JP2024507321A - ヒトｇｌｐ－１ポリペプチド変異体及びその応用 - Google Patents
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Abstract
本願は、ヒトＧＬＰ－１ポリペプチド変異体を提供し、上記ヒトＧＬＰ－１ポリペプチド変異体を使用して構築された融合タンパク質または免疫複合体は、ＧＬＰ－１関連の代謝性疾患又は病状を予防および／又は治療するために使用することができる。【選択図】 なし
Description
本発明は、バイオ医薬品分野に関し、具体的に、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体及びその応用に関する。
グルカゴン様ペプチド（glucagon-like peptide-1、GLP-1）は、小腸上皮L-細胞によって分泌されるインクレチンであり、健康な個体において、GLP-1は体の栄養物質の摂取に応答し、インスリン放出を促進し、グルカゴン分泌を阻害することができる。2型糖尿病に罹患した患者に、超生理学的用量のGLP-1を注入すると、内因性インスリン分泌を回復し、血糖を低下することができる。
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）の酵素性分解と腎クリアランスにより、天然GLP-1の血漿半減期が短くなる。2型糖尿病を治療するために、半減期が延長されるように修飾されたGLP-1Rアゴニスト（デュラグルチドDulaglutideなど）が幾つか開発されたにも関わらず、効果的な長期治療を行うと共に副作用を最小限に抑える計画を開発する必要がある。
本願は、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体を提供し、そのうち、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26、Q23及びY19からなる群から選ばれるアミノ酸位置における少なくとも2つのアミノ酸変異を含む。本願は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体を含む融合タンパク質又は免疫複合体を更に提供し、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、（1）GLP-1受容体と結合することができることと、（2）GLP-1受容体を活性化してcAMPレベルを高めることができることと、（3）血液半減期が長いことと、（4）インビボ/インビトロ安定性が高いことと、（5）血中薬物濃度が高いことと、（6）血糖を低下することができることと、という性質のうちの少なくとも1つを有する。
一態様において、本願は、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体を提供し、そのうち、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26、Q23及びY19からなる群から選ばれるアミノ酸位置における少なくとも2つのアミノ酸変異を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性を有する。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びY19からなる群から選ばれるアミノ酸位置における少なくとも2つの変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びQ23からなる群から選ばれるアミノ酸位置における少なくとも2つの変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びK26アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びQ23アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びY19アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、K26及びQ23アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、K26及びY19アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びY19アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びQ23アミノ酸位置における変異を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体の上記W31では、W31Y、W31K、W31R又はW31Aであるアミノ酸置換を含む。例えば、上記アミノ酸置換は、W31Y、W31K又はW31Rである。また、例えば、上記アミノ酸置換はW31Yである。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体の上記Y19では、Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V及びY19Sからなる群から選ばれる何れか1つのアミノ酸置換を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体の上記Q23では、Q23E、Q23T、Q23S及びQ23Nからなる群から選ばれる何れか1つのアミノ酸置換を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体の上記K26では、K26Rであるアミノ酸置換を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号29、31～53及び61～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号29、32～53及び61～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号32～53の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号61～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本願は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体を含む融合タンパク質又は免疫複合体を提供する。
ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、免疫グロブリンFc領域を更に含む。
ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体の上記免疫グロブリンFc領域は、IgG由来のFc領域である。
ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体の上記免疫グロブリンFc領域は、IgG4由来のFc領域である。
ある実施形態において、上記免疫グロブリンFc領域は、配列番号139～143の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体と上記免疫グロブリンFc領域はインフレーム融合される。
ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、リンカーペプチドを含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体と上記免疫グロブリンFc領域は、上記リンカーペプチドによって連結される。
ある実施形態において、上記リンカーペプチドは、配列番号144～149の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体、上記リンカーペプチドと上記免疫グロブリンFc領域は、インフレーム融合される。
ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号96、98～120及び128～138の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号96、97～120及び128～138の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号96で示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号99～122の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号128～138の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様において、本願は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体をコードする、単離された核酸分子を提供する。
別の態様において、本願は、上記単離された核酸分子を含むベクターを提供する。
別の態様において、本願は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体、上記単離された核酸分子又は上記ベクターを包含又は発現する細胞を提供する。
別の態様において、本願は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体、上記単離された核酸分子、上記ベクター又は上記細胞、及び任意選択的な薬学的に許容されるアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本願は、代謝性疾患又は病状を予防及び/又は治療するための薬剤の調製における、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体の用途を提供する。
別の態様において、本願は、代謝性疾患又は病状を予防及び/又は治療する方法を提供し、上記方法は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体を投与することを含む。
別の態様において、本願は、代謝性疾患又は病状を予防及び/又は治療するための上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体を提供する。
ある実施形態において、上記代謝性疾患又は病状は、GLP-1に関連する代謝性疾患を含む。
ある実施形態において、上記代謝性疾患又は病状は、糖尿病を含む。
別の態様において、本願は、それを必要とする被験者におけるインスリン発現を増加又は促進する方法を提供し、上記方法は、有効量の上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体を上記被験者に投与することを含む。
別の態様において、本願は、それを必要とする被験者におけるインスリン発現を増加又は促進するための上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体を提供する。
別の態様において、本願は、それを必要とする被験者におけるインスリン発現を増加又は促進するための薬剤の調製における、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体又は上記融合タンパク質又は免疫複合体の用途を提供する。
当業者は、以下の詳細な説明から本願の他の態様及び利点を容易に洞察することができる。以下の詳細な説明には、本願の例示的な実施形態のみを示して説明する。当業者に明らかなように、本願の内容により、当業者は、本願にかかる発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された具体的な実施形態を変更することができる。それで、本願の図面及び明細書における説明は、限定的なものではなく、単に例示的なものである。
本願にかかる発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。以下に詳細に説明する例示的な実施形態及び図面を参照することで、本願にかかる発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。
以下、特定の具体的な実施例により、本願の発明の実施形態を説明し、当業者は、本明細書に開示された内容から本願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。
用語の定義
本願において、「GLP-1」という用語は、一般的に、グルカゴン様ペプチド-1（glucagon like peptide 1）を指す。天然GLP-1分子はインビボで加工されて、最初の6個のアミノ酸が切断されたので、この分野では、GLP-1のアミノ酸配列のN末端の最初のアミノ酸を7位と定義し、C末端の最後のアミノ酸を37位と定義することが通例である。加工されたペプチドは、C末端のグリシン残基を除去してアミド基で置換するように、インビボで更に修飾されることができる。GLP-1は、一般的に、それぞれGLP-1（7-37）OH及びGLP-1（7-36）NH2という2つの生物活性形態がある。本願に記載の「GLP-1」には、天然、人工合成又は修飾されたGLP-1タンパク質が含まれ、更に、完全なGLP-1タンパク質又はその機能的断片、及び異なる生物活性形態のGLP-1タンパク質が含まれる。例えば、野生型のヒトGLP-1は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含んでもよく、そのN末端のアミノ酸残基Hは7位と記される。従って、本願における「K26」という用語は、一般的に、GLP-1タンパク質のN末端の7位のHから数え、26位のアミノ酸の位置を指し、配列番号1で示されるアミノ酸配列において、26位のアミノ酸はKであり、「W31」という用語は、一般的に、GLP-1タンパク質のN末端の7位のHから数え、31位のアミノ酸の位置を指し、配列番号1で示されるアミノ酸配列において、31位のアミノ酸はWである。
上記ヒトGLP-1は改変されることができ、改変されたGLP-1の変異体は、改変前のヒトGLP-1の少なくとも一部の活性を有することができる。例えば、例示的な野生型ヒトGLP-1の改変されたアミノ酸配列は、配列番号2で示すことができる。
本願において、「ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性」という用語は、一般的に、ヒトGLP-1タンパク質の1種又は複数種の活性を有し、又はヒトGLP-1タンパク質の少なくとも20%（例えば、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、又は50%、又はそれ以上）の活性を有することを指す。上記「ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性」のヒトGLP-1は、野生型のもの、例えば、配列番号1で示されるアミノ酸配列であってもよい。上記「ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性」におけるヒトGLP-1は、野生型ヒトGLP-1を改変したGLP-1変異体、例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列であってもよい。例えば、本願のヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列のヒトGLP-1の少なくとも一部の活性を有してもよい。他の場合には、本願のヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、アミノ酸配列が配列番号2で示されるヒトGLP-1の少なくとも一部の活性を有してもよい。
上記活性は、ヒトGLP-1タンパク質と同じレベルの活性を必要とせず、ヒトGLP-1タンパク質の活性と比べて高くても、類似しても、又は低くてもよい。場合によっては、「ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性」は、GLP-1受容体に結合する活性、GLP-1受容体を活性化する活性、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内環状アデノシン一リン酸（cAMP）レベルの向上を促進する活性、細胞内Ca2+レベルを正に調節する活性、インスリン分泌を刺激する活性、肝臓グリコーゲン貯蔵量を増加させる活性、胃内容排出を遅延する活性、胃運動を抑制する活性、食欲を低下させる活性、β細胞アポトーシスを抑制する活性、食後グルカゴンの分泌を抑制する活性、低血糖を緩和する活性及び体重を減少させる活性からなる群から選ばれる1種又は複数種であってもよい。例えば、GLP-1受容体への結合能、cAMPの発現レベルを検出することにより、検出することができる。上記「ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性」は、ヒトGLP-1を含む融合タンパク質（例えば、Fc領域との融合タンパク質）の少なくとも一部の活性であってもよい。
本願において、「GLP-1R」という用語は、一般的に、グルカゴン様ペプチド-1受容体（glucagon like peptide 1 receptor）を指す。GLP-1RとGLP-1との結合は、シグナル伝達カスケードを活性化し、アデニル酸シクラーゼの活性化及び細胞内cAMPレベルの増加を引き起こすことができる。本願に記載されるGLP-1Rは、GLP-1Rの活性が保持されば、天然GLP-1Rの全長分子、変異体、断片、合成物を含んでもよい。例えば、本願に記載されるGLP-1Rは、NCBIデータベースの登録番号がNP_002053.3で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、「ポリペプチド」という用語は、一般的に、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）によって線形に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、特定の長さの生成物ではなく、2つ以上のアミノ酸を有する何れの鎖であってもよい。本願に記載されるポリペプチドは、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、又は2つ以上のアミノ酸を有する任意の他の鎖を含み、また、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の何れか1つを代えて、又はそれと交換して使用することができる。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドを発現して修飾した生成物を指してもよく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アシル化、既知の保護性/閉鎖性基による誘導体化、タンパク質の加水分解、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物源に由来するか、又は組換え技術によって生成することができる。
本願において、「変異体」という用語は、一般的に、天然の生物学的活性タンパク質と配列相同性を有するタンパク質分子を指す。本願に記載されるポリペプチド変異体は、1つ又は複数のアミノ酸残基の付加（挿入を含む）、欠失、修飾及び/又は置換によって、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、親配列の少なくとも1つの治療及び/又は生物活性を同時に保持しており、親配列とは異なっている。例えば、変異体は、親タンパク質と少なくとも0%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有してもよい。変異体は、天然に存在してもよいし、しなくてもよい。この分野で知られている技術により、天然に存在しない変異体を生成することができる。ポリペプチド変異体は、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は付加を含んでもよい。
本願において、「変異」という用語は、一般的に、配列（核酸又はアミノ酸配列）に対する任意のタイプの改変又は修飾を含み、アミノ酸又はヌクレオチドの欠失、切断、不活性化、破壊、置換又は転座を含む。本願において、アミノ酸変異はアミノ酸置換であってもよく、「置換」という用語は、一般的に、異なる「置換」アミノ酸残基で、予め決定された親アミノ酸配列における少なくとも1つのアミノ酸残基を置換することを指す。当該1つ又は複数の置換されたアミノ酸残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」（即ち、遺伝暗号によってコードされる）であってもよい。
本願において、「ヒンジ領域」という用語は、一般的に、免疫グロブリンの重鎖CH1とCH2機能領域間の領域を指す。ヒンジ領域は、一般的に、IgGに由来し、例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4に由来してもよい。
本願において、「融合タンパク質」という用語は、一般的に、そのアミノ酸配列が直接的又は間接的に（リンカーペプチドなどのリンカーを介して）異種ポリペプチド（例えば、前のポリペプチド又はそのドメイン非関連ポリペプチド）に融合できるポリペプチドを含むか、又はそのポリペプチドからなるより長いポリペプチドを含むものを指す。場合によっては、融合タンパク質は、上記ポリペプチド変異体、及び上記ポリペプチド変異体と直接的又は間接的に連結される（例えば、リンカーペプチドによって連結される）免疫グロブリンFc領域を含んでもよい。例えば、上記リンカーペプチドは、GS、GAP、G4S、（G4S）2、（G4S）3又は（G4S）4であってもよい。
本願において、「免疫複合体」という用語は、一般的に、ポリペプチド又はタンパク質が興味のある活性物質（例えば、タンパク質、核酸、薬物又はマーカー分子など）と直接的又は間接的に連結（例えば、リンカーを介して共有結合）して形成した複合体を指す。
本願において、「免疫グロブリン」という用語は、一般的に、基本的に免疫グロブリン遺伝子によってコードされる1つ又は複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。広く認められたヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α（IgA1及びIgA2）、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、εとμ定常領域遺伝子、及び多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約25 KD及び214個のアミノ酸）のNH2-末端（約110個のアミノ酸）は可変領域遺伝子によってコードされ、COOH-末端はκ又はλ定常領域遺伝子によってコードされる。一般的に、免疫グロブリンは、2つの同じ軽鎖（L）及び2つの同じ重鎖（H）からなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であってもよい。天然の免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域によって連結された2つのFab分子及びFc領域で構成される。
本願において、「Fc領域」という用語は、一般的に、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を指し、上記C末端領域は、パパインによる完全な抗体の消化によって産生することができる。Fc領域は、天然配列Fc領域又は変異体Fc領域であってもよい。免疫グロブリンのFc領域は、一般的に、2つの定常領域（CH2ドメイン及びCH3ドメイン）を含み、且つ任意選択的にCH4ドメインを含んでもよい。
本願において、「インフレーム融合」という用語は、一般的に、2つ又は複数のオープンリーディングフレーム（ORF）を、元のORFの正確なリーディングフレームが保持されるように連結して、連続したより長いORFを形成することを指す。従って、得られた組換え融合タンパク質は、元のORFによってコードされるポリペプチドに対応する2つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である。
本願において、「核酸分子」という用語は、一般的に、天然環境から単離され、又は人工的に合成された、任意の長さの単離形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体を指す。
本願において、「ベクター」という用語は、一般的に、適切な宿主細胞内で自己複製可能な核酸分子を指し、挿入した核酸分子を宿主細胞内及び/又は宿主細胞間に移転するものである。上記ベクターは、主にDNA又はRNAを細胞内に挿入するためのベクター、主にDNA又はRNAを複製するためのベクター、及び主にDNA又はRNAの転写及び/又は翻訳を発現するためのベクターを含んでもよい。上記ベクターは、更に、種々の上記機能を有するベクターを含んでもよい。上記ベクターは、適切な宿主細胞に導入された場合に、ポリペプチドに転写と翻訳できるポリヌクレオチドであってもよい。一般的に、上記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することにより、上記ベクターは所望の発現産物を産生することができる。
本願において、「細胞」という用語は、一般的に、本願に記載の核酸分子のプラスミド又はベクターを含めるか又は含んだ、或いは、本願に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現可能な個別細胞、細胞株又は細胞培養物を指す。上記宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含んでもよい。天然、予想外の又は意図的な変異により、子孫細胞は、元の親細胞と形態又はゲノムにおいて必ずしも完全に同じであるとは限らないが、本願に記載の抗体又は抗原結合断片を発現することができればよい。上記宿主細胞は、本願に記載のベクターを利用してインビトロで細胞をトランスフェクトすることにより得ることができる。上記宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌）であってもよく、真核細胞（例えば酵母細胞、例えばCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞又は骨髄腫細胞）であってもよい。上記組換え宿主細胞は、ある特定の細胞を含むだけでなく、これらの細胞の子孫も含む。
本願において、「代謝性疾患又は病状」という用語は、一般的に、インビボの正常な代謝プロセスを破壊して、体がエネルギーを正常に使用及び/又は貯蔵することができないようにする疾患又は病状を指す。上記代謝性疾患又は病状は、糖質代謝障害の疾患、脂肪類代謝障害の疾患及び/又は細胞ミトコンドリア障害の疾患を指してもよい。上記代謝性疾患又は病状は、食事、毒素や感染症に関連するものであってもよく、遺伝性疾患であってもよい。上記代謝性疾患又は病状は、代謝関連酵素の欠乏、又は代謝関連酵素機能の異常による疾患又は病状を含んでもよい。本願に記載される代謝性疾患又は病状は、糖尿病、肥満症及び他のGLP-1関連代謝性疾患から選ばれてもよい。
出願において、「デュラグルチド（dulaglutide）」は、一般的に、GLP-1類似体を含む異種融合タンパク質を指し、GLP-1類似体（アミノ酸配列が配列番号2で示される）とヒトIgG4由来のFc領域（アミノ酸配列が配列番号143で示される）を小分子ペプチド（アミノ酸配列が配列番号148で示される）により共有結合することによって形成される。デュラグルチドの商品名はTRULICITY（登録商標）又はトルリシティ（登録商標）である。デュラグルチドは、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む（PCT特許WO2009009562及び米国特許US7452966を参照）。
本願において、「含む」という用語は、一般的に、明確に指定された特徴を含むが、他の要素を排除しないことを意味する。
本願において、「約」という用語は、一般的に、指定値の0.5%～10%の以上又は以下の範囲内の変化、例えば、指定値の0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、又は10%の以上又は以下の範囲内の変化を指す。
ポリペプチド変異体
一態様において、本願は、ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性を有するヒトGLP-1ポリペプチド変異体を提供する。場合によっては、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、GLP-1受容体に結合する活性、GLP-1受容体を活性化する活性、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内環状アデノシン一リン酸（cAMP）レベルの向上を促進する活性、細胞内Ca2+レベルを正に調節する活性、インスリン分泌を刺激する活性、肝臓グリコーゲン貯蔵量を増加させる活性、胃内容排出を遅延する活性、胃運動を抑制する活性、食欲を低下させる活性、β細胞アポトーシスを抑制する活性、食後グルカゴンの分泌を抑制する活性、低血糖を緩和する活性及び体重を減少させる活性からなる群から選ばれる1種又は複数種の活性を有することができる。例えば、GLP-1受容体への結合能、cAMPの発現レベルを検出することにより、検出することができる。上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体の活性は、ヒトGLP-1活性の少なくとも20%（例えば、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、又は50%、又はそれ以上）であってもよい。
配列番号2で示されるアミノ酸配列、即ち、HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG（配列番号2）と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、少なくとも2つのアミノ酸変異、例えば、2個、3個、4個又はそれ以上のアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2～4個（例えば、2～3個、3個又は2個）のアミノ酸置換を含んでもよい。上記少なくとも2つのアミノ酸変異は、K26、W31、Y19及びQ23からなる群から選ばれるアミノ酸位置にあってもよい。
本願において、上記アミノ酸位置「Xn」は、配列番号1又は配列番号2で示されるアミノ酸配列中のn位に対応する残基Xで発生されたアミノ酸置換を指し、そのうち、nは正整数（GLP-1の場合、nは7から始まる）であり、Xは任意のアミノ酸残基の略語である。例えば、アミノ酸位置「W31」は、配列番号1又は配列番号2で示されるアミノ酸配列の31位のアミノ酸に対応する位置を示す。配列番号2で示されるアミノ酸配列の場合、アミノ酸残基Xと位置nとの対応関係は図32に示される通りである。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びY19からなる群から選ばれるアミノ酸位置における少なくとも2つの変異を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びQ23からなる群から選ばれるアミノ酸位置における少なくとも2つの変異を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びK26アミノ酸位置における2つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸変異を有し、W31とK26アミノ酸位置にあってもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号29で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びY19アミノ酸位置における2つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸変異を有し、W31及びY26アミノ酸位置にあってもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号47～53の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びQ23アミノ酸位置における2つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸変異を有し、W31及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号43～46の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、K26及びY19アミノ酸位置における2つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸変異を有し、K26及びY19アミノ酸位置にあってもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号36～42の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、K26及びQ23アミノ酸位置における2つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸変異を有し、K26及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号32～35の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、Y19及びQ23アミノ酸位置における2つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸変異を有し、Y19及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びY19アミノ酸位置における3つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、3つのアミノ酸変異を有し、W31、K26及びY19アミノ酸位置にあってもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びQ23アミノ酸位置における3つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、3つのアミノ酸変異を有し、W31、K26及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、Y19、K26及びQ23アミノ酸位置における3つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、3つのアミノ酸変異を有し、Y19、K26及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、Y19及びQ23アミノ酸位置における3つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、3つのアミノ酸変異を有し、W31、Y19及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26、Y19及びQ23アミノ酸位置における4つのアミノ酸変異を含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、4つのアミノ酸変異を有し、W31、K26、Y19及びQ23アミノ酸位置にあってもよい。
本願において、上記アミノ酸変異は、アミノ酸置換を含んでもよい。上記アミノ酸変異により、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、ヒトGLP-1（例えば、アミノ酸配列が配列番号1又は2の何れか1つで示されるヒトGLP-1タンパク質）の少なくとも一部の活性を依然として有する。上記アミノ酸変異により、上記GLP-1ポリペプチド変異体の融合タンパク質は、ヒトGLP-1（例えば、アミノ酸配列が配列番号1又は2の何れか1つで示されるヒトGLP-1タンパク質）の融合タンパク質の少なくとも一部の活性を依然として有することができる。上記アミノ酸変異により、上記GLP-1ポリペプチド変異体及びFc領域の融合タンパク質は、ヒトGLP-1（例えば、アミノ酸配列が配列番号1又は2の何れか1つで示されるヒトGLP-1タンパク質）及びFc領域の融合タンパク質の少なくとも一部の活性を依然として有することができる。
本願において、上記K26では、アミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換はK26Rであってもよい。
本願において、上記W31では、アミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換はW31Y、W31A、W31R又はW31Kであってもよい。本願において、上記W31では、アミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換はW31Y、W31K又はW31Rであってもよい。例えば、上記W31では、アミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換はW31Yであってもよい。
本願において、上記Y19では、アミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換はY19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V又はY19Sであってもよい。
本願において、上記Q23では、アミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換はQ23E、Q23T、Q23S又はQ23Nであってもよい。
本願において、アミノ酸置換「XnY」は、配列番号1又は配列番号2で示されるアミノ酸配列中のn位に対応する残基Xがアミノ酸残基Yで置換されたことを意味し、そのうち、nは正整数（GLP-1の場合、nは7から始まる）であり、X及びYはそれぞれ独立的に任意のアミノ酸残基の略語であり、且つXはYと異なっている。例えば、アミノ酸置換「W31Y」は、配列番号1又は配列番号2で示されるアミノ酸配列中の31位に対応するアミノ酸残基Wがアミノ酸残基Yで置換されたことを意味する。
本願において、配列番号1又は配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、少なくとも2つのアミノ酸置換を含んでもよく、上記アミノ酸置換は、1）K26Rと、2）W31Y、W31R、W31K及びW31Aから選ばれる何れか1つと、3）Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V及びY19Sから選ばれる何れか1つと、4）Q23N、Q23T、Q23S及びQ23Eから選ばれる何れか1つとからなる群から選ばれてもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、1）K26Rと、2）W31Y、W31R、W31K及びW31Aから選ばれる何れか1つと、3）Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V及びY19Sから選ばれる何れか1つとからなる群から選ばれる少なくとも2つのアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、1）K26Rと、2）W31Y、W31R、W31K及びW31Aから選ばれる何れか1つと、3）Q23N、Q23T、Q23S及びQ23Eから選ばれる何れか1つとからなる群から選ばれる少なくとも2つのアミノ酸変異を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31及びK26アミノ酸位置における2つのアミノ酸置換を含んでもよく、上記K26におけるアミノ酸置換はK26Rであってもよく、且つ上記W31におけるアミノ酸置換はW31Y、W31R、W31K及びW31Aであってもよい。例えば、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31Y及びK26Rのアミノ酸置換を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換W31Yを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26Rを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Q23Eを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Y19Aを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換W31Y及びQ23Eを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換W31Y及びY19Aを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換W31Y及びK26Rを含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号29、31及び61～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。また、例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号29及び61～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列のアミノ酸置換は、W31Y及びK26Rであってもよく、例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号29で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Q23E及びK26Rを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換Y19A及びK26Rを含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、W31におけるアミノ酸置換及びQ23におけるアミノ酸置換を含んでもよい。本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びQ23におけるアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号61～64の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びY19におけるアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号65～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Q23Nを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号61で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Q23Tを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号62で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Q23Sを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号63で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Q23Eを含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号64で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Aを含んでもよい。例えば、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号71で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Lを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号66で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Tを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号67で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Fを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号65で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Iを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号68で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Vを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号69で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換K26R、アミノ酸置換W31Y及びアミノ酸置換Y19Sを含んでもよい。例えば、上記GLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号70で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号153で示されるアミノ酸配列HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAX26EFIAX31LVKGGGを含んでもよく、そのうち、X19＝Y、A、L、T、F、I、V又はS、X23＝Q、E、T、S又はN、X26＝K又はR、X31＝W、A、R、K又はYである。そのうち、X19＝Y、X23＝Q、X26＝KとX31＝Wは全て同時に存在せず、或いは、X19＝Y、X23＝Q、X26＝KとX31＝Wのうちの少なくとも3つは同時に存在しない。
本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号153で示されるアミノ酸配列、即ち、HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAX26EFIAX31LVKGGGを含んでもよく、そのうち、配列番号2で示されるアミノ酸と比較して、X19、X23、X26及び/又はX31における少なくとも2つのアミノ酸置換を含んでもよく、そのうち、X19におけるアミノ酸Yは、A、L、T、F、I、V又はSで置換可能であり、X23におけるアミノ酸QはE、T、S又はNで置換可能であり、X26におけるアミノ酸KはRで置換可能であり、X31におけるアミノ酸WはY、K、R又はAで置換可能である。
本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号150で示されるアミノ酸配列、即ち、HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAREFIAYLVKGGGを含んでもよく、そのうち、X19＝Y、A、L、T、F、I、V又はS、X23＝Q、E、T、S又はNである。そのうち、X19＝YとX23＝Qは同時に存在しない。本願において、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、配列番号150で示されるアミノ酸配列、即ち、HGEGTFTSDVSSX19LEEX23AAREFIAYLVKGGGを含んでもよく、そのうち、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体は、X19及びX23におけるアミノ酸置換を含んでもよく、そのうち、X19におけるアミノ酸YはA、L、T、F、I、V又はSで置換可能であり、X23におけるアミノ酸QはE、T、S又はNで置換可能である。
本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、配列番号151で示されるアミノ酸配列、即ち、HGEGTFTSDVSSYLEEX23AAREFIAYLVKGGGを含んでもよく、そのうち、X23＝E、T、S又はNである。本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、配列番号151で示されるアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、X23におけるアミノ酸置換を含んでもよく、そのうち、X23におけるアミノ酸QはE、T、S又はNで置換可能である。
本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、配列番号152で示されるアミノ酸配列、即ち、HGEGTFTSDVSSX19LEEQAAREFIAYLVKGGGを含んでもよく、そのうち、X19＝A、L、T、F、I、V又はSである。本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、配列番号151で示されるアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、X19におけるアミノ酸置換を含んでもよく、そのうち、X19におけるアミノ酸YはA、L、T、F、I、V又はSで置換可能である。
融合タンパク質又は免疫複合体
別の態様において、本願は、融合タンパク質又は免疫複合体を提供し、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、本願に記載されるヒトGLP-1ポリペプチド変異体を含んでもよい。本願において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、1個、2個又はそれ以上（例えば、3個、4個、5個）の上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体を含んでもよい。
本願において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、更に、免疫グロブリンFc領域を含んでもよい。本願に記載の免疫グロブリンFc領域は、免疫グロブリンの重鎖定常領域2（CH2）及び重鎖定常領域3（CH3）を含んでもよく、一般的に当該抗体からの2つの抗原結合領域（Fab断片）を含まない。また、本願の免疫グロブリンFc領域は、天然タンパク質と類似する生理的活性を有すれば、全て又は一部のFc領域を含んでもよい。本願のFc領域は、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM由来のFc領域を含んでもよい。例えば、上記Fc領域は、IgG由来のFc領域であってもよい。上記Fc領域は、ヒトIgGに由来してもよい。例えば、上記Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4由来のFc領域であってもよい。例えば、上記Fc領域は、ヒトIgG4に由来してもよい。
本願において、上記融合タンパク質又は免疫複合体のFc領域は、更に、免疫グロブリンヒンジ領域を含んでもよい。上記ヒンジ領域は、IgGに由来してもよい。上記ヒンジ領域は、ヒトIgGに由来してもよい。例えば、上記ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4由来のヒンジ領域であってもよい。例えば、上記ヒンジ領域は、上記GLP-1ポリペプチド変異体のC末端にあってもよく、例えば、上記ヒンジ領域は、上記Fc領域CH2のN末端にあってもよい。
例えば、上記Fc領域は、配列番号139～143で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、上記融合タンパク質又は免疫複合体の上記Fc領域は、配列番号142又は143で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。また、例えば、上記Fc領域は、配列番号143で示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記GLP-1ポリペプチド変異体の一端は、上記Fc領域の一端に直接的又は間接的に連結することができる。例えば、インフレーム融合による。場合によっては、上記GLP-1ポリペプチド変異体のC末端は、上記Fc領域のN末端に直接的又は間接的に連結することができる。
本願において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、上記GLP-1ポリペプチド変異体及び免疫グロブリンFc領域を含んでもよい。場合によっては、上記GLP-1ポリペプチド変異体と上記Fcは、リンカー（例えば、リンカーペプチド）を介して連結することができる。例えば、上記リンカーペプチドは、GS、GAP、G4S、（G4S）2、（G4S）3又は（G4S）4から選ばれてもよい。例えば、上記リンカーペプチドは、配列番号144～149の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願において、上記融合タンパク質又は免疫複合体は、N末端からC末端へ、本願に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体、上記リンカーペプチド及び上記Fc領域を順に含んでもよい。上記融合タンパク質又は免疫複合体は、N末端からC末端へ、本願に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体、上記リンカーペプチド（G4S）3（アミノ酸配列が配列番号148で示される）及びIgG4由来のFc領域（アミノ酸配列が配列番号143で示される）を順に含んでもよく、例えば、本願に記載の融合タンパク質又は免疫複合体は、配列番号96、98～120及び128～138の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
本願に記載の融合タンパク質又は免疫複合体は、生物学的活性を有する。生物学的活性は、インビボ又はインビトロでGLP-lRに結合して活性化し、応答を引き起こす能力を指す。上記応答は、インスリンの分泌、グルカゴンの阻害、食欲の抑制、体重の減少、満腹感の誘導、アポトーシスの阻害、膵臓β細胞増殖の誘導及び膵臓β細胞の分化を含むが、これらに限定されない。代表的な幾つかの融合タンパク質についてインビトロ及びインビボ活性を試験する。
本願に記載の融合タンパク質又は免疫複合体は、実施例2において、例えば、ELISA法により検出されるように、本願に記載の融合タンパク質とヒトGLP-lRとの相互作用能力を反映することができる。実施例3は、本願に記載される融合タンパク質のGLP-1Rへのインビトロ活性化能力を反映しており、GLP-1Rの活性化はアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こし、当該酵素の活性化は更に、cAMP応答配列結合タンパク質（CREB）によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を誘導するので、例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の蛍光強度によって示し、又はcAMP発現量によって示す。実施例4は、上記融合タンパク質が長い血液半減期を有することを反映している。実施例5は、本願に記載の融合タンパク質が上昇した血糖レベルを低減できることを反映している。
本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体はGLP-1-XXと命名され、そのうち、「XX」はアミノ酸置換を表し、例えば、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体GLP-WYの場合に、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体GLP-WYのアミノ酸変異は、31位のアミノ酸残基Wがアミノ酸残基Yで置換されたことを表し、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体GLP-KRWYYAの場合に、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体GLP-KRWYYAのアミノ酸変異は、19位のアミノ酸残基Yがアミノ酸残基Aで置換され、26位のアミノ酸残基Kがアミノ酸残基Rで置換され、及び31位のアミノ酸残基Wがアミノ酸残基Yで置換されたことを表す。
本願において、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体及びFc領域の融合タンパク質はGM-XXと命名され、そのうち、「XX」はヒトGLP-1ポリペプチド変異体における対応するアミノ酸置換を表す。
核酸分子、ベクター、細胞及び製造方法
別の態様において、本願は、本願に記載のポリペプチド変異体或いは上記融合タンパク質又は免疫複合体をコードする、単離された1種又は複数種の核酸分子を更に提供する。例えば、上記1種又は複数種の核酸分子のそれぞれは、完全なポリペプチド変異体或いは上記融合タンパク質又は免疫複合体をコードしてもよく、そのうちの一部をコードしてもよい。
本願に記載の核酸分子は、単離されたものであってもよい。例えば、（i）インビトロで増幅し、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅して産生すること、（ii）クローニングして組換えて産生すること、（iii）精製し、例えば、酵素切断及びゲル電気泳動分画により単離すること、或いは（iv）合成し、例えば、化学的に合成することといった方法により産生又は合成することができる。ある実施形態において、上記単離された核酸は、組換えDNA技術によって製造された核酸分子である。組換えDNA及び分子クローニング技術は、Sambrook，J.，Fritsch，E．F．とManiatis，T．Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，（1989）（Maniatis）及びT．J．Silhavy，M．L．BennanとL．W．Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y．（1984）及びAusubel，F．M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，pub．by Greene Publishing Assoc．and Wiley-Interscience（1987）に記載された技術を含む。簡単に言えば、ゲノムDNA断片、cDNA及びRNAによって上記核酸を製造することができ、これらの核酸の全ては、細胞から直接抽出するか、又は様々な増幅方法（PCR及びRT-PCRを含むが、これらに限定されない）によって組換え産生することができる。
別の態様において、本願は、上記核酸分子を含む1種又は複数種のベクターを提供する。例えば、上記ベクターは、1種又は複数種の上記核酸分子を含んでもよい。また、上記ベクターは、適切な宿主細胞内及び適切な条件下での当該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などの他の遺伝子を更に含んでもよい。また、上記ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の正確な発現を可能にする発現制御要素を更に含んでもよい。このような制御要素は当業者に良く知られているものであり、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子転写又はmRNA翻訳を調節する他の制御要素などを含んでもよい。本願に記載の1種又は複数種核酸分子は、上記発現制御要素と操作可能に連結することができる。
上記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ又は例えば遺伝子工学で一般的に使用される他のベクターを含んでもよい。例えば、上記ベクターは発現ベクターである。
別の態様において、本願は、本願に記載の1種又は複数種の核酸分子及び/又は本願に記載の1種又は複数種のベクターを含むことができる細胞を提供する。ある実施形態において、各種又は各宿主細胞は、1つ又は1種の本願に記載の核酸分子又はベクターを含んでもよい。ある実施形態において、各種又は各宿主細胞は、複数（例えば、2つ以上）又は複数種（例えば、2種以上）の本願に記載の核酸分子又はベクターを含んでもよい。例えば、本願に記載のベクターを上記細胞、例えば原核細胞（例えば、細菌細胞）、CHO細胞、NS0細胞、HEK293T細胞又はHEK293A細胞、或いは、植物由来の細胞、真菌や酵母細胞など他の真核細胞に導入することができる。エレクトロポレーション、リポフェクションなどの当該分野で知られている方法により、本願に記載のベクターを上記細胞に導入することができる。
別の態様において、本願は、本願に記載のポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体を製造する方法を提供する。上記方法は、上記ポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体を発現させる条件下で、本願に記載の細胞を培養することを含んでもよい。例えば、適切な培地、適切な温度及び培養時間などを使用することによってもよく、これらの方法は当業者に理解されているものである。
場合によっては、上記方法は、本願に記載のポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体を収集（例えば、単離及び/又は精製）するステップを更に含んでもよい。例えば、プロテインG-アガロース又はプロテインA-アガロースを使用してアフィニティークロマトグラフィーを行ってもよく、ゲル電気泳動及び/又は高速液体クロマトグラフィーなどにより本願に記載のポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体を精製・単離してもよい。
場合によっては、上記方法は、本願に記載のポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体を収集（例えば、単離及び/又は精製）するステップを更に含んでもよい。例えば、プロテインG-アガロース又はプロテインA-アガロースを使用してアフィニティークロマトグラフィーを行ってもよく、ゲル電気泳動及び/又は高速液体クロマトグラフィーなどにより本願に記載のポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体を精製・単離してもよい。
医薬組成物及び用途
別の態様において、本願は、上記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体、上記融合タンパク質又は免疫複合体、上記核酸分子、上記ベクター、又は上記細胞、及び任意選択的な薬学的に許容されるアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
例えば、上記薬学的に許容されるアジュバントは、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属錯体及び/又は非イオン性界面活性剤などを含んでもよい。
本願において、上記医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位でのインサイチュ投与、吸入、直腸内投与、膣内投与、経皮投与又は経皮下デポー投与のために調製されることができる。
本願に記載の医薬組成物は、代謝性疾患又は病状を治療するために使用することができる。上記医薬組成物は、糖尿病（例えば、高血糖症、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能異常、インスリン非依存性糖尿病、MODY（若年成人発症型糖尿病）、妊娠糖尿病及び/又はグリコシル化ヘモグロビン（HbAlC）の低下）、前糖尿病、高血圧、高血糖及び/又は脂質異常症（又は、これらの代謝危険因子の組み合わせ）を治療するために使用することができる。糖尿病の急性症状は、尿の過剰発生、結果として生じる代償性口渇と流体摂取量の増加、視野のぼやけ、原因不明の体重減少、眠気及びエネルギー代謝の変化を含む。糖尿病の慢性高血糖症は、大血管及び微小血管の合併症に関連し、上記合併症は、様々な臓器（特に、目（特に糖尿病性網膜症の形）、腎臓（糖尿病性腎症の形）、神経（糖尿病性神経病変の形）、心臓及び血管）の長期的な損傷、機能障害及び幾つかの場合の最終的な不全をもたらすことができる。上記医薬組成物は、体重増加の治療、体重減少の促進、過剰体重の減少及び/又は肥満症（例えば、食欲、摂食、食物摂取、カロリー摂取及び/又はエネルギー消費の制御による）（病的肥満を含む）及び関連疾患の治療、異常及び健康状態（肥満関連の炎症、肥満関連の胆嚢疾患及び肥満による睡眠時無呼吸を含むが、これらに限定されない）に使用することもできる。例えば、上記代謝性疾患又は病状は、糖尿病、肥満症及び他のGLP-1関連代謝性疾患から選ばれてもよい。
上記医薬組成物の投与頻度及び投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度並びに活性成分となる薬物の種類を含む、多くの関連要因によって決定することができる。上記医薬組成物は、優れたインビボ効果及び濃度持続性を有するため、上記薬物の投与頻度及び投与量を大幅に減らすことができる。
何れの理論にも限定されることなく、以下の実施例は、本願に係る融合タンパク質、製造方法及び用途などを説明するためのものに過ぎず、本願の発明の範囲を限定するものではない。
何れの理論にも限定されることなく、以下の実施例は、本願に係る融合タンパク質、製造方法及び用途などを説明するためのものに過ぎず、本願の発明の範囲を限定するものではない。
本願の実施例に使用される陽性対照デュラグルチド（Dulaglutide）は、Eli Lilly & Coの糖尿病薬であり、コード名がLY-2189265であり、デュラグルチドのアミノ酸配列は配列番号4で示され、本願においてGLP-1-Fc又はKN042と呼ばれる。
実施例1 融合タンパク質の製造
GLP-1ポリペプチド変異体GLP-1-XX及びFcの融合タンパク質を製造し、N末端からC末端へ、GLP-1ポリペプチド変異体（アミノ酸配列が配列番号5～71の何れか1つに示される）、リンカーペプチド（G4S）3及びIgG4由来のFc領域を順に含んだ。
融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを細胞に移転し、発現し精製して融合タンパク質GM-XXを得た。アミノ酸配列は、配列番号72～138の何れか1つで示される。本願に係る融合タンパク質、対応するヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸変異及び配列は、表1に示される通りである。
実施例2 本願に係る融合タンパク質のGLP-1受容体との結合親和性
ELISAにより実施例1における融合タンパク質のGLP-1受容体との結合親和性を検出した。GLP1R-muFc（配列番号3）と呼ばれるGLP-1受容体及びマウスFcの融合タンパク質を発現し、GLP1R-muFcを5 μg/mLに希釈し、96ウェルプレートをコーティングし、室温で30 min固定した。PBSで1回洗浄した後、1%のBSAで37℃、30 minブロッキングし、0.05%のPBST20で3回洗浄した。各ウェルに10 μg/mLで4倍濃度勾配により希釈された検出待ちサンプル50 μLを加え、KN042を陽性対照とした。37℃で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄した。各ウェルに、1%のBSAを含む0.05%のPBST20により2000倍希釈されたマウスモノクローナルHP6023抗ヒトIgG4Fc-HRP（abcam、ab99817）を50 μL加え、37℃で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄した。各ウェルに50 μLのTMBを加えて3 min発色させ、50 μL/ウェルで1MのH2SO4を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、SpectraMax M3）を使用してOD値を検出した。KN042を陽性対照とした。
結果は、図1～13、図16～20及び図33に示される通りである。
図1は、アミノ酸変異W31Y後の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性がF28Y変異よりも優れていることを示す。
図2は、アミノ酸変異W31Y後の融合タンパク質が陽性対照KN042に近いことを示す。
図3は、W31におけるアミノ酸変異後の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性がF28におけるアミノ酸変異後の融合タンパク質よりも優れていることを示す。
図4及び図5は、Q23における複数種のアミノ酸変異後、及びY19における複数種のアミノ酸変異後の融合タンパク質がいずれもGLP-1受容体との結合活性を保持していることを示す。
図6及び図7は、F28におけるアミノ酸変異後の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が大幅に低下していることを示す。
図1～図7から、W31、Q23、Y19におけるアミノ酸変異後の融合タンパク質は依然としてGLP-1受容体との結合活性を保持しているが、F28におけるアミノ酸変異はGLP-1受容体との結合活性を大幅に低下させていることが分かる。
図8は、K26R-W31Y二重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性がK26R-F28Y二重変異よりも優れていることを示す。
図9は、K26R-W31Y、K26R-Q23T、K26R-Q23S、K26R-Q23N、K26R-Y19L、K26R-Y19T及びK26R-Y19F二重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が優れており、陽性対照KN042に近いことを示す。
図10は、K26R-W31Y、K26R-Q23E、K26R-Y19I、K26R-Y19V、K26R-Y19A及びK26R-Y19S二重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が優れており、陽性対照KN042に近いことを示す。
図11は、K26R-W31Y、K26R-Q23N、K26R-Q23S及びK26R-Q23T二重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることを示す。
図12は、W31Y及びY19においてアミノ酸変異した二重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることを示す。
図13は、W31Y-Y19A及びW31Y-Q23Eのアミノ酸二重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることを示す。
図8～図13から、K26、W31、Y19及びQ23のうちの2つの位置におけるアミノ酸変異を含む融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることが分かる。
図16は、GM-WY及びGM-WYFLが何れもGLP-1受容体に結合できることを示す。
図17は、GM-WIFL、GM-WA、GM-WL及びGM-WLFLが何れもGLP-1受容体に結合できることを示す。
図16及び図17は、W31、Y19、Q23及びK26から選ばれる少なくとも2つのアミノ酸位置におけるアミノ酸変異を含まないGLP-1ポリペプチド変異体の融合タンパク質の結合活性が比較的弱いことを示す。
図18は、W31Y-K26R-Q23においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質、又はW31Y-K26R-Y19においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることを示す。
図19は、W31Y-K26R-Q23においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質、又はW31Y-K26R-Y19においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることを示す。
図20は、W31Y-K26R-Q23N三重変異の融合タンパク質、又はW31Y-K26R-Y19A三重変異の融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることを示す。
図18～図20から、K26、W31、Y19及びQ23のうちの3つの位置におけるアミノ酸変異を含む融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性が良好であることが分かる。
本願の試験結果から、K26R-W31Y二重変異を有する融合タンパク質のインビトロ生物活性（例えば、GLP-1受容体との結合活性、cAMP/PKAシグナル伝達経路を活性化する活性）は、K26R-W31A及びK26A-W31Y二重変異よりも優れていることが更に示されている。例えば、図33の結果から、K26R-W31Y二重変異を有する融合タンパク質のGLP-1受容体との結合活性は、K26R-W31A、K26A-W31Y及びK26A-W31A二重変異よりも優れていることが示されている。
実施例3 ルシフェラーゼ法による本願の融合タンパク質のcAMP/PKAシグナル伝達経路に対する活性化作用の検出
GLP-1ポリペプチド変異体の融合タンパク質がGLP-1受容体に結合し、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内環状アデノシン一リン酸（cAMP）レベルの向上を促進する原理により、CREB（cAMP応答配列結合タンパク質）レポーター遺伝子に基づいて、本願に係る融合タンパク質のcAMP/PKAシグナル伝達経路に対する活性化作用を検出した。ヒトGLP-1Rプラスミド及びCREBにより駆動されたルシフェラーゼレポータープラスミドを使用してHER293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした後、HER293-GLP1R-CREB-D4細胞を消化して収集し、カウントし、10%のFBSを含むDMEM培地で細胞数を4×105細胞/mLに調整し、1ウェルあたり50 μLで96ウェルプレートに接種した。10%のFBSを含むDMEM培地で検出待ちサンプルを1000 ng/mLから9つの濃度に希釈し、KN042を陽性対照とした。上記96ウェルプレートの各ウェルに、更に一連の濃度の検出待ちサンプル50 μLを加え、37℃で6時間又は24時間インキュベートした。上清を捨て、各ウェルにルシフェラーゼ基質を加えた。室温で5 min放置した後、50 μL取り出し、ルシフェラーゼアッセイシステムBio-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega、G7940）によりルシフェラーゼの活性を検出し、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、SpectraMax M3）で数値を読み取った。蛍光強度はcAMPのレベルを反映するもので、GLP-1受容体の活性化の程度を反映した。
その結果、図14～図15及び図21～図26に示されるように、本願に係る融合タンパク質は何れもGLP-1受容体を活性化することで、cAMP/PKAシグナル伝達経路を活性化することができる。本願に係る融合タンパク質GM-WYYA、GM-WYQE、GM-KRWY、GM-KRWYQE、GM-KRWYYA、GM-KRWYYL、GM-KRWYYS、GM-KRWYYI、GM-KRWYYT、GM-KRWYQN、GM-KRWYQT、GM-KRWYQSはインビトロ安定性が優れることを示している。
図14は、W31Y-Y19A二重変異のGLP-1ポリペプチド変異体及びFc領域の融合タンパク質がGLP-1受容体を活性化することで、cAMPレベルを向上させることができ、且つインキュベート時間が6時間（14A）から24時間（14B）に増加されるように長くなり、活性化能力がより強くなることを示す。活性化能力は陽性対照に対して高くなることで、出願に係る融合タンパク質GM-WYYAがより優れたインビトロ安定性を示したことを示している。
図15は、W31Y-Q23E二重変異のGLP-1ポリペプチド変異体及びFc領域の融合タンパク質がGLP-1受容体を活性化することで、cAMPレベルを向上させることができ、且つインキュベート時間が6時間（15A）から24時間（15B）に増加されるように長くなり、活性化能力がより強くなることを示す。活性化能力が陽性対照に対して高くなることは、出願に係る融合タンパク質GM-WYQEがより優れたインビトロ安定性を示したことを示している。
図21は、K26R-W31Y二重変異及びK26R-W31Y-Q23においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質が何れもGLP-1受容体を活性化することができることを示す。
図22及び図23は、K26R-W31Y-Y19においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質が何れもGLP-1受容体を活性化することができることを示す。
図24及び図26は、K26R-W31Y-Q23においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質及びK26R-W31Y-Y19においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質が何れもGLP-1受容体を活性化することができることを示す。
図25は、K26R-W31Y-Q23においてアミノ酸変異した三重変異の融合タンパク質がGLP-1受容体を活性化することができることを示す。
実施例4 薬物動態試験
GLP-1-Fc融合タンパク質のインビボ薬物動態を調べた。実験は、環境温度23±2℃、相対湿度40～70%、12時間明暗サイクルであるSPF動物室で行った。実験動物は自由に飲食させ、実験前に少なくとも3日適応させた。体重が180～220 gのSPFグレードのSDラットをランダムに群分けした。各群のラットに、対応する被験品を皮下注射し、dulaglutideを対照とした。投与前、投与後の6 h、24 h、48 h、72 h、96 h及び120 hに頸静脈から約100 μL採血した。採取した血液を遠心分離管に加え、室温で30～60 min静置した。その後、4℃で2時間以内に4000 rpmで10分間遠心分離し、血清を迅速に分離した。-80℃で保存した。サンプルをELISAにより検出した。DAS（3.2.8）ソフトウェアにより薬物動態パラメータを算出した。
その結果、対照と比較して、本願に係る融合タンパク質は良好な薬物動態特性を有することを示した。図27は、本願に係る融合タンパク質GM-KRWYの半減期がデュラグルチドよりも長く、16.199 hであり、且つ薬物曝露量がデュラグルチドよりも高く、且つ血中薬物濃度が近いことを示す。図28は、本願に係る融合タンパク質GM-KRWYYL、GM-KRWYYA及びGM-KRWYYIの半減期がデュラグルチドよりも長く、約13～16.5 hであり、且つ薬物曝露量及び血中薬物濃度がデュラグルチドよりも高いことを示す。図29は、本願に係る融合タンパク質GM-KRWYQN、GM-KRWYQE及びGM-KRWYYAの半減期がデュラグルチドよりも長く、約22～25 hであり、且つ薬物曝露量及び血中薬物濃度がデュラグルチドよりも高いことを示す。
実施例5 経口耐糖能試験（OGTT）
GLP-1-Fc融合タンパク質のインビボ血糖降下活性を調べた。マウスを一晩絶食させ、実験前に血糖と体重を測定した後、ランダムに群分けした。各群のマウスに、対応する被験品を腹腔内注射し、デュラグルチドを対照とした。投与後の0.5 hに、各マウスに1.5 g/kgのグルコースを経口負荷した。マウスに対して、グルコース負荷前、負荷後の10、20、30、60及び120 minに、ハンドヘルドロシュ血糖値測定器（Roche、Accu-chek）でマウスの尾の先端の血糖値を測定した。マウスの尾の先端を約1 mm切除し、尾を根部から先端へ押して静脈血液を採取して血糖値を測定した。
その結果、対照と比較して、本願に係る融合タンパク質GM-KRWY（図30A及び図30B）、GM-KRWYYA及びGM-KRWYQE（図31A及び図31B）は、同じレベルのインビボ血糖降下活性を有することを示した。
Claims (28)
- ヒトGLP-1ポリペプチド変異体であって、配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、前記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26アミノ酸位置における変異、及びQ23とY19からなる群から選ばれるアミノ酸位置における変異を含む、ヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- ヒトGLP-1の少なくとも一部の活性を有する、請求項1に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、前記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びY19アミノ酸位置における変異を含む、請求項1～2の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列と比較して、前記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、W31、K26及びQ23アミノ酸位置における変異を含む、請求項1～3の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 前記W31では、W31Y、W31R、W31K又はW31Aであるアミノ酸置換を含む、請求項1～4の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 前記Y19では、Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V及びY19Sからなる群から選ばれる何れか1つのアミノ酸置換であるアミノ酸置換を含む、請求項1～5の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 前記Q23では、Q23E、Q23T、Q23S及びQ23Nからなる群から選ばれる何れか1つのアミノ酸置換であるアミノ酸置換を含む、請求項1～6の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 前記K26では、K26Rであるアミノ酸置換を含む、請求項1～7の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 配列番号150で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1～8の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 配列番号61～71の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項1～9の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体。
- 請求項1～10の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体を含む、融合タンパク質又は免疫複合体。
- 免疫グロブリンFc領域を更に含む、請求項11に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 前記免疫グロブリンFc領域はIgG由来のFc領域である、請求項12に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 前記免疫グロブリンFc領域はIgG4由来のFc領域である、請求項11又は12に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 前記免疫グロブリンFc領域は、配列番号139～143の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項11～14の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 前記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体と前記免疫グロブリンFc領域はインフレーム融合される、請求項11～15の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- リンカーペプチドを含む、請求項11～16の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 前記ヒトGLP-1ポリペプチド変異体と前記免疫グロブリンFc領域は、前記リンカーペプチドによって連結される、請求項17に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 前記リンカーペプチドは、配列番号144～149の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項17又は18に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 128～138の何れか1つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項11～19の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体。
- 請求項1～10の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体或いは請求項11～20の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体をコードする、単離された核酸分子。
- 請求項21に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項1～10の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体、請求項11～20の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体、請求項21に記載の単離された核酸分子或いは請求項22に記載のベクターを包含又は発現する、細胞。
- 請求項1～10の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体、請求項11～20の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体、請求項21に記載の単離された核酸分子、請求項22に記載のベクター或いは請求項23に記載の細胞、及び任意選択的な薬学的に許容されるアジュバントを含む、医薬組成物。
- 代謝性疾患又は病状を予防及び/又は治療するための薬剤の調製における、請求項1～10の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体或いは請求項11～20の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体の用途。
- 前記代謝性疾患又は病状は、GLP-1に関連する代謝性疾患を含む、請求項25に記載の用途。
- 前記代謝性疾患又は病状は、糖尿病を含む、請求項25～26の何れか一項に記載の用途。
- それを必要とする被験者におけるインスリン発現を増加又は促進する方法であって、有効量の請求項1～10の何れか一項に記載のヒトGLP-1ポリペプチド変異体或いは請求項11～20の何れか一項に記載の融合タンパク質又は免疫複合体を前記被験者に投与することを含む、方法。
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