KR101524517B1 - 인체 Ｔ-임파구 칼륨 채널(아형 Ｋｖ1.3)을 높은 선택성으로 차단하며 래트에서 생체내 ＤＴＨ-반응을 감소시키는 두 개 전갈 펩타이드, Ｖｍ23 및 Ｖｍ24 - Google Patents

인체 Ｔ-임파구 칼륨 채널(아형 Ｋｖ1.3)을 높은 선택성으로 차단하며 래트에서 생체내 ＤＴＨ-반응을 감소시키는 두 개 전갈 펩타이드, Ｖｍ23 및 Ｖｍ24 Download PDF

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Abstract

칼륨 채널 Kv1.3은 면역질환 및 이식 거부와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 칼륨 채널 Kv1.3을 고도의 친화도와 특이성으로 차단할 수 있는 펩타이드, 이의 약학적 조성물, 및 이를 Kv1.3 칼륨 채널을 차단하는 데 사용하여 다양한 면역학적 상태를 치료하고 진단 적용하는 방법이 개시된다. 이들의 화학적 합성 및 정확한 폴딩 방법 또한 개시된다. 예증되는 펩타이드는 멕시코 전갈 Vaejovis mexicanus smithi의 독으로부터 분리된 단백질 성분 (Vm23 및 Vm24)에 상응한다 Vm23 및 Vm24는 거의 비가역적 방식으로 hKv1.3 채널에 결합하여, 시험관내 인간 임파구 배양물에 적용시 3 피코몰 범위의 Kd 값을 나타낸다. Vm24은 화학적으로 합성되었고 생체 내 실험에서 감작된 래트를 성공적으로 치료하는 데 사용되었다 ( DTH-반응 상에서). Vm24나 합성된 Vm24 어느 것도, 비교적 높은 농도로 마우스에 주입시 (마우스 킬로그람 체중당 10,000 마이크로그람까지 분석됨), 독성적이지 않았다. 이러한 펩타이드들 (Vm24 및 Vm23) 및 적어도 83% 사슬 동일성을 지닌 기능적 동일 유사체는, 다양한 면역학적 상채의 치료 및 진단 적용에 주된 화합물 후보이다.
칼륨 채널 Kv1.3, 펩타이드, Vm23, Vm24,

Description

인체 Ｔ-임파구 칼륨 채널(아형 Ｋｖ1.3)을 높은 선택성으로 차단하며 래트에서 생체내 ＤＴＨ-반응을 감소시키는 두 개 전갈 펩타이드, Ｖｍ23 및 Ｖｍ24{VM23 AND VM24, TWO SCORPION PEPTIDES THAT BLOCK HUMAN T-LYMPHOCYTE POTASSIUM CHANNELS (SUB-TYPE KV1.3) WITH HIGH SELECTIVITY AND DECREASE THE IN VIVO DTH-RESPONSES IN RATS}
본 발명은 생화학, 분자생물학, 면역학 및 전기생리학의 분야에 관한 것이다. 펩타이드류, 이들의 약학 조성물들, 및 Kv1.3 칼륨 채널을 차단하는 데 이들을 사용하기 위한 방법, 다양한 면역학적 상태를 치료하는 방법, 및 진단 적용 방법, 및 면역 질환 및 이식 거부에 관여하는 것으로 나타난 아형 칼륨 채널 (hKv1.3)을 높은 친화도 및 특이성으로 차단할 수 있는, 칼륨 채널 특이성 리간드의 새로운 아족을 구성하는, 멕시코 전갈 바이조비스 멕시카누스 스미티(Vaejovis mexicanus smithi) (이하, V. mexicanus로 약칭)의 톡으로부터 분리된 두 개의 단백질 성분에 상응하는 펩타이드들에 대한 화학합성 및 정확한 폴딩 방법이 개시된다. 이들의 화학적 및 기능적 특성을 규명하는 데 사용되는 방법과 기술을 물론, Vm24로 처리시 감작된 래트의 DTH-반응에 대한 생체 내 실험 결과가 또한 개시된다. 이러한 펩타이드 (Vm24), 이의 상동성 Vm23 및 이들의 기능적 동일 유사체는 다양한 면역학적 상태의 치료 및 진단 적용에 주된 화합물이고 후보물질이다.
일반적 고려사항
여기 개시된 본 발명의 목적에 관하여 몇 가지를 고려하여야만 하고, 이 중에는 하기 내용에 대하여 나타나는 지식과 관련하여 생화학, 분자생물학, 면역학 및 전기생리학의 분야에서 중요한 진전을 전제로 한다:
1)- 세포 교신, 신호 전달 경로 및 조직과 다양한 기관 기능의 통상적인 항상성에 기본적인 역할을 하는 "이온 채널"로 지칭되는 생물학적 막의 내재성(integral) 단백질의 존재;
2)- 자가면역질환의 개시와 관련된 사건에 명확한 역할을 하는 것으로 나타난, 면역계의 세포, 주로 T-임파구에서 이러한 채널들의 상이한 발현 수준;
3)- 다양한 화합물, 천연 리간드, 및 리간드를 천연에서 발견되는 것 같이 재생산하든지 또는 유사 유도체 (펩티도의태체, peptidomimetic )를 제조하든지, 합성제조된 물질의 첨가를 통해, 채널 기능의 조절 가능성, 즉 질병을 치료하는 것의 가능성.
지난 15년간, 분리, 개별적 발현 및 기능적 분석에 의해 많은 칼륨 (K) 채널들이 발견되었고 그 존재가 보고되었다.
이들은 세포 막 전위를 결정하는 데 연관된 다중체 (multimeric) 단백질로서, 평활근 상태 (tone), 시냅스 흥분성 (synaptic excitability), 신경전달물질 방출 및 다른 과정을 제어한다. 본 발명에서, 본 발명자들은 K 채널 종인, 아형 Kv1.3의 중요성과, 임파구 증식에서의 이의 역할, 및 이러한 채널을 저해함으로써 자가면역 질환을 제어하는 데에서의 역할을 강조하고자 한다. 이것은 T 임파구에 주로 발현되는 지연된 정류기 채널로서 [Grissmer 등, 1990; Lewis and Cahalan, 1995], 단지 몇 개의 아형의 K 채널들을 언급하자면, 뇌에 광범위하게 분포된 아형 Kv1.1, Kv1.2 및 심장 조직에 분포된 Kv1.5과는 상이하다.
Kv1.3 채널들의 활성을 조절하면 임파구 증식에 영향을 끼치는 기작이 몇몇 연구실에서 연구중에 있고 많은 최근 논문 ([Beeton and Chandy, 2005; Judge and Bever, 2006, Panyi 등, 2006]에서 리뷰) 및 특허들 (예, Cahalan 등의 US 5,397,702및 Kem 등의 US 6,077,680, 2000년)의 주제였다.
자가면역 질환들은 세계적으로 상당한 사망률이 알려져 있다. 이러한 질환으로는, 몇 가지를 언급하자면, 제 1형 당뇨 (인슐린 의존성), 다발성 경화증 (MS), 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 혼합 결체 조직 질환, 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증이 있다. 자가면역 질환들에 대한 적절한 실험 모델은 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)이다. 이러한 자가면역 질환들은 세포에 직접적으로 공격을 하든지 또는 자가 항체를 생성함으로써 특정 조직을 파괴하는 면역체계의 반응으로부터 결과한다. Kv1.3 채널들의 과발현은 자가반응 T 세포의 독자적인 특징으로, 이로써 Kv1.3의 차단체에 의해 이들의 증식을 변경하는 것에 대하여 훌륭한 기회를 제공하게 된다.
이러한 연구와 실험의 선상에서, 몇 가지 물질을 설명하였고 특허까지 허여 되었다. 그러한 한 가지 예는 바다 말미잘 Stichodactyla helianthus 로부터 얻은 독소 ShK 이고, 이의 몇 가지 유도체는 몇 가지 자가면역 질환들에 대하여 방어 효과를 가지는 것으로 주장되고 있다 (예, Kem 등의 US 6,077,680, 2000년).
이온-채널들의 기능에 영향을 줄 수 있는 다른 자연 리간드 중에는 전갈 독으로부터 분리한 독성 펩타이드들이 있다. 이러한 독으로부터 분리한 K 채널 특이성 펩타이드들은 22 내지 42 개 아미노산을 포함하는 짧은 사슬 펩타이드들로서 세 개 내지 네 개 디설파이드 다리에 의해 밀집되어 있다. 이들은 채널들의 많은 상이한 아형들의 차단체로서, 선택도와 친화도에서 매우 다양하다 ([Giangiacomo 등, 2004; Rodriguez de la Vega and Possani, 2004]에서 리뷰). 예를 들어, 챠립도톡신(charybdotoxin)은 Kv1.1, Kv1.2 and 1.3 세이커 (Shaker) 지연 정류체 채널들의 강력한 차단체이지만, 또한 맥시(maxi)-유형 K(Ca) 채널들을 차단한다 [Rauer 등, 2000]. 다른 전갈 독 펩타이드인, 마르가톡신(Margatoxin)은 K(Ca) 채널 차단활성이 없으나, Kv1.3 채널들의 높은 친화성 차단을 유지한다 [Garcia-Calvo 등, 1993]. 아지오톡신(agitoxin), 녹시우스톡신(noxiustoxin) 및 칼리오톡신(kaliotoxin)은 구별되는 친화도와 선택성을 가지고 상이한 유형의 K 채널들에 영향을 끼치는 전갈 독소의 예로서, 보통 채널들의 하나 이상의 아형을 변형한다 ([Panyi 등, 2006]에서 최근 리뷰). 디설파이드 다리에 의해 단단하게 유지된, 비교적 견고한 삼차 구조로 인하여, 이러한 전갈 펩타이드류의 일부는 채널들의 외부 입구에 있는 K 채널 아미노산 잔기 간의 거리를 측정하는 "분자 척자"로서 사용된다 [Krezel 등, 1995; Garcia 등, 2000]. K 채널들에 특이성이 있는 많은 전갈 독 소의 삼차 구조는 핵자기 공명 및/또는 X-선 회절 방법에 의해 밝혀졌고, 일부 K 채널들의 공지된 구조와 연계하여 수용체 (이온-채널)과 리간드 (전갈 독소) 간의 상호작용을 모델링하는데 실마리를 제공하였다. 이온-채널 및 리간드 둘 다에서의 아미노산 잔기를 부위-지정 돌연변이하여, 이러한 수용체-리간드 단백질간의 추정되는 상호작용 표면을 확인하는 정보를 얻었다 [Rodriguez de la Vega 등, 2003]. 이러한 정보는 잠재적인 약학적 적용성을 가지는 가능한 약물을 합리적으로 디자인하는 바탕이 된다. 선택성과 친화도의 부족은 이러한 천연 펩타이드들을 잠재적 약물로 사용하는 데 유일한 문제점으로 나타난다. 현재, 20 개 아족의 전갈 독소가 있고, 이는, 서열 유사성과 가능한 기능으로 분류시, 125개 이상의 구조적으로 연관된 펩타이드들을 포함하고 있다 [Tytgat 등, 1999; Rodriguez de la Vega and Possani, 2004].
자가면역 질환들의 Kv1 . 3저해체 -기반 요법에 대한 분자적 토대
본 단락에서, 본 발명자들은 임파구의 "작용기억 T-세포" (TEM)의 Kv1.3 이온-채널들을 고도의 친화도와 선택성으로 차단할 수 있는 리간드 (펩타이드 또는 유기 화합물)을 단순히 적용함으로써 몇몇의 면역학적 질환을 제어하는 것에 관한 기술 지식의 상태를 제공한다.
Kv1.3 저해체들이 생리적 항체 자극 또는 마이토젠에 의해서 야기된 임파구의 활성 작용을 방해하는 기작은 세포막의 탈분극이고, 도전 항원에 특이적인 T-세포 클론들의 증식과 생성으로 세포 주기가 정상적으로 진행하는 데 필요한 Ca2+ 신 호를 결과적으로 저해하는 것임이 일찍이 밝혀졌다 ([Cahalan 등, 2001; Panyi 등, 2004; Panyi 등, 2006]에서 리뷰). T-세포의 초분극화 막전위 (-50, -60 mV) [Verheugen 등, 1995]를 충분히 유지하는 것을 담당하는 두 가지 유형의 K 채널이 있다: Kv1.3 로 표시되는 전압 관문 (전위 관문) 및 탈분극 활성화 채널 [Decoursey 등, 1984; Matteson and Deutsh, 1984]; 및 IKCa1 (또는 최근 명명법에 따라 KCa3.1.)로 표시되는 중간 전도도의 Ca2 +-활성화 K 채널 [Grissmer 등, 1993]. 이러한 채널들의 활성화는 Ca2 + 분비 활성화 Ca2 + 채널들을 통해 T 세포로 Ca2+ 가 들어가는 동안 막의 음전압을 유지하는 데 필요한 균형의 양하전 유출을 일으킨다 [Feske 등, 2006; Yeromin 등, 2006]. T 세포의 막전위에 대한 이러한 두 가지 유형의 K 채널의 기여도는, 하기 논의되는 바와 같이, 세포의 활성화 상태 (휴지 대 활성화), 및 T 세포의 말단 분화의 정도에 의해 결정되는 면역계에서의 그 기능적 역할에 의존한다 [Wulff 등, 2003].
두 가지 유형의 T 세포, 미접촉 (naive) 및 중심 기억 T 세포 (TCM)는 활성화될 말단(이차) 림프 기관에서의 강한 항원 자극 및 공동-자극을 요구한다. 이전에 항원과 마주치지 않은 미접촉 T 세포는 CCR7+CD45RA+ 기능 마커 발현을 보우하고 있다. 반응성 (reactive) 기억을 중개하는 중심 기억 T 세포 (TCM, CCR7+CD45RA-)는 대개는 작용 기억 세포(TEM) 로 되는 말단 분화의 중간 단계에 머물러서 있다 [Sallusto 등, 2004]. 이러한 세포들은 작용기능이 거의 또는 아주 없지만, 항원 자극에 반응하여 즉시 작용 세포로 증식되고 분화된다. 방어 기억 (protective memory)은 작용 기억 TEM 세포 (CCR7-/-CD45RA+/-)에 의해 지배된다. TEM 세포들은 즉각적인 작용 기능을 발휘하는 염증화된 조직으로 불러모아지는 데 필요한 케모카인 수용체와 부착 분자 (adhesion molecule)의 특징들을 나타낸다. 다발성 경화증 (MS) (Wulff 등, 2003), 류마티스 관절염과 제 1 형 당뇨병 [Beeton 등, 2006], 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환을 위시한 몇몇의 자가면역 질환에서, 만성적으로 활성화된 TEM 세포들은 조직 손상을 야기하고, 따라서 이러한 세포들의 증식과 기능적 활성을 선택적으로 저해하는 것은 이러한 질환들을 관리하는 데 극도로 중요하다 ([Chandy 등, 2004; Beeton and Chandy, 2005; Panyi 등, 2006]에서 리뷰).
CD4+ (헬퍼) 또는 CD8+ (세포독성적) 표현형의 휴지 (resting) 인간 미접촉, TCM 및 TEM은 세포당 유사한 수 (200-300)의 Kv1.3 및 30 미만의 IKCa1 채널들을 발현한다 [Wulff 등, 2003]. 미접촉 및 TCM 세포를 특이성 항원 자극에 의해 증식하는 아세포로 형질전환하면 세포당 Kv1.3 채널들의 수가 약간 (~1.5 배) 증가하는 반면, IKCa1 채널들의 수는 극적으로 증가하여 (500 채널/세포), 따라서 IKCa1highKv1.3low 이온 채널 표현형을 달성한다. 대조적으로, 말단 조직에서 CD4+ 또 는 CD8+ 표현형의 TEM 을 활성화시키면 IKCa1 수준의 변화 없이 Kv1.3 채널의 수가 ~1500/세포로 극적으로 증가되고, 따라서 활성화된 TEM의 채널 표현형은 IKCa1lowKv1.3high 으로 된다.
Kv1.3high TEM 및 자가면역 질환간의 일상적인 연계고리는 인간 질병에서 얻어진 하기 데이터에 의해 구체화된다:
1) MS 환자의 말초 혈액으로부터 얻은 마이엘린-반응성 T 세포들은 Kv1.3high 이다[Wulff 등, 2003];
2) 건강한 대조군의 말초혈액으로부터 얻은 마이엘린-반응성 T-세포들은 Kv1.3low이고, 이는 미접촉/TCM 표현형과 일치한다;
3) MS 환자 T 세포를 인슐린 펩타이드, 오발부민 과 같은 무관한 항원으로 또는 통상적인 마이토젠으로 자극하면 해도 Kv1.3highIKCa1low 채널 표현형을 지닌 TEM 생성을 유도하지 않았다;
4) Kv1.3high TEM 세포들은 사후 MS 환자 뇌 염증성 침입물 및 탈수(demyelinated) MS 병변의 유조직 (parenchyma)에서 나타났다 [Rus 등, 2005];
5) 류마티스 관절염 (RA)으로 고생하는 인간 환자의 활액으로부터 분리된 T 세포는 동일한 공여자이지만 말초혈액에서 분리된 T 세포에 비하여 많은 양의 Kv1.3를 발현한다. 이러한 Kv1.3high T 세포는 CCR7- 이고, 이들이 TEM 세포임을 나타낸다 [Beeton 등, 2006];
6) 제 1 형 당뇨병 (T1DM) 인간 환자의 말초혈액 임파구로부터 발생되고, T1DM-관련 자가항원 인슐린 및 GAD65에 특이성인, 단기 항원 특이성 CD4+ T 세포 주들(TCLs)은 CCR7 항원 (CCR7-) 및 Kv1.3high 채널 표현형이 결여된 것을 위시한 TEM 세포의 특성을 나타낸다 [Beeton 등, 2006].
TEM 세포의 막전위 조절이 Kv1.3 채널들의 활성에 의해 독점적으로 지배됨에 따라, 이러한 세포의 증식, 이들의 기능적 활성 및 따라서 자가면역 질환의 증상은 Kv1.3 저해체를 사용함으로 개선되어야만 한다. 문헌에서의 하기 시험관내 및 생체내 데이터는 이러한 시나리오를 지지하고 있다:
1) TEM (CCR7-, Kv1.3high)의 특성을 지니며 마이엘린 항원에 특이적이거나 [Wulff 등, 2003] 또는 RA 환자의 활액으로부터 분리된 TEM 세포에 특이적인 만성적으로 활성화된 인간 T 세포주를 시험관내 증식은 ShK와 같은 Kv1.3 특이성 차단체 펩타이드 ShK(L5) 에 의해 [Wulff 등, 2003], 또는 소분자 Kv1.3 차단체 PAP-1에 의해 [Beeton 등, 2006] 완전하고도 영원히 억제된다;
2) 높은 친화성 Kv1.3 차단체 펩타이드인 마르가톡신으로 행한 생체내 실험 에서, Kv1.3의 차단은 미니돼지에서 지연형 과민증 반응을 저해하게 하고; 이러한 반응은 작용 기억 T 세포의 활성의 양호한 척도이다 [Koo 등, 1997];
3) MBP-특이성 래트 T 세포를 MBP (감작기)로 시험관내 자극하는 동안 ShK 또는 ShK-Dap22로 처리하면서 이들 펩타이드들을 수용 동물로 반복적으로 적용하면 (작용기 기간) 루이스 래트로 실험적 자가면역성 뇌척수염의 인입전달 (adoptive transfer of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (AT-EAE))를 방지하였다 [Beeton 등, 2001]. 래트에서의 EAE [Ben Nun and Cohen, 1982]는 유사한 병리학 및 신경학적 이상에 의해 특징화되는 인간질환 MS에 대한 가장 잘 특성화된 모델이고, T cell 증식을 야기하는 이러한 질병은 Kv1.3high 채널 표현형을 가진 마이엘린-특이성 TEM이다. Kv1.3 및 IKCa1 채널 차단체들의 복합 적용 또한 병의 개시 이후 투여시, EAE의 증상을 개선하였다 [Beeton 등, 2001];
4) 다크 아구티(Dark Agouti) 래트에서의 프리스탄-유도 MHC 클래스 II-제한 만성 관절염 모델 (PIA)은 인간 질병 류마티스 관절염에 대한 모델이다. ShK(L5)을 단독으로 매일 주사하면 시험 기간 (최대 34 일) 동안 그 질환에 의해 영향을 받는 관절의 수를 상당히 감소시켰다 [Beeton 등, 2006];
5) 실험적 자가면역성 당뇨병 (EAD, 인간의 T1DM에 대한 래트 모델)을 방지하는 Kv1.3 저해체의 효능은ββ MHC 클래스 II-제한 DP-BB/W 래트에서 연구되었다 [Beeton 등, 2006]. 고도의 친화성 및 선택성을 가진 Kv1.3의 소분자 차단체인 PAP-1를 매일 반복적으로 투여하면 부형제 만을 처리한 대조군에 비하여, EAD를 나 타내는 래트의 비율을 ~50% (110 일령에서 산정)만큼 감소시켰다. 이것은 부형제-처리 대조군에 비하여 PAP-1-처리된 군에서 섬내부(intraislet) T 세포와 대식세포 침윤이 감소되고 β 세포 파괴가 감소되는 것이 동반되었다 [Beeton 등, 2006].
Kv1.3-특이성 저해체에 의한 T 세포 증식의 저해는 TEM 세포에 특이적이고, 이는 이러한 화합물이 자가면역 질환들의 관리나 예방에 이상적인 장치로 작용하게 한다. 비록 휴지 미접촉 및 TCM 세포들의 항원-유도 증식이 Kv1.3-매개 저해에 부분적으로 민감하지만, IKCa1 채널들을 전사적으로 증가시키면 예비-활성화된 T 세포에서의 이러한 것을 극복하며, 이러한 세포들의 증식이 Kv1.3 저해체는 아니고 IKCa1 저해체에 민감하게 한다 [Ghanshani 등, 2000]. 상이한 T 세포 아형들에 대한 Kv1.3 및 IKCa1 저해체들의 이러한 제한된 활동은 주어진 분자가 IKCa1을 넘어선 Kv1.3에 대한 선택성의 중요함에 대한 기초를 이루고 있다. Kv1.3 저해체에 의한 TEM 증식의 저해는, 정상적인 방어 기억 면역 반응 동안 병원균 및 백신 항원에 의한 TEM 세포의 활성화를 모방하는 과도한 항원 자극에 의해 극복될 수 있다는 것이 최근 밝혀졌다 [Beeton 등, 2006]. 따라서, 고도의 친화성 및 선택성을 가지는 Kv1.3 저해체를 적용하면 자가면역 반응 동안 반복적으로 활성화된 TEM 세포를 이상적으로 타겟하는 반면, 면역계의 다른 방어 기능은 변경하지 않고 둔다.
인간 T 및 B 임파구에 더하여, Kv1.3 채널들은 또한 몇몇의 기관 및 조직 (중추신경계, 신장, 간장, 근육)에서 발현되고, 그리고, 상기 세포에서 Kv1.3 채널 들을 차단하면 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 예전에 많은 시험관내 및 급성, 만성 생체내 독성학적 시험이 펩타이드 차단체 군에서 나온 ShK(L5) 에 대하여 [Beeton 등, 2005; Beeton 등, 2006] 소분자 차단체의 군에서 나온 PAP-1 에 대하여 [Schmitz 등, 2005; Beeton 등, 2006] 에 대하여 시행되었다. 이러한 연구는 신경학적 및 심장학적 부작용에 대한 임상학적 증상, 또는 Kv1.3이 발현되는 조직에서의 조직병리학적 변화가 없다는 것을 나타내었다. 따라서, 상기 언급된 Kv1.3 차단체의 이로운 처리 효과는 자가면역 질환들의 관리에서 선택적인 Kv1.3 차단체의 적용성에 대하여 부작용의 최소화 또는 부재와 결합될 수 있다.
요약하면, 상기의 데이터는 생리적 면역 반응을 실행하는 데 있어서 Kv1.3 K 채널들의 중심적 역할을 제시하고 및 Kv1.3 채널들을 저해함으로써 자가면역 질환에서의 치료적 간섭으로 적용할 수 있는 점을 제시한다.
발명의 요약
본 발명은 특정 이온 전도도를 차단함으로써 고도의 친화도와 특이성을 가지고 인간 임파구의 hKv1.3 채널들의 기능을 저해할 수 있는, 멕시코 전갈 V. mexicanus의 독으로부터 분리된 펩타이드류: Vm23, Vm24 및 이들의 기능적 동일 유사체의 동정 및 용도, 이들을 사용하여 Kv1.3 칼륨 채널들을 차단하는 방법, 다양한 면역학적 상태를 치료하는 방법과 진단 적용 방법, 및 이들의 화학적 합성 및 정확한 폴딩 방법에 관한 것이다. 이러한 펩타이드들은 통상적인 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분리되었고, 에드만 분석 및 질량 분광분석으로 그 일차 아미노 산 서열이 결정되었고, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2로 그 일차 구조가 나타나 있다. Vm24는 36개 아미노산으로 구성되며3863.5 달톤의 분자량을 가진다. 이것은, 질량 분광분석으로 나타난, 시스테인 쌍 C6과 C26, C12과 C31, C16과 C33, 및 C21과 C36 사이에, 4 개의 디설파이드 다리에 의해 유지되고 있는 밀집된 분자이고, 여기서 문자 C는 시스테인 잔기를 나타내며 숫자는 아미노산 서열에서 상대적인 위치에 상응한다. 상기 펩타이드의 카르복실 말단의 아미노산은 아미드화 되어있다. 전체 펩타이드는 메리필드 (Merrifield)의 고체 상 방법을 사용하여 화학적으로 합성되었고, 합성된 펩타이드의 정확한 폴딩은 화학적 및 기능적 분석 둘 다에 의해 얻고 확인되었다. Vm24은 비교적 고농도로 (20 그람 체중의 마우스 당 200 마이크로그람까지 분석, 즉: 10,000 마이크로그람/킬로그람 마우스 체중) 투여되었을 때도 마우스에 독성이 없다. 시험관 내에서 인간 임파구에 적용했을 때, 패치-클램프 기술로 분석시, hKv1.3 채널들에 대하여 극히 고도의 친화도를 보인다. 이것은 이러한 채널들에 거의 불가역적 방식으로 결합하여, 피코몰 범위 이하 (3 피코몰 이하 -3 pM)로 Kd 값을 나타내고 있다. 10 나노몰 (10 nM)의 농도로 분석시, 이것은 하기 이온 채널: hKv1.4, hKv1.5, rKv2.1, hBK 및 hERG-채널의 칼륨 전류, 및 전압 관문 심장 Na+ 채널 (hNaV1.5)의 전류를 변경하지 않는다. hKv1.3 채널들에 대해서는 100% 차단인 것에 비하여, 채널 hIKCa1, mKv1.1 및 hKv1.2에 대하여 10 nM 농도에서 전류 저해는 약 20 내지 50%이다. 상기 독소는 3 pM 나 작은 농도에서 hKv1.3 전류를 50% 이상 차단하며, 따라서 분석된 임의의 다른 채널에 비하여 이 채널에서 1500 배 이상의 효과를 나타낸다.
Vm24로 시행된 치사 시험에서, 200 마이크로그람/20 그람 마우스 체중까지의 농도를 사용할 때, 독성의 징후를 발견할 수 없었다. 지연형 과민증 (DTH) 에 대한 래트 모델에 적용시, Vm24은 실험 동물을 보호하였다. 디니트로플루오로벤젠 (DNFB)으로 실험 래트를 피부 감작시키면 상당한 면역 반응 (귀의 홍반 및 전체적인 염증)을 야기한다. 처리 개수 후 6일 째에, Vm24의 10 10 마이크로그람을 단일 주사한 래트 군은 상기 면역 반응의 상당한 감소를 나타내며; 처리된 귀의 염증은 용제 처리만 받은 대조군 래트에 비하여 상당히 감소된다 (적어도 60% 감소 염증).
Vm23으로 명명된 관련 펩타이드는 또한 동일한 독으로부터 분리되었고 SEQ ID NO:2로 완전히 서열 분석되었다. 이러한 펩타이드는 Vm24와 83% 동일하고, 35개 아미노산 잔기를 가지며, 4 개 디설파이드 다리에 의해 응집되어 있고, 3665 달톤의 분자량을 가진다. Vm23는 Vm24와 동일한 기능을 보인다: hKv1.3 채널들에 대한 고도의 친화도 및 선택성. Vm2310 nM 농도에서, 채널 hKv1.3, hIKCa1, mKv1.1 및 hKv1.2에 대한 전류를 각각 95%, 1%, 3% 및 9%로 차단한다.
K 채널들에 특이적인 125 개의 다른 공지된 펩타이드들 [Bagdany 등, 2005]을 사용하여 두 개 펩타이드들을 계통발생 분석한 결과, Vm23 및 Vm24은 이미 알려진 전갈 독소 구조의 20 개 아족 어느 것에도 속하지 않는 것으로 나타났다. 이들은 새로운 구조적 아족의 첫번째 두 개 예로, 여기서는 α-KTx 21로 명명할 것을 제안한다. Vm24 및 Vm23은 따라서 각각 α-KTx 21.1 및α-KTx 21.2로 명명된다. 현재 사용중인 체계적 명명법을 규정한 과학자들의 국제적 위원회에 따라서(참조 [Tytgat 등, 1999]), K 채널들에 특이적인 전갈 독소의 새로운 아족들을 정의하는 데 사용된 원칙에는, 일차 서열이 다른 것들과 적어도 50% 다를 것을 요구하고 있다. 사실 Vm23 및 Vm24 둘 다는 다른 공지된 독소와 약 50% 미만의 서열 상동성을 보인다.
당해 분양의 기술적 지식 상태에 의거하여, 이러한 특성들로 인하여 Vm23, Vm24 및 이들의 기증적 동일 유사체가, 면역 억제 및 면역적 질병의 진단과 치료에 뛰어난 후보물질로 사용될 수 있다.
정의
별다르게 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하여 있는 기술 분야의 통상의 기술자에 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은 별다르게 기술되지 않으면 그것에 지정된 의미를 가진다. 본 명세서에 사용된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실제 및 시험에 사용될 수 있다고 하더라도, 바람직한 방법과 물질이 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 정의된다.
본 발명에서, 용어, "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 발명의 펩타이드 분자를 지칭하는 것으로 구별없이 사용된다.
용어 "Kv1.3 칼륨 채널 차단 활성"은 일반적으로 Kv1.3 칼륨 채널 저해체의 존재에 의해 야기되어, 상기 Kv1.3 채널들을 통해 칼륨 이온들의 흐름을 저해하는 정도를 실제 추산한 것을 지칭한다.
용어 "Kv1.3 칼륨 채널 차단체"는 상기 이온 전도 경로를 직접적으로 폐쇄함으로써, 상기 채널을 포함하고 있는 세포막의 Kv1.3 채널을 통한 칼륨 이온의 흐름을 방해하는 물질을 일반적으로 의미한다.
용어 "유사체"는 일반적으로 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 36 개 배열된 위치에 걸쳐83%의 대서열 동일성을 공유하는 임의의 폴리펩타이드 사슬을 의미한다 (36 위치에 걸쳐 30 개 합치). 이것은, 이에 한정되지 않고, 6 개까지의 아미노산 변화, 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기, 하나 이상의 잔기에서의 화학적 변이, 및 다른 아미노산 잔기 또는 유기 분체에 의한 N-말단 및/또는 C-말단 연장을 포함할 수 있다.
용어 "대사슬 (pairwise sequence) 동일성 퍼센트"는 두 개 단백질 서열이 배열되었을 때 모든 위치에 걸쳐 두 개 배열된 서열에서 동일한 아미노산을 가지는 아미노산 잔기 위치간의 계수를 의미한다.
용어 "기능적 동일체"는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 설정된 바와 같은 Kv1.3에 대하여 유사한 친화도 및 유사성을 나타내는 임의의 분자 구조체를 의미하는 것으로, Kv1.3 채널들에 대한 고도의 친화도 및 선택성을 이러한 서열에 부여하는 친화도 및/또는 특이성의 동일한 구조적 결정인자를 공유하는 것을 말한다. 이것은 유사체 또는 펩티도의태체일 수 있다.
용어 "친화도 및/또는 특이성의 구조적 결정인자"는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에게 hKv1.3 채널들에 대한 고도의 친화도 및 특이성을 부여하는 폴리펩타이드 구조 상의 모든 관능기 및 이들의 삼차원적 위치를 의미한다. 친화도 및 특이성의 이러한 구조적 결정인자는, 동일, 부분적으로 중첩되거나 또는 상이한 아미노산 잔기와 연관이 될 수 있다.
용어 "관능기"는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 내에 있는 주어진 화학 분체를 의미하는 것으로, 주 폴리펩타이드 사슬에 있든지 또는 이의 아미노산 잔기 측쇄에 있든지, hKv1.3 채널들과 특이적이고 강한 접촉을 하고, hKv1.3 채널들에 대한 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 의 친화도 및 선택성을 결정한다.
용어 "기능적 동일 유사체"는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 36 개 배열된 위치에 걸쳐 적어도 83% 대서열 동일성 (36 개 위치에 걸쳐 30개 일치)을 공유하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 이것은, SEQ ID NO:1 or SEQ ID NO:2에 설정된 것과 유사한 hKv1.3에 대한 친화도 및 선택성을 나타내며, 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기, 하나 이상의 잔기의 화학적 변이, 및 다른 아미노산 잔기 또는 다른 유기 분체에 의한 N-말단 및/또는 C-말단 연장을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "펩티도의태체"는 유사한 삼차원적 위치에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3와 동일한 관능기를 보이는 것으로, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2와 hKv1.3 채널간의 특이적 접촉을 모사하는 임의의 화합물을 의미한다.
용어 "본 발명의 펩타이드"는 위치 C6과 C26, C12와 C31, C16과 C33, 및 C21과 C36에 있는 시스테인 간에 설정된 4 개 디설파이드 다리에 의해 유지되는 삼차 구조를 가지는, SEQ ID NO:의 서열을 지닌 펩타이드를 의미하는 것으로, 여기서 문자 C는 시스테인 잔기의 약자이고 숫자는 배열된 아미노산 서열에서의 상대적인 위치에 상응한다. 바람직한 펩타이드들의 예는 SEQ ID NO:1 (Vm23) 및 SEQ ID NO:2 (Vm24)의 서열을 가지는 것들이다. 상기펩타이드들은 고도의 친화성과 특이성을 가지고 칼륨 채널 Kv1.3을 차단할 수 있다. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 기능적 동일 유사체, 즉 , SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 36 개 배열된 위치에 걸쳐 적어도 83% 대사슬 동일성을 공유하는 (36 위치에 걸쳐 30개 합치) 것들이 포함되고, 이들은 4 개 디설파이드 다리에 의해 유지되는 3차 구조를 보존하고 있고 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 설정된 바와 같이 hKv1.3에 대하여 유사한 친화성과 선택성을 나타낸다.
용어"약학적 허용 담체"는 인산 완충 생리액, 물, 및 에멀젼 (기름/오일 또는 물/오일 에멀젼과 같은), 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 보조제를 위시한 임의의 표준 약학 담체, 완충액 및 부형제를 포함한다. 적합한 약학 담체 및 이들의 제형은 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., Easton, 19판. 1995)에 서술되어 있다. 바람직한 약학적 담체는 활성 제제의 의도하는 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여 방식이 하기 서술된다.
용어 "약학적 허용 염"은 비독성 산부가염을 말하는 것으로, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산으로 형성된 염, 및 아세트산, 옥살산, 말레산 말산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 다른 약학적 허용 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등과 같은 알카리 및 알카리 토금속에 기반한 양이온을 포함하지만 이에 한정되지 않는 무기 질산염, 황산염, 아세테이트, 말레이트, 포르메이트, 타르타레이트, 석시네이트, 사이트레이트, p-톨루엔설포네이트 등은 물론, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 비독성 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다.
용어 "약학적 조성물"은 포유동물 또는 인간 대상체를 위시한 대상체에게 약학적으로 사용하기 적합한 조성물을 의미한다. 약학적 조성물은 일반적으로 유효한 양의 활성 성분 및 약학적 허용 담체를 포함한다.
용어 "유효한 양"은 특정 활성 성분, 이 경우는, Kv1.3 칼륨 채널 차단 활성을 가지는 펩타이드의 투여량을 말하는 것으로, 원하는 결과, 예를 들어, 포유동물에서 면역 반응을 억제하는, 필요로하는 대상체에게 자가면역 질환을 치료하는, 포유 동물의 면역 체계에서 T-세포 활성 과정을 억제하는, T-임파구에서 칼슘 신호전달 경로을 약화시키는 결과를 나타내기에 충분한 투여량이다. 상기 원하는 결과는 상기 투여량을 받는 대상체 (세포 포함)에서 주관적 또는 객관적 개선을 포함할 수 있다.
용어 "대상체"는 인간을 위시한 포유동물을 의미하는 것으로 의도된다. 치료할 비인간 포유동물 대상체는, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 말, 개 및 고양이를 포함한다.
용어 "자가면역 질환"은 일반적으로 유기체의 면역 세포에 의해 주도되어, 그 유기체의 항상성에 영향을 끼치는 병리학적 상태를 의미한다.
용어 "TEM과 연계된 자가면역 질환"은 상기 유기체를 공격하는 세포가 임파구 TEM 세포인 임의의 자가면역 질환을 의미한다. 이러한 질병 중에는: 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "예방적 치료"는 질병의 징후를 나타내지 않거나 질병의 초기 징후만을 보이는 대상체에게 실시되는 치료로서, 여기서 치료는 병리적 상황, 상세하게는 자가면역 질환, 더욱 상세하게는 임파구 TEM.에 연계된 자가면역 질환을 발전시키는 위험을 낮추고자 실시된다.
용어 "치유적 치료"는 병리 징후를 나타내는 대상체에게 행하는 치료로서, 여기서 치료는 그러한 병리적 징후, 특히 자가면역 질환, 더욱 상세하게는 임파구 TEM.에 연계된 자가면역 질환을 감소시키거나 또는 제거할 목적으로 시행된다.
용어 "기관"은 심장, 간, 폐, 신장, 뇌, 부신, 혈관내피계, 면역계 등과 같은 신체 체제를 의미한다.
용어 "분자 탐침자"는 탐침자가 고도의 친화도 및 특이성을 가지고 결합할 수 있는 일반적으로 타겟 세포, 세포 구조, 수용체 또는 임의의 분자를 확인하기 위해 특별히 사용될 수 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다.
용어 "비필수 아미노산"은 일반적으로 Kv1.3 채널들에 대하여 결과되는 유사체의 친화도 또는 특이성이 실질적으로 변화하지 않고, 임의의 다른 아미노산으로 교환될 수 있는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 내의 임의의 아미노산을 의미한다.
주요 발견사항
본 발명의 주요 주제는 두 가지 신규한 펩타이드들 (Vm23 및 Vm24), 이들 아미노산 서열 (SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2)은 물론 가능한 기능적 동일 유사체, 및 특이적 면역억제제로서의 이들의 잠재적 용도에 관한 것이다. Vm23 및 Vm24은 아형 Kv1.3, 특히 인간 임파구 (hKv1.3)의 칼륨 이온 채널의 고도로 선택적인 차단체이고, 래트에서 지연형 과민증 반응에 대한 염증 반응을 생체 내에서 감소시키는 것으로 나타났고, 따라서, 이러한 두 가지 펩타이드들 및 이들의 기능적 동일 유사체는 비정상적인 T-세포 반응에 관계한 특정 면역학적 질병을 치료하는 데 사용되는 주된 화합물이다. 이들 면역억제제 및 hKv1.3 채널들에 대한 이들의 효과에 대하여 상세하게 들어가기 전에, 이러한 분야에서의 기본 지식을 복습하는 것은 중요하다.
모든 세포의 막전위의 조절은 칼륨 이온을 투과할 수 있는 이온 채널, 단순히 K 채널의 존재에 의해 주로 유지된다. 개별 세포는 몇 가지 구별되는 K 채널들을 발현할 수 있고, 이들은, 전압 관문 채널이 가장 보편적인 것이지만, 전압, 세포내 칼슘 농도 또는 특이적 리간드에 반응하여 열리거나 닫힌다 [Gutman 등, 2005]. K 채널들의 기능을 변경할 수 있는 천연 리간드 중에는 벌, 전갈, 뱀 및 말마잘의 독에서 나온 독소가 있다 [Castle 등, 1989; Jouirou 등, 2004; Rodriguez de la Vega and Possani, 2004]. 그러한 독소들의 예는 전갈 Centruroides noxius 의 녹시우스톡신 (noxiustoxin) [Carbone 등, 1982], 전갈 Leiurus quinquestriatus 의 챠립도톡신 [Miller 등, 1985], 전갈 Anuroctonus phayodactilus의 아누록톡신(Anuroctoxin) [Bagdany 등, 2005], 말미잘 Bundosoma granulifera의 BgK [Aneiros 등, 1993], 및 Stichodactyla helianthus 의 ShK [Castaneda 등, 1995]이다. 이러한 독소들은 상이한 친화도 및 특이성으로, Kv1.3을 위시한, 다양한 상이한 유형 및 아형 K+ 채널들을 차단하는 것으로 나타난다 [Panyi 등 2006의 리뷰]. Kv1.3 채널은 T 임파구 증식 및 림포카인 증식에 관여하며, Kv1.3의 차단체들은 잠재적 면역억제제로서 흥미를 끈다 [Panyi 등 2006].
이러한 K 채널 특이성 독소의 몇몇은 삼차 구조가 밝혀졌다 ([Mouhat 등, 2004]의 리뷰). 여섯 개 경막 세그먼트를 함유하는 두 개의 전압-의존성 K 채널의 삼차원 구조의 해독 [Lee 등, 2005: Long 등, 2005] 및 몇몇 연구진에 의한 이중 변이(독소 및 채널) 를 이용한 실험 [Goldstein 등, 1994; Stampe 등, 1994; Aiyar 등, 1995; Hidalgo and Mackinnon, 1995] 덕택에, K 채널들에 대한 이러한 몇몇의 리간드의 접촉 면이 동정되었다. 현재까지 알려진 전갈 독소에 관하여는, 125 종이 넘는 펩타이드들이 연구되었고, 이들의 아미노산 서열이 보고되어 있다 [Rodriguez de la Vega and Possani, 2004]. 이러한 펩타이드들은 주로 하기 세 가지 기준에 의거, 20 개 다른 아족으로 구분된다: 일차 서열 유사성, 디설파이드 다리의 위치, 및 기능의 특이성. 본 발명의 목적 상, 펩타이드 (Vm23 및 Vm24)를 분리하고, 정제하고, 서열분석하고 시험하였다. 얻은 중요한 독창적이고 전매적인 정보는 이들의 일차 구조의 독특함과 고도의 특이적 기능으로, 이는 이들의 구조적 특성을 단순히 관찰해서는 증명되지 않고, 본 발명에서 나타나고 주장되는 바와 같이, 시험관 내 및 생체 내 둘다에서 기능의 실험적 증명을 필요로 한다.
이러한 작업은 야생에서 전갈종 V. mexicanus 를 포획하고 이들의 독을 전기 자극으로 추출하면서 시작되었다. 이 전갈들은 멕시코 모렐로스 주에서 채집하였다. 본 발명자들은 이러한 목적을 위해 공식적인 허가를 받았다 (서류 번호 SGPA/DGVS/02483, 2005년 3월 18일자, 멕시코 정부의 the Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales 에서 허여). 통상 30 마리 전갈을 이산화탄소 (CO2)로 마취한 후 독을 빼냈다. 원 독을 즉시 가공하든지 -20℃에서 사용할 때까지 보관하였다.
이 후, 수용성 독을 HPLC로 분리하였다. 마우스를 가능한 독소 효과용 모델 동물로 사용하여 본 발명의 목적인 정제된 펩타이드를 생체내 분석 (치사 시험)하였고, 에드만 분석 및 질량 분광 분석으로 일차 구조를 결정하였다. 이러한 실험의 상세 내역은 하기 실시예 1에서 설명된다.
독에서 이러한 펩타이드들의 양이 매우 적기 때문에, hKv1.3 채널들 상에서 이들의 작용 기능성 및 특이성을 더 구체화시키기 위해, 상당한 양의 Vm24를 화학적으로 합성하였다.
Vm24의 화학적 합성
고상 방법을 통한 펩타이드의 합성은 한정되지 않는 예인, 폴리스티렌, 폴리아크릴아마이드, 특정 섬유 또는 다른 안정한 폴리머와 같은 고상 수지의 사용을 포함한다. 고상 수지의 유도화는 예를 들어, 이에 한정되지 않는 클로로트리틸 클로라이드, 2-클로로트리틸 클로라이드, 하이드록시메틸페닐, 사스린 (Sasrin)과 같은 적절한 기구를 C-말단 산에 기능적으로 생성하는 수단으로 사용하여 생성되거나 또는 이에 한정되지 않는 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시메틸 기와 같은 수지 링커를 통한 단백질 분해를 안정화시킴으로써 제조될 수 있다.
사슬 조립은 통상 아미노산 보호기가 t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 또는 9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐 (fmoc)인 임의의 보호기 전략을 포함한다. 상기 펩타이드의 합성에 사용된 다양한 아미노산의 반응성 측쇄들은 정상적으로 보호된다. 통상적으로 사용되는 보호기들은: t-부틸, 벤질, 트리틸, 메틸트리틸, 벤질-메틸벤질, 토실, 벤질옥시메틸, t-부틸옥시카르보닐, 2-클로로벤질, 2-브로모 벤질, 메톡시 벤질, 포밀, 아세트아미도메틸, 펜타메틸크로만 설포닐, 펜타메틸디하이드로벤조퓨란-설포닐, 측쇄 아민용 니트로, 구아니딘류, 알코올류, 산류, 이미다졸류, 티올류 및 인돌류를 포함한다. 다른 보호기들을 개발하여 일차 사슬 조립 동안 원치 않는 부 반응을 제거하는 동일한 목적을 이룰 수 있다.
신류한 아미노산을 합성중인 펩아티드로 부가하는 동안 아마이드 결합의 합성은, 이에 한정되지 않는, 대칭적 무수물 (카르보디이미드), HOBT 에스테르류, 아실 플루오라이드류, TBTU, HATU 또는 HBTU와 같은 유로늄 활성체, BP, PyBOP, PyBrOP와 같은 포스포늄 활성체를 포함하는 임의의 산 활성화 방법를 사용하여 이뤄질 수 있다. 이러한 것들은 펩타이드 합성의 기술을 실행하는 자들이 알고 있다고 예상되는 카르복실 기의 활성화의 모든 방법이다.
서열 SEQ ID NO:1 (Vm23), SEQ ID NO:2 (Vm24) 또는 SEQ ID NO:3 (Vm23 및 Vm24 콘센서스 서열)에 비천연 아미노산을 대입하는 것을 포함하는 유사 구조체의 합성은 또한 본 발명의 특정 구체에에 유용할 수 있다. 상기 펩타이드의 분획물들이, 최종 생성물이 Vm23, Vm24 또는 이들의 유사체가 되는 그러한 방식으로 조립되는 수렴 방법의 사용은 또한 당해 분야의 전문가가 사용할 수 잇는 것이다. 합성 과정의 끝에서 고형 지지체로부터 합성 펩타이드를 절단하는 및 서열 SEQ NO.1 및 2 또는 이들의 유사체를 얻도록 디설파이드 다리를 정확하게 폴딩하는 방법은 공지되어 있고 본 주제의 기술 상태에서 전문가에 의해 재현될 수 있다. 독소의 최종 절단과 탈보호 및 폴딩은 합성에 사용한 전략에 따라서 HF 또는 TFA일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 디설파이드 결합 형성은, 차별적인 Cys 보호를 사용하여 디설파이드 결합을 정확한 형태로 위치시키는: Vm24의 경우C6-C26, C12-C31, C16-C33, 및 C21-C36 연결에 위치시키는 임의의 정통적인 방식을 포함한다. 그러나, 상기 디설파이드 다리 형성은 또한 공기 산화, 또는 다양한 비율로 환원 및 산화된 글루타치온의 존재로 지원되는 셔플링 반응에 의해서 얻어질 수 있다.
이러한 기본 방법론에 따라서, 뱀, 전갈 및 말미잘의 다양한 천연 발생 독소를 합성적으로 생성하고, I125로 방사선 표지하고 및 칼륨 채널 고조 및 기능을 조사하는 분자 탐침자로 사용하였다 [Strong, 1990; Moczydlowski 등, 1998; Garcia et al, 2001, Kem 등, Patent US6,077,680]. 많은 이러한 독소는 특별한 K 채널 아형에 선택적이다 [Auguste 등, 1990; Galvez 등, 1990; Crest 등, 1992; Garcia-Calvo 등, 1993; Garcia et al, 1994, Kem 등, Patent US6,077,680]. 가장 빈번하게 사용되는 예는, 몇몇을 언급하자면, 뱀 Dendroaspis polylepsis의 독의 덴드로톡신 [Harvey, 1997], 말미잘 Bunodosoma granulifera의 BgK [Aneiros 등, 1993; Alessandri Haber 등, 1999], 말미잘 Stichodactyla helianthus의 ShK [Castaneda 등, 1995; Pennington 등, 1995], 및 수 개의 전갈 독소, 예를 들어, Centruroides noxius 의 녹시우스톡신 [Drakopoulou 등, 1995] 및 Leiurus quinquestratus 의 챠립도톡신[Sugg 등, 1990]이 있다. ShK와 같이, 이러한 독소의 어떤 것들은 매우 적은 농도에서(<1 nM) 저캣(Jurkat) T 임파구의 Kv1.3 type K 채널들을 차단한다. 그러나 이들의 많은 것들이 특이성이 없다. 즉, 약 10 내지 100 nM의 농도에서, 이들은 다른 아형 채널들을 또한 차단할 수 있다. 하기 설명되는 바와 같이, Vm23 및 Vm24이 hKv1.3 채널들에 극히 특이적이고 이때까지 문헌에 소개된 다른 펩타이드류과는 구별되는 일차 구조를 가지고 있기 때문에, Vm24를 합성하기로 결정하였다.
Vm24의 공유결합 구조는 Merrifield의 고상계 [Merrifield, 1964]에 따라, 우리 연구진에 의해 이전에 설명된 바와 같이 [Drakopoulou 등, 1995] fmoc-아미노산을 사용하여 화학 합성으로 얻었다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 일차 구조의 아미노산 일부를 다른 변형된 아미노산으로 치환하여 생체 내에서 더 높은 반감기를 가지는 유사 펩타이드를 얻어서 천연 펩타이드의 단백질 분해효소 취약성을 감소시키는 가능성은 본 발명의 범위 내에 있다. 이것은 비필수 잔기를 보존적 등비체적 치환체로 치환하는 것을 포함한다: 예를 들어, 글루타민 또는 아세틸-리신에 대해서는 리신, 또는 알라닌과 같은 중성 아미노산 또는 Na-메틸화 아미노산 치환을 특정 위치에서 하여 생물학적 활성 펩타이드의 단백질분해를 감소시킨다. 또한, 기능에 비본질적인 특정 아미노산을 삭제 또는 번외 잔기를 첨가함으로써 일차 서열을 변형하여 생체 내에서 더 높은 안정성을 가지는 유사체 구조를 제공할 수 있다. SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 배열로 확인된, 본 발명의 펩타이드의 특정 비본질 잔기들은 배열된 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 또는 배열된 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 위치 번호 10, 13, 17, 23, 29 및 35에 있는 잔기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
기능적 동일 유사체 펩타이드는 선택된 D-아미노산들을 내포함으로써 또는 모든 잔기가 D-아미노산이고 아미노산 서열이 역전되어 있는 리트로-인버스 유사체의 화학 합성 [Jameson 등, 1994; Juvvadi 등, 1996]으로 생성될 수 있다. 이러한 변형은 생성물의 안정성을 높일 수 있다.
다른 주요 방법은 비펩타이드성물질 (펩티도의태체)를 생성하기 위해 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 친화성과 특이성의 구조적 결정자에 근거하여 낮은 분자량 화합물을 개발하는 것이다. 이러한 연구에서, 원래 폴리펩타이드의 칼륨 채널 결합 표면으로부터 주요 관능기를 포함하는 비펩타이드성 구조체를 고안하고 합성하였다. 천연의 저분자량, 비펩타이드성 화합물이 폴리펩타이드 또는 단백질 리간드의 효과를 모방하거나 길항하는 것으로 나타나는 많은 예가 있다. 치료적으로 연관된 많은 펩타이드들에 대한 펩티도의태체 화합물이 고안되고 합성되었다. HIV gp120 단백질에 결합하는 CD4 수용체 상에 존재하는 루프를 고안하고 합성적으로 제조하였고 [Chen 등, 1992], 낮은 마이크로몰 농도에서 CD4 수용체에 결합하는 gp120의 효과적인 차단체임이 밝혀졌다. FTI-276는 종양발생적 Ras 신호전달의 강력한 차단체인 Ras 단백질의 C-말단 부위의 의태체 예이다 [Lerner 등, 1995].
상기에서 추론될 수 있는 바와 같이, T 임파구의 비정상적인 기능을 조절하는 주된 약물로 사용될 수 있는, 이러한 두 가지 펩타이드 Vm23 및 Vm24의 기능적 동일 유사체를 제조하는 많은 방법이 있다. T 임파구의 부적절한 활성화는 자가면역 질환들 (예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제 1 형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환.), 및 다른 것으로는 이식 거부를 야기하는 것으로 알려져 있다.
가능한 신규 면역억제제 약물의 효능을 시험하기 위한 많은 동물 모델이 있고 이들은, 본 발명에서 사용된, 래트에서의 지연형 과민증 (DTH-반응)으로 알려진 반응의 경우와 같이, 신규한 알려지지 않은 화합물의 효능 및 가능한 부작용을 시험하는 데 적절한 생체내 분석을 제공한다. 하기에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드의 방어 효과를 산정하기 위해, 적은 양의 Vm24를, 미리 디니트로플루오로벤젠 (DNFB)으로 감작된 래트의 귀에서 일어나는 염증 반응을 조절하는 것에 시험하였다. 이러한 분석은 광범위하게 사용되고 본 발명의 목적에 적절한 모델로서 간주된다 [Phanuphak 등, 1974].
면역억제제
사이클로스포린 및 FK506과 같은 면역억제제는 이들의 치료적 용도를 제한하는 심각한 부작용을 나타낸다. 이러한 두 개 화합물로 행한 연구에서, 이러한 약물의 투여시 원하지 않는 부작용을 담당하는 분자 기작에 적어도 부분적으로 관여한다는 것을 밝혔다. 사이클로스포린은 많은 상이한 조직에 존재하는 단백질 사이클로필린과 상호작용하는 반면, FK506는 많은 상이한 조직에서 발견되는 FK-결합 단백질을 타겟하기 때문에 독성을 야기한다. 따라서, 심각한 부작용이 없는 신규한 면역억제제를 동정하는 주된 노력이 있어왔다. 상기 주요 목적 중 하나는 Kv1.3 이온-채널과 같은 T-임파구에서 주로 발현되는 신규한 타겟을 동정하는 것이다. T 임파구에서 발현되는 Kv1.3 칼륨 채널들은, 비록 이러한 단백질을 암호화하는 RNA가 다른 세포 (B-임파구, 소교세포, 대식세포, 용골세포, 혈소판, 및 특정 뇌세포)에서 또한 발견되지만, 특정 세포 기능에 매우 중요하다. 그러나, T-임파구들에서만, Kv1.3가 막전위를 지배하며 이의 차단은 심각한 기능적 결과를 낳는다. Kv1.3 차단체들의 활동의 구별되는 기작 및 Kv1.3 채널들의 상대적으로 제한된 조직 분포로 인하여, Kv1.3의 특이적이고 고도의 친화성 차단체는 사이클로스포린 및 FK-506보다 낮은 독성 부작용을 보일 것으로 예상되며, 따라서, 자가면역 질환들의 치료는 물론 이식요법에 유용하다는 것이 증명될 수 있다.
Merck Sharpe 및 Dohme의 과학자들은 마르가톡신 (다른 전갈 독소 펩타이드)이 Kv1.3 채널의 차단체로서 강력한 효과를 가지며, 동물 모델 (돼지)에서 면역 반응을 억제할 수 있다는 것을 보였다. 그러나, 마르가톡신은 Kv1.3 채널들에 특이적일 뿐 아니라, Kv1.2 채널에 대해서도 유사한 정도로 영향을 끼친다. 심장 및 뇌 조직이 또한 Kv1.2 채널들을 발현하기 때문에, 이의 차단은 심각한 악효과를 가질 수 있다. 말미잘에서 분리한 다른 펩타이드ShK은 Kv1.3의 강력한 차단체로서 (참조 Kem 등, 2000, 특허 US6,077,680), 다른 연관 Kv1 채널들에 영향을 끼친, 동일한 차단에는 백배 높은 농도가 필요하다. 이것은 상기 관련 채널들이, Kv1.3에 비하여 그 적용에 100-배 낮게 민감하다는 것을 의미한다. 본 발명의 목적인 펩타이드 Vm23 및 Vm24는 ShK와는 상이한 생물학적 원천으로부터 나온 것이고, 뚜렷이 다른 일차 구조를 가지고 있고, ShK보다 hKv1.3 채널들에 더 특이적이다. 하기 실시예에서 상세하게 나타내고 논의되는 바와 같이 (실시예 7 내지 10), Vm23 및 Vm24는 hKv1.3 채널들의 동일한 비율을 차단하는 데 필요한 것보다 300 배 더 높게 적용했을 때 다른 K 채널들을 ≤ 50%로 차단하였다.
본 발명은 또한 고상 방법으로 Vm23, Vm24 및 이들의 기능적 동일 유사체를 제조하는 것을 포함한다. 화학적 합성에 사용되는 방법은 실시예 3의 설명에서 상세하게 다루는 바와 같이, 당해 분야의 전문가에게 공지된 일련의 절차를 포함한다.
전기생리학적 특성화
외부 또는 자가항원에 대한 충분한 면역 반응을 발전시키려면 주어진 항원에 특이적인 임파구의 활성화 및 증식이 요구된다. 이것은 면역게의 상이한 세포 성분 간의 잘 조화된 상호작용을 요한다. 이러한 과정의 첫 단계는 전문적인 항원 제시 세포에 의해 임파구에 가공된 항원을 제히사는 것이다 [Janeway 등, 2001]. 전위 관문 K 채널, Kv1.3에 특이적인 차단체에 의한 T-임파구 매개 면역 반응 (예, 지연형 과민증)을 조절하는 것이 본 발명의 주제 내에 있다. 따라서, K 채널들을 임파구 활성화시키는 데 연루시키는 것을 T 세포로 제한한다. 그러나, 우리는 특정 B 임파구들의 증식 또한 특정 Kv1.3 채널들의 활성에 의존한다는 것을 언급한다 [Wulff 등, 2004].
T 제시된 항체를 세포의 항원 수용체가 인식하면, 상기 세포를 활성화, 증식 및 최종 분화로 유도한다 [Sallusto 등, 2004]. 항원 인식에 의해 촉발된 경막 신호전달 경로는 몇몇의 단백질 키아제들의 활성화 및 결론적으로 포스포리파제 C-γ(PLC-γ)의 활성화를 포함한다. 막 인지질 포스파티딜이노시톨 4,5-비포스페이트 (PiP2)의 PLC-γ-매개 가수분해에 의해 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP3)이 생성되는 것은 T 세포에서의 증식을 시행하는 데 필요한 이상(biphasic) Ca2+ 신호를 개시한다 [Lewis, 2001]. IP3는 소포체 (ER)에 있는 그의 수용체로 확산하고 결합하여, 원행질 내로 Ca2+ 분비를 결과하게 되고 원형질 내의 자유 칼슘 농도 ([Ca2+]i)를 상당히 높이게 된다. ER로부터 분비 후, [Ca2+]i의 일시적 증가는 신호 전달 다단계 (signal transduction cascade)를 실행하는 데 충분하지 안고, 지속적 Ca2+ 신호가 필요하다. 이것은 칼슘 분비 피활성화 Ca2+ 채널들 (CRAC 채널)을 통해 세포막에 있는 Ca2+ 채널들을 통한 세포외 공간으로부터 Ca2+ 유입으로 실현된다 [Zweifach and Lewis, 1993].
비록 CRAC 채널들이 본질적으로 전압 의존성이지만, Ca2 + 전류는 Ca2 +에 대한 전기화학적 구배에 민감하고, 이는 세포의 막전위에 의해 영향을 받는다 [Panyi 등, 2004]. 상기 탈분극 Ca2+ 유입은 K 채널들의 활성화에 의해 균형이 잡히게 되어 막전위를 음의 값에서 고정시키게 되고 따라서 추가의 Ca2+ 진입에 대한 충분한 구동력을 제공하게 된다 [Fanger 등, 2001]. 선택되고, 조절된 K+ 유출은 약 -50 내지 -60 mV 근처이고, T 임파구들의 막전위의 주요 결정인자 중 하나이다. 두 가지 유형의 K 채널들은 이러한 세포들에서 생리적 조건하에서 외향적인 K+ 흐름을 실행한다. 인간 T 임파구에서의 주된 전위 관문 K 채널인 Kv1.3은 세포의 휴지 전위에 가까운 활성화 역치로 막 탈분극시 열린다 [Matteson and Deutsch, 1984]. 인간 T 세포의 Ca2+-활성화 칼륨 채널 IKCa1 (또는 KCa3.1)이 막전위에 관계없이, 세포질 자유 칼슘 농도가 ~200 nM를 넘어서는 것으로만 활성화된다 [Grissmer 등, 1993].
T 세포의 막전위 조절에 대한 Kv1.3 및 IKCa1 채널들의 기여는, 본 발명의 배경 부분에서 상세하게 설명한 바와 같이, 세포의 활성화 상태 (휴지 대 활성화된), 및 T 세포의 최종 분화의 정도에 의해 결정되는 면역계에서의 이들의 기능적 역할에 달려있다 [Wulff 등, 2003]. 자가면역 질환에서의 Kv1.3 차단체의 치료적 적용의 관점에서 보면, IKCa1 채널을 넘어서 Kv1.3 채널에 대한 선택성이 매우 중요하다는 것을 강조하는 것이 중요하다 [Wulff 등, 2003]. 작용 기억 T 세포(TEM)는 예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제 1 형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환에서 조직 손상을 매개 하는 데, 활성화시 Kv1.3 채널들을 선택적으로 상향조절하고, 및 따라서 이러한 세포들의 막전압 조절이 Kv1.3 채널들에 의해서만 단독으로 지배된다 [Beeton 등, 2006]. 결론적으로, 이러한 세포들의 증식은 선택적인 Kv1.3 저해체에 의해서 효과적으로 및 지속적으로 억제될 수 있다 [Wulff 등, 2003; Vennekamp 등, 2004; Beeton 등, 2005]. 반면에, 미접촉 및 중추 기억 T 세포(TCM)들은 IKCa1의 전사성 상향조절 (upregulation)에 의해 증식의 Kv1.3 차단-매개 저해되는 것[Wulff 등, 2003]으로부터 탈출한다 [Ghanshani 등, 2000]. 이러한 예비-활성화된 세포의 증식은 IKCa1 저해체에 민감하게 되나, Kv1.3 저해체에는 되지 않는다. 따라서, 미접촉 및TCM 세포의 증식에 대하여 유의하게 방해하지 않고, TEM 세포의 활성화를 억제하는 Kv1.3-기반요법은 제 1 형 당뇨병 [Viglietta 등, 2002; Beeton 등, 2006], 류마티스 관절염 [Beeton 등, 2006], 다발성 경화증, 실험적 치주질환에서의 염증성 골흡수 [Valverde 등, 2004]와 같은 자가면역 질환들, 특히 임파구 TEM 연관 자가변역 질환, 및 만성 이식 거부 및 이식편-대-숙주 질환과 같은, 만성적으로 활성화된 TEM 세포에 의해서 유지되는 것으로 제시된 기관 거부에 관련된 상태 [Yamashita 등, 2004] 의 관리에 사용될 수 있다.
평가 선택성
Kv1.3의 몇가지 높은 친화도 펩타이드 차단체는, Vm24와 유사하게, IKCa1보다 Kv1.3에 더 선택적이다. 이러한 것들은 전갈 독소들, 예를 들어, 마르가톡신 (MgTx), 녹시우스톡신 (Ntx), 칼리오톡신(Kaliotoxin), 아누록톡신(Anuroctoxin) 및 말미잘로부터 분리한 ShK를 포함한다. 그러나, 신경 및 근육 흥분도에 중요한 이온 채널들 또한 이러한 독소들에 나노몰 내지 피코몰 친화도로 저해되고, 예를 들어, Kv1.1는 ShK [Kalman 등, 1998] 및 칼리오톡신 Kaliotoxin [Grissmer 등, 1994]에 의해, Kv1.2는 MgTx [Koch 등, 1997], Ntx [Grissmer 등, 1994] 및 아누록톡신 [Bagdany et al, 2005]에 의해 차단된다.
상기 독소의 특이성 결여는 심각한 생물학적 효과를 나타낸다. Kv 족의 이온 채널들은 전통적으로 흥분할 수 있거나 비흥분성 세포에 광범위하게 분포되어 있다 (전반적 리뷰에 대하여 [Gutman 등, 2005] 참조). 신경, 골격 및 심장 근육 세포에서, 이러한 채널들은 전기적 흥분성의 주요 결정인자이다. 이들은 휴지 막 전위를 유지하는 것, 재분극의 속도에 영향을 끼침으로써 활동 전위을 형성하는 것에 기여하며, 및 초분극후에 스파이크 빈도 및 신경을 결정한다 (전반적 리뷰에 대해서 [Gutman 등, 2005] 참조). 중추 신경계에서 발현된 이온 채널들은 혈뇌장벽 (blood-brain barrier)으로 인해 전신적으로 적용된 독소에 대해서는 더 많이 보호되나, Kv1.3 저해체의 잠재적 적용 영역인, 다발성 경화증에서는, 이러한 장벽은 손상되어 MS의 동물 모델에서 신경 독성으로 나타난다 [Beeton 등, 2005]. 상기 세포와 혈류간의 직접적인 접촉으로 인하여, 심장 근세포는 비선택적 Kv1.3 저해체의 잠재걱 부작용에 더 많이 취약하다. 인간 심방근세포에서, Kv1.5 [Feng 등, 1997] 및 심실근세포에서, Kv1.4 [Patel and Campbell, 2005] 및 hERG ([Sanguinetti and Tristani-Firouzi, 2006]에서 리뷰) 채널들은 활동 전위의 재분극 상을 임계적으로 결정하는 반면 NaV1.5는 탈분극상에 대하여 관여한다 [Rogart 등, 1989]. BK Ca2+-활성화 K 채널들은 인체내에서 보편적으로 분포되어 있고 (뇌, 골격근, 평활근, 췌도세포 등, [Wei 등, 2005]에서 리뷰), 신경세포와 골력근세포의 전기적 흥분성 및 평활근에서의 Ca 과도현상을 포함 한 다양한 생리적 기능을 조절한다 한다. BK 채널들은 α-KTx1.x 족의 독소에 의해 차단된다 (예를 들어, 챠립도톡신 [Miller 등, 1985]).
박테리아 [Doyle 등, 1998] 및 인간 전위 관문 K 채널 [Long 등, 2005]의 X-선 결정 구조를 이용하여 최근 10년에 걸쳐 상이한 이온 채널에 대한 α-KTx 특이성의 분자적 기초를 이해하는 것에 확장 되었지만 [Giangiacomo 등, 2004], 그러나, 오늘날, 주어진 펩타이드 독소의 일차 구조에 기초한 그 선택성 프로파일에 대하여 예측한다는 것은 가능하지 않다. 이것은 생물학적 중요성을 가지며 및 동물 독소에 의한 차단 취약성을 알고있는 이온 채널에 대하여 Vm 24의 선택성을 실험적으로 결정하는 것으로 구체화된다.
분자생물학의 진보 및 이온 채널 유전자의 클로닝으로 인하여 재조합 이온 채널들의 약학적 연구가 수행될 수 있다. 적절한 세포주에서의 재조합 채널들의 발현은 약학적 실험에 몇 가지 장점을 부여한다. 예를 들어, 오염 전류의 크기는 무시될 수 있고 전류의 진폭은 약학적 시험에 적합하다. 더구나, 발현된 재조합 채널들은 천연 세포에 발현된 채널들의 약학적 특성을 유지한다.
약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 펩타이드들을 포함하는 약학적 조성물들을 제공한다. 이미 언급한 바와 같이, 이러한 펩타이드들은 T 세포들의 특정 군이 활성화되는 포유동물에서 면역반응을 억제하는 데 유용하다. 특히, 본 발명의 펩타이드들을 포함하는 약학적 조성물은 면역반응이 이종 기관 거부의 결과(예를 들어, 폐, 간, 신장 또는 췌장) 또는 임파구 TEM와 연관된 자가면역질환의 결과인 상태를 치료하거나 예방하는 데 유용하다.
본 발명의 바람직한 관점에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명의 펩타이드나 이의 약학적 허용 염 및 약학적 허용 담체를 포함한다. 이러한 약학적 조성물의 바람직한 형태 및 상기 약학적 허용 담체의 선택은 투여 및 치료 적용의 의도하는 양태에 달려있다. 상기 약학적 조성물은 (원하는 제형에 따라서), 약학적 허용, 비독성 담체 또는 희석제를 포함하고, 이는 동물 또는 인간 투여요응로 약학적 조성물을 제형하는 데 통상적으로 사용되는 부형제로 정의된다. 추가적으로 또는 선택적으로, 상기 약학적 조성물들은 또한 치료에서 보조적인 효과를 가지는 적어도 하나 이상의 추가적인 면역억제제를 포함할 수 있다. 특정, 예증적인 면역억제제는 사이클로스포린, 라파마이신, 아지티오프린, 프레드니손, ShK 독소, ShK 유도체 및 데옥시스페르구알린, 이들의 유도체 또는 염이다. 본 발명의 약학적 조성물들은 후술하는 바와 같이 투여될 수 있다.
치료 및 예방법
본 발명은 포유동물에서 면역 반응의 억제가 요구되는, 그러한 치료가 필요한 대상체에서 특히 T-세포가 활성화될 때의 상태를 치유 또는 예방 하는 치료 방법, 특히 체외 방법을 제공하는 것으로, 상기 상태는 이종 기관 거부 (예를 들어, 심장, 폐, 간, 신장 또는 췌장) 또는 자가면역 질환 (예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제 1형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환)을 포함한다. 이러한 대상체들은, 인간 및, 몇가지를 거론하자면, 개, 고양이, 염소, 소, 말, 돼지, 양과 같은 다른 포유동물을 포함한다. 한 관점에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체의 T 세포의 세포막의 Kv1.3 칼륨 채널들을 저해함으로써 이에 반응적이거나 민감한 상태를 치료할 수 있는 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 인간을 위시한, 이를 필요로하는 대상체에, 상술한 본 발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 펩타이드는 SEQ ID NO: 1를 가지는 Vm24, SEQ ID NO: 2를 가지는 Vm23 또는 SEQ ID NO: 3를 가지는 펩타이드, 또는 이의 기능적 동일 유사체, 또는 이의 약학적 허용염을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 T-세포 활성화에 연관되거나 Kv1.3 칼륨 채널 저해에 반응성인 자가면역 질환을 치료하고 예방하는 것에 특히 지향된 방법을 제공한다. 그러한, 자가면역 질환들은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제 1 형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 방법들은 인간 대상체를 위시한, 필요한 대상체에 전술한 바와 같은 본발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이종 기관 (예를 들어, 폐, 간, 신장 또는 췌장)의 이식 거부를 치료하고 예방하는 것에 특히 지향된 방법을 제공한다. 이러한 방법은 인간을 위시한, 필요한 대상체에 (예를 들어, 기관 이식을 받을 또는 받은 대상체)에 전술한 바와 같은 본 발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
투여량 및 투여방법
치료 적용에서, 본 발명의 펩타이드는 질병 또는 원하지 않는 상태 (예를 들어, 각각, 자가면역 질환 또는 이종 기관 이식)을 앓고 있는 대상체에, 상기 질병의 진행 및 이의 합병증을 치료, 치유, 부분적 정지 또는 감지할 정도로 늦추기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료 적용에 사용되는 데 충분한 본 발명의 펩타이드의 양은 상태의 심각도, 환자의 일반적 상태, 및 투여 경로에 달려있다. 치료 적용에 효과적인 펩타이드 양은 투여당 체중 kg 당 상기 펩타이드 (또는 이의 약학적 허용염)의 약 0.1 마이크로그람 내지 약10 마이크로그람 범위에 있다.
예방 적용에서, 상기 펩타이드 또는 이의 약학적 조성물은 질병 또는 원치 않는 상태를 이미 앓고 있는 것이 아니고 그 위험에 있는 대상체에게 투여된다. 투여될 펩타이드의 효과적인 양은 환자의 건강과 면역계의 일반적인 상태에 달려있다. 예방 적용에서의 상기 펩타이드의 유효량은 일반적으로, 투여강 체중 kg 당, 상기 펩타이드 약 0.1 마이크로그람 내지 10 마이크로그람 범위에 있다.
본 발명의 펩타이드 및 약학적 조성물의 전달 경로는 질병 또는 임상적 지시 및 치료가 요구되는 장소에 의해 결정된다. 특정 유형의 질병에 대하여, 신체의 제한적 부위로 한정된다면, 상기 펩타이드 또는 이의 조성물을 국소 위치로 적용하는 것 (국소 적용)이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 질병의 진행에 따라 또는 상기 국소 적용과 동시에, 상기 펩타이드 또는 조성물을 전신적으로 푸여하는 것이 바람직할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 펩타이드 및 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내, 및 피부내 투여는 물론 기관지내 흡입 (예를 들어, 분무기를 이용하여), 및 경점막, 전신, 경피적 (예를 들어, 피부 패치에서의 지질 용해 담체를 사용), 경구 및 위장관 전달 (예를 들어, 캡슐 또는 정제를 사용)로 전달될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 펩타이드들은 조합 요법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 펩타이드들을 다른 명역엑제제 (전술한 바와 같은)와 조합하여 치료가 필요한 대상체에 투여될 수 있다. 면역 혈소판감소성 자반증 [Cooper and Bussel, 2006] 또는 자가면역 임파구증식성 증후군 [Oren 등, 2002]과 같은 특발성 자가면역 질환들이 있고, 여기서 치료는 다중타겟 방식을 요하여서, 두 개 이상의 면역 억제 물질이 필요하다.
본 발명의 펩타이드들은 "약학적 조성물" 단락에서 설명한 바와 같이, 단독으로 또는 약학적 허용 담체와 조합하여 투여될 수 있다. 상기 펩타이드들은 단독 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다. 적절한 약학적 담체는 비활성 고형 희석제, 중전제, 멸균 수성 용액 및 다양한 비독성 유기 용제를 포함한다. 상기 펩타이드와 약학적 허용 담체를 혼합함으로써 형성되는 약학적 조성물들은 정제, 로젠지, 시럽, 주사용액, 등과 같은 다양한 투여 제형으로 즉시 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 약학 담체는 추가의 성분, 향료, 결합제, 부형제등과 같은 것을 포함할 수 있다.
경구 투여용으로, 소듐 사이트레이트, 칼슘 카보네이트 및 칼슘 포스페이트와 같은 다양한 부형제를 포함하는 정제를, 전분, 바람직하게는 감자 또는 타피오카 전분, 알진산 및 특정 복합 실리케이트와 같은 다양한 붕해제, 폴리비닐피롤리돈, 수크로즈, 젤라틴 및 아카시아와 같은 결합제와 함께 사용할 수 있다. 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제를 또한 정제 목적에 추가할 수 있다. 유사한 유형의 고형 조성물을 염 및 경질 젤라틴 캡슐에서의 충전제로 사용될 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 물질은 락토즈, 밀크 슈가 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜류를 포함한다. 엘릭서의 수성 현탁액이 경구 투여용으로 필요한 경우, 이곳에서의 본질적인 활성 펩타이드 성분은 다양한 감미 또는 향료제, 착색물질 또는 염료와 혼합될 수 있거나, 필요한 경우, 유탁 또는 현탁제와, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및 이의 혼합물과 같은 희석제와 같이 조합될 수 있다.
장관내 투여용으로, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 참깨 또는 땅콩유 또는 수성 폴리프로필렌 글리콜 용액은 물론, 전술한 상응하는 수성 약학적 허용 금속염의 멸균 수성 식염수 용액을 사용할 수 있다. 그러한 수용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어져야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코즈와 등장액으로 만들어야 한다. 이러한 특정 수용액들은 특히 정맥내, 근육내, 피하내 및 복강내 주사에 적합하다. 사용된 멸균 수성 배지는 모두 당해분야의 숙련자들에게 공지된 표준 기술로 쉽게 얻어질 수 있는 것이다. 이에 더하여, 전술한 화합물은 특정 목적에 적합한 적절한 용액을 사용함으로써 국소적으로 (예를 들어, 카테터를 통해) 투여될 수 있다.
분자 탐침자로서의 Vm23, Vm24 및 기능적 동일 유사체
본 발명의 펩타이드의 치료적 용도외에, 이러한 펩타이드들은 동물 조직 또는 안정적인 배재양물로부터 얻은, 다양한 세포에서 Kv1.3 채널의 발현 수준을 검출하고 특성분석하는 데 사용될 수 있다. T 세포에서 Kv1.3 발현을 특성화시키는 것의 중요성은 이미 이 문서에서 조명되었고, 따라서 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 Kv1.3 채널-발현 세포를 생리적으로 특성분석하는 분자 탐침자로서 사용하는 것에 관한 것이다. Kv1.3 발현의 검출 및 특성분석은 본 발명의 공유결합적으로 표지된 펩타이드를 사용하여 몇 가지 검출 방법으로써 실행될 수 있고, 상기 방법은: 유세포 측정법, 공촛점 및 통상적인 형광 현미경법, 총 형광 반사법, 방사능 결합 및 치환 기술, 및 면역 풀다운 분석법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 주어진 세포에서 발현되는 Kv1.3 채널들의 정량적 결정은: 공촛점 레이저 스캐닝 현미경법에 의한 채널 계수, 면역골드 검출 및 방사능 결합과 치환 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 정량 검출 기술에 의해 수행될 수 있다. 더구나, 몇몇 비필수 아미노산들의 폴리펩타이드 사슬 또는 곁사실의 화학적 변형은 Kv1.3 채널 검출 및 정량화에 사용될 수 있는 표지된 기능적 동일 유사체를 제공할 수 있다. 다음으로, 이러한 기능적 동일 유사체들은 특이성 리간드를 탐색하는 분자 탐침자로서 사용될 수 있고, 이러한 신규 리간드에게 Kv1.3 상에 Vm23, Vm24 및 이의 기능적 동일 유사체와 동일한 결합 부위를 공유하게 한다. 임의의 그러한 화학적 변형은, Kv1.3에 대하여 고도의 친화도와 특이성을 부여하게 하는, Vm23, Vm24 및 이들의 기능적 동일 유사체의 구조적 결정 인자는 변형되지 않도록 남겨 놓는다. 폴리펩타이드 사슬의 화학적 변형은 유용한 분자 탐침자를 얻는 통상을 방법이다; 이는 몇 가지 광범위하게 이용가능한 방법에 의해 이루어 질 수 있고, 당해 분야의 전문가에 의해 사용될 수 있다. 변형에 의해 제공되는 표지는, 방사능 동소체, 형광성, 화학발광 또는 색원체성 (chromogenic) 분체 및 태그 단백질 (항체, 비오틴, 녹색 형광 단백질 이의 유도체)과의 가교 또는 융합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
하기 실시예에서, 본 발명의 이러한 신규 펩타이드가, 어떻게 분리되고, 정제되며 화학적으로 특성분석되는 지 상세히 설명된다. 예증적 펩타이드 Vm24의 합성이 서술되며, 본 발명의 두 개 예증적 펩타이드 (Vm23 및 Vm24)가 인간 T 임파구의 Kv1.3 채널 상에서 어떤 선택 작용을 하는지 상세하게 설명될 것이다. 마지막으로, 래트에서 DTH-반응에 대한 생체 내 분석에서의 저농도에서의 Vm24의 방어 작용 또한 설명된다.
본 개시물에 포함된 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 관정믈 더욱 설명하기 위해 제시된다. 완전한 발명은 이러한 하나 이상의 도면을 여기, 특히 하기 실시예의 단락에서 제시된 특정 구체예의 상세한 설명과 보조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도1: 전갈 V. mexicanus .로부터 분리된 수용성 독의 1 mg의 HPLC 분리. 60분에 걸쳐 0% 부터 60% 까지의 용액 B 구배(0.12% TFA을 용해한 아세토니트릴)을 사용하면서, 용액 A (0.10% TFA을 용해한 물)로 평형화한 C18 역상 컬럼(카탈로그 번호 218TP54, Vydac 사 제품, Hisperia, CA)에 수용성 독을 적용함으로써 80 개가 넘는 상이한 성분들을 분리적으로 얻었다. 유지 시간 24 및 24 분에 숫자 1 및 2는 각각 Vm23 및 Vm24의 용출을 지시한다. 이러한 두 개 크로마토그래프 분획물 각각의 추가 분리를 동일한 시스템에서, 그러나 용액 A 부터 40% 용액 B까지의 선형 구배를 60 분간에 걸쳐 양 쪽 펩타이드에 대해 사용하여 수행하였다. 이 결과는 도면의 삽입도로 도시되어 있다. 삽입도에서의 별표는 고도로 정제된 펩타이드의 용출 위치를 표시하고 있다.
도 2: Vm23 , Vm24 및 컨센서의 아미노산 서열. Vm23 및 Vm24의 서열은 천연 펩타이드 및 환원 및 알킬화된 샘플을 직접 에드만 분해 분석과, 하기 지시한 바와 같이, 특정 효소 (엔도프로테아제 Arg-C 및 Lys-C)으로 순수한 펩타이드를 효소 절단하여 얻은 펩타이드를 질량 분광분석과 조합하여 얻었다. 효소 가수분해 및 HPLC 분리 후에 정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 질량 분광분석으로 동정하였다 (MS/MS, 전기분사 이온화에 의한 질량 분광분석 단편화를 의미). 사용된 다양한 방법에 의해 확인된 세그먼트의 표시가 각 서열 아래에 있다. Direct는 에드만 분해분석을 의미하고, Arg-C 및 Lys-C는 효소 절단 후 정제된 단편들이다. MS 단독은 빠진 아미노산의 분자량에 근거한 동정을 의미한다. 컨센서스 서열은 Vm23 또는 Vm24의 것과 동일한 30 개 아미노산 잔기를 가진다. "x"로 표지된 위치는: x1, 즉, 단백질의 삼차원 폴딩을 방해하지 않는다면 임의의 아미노산일 수 있거나, 좋기로는 K 또는 P일 수 있고; x2, 즉, 단백질의 삼차원 폴딩을 방해하지 않는 다면 임의의 아미노산 좋기로는 L 또는 P일 수 있고; x3, 즉, 단백질의 삼차원 폴딩을 방해하지 않는 다면 임의의 아미노산 좋기로는 K 또는 R일 수 있고; x4, 즉 단백질의 삼차원 폴딩을 방해하지 않는 다면 임의의 아미노산 좋기로는 S 또는 N일 수 있고; x5, 즉, 단백질의 삼차원 폴딩을 방해하지 않는 다면 임의의 아미노산 좋기로는 K 또는 R일 수 있고, 및; x6, 즉 단백질의 삼차원 폴딩을 방해하지 않는 다면 임의의 아미노산 좋기로는 Y 또는 전혀 없을 수 있다.
도 3: Vm24 은 아미드화된 C 말단을 가진다. m/z 909.4 a.m.u (모노동위원소성 분자량)에서 C-말단 [M+H]+ 이온의 충돌 유도 해리 (CID)는 [M+H]+ 910.5 a.m.u의 예상된 이론적 수치보다 1.0 단위 적은 것을 보여준다. 아미드화된 C-말단 서열 에 상응하는 y 이온 시리즈 (이태릭체)는 1)로 표지된 삽입도에 나타나 있다. 자유 카르복실 말단 펩타이드 (TV-COOH)에 대한 이론적 y 이온 시리즈 값, 아미드화 C-말단 (TV-NH2)에 대한 이론적 y 이온 시리즈 값, 및 실험적 y 이온 시리즈 값 (EXP.)을 삽입된 표에서 비교하였다 (2로 표지된 삽입표).
도 4: 디설파이드 할당에 대한 Vm24 이종이량체 . 숫자 1 및 2는 pH 6.5에서 트립신과 키모트립신을 사용하여 동시에 Vm24를 단백질 분해 절단하여 생성된 이종이량체의 분자량 및 도식적 구조를 나타낸다. m/z 788.0 a.m.u.에서의 [M+H]+ 이온은 시스틴 반쪽 쌍C4-C8 (숫자 1)을 포함하는 이종이량체의 분자량에 상응하고 m/z 560.4 a.m.u.에서의 [M+H]+ 이온은 시스틴 반쪽 쌍 C3-C7 (숫자 2)에 해당한다.
도 5: Vm24 시스틴 반쪽 쌍. A) m/z 1099.7 a.m.u. 에서 [M+2H]+2 이온을 가지는 시스틴 반쪽 쌍 C1-C4 및 C2-C6 양 쪽을 포함하는 복합체 중심의 구조에 상응하는 질량 스펙트럼. 이것을 단편화하여 도 4B에 나타난 MS/MS 스펙트럼을 생성하였다. 1137 에서부터 1507 a.m.u.까지의 b 이온 시리즈 값은 태그 GSPE를 명확하게 나타내며, 마지락 두 개 시스틴 반쪽 쌍의 임무를 확인하였다. B). 이 도면의 부분 A에서 설명된 질량 분광분석으로 결정된 바와 같이, Vm24의 전체 디설파이드 다리를 나타낸다.
도 6: 합성 Vm24 의 HPLC 정제. 합성적으로 제조한 Vm24 (50 밀리그람 단백질)을 C18 역상 준비 컬럼에서 분리하였다. 숫자 1은 합성 및 정확히 폴딩된 Vm24 의 용출 위치를 가르키고 반면 2 와 3은 부정확하게 폴딩되거나 절단된 서열을 나타낸다. 이러한 크로마토그래피성 분획물의 추가 분리를 동일 시스템에서, 그러나 60 분간 용액 A로부터 40% 용액 B까지의 선형 구배로 전개된 분해 컬럼을 사용하여 수행하였다. 결과를 도면의 삽입도로 나타내었다.
도 7: 합성 및 천연 Vm24 펩타이드의 HPLC 비교. A) 천연 Vm24의 10 마이크로그람을 도 1에서 설명한 HPLC의 분석 C18 컬럼 (카탈로그 번호 218TP54, Vydac사 제품, Hisperia, CA) 적용하여, 순수한 펩타이드가, 60 분간, 용액 A에서부터 40% 용액 B까지의 선형 구배로 전개시, 32.67에 용출된 것을 나타낸다. B) 합성적으로 제조한 그리고 폴딩된 Vm24의 15 마이크로그람에 대한 동일 시스템과 조건에서 작성된 크로마토그램. C) 합성 및 천연 Vm24의 1:1 혼합물 (총 1 8 마이크로그람)을 공주입하여, 동일 유지 시간에서 공동 용출되는 것을 보여준다. 그래프의 X-축은 문자 B 및 C에 대하여 우측으로 전이되었고 이는 세 개 그래프가 분리적이 아닌, 비교적으로 관찰하기 위한 것이며, 그렇게 하지 않으면, 세 개의 독립적인 HPLC 주행의 용해 시간은 동일한 정점에 해당되게 되고 구별할 수 없게 된다.
도 8: Vm23 및 Vm24 의 서열 및 계통발생적 분석. A) Vm24 및 Vm23과 이들의 가장 밀접하게 관련된 α-KTxs과의 다중 서열 배열. 상기 배열은 CLUSTAL_X [Thompson 등, 1997] 소프트웨어를 사용하여 수행하였고 Vm24와 서열 동일성 (%I, 마지막 컬럼)은 BioEdit로 계산하였다. B) 간편화된 계통발생도는 MrBayes 3.0b4로 계산하였다 [Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist and Huelsenbeck, 2003]. Vm23 및 Vm24은 서로 집단화되어 있고 α-KTx 6 아족의 구성원과 상당히 차이가 난 다.
도 9: Vm24 에 의한 임파구 이온 채널의 선택적 차단. A), 매 15 초 마다 -120 mV의 홀딩 전위로부터 +50 mV로 탈분극 펄스되는 것에 대한 반응으로, 인간 T 세포로부터 hKv1.3 채널을 통한 전체-세포 칼륨 전류가 야기된다. Vm24의 부재 속에서의 전류(대조군, 화살표로 표시)는 1 nM Vm24가 세포외 배지로 관류함으로써 세포에 투여될 때, 거의 완전히 차단된다. 화살표는 Vm24에서의 첫번 펄스를 나타낸다. B) Vm24를 1 nM (막힌 원) 또는 0.3 nM (빈 원) 적용 후, 표준화된 정점 전류가 시간의 함수로 표시되어 있다. 화살표는 독소의 적용 개시를 나타낸다. C) 3 pM Vm24가 세포에 적용되고 그 후 세포외 배지로부터 제거 (유실)됨에 따라 임파구의 표준화된 정점 전류가 시간의 함수로 나타나 있다. 무독소 배지로 관류시키면 ~3800 s의 시간 상수로, 차단에서 매우 천천히 부분적으로 회복된다. 펄스는 매 30초마다 전달되었다. D) I 및 I 0 는 각각 독소의 존재 및 부재에서 측정된 정점 전류인 잔류 전류 분획(RCF=I / I 0 )을 독소 농도의 함수로 좌표 표시함으로써 및 데이터 포인트를 [Tx]는 독소 농도이고 Kd 는 해리 상수이다 함수: RCF = Kd n / (Kd n + [Tx]n)에 맞춤으로써, Vm24에 대한 용량-반응 관계를 얻었다. 에러 막대는 SEM (n = 3-6)를 나타낸다. 이러한 방식으로 얻은 용량-반응 함수는 Kd = 2.9 pM 및 Hill 계수 n~1를 나타내었다. E) T 임파구 (hIKCa1)의 Ca2+ 활성화 K 채널을 Cos-7 세포에서 발현하였고, 매 10초 마다 -120 mV의 홀딩 전위로부터 -120에서 +50 mV로 전압 상승시킴으로써 전류를 이끌어 냈다. 독소 적용 전에 (대조군), 10 nM Vm24 존재하에서 4.5 분간 차단 평형화 후에, 및 2.5 분간 독소의 유실 (세척) 후에, 기록된 전류를 나타낸다. F) 1 nM 및 10 nM Vm24의 존재하에서 hIKCa1 전류의 잔류 분획을 s/s 0 로 계산하였고, 여기서s 및 s 0는 각각 Vm24의 존재 및 무존재하에서 전압 상승에 의해 야기된 I-V 관계식의 기울기이다. 에러 막대는 SEM (n = 3)를 나타낸다.
도 10: Vm24 는 Shaker 족 ( Kv1 .x) 채널들 간에서 hKv1 .3에 대해 선택적이다. 독소 적용 전에 (대조군), 10 nM Vm24에 의한 차단 평형화 후에, 및 2.5 분간 독소의 유실 (세척) 후에, 기록된 전류를 나타낸다. A) mKv1.1 채널은 L929 세포에 의해 발현되었고, 매 30초 마다, -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로써 전류를 발생시켰다. 평형화 차단은 6 분 내에 전개되었고, 유실 기간은 5 분이었다. B) hKv1.2 채널은 Cos-7 세포에서 발현되었고, 매 30초 마다, -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로써 전류를 발생시켰다. 평형화 차단은 5.5 분 내에 전개되었고, 유실 기간은 7 분이었다. C) hKv1.3 채널은 말초혈액 임파구에서 내재적으로 발현되었고, 매 30초 마다, -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로써 전류를 발생시켰다. 평형화 차단은 3.5 분 내에 전개되었고, 유실 기간은 4.5 분이었다. D) 빠른 불활성으로 제거되는 hKv1.4 (Kv1.4ΔN) 채널은 Cos-7 세포에서 발현되었고, 매 30초 마다, -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로써 전류를 발생시켰다. Vm24 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 5 분 및 4.5 분이었다. E) hKv1.5 채 널은 MEL 세포에서 발현되었고, 매 30초 마다, -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로써 전류를 발생시켰다. Vm24 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 6 분 및 3.5 분이었다.
도 11: Vm24 은 다양한 이온 채널들을 차단하거나 저해하지 않았다. 독소 적용 전에 (대조군), 10 nM Vm24에 의한 차단 평형화 후에 및 독소의 유실 (세척) 후에, 기록된 전류를 나타낸다. A) rKv2.1 채널은 Cos-7 세포에 의해 발현되었고, 매 30초 마다, -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로써 전류를 발생시켰다. Vm24 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 7 분 및 3 분이었다. B) hERG 채널은 HEK 세포에 의해 발현되었고, -40 mV로 단계 상승 후 +20 mV로 전압단계 상승으로 전류를 발생시키고 이 동안 정점 전류를 측정하였다. 홀딩 전위는 -80 mV이었고, 펄스는 매 30초마다 전달되었다. Vm24 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 5 분 및 2.5 분이었다. C) hBK (KCa1.1) 채널은 tsA-201 세포에서 발현되었고, 0 mV의 홀딩 전위에서부터 -120 mV로 10-ms 초분극한 후, +50 mV로 전압 단계 상승하여 전류를 발생시켰다. 펄스는 매 5초 마다 전달되었다. Vm24 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 4 분 및 1 분이었다. D) NaV1.5 채널은 Cos-7 세포에서 발현되었고, 매 15초 마다 -120 mV의 홀딩 전위에서부터 0 mV로 전압 단계 상승시킴으로 전류를 발생시켰다. Vm24 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 1 분 및 또 1 분이었다.
도 12: Vm24 의 선택성 프로파일. 막대들은 1 nM (A) 또는 10 nM 농도 (B)로 적용된 Vm24에 의해서 지정 채널의 평형화 차단시에서의 전류 전류 분획을 나타낸 다. 데이터는 n≥3 독립적 시험에 대한 평균ㅁSEM 로 제시된다. 발현 시스템 및 RCF계산과 다른 조건에 대하여는 도 9 내지11의 범례를 참고.
도 13: 합성 Vm24 에 의한 hKv1 .3 채널의 고 친화도 차단. A) 매 30초 마다 -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 탈분극 펄스되는 데에 반응하여 인간 T 세포에서 hKv1.3 채널을 통해 전체-세포 칼륨 전류를 생성하였다. 상기 펩타이드 부존재 하에서 (대조군, 화살표로 지시) 기록된 전류는 100 pM 합성 Vm24 (sVm24)이 세포외 배지의 관류를 통해 세포로 투여될 때 실질적으로 차단된다(>90%). 화살표는 sVm24에서 첫번 펄스를 나타낸다. B) 100 pM sVm24 적용후 표준화된 정점 전류가 시간의 함수로 도시되어 있다. 화살표는 독소의 적용 개시를 표시한다. 세포가 무sVm24 용액으로 관류될 때 차단으로부터 어떠한 유의한 회복이 이루어지지 않는다 (화살표는 유실 기간의 개시를 표시한다). C) 막대는 sVm24 및 Vm24을 100 pM 농도로 적용하여 hKv1.3을 평형 차단할 때의 잔류 전류 분획을 표시한다. 데이터는 n≥3 독립적인 실험에 대한 평균ㅁSEM로 제시된다. 발현 시스템 및 RCF계산과 다른 조건에 대하여는 도 9 내지11의 범례를 참고.
도 14: Vm23 은 hKv1 .3에 선택적이다. 독소 적용전 (대조군), 10 nM Vm23에 의한 차단 평형화 후, 및 독소의 유실(세척) 후 기록된 전류 자취가 도시되어 있다. Vm24의 10 nM 농도에 의해 상당히 차단된 이온 채널들을 Vm23의 약학적 특성 분석에 선택하였다. A) hKv1.3 채널들은 말초 혈액 임파구에서 내재적으로 발현되었고, 매 15 초마다 -120 mV의 홀딩 전위로부터 +50 mV로 전압 단계 상승으로 전류를 발생시켰다. 평형 차단은 3.5 분내에 전개되었고, 유실 기간은 2 분이었다. B) T 임파구의Ca2+ 활성화 K 채널 (hIKCa1)은 Cos-7 세포에서 발현되고, 매 15 초 마다 -120 mV의 홀딩 전위에서부터 -120 내지 +50 mV로 전압 상승시킴으로 전류를 발생시켰다. Vm23 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 3.5 분 및 2 분이었다. C) mKv1.1 채널은 L929 세포에서 발현되었고, 매 15 초마다 -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로 전류를 발생시켰다. Vm23 적용 및 유실 기간의 시간은 각각 3.5 분 및 1 분이었다. D) hKv1.2 채널은 Cos-7 세포에서 발현되었고, 매 15초 마다 -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로 전압 단계 상승시킴으로 전류을 발생시켰다. 평형 차단은 3.5분 내에 전개되었고, 유실기간은 2 분이었다.
도 15: Vm23 의 선택성 프로파일. 막대는 10 nM 농도로 적용된 Vm23에 의해 지정된 채널이 평형 차단되었을 때의 잔류 전류 분획을 표시한다. 데이터는 n≥3 독립적인 실험에 대한 평균ㅁSEM로 제시된다. 발현 시스템 및 RCF계산과 다른 조건에 대하여는 도 9 내지14의 범례를 참고.
도 16: 래트에서의 지연형 과민증 ( DTH ) 반응. 각 3 마리 래트의 두개 군을 DNFB으로 감작 적용시켰다. 한 군은 PBS 단독 주사적용되었고 (대조군, 번호 1) 및 나머지 하나에는 10 마이크로그람 Vm24을 단회 주사하였다 (군 2). 이러한 처치 24시간 후, 귀 측정을 하였다. 대조군 막대는 대조군 래트에 대해 DNFB로 적용한 후 귀의 두께를 나타내고, 처치군 (군 2)에 상응하는 막대는 Vm24로 처치된 래트의 귀의 두께를 나타낸다. 대조군 래트와 비교할 때, Vm24을 받은 래트에서, 염증에서 약 60% 감소가 관찰된다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 증명하는 것으로 제시되고 있다. 많은 변화가 제시된 실시예의 특정 구체예에서 만들어 질 수 있고, 본 발명의 사상과 범위에 벗어나지 않고 당해 분야의 숙련자에 의해서 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다. 최종 생성물이 여기 제시된 서열 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3) 또는 이들의 기능적 동일 유사케를 포함한다면, 이들은 본 명세서에서 설명된 바와 동일한 결과를 재생하게 될 것이고 따라서 본 명세서에서 주장된 본 발명의 실제에 잘 기능할 것으로 기대된다.
실시예 1. Vm23 및 Vm24의 분리, 마우스에서의 치사 시험 및 일차 구조 결정
이전 설명된 바와 같이 전체 과정에 걸쳐 사용된 용제 및 화학물은 분석 등급이며, 이중 증류수를 사용하였다 [Batista 등, 2007].
분리 과정
전술된 다양한 천연 리간드를 분리하는 데 사용된 과정은 크로마토그래피 기술을 이용한다. 독을 물에 용해하고 10,000 x g 에서 5 분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분리한다. 상기 수용성 독 단백질 1.0 밀리그람을 포함하는 100 마이크로리터를 HPLC 시스템 (Millenium Millipore, Milford, MA)의, Vydac (Hisperia, CA, USA)에서 얻은 분석 C18 역상 컬럼 (규격 10 x 250 mm, 카탈로그 번호 238TP)에 적용하였다. 용액 A (0.12% 트리플루오로아세트 산 - TFA 포함 수용액)에서 60% 용액 B (0.10% TFA 포함 아세토니트릴 용액)까지의 선형 구배를 이용하여 60 분간 구동시켜 성분들을 정제하였다. 230 nm에서의 흡광도로 검출을 관찰하였고 1 ml/min 유속으로 용출하였다. 분획물을 수동으로 모으고, Savant Speed-Vac 건조기를 사용하여 건조시켰다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 이러한 HPLC 분리로부터 80 개 이상의 구변된 분획물이 수집되었다. 20 내지 35 분 정체 시간에서 용출되는 분획물은 통상 연구된 다른 전갈 독의 대부분 K 채널 전갈 특이성 독의 용출시간에 해당한다 [Batista 등, 2007]. 이러한 이유로, 이러한 시간에 용출되는 독 성분에 특별한 주의를 기울였다. 특히, 두 가지 분획물: 하나는 23 분에 다른 하나는 24 분에 분획된 것을 더 분석하였는 데, 이러한 용출 시간 대에서 나온 펩타이드의 질량 분광분석 결정은 다른 알려진 K 채널 특이성 독소에 대해 알려진 값과 밀접하게 연관되기 때문이다, 즉 이들은 약 4,000 달톤 분자량을 가졌다. 이러한 성분들은 여전히 동일하지 않기 때문에, HPLC 시스템을 사용하여 두 번째 크로마토그래피 분리를, 다른 구배 (용매 A에서 40% 용매 B까지 60 분간, C18 컬럼 이용, 카탈로그 번호 218TP54, Vydac, Hisperia CA에서 구입)로 용출하여 실시하였다. 도 1의 삽입도에서 나타난 바와 같이, 주요 성분은 이러한 시초 분획물들 중 (별표로 표시) 각각으로부터 분리되었다. 왼편의 삽입도는 23 분에서 용출된 분획물과 상응하며, 오른편의 것은 24분에 용출하는 분획물과 상응한다. 질량 분광분석 결정에 의한 분석 및 자동 에드만 분석에 의한 서열화에서, 양 쪽 펩타이드는 동종임이 발견되었다. 우리의 실험 조건에서 24분에 용출된 것을 먼저 분석하였다. 이것은 순수하고 및 3864 원자 질량 단위 (a.m.u.)의 분자량을 나타내었다. 본 명세서에서, 우리는 a.m.u. 또는 달톤 (Da로 약자)을 분자량의 하나의 단위로 지정하는 데 상호교환하여 사용할 것이다. 이러한 이유로, 상기 펩타이드를 Vm24으로 명칭하고, 이는 우리 실험 조건에서 24분에 용출된, V. mexicanus 의 독으로부터 나온 펩타이드라는 것을 표시한다. 왼편의 삽입도에 나타난 크로마토도면 (도1)은 Vm23으로 명칭된 펩타이드의 분리에 해당한다. 이는 23 분에 용출된, V. mexicanus 의 독으로부터 나톤 펩타이드를 표시하고 있다. 이러한 성분에 대한 실험적 분자 질량은 be 3665 Da인 것으로 결정되었다.
V. mexicanus 로부터 얻은 전체 독의 생체내 독성 결정 및 정제된 Vm23 및 Vm24의 치사 시험
독 및 순수한 펩타이드의 효과는 통상 적어도 세가지 생물학적 모델을 사용하여 실헙실에서 수행된다: 포유동물, 귀뚜라미류 및 갑각류. 왜냐하면, 전갈독은 종특이적 독소를 포함하고 있는 것으로 알려져 있기 때문이다. 포유동물 또는 다른 유형의 절지동물에 특이적인 독소가 있다 ([Possani 등, 1999]에서 리뷰). 본 발명의 목적 상, 결과가 독 또는 정제된 독소와 접촉된 인간에게 일어날 수 있는 것에 대한 신뢰할 만한 것이기 때문에 우리는 동물 모델로서 마우스를 사용하여 실험을 진행하였다. V. mexicanus 의 수용성 독의 다양한 양 (20 그람 체중의 마우스당 50 내지 200 마이크로그람 단백질)으로 주사된 마우스는 중독의 증상을 보이지 않았다. 통상, 상기 독이 이러한 양의 물질을 가진 인체에 대한 독소를 포함한다면, 흥분, 타액분비, 호흡 장애 (호흡 곤란), 뒷다리 마비, 설사, 경련 또는 심지어 사망 과 같은 명백한 중독 증상이 나타났을 것이다 [Possani el al., 1985]. 상기 펩타이드는, 주입된 동물이 상기 임의의 증세를 보인지만, 펩타이드 투여후 24 시간 내에 회복된다면, "독성적"이라고 말하여 지지만, 마우스가 죽는다면, "치사적"이라고 말하여 진다. 비독성 성분은 성분은 중독의 어떠한 증상도 유도하지 않고, PBS-식염용액, pH 7.2로 주입된 마우스와 유사한 거동을 내는 것들이다 [Possani 등, 1985]. 결국, 비교적 저 용량의 독은 독성이지 않지만, 유사한 용량의 정제된 펩타이드들은, 정제중에 샘플의 특정 성분이 풍부해질 수 있기 때문에, 중독의 증상을 유도할 수 있다. 이러한 이유로 및 V. mexicanus 의 수용성 독이 200 마이크로그람/ 20 그람 마우츠 체중에서는 독성이지 않는다는 사실을 고려할 때, 정제된 펩타이드 Vm24를 다양한 농도에서 마우스에 주입하였다. 사용된 최고 용량은 200 마이크로그람/20 그람, 즉: 10,000 밀리그람/킬로그람 마우스 체중이었고 중독의 징후가 관찰되지 않았다.
이것은 다른 멕시코 전갈 Centruroides noxius로부터 정제된 독소 Cn2와 같은 치사 성분과는 확실히 구별된다. 마우스에서 Cn2에 대한 50% 치사량 (LD50 , 분석된 돌물 군에서 50% 사망률을 야기하는 용량을 의미) 는 0.25 마이크로그람/20 그람 마우스 체중이다 [Zamudio 등, 1992]. 이것은 800 배 더 높은 단백질 농도에서 Vm24이 마우스에는 독성이 아닌 반면, Cn2는 반을 죽이는 것이다는 것을 의미한다.
Vm23 및 Vm24의 아미노산 서열 결정
두 가지 기술을 사용하였다: 자동 에드만 분석 및 질량 분광분석 (MS). Beckman LF 3000 단백질 시퀀서 (Palo Alto, CA, USA)를 그 회사에서 제공하는 화합물과 절차를 함께 사용하여 순수한 독소의 직접적인 아미노산 서열 결정을 수행하였다. 다른 전갈 성분에 대하여 이전에 설명된 바와 유사한 방식으로 [Valdez 등, 2004; Batista 등, 2007; Diego-Garcia 등, 2007] 사용하여, 순수한 펩타이드의 환원된 및 알킬화된 샘플을 Arg-C 엔도펩티다제 (Roche Diagnostics, 바젤, 스위스)로 효소 절단하였다. 상응하는 펩타이드를 HPLC로 정제하고 서열결정하였다. 질량 분광분석에 대해서는, 샘플을 Surveyor MS 시린지 펌프 전달 시스템을 사용하여 직접적으로 Finnigan LCQDUO 이온 트랩 질량 분광분석기 (San Jose, CA)에 적용하였다. 10 마이크로미터/분에서의 용출물을 분할하여 샘플 5% 만을 나노스프레티 소스로 들어가게 하였다 (0.5 마이크로미터/분). 스프레이 전압을 1.7 kV에 및 캐필러리 온도를 130℃에 맞추었다. MS/MS 실험에서, 분획화 소스는 25 V의 충돌 에너지, 정상화된 (normalized) 충돌 에너지의 35-45% (임의 단위)로 수행하였고, 및 광대역 활성화하면서 스캔하였다. 모든 스펙트럼은 양성-이온 양태로 얻었다. 데이터 획득 및 데이터의 해독은 Windows NT PC 시스템 상에서 Xcalibur 소프트웨어로 수행하였다. 효소적으로 생성된 펩타이드로부터의 MS/MS 스펙트럼을 수동으로 및 Sequest 소프트웨어 [Batista 등, 2007]로 분석하였다.
양쪽 Vm23 및 Vm24의 일차 서열을 (도 2 참조)를 결정하였고, 펩타이드들을 후술하는 바와 같이 전기생리학적 실험에 사용하였다 (본 발명의 실시예 7 내지 10). 23 분에 용출된 분획물로부터 재정제된 천연 펩타이드 (도 1의 왼편 삽입도 참조)를 완전히 특성분석하였다. 이의 분자량은 3665 Da으로 밝혀졌다. 이 펩타이드의 일 나노몰을 시퀀서에 적용하고 첫 번 34개 아미노산들을 에드만 분석으로 동정하였다 (밑줄). 시스테인 잔기들은 회사(Beckman)에서 제시한 방법을 사용하여 환원 및 알킬화로 확인하였다. 위치 35에 있는 Vm23의 마지막 잔기는 질량 분광분석으로 결정하였다. 결정된 서열에 근거한 예상된 이론적 평균 분자량은 3665.51 Da이었고, 따라서 전체 서열의 모호하지 않은 결정을 확인하였다. 실험적으로 결정된 그리고 예상된 이론적 분자량 양쪽이 사용된 기구 (Finnigan 이온 트랩 LCQDuo 질량 분광분석기)의 오차 범위 내에서 동일하였다.
유사하게, 동종 펩타이드 Vm24 (도 1의 우편 삽입도에 도시된 바와 같이 재정제된)의 일 나노몰을 자동 에드만 분석에 처리하고, 처음 28 아미노산 잔기 (도 2, 표지된 Vm24)을 동정하였다. 환원된 및 알킬화된 펩타이드의 다양한 분획물로 실시한 분석을 사용하여 시스테인 잔기를 확인하고 엔도펩티다제로 절단을 확인하였다. Vm24를 ArgC-엔도펩티다제로 절단하면 세 개 부차-펩타이드들이 생성되고, 하나는 잔기 Ala1 내지 Arg17의 서열을 확인한 것이고 (도면상에는 표시되지 않음. 천연 펩타이드-"direct"로 아래 표지된 것을 분석할 때 이미 결정된 동일한 N-말단 서열을 포함하기 때문이다); 다른 것은 "Arg-C1"로 아래 표지된 것들에 의해 지시되는 Ala18 내지 Arg29에 해당되며, 마지막 것은 Lys30 내지 Cys36이다 (Arg-C2로 아래 표지). 이러한 서열들은 에드만 분석과 MS/MS 분획화의 조합 분석으로 얻어졌 다 (참조 도 2, Vm24). 마지막 잔기가 CID (충돌 유도 분획화)에 의해 동정되었기 때문에, 위치 30 및 32이 아미노산들은 리신 또는 글루타민 (동일 분자량)일 수 있다. 이러한 모호함을 해결하기 위해, 이러한 최종 부차 펩타이드를 트립신으로 추가 효소 절단하였다. 세 가지 작은 펩타이드들이 HPLC로 분리되었고 CID에 의해 결정된 이의 아미노산 서열은 위치 Cys26 내지 Lys30 (밑줄 Trp1), Cys26 내지 Lys32 (단순함을 위해 미표시) 및 Cys33 내지 Cys36 (미표시)로부터 있다는 것이 밝혀졌다. 트립신은 리신의 C- 말단에서 펩타이드 결합을 절단하기 때문에, 이러한 두 개 위치는 리신 잔기임이 분석되었고, 전체 서열이 명확하게 드러났다. C-말단에서의 마지막 4 개 아미노산은 또한 Lys-C 엔도프로테아제 (아래표지된 Lys-C)로 가수분해 후 분리된 펩타이드의 MS/MS 분획화로 확인되었다. 아미드화된 C-말단 아미노산이라고 가정되는, 예상된 펩타이드의 이론적 평균 분자량은 3863.64 Da 이었고, 실험적으로 찾은 수치는 3864.0 Da이며, 전체 서열을 확인하였다. 삼차원 이온 트랩의 정교함은 1,000 Da 미만의 펩타이드들에 대해서은 100 ppm의 범위에 있기 때문에, 0.36 단위의 작은 차이는 예상된 수치 내에 있는 것이다 (장비의 정교함에 대한 참고문헌 참조 [Aebersold and Goodlett, 2001]).
본 발명에 관계가 있는 중요한 Vm23 및 Vm24의 5 개 특성을 조명한다:
1) 현재 알고 있는 모든 다른 전갈 독소와 비교한 이들의 일차 구조는 50% 이상 차이가 난다 (하기 실시예 6 참조). 이러한 사실은 새로운 아족 (현재까지 알려지지 않은)의 좆재를 정당화하고, 여기서 숫자 α-KTx 21로 제안한다; 예를 들어, α-KTx21.1 및 α-KTx21.2. 이것은 첫번 개시이고 및 양 쪽 펩타이드들이 말미 잘, 벌 및 뱀 독 펩타이드를 위시한 임의의 다른 그러한 리간드와 구조적으로 다르다는 것을 명확하게 나타낸다.
2) 위치 10에 있는 아미노산까지의 양쪽 서열의 N-말단 부위는 동일하고 디설파이드 다리를 유지하는 시스테인의 8 개 위치 중 7가가 일차 구조에서 동일 장소에 있다. Vm23의 제 8 시스테인 (C8)은 C-말단 편의 극단인 위치 35에 있고, 초기의 하나의 아미노산은 Vm24과 비견된다. 이러한 이유로, Vm24은 36개 잔기를 가지는 반면, Vm23은 35개 아미노산 잔기를 가진다. Vm23의 최종 시스테인은 아미드화되지 않았지만, 우리는 구조적 폴딩이 Vm24의 것과 동일하다고 가정하였다. 양쪽 Vm23 및 Vm24의 생리적 효과가 비견되기 때문에, N-말단 부위에서의 아미노산 서열은 활성에 결정적일 것이라고 예상된다. Vm23 및 Vm24의 일차 구조를 비교할 때, 다섯 개 차이점이 위치: 10, 13, 17, 23 및 29에서 발견되었고, 하나는 최종 아미노산과 그 전의 것 사이에 있다 (Vm 에서는 Y34 및 Vm24에서는 Y35). 가장 변위적인 부위는 양쪽 펩타이드의 중앙부이고 (잔기 10 내지 30, 여기서 6 개 차이 잔기중 다섯개가 위치), 이러한 잔기들이 상기 펩타이드들 어느 것의 기능에 결정적이지 않다는 것을 제시한다. 위치17 (R/K), 23 (N/S) 및 29 (R/K)에서의 치환물은 보존적 변형이고, 이는 아르기닌 (R) 및 리신 (K) 둘 다는 하전된 기본 아미노산인 반면, 아스파라긴 (N)과 세린 (S)은 비하전 친수성 아미노산 잔기이기 때문이라는 것을 언급할 필요가 있다. Vm24에 비하여 위치 35에서의 타이로신 결여 (Vm23에서는 시스테인으로 치환) 는 양쪽 펩타이드의 동일한 폴딩 및 기능에는 단지 하나의 타이로신이면 충분하다는 것을 제시하고 있다.
3) 가장 변위적인 부위가 따라서 중앙부에 위치하며, 보존적 치환을 가능하게 한다. 이것은 당해 분야의 전문가에 의해서 용이하게 디자인될 수 있고, 적어도 83% 대서열 동일성 (여기서 Vm23 및 Vm24의 경우에 제시된 바와 같이) 을 공유하는 배열된 위치에서의 동일한 생리화학적 특성을 가지는 아미노산에 의한 변형과 치환은 동일한 특성을 지니는 기능적 동일 유사체를 생성하는 것으로 예상되며, 따라서 본 발명의 범주내에 들어간다.
4) 가장 중요한 특성은, 그러나, 하기 실시예 7 내지 10에서 제시되고 논의되는 바와 같이, 양쪽 Vm23 및 Vm24이 칼륨 채널의 다른 아형과 비교할 때, hKv1.3 채널들에 대하여 가지는 고도의 친화성이다. Vm23 및 Vm24는 챠립도톡신, 아누록톡신, BgK, ShK, 등과 같은 다른 공지된 차단체 [Panyi 등, 2006]에 비하여 hKv1.3 대하여 더 높은 친화도를 가진다. 상기 언급된 다른 차단체는 매우 뚜렷한 아미노산 서열 및/또는 디설파이드 다리를 가지거나 Kv1.3 채널들에 대한 활동의 구별된 특이성 및 결합 친화도를 나타낸다. Vm23 및 Vm24의 일차 구조의 간단한 분석으로부터, 이들이 다른 전갈 또는 말미잘 독소에 보여진 것들과 유사한 방식으로 Kv1.3 채널들에 영향을 끼친다는 것이 명백하지 않다. 여기서, Vm23 및 Vm24에 독점적 정보 및 용도가 주장되는 서열은 Kv1.3 채널들에 영향을 끼치는 다른 펩타이드의 지식으로부터 나타나지 않았다. 본 발명은 완전히 구별되고 신규한 아미노산 서열을 (참조 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO:2) 보고한다. 결정된 서열이 정확하다는 것을 보여주는 다른 증거는 합성적으로 제조된 Vm24으로 얻어진 결과로부터 온다. 양쪽 천연 Vm24 및 합성적으로 제조된 것은 하기 나타나는 바와 같이 (실시예 9), 정확히 동일한 생리적 활동을 가진다.
5) 최종적으로, 이러한 두 가지 펩타이드로 발견된 중요한 다른 사실은 비교적 높은 농도 (20 그람 마우스 체중 당 10,000 마이크로그람)에서 실험 동물에 주입되었을 때 독성적이지 않다는 것이다. 이것은 우리가 다른 공지된 전갈 독 독소, 예를 들어, 이전에 언급된 바와 같은 Centruroides noxius에서 나온 Cn2와 비교할 때 더 중요한 것이다 [Zamudio 등, 1992]. Vm24 보다 800 배 더 적은 용량으로 마우스에 주입시 Cn2은 50% 사망률을 야기한다.
실시예 2: V. mexicanus의 독에 존재하는 성분의 질량 핑거 프린트 분석
전갈 독은 이온 채널 상에 활성적인 단쇄 및 장쇄 펩타이드 ([Possani and Rodriguez de la Vega, 2006]에서 리뷰), 자유 아민류, 뉴클레오타이드류, 탄수화물류, 지질류 (Possani 등, 1999에서 리뷰), 포스포리파제와 같은 효소류 [Zamudio 등, 1997: Valdez 등, 2004], 하이알루로니다제와 라이소자임류 [Batista 등, 2007] 및 많은 다른 미지 기능의 단백질 성분 [Diego-Garcia 등, 2007]을 포함하는 성분들의 매우 복잡한 혼합물이다. 추가로, 전갈들은 지표변 상에서 삼억년 이상을 진화해온 고대 생물이고 그들의 희생물을 사냥하기 위한 특이한 수단 또는 포식자로부터 그들 자신을 방어하기 위한 도구를 선택할 시간을 가졌다. 이러한 이유로, 드들 독에서 생물학적 활성 성분의 존재를 탐색하는 것이 받아들여지고 현명한 것이다. 최근의 질량 분광분석 방법론 및 장비 상에서의 진보 덕택에, 전체 독의 질량 핑거 프린트 분석을 얻는 것이 현재 가능해 졌다. 이러한 이유로, V. mexicanus 의 수용성 독으로 수행한 초기 연구들의 하나는 모든 성분의 분자량 확인이었고, 이는 Finnigan LCQDUO (San Jose, CA) 이온 트랩 질량분광분석기 (EIS/MS) 및 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption time of flight), Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)으로부터 구입한 모델 Ettan MALDI-TOF/Pro 기구를 사용하여 가능하게 되었다. 사용한 전략은 C18 역상 컬럼에서 혼합물로 용출하면서, HPLC 분리에 의해, 순수한 펩타이드들 또는 연관 성분의 족을 예비 선택하는 것이고 (도 1), 이 후, 이들의 분자질량을 질량 분광분석으로 분석하는 것이다. 표 1에, HPLC 시스템으로부터 수집된 분획물의 보유 시간이 수록되에 있고, 각 분획물에서 발견된 성분의 분자량이 적혀있다. 340 개가 넘는 구별된 분자량 성분을 결정하였다. 특정 성분들은 HPLC 분리 시스템의 두 개의 연속되는 부차 분획물에서 나타나고, 그러한 경우는 하나만을 계수하였다는 것을 밝힌다. 또한 특정 분획물은 동정되지 않았다 (ND 표지).
RT 평균질량 RT 평균질량
2.92 222.334, 260.168, 372.815 27.12 1340.203, 1642.177, 2620.029
5.06 272.055 28.24 2084.938, 2883.506, 3770.697
B 5.06 429.1 28.72 222.295, 373.089, 4037.264, 4062.469, 4860.475
7.40 - ND 29.12 2028.249, 4044.625, 4743.102
9.84 1235.349 S 29.82 1989.272, 2117.962, 3770.356, 3828.061, 4048.342, 5125.488
10.78 994.899, 1047.829, 1234.056 29.82 2368.289, 2514.764, 3772.141, 4131.437, 4196.231, 5612.061, 5684.0
11.28 117.063, 1234.349 30.62 1219.7, 2029.978, 2756.56, 4051.043, 5487.234
B 11.28 - ND 31.20 1894.409, 2288.761, 3544, 3695.567, 3873, 4053.615, 4623.314, 5309.113, 5468.43, 8340.499
13.07 300.703 31.71 2526.804, 4053.34, 4256.777, 4623.389, 8184.727
14 1466.168, 1960.937, 2363.969, 2441.293, 3091.036 32.22 2610.12, 3068.716, 4050.544, 4251.603, 4616.633, 8157.368
14.96 - ND 32.78 1727.988, 3115.418, 3838.78, 6231.008
15 272.091, 334.602, 427.197, 1086.902, 1689.2 33.47 1288.661, 1630.123, 1856.102, 2076.866, 2116.85, 2306.616, 3302.189, 4160.467, 4322.925, 5434.357, 6514.206, 7937.084, 8364.316, 9125.702, 15373.608
16.22 - ND 34.11 1811.589, 2792.828, 2890.806, 3272.21, 4008.728, 4044.677
16.70 324.238, 418.72, 501.4, 834.6, 1049.296, 1877.397 S1 35.79 3032.485, 3862.668, 7469.49
17.34 261.344, 1205.752, 1274.737, 1876.767, 1886.725 S2 35.72 2558.149, 3032.024, 3987.629, 4232,375, 8260.244
17.66 261.283, 1243.892 S3 35.79 3037.876, 3058.507, 3738.686, 4027.624
18.35 208.909, 223.509, 373.827, 1436.27, 1652.505 35.79 3038.075, 3738.649, 4027.696, 8269.386
19.10 1148.738, 2096.296, 2297.193, 2318.577, 2353.524 36.19 2814.497, 3038.868, 3564.677, 3721.56, 3807.978, 3878.666, 4027.936, 8267.094, 13944.696
B 19.10 2377.208, 2593.419, 2610.334 36.72 3588.529, 3610.297, 3625.895, 3983.521, 4020.726, 4223.762
20.14. 2593.88 46.53 3915.145, 4051.546, 4319.845, 4710.326, 4782.406, 4868.122, 5107.706, 7067.905, 13435.689
20.14.2 1464.42, 2098.654, 2594.163, 2610.477 46.86 3920.472, 4236.709, 5044.021, 5182.747, 8246.293, 11459.022, 13358.3, 16209.23
20.23 - ND 47.82 4298.5, 4700.818, 5272.777, 12469.982
20.96 1866.081, 3777.92 48.70 2166.644, 2304.621, 2569.271, 2768.228, 3278.62, 3424.448, 3819.497, 3916.217, 4265.672, 4292.422
21.98 431.4, 714.7, 1259.696, 3777.049 49 5953.928, 11315.991
22.40 533.5, 788.5, 2286.744, 4024.456, 4980.605 49.6 - ND
23.39 1014.47, 1129.8, 1390.042, 1527.099, 1902.299, 2111.018, 2228.143, 2311.791, 3665, 4025.1 50.75 - ND
S 24.11 1048.604, 1657.949, 2310.809 51.66 - ND
S 24.11 1048.604, 1657.949, 2310.809 52.34 - ND
24.11 1952.328, 2166.86, 3864, 5338.229 53.31 3460.978, 3807.741, 5673.486, 10978.726, 16185.602, 24611.234
B 24.11 253.04, 875.42, 1398.661, 1948.124, 2436.139, 2679.346, 5336.308 53.84 3548.378, 3591.69, 3899.344
25.10 1489.6 , 1511.315, 1617.7, 2529.512, 3864.577 54.27 - ND
25.10.2 253.073, 590.4, 1194.739, 1511.312, 1985.92, 2075.691 55.20 - ND
25.52 1485.399, 1728.229, 2258.489, 2387.001 56.27 1603.661, 1640.656
26.10 422.3, 462.4, 1327.008, 1495.436, 2258.772, 2620.03, 3870.226,3917.489 58.92 - ND
26.51 1234.369, 2621.099, 3871.574
볼드체로 표시된 성분들은 독에서 더 높은 농도로 있는 것이고, 이태릭체로 표시된 성분들은 EIS/MS 분광분석기 상에서만 오로지 확인된 것을 의미한다. 유지 시간에 문자 S가 선행하는 경우는, 크로마토그래프 정점이 대칭적이지 않고 수집된 분획물은 곡선의 상승 부분에 상응하는 반면 문자가 B인 경우에는, 곡선의 하강 부분을 의미한다. 이태릭체는 상응하는 분자량이 EIS/MS에 의해서만 얻어졌다는 것을 의미한다. 특정 수치는 결정되지 않았다 (ND).
표 1에 등록된 다양한 성분들을 분석하고, 500 Da 미만을 가지는 것들로 시작하여, 500-1000, 1000-2000 등으로 9000-10000 Da까지 임의 구분하였다 (각 군당 1000 차이). 확인된 성분의 90%이상이 분자량 10,000 Da의 분자질량을 가진다. 세 개의 군은 적어도 60 다른 성분을 가졌다. 이것들은 1000-2000; 2000-3000 및 3000 내지 4000 Da의 범위내에 속한다. 40 개가 넘는 성분은 4000 내지 5000 Da 분자질량은 가졌다.
이러한 결과들은 기능적 분석에 적절한 펩타이드를 선택하는 데 중요하다. 사용된 논거는 Tityus stigmurus 전갈을 사용한 우리 연구진에 의한 최근 논문에 논의 및 발표되어 있고 [Batista 등, 2007], 여기서, 상이한 종의 전갈 (V. mexicanus는 포함되지 않음)의 다양한 질량 핑거 프린트를 고려하여, 비교 분석을 실시하였다. 약 4,000 Da의 분자량을 가지는 펩타이드들은 K+ 이온에 투과성인 이온 채널들을 인식하는 데 특이적이라는 것을 공통적으로 발견하고 있다. 이러한 이유로, 우리는, 후술하는 바와 같이, 생리학적 연구에 이러한 범위의 분자량을 가진 펩타이드를 선택하였다. 이러한 전략을 따르면서, 두 개 펩타이드: Vm23 및 Vm24를 일차 구조 결정에 선택하였고 (도 2) 추가의 생리적 분석을 실시하였다 (실시예 7-10 참조).
실시예 3: Vm23 및 Vm24의 C-말단 아미노산 서열의 특성분석
Vm23의 C-말단 아미노산 서열에서의 말단 잔기에 관하여는, 결과가 명확하다. 그 서열이 도 2에 도시된, 본 개시물의 실시예 1에서 설명된 서열 분석은 마지막 잔기가 아미드화되지 않고 자유 카르복실 시스테인 잔기를 가지는 일차 구조로 종지된다는 의심의 여지가 없다.
그러나, Vm24에 대해서, 질량 분광분석 결과는 C-말단 잔기가 아미드화될 수도 있다는 것을 암시하고 있다. 문헌에 따르면, 주어진 펩타이드의 마지막 아미노산의 아미드화가 그 생물학적 기능을 정의하는 데 중요한 예가 보고되어 있다. 그러한 한 예는 전갈 Heterometrus spinnifer 의 독신 HsTx1에 대하여 발견된 경우이다 [Lebrun 등, 1997]. 전기생리학적 실험으로, 이러한 독소의 아미드화 형태가 자유-카르복실 말단 형태보다 5 배 더 강력하며, 래트 뇌 시냅토좀으로의 결합 시험에서 300 배 더 활성적이다는 것이 증명되었다 [Lebrun 등, 1997]. 이러한 이유로, Vm24의 마지막 잔기의 화학 형태를 확실히 하는 것은 매우 중요하다. 실시예 1의 논의에서 언급된 바와 같이, Vm24에 대해 측정된 실험적 분자 질량은 3864 Da이었고, 도 2에 나타난 아미노산 서열로부터 예상되는 이론적 분자량은 3864.6 Da이었다. 상기 두 가지 수치는 0.6 a.m.u 만큼 차이나며 이것은 Vm24의 아미드화된 C-말단 잔기의 존재에 기인될 수 있다. Arg-C 절단에 의해 생성된 C-말단 펩타이드 (909.4 a.m.u.-모노동위원소성 질량)로 수행된 충돌 유도 해리 (CID) 실험은 자유 카르복시-말단 펩타이드에 이론적으로 예상되는 것보다 1.0 a.m.u. 더 낮은 모든 y 이온 시리즈 값 및 b 이온 시리즈에 대해서는 들어맞는 값을 보이며, 이는 독소의 C-말단이 아미드화된 것을 확인하는 것이다 (도 3).
이러한 실험에, Vm24의 25 마이크로그람 단백질 분획물들을 실시예에서 설명된 절차에 따라서 효소 Arg-C로 절단하였다 [Valdez 등, 2004; Batista 등, 2007]. 효소 가수분해의 생성물은 도 1에 설명된 바와 동일한 시스템에서 HPLC로 분리하였다. 동종 형태로 있는 모든 펩타이드들을 MS로 체계적으로 분석하였고, 909.5 a.m.u.의 분자질량을 가진 펩타이드를 MS/MS 분석하였다. 질량 분광분석기의 나노 스프레인 이온화 소스에 맞춘 실험 절차는 가열 모세관에 대하여 130℃ 및 스프레인 전압으로 1.65 kV를 정하였다. 50% 아세토니트릴 (AcCN) 을 선형 모드로 사용하여 0.6 마이크로리터/분으로 Surveyor 용매 전달 시스템을 구동하였다. MS/MS 스캔물들을, 주사 시간을 200 스캔/밀리초로 하고, 광대역을 활성화시키고, 25 V 충돌 에너지, 1.0 (m/z) 분리 너비 및 40% 정상화 충돌 에너지로 하여 규정하였다. 데이터를 수동으로 및 캘리포니아-샌프란시스코 주립대학 질량 분광분석 기관 (University of Califonia-San Francisco Mass Spectrometry Facility)에서 개발한 Protein Prospector의 MS-생성물 도구를 사용하여 자동으로 분석하였다 (http://prospector.ucsf.edu/). 상기 MS-생성물 조구는 모노동위원소 질량, 비변형 시스테인 및 차단되지 않은 N-말단 잔기를 사용하여 펩타이드 KCKCYYC에 대해 생성된 가능한 이온 분할물을 계산할 수 있게 한다. 계산은 상기 자유 카르복실산 말단 및 아미드화 C-말단 펩타이드 양쪽에 대하여 수행하였다. ESI 이온 트랩 기기를 이러한 평가에 선택하였다. 상기 Protein Prospector를 사용하여 아미드화된 C-말단 펩타이드의 이론적 분할화를 수행하여, b 에 대하여 실험적으로 얻은 것(232.11, 360.21, 463.22, 626.28 및 789.34) 및 y 이온에 대하여 실험적으로 얻은 것 (782.27, 679.26, 551.16, 448.15, 285.09 및 122.03)과 정확히 동일한 값을 나타내었다. 그러므로, Vm24 펩타이드는 C-말단 아미드화, 즉 시시테인아미드 잔기를 보유하고 있다.
실시예 4: Vm24 의 디설파이드 다리의 결정
작은 크기로 인해, Vm24 독소는 구조-기능 관계를 연구하는 데 이상적인 분자이다. 상기 펩타이드는 위치 6,12,16,21,26,31,33 및 36에 위치한 8 개의 시스테인 잔기를 포함하여, 이들은 4 개의 분자내 디설파이드 결합을 형성한다. 본 실시예는 단백질분해 효소로 절단한 후 RP-HPLC 컬럼으로 정제한 펩타이드들의 에드만 분석 및 질량 분광분석 결정을 사용하여 디설파이드 결합 패턴을 결정하는 것을 설명한다.
디설파이드 짝은 순수 독소를 엔도펩티다제 절단하고 HPLC로 분리한 후 얻은 펩타이드 분획물을 질량 분광분석으로 결정되었다. 단백질의 25 마이크로그람을 포함하는 독소의 샘플을 키모트립신 및 트립신(Boehring Manheim, Germany) 의 동일한 혼합물 (0.5 마이크로그람 각각)을 함유한 150 mM Tris-HCl, pH 6.8와 12 시간 37℃에서 항온처리하였다. 생성된 펩타이드들을 C18 역상 컬럼 (카탈로그 번호 218TP54, Vydac 사 제품, Hisperia, CA)을 사용하는 HPLC로 분리하였다. 용매 A (0.12% TFA 함유 수용액) 에서 60% 용매 B (0.10% TFA를 함유한 아세토니트릴)까지의 선형 구배를 상기 컬럼에 적용하고 60분간 구동하였다. 유출 피크물들을 수집하고 즉시 동결건조시켰다. 개별 펩타이드들을 질량 분광분석 분획화로 분석하였고, 이로부터 아미노산 서열을 얻었다. 일차 구조가 알려졌기 때문에, 디설파이드 다리의 임무가 추정될 수 있었다.
Vm24의 환원 및 산화된 형태를 분자 질량 비교하면, 정확히 8 a.m.u. 차이를 보인다; 천연 펩타이드에 대해 발견된 실험적 분자량은 3864.0 a.m.u. 이었고 및 완전히 환원된 펩타이드에 대해서는 3872 a.m.u이었고, 이는 모든 시스테인들이 디설파이드 다리 형성에 관여한다는 것을 확인하였다. 세 개 주된 펩타이드 분획물을 pH 6.8에서 (혼합물 디설파이드 재배열을 방지하기 위해 약간 산성 pH) 키모트립신과 트립신으로 동시 절단으로부터 얻고, 이는 [M+H]+ 788.0, [M+H]+ 560.4 및 [M+2H]2+ 1099.7 a.m.u. (도 4-1, 4-2 및 5A)의 모노동위원소 분자질량을 나타낸다. [M+H]+ 788.0을 가진 펩타이드는 정확이, 이종이량체 아미노산 서열 AQGCK-CY의 시스틴 쌍 (C4-C8)의 예상된 분자량과 정확히 상응한다 (도 4-1). 결정된 두 번째 디설파이드 다리는 이론적 및 실험적으로 동일한 560.4 a.m.u.의 수치를 가지는 C3-C6 였다 (도 4-2). 양 쪽 펩타이드들은 CID 실험으로 더 특성 분석되었고, 예상된 아미노산 서열을 나타내었다. m/z [M+2H]2+ 1099.7 a.m.u.에서의 신호 (2197.4 풀어진 질량) 는 마지막 두 개 시스틴 쌍을 포함하는 이종이량체 중심체로부터 온다 (도 5A). 이러한 단편을 직접적으로 분석하였다. m/z [M+2H]2+ 1099.7 에서의 신호로부터 나온 CID 이온 시리즈는 상기 마지막 두 개 시스틴 쌍의 완전한 결정을 위한 조건을 만족시키는 두 개 이온 값을 나타내고 있다. 글루탐산 (E11)과 시스테인 (C12) 사이의 동일한 아미드 결합 절단으로부터 나온 생성물인 1507.4에서의 b 이온 및 691.3에서의 y-이온은 C1-C5 및 C2-C7 쌍을 명확하게 나타낸다. 더구나, b-이온1710.5 내지 b-이온 1137.3의 직렬 단편화 값은 내부 태그 (GSPEC-C)를 특징짓고 명확한 질량값은 디설파이드 다리 배열을 확인하고 있다 (도 5B에서 도식적으로 표시).
실시예 5: Vm24의 화학적 합성
본 실시예에서 및 Vm24의 화학적 합성을 설명하기 전에, 펩타이드 화학의 주제 및 기존재 생성물의 천연 추출에 의하기 보다는 화학 합성에 의한 리간드 생성에 대한 논거에서 기본 개념을 다루는 것이 중요하다.
많은 독성 폴리펩타이드들이 독 원천으로부터 정제되었고, 및 이들은 수용체들 (전갈 독소의 경우 대부분 이온-채널들)에 결합함으로써 생물학적 막에 걸쳐 존재하는 이온 분포에 영향을 끼치고 및 막에 걸쳐 전위의 세포 탈분극 또는 조절을 야기하여, 이러한 방식으로 세포 기능을 조절하기 때문에, 세포 교신을 연구하는 가치있는 도구임이 밝혀졌다. 이러한 이유로, 이온 채널의 뚜렷한 유형 또는 아형을 구별할 수 있는 특수 독성 펩타이드를 발견하는 것은 실험 동물의 일정 범위의 생리적 또는 비정상적인 상태를 치료하는 데 및 결국 인간 병리를 치료하기 위한 가치있는 치료 모범이 된다. 공지된 펩타이드들 대부분은, 다른 유기 화합물에 비해, 높은 효과, 좋은 타겟 특이성, 높은 용해성 및 활동의 빠른 개시 등과 같은 일련의 장점을 제공하는, 짧고, 잘 폴딩되고 및 밀집된 구조를 이다. 더구나, 이것들은 몇 개의 디설파이드 다리로 가교된 작은 단백질들이다. 이러한 구조적 특성은, 비록 합성적으로 제조한 유도체들의 정확한 폴딩이 적절한 합성에 어떤 추가의 문제점을 더하지만, 이러한 펩타이드들에게 고도의 안정성을 부여한다. 그러나, 이러한 독 원천에 존재하는 이러한 폴리펩타이드의 양은 항상 매우 작다. 실제로, 이들은 생리적 활동에서 매우 특이적이고 효율적이기 때문에, 이러한 펩타이드를 생성하는 동물들은, 그들의 희생물을 포획하든지 또는 포식자로부터 자신들을 보호하기 위해서든지 간에, 이들을 효과적으로 사용하기 위해 많은 양을 생성할 필요가 없다. 비록 상기 원천으로부터 직접적으로 분리한 이러한 다양한 펩타이드들의 양이 활동의 일반적인 기작을 특성분석하기에 충분하고 및, 과거에는, 주로 핵자기 공명 기술에 의해, 상기 펩타이드의 구조적 분석을 시행할 수 있었다고는 하지만, 일상적으로, 조사 또는 임상 적용에 의해 추구되는 범위에 따라서, 동일한 펩타이드 또는 이들의 유도체를 합성적으로 생성하는 것이 필요하다. 상기 펩타이드의 삼차원 구조를 결정하는 것 및 수용체 편 (이온 채널)의 인식에 관계하는 표면을 동정하는 것은 시초 모델의 변형된 버전을 디자인하기 위해 또는 펩티도의태체들의 합성을 위해 기본이 되는 것이다.
여기서, 우리는 Vm24의 화학 합성을 설명한다. 역사적으로, Vm24는 Vm23보다 더 일찍 동정되었다. 이러한 이유로, 본 발명의 주제인, 상세한 작업의 대부분이, Vm24의 경우에 대하여 행해졌고 설명되었고, 그 후 양쪽 펩타이드에 대하여 진실임을 확인하였다.
Vm24의 선형 유사체는 Rink Amide MBHA 수지 (Calbiochem-Novabiochem Corp) 상에서 고상 방법으로 합성되었다. Fmoc-아미노산들 (Calbiochem-Novabiochem Corp)을 하기 측쇄 보호에 사용하였다 Arg(Pbf), Asn(Trt), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Lys(Boc), Ser(tBu), 및 Tyr(tBu).
Fmoc 기는 20 % 피페리딘을 포함하는 디메틸포름아미드 (DMF)로 20 분간 처리하고, DMF로 세척하여 제거되었다. Fmoc-아미노산류 (0.5 mmol)는 DMF에서 미리 형성된 활성 에스테르로서 활성화 제제로서 HBTU (2-(1-H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트)/DIEA (디이소프로필에틸아민) (0.45mmol/0.75mmol, 2 분 활성화)와 짝지워졌다. 커플링 시간은 30 분이었다. 미반응 또는 탈블록된 자유 아민류는, 펩타이드 합성의 모든 주기마다 닌히드린 시험 (Sarin et al 1981)으로 관찰하였다. 전체 합성 중에, 다음 아미노산을 커플링하기 전, 바람직하지 않은 잔류 자유 아민류를 아세틸화로 차단시켰다. 모든 작동은 테플론이 안에 대어진 나사 캡을 가진 50 ml 유리 반응 용기 내에서 수동으로 시행되었다. Nα-탈보호 및 커플링 단계 중에 부드럽게 뒤집어서, 펩타이드-수지를 흔들었다.
Fmoc-기의 최종 제거 후, 상기 펩타이드 수지 (1.7 그람) 을 수지로부터 절단하고 동시에 시약 K [Drakopoulou et al 1995] 를 사용하여 실온에서 두 시간 탈보호시켰다. 절단 후, 조 펩타이드를 빙냉 t-부틸 에테르로 침전 및 세척하고, 20% 수성 아세트 산에 용해시켰다. 생성물을 동결건조시키고 사용시까지-20 ˚C에서 건조 보관하였다.
분자의 상응하는 디설파이드 다리를 만드는 고리화 반응을 0.1 M NaCl, 5 mM 환원된 글루타치온, 0.5 mM 산화된 글루타치온, 20 mM Na2HPO4 (pH 7.8) 및 30 μM 미폴딩된 합성 Vm24 내에서 수행하였다. 고리화된 조생성물을 HPLC로 이단계 정제하였다. 처음은 용액 A (0.12% TFA를 포함하는 물)부터 용액 B (0.1% TFA을 포함하는 아세토니트릴)의 구배가 60분 내에서 60% B까지 구동되는 C18 예비 컬럼 (238TP1022 Vydac)을 사용하였다. 얻은 크로마토그램의 프로필이 도 6에 도시되어 있다. 주요 성분 (도 6에서 숫자 1로 표시)를 C18 분석 컬럼 (218TP54 Vydac)을 사용하여 용매 A부터 40% B까지의 선형 구배로 60 분내에 구동시켜서 최종적으로 정제하였다 (도 6의 삽입도). 합성 독소의 구조 및 순도를 분석 HPLC, 아미노산 서열 및 질량 분광분석 결정으로 확인하였다. 아미노산 서열화는 Beckman LF3000 단백질 시퀀서 (Fullerton, CA)에서 수행하였고 질량 분광분석은 FinniganLCQDuo 분광기 (San Jose, CA. USA)에서 행하여졌다. 아미노산 서열의 정확성은 잔기 30까지를 직접 에드만 분해분석으로 증명하였다. HPLC 컬럼으로부터의 용출 시간은 동일한 조건에서 같은 컬럼으로부터 천연 펩타이드가 용출되는 시간과 정확하게 일치하였다. 천연 Vm24 (도 7A), 여기서 설명된 바와 같은 합성 Vm24 (도 7B) 및 천연 및 합성 Vm24의 동일 몰 혼합물(도 7c)로 얻은 용출 패턴의 예가 도 7에 도시되어 있다. 질량 분광분석으로 얻은 분자 질량은 3864 Da이었고, 이는 예상된 서열의 것과 정확하게 상응함을 나타내었다. 사용된 수지는 Vm24의 경우에서와 정확하게 일치하게, C-말단 아미드화 펩타이드의 생성에 고안된 것임을 밝힌다.
Vm24의 예상된 일차구조를 가진 합성적으로 제조한 펩타이드를 포함하는 수지의 약 1.7 그람으로부터, 정확하게 폴딩된 펩타이드 약 300 밀리그람을 얻어서, 이론적 예상 수치 (출발 수지로부터) 30%의 수율을 나타내었다.
실시예 6: 아미노산 서열 비교
SEQ NO: 1 및 SEQ NO: 2의 서열은 짧은 펩타이드 사슬, 염기성 아미노산 잔기가 많은 것, 및 유사한 시스테인 패턴과 같이, α-KTx 족 내에 분류된 다른 짧은 사슬 전갈 독소 [Tytgat 등, 1999]와 유사점을 나타낸다. 이러한 족의 모든 구성원은 구조적으로 관련이 있고 칼륨 채널 차단체로서 유사한 기능을 수행한다; 그럼에도 불구하고, 그들은 칼륨 채널들의 특정 유형 및 아형에 대하여 다양한 선택성를 나타낸다 [Rodrㅽguez de la Vega and Possani, 2004; Panyi 등, 2006]. 그러한 분류를 제안한 국제적 전문가 패널에 의해 지지되는 논거는 주어진 아족은 그들 구성원 간에 높은 비율의 유사성과 다른 아족 구성원과의 낮은 일치도에 의해 확인될 수 있어야 한다는 것이다 [Tytgat 등, 1999]. 후에, 이러한 구별은, 어느 정도, 대부분 아족의 약학적 스펙트럼을 반영하는 것으로 증명되었다 [Rodrㅽguez de la Vega 등, 2003; Zhu 등, 2004]. 따라서, 족의 상대적으로 제한된 다양성을 고려할 때-이의 환원된 크기로 인하여-, 주어진 기능적 스펙트럼을 부여하는 분자 및 구조 특성을 동정하는 것이 중요하다. 이러한 종류의 분석은 통상 서열 비교 및 계통학적 추론에 의해 수행된다. 이러한 비교의 근간을 이루는 생각은 동일한 계통에 속하는 그러한 단백질들은 선조 유전자(들)의 복제 및 분기 후에 또는 동시에 종분화의 사건과 연관되었을 것이라는 가정하에 세워진 것으로, 생체정보적 분석에 의한 그들 진화적 역사을 재구성하는 것이 가능하게 되고 주어진 서열 공간 내에서 적합도 경관(fitness landscape)을 정화하는 데 도움을 준다 [Thornton and DeSalle, 2000; Orengo and Thornton, 2005].
국지적 배열 (BLAST [Altschul 등, 1990] 및 FASTA 3 [Pearson and Lipman, 1988])내에서 Vm24 및 Vm23의 서열 유사성을 확인하기 위해 발견적 (heuristic) 탐색을 수행하는 프로그램을 사용하여, 연관점을 거의 확인하지 못하였고 기대치가 낮았다 (E-값 >10-5). 현재 보고된 모든 짧은 사슬 독소에 대하여 좀 더 면밀한 조사를 실시하여, Vm24 및 Vm23은 α-KTx 아족 6의 가능성있는 신규 구성원이라는 것을 제시하게 되었다 ([Tytgat 등, 1999]의 제안에 따라서). 대 (pairwise) 비교는, 그러나, 상기 아족의 다른 구성원과 낮은 동일성을 보였다 (도 8). α-KTx 족의 방대한 서열 분기화는 Vm24 및 Vm23이 20 개의 이전에 특성화된 α-KTx 아족에 속하는 것인지를 해독하는 것을 매우 어렵게 한다. α-KTx 족과의 관계를 명확하게 하기 위해, 베이지언 (Bayesian) 계통발생학적 추론 분석을 α-KTx 족에 속해 있는 92개 서열들의 다중 서열 배열을 사용하여, MrBayes 3.04b [Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist and Huelsenbeck, 2003]을 수단으로 이전에 설명된 바와 같이 [Bagdany 등, 2005] 수행하였다. 베이지언 계통발생학적 추론은 확률적으로 생성된 계통도에 걸쳐 마코프(Markov) 사슬 몬테 칼로(Monte Carlo) (MCMC)에 기초한 샘플링 방식에 따라 주어진 계통도 위상의 후속 가능성을 계산한다. 하나의 마코프 사슬은, 샘플링 절차의 주어진 단계에서 가장 좋은 후속 확률로 계통도 위상 내에서 발견적 탐색을 하는 것으로 있게 된다; 특정화된 아미노산 치환 모델하에서 평가된다 (전체 과정을 메트로폴리스(Metropolis) 커플링 마코프 사슬 몬테 칼로 또는 MC3로 지칭된다). 이러한 분석에, 각각 250,000 계통도를 가진 4 개 사슬을 JTT 아미노산 치환 모델 하에서 발생하였고 매 250번째 반복마다 샘플처리되었다. 175,000 반복에서 융합된 것을 얻었고, 가장 좋은 후속 확률을 가진 나머지 250개 계통도를 합병하여 50% 다수결 합의 계통도를 계산하였다. 이러한 계통도는 α-KTx 아족 6이, 최종 계통도 세트의 92%로, 그의 모든 구성원 및 아족 7로부터 나온 두 개 밀접하게 연관된 독소를 포함하는 단일계통적 군으로서 분리된는 것을 명백히 나타내고 있다. 이러한 분석은 또한 Vm24 및 Vm23를 이러한 단계통군 (clade)의 자매 군으로서 둔다 (특정 분할구역은 최종 계통도의 81%로 만연됨. 도 8 참조); 이는 Vm24 및 Vm23이 신규한 α-KTx 아족을 구성하는 것을 강력하게 지지한다. 이러한 분석에 기초하여 및 K 채널들에 특이적인 전갈 독소를 분류한 국제적 전문가 패널에 의해 제시된 가이드라인을 고려할 때 [Tytgat 등, 1999], Vm23 및 Vm24이 K 채널들을 인식하는 전갈 독소의 신규 아족을 구성한다는 것이 확실하다. 이러한 독소들 간의 가장 높은 서열 동일성은, 다른 K 채널 차단체 아족과 같이, C-말단 부에 위치한다. N-말단 부분은 이러한 아족의 가장 가변 부위이고 오직 Vm24 및 Vm23만이 상기 서열의 시작에서 비범한 삼중 알라닌 부분을 제공하고 있다.
실시예 7: Vm24는 T 세포의 Ca 2+ 활성화 K 채널 hIKCa1보다 전압 관문 hKv1.3 채널을 선택적으로 차단한다
Vm24에 의한 hKv1.3 채널의 고친화도 차단
Vm24에 의한 hKv1.3 채널들의 차단은 인간 말초 혈액 T 세포에서 내재적으로 발현되는 채널에서 특성분석된다 [Peter 등, 2001; Bagdany 등, 2005]. 전기생리학적 실험용으로T 세포를 얻기 위한 방법의 간단한 설명이 다음과 같다. 헤파린 처리된 인간 말초 정맥혈을 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리로 분리하였다. 수집된 세포를 Ca2+ 및 Mg2+이 없는, 25 mM HEPES 완충액 (pH 7.4) 함유 한스 용액(Hank's solution)으로 두 번 세척하였다. 세포를 10% FCS/Hyclone (Logan, Utah, USA), 100 마이크로그람/ml 페니실린, 100 마이크로그람/ml 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640 배양액을 담고 있는 24-웰 배양 플레이트에 0.5 x 106/ml 밀도로 분주하고 37 ℃에서 3-4일간 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액은 또한 피토헤마글루티닌 A (PHA-P, Sigma-Aldrich Kft, Hungary) 를 6 또는 8 마이크로그람/ml 함유하여 K 채널 발현을 증가시켰다 [Deutsch 등, 1986]. Matteson 및 Deutsch (Matteson 등, 1984)에 의해 설명된 바와 같이, 마우스 항-인간 CD2 (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) 로 처리 후, 염소 항-마우스 IgG 항체 (Biosource, Camarilo, CA, USA)로 코팅된 페트리 디쉬에 선택적으로 부착하여 T 임파구를 전류 기록용으로 선택하였다. 디쉬를 패치-클램프 실험용 정상적인 세포외 욕조 배지 (하기 참조) 1 ml로 5 번 부드럽게 세척하였다.
전체-세포 전류를 Axon Digidata 1200 또는 Digidata 1322A 데이터 획득 하드웨어를 사용하는 개인용 컴퓨터에 연결된 Axopatch 200A 또는 Multiclamp 700B 증폭기를 사용하여 전압-클램프 T 세포에서 측정하였다. 85%까지 직렬 저항 보상을 사용하여 전압 에러를 최소하시키고 양호한 전압-클램프 조건을 달성하였다. 데이터 획득 및 분석을 위해, pClamp8 또는 pClamp9 소프트웨어 패키지 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA)를 사용하였다. 분석전에, 전체 세포 전류 자취를 옴 누설용으로 교정하고 디지털적으로 여과하였다 (3 점 박스카 평활화 (boxcar smoothing)). 고도의 전류 차단에서 정점 전류를 결정하는 것은 상승하는 성분의 증폭을 분리하기 위해 독소가 없는 상태에서 결정된 것에 시간 상수를 고정시킨 상황에서, 상승하는 4 지수 함수를 데이터 자취에 맞춤으로써 [Hodgkin-Huxley model] 수행된다.
피펫을 Clark GC 150 F-15 보로실리케이트 모세관으로부터 5 개 단계로 잡아 당기고 불로 매끄럽게 하여, 욕조에서 불로 2-3 메가 옴 저항을 가지는 전극을 만들었다. 욕조 용액은 (mM 단위로): 145 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2.5 CaCl2, 5.5 글루코즈, 및 0.1 mg/ml 우혈청 알부민 (Sigma)으로 보충된 10 HEPES (pH 7.35)로 구성되었다. 외부 용액의 측정된 몰삼투압 농도가 302와 308 밀리삼투몰 (mOsm) 사이이다. 피펫을 채운 용액 (내부 용액)은 (mM 단위로): 140 KF, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 및 11 EGTA (pH 7.22)로 구성되었다. 상기 내부 용액의 측정된 몰삼투압 농도는 약 295 mOsm이었다. 측정된 세포 주위로 상이한 시험 용액으로 욕조 관류하는 것은 6 개 입력 라인을 갖춘 중력-유동 관류 장비 및 플랜지된 구멍이 있는 PE10 폴리에틸렌 튜브 출력 팁을 사용하여 수행하였다. 잉여 유체를 완전히 제거하였다.
T 세포에서의 전압 K+ 전류를 불러내는 표준 전압 프로토콜은 -120 mV의 홀딩 전위에서부터 +50 mV로의 일련의 14-ms-길이 탈분극으로 구성된다. 전위 펄스 간의 시간은 15초로 맞추어서 hKv1.3 채널들의 누적 비활성화를 피하고자 하였다. 정상적인 욕조 용액내의 대표적인 전류 자취는 도 9A에 나타나 있다 (대조군). 적용된 실험 조건 (피펫 충전 용액에서의 Ca2+ 결여 및 전압 프로토콜의 본질)하에서, 전체-세포 전류는 hKv1.3 채널들에 의해서 독점적으로 수행되었다 [Peter 등, 2001]. 도 9A는 관류에 의해 1 nM Vm24를 외부 용액에 추가하기 전 (대조군 자취) 및 한 후에, 동일 세포에서 순차적으로 기록된, hKv1.3 채널들을 통한, 거시적 K+ 전류를 나타내고 있다. Kv1.3 전류는 1 nM Vm24 존재하에서 12번째 펄스 (3 분에 해당)에 의해 완전히 사라졌다.
1 nM (막힌 원) 및 0.3 nM (빈 원) Vm24 농도에서의 차단의 발전과정이 도 9B에 도시되어 있다. 대조군 용액에서의 4 번째 펄스 후에, 상기 세포외 관류는 독소 함유 용액으로 바뀌었고, 탈분극 펄스는 매 15초마다 연속되었다. 정점 전류를 결정하고, 대조군 용액에서의 정점 전류에 표준하하고, 시간의 함수로 그래프화하였다. 상기 도면은 더 높은 독소 농도에서, 독소 및 상기 채널 간의 가성-일차 지수 반응으로 예상되는 바와 같이 차단의 발전 과정이 더 빠르나, 양쪽 독소 농도에서는 전체 세포 Kv1.3 전류의 완전 차단이 이뤄진다. 1 nM Vm24 농도에 대한 데이터는 도 9A에 도시된 실험으로부터 나온 것이다. 기록 챔버를 무독소 대조군 용액으로 관류하면, 처음 8 분 내에 차단이 매우 작게 풀리는 결과를 나타낸다 (미도시). 독소를 3 pM 농도에서 10.5 분간 적용하는 동안 (도 9C), 전류의 손실은 대조군 용액에서 작성된 정점의 ~36%에서 포화되는 것으로 나타난다. 이러한 기간은 30분간 유실 (washout) 기간이 뒤따르고 (화살표는 무독소 용액으로 관류를 시작한 시점을 가르킴), 이 동안 차단된 전류의 삼분의 일이 매우 느린 과정으로 회복된다 (유실에 대한 추정된 시간 상수는 ~3800 초이고 ~2.6x10-4 s-1의 오프율 (off rate)에 상응한다).
전갈 독소가 K 채널들을 차단하는 일반적인 기작은 채널의 세포외 전실부에 결합할 때 이온 전도 경로를 막는 것이다 [Goldstein and Miller, 1993]. Vm24 존재 하에서, 전류 감소의 느리고 불완전한 가역성은, 그러나, hKv1.3의 차단이라기 보다는 막 상의 펩타이드의 비특이적 효과를 나타내는 것일 수 있다. 우리는 이러한 시나리오에 하기와 같이 반론을 제기하고자 한다: 1) 전류 손실의 발전에 대한 속도는 (높은 독소 농도에서), Vm24의 농도에 의존하며, 이는 더 높은 독소 농도에서는 더 빠르다 (도 9B); 2) 누설 전류는 옥소의 존재하에서 증가되지 않으며, 이는 Vm24에 의한 막의 일반적인 손상이 결여되어 있는 것을 나타낸다; 3) Vm24은 몇 개의 다른 K+ 전류를 저해하지 않거나, 이들을 빠르고 가역적으로 저해하였고 (후속의 독소의 선택성 그래프를 참조), 이는 혈장 단백질의 구조 상에 독소가 비특이적 활동을 한다는 것 또는 일반적으로 막 단백질의 기능을 독소 유도로 손실하게 한다는 것에 대한 매우 강력한 반박이다; 4) Kv1.3의 공지된 공극 차단체인 ChTx 및 Vm24을 동시에 적용하면, 동일한 결합 부위에 대하여 두 개 독소 간에 경쟁을 나타내며, 이는 ChTx의 농도를 높임에 따라 Vm24의 차단 역학이 느리게 되는 것에서 명백하다 (데이터 미도시).
용량 응답 관계의 일반화에 제한점을 부여하는 상기 독소의 매우 느린 온-오프 속도가 도 9의 패널 D에 도시되어 있다. 일반적으로, 상이한 펩타이드 농도에서 채널의 평형 차단에 대해, 잔류 전류 분획 (RCF) 는 I/I 0 로 계산되고, 상기 식에서, I 및I 0 는 각각 독소의 존재 및 부존재 하에서 기록된 정점 전류이다. 낮은 펩타이드 농도에서 매우 낮은 온 (On) 속도로 인하여, I 의 결정이 문제가 되는 데 이는 삽화-대-삽화 (episode-to-episode)로부터의 정점 전류의 하락이 적어서, 비록 차단이 그의 평형 상태에 아직 도달하지 못하였지만, 가시적인 포화가 데이터 수집 중에 관찰된기 때문이다. 더 길게 독소를 적용하게 되는 것은 전체-세포 패치 클램프 기록에서 정점 전류의 안정성에 의해 제한된다. 더구나, 정점의 런다운(rundown)은 펩타이드의 극도로 긴 유실 시간으로 인하여 독립적으로 결정하지 못할 수 있었다. 따라서, 도 9D에 제시된 데이터는 상이한 독소 농도에서 I/I 0 값에 대하여 상단 한계치를 보이고, 따라서, 용량-반응 관계로부터 추정되는 Kd는 또는 실제 Kd을 과추정한 것이다 도 9D에서의 용량-반응 관계는 RCF = Kd n / (Kd n + [Tx]n) 함수와 들어 맞고, 여기서 [Tx]는 독소 농도를 나타내고, Kd 는 해리 상수이고, 및 n은 Hill 계수이다. 이중으로 포개진 실선은 변수 Kd= 2.9 pM 및Hill 계수 ~1과 가장 잘 들어 맞는 것을 나타낸다. 에러 막대는 SEM (n = 3-6)를 표시한다. Hill 계수에 대한 n~1 값은 단일 독소 분자가 채널과 상호작용하는 것을 나타낸다 (1:1 화학양론). 우리가 아는 한, Vm24은 전기생리학 분석에서, hKv1.3의 차단체로서 최고의 친화도를 가진다.
Vm24은 hIKCa1 채널들의 저친회도 차단체이다
실시예 7에 대한 개론에서 개괄된 바와 같이, 펩타이드가 선택적인 면역억제제가 되는 데 가장 중요한 요구 사항 중 하나는 IKCa1를 넘어서는 Kv1.3에 대한 선택성이다. IKCa1 채널들은 또한 T 세포에서 내재적으로 발현되어 있다 [Grissmer 등, 1993]. IKCa1 채널들에 의해 전달되는 전류는 이러한 채널을 완전히 활성화시키는 데 충분한, 1 μM 무Ca2+ 농도를 가지는 피펫 충전 용액을 사용하여 측정될 수 있다 [Grissmer 등, 1993]. 그러나, 동일 세포에서의 이러한 Kv1.3 채널들이 동시에 존재하기 때문에, IKCa1 채널들의 약학적 특성분석이 어렵게 되며, 연구가 Kv1.3 채널들이 활성화되지 않는 막전위로 제한된다 [Grissmer 등, 1993; Bagdany 등, 2005]. 심지어 자극된 T 세포에서도 비교적 적은 수의 IKCa1 채널로 인해, 재조합 채널들을 이용하여 IKCa1 약학 연구하게 되었다.
제조사 방식에 따라서 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 EGFP-표지된 인간 IKCa1 유전자 (AF033021)를 Cos-7 세포로 형질전환시켰다. EGFP-표지된 hIKCa1 클론은 이전에 T 세포에서 천연 IKCa1와 동일한 생체물리 및 약학 특성을 가지는 것으로 나타났고, 따라서, 약학 연구에 광범위하게 사용되어 왔다 [Wulff 등, 2001]. Cos-7 세포를 표준 세포 배양 조건에서 유지시켰다 [Bagdany at al, 2005]. 형질전환 후 2-3일에 전류를 기록하였다. GFP 양성 형질전환체는 Nikon TE2000U 형광 현미경에서 확인되었고 전류 기록에 사용되었다. 정상적인 세포외 용액은 전술한 바와 같다. 피펫 충전 용액의 조성은 (mM 단위로) 150 K-아스파테이트, 5 HEPES, 10 EGTA, 8.7 CaCl2, 2 MgCl2, (pH 7.2)이었다. 이 용액은 1 μM 자유 Ca2 + 농도를 함유하여 hIKCa1 전류를 완전히 활성화시켰다. 모든 다른 기록 조건들 (데이터 획득, 관류 등)은 Kv1.3 채널들에 대해 상기 설명한 것과 동일하였다.
-120 mV의 홀딩 전위로부터 -120 mV 에서 +50 mV까지의 이백밀리초 길이 전압 상승을 사용하여 Cos-7 세포에서 hIKCa1 전류를 이끌어 냈다 (상승 속도 0.85 mV/ms). 전압 상승은 매 10초마다 실행하였다. 도 9E에 나타난 Vm24의 부재에서 기록된 전류 자취 (대조군)는 순수한, 비-전위 관문 hIKCa1 전류가 적용된 전압 프로토콜에 의해 유도된다는 것을 나타내고 있다. 전류의 역 전위는 -75 mV이고, 이는 기록 용액의 이온 조성물에 기초한 K+ 전도도에 특징적인 것이다. IKCa1 전류에 대해서는, 선형 전류-전압 관계의 기울기 (s)를 사용하여 전류 차단을 특성분석할 수 있다 [Grissmer 등, 1993]. s 의 값은 도 9E에 도시된 실험 중에, 10 nM Vm24 존재시 대조군의~52%로 감소하며, 평형 차단은 4.5 분 내에 도달한다 (27 개 삽화). 전류 차단은 상기 관류를 무독소 세포외 용액으로 바꾸었을 때 2.5 분 내로 완전히 역전된다 (도 9 E, 세척). 1 nM 및 10 nM Vm24 농도에서 잔류 전류 분획들은 s/s 0 로 계산되며 여기서 s 및 s 0 는 각각 Vm24의 존재 및 부존재 하에서 전압 상승에 의해 유도된 I-V 관계식의 기울기이고, 도 9F에 도시되어 있다. 에러 바들은 n=3 독립적 실험에 대한 SEM를 나타낸다. 1 nM 농도에서, Vm24는 실제적으로 hIKCa1 채널들을 차단하지 않고 (도 9F) 반면에, 동일 농도에서, 상기 펩타이드는 hKv1.3 채널들을 완전히 차단한다 (도 9D). hIKCa1에 대한 Vm24의 Kd는 하나의 독소 분자가 하나의 채널과 상호작용하는 모델로부터 추정될 수 있어서 ~14 nM의 Kd 를 산출하였다. hKv1.3에 대해 결정된 Kd 를 고려하면 (2.9 pM), hKv1.3에 대한 Vm24의 선택성은 hIKCa1에 비하여 적어도 ~ 4500-배 크다.
실시예 8: Vm24의 선택성 프로파일
본 연구에 사용된 모든 채널 작제물은 약학 및 생체물리학적 분석에 통상적으로 사용되는 것이고 이들의 적용성은 수록된 참조문헌에서 확인된다.
일시적 형질전환: Cos-7 세포를 사용하여 래트 Kv2.1 (rKv2.1, 코네티컷 주립 대학의 S. Korn 박사로부터 호혜로 얻음) [Immke 등, 1999]; 인간 Kv1.2 (hKv1.2, Kv1.2에 대한 전체 코딩 서열을 함유하는 pcDNA3/Hygro 벡터, 독일 울름 대학의 S. Grissmer 박사로부터 호혜로 얻음) [Visan 등, 2004]; 인간 Kv1.4 (hKv1.4△N: Kv1.4의 불활성화 불 (ball) 삭제 돌연변이, 카나다 밴쿠버 소재 브리티시 콜럼비아 주립대 D. Fedida로부터 얻음) [Kurata 등, 2004]; 및 인간 NaV1.5 (미국 펜실베니아 주 필라델피아 소재의 토머스 제퍼슨 대학의 R. Horn으로부터 호혜적으로 얻음) [O'Leary 등, 1995; Ahern 등, 2005] 채널들을 발현시켰다. tsA-201 세포를 사용하여 hBK 채널들을 발현시켰다 (hSlo1 유전자 (U11058), pCI-네오 플라즈미드에 존재, 펜실베니아주 필라델피아 소재 펜실베니아 주립대의 Toshinori Hoshi로부터 얻음) [Avdonin 등, 2003]. 모든 Lipofectamine 2000 시약을 제작사 방침대로(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 사용하여 이러한 채널 클론들을 녹색 형광 단백질 (GFP)을 포함하는 플라즈미드로 1:5의 몰비에서 일시적 공동 형질전환시키고, 표준 조건 하에서 배양하였다. 전류를 형질전환 한 2-3 일 후에 기록하였다. GFP 양성 형질전환체는 Nikon TE2000U 형광 현미경으로 확인하였고 전류 기록에 사용하였다 (공형질전환에 >70% 성공율).
안정한 세포주: mKv1.1를 안정적으로 발현하는 L929 세포 및 hKv1.5 채널들을 안정적으로 발현하는 MEL 세포는 이전에 설명되어 있고 [Grissmer 등, 1994], Heike Wulff 박사 (UC Davis, CA, USA)의 호혜적 선물이었다. hERG 채널들은 HEK-293 세포주에서 안정적인 방식으로 발현되고 있었다.
전체 세포 전류는 실시예 7에서 설명한 바와 같이 기록하였다. 피펫 충전 용액이 (mM단위로) 140 KCl, 10 EGTA, 9.69 CaCl2, 5 HEPES (pH 7.2)인 경우 hBK 전류 기록을 제외하고는 모든 경우에, 표준 세포외 및 피펫 충전 용액을 사용하였다 (참조 실시예 7). 이러한 용액의 자유 Ca2+ 농도는 [Ca2+]int = 5 마이크로몰이고, 이는 중간 탈분극 전위에서 BK 전류를 기록할 수 있게 되었다 [Avdonin 등, 2003]. 모든 다른 실험 조건들 (데이터 획득, 분석 원리, 관류)는 실시예 7에서 설명된 바와 동일하였다.
Kv1 족의 구성원 (mKv1.1, hKv1.2, hKv1.3, hKv1.4△N, hKv1.5)에 대하여 표준 세포외 용액 (대조군)에서 얻은 전류 자취는 도 10A 내지 10E에 도시되어 있다. 모든 경우에서, 세포들은 -120 mV 홀딩 전위에서 유지되고 있고 반복적으로 +50 mV로 탈분극되어 전류를 발생시켰다. 상기 탈분극 펄스의 기간 (도 10의 각 패널에서 따로 표시된)을 정하여 전류의 완전 활성화를 이루고 불활성화를 최소화시켰다. 모든 경우, 충분한 시간이 임의의 잔류 불활성화로부터 채널들의 완전한 회복을 위한 홀딩 전위 (-120 mV) 에서 펄스간에 주어졌다 (펄스간 기간은 15 내지 30 초). hKv1.4의 빠른 (N-유형) 불활성화 제거 버전을 본 연구에 사용하였다 (hKv1.4△N, N-말단 147개 아미노산들이 삭제). N-유형 불활성화 부존재 하에서, 전류 차단은, 이러한 클론에서의 정점 전류가 상기 매우 빠른 불활성화 과정에 의해 영향을 반지 않기 때문에, 더 빠르고 더 정확하게 결정된다 (시간 상수: 15-20 ms, [Kurata 등, 2004]). 야생형 채널에서는, 시간 의존성 전류 활성화 및 불활성화 사이의 경쟁으로 인하여, 정점 전류는 과소평가되고 있고, 이는 전류 차단 분석을 어렵게 한다.
도 10은 10 nM Vm24에 의한 차단의 평형화 후 및 독소의 유실 (세척) 후에, 독소의 적용 전(대조군)에 기록된 전류 자취를 나타낸다. 상기 패널들을 분석하면, hKv1.4 및 hKv1.5 채널들이 실제적으로 Vm24에 둔감하다는 것이 나타난다 (도 12B의 막대그래프 참조). 그러나, hKv1.3 대한 Kd의 ~3500 배인, 10 nM 농도의 Vm24는 mKv1.1 채널 (RCF=0.80ㅁ0.02, n=3) 및 hKv1.2 채널 (RCF=0.54ㅁ0.08, n=3)을 유의하게 차단한다. 더구나, hKv1.2의 차폐는 완전하게 가역적이지 않다. 10 nM Vm24 농도에서의 hKv1.3 전류 차페는 (인간 T 세포에서 기록됨) Kv1 채널의 차단체로서 (RCF=0.01±0.01, n=3) Vm24의 효과를 더 쉽게 비교하고자 도 10C에 도시되어 있다. mKv1.1 및 hKv1.2 전류의 유의한 차페로 인하여, Vm24는 또한 더 낮은 농도 (1nM)에서 시험되었다 (도 12A). 1 nM 농도에서, RCF 값은 mKv1.1 및 hKv1.2 전류에 대하여 각각 0.97±0.02 (n=3) 및 0.81±0.015 (n=3) 이었다. 상기 RCF 값으로부터, 이러한 채널들에 대한 Vm24의 친화도는 하나의 독소 분자가 하나의 채널과 상호작용하는 모델에서 측정하여 Kd 값을 mKv1.1에 대해서는 30-40 nM 및 hKv1.2에 대해서는5-10 nM으로 산출하였다. hKv1.3에 대해 결정된 Kd (2.9 pM)를 고려하여, mKv1.1 및 hKv1.2에 비하여 hKv1.3에 대한 Vm24의 선택도는 적어도 각각 ~ 10000-배 및 1500-배 크다.
유의한 생물학적 효과를 가지며 및 동물 독소에 의한 차단에 민감한 다른 이온 채널의 활성을 저해하는 Vm24의 효과를 또한 결정하였다. 이러한 채널들은 rKv2.1와hERG (Kv11.1) 전위 관문 K 채널들, Ca2+-활성화 K 채널 hBK (KCa1.1) 및 심 전위 관문 나트륨 채널 NaV1.5을 포함한다. 도 11은 표준 세포외 용액 (대조군)에서, 주어진 채널에 적절한 전압 프로토콜로 이끌어 낸 대표적인 전체-세포 전류를 나타낸다. 정점 Kv2.1 및 NaV1.5 전류는 -120 mV의 홀딩 전류로부터 각각 +50mV 및 0mV로 탈분극에 방응하여 얻어진 기록물로부터 결정되었다 (도 11A 및 11D). hERG 채널들을 발현하는 HEK293 세포들은 -80mV에서 유지되다가, 2.5 초 동안 +20 mV로 탈분극되어 상기 채널들을 활성화 및 불활성화시켰다 (도 11B). 이것 후에, -40 mV로 내리고, 여기서 불활성화된 채널들은 빠르게 회복되고 정점 hERG 전류가 결정될 수 있다. 이러한 복잡한 전압 프로토콜은 hERG 전류를 기록하는 표준이다. BK 채널들은 막의 탈분극에 의해 활성화되지만 (도 11B), 미지의 확률의 전압 의존성은 세포내 자유 Ca2+ 농도에 좌우된다. 본 연구에 적용된 5 밀리몰 자유 [Ca2+] 농도에서, 상기 채널들의 50% 이상이 +50 mV에서 활성화 되었고, 따라서, 다른 Kv 채널들에 사용된 것과 동일한 막 전위에서 Vm24의 효과들을 비교하는 것이 가능하다. +50 mV에서 BK 채널들의 완전한 활성은 안정적인 전체-세포 기록과는 양립할 수 없는 [Ca2+]를 요구하며, 역으로, 5 마이크로몰 자유 [Ca2+]에서의 BK 채널들의 완전한 활성화는 >+100 mV로 탈분극을 요구한다. 따라서, 5 밀리몰 [Ca2+] 및 +50mV 시험 전위의 조합은 Vm24의 효과를 연구하는 데 합리적인 절충안이었다. 시험 펄스에 선행하는 -120 mV로의 펄스를 사용하여 비특이적 누출에 대하여 산정하였다. 펄스 프로토콜들 간의 홀딩 전위는 0 mV 였고, 여기서 모든 Kv 채널들은 불활성화 되며, 이에 의해서 tsA-201 세포에서 간헐적으로 발견되는 내재적 Kv 전류에 의한 기록 오염의 가능성을 줄여준다. 이러한 막 전위에서, BK 채널들은, 펄스의 시초에서 유의한 홀딩 전류에 의해 증명되는 바와 같이 이미 활성적이다.
도 11에서 나타난 상이한 채널들에 대한 Vm24의 효과를 분석하기 위해, 세포들을 반복적으로 탈분극시켜 상이한 세포외 용액에서 전류를 이끌어 냈다. 도 11은 독소의 적용 전에 (대조군), 10 nM Vm24을 4-7 분간 적용 후에, 및 독소의 유실 (세척) 후에 기록된 대표적인 전류 자취를 나타낸다. 도 11의 모든 패널은 Vm24의 존재하에서 및 유실 후에, 기록되는 전류가 대조군 용액에서 기록되는 것과 구별될 수 있는 것을 나타내며, 이러한 채널의 차폐가 결여된 것을 가르킨다. 통계 분석이 도 12B에 제시되어 있고, 여기서 10 nM Vm24 (n≥3)의 존재하에서 잔류 전류 분획의 평균 및 SEM이 나타나 있다.
도 12에 제시된 데이터는 다양한 K 채널들에 대한 Vm24의 차폐능력의 순서가 hKv1.3>>>hKv1.2>hIKCa1>mKv1.1>>>hKv1.4- hKv1.5-rKv2.1-hERG-hBK-hNaV1.5임을 나타낸다. 용량-반응 관계식으로부터 hKv1.3 대하여 얻은 Kd 값 및 다른 채널에 대한 Kd 값의 단일 포인트 추정 (즉, 1:1 독소-채널 화학양론으로 가정하고 10 nM Vm24 및 전류의 잔류 분획에서의 데이터로부터 계산된) 에 기초하여, 본 연구에서 분석된 다른 채널들에 비하여 hKv1.3에 대한 Vm24의 선택성은 >1500-배이다. 이러한 값은 선택성에 대한 공통적으로 허용되는 기준에 걸쳐 [Giangiacomo 등, 2004] 잘 된 것이고 이는 평형 해리 상수에서 100 배 차이 또는 두 개 상이한 칼륨 채널들에 대한 α-KTx 결합에 대한 결합 자유 에너지에서의 차이, △△GCh1 ; Ch2 > 2.72 kcal/mol의 Ch1 및 Ch2로서 정의된다.
실시예 9: 합성 Vm24는 천연 독신과 동일한 정도의 hKv1.3의 차단체이다
실시예 5에서 설명된 바와 같이, 이론적 및 실제적으로 고려하여, Vm24을 화학 합성하였다. 전술한 바와 같이, 합성 독소의 구조와 순도는 분석 HPLC, 아미노산 시퀀싱 및 질량 분광분석 결정으로 확인되었다. 모든 이러한 방법은 합성 Vm24 (sVm24) 의 일차 서열이 천연 펩타이드와 동일하다는 것을 나타내었다. 더구나, sVm24의 생성에 대한 프로토콜은 천연 펩타이드에서와 같이 동일한 디설파이드 짝으로 폴딩이 제한되는 것을 확실하게 하도록 디자인된 티올기에 대한 구별된 보호기를 사용하였다. 이러한 데이터는, 그러나, 펩타이드의 생물학적 활성이 유지된다고 보장하지 않는다. 고친화도 차단을 매개하는 채널과 펩타이드의 보조적 표면은 매우 복잡하고, 천연 펩타이드의 구조로부터 조금만 벗어나도 Kv1.3을 차단하는 sVm24의 효율을 저하시킬 수 있다 [Giangiacomo 등, 2004].
sVm24의 생물학적 활성은 인간 T 세포의 Kv1.3 채널 상에서 분석되었다. 이러한 연구에 실험적인 조건은 실시예 7에서 설명한 바와 완전히 같았다. 전체-세포 패치 클램프된 T 임파구를 상이한 용액의 존재하에서 매 30초마다 -120 mV의 홀딩 전위로부터 +50 mV까지 반복적으로 탈분극시켰다 (도 13A). sVm24의 부재하에 (대조군) 측정된 hKv1.3 전류는, 관류 장치를 통해 100 pM sVm24를 투여시, 점진적으로 그리고 거의 완전히 사라졌다. 16 번째 펄스 후, 기록 챔버를 무독소 세포외 용액으로 관류하였다. 관류 용액으로부터 독소를 제거해도, 5 분 내에 hKv1.3 차단을 유의하게 완화하지 않는 결과를 가져왔다. 이것은 도 13B에 더욱 명확히 나타나 있고, 여기서, sVm24 적용전에 대조군 용에서 기록된 것에 표준화된 정점 전류 (표준화된 정점)가 시간의 함수로 나타나 있다. 화살표는 sVm24 (100 pM sVm24)로 관류를 시작한 것과 관류액을 무독소 용액 (유실)으로 바꾼 것을 지시하고 있다. sVm24 또는 Vm24의 100 pM로 차단 평형화 후 측정된 잔류 전류 분획 (RCF)이 도 13B에 비교되어 있다 (각각 n=6 및 n=4, 막대는 SEM을 지시한다). 통계 비교 (t-시험)은 RCF들이 두 개 군 사이에 통계적으로 차이가 없다는 것을 나타낸다 (p=0.57). 우리의 결론은 sVm24가 hKv1.3 채널들을 차단하는 데 천연 독소와 동일하게 강력하다는 것이다.
실시예 10: 상이한 이온 채널 상에서의 Vm23의 생물학적 활성 분석
전갈 독은 과잉의 생물학적 활성 펩타이드들을 포함하고 있다. 어떤 종의 독은 통상, V. mexicanus (참조 실시예 1)의 Vm23 및 Vm24의 경우와 같이, 고도의 서열 동일성을 가지는 펩타이드들을 포함하고 있다. 펩타이드들의 고도의 서열 동일성은 보통 개별 분자에 동일한 생물학적 활성을 부여한다. 이것은 이온 채널의 외부 전실(vestibule)에 위치한 독소 수용체와 펩타이드 독소와의 상호 작용은 장기 정전기, 단기 정전기 및 밀접 상호작용을 위시한 다중 기작에 의해 결정되며, 이러한 인자들의 순수 효가가 결합 친화도 및 선택도를 결정한다는 사실로부터 유래된다 [Park and Miller, 1992; Peter 등, 2001; Giangiacomo 등, 2004]. 단일 아미노산 만이 상이한, 동일한 전갈의 두 개 펩타이드 (Pi2 and Pi3 of P. imperator) 양쪽 다 나노몰 이하의 농도에서, Kv1.3을 차단하는 것이 나타났다 [Peter 등, 2001]. Miller와 공동 작업자들의 선구적인 노력으로부터 [Goldstein 등, 1994], 챠립도톡신의 몇 개 위치에서의 비보존적 아미노산 치환이라하더라도 잘 참아져 있고 그 독소는 Shaker 칼륨 채널 (예, T9K and N22K)에 대한 친화도를 유지하는 것이 또한 밝혀졌다. Kv1.3에 대한 그들의 친화도 및 선택도를 유의하게 변화시키지 않는 다는 것을 증명하기 위해, Vm23의 약학적 특성분석을 후술하는 바와 같이 조사하였다.
Vm23의 이온 채널 차단 능력을 인간 T 세포의 Kv1.3 채널에 대하여 및 mKv1.1, hKv1.2과 hIKCa1 채널들에 대하여 분석하였다. 이러한 채널들은 Vm23과 83% 서열 동일성을 공유하는 관련 펩타이드 Vm24에 의한, 낮은 친화도(mKv1.1, hKv1.2 and hIKCa1) 또는 높은 친화도 차단(hKv1.3)에 기초하여, 본 연구에 포함되었다. 실험 조건은 실시예 7과 8에서 상응하는 채널에 관하여 설명된 것과 완전히 동일하였다.
전체-세포 패치 클램프된 T 임파구를 상이한 용액의 존재하에서 매 15초마다 -120 mV의 홀딩 전위로부터 +50 mV로 반복적으로 탈분극시켰다 (도 14A). Vm23의 부존재하에서 측정된 hKv1.3 전류는 (대조군) 관류 장치를 통해 10 nM Vm23를 투여시 3.5 분 내로 거의 완전히 사라졌다. "10 nM Vm23"로 표시된 자취는 차단 평형화 이후에 기록된 것이다. 19번째 펄스 후, 기록 챔버를 무독소 세포외 용액으로 관류시켰다 (유실). 상기 관류 용액으로부터 독소를 제거해도 2 분 내로 hKv1.3 차단이 유의하게 완화되지 않았다. 10 nM Vm23로 차단 평형화 후에 측정된 잔류 전류 분획(RCF)은 도 15에 도시되어 있다 (n=3, 막대는 SEM을 가르킴). 이러한 결과는 hKv1.3 채널들의 Vm23-매개 차단 특성이 Vm24-매개 차단의 것과 매우 유사하다는 것을 나타낸다: 상기 차단은 매우 친화적이며, 독소의 오프율은, 본 분석에 사용된 시간 한계를 넘어서, 매우 낮다. Vm23의 제한된 양 (독의 0.5%미만이 Vm23이다)은 hKv1.3 차폐의 용량-반응 관계식 설정을 방해하며 Vm24과 해리상수의 적절한 통계 비교를 하지 못하게 한다.
10 nM Vm23 첨가 전에 (대조군), 첨가 후 3.5 분에, 및 독소의 유실 후 (2 분)에 기록된 전류를 비교하면 10 nM Vm23이 hIKCa1 채널 (도 14B) 또는 mKv1.1 채널 (도 14C)를 실제적으로 차단하지 못한다는 것을 보여준다 (실시예 7 및 8의 상응 단락 실험 상세 참조). Vm23에 의한 hIKCa1 차폐의 완전한 결여는 동일 농도에서 채널의 ~40%를 차단한 Vm24의 효과와 상이하다 (참조 도 9F). 한편, hKv1.2 채널들은 10 nM Vm23에 의해 약하게 차단되어 (도 14D) 0.91ㅁ0.02의 RCF 값을 나타내었고 (n=3, SEM, 도 15), 그 차단은 2 분내에 즉시 가역적이지 않았다. Vm24의 동일한 농도는 상기채널들의 ~46%를 차단하였다 (참조 실시예 8).
10 nM Vm23 존재하에서 hKv1.3, hIKCa1, mKv1.1 및hKv1.2에 대한 잔류 전류 분획을 (도 15)와 Vm24에 대하여 얻은 데이터 (도 12 A 및 B)를 비교하면, hKv1.3에 대한 Vm 23의 선택성 특성이 시험된 채널들에 대해서는 약간 더 좋다는 것을 표시하고 있다. Vm23과 Vm24의 일차 구조에서의 차이점에도 불구하고, 현저한 선택성을 가지고 hKv1.3을 고친화도로 차단하는 것이 유지된다는 것이 상기 비교에서 결론지을 수 있다.
실시예 11: Vm24의 생체내 면역학적 효과
전세계 수백만명의 사람이, 이에 한정되지 않지만 특히, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제 1 형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염, 골흡수 치주질환, 면역 혈소판 감소성 자반증 및 자가면역 임파구증식성 증후군과 같은 자가면역질환에 고통받고 있다. 현재, 이러한 질환의 개시는 작용 기억 T 세포(TEM)로 전환되는 잠재 질환 특이성 자가반응성 T 세포의 활성화를 포함한다고 생각하고 있다. 자가반응성 T 세포는 반복도니 자가항원 자극으로 인하여 미접촉 상태에서 연속적으로 활성화된 T 세포로 분화되고 및 조직으로 이동하고, 염증성 사이토카인류를 분비하고 즉각적인 작용 기능을 보임으로써 염증성 손상을 나타내게 할 수 있다 [Sallusto 등, 1999]. 지연형 과민증 (DTH)에 연관된 기작은 TEM 세포에 의해 야기되는 피부 병변의 다른 예이다 [Soler 등, 2003]. 많은 자가면역 질환들의 병리는 기억 B 세포, 특히 클래스-전환된 CD27+IgD- 군에 속하여 있는 것들로 인한 것일 수 있다 [Iglesias 등, 2001; O'Connor et al, 2001; Corcione 등, 2004]. 이러한 이유로, TEM 및 클래스-전환된 기억 B 세포를, 다른 임파구 세포 아군의 활성을 저해하지 않고, 선택적으로 타겟알 수 있는 치료제를 개발하는 것이, 급성 면역 반응의 악화를 피하게 되면서 바람직하다. 본 발명의 실시예 7 내지 10에서 언급한 바와 같이, 전위 관문 Kv1.3 채널들은 TEM 및 클래스-전환된 기억 B 세포의 면역조절에 새로운 치료 타겟이 된다. TEM 세포들은 활성화 시 Kv1.3을 상향조절하고, 이들의 항원-주도 증식은 Kv1.3 채널들을 차단하는 공지된 물질에 매우 민감하다 [Wulff 등, 2003]. 반면에, 미접촉 및 TCM 들은 Kv1.3 차단체에 매우 덜 민감하고 칼슘-활성화 K 채널 KCa 3.1을 상향 조절함으로써 Kv1.3차폐에 빠르게 저항적이게 된다 [Wulff 등, 2003; Chandy 등, 2004]. 분화 과정 중에, B 세포 및 T 세포들은 그들의 칼륨 채널 의존성을 KCa 3.1에서 Kv1.3로 변화시킨다 [Wullf 등, 2004]. 이러한 사실로 인하여, Kv1.3 채널 차단체는 미접촉 및 CD27+IgD+ 기억 세포에 영향을 주지 않고, 이러한 세포의 증식을 저해한다. 따라서, Kv1.3 채널들에 특이적인 차단체를 사용하면, 면역 반응 실체에 손상을 끼치지 않고, TEM 및 클래스-전환된 기억 B 세포에 우선적으로 영향을 끼쳐 자가면역 질환들의 결과로서 나타난 건강상태를 향상시키게 될 것이다. Kv1.3 채널을 차단하면, 동물 모델에서 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE), 골흡수 치주질환 및 DTH 반응을, 명시적인 부작용없이 개선하였다 [Koo 등, 1997; Beeton 등, 2001; Valverde 등, 2004]. 펩타이드들에 의한Kv1.3 채널 들의 차폐는 즉각적으로 가역적이기 때문에, 화학요법제 또는 단일클론 항체를 사용할 때, 진정되기 까지 수 개월이 걸리는 경우가 아닌, 치료 과정을 제어할 수 있게 한다. 명맥히, 이러한 요법적 치료에 고도로 선택적인 펩타이드를 발견하는 것이 주요 문제점이다 [Chandy 등, 2004].
전술한 실시예 7-10에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 주제인 양 쪽 펩타이드 (Vm23 및 Vm24)는 시험관 내에서 Kv1.3 채널들의 강력하고도 매우 특이적인 차단체이다. 활동의 선택성을 증명하기 위해, 배양된 인간 T-임파구 상에서 직접적으로 및 수 개의 전위 의존성 K 채널들을 발현하는 다른 세포를 사용하여 실험을 실시하였다. "개념 증명 (proof-of-concept)"을 위해, 생체 내 실험을 주요 DTH-반응을 이끌어 낼수 있는 제제로서 디니트로플루오로벤젠 으로 감작된 래트에서 수행하였다.
이러한 종류의 실험을 수행하기 위해, 우리는 래트에서 DTH 반응을 연구하는 프로토콜을 마련하였다. 사용된 시스템은 기본적으로 Phanuphak 등, 1974에 의해 설명된 것이었다. 간단히 얘기하자면, 두 군의 래트 (각 3 또는 5 마리)의 등을 간단히 면도한 후, 0.7% DNFB를 함유하는 4:1 비율의 아세톤: 올리브유 용액 40 마이크로리터를 이틀 연속 (1일 및 2일) 적용하여 감작시켰다. 상기 감작 용액을 두 번째 적용한 7일 후에, 동물들에게, 상기와 같은, 0.4% DNFB가 용해된 아세톤: 올리브유 용액 20 마이크로리터를 한번 적용하였다. 이 용액을 오른쪽 귀의 뒤 표면에 넓게 바르고, 건조시킨 반면 왼쪽 귀는 담체 용액 (아세톤:올리브 유)만을 넓게 발랐다. 상기 프로토콜의 8일째에, 인산식염완충액 pH 7.8 (PBS) 의 100 마이크로리터를 대조군으로 사용된 동물 각각에 피하 주사한 반면, 실험군의 래트는 마이크로그람 순수Vm24을 함유하는 100 마이크로리터 PBS를 피하적용하였다. 모든 동물의 양 쪽 귀의 두께를 Vm24 적용 24 시간 후에 측정하였다.
상기 실험의 결과를 도 16에 도시한다. Vm24 주사를 받지 않은, 대조군 동물은 귀의 염증 평균 수치가 0.32 mm (표지된 대조군)인 반면에 10 마이크로그람 Vm24로 한번 투여된 동물의 귀의 것은 0.10 mm 두께를 넘지 않는다는 것이 명백히 나타나고 있다. 이러한 수치들은, 주사되지 않은 귀 (왼편 귀)의 두께를 뺀 것이기 때문에, 실제 염증 과정과 상응하는 것이다. 이것은 염증 과정의 60% 넘는 순수 감소를 나타내고 있다. 결론적으로, 이러한 결과는 Vm24이 래트에서 DTH-반응에 주요 면역 억제제이다는 생각을 지지하고 있다. 따라서, Kv1.3 채널들이 T 및 B 임파구들의 활성화에 의존하는 면역 질환을 야기하고 유지하는데 중요한 기여를 하는 그러한 질환의 저해자로서 분석될 가치가 있는 주요 성분이라는 것이 확실하다.
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Claims (36)

  1. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리되고 정제된 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이의 약학적 허용염의 유효량과 접촉시켜서 Kv1.3 칼륨 채널 활성을 차단하는 것을 포함하는, 분리된 포유 동물 세포에서 Kv1.3 칼륨 채널의 활성을 저해하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 임파구 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 포유 동물 세포에서 Kv1.3 칼륨 채널의 활성을 저해하는 방법.
  6. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 Kv1.3 칼륨 채널 차단 활성이 있는 펩타이드의 유효량과 T-임파구 세포를 접촉시켜서 분리된 T-임파구 세포에서의 칼슘 신호전달 경로를 약화시키는 방법.
  7. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 Kv1.3 칼륨 채널 차단 활성이 있는 펩타이드 또는 이의 약학적 허용염의 유효량과 일군의 T-세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 포유동물의 면역계에서 분리된 T-세포의 활성을 억제하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는, 포유동물의 면역계에서 분리된 T-세포의 활성을 억제하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 T-세포 활성은 상기 포유동물에서의 면역 반응에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는, 포유동물의 면역계에서 분리된 T-세포의 활성을 억제하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 면역 반응은 이종 기관 이식 거부의 결과인 것을 특징으로 하는, 포유동물의 면역계에서 분리된 T-세포의 활성을 억제하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 면역 반응은 자가면역 질환의 결과인 것을 특징으로 하는 , 포유동물의 면역계에서 분리된 T-세포의 활성을 억제하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 Kv1.3 칼륨 채널 차단 활성이 있는 적어도 하나의 펩타이드 또는 이의 약학적 허용염, 그리고 약학적 허용 담체 및 선택적으로 필요한 대상체의 임파구 TEM과 연관된 자기면역질환의 치료에 사용되는 적어도 하나의 추가적 면역 억제제을 포함하는 약학적 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 추가적 면역 억제제는 라파마이신, 아자티오프린, 프레드니손, ShK 독소, ShK 유도체 및 데옥시스페르구알린, 이들의 유도체 또는 염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 23 항에 있어서, 임파구 TEM과 연관된 자기면역질환은 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 자가면역성 건선, 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 교감성 안염 및 골흡수 치주질환, 면역 혈소판감소성 자반증 및 자가면역 임파구증식성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 필요한 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 Kv1.3 칼륨 채널에 고도의 친화성 및 특이성 결합을 포함하는 표지된 펩타이드.
  28. 제 27 항에 있어서, 표지 분체는 방사능 동위원소, 형광 분체, 화학발광 분체, 크로모포어 및 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표지된 펩타이드.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 표지분체인 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는 표지된 펩타이드.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 표지분체인 단백질은 비오틴인 것을 특징을 하는 표지된 펩타이드.
  31. 제 28 항에 있어서, 상기 표지분체인 단백질은 녹색형광 단백질인 것을 특징을 하는 표지된 펩타이드.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 표지분체인 단백질은 녹색형광 단백질로부터 유도된 구별된 방사 스펙트럼을 가지는 단백질인 것을 특징을 하는 표지된 펩타이드.
  33. a) 공유결합적으로 표지된, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 Kv1.3 칼륨 채널에 고도의 친화도 및 특이성 결합을 가지는 표지된 펩타이드와 일군의 타겟 세포를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 일군의 타겟 세포에 존재하는 Kv1.3 칼륨 채널에 결합된 상기 표지된 펩타이드를 검출 기술로 검출하는 단계
    를 포함하는, 체외(in vitro)에서 Kv1.3 채널 발현 세포를 동정하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 세포는 인간 임파구인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. a) 공유결합적으로 표지된, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 Kv1.3 칼륨 채널에 고도의 친화도 및 특이성으로 결합하는 표지된 펩타이드와 일군의 타겟 세포를 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 일군의 타겟 세포에 존재하는 Kv1.3 칼륨 채널들에 결합된 상기 표지된 펩타이드를 정량 검출 기술로 검출하고 정량하는 단계
    를 포함하는, 분리된 세포에서 발현되는 Kv1.3 채널의 수를 정량하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 세포는 인간 임파구인 것을 특징으로 하는 방법.
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