17) <223> X23 may be Q, E, T, S or N <400> 151 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Xaa Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 152 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 variant general formula 4 <220> <221> X19 <222> (13)..(13) <223> X19 may be Y, A, L, T, F, I, V or S <400> 152 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Xaa Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Tyr Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 153 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 variant general formula 1 <220> <221> X19 <222> (13)..(13) <223> X19 may be Y, A, L, T, F, I, V or S <220> <221> X23 <222> (17)..(17) <223> X23 may be Q, E, T, S or N <220> <221> X26 <222> (20)..(20) <223> X26 may be K or R <220> <221> X31 <222> (25)..(25) <223> X31 may be W, Y, K, R or A <400> 153 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Xaa Leu Glu Glu 1 5 10 15 Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Xaa Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 154 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1-KAWA <400> 154 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Ala Glu Phe Ile Ala Ala Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30

Claims (28)

  1. SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 아미노산 서열이 W31, K26 아미노산 위치에서의 돌연변이, 및 Q23 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 GLP-1의 적어도 부분 활성을 갖는, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Q23 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31R, W31K 또는 W31A인, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y19에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환인, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Q23에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Q23E, Q23T, Q23S 및 Q23N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환인, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 K26에는 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 K26R인, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 150에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 61-71 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  12. 제11항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역을 또한 포함하는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG 유래의 Fc 영역인, 융합단백질 또는 면역접합체.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 유래의 Fc 영역인, 융합단백질 또는 면역접합체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 139-143 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 면역글로불린 Fc 영역은 프레임 내 융합되는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드를 포함하는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 링커 펩티드를 통해 상기 면역글로불린 Fc 영역에 연결되는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 144-149 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 128-138 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질 또는 면역접합체.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 면역접합체를 코딩하는, 분리된 핵산 분자.
  22. 제21항에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 면역접합체, 제21항에 따른 분리된 핵산 분자 또는 제22항에 따른 벡터를 포함하거나 또는 발현하는, 세포.
  24. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 면역접합체, 제21항에 따른 분리된 핵산 분자, 제22항에 따른 벡터 또는 제23항에 따른 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는, 약학 조성물.
  25. 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용되는 약물의 제조에 있어서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 면역접합체의 용도.
  26. 제25항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함하는, 용도.
  27. 제25항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함하는, 용도.
  28. 수요가 있는 피시험자에게 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 또는 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피시험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 방법.
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