JP2010528988A - ヒトＴ−リンパ球カリウムチャンネル（Ｋｖ１．３亜型）を高い選択性で遮断し、ラットにおける生体内でのＤＴＨ−応答を減少させる二つのサソリペプチドＶｍ２３及びＶｍ２４ - Google Patents

ヒトＴ−リンパ球カリウムチャンネル（Ｋｖ１．３亜型）を高い選択性で遮断し、ラットにおける生体内でのＤＴＨ−応答を減少させる二つのサソリペプチドＶｍ２３及びＶｍ２４ Download PDF

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Abstract

カリウムチャンネルＫｖ１．３は、免疫疾患及び移植片拒絶反応に関与することが知られている。高い親和性及び特異性でカリウムチャンネルＫｖ１．３を遮断することが可能なペプチド、その医薬品組成物、並びにＫｖ１．３カリウムチャンネルを遮断するための、各種免疫疾患を治療するための、及び診断的適用へのその使用方法を開示する。また、その化学合成及び正確な折り畳みの方法を開示する。例示的なペプチドは、メキシコサソリのヴァエジュビス・メキシカナス・スミシ（Vaejovis mexicanus smithi）の毒液から単離されたタンパク質成分（Ｖｍ２３及びＶｍ２４）に対応する。Ｖｍ２３及びＶｍ２４は、ほとんど不可逆的な方法でｈＫｖ１．３チャンネルに結合し、生体外でのヒトリンパ球培養に適用すると、ほぼ３ピコモル濃度程度の範囲でＫｄ値を示す。Ｖｍ２４を化学合成し、生体内での実験に用いて、感作されたラットを首尾よく治療した（ＤＴＨ-応答）。比較的高い濃度で注射した場合（マウス体重１キログラム当たり１０,０００マイクログラムまでアッセイした）、Ｖｍ２４及び合成Ｖｍ２４はいずれもマウスに対して毒性を持たない。これらのペプチド（Ｖｍ２４及びＶｍ２３）及び少なくとも８３％の配列同一性を有するそれらの機能的に同等な類似体は、リード化合物であり、各種免疫条件の治療及び診断的適用の候補である。

Description

本発明は、概して生化学、分子生物学、免疫学及び電気生理学の分野に関連するものである。ペプチド、その医薬品組成物、それらの使用によってＫｖ１．３カリウムチャンネルを遮断する方法、各種免疫条件の治療方法、診断的な適用方法、並びにメキシコサソリのヴァエジュビス・メキシカナス・スミシ（Vaejovis mexicanus smithi）（以下、Ｖ．メキシカナス（mexicanus）と省略）の毒液から単離される二種類のタンパク質成分に対応するペプチドの化学合成方法及び正確な折り畳み方法を開示し、該ペプチドは、カリウムチャンネル特異的リガンドの新規なサブファミリーを構成し、高い親和性及び特異性で、免疫疾患及び移植片拒絶反応に関与することが知られているカリウムチャンネルの亜型（ｈＫｖ１．３）を遮断することが可能である。その化学的及び機能的な特徴付けに用いられる方法及び技術を、Ｖｍ２４によって処理した場合の感作されたラットのＤＴＨ-応答についての生体内での実験結果と共に開示する。このペプチド（Ｖｍ２４）と、その同族であるＶｍ２３と、それらと機能的に同等な類似体は、リード化合物であり、各種免疫条件の治療及び診断的適用の候補である。
概論
ここで報告される本発明の対象に関して、幾つかの側面を考慮する必要があり、それらの中には、
１）細胞の情報交換、シグナル伝達経路、並びに組織及び各種臓器機能の一般的な恒常性において基本的な役割を果たす「イオンチャンネル」と呼ばれる生体膜の内在タンパク質の存在；
２）自己免疫疾患の発症に関連する現象において明確な役割を果たすことが知られている免疫系の細胞、主にＴ-リンパ球におけるそのチャンネルの発現レベルの違い；
３）各種化学物質、天然リガンド、並びに天然において発見されたリガンドを再生するか又は類似の誘導体（ペプチド模倣物）を調製することで合成的に調製される物質を加えることによって、そのチャンネル機能を制御する可能性と、それによって疾患を治療する可能性；
について生じる知識に関連した、生化学、分子生物学、免疫学及び電気生理学の分野の重要な進歩がある。
多数のカリウム（Ｋ）チャンネルが発見され、ここ１５年間でそれらの単離、個別の発現及び機能分析を可能にする多数のカリウム（Ｋ）チャンネルが存在すると報告された。
それらは、細胞膜電位の測定に関与する多量体タンパク質であり、それによって、平滑筋緊張、シナプス興奮性、神経伝達物質放出及び他の過程を制御する。本発明において、我々は、Ｋチャンネル種、亜型Ｋｖ１．３の重要性と、リンパ球増殖でのその役割及びこのチャンネルの遮断による自己免疫疾患の制御でのその役割の重要性とを強調したい。これは、Ｔリンパ球で主として発現する遅延整流性のチャンネルであり［Grissmer et al., 1990; Lewis and Cahalan, 1995］、Ｋチャンネルの亜型のほんの一部を挙げれば、脳内に広く分布する亜型Ｋｖ１．１，Ｋｖ１．２又は心臓組織内のＫｖ１．５と異なる。
Ｋｖ１．３チャンネル活性の調節がリンパ球増殖に影響を与える機構は、数々の研究室において研究されており、一部の特許（v.gr. Cahalan et al.による米国特許第５３９７７０２号明細書（1995）及びKem et al.による米国特許第６０７７６８０号明細書（2000））を含めて、最近の多くの刊行物の対象であった（［Beeton and Chandy, 2005; Judge and Bever, 2006, Panyi et al.,2006］において概説されている）。
自己免疫疾患は、世界的にかなりの罹患率で知られている。これらの疾患には、ほんの一部を挙げれば、１型糖尿病（インスリン依存性）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症がある。自己免疫疾患について関連のある実験モデルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）である。これらの自己免疫疾患は、細胞への直接攻撃によって又は自己抗体を生成することによって、特異的組織を破壊する免疫システムの応答に起因することが一般に認められている。Ｋｖ１．３チャンネルの過剰発現は、自己反応性Ｔ細胞の特性であり、Ｋｖ１．３の遮断薬によってその増殖を変更するための素晴らしい機会を与える。
これらの研究および実験に沿って、幾つかの物質が開示され、特許されたものさえあった。その一つの例が、イソギンチャクのStichodactyla helianthusからの毒素ＳｈＫ、及び幾つかのその誘導体であり、幾つかの自己免疫疾患に対して保護効果を有するとしている（v.gr. Kem et al.による米国特許第６０７７６８０号明細書（2000））。
イオンチャンネルの機能に影響を与えることが可能な他の天然リガンドの中には、サソリの毒液から単離した毒性ペプチドがある。その毒液から単離したＫチャンネル特異性ペプチドは、三つ又は四つのジスルフィド架橋によって緊密化した２２〜４２のアミノ酸を含有する短鎖ペプチドである。それは、多くの異なる亜型チャンネルの遮断薬であり、選択性及び親和性の変動が大きい（［Giangiacomo et al., 2004; Rodriguez de la Vega and Possani, 2004］において概説されている)。例えば、カリブドトキシンは、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２及び１．３Ｓｈａｋｅｒ型遅延整流性チャンネルのタンパク質遮断薬であると共に、ｍａｘｉ型Ｋ（Ｃａ）チャンネルをも遮断する［Rauer et al., 2000］。他のサソリ毒液ペプチドであるマーガトキシンは、Ｋ（Ｃａ）チャンネル遮断活性を欠いているが、Ｋｖ１．３チャンネルの高親和性遮断を維持する［Garcia-Calvo et al., 1993］。アギトキシン、ノキシウストキシン、カリオトキシンは、異なる親和性及び選択性で異なる型のＫチャンネルに影響を与えるサソリ毒の例であるが、通常、一つより多い亜型チャンネルを修飾する（［Panyi et al, 2006］において最近概説されている）。ジスルフィド架橋によりしっかりと維持される比較的硬い三次元構造のため、これらサソリペプチドには、Ｋチャンネルの外側前庭におけるＫチャンネルアミノ酸残基間の距離を測定するための「分子キャリパー」として使用されるものもある［Krezel et al., 1995; Garcia et al., 2000］。Ｋチャンネルに対して特異的な多くのサソリ毒の三次元構造は、核磁気共鳴及び／又はＸ線回折法によって分解され、一部のＫチャンネルの既知の構造と共に、受容体（イオンチャンネル）とそのリガンド（サソリ毒）間での相互作用をモデル化する手掛かりを与えた。イオンチャンネル及びそのリガンドの双方におけるアミノ酸残基の部位特異的変異誘発は、この対の受容体−リガンドタンパク質の中にある推定相互作用面の同定に関する情報を与えた［Rodriguez de la Vega et al., 2003］。この情報は、薬理学的用途の可能性のある可能性薬物の合理的設計の基本となる。この天然に存在するペプチドを可能性薬物として使用する唯一の問題は、特異性及び親和性の欠如である。現在、２０サブファミリーのサソリ毒があり、構造的に関連するペプチドを１２５を超えて備え、配列類似性及び考えられる機能によって分類される［Tytgat et al., 1999; Rodriguez de la Vega and Possani, 2004］。
自己免疫疾患のＫｖ１．３阻害剤に基づく治療についての分子基盤
このセクションで、発明者は、高い親和性及び選択性でリンパ球の「エフェクターメモリＴ細胞」（ＴＥＭ）のＫｖ１．３イオンチャンネルを遮断することが可能なリガンド（ペプチド又は有機化合物）を単に適用することによって幾つかの免疫疾患を制御する最先端の知識を示す。
Ｋｖ１．３阻害剤が生理的抗原刺激又はマイトジェンによって誘発したリンパ球の活性化過程を妨げる機構が、膜の脱分極と、結果として起こる、興味深い抗原に対して特異的なＴ細胞クローンを増殖及び生成する細胞周期の正常な進行に必要なＣａ２＋の阻害であることはこれまでに示されている（［Cahalan et al., 2001; Panyi et al., 2004; Panyi et al., 2006］において概説されている）。Ｔ細胞の十分に過分極した膜電位（−５０，−６０ｍＶ）の維持に関与する二種のＫチャンネル［Verheugen et al., 1995］、Ｋｖ１．３として示される電位開口型の脱分極活性化チャンネル［Decoursey et al., 1984; Matteson and Deutsh, 1984］、及びＩＫＣａ１（又は最近の命名法によるとＫＣａ３．１．）として示される中間コンダクタンスのＣａ２＋活性化Ｋチャンネル［Grismmer et al., 1993］がある。これらのチャンネルの活性は、Ｃａ２＋放出が活性化されたＣａ２＋チャンネルを通してＴ細胞中にＣａ２＋を流入させる間、負の膜電位を維持するのに必要な平衡する正電荷の流出をもたらす［Feske et al., 2006; Yeromin et al., 2006］。この二種のＫチャンネルのＴ細胞膜電位への寄与は、以下で説明するように、細胞の活性化状態（静止対活性化）、及びＴ細胞の最終分化の程度によって決まる免疫系でのそれらの機能的役割によって決まる［Wulff et al., 2003］。
未処理細胞及び中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）という二種のＴ細胞は、活性化される末梢（二次）リンパ器官において強い抗原刺激及び同時刺激を必要とする。事前に抗原と遭遇していない未処理Ｔ細胞は、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋機能的マーカーの発現を生む。中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ，ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−）は、反応性記憶を媒介しており、おそらく最終分化の中間段階で静止し、エフェクターメモリ細胞（ＴＥＭ）となる［Sallusto et al., 2004］。これらの細胞は、エフェクター機能をほとんど又は全く有さないが、抗原刺激に応答して容易に増殖し、エフェクター細胞に分化する。保護記憶は、エフェクターメモリＴＥＭ細胞（ＣＣＲ７―ＣＤ４５ＲＡ＋／−）によって管理される。ＴＥＭ細胞は、それが即時のエフェクター機能を発揮する場合に、炎症組織へのホーミングに必要なケモカイン受容体及び接着分子の特徴的なセットを示す。多発性硬化症（ＭＳ）（Wulff et al., 2003）、関節リウマチ及びＩ型糖尿病［Beeton et al., 2006］、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎並びに骨吸収歯周病を含む幾つかの自己免疫疾患において、慢性的に活性化したＴＥＭ細胞は、組織損傷に関与するため、該細胞の増殖及び機能活性の選択的阻害が、これらの疾患の管理において最も重要である（［Chandy et al., 2004; Beeton and Chandy, 2005; Panyi et al., 2006］において概説されている）。
休止したヒト未処理細胞であるＣＤ４＋（ヘルパー）又はＣＤ８＋（細胞傷害性）表現型のＴＣＭ及びＴＥＭは、細胞当たり、近い数（２００〜３００）のＫｖ１．３チャンネルと、３０未満のＩＫＣａ１チャンネルとを発現する。特異的な抗原刺激による未処理細胞及びＴＣＭ細胞の増殖性芽細胞への形質転換は、細胞当たりのＫｖ１．３チャンネルの数のわずかな増加（〜１．５倍）を伴う一方で、ＩＫＣａ１チャンネルの数は劇的に増加するため（５００チャンネル／細胞）、それらはＩＫＣａ１高Ｋｖ１．３低イオンチャンネル表現型を獲得する。これに対して、末梢組織におけるＣＤ４＋又はＣＤ８＋のＴＥＭの活性化は、ＩＫＣａ１レベルの変化なしに、Ｋｖ１．３チャンネルの数を約１５００／細胞まで劇的に増加させることを伴い、それによって、活性化ＴＥＭのチャンネル表現型が、ＩＫＣａ１低Ｋｖ１．３高となる。
Ｋｖ１．３高ＴＥＭと自己免疫疾患との間の因果関係は、ヒト疾患で得られた以下のデータによって立証される。
１）ＭＳ患者の末梢血からのミエリン反応性Ｔ細胞は、Ｋｖ１．３高である［Wulff et al., 2003］。
２）健常対照群の末梢血からのミエリン反応性Ｔ細胞は、Ｋｖ１．３低である［Wulff et al., 2003］。
３）インスリンペプチド、オボアルブミン等の不適切な抗原又は通常のマイトジェンを持つＭＳ患者のＴ細胞の刺激は、Ｋｖ１．３高ＩＫＣａ１低イオンチャンネル表現型を持つＴＥＭの発生を誘発しない。
４）Ｋｖ１．３高ＴＥＭ細胞が、死後ＭＳ脳の炎症性浸潤、及び脱髄したＭＳ病変部の柔組織において見られた［Rus et al., 2005］。
５）間接リウマチ（ＲＡ）に苦しむヒト患者の滑液から単離したＴ細胞は、同じドナーであるが末梢血から単離したＴ細胞と比較して多量のＫｖ１．３を発現する。このＫｖ１．３高Ｔ細胞は、それがＴＥＭ細胞であることを示すＣＣＲ７−であった［Beeton et al., 2006］。
６）Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）ヒト患者の末梢血リンパ球から生成した、Ｔ１ＤＭに関連した自己抗原インスリン及びＧＡＤ６５に特異な短期抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、ＣＣＲ７抗原（ＣＣＲ７−）の不足及びＫｖ１．３高チャンネル表現型を含むＴＥＭ細胞の特性を示す［Beeton et al., 2006］。
ＴＥＭ細胞の膜電位制御が、Ｋｖ１．３チャンネルの活性によってのみ支配されるため、それらの細胞の増殖、それらの機能活性、及び自己免疫疾患の症状は、Ｋｖ１．３阻害剤の使用によって改善されるはずである。以下に示す文献における生体外及び生体内でのデータが、この予測を支持している。
１）ＴＥＭの特性（ＣＣＲ７−，Ｋｖ１．３高）を持ち、ミエリン抗原に特異的である慢性的に活性化したヒトＴ細胞株［Wulff et al., 2003］又はＲＡ患者の滑液から単離したＴＥＭ細胞の生体外での増殖は、ＳｈＫ［Wulff et al., 2003］、ＳｈＫ（Ｌ５）等のＫｖ１．３特異的遮断ペプチド、もしくは小分子Ｋｖ１．３遮断薬ＰＡＰ−１［Beeton et al., 2006］によって、完全且つ永久に抑制される。
２）他の高親和性Ｋｖ１．３遮断ペプチドであるマルガトキシン毒を用いた生体内での実験は、Ｋｖ１．３の遮断がミニブタにおける遅延型過敏症反応の阻害を導くことを示す。この反応は、エフェクターメモリＴ細胞の活性の良好な尺度になる［Koo et al., 1997］。
３）（エフェクター段階中）受容動物中にペプチドを繰り返し適用すると共に、ＭＢＰによって生体外で刺激する間（感作段階）の、ＳｈＫ又はＳｈＫ−Ｄａｐ２２を用いたＭＢＰ特異性ラットＴ細胞の治療は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）のルイスラットへの養子移植を妨げた［Beeton et al., 2001］。ラットのＥＡＥ［Ben Nun and Cohen, 1982］は、類似の病変形成及び神経学的異常を特徴とするヒト疾患ＭＳに対して最も良く特徴付けられたモデルであり、Ｔ細胞集団を引き起こす疾患は、Ｋｖ１.３高チャンネル表現型を有するミエリン特異性ＴＥＭである。また、Ｋｖ１．３及びＩＫＣａ１チャンネル遮断薬の併用は、その発現を受けて投与した場合にＥＡＥの兆候を改善した［Beeton et al., 2001］。
４）ダーク・アグーチ・ラットにおけるプリスタン誘導のＭＨＣクラスＩＩ拘束性慢性関節炎モデル（ＰＩＡ）は、ヒト疾患の間接リウマチに対するラットのモデルである。ＳｈＫ（Ｌ５）の１日１回の投与は、試用期間（最長３４日）中に疾患にかかった関節の数を大きく低減した［Beeton et al., 2006］。
５）実験的自己免疫性糖尿病（ＥＡＤ，ヒトのＴ１ＤＭに対するラットモデル）を妨げるＫｖ１．３阻害剤の有効性は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＤＰ−ＢＢ／Ｗラットにおいて研究された［Beeton et al., 2006］。Ｋｖ１．３の高親和性及び選択性小分子遮断薬であるＰＡＰ−１の連日反復投与は、賦形剤のみで治療した対照動物と比較して、ＥＡＤの症状を示すラットの割合を約５０％まで低減した（１１０日齢で評価した）。これは、膵島内Ｔ細胞及びマクロファージ浸潤の減少を伴い、賦形剤で治療した対照と比較してＰＡＰ−１で治療したグループにおけるβ細胞の破壊を低減した（３５〜７０日齢で評価した）［Beeton et al., 2006］。
Ｋｖ１．３特異的阻害剤によるＴ細胞増殖の阻害は、ＴＥＭ細胞に特異的であり、その化合物を自己免疫疾患の管理又は予防に対する理想的なツールとする。未処理細胞及びＴＣＭ細胞を静止させる抗原誘導の増殖は、Ｋｖ１．３媒介の阻害剤に対して部分的に感受性があるが、ＩＫＣａ１チャンネルの転写性上方規制は、活性化前のＴ細胞においてこれを克服し、その細胞の増殖を、Ｋｖ１．３阻害剤ではなくＩＫＣａ１阻害剤に対して感受性があるものとする［Ghanshani et al., 2000］。異なるＴ細胞サブセットに関するこのＫｖ１．３及びＩＫＣａ１阻害剤の制限的作用は、Ｋｖ１．３について与えられた分子の選択性がＩＫＣａ１よりも重要であることを明確に示す。また、最近、Ｋｖ１．３阻害剤によるＴＥＭ増殖の阻害は、正常の保護メモリ免疫反応中に病原体及びワクチン抗原によるＴＥＭ細胞の活性化を模倣する過剰な抗原刺激によって克服できることが示された［Beeton et al., 2006］。従って、高親和性及び高選択性のＫｖ１．３阻害剤の適用は、自己免疫反応の間繰り返し活性化されるＴＥＭ細胞を標的とする一方で、不変の免疫系の他の保護機能をそのままにしておくことが理想的である。
ヒトＴ及びＢリンパ球に加えて、Ｋｖ１．３チャンネルはまた、幾つかの器官及び組織（中枢神経系、腎臓、肝臓、骨格筋を含む）において発現し、該細胞におけるＫｖ１．３チャンネルの遮断が、大きな副作用を引き起こし得る。生体外での広範囲な毒性試験、及び生体内での急性・慢性の毒性試験は、これまでにペプチド遮断薬グループからのＳｈＫ（Ｌ５）［Beeton et al., 2005; Beeton et al., 2006］及び小分子遮断薬のグループからのＰＡＰ−１［Schmitz et al., 2005; Beeton et al., 2006］に対して行われた。これらの研究は、神経学的及び心臓の副作用又はＫｖ１．３が発現する組織における病理組織学的な変化についての臨床症状の不足を示した。従って、上述したＫｖ１.３遮断薬の有益な治療効果は、最小の又は完全欠如の副作用と組み合わせて、自己免疫疾患の管理における選択的Ｋｖ１．３遮断薬の適用性を示す。
要約すると、上述のデータは、生理学的免疫応答の遂行においてＫｖ１．３ Ｋチャンネルの重要な役割を示唆しており、Ｋｖ１．３チャンネルの阻害による自己免疫疾患における治療的介入の適用性を示す。
本発明は、メキシコサソリのＶ．メキシカナスの毒液から単離される新規なペプチド：Ｖｍ２３，Ｖｍ２４及び機能的に同等なその類似体の同定及び使用に関するものであり、それらは、特異的なイオン電導度を遮断することによって、ヒトリンパ球からのｈＫｖ１．３チャンネルの機能を高い親和性及び特異性で遮断することが可能である。本発明の他の実施態様において、本発明者らは、Ｖｍ２３、Ｖｍ２４及び機能的に同等なその類似体を備える医薬品組成物、その使用によってＫｖ１．３カリウムチャンネルを遮断する方法、各種免疫条件の治療方法、診断的適用方法、並びにその化学合成方法及び正確な折り畳み方法を開示する。それらペプチドは、従来の高速液体クロマトグラフィーを用いて単離され、エドマン分解及び質量分析によって決定した一次アミノ酸配列を有し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２に示される一次構造を示した。Ｖｍ２４は、分子量３８６３．５ダルトンを持つ３６のアミノ酸を含有する。それは、Ｃ６及びＣ２６、Ｃ１２及びＣ３１、Ｃ１６及びＣ３３、Ｃ２１及びＣ３６の位置における対のシステイン間にあることが質量分析によって確立された四つのジスルフィド架橋によって維持される緊密化した分子であり、ここで、文字Ｃは、システイン残基の略称を示し、その番号は、アミノ酸配列中での相対位置に対応する。ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸は、アミド化されている。完全なペプチドは、メリフィールド固相法を用いて化学合成され、該合成ペプチドの正確な折り畳みが得られ、化学的分析及び機能的分析の双方によって確認された。Ｖｍ２４は、比較的高濃度で注入した場合、マウスに対して毒性がない（体重２０ｇのマウスにつき２００マイクログラムまで、即ち１００００マイクログラム／キログラムマウス体重までアッセイした）。生体外でヒトリンパ球に適用した場合、それは、パッチクランプ法によってアッセイしたところ、ｈＫｖ１．３チャンネルに対して非常に高い親和性を示す。それは、ほとんど不可逆的な方法でｈＫｖ１．３チャンネルに結合し、低いピコモル濃度範囲（３ピコモル濃度−３ｐＭ未満）でＫｄ値を示す。１０ナノモル濃度（１０ｎＭ）でアッセイした場合、ｈＫｖ1.４、ｈＫｖ１．５、ｒＫｖ２．１、ｈＢＫ及びｈＥＲＧ−チャンネルというイオンチャンネルのカリウム電流、並びに電位開口型心臓Ｎａ＋チャンネル（ｈＮａｖ１．５）の電流を変更しない。チャンネルｈＩＫＣａ１、ｍＫｖ１．１及びｈＫｖ１．２に対して１０ｎＭの濃度での電流阻害は、ｈＫｖ１．３に対する１００％の閉塞とは対照的に、約２０〜５０％である。毒素は、３ｐＭ程度の低濃度でｈＫｖ１．３電流の５０％以上を遮断し、従って、アッセイした他のどんなチャンネルよりもこのチャンネルの方が約１５００倍効果的である。
Ｖｍ２４で実施した致死試験は、最大２００マイクログラム／マウス体重２０ｇの濃度で用いて中毒症状が観察されなかった。遅延型過敏症（ＤＴＨ）に対するラットモデルに適用したＶｍ２４は、実験動物を保護した。ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＥＢ）による実験ラットの皮膚感作は、大きな免疫応答（耳の発赤及び肉眼的炎症）を引き起こす。治療開始後６日目にＶｍ２４を１０マイクログラム単回投与したラットのグループは、注目すべき免疫応答を示しており、治療した耳の炎症は、溶媒治療のみを受けた対照ラットと比較して大きく減少した（少なくとも６０％小さい炎症）。
また、Ｖｍ２３という関連ペプチドは、同じ毒液から単離され、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で見られるように完全に配列を決定した。このペプチドは、Ｖｍ２４と８３％一致しており、四つのジスルフィド架橋によって密集した３５のアミノ酸残基を有し、分子量３６６５ダルトンを示す。Ｖｍ２３は、Ｖｍ２４と同等の機能：ｈＫｖチャンネルに対する高い親和性及び特異性を示す。チャンネルｈＫｖ１．３、ｈＩＫＣａ１、ｍＫｖ１．１及びｈＫｖ１．２に対してＶｍ２３濃度１０ｎＭでの電流阻害は、それぞれ約９５％、１％、３％及び９％である。
Ｋチャンネルに特異的な１２５を超える他の既知のサソリペプチド［Bagdany et al., 2005］を用いた両ペプチドの系統発生解析は、Ｖｍ２３及びＶｍ２４が既に開示されたサソリ毒の構造の２０のサブファミリーのいずれにも含まれないことを示す。それらは、新しい構造的なサブファミリーの最初の２例であり、ここで、α−ＫＴｘ２１と名付けることを提案する。よって、Ｖｍ２４及びＶｍ２３は、それぞれα−ＫＴｘ２１．１及びα−ＫＴｘ２１．２と名付けられる。Ｋチャンネルに特異的なサソリ毒の新しいサブファミリーを決定するのに使用される基準のうち、現在使用されている体系的な命名法（［Tytgat et al., 1999］参照）を設けた科学者の国際パネルによれば、一次構造が他のものと少なくとも５０％異なる必要がある。実際、Ｖｍ２３及びＶｍ２４の双方は、他の既知の毒素と約５０％未満の配列同一性を示す。
当該分野の最先端の知識に基づいて、それらの特性は、Ｖｍ２３、Ｖｍ２４及び機能的に同等なそれらの類似体を免疫抑制並びに免疫疾患の診断及び治療の優れた候補とする。
この開示に含まれる図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に明らかにするためにここに含まれる。完全な発明は、一つ又はそれ以上の図面をここに示す特定の実施態様の詳細な説明、特に以下の実施例のセクションで補うことでより理解できる。
サソリのＶ．メキシカナスからの可溶性毒液１ｍｇのＨＰＬＣ分離である。８０を超える異なる成分が、６０分にわたる０％から６０％の溶液Ｂ（０．１２％ＴＦＡのアセトニトリル）の傾斜を用いた溶液Ａ（０．１０％ＴＦＡの水）で平衡化されたＣ１８逆相カラム（Vydac, Hisperia, CAのカタログ番号218TP54）中への可溶性毒液の適用によって分離して得られた。保持時間２３分及び２４分での番号１及び２は、それぞれＶｍ２３及びＶｍ２４の溶出位置を示す。その二つのクロマト分画の一つ一つの追加の分離を同じシステムで行ったが、溶液Ａから４０％の溶液Ｂまでの線形勾配を用い、両方のペプチドに対して６０分間行った。その結果を差し込み図として示す。差し込み図中のアスタリスクは、高度に精製されたペプチドの溶出位置を示す。 Ｖｍ２３、Ｖｍ２４及びコンセンサスのアミノ酸配列である。Ｖｍ２３及びＶｍ２４の配列は、天然ペプチドと還元・アルキル化したサンプルとの直接エドマン分解を、後述する配列を示す特異的酵素（エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ及びＬｙｓ−Ｃ）を持つ純ペプチドの酵素的切断によって得られるペプチドの質量分析と組み合わせて得られた。酵素加水分解及びＨＰＬＣ分離後に精製したペプチドのアミノ酸配列は、質量分析（ＭＳ／ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化による質量分析断片化を意味する）によって同定された。各配列において、様々な方法によって同定したセグメントを表示する。直接は、エドマン分解を意味し、Ａｒｇ−Ｃ及びＬｙｓ―Ｃは、酵素消化後に精製した断片である。ＭＳは、単に欠損したアミノ酸の分子量に基づく同定を意味する。コンセンサス配列は、Ｖｍ２３又はＶｍ２４の配列と一致した３０のアミノ酸残基を有する。「ｘ」とラベルした位置については、ｘ１がタンパク質の三次元折り畳みを破壊しない任意のアミノ酸であり、更に良くはＫ又はＰであり；ｘ２がタンパク質の三次元折り畳みを破壊しない任意のアミノ酸であり、更に良くはＬ又はＰであり；ｘ３がタンパク質の三次元折り畳みを破壊しない任意のアミノ酸であり、更に良くはＫ又はＲであり；ｘ４がタンパク質の三次元折り畳みを破壊しない任意のアミノ酸であり、更に良くはＳ又はＮであり；ｘ５がタンパク質の三次元折り畳みを破壊しない任意のアミノ酸であり、更に良くはＫ又はＲであり；ｘ６がタンパク質の三次元折り畳みを破壊しない任意のアミノ酸であり、更に良くはＹか又は何もない。 Ｖｍ２４がアミド化Ｃ末端を有する。Ｃ末端の衝突誘起解離（ＣＩＤ）［Ｍ＋Ｈ］＋イオン（ｍ／ｚ９０９．４ ａ．ｍ．ｕ．）（モノアイソトピック分子量）は、期待される理論値［Ｍ＋Ｈ］＋９１０．５ａ．ｍ．ｕ．よりも１．０単位少ない。アミド化Ｃ末端配列に対応するｙイオンシリーズ（イタリック）を、１）と表示された挿入部分に示す。遊離カルボキシ末端ペプチドのｙイオンシリーズの理論値（ＴＶ−ＣＯＯＨ）、アミド化Ｃ末端のｙイオンシリーズの理論値（ＴＶ−ＮＨ２）及びｙイオンシリーズの実験値（ＥＸＰ．）を、挿入した表（２と表示された挿入部分）において比較する。 ジスルフィドの帰属のためのＶｍ２４ヘテロに量体である。番号１及び２は、ｐＨ６．５でのトリプシン及びキモトリプシンを用いたＶｍ２４の同時タンパク質切断によって生成したヘテロ二量体の分子量及び模式的な構造を示す。［Ｍ＋Ｈ］＋イオン（ｍ／ｚ７８８．０ａ．ｍ．ｕ．）は、システイン半ペア（half-pair）Ｃ４−Ｃ８を含有するヘテロ二量体の分子量に対応し（番号１）、［Ｍ＋Ｈ］＋イオン（ｍ／ｚ５６０．４ａ．ｍ．ｕ．）は、システイン半ペアＣ３−Ｃ７を含有するヘテロ二量体の分子量に対応する（番号２）。 Ｖｍ２４システイン半ペアである。Ａ）は、［Ｍ＋２Ｈ］＋２イオン（ｍ／ｚ１０９９．７４ａ．ｍ．ｕ．）の両方のシステイン半ペアＣ１−Ｃ４及びＣ２−Ｃ６を含有する複合体コアの構造に対応する質量分析である。これを断片化し、図４Ｂに示すＭＳ／ＭＳスペクトルを作成した。１１３７〜１５０７ａ．ｍ．ｕ．のｂイオンシリーズの値は、明白に、少なくとも二つのシステイン半ペアの帰属を確認する標識ＧＳＰＥを示す。Ｂ）は、この図のＡ部分に記載の質量分析によって決定された、Ｖｍ２４の完全なジスルフィド架橋配置を示す。 合成Ｖｍ２４のＨＰＬＣ精製である。合成的に調製したＶｍ２４（５０ミリグラムタンパク質）をＣ１８逆相分取カラムで分離した。番号１は、合成し正確に折り畳まれたＶｍ２４の溶出位置を示し、一方、２及び３は、不正確に折り畳まれたか又は切り詰められた配列を示す。このクロマト分画の追加の分離を同じシステムで行ったが、６０分間、溶液Ａから４０％の溶液Ｂまでの線形勾配で展開した分析カラムを用いた。その結果を差し込み図として示す。 合成および天然Ｖｍ２４ペプチドのＨＰＬＣ比較である。Ａ）図１に記載のＨＰＬＣシステムにおける、１０マイクログラムの天然Ｖｍ２４の分析Ｃ１８カラム（Vydac, Hisperia, CAのカタログ番号218TP54）中への適用は、６０分間溶液Ａから４０％の溶液Ｂまでの線形勾配で展開した場合、純ペプチドが３２．６７分で溶出することを示す。Ｂ）同じシステム及び条件において合成的に調製し折り畳まれた１５ミリグラムのＶｍ２４のクロマトグラフである。Ｃ）同一の保持時間で同時溶出することを示す合成及び天然Ｖｍ２４の１：１の混合物（合計８マイクログラム）の同時注入である。グラフのＸ軸は、三つのグラフを比較して観察できるようにするため、文字Ｂ及びＣを右側にシフトし分離しているが、そうでなければ、独立した三つのＨＰＬＣ実験の流出時間が同一のピークに入れられ、区別できなくなることに言及する価値がある。 Ｖｍ２３及びＶｍ２４の配列及び系統発生解析である。Ａ）最も密接に関わるα−ＫＴｘｓでのＶｍ２３及びＶｍ２４の多重配列アライメントである。該アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ［Thampson et al., 1997］ソフトウェアで実行され、Ｖｍ２４との配列同一性（％Ｉ、最終カラム）をＢｉｏＥｄｉｔで計算した。 Ｂ）ＭｒＢａｙｅｒｓ ３．０ｂ４［Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist and Huelsenbeck, 2003］で計算した単純化した系統樹である。Ｖｍ２３及びＶｍ２４は、一緒にクラスター化し、サブファミリーα−ＫＴｘ６のメンバーと実質的に異なる。 Ｖｍ２４によるリンパ球イオンチャンネルの選択的遮断である。Ａ）１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位から＋５０ｍＶまでの脱分極パルスに応答して、ｈＫｖ１．３チャンネルを通過する細胞全体でのカリウム電流をヒトＴ細胞から誘発した。Ｖｍ２４がない場合の電流（対照、矢印で示す）は、１ｎＭのＶｍ２４が細胞外培地での灌流によって細胞に投与される場合、ほぼ完全に遮断される。矢印は、Ｖｍ２４の第１パルスを示す。 Ｂ）１ｎＭ（黒丸）又は０．３ｎＭ（白丸）のＶｍ２４の適用を受けて、時間に応じた正規化ピーク電流を示す。矢印は、毒の適用の開始を示す。 Ｃ）３ｐＭのＶｍ２４を細胞に適用し、次いで細胞外培地から除去する（洗い流す）ときの時間に応じたリンパ球の正規化ピーク電流を示す。毒のない培地での灌流は、約３８００ｓの時定数で遮断からの非常に緩除な部分回復を生じる。パルスを３０秒毎に送った。 Ｄ）Ｖｍ２４の用量反応関係は、毒の濃度に応じた残留電流割合（ＲＣＦ＝Ｉ／Ｉ０）（ここで、Ｉ及びＩ０は、それぞれ毒の存在又は非存在下で測定したピーク電流である）をプロットし、割合：ＲＣＦ＝Ｋｄ ｎ／（Ｋｄ ｎ＋［Ｔｘ］ｎ）（ここで、［Ｔｘ］は毒の濃度を示し、Ｋｄは解離定数である）によってデータ点を適合することで得られた。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３〜６）を示す。このようにして作成した用量反応関数は、Ｋｄ＝２．９ｐＭで、Ｈｉｌｌ係数ｎが約１である。 Ｅ）Ｔリンパ球のＣａ２＋活性化Ｋチャンネル（ｈＩＫＣａ１）をＣｏｓ−７細胞で発現し、１０ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの−１２０〜＋５０ｍＶの電圧ランプによって電流を誘発した。毒を適用する前に記録した電流追跡（対照）、１０ｎＭのＶｍ２４の存在下４．５分間の遮断平衡後に記録した電流追跡、２．５分間の毒の洗い流し（洗浄）後に記録した電流追跡を示す。 Ｆ）１ｎＭ及び１０ｎＭのＶｍ２４の存在下でのｈＩＫＣａ１電流の残留割合をｓ／ｓ０で算出した。ここで、ｓ及びｓ０は、それぞれＶｍ２４の存在下及び非存在下、電圧ランプによって誘発したＩ−Ｖの関係の傾きである。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３）を示す。 Ｖｍ２４は、Ｓｈａｋｅｒファミリー（Ｋｖ１．ｘ）チャンネルの中でｈＫｖ１．３に対して選択的である。毒を適用する前（対照）、１０ｎＭのＶｍ２４による遮断平衡後、及び毒の洗い流し（洗浄）後に記録した電流追跡を示す。Ａ）ｍＫｖ１．１チャンネルをＬ９２９細胞で発現し、３０ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。平衡遮断が６分で発現し、洗い流し期間は５分であった。 Ｂ）ｈＫｖ１．２チャンネルをＣｏｓ−７細胞で発現し、３０ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。平衡遮断が５．５分で発現し、洗い流し期間は７分であった。 Ｃ）ｈＫｖ１．３チャンネルを末梢血リンパ球で内因的に発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。平衡遮断が３．５分で発現し、洗い流し期間は４．５分であった。 Ｄ）高速不活性化除去したｈＫｖ１．４（Ｋｖ１．４ΔＮ）チャンネルをＣｏｓ−７細胞で発現し、３０ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。Ｖｍ２４適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ５分及び４．５分であった。 Ｅ）ｈＫｖ１．５チャンネルをＭＥＬ細胞で発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。Ｖｍ２４適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ６分及び３．５分であった。 Ｖｍ２４は、様々な生物学的に重要なイオンチャンネルを遮断又は阻害しない。毒の適用前（対照）、１０ｎＭのＶｍ２４による遮断平衡後、及び毒の洗い流し（洗浄）後に記録した電流追跡を示す。Ａ）ｒＫｖ２．１チャンネルをＣｏｓ−７細胞で発現し、３０ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。Ｖｍ２４適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ７分及び３分であった。 Ｂ）ｈＥＲＧチャンネルをＨＥＫ細胞で発現し、＋２０ｍＶまでの電圧ステップと、次いでピーク電流を測定する間は−４０ｍＶまでのステップとによって電流を誘発した。保持電位は−８０ｍＶであり、３０ｓ毎にパルスを送った。Ｖｍ２４適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ５分及び２．５分であった。 Ｃ）ｈＢＫ（ＫＣａ１．１）チャンネルをｔｓＡ−２０１細胞で発現し、０ｍＶの保持電位からの−１２０ｍＶまでの１０−ｍｓ過分極によって進行した５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。５ｓ毎にパルスを送った。Ｖｍ２４適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ４分及び１分であった。 Ｄ）Ｎａｖ１．５チャンネルをＣｏｓ−７細胞で発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。Ｖｍ２４適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ１分及び１分であった。 Ｖｍ２４の選択性プロファイルである。棒は、１ｎＭの濃度（Ａ）で適用されたＶｍ２４による表示チャンネルの平衡遮断における残留電流割合を示す。データは、ｎ≧３の独立した実験に対する平均±ＳＥＭとして示される。発現システム及びＲＣＦの計算及び他の条件については、図９〜１１に対する説明文中の詳細を参照する。 棒は、１０ｎＭの濃度（Ｂ）で適用されたＶｍ２４による表示チャンネルの平衡遮断における残留電流割合を示す。 合成Ｖｍ２４によるｈＫｖ１．３チャンネルの高親和性遮断である。Ａ）３０ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの脱分極パルスに応答して、ｈＫｖ１．３チャンネルを通過する細胞全体でのカリウム電流をヒトＴ細胞から誘発した。ペプチドの不在下で記録した電流（対照、矢印で示す）は、１００ｐＭの合成Ｖｍ２４（ｓＶｍ２４）が細胞外培地での灌流によって細胞に投与される場合、実質的に遮断される（＞９０％）。矢印は、ｓＶｍ２４の第１パルスを示す。 Ｂ）１００ｐＭのｓＶｍ２４の適用を受けて、時間に応じた正規化ピーク電流を示す。矢印は、毒の適用の開始を示す。ｓＶｍ２４のない溶液で細胞を灌流する場合、遮断からの大きな回復は達成されない（矢印は洗い流し期間の開始を示す）。 Ｃ）棒は、１００ｐＭの濃度で適用されたｓＶｍ２４及びＶｍ２４によるｈＫｖ１．３の平衡遮断における残留電流割合を示す。データは、ｎ≧３の独立した実験に対する平均±ＳＥＭとして示される。発現システム及びＲＣＦの計算及び他の条件については、図９〜１１に対する説明文中の詳細を参照する。 Ｖｍ２３は、ｈＫｖ１．３に対して選択的である。毒の適用前（対照）、１０ｎＭのＶｍ２３による遮断平衡後、及び毒の洗い流し（洗浄）後に記録した電流追跡を示す。１０ｎＭの濃度のＶｍ２４によって著しく遮断したイオンチャンネルをＶｍ２３の薬理学的プロファイリングに選択した。Ａ）ｈＫｖ１．３チャンネルを末梢血リンパ球で内因的に発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。平衡遮断が３．５分で発現し、洗い流し期間は２分であった。 Ｂ）Ｔリンパ球のＣａ２＋活性化Ｋチャンネル（ｈＩＫＣａ１）をＣｏｓ−７細胞で発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの−１２０〜＋５０ｍＶの電圧ランプによって電流を誘発した。Ｖｍ２３適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ３．５分及び２分であった。 Ｃ）ｍＫｖ１．１チャンネルをＬ９２９細胞で発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。Ｖｍ２３適用期間及び洗い流し期間は、それぞれ３．５分及び１分であった。 Ｄ）ｈＫｖ１．２チャンネルをＣｏｓ−７細胞で発現し、１５ｓ毎に−１２０ｍＶの保持電位からの＋５０ｍＶまでの電圧ステップによって電流を誘発した。平衡遮断が３．５分で発現し、洗い流し期間は２分であった。 Ｖｍ２３の選択性プロファイルである。棒は、１０ｎＭの濃度で適用されたＶｍ２３による表示チャンネルの平衡遮断における残留電流割合を示す。データは、ｎ≧３の独立した実験に対する平均±ＳＥＭとして示される。発現システム及びＲＣＦの計算及び他の条件については、図９及び１４に対する説明文中の詳細を参照する。 ラットの遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応である。３匹のラットからなる二つのグループをそれぞれ感作し、ＤＮＦＢの適用により試験した。一方のグループはＰＢＳのみの注入を受け（対照、番号１）、他方は１０マイクログラムのＶｍ２４の単回注入を受けた（グループ２）。この処置の後、耳の測定を２４時間行った。対照の棒は、対照ラットに対してＤＮＦＢで試験した後の耳の厚みを示し、一方、治療グループ（グループ２）に対応する棒は、Ｖｍ２４で処置したラットの耳の厚みを示す。対照ラットと比較した場合、Ｖｍ２４を受けたラットに炎症の約６０％の減少が観察された。
定義
別段の定義がない限り、ここで用いるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。ここで用いるように、以下の用語は、特記されない限り、それらに帰する意味を有する。ここで説明するものと類似又は同等の方法及び材料はいずれも本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料を説明する。本発明の目的ため、以下に用語を定義する。
本発明において、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」の用語は、本発明のペプチド分子を指すのに区別なく使用される。
「Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性」の用語は、概して、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル阻害剤の存在によって生じた、該Ｋｖ１．３チャンネルを通過するカリウムイオン流れの阻害の程度についての実際の概算を指す。
「Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断薬」の用語は、概して、イオン伝導経路を直接閉鎖することによって、該チャンネルを含有する細胞膜のＫｖ１．３チャンネルを通過するカリウムイオンの流れを阻害する物質を意味する。
「類似体」の用語は、概して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を共有する任意のポリペプチド鎖を意味する（３６の位置に対して３０の一致）。限定されないが、最大で６のアミノ酸の変更、一つ又はそれ以上の非天然アミノ酸残基、該残基の一つ又はそれ以上の化学的誘導体化、並びに他のアミノ酸残基又は他の有機部分のいずれかによるＮ末端及び／又はＣ末端伸長を挙げることができる。
「対配列同一性パーセンテージ」は、概して、二つのタンパク質配列を並べたときの二つの並べられた配列における全ての位置に対して同一のアミノ酸を有するアミノ酸残基位置間の係数を意味する。
「機能的に同等な」の用語は、概して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と同様なＫｖ１．３への親和性及び選択性を示す任意の分子構造を意味し、但し、それは、親和性及び／又は特異性についての同一の構造的決定因子を共有し、それらの配列にＫｖ１．３チャンネルに関する高い親和性及び選択性を与える。それは、類似体又はペプチド模倣物である。
「親和性及び／又は特異性の構造的決定因子」の用語は、概して、ｈＫｖ１．３チャンネルに対して高い親和性及び特異性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を与えるポリペプチド構造上の全ての官能基及びその三次元位置を意味する。親和性及び特異性の構造的決定因子は、同一の、部分的に重複する又は異なるアミノ酸残基に関係している場合がある。
「官能基」の用語は、概して、ポリペプチド主鎖又はそのアミノ酸残基の側鎖におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３内の所定の化学的部分を意味し、ｈＫｖ１．３チャンネルと特異的且つ強固に接触するため、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｈＫｖ１．３チャンネルに対する親和性及び選択性を決定する。
「機能的に同等な類似体」の用語は、概して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を共有する任意のポリペプチド鎖を意味する（３６の位置に対して３０の一致）。限定されないが、一つ又はそれ以上の非天然アミノ酸残基、該残基の一つ又はそれ以上の化学的誘導体化、並びに他のアミノ酸残基又は他の有機部分のいずれかによるＮ末端及び／又はＣ末端伸長を挙げることができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と同様なＫｖ１．３への親和性及び選択性を示す。
「ペプチド模倣物」の用語は、概して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と類似の三次元構造位置にて同一の官能基を示す任意の化合物を意味しており、従って、ｈＫｖ１．３チャンネルとのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の特異的な接触を模倣する。
「本発明のペプチド」の用語は、概して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するペプチドを意味し、Ｃ６及びＣ２６、Ｃ１２及びＣ３１、Ｃ１６及びＣ３３並びにＣ２１及びＣ３６の位置における対のシステイン間にあることが確立された四つのジスルフィド架橋によって三次構造を維持しており、ここで、文字Ｃは、システイン残基の略称を示し、その番号は、並べられたアミノ酸配列中での相対位置に対応する。例示的な好ましいペプチドは、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（Ｖｍ２３）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（Ｖｍ２４）を有するペプチドである。前記ペプチドは、カリウムチャンネルＫｖ１．３を高い親和性及び特異性で遮断することが可能である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の機能的に同等な類似体、即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を共有するもの（３６の位置に対して３０の一致）が含まれ、それらは、四つのジスルフィド架橋によって維持された三次構造を保存し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と同様なｈＫｖ１．３への親和性及び選択性を示す。
「薬学的に許容されるキャリアー」の用語は、標準的な医薬品キャリアー、緩衝液及び賦形剤をいずれも包含し、リン酸緩衝食塩水、水、及び乳濁液（油／水又は水／油の乳濁液等）、並びに様々な種類の湿潤剤及び／又はアジュバンドを含む。適切な医薬品キャリアー及びその製剤は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Mack Publishing Co., Easton, 19th ed. 1995）に記載されている。好適な医薬品キャリアーは、対象とする活性剤の投与方法によって決まる。典型的な投与方法は、以下に説明される。
「薬学的に許容される塩」の用語は、非毒性酸付加塩を指しており、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、過塩素酸等の無機酸で形成される塩、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸等の有機酸で形成される塩が含まれる。他の薬学的に許容される塩には、限定されないが、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属に基づく陽イオン、並びに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等の非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム及びアミン陽イオンを含む無機硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等が挙げられる。
「医薬品組成物」の用語は、哺乳動物対象又はヒト対象を含む対象への薬学的使用に適した組成物を意味する。医薬品組成物は、概して、効果的な量の活性剤と薬学的に許容されるキャリアーとを備える。
「効果的な量」の用語は、特定活性剤の投与量を意味し、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有するペプチドの場合においては、例えば、哺乳動物の免疫応答を抑制すること、治療を必要とする対象の自己免疫疾患を治療すること、哺乳動物の免疫系のＴ-細胞活性化過程を抑制すること、Ｔリンパ球におけるカルシウム信号経路を減衰させることといった所望の結果を実現するのに十分な特定活性剤の投与量を意味する。所望の結果は、上記投与量を受ける対象（細胞を含む）において客観的又は主観的な改善を備えてもよい。
「対象」の用語は、ヒトを含む哺乳動物を意味することを目的としている。治療されるヒトでない哺乳動物の対象には、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコが含まれる。
「自己免疫疾患」の用語は、概して、生物体の恒常性に影響する生物体の免疫細胞によって動かされる病的状態を意味する。
「リンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患」の用語は、生物体を攻撃する細胞がリンパ球ＴＥＭ細胞である場合の任意の自己免疫疾患を意味する。それらの疾患の中には、限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎、及び骨吸収歯周病が含まれる。
「予防的治療」の用語は、疾患の徴候を示さないか又は疾患の初期症状のみを示す対象に対して投与される治療であり、ここで、該治療は、病的状態、特には自己免疫疾患、より具体的にはリンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患が発症する危険を減少させる目的で投与される。
「治療上の処置」の用語は、病変の徴候を示す対象に対して投与される治療であり、ここで、該治療は、その病的徴候、特には自己免疫疾患、より具体的にはリンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患を軽減又は解消する目的で投与される。
「器官」の用語は、心臓、肝臓、肺、腎臓、脳、副腎、血管内皮系、免疫系等の体組織を意味する。
「分子プローブ」の用語は、概して、標的細胞、細胞構造、受容体又は高い親和性及び特異性でプローブが結合できる任意の分子の同定に対して特に使用できる任意の化学物質又は生物学的物質を意味する。
「非必須アミノ酸」の用語は、概して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３内のアミノ酸であって、結果として生じる類似体のＫｖ１．３チャンネルに対する親和性及び特異性を実質的に変えずに、他のアミノ酸と交換できることができるアミノ酸を意味する。
主な発見
本発明の主題は、二つの新規なペプチド（Ｖｍ２３及びＶｍ２４）、そのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、並びに機能的に同等な類似体の可能性及び特定の免疫抑制剤としてのその使用の可能性について言及する。Ｖｍ２３及びＶｍ２４は、亜型Ｋｖ１．３、特にはヒトリンパ球（ｈＫｖ１．３）のカリウムイオンチャンネルの高選択性遮断薬であり、生体内でラットにおける遅延型過敏症反応への炎症反応を減少させることが示される。従って、それら二つのぺプチド及びその機能的に同等な類似体は、異常Ｔ細胞応答に関連した一部の免疫疾患の治療に使用されるリード化合物である。その免疫抑制剤及びそのｈＫｖ１．３への効果の詳細に入る前に、この分野におけるいくつかの基礎的な知識を復習することが重要である。
全ての細胞の膜電位の調整は、主として、単純にＫチャンネルと呼ばれるカリウムイオンに対して透過性のあるイオンチャンネルの存在によって維持される。個別の細胞は、幾つかの異なるＫチャンネルを発現し、電圧、細胞内カルシウムレベル又は特定のリガンドの変化に応じて開閉することができるが、電位開口型チャンネルが最も一般的である［Gutman et al., 2005］。Ｋチャンネルの機能を調整できる天然リガンドの中には、蜂、サソリ、ヘビ及びイソギンチャクの毒液からの毒素がある［Castle et al., 1989; Jouirou et al., 2004; Rodriguez de la Vega and Possani, 2004］。かかる毒素の例は、サソリCentruroides noxiusからのノキシウストキシン［Carbone et al., 1982］、サソリLeiurus quinquestriatusからのチャリーブドトキシン［Miller et al., 1985］、サソリAnuroctonus phayodactilusからのアニュロックトキシン［Bagdany et al., 2005］、アネモナBundosoma granuliferaからのＢｇＫ［Aneiros et al., 1993］及びStichodactyla helianthusからのＳｈＫ［Castaneda et al., 1995］である。これらの毒は、Ｋｖ１．３を含む様々な異なる種類及び亜型のＫ＋チャンネルを異なる親和性及び特異性で遮断することが示された［Panyi et al.によって概説されている（2006）］。Ｋｖ１．３チャンネルは、Ｔリンパ球増殖及びリンホカイン生成に関与しており、Ｋｖ１．３の遮断薬は、潜在的な免疫抑制剤として関心を集めている［Panyi et al. 2006］。
これらＫチャンネルに特異的な毒の幾つかは、その三次元構造が決定された（［Mouhat et al., 2004]で概説されている）。六つの膜貫通セグメントを含有する二つの電圧依存性Ｋチャンネルについての３次元構造の解明［Lee et al., 2005: Long et al., 2005］及び幾つかのグループによって行われた二重変異体（毒及びチャンネル）の実験［Goldstein et al., 1994; Stampe et al., 1994; Aiyar et al., 1995; Hidalgo and Mackinnon, 1995］の結果、幾つかのリガンドのＫチャンネルとの接触面を同定した。今日まで知られているサソリの毒に関し、１２５を超える異なるペプチドが研究され、そのアミノ酸配列が報告された［Rodriguez de Ia Vega and Possani, 2004］。そのペプチドは、主として一次配列の類似性、ジスルフィド架橋の位置及び機能の特異性という三つの基準に基づき、２０の異なるサブファミリーにグループ化された。本発明の目的のため、両方のペプチド（Ｖｍ２３及びＶｍ２４）を単離し、精製し、配列決定し、アッセイした。得られた独創的で独占的である重要な情報は、その一次構造の特有性と非常に特異的な機能であり、それは、その構造的な特徴の単純な観察によっては明らかにならず、本発明において示し要求するように、生体外及び生体内の双方において機能についての実験的証明を必要とする。
この研究は、当該分野におけるＶ．メキシカナス種のサソリの収集と、その毒液の電気的な刺激による抽出によって始まった。サソリは、メキシコのモレロス州において集められた。筆者は、この目的に対して公的な認可を有する（書類番号SGPA/DGVS/02483、２００５年３月１８日付でthe Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales of Mexican Governmentによって与えられた)。通常、二酸化炭素（ＣＯ２）の麻酔後に３０匹のサソリから毒を抜いた。粗毒液は、すぐに処理されるか又は使用するまで−２０℃で凍結保存される。
その後、可溶性毒液をＨＰＬＣによって分離した。更に、本発明の目的である精製ペプチドは、毒性効果の可能性のためにモデル動物としてマウスを用いて生体内でアッセイされ（致死試験）、その一次構造がエドマン分解及び質量分析によって決定された。それらの実験の詳細は、以下の例１において説明される。
毒液中の上記ペプチドの量は比較的少ないという事実によって、更にｈＫｖ１．３チャンネルに対する作用の機能性及び特異性を特徴付けるために、相当量のＶｍ２４を化学合成した。
Ｖｍ２４の化学合成
固相法によるペプチドの合成は、限定されないがポリスチレン、ポリアクリルアミド、特定の繊維、他の安定な重合体等の固相樹脂の使用を含む。固相樹脂の誘導体化は、Ｃ末端の酸を機能的に形成する方法としてクロロトリチルクロリド、２−クロロトリチルクロリド、ヒドロキシメチルフェニル、Ｓａｓｒｉｎ等の適切なハンドルが使用できたり、限定されないが４−(２',４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル)−フェノキシメチル基等の樹脂リンカーを介したタンパク質安定化によって準備されてもよい。
鎖の構築は、通常、アミノ酸保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）又は９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（ｆｍｏｃ）である保護基戦略のいずれかを含む。ペプチドの合成に用いる様々なアミノ酸の反応性側鎖は、通常保護される。一般に使用される保護基には、ｔ−ブチル、ベンジル、トリチル、メチルトリチル、ベンジル−メチルベンジル、トシル、ベンジルオキシメチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、２−クロロベンジル、２−ブロモベンジル、メトキシベンジル、ホルミル、アセトアミドメチル、ペンタメチルクロマンスルホニル、ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−スルホニル、側鎖アミンのニトロ、グアニジン類、フェノール類、アルコール類、酸、イミダゾール類、チオール及びインドール類が含まれる。一次鎖構築の間、望ましくない副反応を排除するという同一の目標を達成する他の保護基を発明し得る。
新しいアミノ酸を成長ペプチドに付加する間のアミド結合の合成は、限定されないが、対称無水物（カルボジイミド）、ＨＯＢＴエステル、フッ化アシル、限定されないがＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ等のウロニウム活性剤、限定されないがＢＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ等のホスホニウム活性剤を含む酸活性化法のいずれかを用いることで達成できる。ペプチド合成の当業者が知っていると期待されるカルボキシ基の活性化についての全ての方法がある。
また、非天然アミノ酸を配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（Ｖｍ２３）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（Ｖｍ２４）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（Ｖｍ２３及びＶｍ２４のコンセンサス配列）中への置換を含む類似体構造の合成は、本発明の特定の実施態様に対して有用な場合がある。ペプチド断片を一応構築し、それによって最終生成物がＶｍ２３、Ｖｍ２４又はその類似体になる収束法の使用もまた当業者に知られており、使用することができる。配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及び２又はその類似体を得るため、ジスルフィド架橋の合成手順及び正確な折り畳みの最後で固体支持物から合成ペプチドを切断する方法もまた、当業者に知られており、再現されることができる。毒の最終切断及び脱保護及び折り畳みは、ＨＦ又はＴＦＡに限定されず、合成に採用された戦略によって決めることができる。ジスルフィド結合の形成は、異なるＣｙｓ保護を用いて、正しい形でジスルフィド結合を位置づける任意の直交的アプローチを含むものであり、Ｖｍ２４については、Ｃ６−Ｃ２６、Ｃ１２−Ｃ３１、Ｃ１６−Ｃ３３及びＣ２１−Ｃ３６の結合である。しかしながら、ジスルフィド架橋の形成はまた、空気酸化、又は様々な割合の還元・酸化グルタチオンの存在によって補助されるシャッフリング反応によって得ることもできる。
この基礎的な方法論に従って、ヘビ、サソリ及びイソギンチャクからの天然に存在する様々な毒を合成的に作り、Ｉ１２５で放射標識し、カリウムチャンネルの構造及び機能を調査するための分子プローブとして用いた［Strong, 1990; Moczydlowski et al., 1998; Garcia et al, 2001, Kern et al., 米国特許第６０７７６８０号］。該毒の多くは、特定の亜型Ｋチャンネルに対して選択的である［Auguste et al., 1990; Galvez et al., 1990; Crest et al., 1992; Garcia-Calvo et al., 1993; Garcia et al, 1994, Kem et al., 米国特許第６０７７６８０号］。最も頻繁に使用される例の中には、ほんの一部を挙げれば、ヘビDendroaspis polylepsisの毒液からのデンドロトキシン［Harvey, 1997］、イソギンチャクBunodosoma granuliferaからのＢｇＫ［Aneiros et al., 1993; Alessandri Haber et al., 1999］及びイソギンチャクStichodactyla helianthusからのＳｈＫ［Castaneda et al., 1995; Pennington et al., 1995］の他、Centruroides noxiusからのノキシアストキシン［Drakopoulou et al., 1995］、Leiurus quinquestratusからのチャリーブドトキシン［Sugg et al., 1990］等の幾つかのサソリ毒がある。ＳｈＫ等の該毒には、非常に低い濃度（＜１ｎＭ）でジャーカットＴリンパ球におけるＫｖ１．３型Ｋチャンネルを遮断する。しかしながら、それらの多くは、特異性の欠如に苦しむ。つまり、１０〜１００ｎＭ程度の濃度で、それらが他の亜型チャンネルをも遮断することができる。後述する例において実証されるように、Ｖｍ２３及びＶｍ２４は、ｈＫｖ１．３チャンネルに対して極めて特異的であり、今までのところ文献にて記載される他のペプチドと異なる一次構造を有するため、我々は、Ｖｍ２４を合成的に調製することに決めた。
Ｖｍ２４の共有構造は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相システム［Merrifield, 1964］に従い、これまでに我々のグループによって説明されたｆｍｏｃ−アミノ酸［Drakopoulou et al., 1995］を用いた化学合成によって得られた。
生体内でより高い半減期を持つペプチド類似体を得るために他の変性アミノ酸によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の一次構造のアミノ酸の一部を置換する可能性のため、天然ペプチドのプロテアーゼ感受性を低減することは本発明の範囲内である。これは、保存的なイソステリック交換による不必要な残基の交換又は置換を含むことができ、例えば、グルタミン又はアセチル-リシンのためのリシン、又はアラニン等の中性アミノ酸、又は生物学的に活性なペプチドのタンパク質分解を低減する位置でのＮａ−メチル化アミノ酸の置換である。また、一次配列の切断は、その機能に不必要なアミノ酸の欠失又は余分な残基の付加によって、生体内でより高い安定性を持つ類似構造を与えることができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列比較によって同定した本発明のペプチドの不必要な残基の一部には、限定されないが、整列させたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又は整列させたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の位置番号１０、１３、１７、２３、２９及び３５における残基が含まれる。
機能的に同等なペプチド類似体は、選択されたＤ−アミノ酸の包含又はレトロ−インバース類似体の化学合成によって生成でき、ここで、全ての残基はＤ−アミノ酸であり、そのアミノ酸配列は、逆転されている［Jameson et al., 1994; Juvvadi et al., 1996］。これらの修飾は、生成物の安定性を増大し得る。
他の重要なアプローチは、非ペプチド（ペプチド模倣物）を生成するため、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の親和性及び特異性の構造的な決定因子に基づいた低分子量化合物の開発である。この研究において、非ペプチド骨格が、設計して合成されており、親ポリペプチドのカリウムチャンネル結合表面から重要な官能基を含む。天然に存在する低分子量の非ペプチド化合物はポリペプチド又はタンパク質リガンドの効果を模倣したり無効にしたりすることが示された例が多く存在する。ペプチド模倣の化合物は、多くの治療に関連したペプチドのために設計され合成されてきた。ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質に結合するＣＤ４受容体上に存在するループが、設計して合成的に得られ［Chen et al., 1992］、低いマイクロモル濃度でＣＤ４受容体に結合するｇｐ１２０の効果的な遮断薬となることが示された。ＦＴＩ−２７６は、発癌Ｒａｓシグナルの強力な遮断薬であるＲａｓタンパク質のＣ末端領域の模倣物についての他の例である［Lerner et al., 1995］。
上述の説明から推測できるように、Ｔリンパ球の異常な機能を制御するための先行薬物として使用できる二つのペプチドＶｍ２３及びＶｍ２４についての機能的に同等な類似体を調製する方法が多く存在する。Ｔリンパ球の適切でない活性化は、特に、自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、骨吸収歯周病等）及び移植片拒絶を引き起こすことが知られている。
可能性のある新規な免疫抑制剤の効率を試験するため、多くの動物モデルがあり、それらは、新規な未知化合物の効率及び起こり得る副作用を試験するための適切な生体内でのアッセイを提供するものであり、ラットにおける遅延型過敏症（ＤＴＨ-応答）として知られる反応の場合には、本発明において使用された。後述するように、本発明のペプチドの保護効果を評価するため、少量のＶｍ２４を試験して、ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）で前もって感作されたラットの耳で起こる炎症反応を制御した。このアッセイは、広く使用されており、本発明の目的に適したモデルとして認められる［Phanuphak et al, 1974］。
免疫抑制剤
シクロスポリン、ＦＫ５０６等の免疫抑制剤は、その治療的使用を制限する重度の副作用を示す。その二つの化合物で行った研究は、その薬剤の投与によって望ましくない副作用に関与する分子機構の少なくとも一部を同定することができた。シクロスポリンは、多くの異なる組織に存在するタンパク質シクロフィリンと相互作用し、一方、ＦＫ５０６は、ＦＫ結合タンパク質を標的とするため毒性を引き起こし、また多くの異なる組織においても見られた。従って、重篤な副作用のない新規な免疫抑制剤を同定するための大変な努力があった。主な目標の一つは、Ｋｖ１．３イオンチャンネル等のＴ-リンパ球において主に発現する新規なターゲットを同定することである。Ｔ-リンパ球にて発現するＫｖ１．３カリウムチャンネルは、特定の細胞機能に対して非常に重要であるが、このタンパク質に対するＲＮＡコーディングもまた他の細胞（Ｂ-リンパ球、ミクログリア、マクロファージ、破骨細胞、血小板、及び一部の脳細胞）において見られる。しかしながら、Ｔ-リンパ球の場合に限り、Ｋｖ１．３は、膜電位を支配し、遮断に重要な機能的結果を有する。Ｋｖ１．３遮断薬の作用の異なる機構、及びＫｖ１．３チャンネルの比較的制限された組織分布のため、Ｋｖ１．３の特異的で且つ高親和性の遮断薬は、シクロスポリン及びＦＫ５０６よりも低い毒性の副作用を示すことが期待され、従って、自己免疫疾患の治療及び移植医療に有用であることが証明できる。
Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐｅ及びＤｏｈｍｅの科学者は、マーガトキシン（他のサソリ毒のペプチド）がＫｖ１．３チャンネルの遮断薬として強力な効果を有し、動物モデル（ブタ）の免疫反応を抑制することが可能であることを示した。しかしながら、マーガトキシンは、Ｋｖ１．３に対して特異的であるだけでなく、同様の効力でＫｖ１．２チャンネルにも作用する。また、心臓及び脳組織はＫｖ１．２チャンネルを発現するため、その閉塞は、非常に有害な効果を有し得る。イソギンチャクから単離した他のペプチドであるＳｈＫは、Ｋｖ１．３の強力な阻害剤であり（Kem et al., 2000，米国特許第６０７７６８０号参照）、他の関連するＫｖ１チャンネルに影響を与えるが、同様の遮断には、１００倍を超える高い濃度が必要とされる。これは、関連するチャンネルが、Ｋ１．３と比較して、その適用に対する感受性が＞１００倍低いことを意味する。本発明の目的であるペプチドＶｍ２３及びＶｍ２４は、異なる生物源からのものであり、ＳｈＫとは明確に異なる一次構造を有し、ＳｈＫと比べてｈＫｖ１．３チャンネルに対し特異的である。Ｖｍ２３及びＶｍ２４は、ｈＫｖ１．３チャンネルの同一画分を遮断するのに必要とされる濃度より３０００倍以上の濃度で適用した場合、二つの他のＫチャンネルを≦５０％遮断し、このことは、以下の例において示され、詳細に説明される（例７〜１０）。
また、本発明は、Ｖｍ２３、Ｖｍ２４及びその機能的に同等な類似体の固相法による生成を含むものである。化学合成に使用される手順には、例３で詳細に説明されるように、当業者によく知られる一連の手順が含まれる。
電気生理学的な特性付け
異物又は自己抗原に対する効果的な免疫反応の開発には、所定の抗原に特異的なリンパ球の活性化及び増殖が求められる。これは、免疫系の異なる細胞成分間の十分に調整された相互作用を必要とする。この過程の第１ステップは、プロフェッショナル抗原提示細胞による処理された抗原のリンパ球に対する提示である［Janeway et al., 2001］。電位開口型Ｋチャンネル、Ｋｖ１．３に特異的な遮断薬によって、Ｔ-リンパ球媒介免疫反応（例えば、遅延型過敏症）を制御することは、本発明の目的の範囲内である。従って、我々は、Ｔ細胞に対するリンパ球の活性化においてＫチャンネルが関与する同化作用を制限する。しかしながら、我々は、Ｂリンパ球における特定のサブセットの増殖もまたＫｖ１．３チャンネルの活性次第であることについて言及すべきである［Wulff et al., 2004］。
Ｔ細胞の抗原受容体による提示された抗原の認識は、細胞の活性化、増殖及び最終分化を導く［Sallusto et al., 2004］。抗原認識によって誘発した膜貫通シグナル経路は、幾つかのタンパク質キナーゼの活性化と、その結果として起こるホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）の活性化を含む。膜リン脂質ホスファチジルイノシトール４，５−ビホスフェート（ＰｉＰ２）のＰＬＣ−γ−媒介加水分解によるイノシトール１，４，５−トリスホスフェート（ＩＰ３）の生成は、Ｔ細胞の増殖への傾倒に必要な二相のＣａ２＋シグナルを惹起する［Lewis, 2001］。ＩＰ３は、拡散して小胞体（ＥＲ）中の受容体に結合し、細胞質ゾル内へのＣａ２＋の放出及び細胞質遊離カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の大きな上昇を引き起こす。ＥＲからの放出を受けた［Ｃａ２＋］ｉの一時的な上昇は、シグナル伝達カスケードの遂行のために十分でなく、持続的なＣａ２＋シグナルが必要である。これは、カルシウム放出で活性化したＣａ２＋チャンネル（ＣＲＡＣチャンネル）によって、細胞膜のＣａ２＋チャンネルを通過した細胞外空間からのＣａ２＋の流入により実現される［Zweifach and Lewis, 1993］。
ＣＲＡＣチャンネルは、本質的に電圧依存であるが、Ｃａ２＋電流は、Ｃａ２＋の電気化学的な勾配に敏感であり、細胞の膜電位によって影響を受ける［Panyi et al., 2004］。脱分極性のＣａ２＋流入は、負の値の膜電位を固定し、更なるＣａ２＋流入に十分な推進力を与えるためにＫチャンネルの活性化によって平衡化される必要がある［Fanger et al., 2001］。制御された選択的Ｋ＋流出は、ヒトＴリンパ球の膜電位の主要な決定因子の一つであり、およそ−５０〜−６０ｍＶである。２種類のＫチャンネルは、その細胞の生理学的条件下で外向きのＫ＋流動に導く。ヒトＴリンパ球における支配的な電位開口型ＫチャンネルであるＫｖ１．３は、細胞の静止電位に近い活性化閾値の膜脱分極で開口する［Matteson and Deutsch, 1984］。ヒトＴ細胞のＣａ２＋で活性化したカリウムチャンネルであるＩＫＣａ１（又はＫＣａ３．１）は、膜電位に独立して、約２００ｎＭを超える細胞質遊離カルシウム濃度の上昇によってのみ活性化される［Grissmer et al., 1993］。
Ｋｖ１．３及びＩＫＣａ１チャンネルのＴ細胞の膜電位制御への寄与は、細胞の活性化状態（静止対活性）と、Ｔ細胞の最終分化の程度によって決定される免疫系での機能的役割とによって決まり［Wulff et al., 2003］、発明の背景技術のセクションにて詳細に説明されている。自己免疫疾患におけるＫｖ１．３遮断薬の治療的適用の点から、ＩＫＣａ１チャンネルを超えたＫｖ１．３チャンネルへの選択性が最重要であることを強調することが重要である［Wulff et al., 2003］。エフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ）は、例えば多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎及び骨吸収歯周病における組織損傷を媒介しており、活性化時にＫｖ１．３チャンネルを選択的に上方制御し、従って、その細胞の膜電位制御は、Ｋｖ１．３チャンネルのみによって支配される［Beeton et al., 2006］。その結果、該細胞の増殖は、選択的Ｋｖ１．３阻害剤によって効果的で且つ持続的に抑制できる［Wulff et al., 2003; Vennekamp et al., 2004; Beeton et al., 2005］。これに対して、未処理細胞及び中央メモリＴ細胞（ＴＣＭ）は、ＩＫＣａ１の転写上方制御［Ghanshani et al., 2000］によってＫｖ１．３遮断で媒介した増殖阻害［Wulff et al., 2003］から回避する。予備活性化細胞の増殖は、ＩＫＣａ１阻害剤に対して感受性が高くなるが、Ｋｖ１．３阻害剤に対しては高くならない。従って、未処理細胞及びＴＣＭ細胞の増殖の大きな障害なしにＴＥＭ細胞の活性化を抑制するＫｖ１．３に基づいた治療は、自己免疫疾患、特にはＩ型糖尿病［Viglietta et al., 2002; Beeton et al., 2006］、関節リウマチ［Beeton et al., 2006］、多発性硬化症、実験的歯周病の炎症性骨吸収［Valverde et al., 2004］等のリンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患、並びに慢性的に活性化したＴＥＭ細胞によって持続することが提案された慢性移植片拒絶反応及び移植片対宿主病［Yamashita et al., 2004］等の器官拒絶反応に関連した状態の管理に使用され得る。
選択性評価
幾つかのＫｖ１．３の高親和性ペプチド遮断薬は、ＩＫＣａ１よりＫｖ１．３に対して選択的であり、Ｖｍ２４に対しても同様である。これらには、サソリ毒、例えば、マルガトキシン（ＭｇＴｘ）、ノキシウストキシン（Ｎｔｘ）、カリオトキシン、アニュロックトキシン及びイソギンチャクから単離されたＳｈＫ毒等が含まれる。しかしながら、神経興奮性及び筋肉興奮性に重要なイオンチャンネルもまた、ナノモル濃度〜ピコモル濃度での親和性を持つ毒によって阻害され、例えば、Ｋｖ１．１は、ＳｈＫ［Kalman et al., 1998］及びカリオトキシン［Grissmer et al., 1994］によって阻害され、一方、Ｋｖ１．２は、ＭｇＴｘ［Koch et al., 1997］、Ｎｔｘ［Grissmer et al., 1994］及びアニュロックトキシン［Bagdany et al, 2005］によって遮断される。
毒の特異性の欠如は、大きな生物学的効果の可能性を抑制する。Ｋｖファミリーのイオンチャンネルは、古典的な興奮性細胞及び非興奮性細胞において広く分布される（包括的な概説については［Gutman et al., 2005］参照）。神経細胞、骨細胞及び心筋細胞において、そのチャンネルは、電気的興奮性の主要な決定因子である。それは、静止膜電位の維持、再分極の速度に影響することによる作用電位の形に寄与し、また、超分極後のスパイク頻度及び神経細胞を決定する（包括的な概説については［Gutman et al., 2005］参照）。中枢神経系で発現したイオンチャンネルは、血液脳関門のため、体系的に適用された毒から更に保護されているが、Ｋｖ１．３阻害剤の潜在的適用範囲である多発性硬化症においては、この関門が損なわれ、ＭＳの動物モデルにおける神経毒性を引き起こす［Beeton et al., 2005］。細胞の血流との直接接触によって、心筋細胞は、非選択的Ｋｖ１．３阻害剤の潜在的副作用に対してより影響を受けやすい。ヒト心房筋細胞におけるＫｖ１．５［Feng et al., 1997］並びに心室筋細胞におけるＫｖ１．４［Patel and Campbell, 2005］及びｈＥＲＧ（［Sanguinetti and Tristani-Firouzi, 2006］において概説されている）チャンネルは、作用電位の再分極相を強く決定し、一方、Ｎａｖ１．５は、脱分極相に関与する［Rogart et al., 1989］。ＢＫ Ｃａ２＋で活性化したＫチャンネルは、人体において広範に存在しており（脳、骨格筋、平滑筋、膵島細胞等、［Wei et al., 2005］において概説されている）、神経細胞及び骨格筋細胞の電気的興奮性並びに平滑筋のＣａ過渡応答等の様々な生理学的機能を調整する。ＢＫチャンネルは、α−ＫＴｘ１．ｘファミリーの毒によって遮断される（例えば、チャリーブドトキシン［Miller et al., 1985］）。
細菌性の［Doyle et al., 1998］及びヒトの電位開口型Ｋチャンネル［Long et al., 2005］のＸ線結晶構造の利用可能性は、ここ１０年間で、異なるイオンチャンネルに対するα−ＫＴｘ特異性の分子基盤の理解を深めたが［Giangiacomo et al., 2004］、今まで、一次構造に基づいた所定のペプチド毒の選択性プロファイルの予測は、不可能であった。これは、生物学的意義及び動物毒によって遮断する既知の感受性を有するイオンチャンネルに対するＶｍ２４の選択性の実験的な決定因子を実証する。
分子生物学の進歩及びイオンチャンネル遺伝子のクローニングは、薬理学的研究が組換え型イオンチャンネルで行われることを可能にする。適切な細胞株における組換え型チャンネルの発現は、薬理実験に対して幾つかの利点を与えており、例えば、混入する電流の大きさが無視でき、該電流の振幅は薬理分析に適している。更に、発現した組換え型チャンネルは、天然細胞で発現したチャンネルの薬理学的特性を維持する。
医薬品組成物
本発明は、本発明のペプチドを備える医薬品組成物を提供する。前述したように、該ペプチドは、Ｔ細胞の特異的なサブセットが活性化する場合に哺乳動物における免疫反応を抑制するのに有効である。特に、本発明のペプチドを備える医薬品組成物は、免疫反応が異種器官拒絶反応の結果であるか（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓又は膵臓）又はリンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患の結果である病状を治療又は予防するのに有効である。
本発明の好ましい態様において、医薬品組成物は、本発明のペプチド又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容されるキャリアーとを備える。該医薬品組成物の好ましい形態及び薬学的に許容されるキャリアーの選択は、投与及び治療的適用の目的とする形式によって決まる。医薬品組成物は、（所望の製剤に応じて）薬学的に許容できる非毒性キャリアー又は希釈剤を含み、それらは、動物又はヒト投与用の医薬品組成物を製剤化するのに一般に使用される賦形剤として定義される。加えて、任意には、医薬品組成物はまた、少なくとも一つの追加の免疫抑制剤を備えてもよく、それは、治療における相補的な効果を有し得る。具体的な免疫抑制剤の一部は、シクロスポリン、ラパマイシン、アザチオプリン、プレドニゾン、ＳｈＫ毒素、ＳｈＫ誘導体及びデオキシスパガリン、それらの誘導体、又はそれらの塩である。本発明の医薬品組成物は、以下に述べるように投与できる。
治療方法及び予防方法
本発明は、哺乳動物における免疫反応の抑制が必要とされる病状の治療的又は予防的処置の方法を提供するものであり、特にはかかる処置を必要とする対象においてＴ細胞が活性化する場合であり、ここで、上記病状には、異種器官拒絶反応（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓又は膵臓）又は自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎及び骨吸収歯周病）が含まれる。該対象には、ほんの一部を挙げれば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の他の哺乳動物を挙げることができる。一の態様において、本発明は、治療的又は予防的処置を必要とする対象についてのＴ細胞の細胞膜におけるＫｖ１．３カリウムチャンネルの阻害に対する応答又は感受性によって治療可能な病状の予防的又は治療的処置の方法を提供する。該方法は、ヒト等のそれを必要とする対象に対して、上述した本発明のペプチドを効果的な量投与する工程を備える。一般に、このペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＶｍ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＶｍ２３というペプチドもしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有するペプチド、もしくはそれらの機能的に同等な類似体、又はその薬学的に許容される塩を備えてもよい。
好ましい実施態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化に関連した又はＫｖ１．３カリウムチャンネル阻害に応答する自己免疫疾患を治療及び予防することを特に目的とする方法を提供する。かかる自己免疫疾患には、限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎及び骨吸収歯周病が含まれる。上記方法は、ヒト等のそれを必要とする対象に対して、上述した本発明のペプチドを効果的な量投与する工程を備える。
他の好ましい実施態様において、本発明は、異種器官（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓又は膵臓）の拒絶反応を治療及び予防することを特に目的とする方法を提供する。上記方法は、ヒト等のそれを必要とする対象（即ち、臓器移植を受けるか又は受けた対象）に対して、上述した本発明のペプチドを効果的な量投与する工程を備える。
投与量及び投与方法
治療的適用において、本発明のペプチドは、疾患又は望ましくない病状（例えば、それぞれ自己免疫疾患又は異種臓器拒絶反応）に既に苦しむ対象に対して、該疾患及びその合併症の進行を治療し、回復し、部分的に停止し又は検出可能な程度に遅くするのに十分な量で投与できる。本発明のペプチドの治療的適用で用いるのに効果的な量は、病状の重症度、対象の一般的症状及び投与経路によって決まることになる。治療的適用におけるペプチドの効果的な量は、一般に、キログラム当たり約０．１マイクログラム〜キログラム当たり約１０マイクログラムの投与量当たりペプチド（又はその薬剤的に許容される塩）の範囲内である。
予防的適用において、対象とするペプチド又はその医薬品組成物は、疾患又は望ましくない病状に苦しんでいないが危険性のある対象に対して投与される。投与されるペプチドの効果的な量は、健康な対象の状態及び免疫系の一般的な状態によって決まる。予防的適用におけるペプチドの効果的な量は、一般に、キログラム当たり約０．１マイクログラム〜キログラム当たり約１０マイクログラムの投与量当たりペプチドの範囲内である。
本発明のペプチド及び医薬品組成物の送達経路は、疾患又は臨床的徴候及び治療を必要とする部位によって決定される。体の限定部位に制限されるある種の疾患については、その局所部位に上記ペプチド又は組成物を適用するのが望ましい場合がある（局所適用）。或いは、疾患が進行する場合又は局所適用と同時に、該ペプチド又は組成物を全身的に投与するのが望ましい場合もある。
他の徴候に対して、本発明のペプチド及び医薬品組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内及び皮内注射、並びに気管支内点滴（例えば、噴霧器を用いる）及び経粘膜的、全身的、経皮的（例えば、皮膚用パッチの脂溶性キャリアーによる）、経口的及び胃腸内送達（例えば、カプセル又は錠剤による）によって送達できる。
本発明の一つ又はそれ以上のペプチドは、併用療法において投与されてもよい。例えば、一つ又はそれ以上の対象ペプチドは、他の免疫抑制剤（上述のもの等）と組み合わせて、かかる処置を必要とする対象に対して投与されてもよい。免疫性血小板減少性紫斑病［Cooper and Bussel, 2006］又は自己免疫性リンパ球増殖性症候群［Oren et al, 2002］等の特発性自己免疫疾患もいくつか存在し、ここで、上記処置が複数目標アプローチに必要とされる場合があるため、二つ以上の免疫抑制物質が必要となる。
本発明のペプチドは、単独で又は「医薬品組成物」のセクションにおいて説明した薬学的に許容されるキャリアーと組み合わせて投与できる。ペプチドは、単回又は複数回投与で投与され得る。適切な薬学的に許容されるキャリアーには、不活性固体希釈剤又は充填剤、無菌水溶液、及び各種非毒性有機溶媒が含まれる。対象とするペプチドを薬学的に許容されるキャリアーと組み合わせてなる医薬品組成物は、錠剤、トローチ剤、シロップ、注射可能な溶液等の各種投薬形態で容易に投与されることができる。望ましくは、医薬品キャリアーは、香味料、結合剤、賦形剤等の追加の成分を含有してもよい。
経口投与に関して、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等の各種賦形剤を含有する錠剤は、澱粉、好ましくはジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、、特定の複合ケイ酸塩等の各種錠剤分解物質と一緒に、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、アカシア等の結合剤を含めて使用できる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の平滑剤を錠剤化目的で加える。また、同様な種類の固体組成物は、塩及び硬ゼラチンカプセルにおいて充填剤として使用されてもよい。この目的に対して好適な材料には、ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。エリキシル剤の水性懸濁液が経口投与に望ましい場合、ここで重要な活性ペプチド成分は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、それらの組み合わせ等の希釈剤を含めて、各種甘味料又は香味料、着色料又は染料、望ましくは乳化剤又は懸濁剤と組み合わせることができる。
非経口投与に関して、本発明のペプチドのゴマ油溶液もしくはピーナッツ油溶液又は含水ポリプロピレングリコール溶液は、前述した対応する薬学的に許容される水溶性金属塩の無菌生理食塩水と同時に使用されてもよい。かかる水溶液は、必要ならば十分な生理食塩水又はグルコースによって最初に等浸透圧にされた液体希釈剤で、適切に緩衝されるべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内注射に適している。使用される無菌水媒体は、当業者に広く知られる標準的な技術によって完璧に得ることができる。加えて、前述の化合物は、特定の目的に適している適当な溶液を用いることによって、局所に（例えば、設置されたカテーテルを通して）投与されてもよい。
分子プローブとしてのＶｍ２３、Ｖｍ２４及び機能的に同等な類似体
本発明のペプチドの治療上の使用と別に、これらのペプチドは、動物組織又は安定な培養物から得られる幅広い細胞において、Ｋｖ１．３チャンネルの発現レベルを検出し及び特徴づけるために使用され得る。Ｔ細胞におけるＫｖ１．３の発現を特徴付けることの重要性は、すでに本明細書において取り上げられており、従って、本発明はまた、Ｋｖ１．３チャンネル発現細胞を生理的に特徴付けるための分子プローブとしての本発明のペプチドの使用に関するものである。Ｋｖ１．３発現の検出及び特徴付けは、都合よく標識化された本発明のペプチドを用いる幾つかの検出技術によって行われることができ、限定されるものではないが、フローサイトメトリー、通常の共焦点蛍光顕微鏡、蛍光全発光、放射性結合及び置換技術、並びに免疫学的プルダウンアッセイが挙げられる。所定の細胞において発現したＫｖ１．３チャンネルの定量は、定量検出技術によって行われることができ、限定されるものではないが、共焦点レーザー走査顕微鏡によるチャンネル計数、免疫金検出並びに放射性結合及び置換技術が挙げられる。更に、幾つかの非必須アミノ酸のポリペプチド鎖又は側鎖の化学的修飾は、Ｋｖ１．３チャンネルの検出及び定量化に使用できる標識化された機能的に同等な類似体を提供することができる。同様に、その機能的に等価な類似体は、特異的なリガンドを検索するための分子プローブとして使用でき、但し、その新規なリガンドは、Ｋｖ１．３上にＶｍ２３、Ｖｍ２４及びそれらの機能的に同等な類似体と同一の結合部位を共有する。かかる化学的修飾は、Ｋｖ１．３に対して高い親和性及び特異性を持つリガンドを与えるＶｍ２３、Ｖｍ２４及びそれらの機能的に同等な類似体の構造決定を未修飾のままにしておくべきである。ポリペプチド鎖の化学修飾は、有効な分子プローブを得るための常法であり、広く利用できる幾つかの方法によって達成でき、当業者に常用されている。修飾によって与えられる標識には、限定されないが、放射性同位体部分、蛍光部分、化学発光部分又は発色性部分、及びタグタンパク質（抗体、ビオチン、緑色蛍光タンパク質又はその誘導体）との架橋結合又は融合が含まれる。
以下の実施例において、新規な本発明のペプチドをどのように単離し、精製し、化学的に特徴づけしたかを詳細に説明する。例示的なペプチドＶｍ２４の合成を説明し、ヒトＴリンパ球のＫｖ１．３チャンネルに対する二つの例示的な本発明のペプチド（Ｖｍ２３及びＶｍ２４）の選択的作用を徹底的に説明する。最後に、ラットにおけるＤＴＨ-応答の生体内アッセイにおいて、低濃度でのＶｍ２４の保護作用についても説明する。
以下の例には、典型的に好ましい本発明の実施形態を実証することが含まれる。報告した例のうち特定の実施態様において多くの変更がなされ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって同様の又は類似の結果を得ることができる。最終生成物が、ここで示す配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）又はそれらの機能的に同等な類似体を備える場合、それは、ここに示す結果と同じ結果を必ず再現し、ここで主張する本発明の実施においてよく機能すると期待される。
例１．Ｖｍ２３及びＶｍ２４の単離、マウスにおける致死試験及び一次構造決定
使用した全ての溶媒及び化学物質は分析グレードで、二回蒸留水は、以前説明したような手順によって使用された［Batista et al., 2007］。
単離手順
上述した各種天然リガンドの単離に用いる手順は、クロマトグラフ技術を用いる。毒液を水中で可溶化し、１００００ｘｇで５分間遠心分離した。浮遊物を回収し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離した。可溶性毒液タンパク質を１．０ミリグラム含有する１００マイクロリットルを、ＨＰＬＣシステム（Millenium Millipore, Milford, MA）のＶｙｄａｃ（Hisperia, CA, USA）から得た分析Ｃ１８逆相カラム（大きさ１０×２５０ｍｍ，カタログ番号２３８ＴＰ）に適用した。溶液Ａ（水中０．１２％トリフルオロ酢酸ＴＦＡの水）から６０％溶液Ｂ（アセトニトリル中０．１０％ＴＦＡ）までの線形勾配を用い、６０分間流して、成分を精製した。２３０ｎｍの吸光度にて検出を監視し、１ｍｌ／分の流速で溶出した。手動で画分を収集し、Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ乾燥機を用いて乾燥させた。図１に示すように、８０を超える異なる画分をこのＨＰＬＣ分離から収集した。２０〜３５分の保持時間で溶出する画分は、通常、研究された他のサソリ毒液のＫチャンネルに最も特異的なサソリ毒の溶出時間に対応する［Batista et al., 2007］。このため、この時間に溶出する毒液成分に専念するよう特に注意しなければならない。特に、２３分と２４分に溶出する二つの画分を更に分析した。なぜなら、この溶出時間からのペプチドの質量分析決定は、既知の他のＫチャンネル特異性毒に対して見られた値と密接な関係があるからであり、それらは、約４０００ダルトンの分子量を有する。それらの成分は依然として均質でないため、第二のクロマトグラフ分離を同一のＨＰＬＣシステムを用いて行い、但し、異なる勾配で溶出した（溶液Ａから４０％溶液Ｂ、６０分間、Ｖｙｄａｇ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ ＣＡのカタログ番号２１８ＴＰ５４のＣ１８カラムの使用）。図１の差し込み図に示されるように、主成分が、冒頭の各画分から単離された（アスタリスクでラベルされる）。左側の差し込み図は、２３分で溶出する画分に対応しており、右側の差し込み図は、２４分で溶出する画分に対応する。質量分析決定及び自動エドマン分解による配列決定による分析を受けて、両方のペプチドが均質であることが分かった。最初に、我々の実験条件で２４分にて溶出したものを分析した。それは純粋であり、３８６４原子量単位（ａ．ｍ．ｕ．）の分子量が示された。本明細書において、我々は、一つの分子量単位を指定するため、置き換え可能なようにａ．ｍ．ｕ．又はダルトン（Ｄａと省略）を使用することになる。このため、そのペプチドはＶｍ２４と名付けられ、我々の実験条件において２４分で溶出するＶ．メキシカナスからの毒液のペプチドを意味する。左側の差し込み図（図１）に示すクロマトグラムは、Ｖｍ２３と名付けたペプチドの分離に対応する。それは、２３分で溶出するＶ．メキシカナスからの毒液のペプチドを意味する。この成分の実験的分子量は、３６６５Ｄａであると測定された。
Ｖ．メキシカナスからの全毒液の生体内での毒性測定並びに精製したＶｍ２３及びＶｍ２４の致死試験
毒液及び純ペプチドの効果は、サソリ毒液が種特異的な毒を含有することが知られているため、少なくとも三つの生物学的モデル：哺乳動物、コオロギ、甲殻類を用い、研究室で通常行われる。哺乳動物又は異なる種類の節足動物に特異的な毒がある（［Possani et al., 1999］において概説されている）。本発明の目的のため、我々は、動物モデルとしてマウスを用いた実験を行ったが、これは、その結果が、毒液又は精製された毒と接触したヒトに起こる信頼性の高い徴候となるからである。Ｖ．メキシカナスの可溶性毒液を様々な量（体重２０グラムのマウス当たり５０〜２００マイクログラムのタンパク質）で注射されたマウスは、中毒症状を示さなかった。通常、毒液が上記の物量で人に対して毒性を有する場合、興奮性、唾液分泌、呼吸促迫（呼吸困難）、後肢の麻痺、下痢、痙攣、更には死等、明らかな中毒症状が見られた［Possani el al., 1985］。注射された動物に上述の症状のいずれかが現れるがペプチド投与後２４時間以内に回復したらこのペプチドは「毒性」であると言え、一方、マウスが死んだら、それは「致死」とよばれる。非毒成分は、中毒症状を誘発しないものであり、ｐＨ７．２のＰＢＳ食塩水が注射されたマウスと同様の挙動を起こす［Possani et al., 1985］。最終的には、比較的低い投与量での全毒液は毒性がないが、同様な投与量での精製されたペプチドは中毒症状を引き起こすことができ、これは、精製中、サンプルが特定の成分中に濃縮されるからである。このため、Ｖ．メキシカナスの可溶性毒液が２００マイクログラム／２０グラムマウス体重で毒性がないことを考慮して、純ペプチドＶｍ２４を様々な濃度でマウスに注射した。使用した最高投与量は、２００マイクログラム／２０グラム、即ち１００００ミリグラム／キログラムマウス体重であり、中毒症状は観察されなかった。
これは、他のメキシコサソリCentruoides noxiusから精製された毒素Ｃｎ２等の致死成分と明らかに異なっている。マウスにおけるＣｎ２の５０パーセント致死量（ＬＤ５０，分析した動物のグループにおいて５０％の死亡率をもたらす投与量を意味する）は、０．２５マイクログラム／２０グラムマウス体重である［Zamudio et al., 1992］。それは、８００倍高いタンパク質濃度のＶｍ２４がマウスに対して毒性がない一方で、Ｃｎ２は集団の半数を死亡させることを意味する。
Ｖｍ２３及びＶｍ２４のアミノ酸配列の決定
二つの技術を用いた。自動エドマン分解と質量分析（ＭＳ）である。純毒の直接アミノ酸配列決定は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＦ ３０００タンパク質シークエンサー（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、該会社から供給された化学物質及び手順によって行われた。純ペプチドの還元・アルキル化したサンプルを、他のサソリ成分に関して前に説明された手順と同様な手順を用いて［Valdez et al., 2004; Batista et al., 2007; Diego-Garcia et al., 2007］、Ａｒｇ−Ｃエンドペプチダーゼ（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）で酵素的に切断した。対応するペプチドをＨＰＬＣで精製し、配列決定した。質量分析については、サンプルを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＭＳシリンジポンプ伝達システムを用いて、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱＤＵＯイオントラップ質量分析計（San Jose, CA）中で直接適用した。サンプルの５％をナノスプレー源（０．５マイクロリットル／分）に入れるため、１０マイクロリットル／分の溶出液を分割した。スプレー電圧を１．７ｋＶに設定し、毛細管温度を１３０℃に設定した。ＭＳ／ＭＳ実験については、断片化ソースを、２５Ｖの衝突エネルギー、３５〜４５％（任意単位）の正規化衝突エネルギー及び活性化した広帯域スキャンで操作した。全てのスペクトルを正イオンモードで得た。データ収集及びデータ解析をＷｉｎｄｏｗｓ(登録商標） ＮＴ ＰＣシステム上のＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアで実行した。酵素的に生成したペプチドからのＭＳ／ＭＳスペクトルを手動及びＳｅｑｕｅｓｔソフトウェアによって分析した［Batista et al., 2007］。
Ｖｍ２３及びＶｍ２４の両方の一次構造（図２参照）を決定し、該ペプチドを後述する電気生理学的実験に用いた（添付の本発明の例７〜１０を参照）。２３分で溶出する画分から再精製した天然ペプチド（図１の左側差し込み図を参照）を完全に特徴付けした。その実験的分子量は、３６５５Ｄａであることが分かった。このペプチドの１ナノモルをシークエンサー中に装填し、最初の３４のアミノ酸をエドマン分解によって直接的に同定した（直接として下線が引かれている）。会社によって与えられた方法論を用いて（Beckman）、システイン残基を環元及びアルキル化によって確認した。位置３５におけるＶｍ２３の最後の残基を質量分析によって決定した。決定された配列に基づき予想した理論平均分子量は、３６６５．５１Ｄａであり、従って、完全配列の明白な決定を確認した。実験的に決定した分子量と予想した理論分子量の両方は同一であり、用いた装置の誤差の範囲内であった（ＦｉｎｎｉｇａｎイオンとラップＬＣＱＤＵＯ質量分析計）。
同様に、１ナノモルの均質ペプチドＶｍ２４（図１の右側差し込み図に示されるように再精製した）を自動エドマン分解にかけ、最初の２８のアミノ酸残基の同定を可能にした（図２、Ｖｍ２４とラベルされている）。様々な分量の環元・アルキル化ペプチドで行った分析をシステイン残基の確認及びエンドペプチダーゼによる消化に用いた。ＡｒｇＣ−エンドペプチダーゼによるＶｍ２４の消化は、三つのサブペプチドを生成し、それは、Ａｌａ１からＡｒｇ１７までの残基の配列が確認された部分（天然ペプチドを分析する際に既に決定された同一のＮ末端配列を備えるため、図示しなかった。「直線」とラベルされ下線が引かれている）、「Ａｒｇ−Ｃｌ」とラベルされた下線が引かれた部分によって示されるＡｌａ１８からＡｒｇ２９までの部分、Ｌｙｓ３０からＣｙｓ３６までの最後の部分（Ａｒｇ-Ｃ２と下線が引かれている）である。その配列をＭＳ／ＭＳ断片化と組み合わせたエドマン分解によって得た（図２、Ｖｍ２４参照）。最後の残基をＣＩＤ（衝突誘起解離）によって同定するため、位置３０及び３２におけるアミノ酸は、リシン又はグルタミンであった（同じ分子量）。不明確性を解決するため、この最後のサブペプチドのトリプシンによる追加酵素切断を行った。三つの小ペプチドをＨＰＬＣによって分離し、ＣＩＤによって画定したそのアミノ酸配列を同定したところ、Ｃｙｓ２６からＬｙｓ３０（Ｔｒｐ１と下線が引かれている）、Ｃｙｓ２６からＬｙｓ３２（表記の簡略化のため図示せず）及びＣｙｓ３３からＣｙｓ３６（同様に図示せず）の位置であった。トリプシンはリシンのＣ末端に位置するペプチド結合を切断するため、その二つの位置はリジン残基に割り当てられ、完全配列を明白に解いた。また、最もＣ末端に位置する最後の四つのアミノ酸をＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼで加水分解した後に単離したペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化によって同定した（Ｌｙｓ−Ｃとラベルして下線が引かれている）。アミド化したＣ末端アミノ酸を仮定すれば、予想したペプチドの理論的平均分子量は３８６３．６４Ｄａであり、実験値は３８６４．０Ｄａであって、完全配列を確認した。三次元イオントラップの精度は１０００Ｄａ未満のペプチドに対して１００ｐｐｍの範囲であるため、０．３６単位の小さい誤差は、期待値の範囲内である（装置の精度の参考のため［Aebersold and Goodlett, 2001］参照）。
本発明に関して、Ｖｍ２３及びＶｍ２４についての五つの特性を取り上げることが重要である。
１）今までに既知である他のサソリ毒の全てと比較した一次構造は、５０％を超える相違を有する（以下、例６参照）。この事実によって、ここで番号α−ＫＴｘ２１（例えばα−ＫＴｘ２１．１及びα−ＫＴｘ２１．２）と提案された新しいサブファミリー（今日まで未知である）の存在を証明する。それは、最初の開示であり、両ペプチドがイソギンチャク、ハチ及びヘビの毒ペプチドを含む他のリガンドと構造的に異なることを明確に示す。
２）両配列の位置１０のアミノ酸までのＮ末端セグメントは、同一であり、ジスルフィド架橋を維持するシステインの８の位置の内の７が一次構造の同一位置にある。Ｖｍ２３の八番目のシステイン（Ｃ８）は、Ｃ末端側の最末端の位置３５に配置されており、Ｖｍ２４と比較して一つ早いアミノ酸である。このため、Ｖｍ２４は３６の残基を有するが、Ｖｍ２３は３５のアミノ酸残基を有する。Ｖｍ２３の最終システインはアミド化されていないが、我々は、構造的折り畳みがＶｍ２４のものと同じであることを仮定した。Ｖｍ２３及びＶｍ２４の両方の生理学的効果が同程度であるため、Ｎ末端領域のアミノ酸配列が活性に重要であると見込まれる。Ｖｍ２３及びＶｍ２４の一次構造を比較すると、五つの相違が位置１０、１３、１７、２３及び２９で見られ、最後のアミノ酸とその前のアミノ酸の間に一つの挿入欠失がある（Ｖｍ２３のＹ３４及びＶｍ２４のＹ３５）。最も変わりやすい領域は、両ペプチドの中央部であり（１０〜３０の残基で、６の相違のうち５が位置する）、おそらく該残基がペプチドの機能に重要でないことを示唆する。位置１７（Ｒ／Ｋ）、２３（Ｎ／Ｓ）及び２９（Ｒ／Ｋ）の置換は、アルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）が帯電した塩基性アミノ酸である一方で、アスパラギン（Ｎ）及びセリン（Ｓ）は、非帯電の親水性アミノ酸残基であるため、保存的な修飾であることについて言及する価値がある。Ｖｍ２４と比較して、位置３５のチロシンの欠如（Ｖｍ２３のシステインと置換）は、唯一つのチロシンが両ペプチドの同一な折り畳み及び機能に十分な量であることを示唆する。
３）このように、最も変わりやすい領域は中央部分に位置しており、保守的な置換を可能にする。これは、当業者が容易に設計でき、少なくとも８３％の対配列同一性を共有する整列位置において類似の生理学的特性を持つアミノ酸による修飾又は置換が（ここではＶｍ２３及びＶｍ２４の場合が示される）、類似の特性を持つ機能的に同等な類似体を生成すると期待され、従って、本発明の範囲に含まれるべきである。
４）しかしながら、最も重要な特徴は、以下の例７〜１０において説明するように、他の亜型のカリウムチャンネルと比べて、Ｖｍ２３及びＶｍ２４の双方が有するｈＫｖ１．３への高い親和性である。Ｖｍ２３及びＶｍ２４は、チャリーブドトキシン、アニュロックトキシン、ＢｇＫ、ＳｈＫ等の既知の他の遮断薬と比べてｈＫｖ１．３に対し高い親和性を有する［Panyi et al., 2006］。上述の他の遮断薬は、大きく異なるアミノ酸配列及び／又はジスルフィド対形成を有するか、又は異なる作用特異性及びＫｖ１．３チャンネルに対する結合親和性を示す。Ｖｍ２３及びＶｍ２４の一次構造の単純な分析から、それらが他のサソリ又はイソギンチャク毒と同様な方法でＫｖ１．３に影響を与えるかは明らかでない。このように、専有情報及び使用を請求するＶｍ２３及びＶｍ２４の配列は、Ｋｖ１．３チャンネルに影響を与える他のペプチドの知識から明らかではない。本発明は、完全に異なる新規のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２参照）を報告する。決定した配列が正しいことを示す更なる証拠は、合成的に調製したＶｍ２４で得られた結果からもたらされる。天然Ｖｍ２４及び合成的に調製したＶｍ２４の双方は、以下に示すように（例９）、全く同じ生理作用を有する。
５）最後に、二つのペプチドで見出した他の重要な事実は、それらが実験動物に対し相対的に高い濃度（２０グラムマウス体重当たり最大１００００マイクログラム）で注射した場合毒性がないことである。これは、以前述べたように、既知の他のサソリ毒液、例えば、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｎｏｘｉｕｓからのＣｎ２と比較してかなり顕著である［Zamudio et al., 1992］。Ｖｍ２４よりも約８００倍低い投与量でマウスに注入したＣｎ２は、５０％の死亡率をもたらす。
例２：Ｖ．メキシカナスの毒液中に存在する成分のマスフィンガープリント分析
サソリ毒液は、成分の非常に複雑な混合物であり、イオンチャンネルに関し活性がある短鎖ペプチド及び長鎖ペプチド（［Possani and Rodriguez de Ia Vega, 2006］において概説されている）、遊離アミン、ヌクレオチド、炭水化物、脂質（Possani et al., 1999において概説されている）、ホスホリパーゼ［Zamudio et al., 1997: Valdez et al., 2004］、ヒアルロニダーゼ、リゾチーム［Batista et al., 2007］等の酵素、及び未知の機能を有するその他多くのタンパク質成分［Diego-Garcia et al., 2007］を備える。加えて、サソリは、地表上で３億年以上も進化した非常に古代の生物であり、その餌を狩ったり又は捕食動物から自身を守るための特殊な手段を選択する時間があった。このため、その毒液における生物学的活性な成分の存在を捜し求めることは魅力的で且つ賢明である。質量分析法及び装置に関する最近の進歩の結果、今では全毒液のマスフィンガープリント分析を得ることが可能である。このため、Ｖ．メキシカナスの可溶性毒液で行った最初の研究の一つは、全ての成分についての分子量の同定であり、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱＤＵＯ（San Jose, CA）イオントラップ質量分析計（ＥＩＳ／ＭＳ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ（Uppsala, Sweden）からのマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）型Ｅｔｔａｎ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／Ｐｒｏ装置を用いて同定される。使用した戦略は、精製分離の純ペプチド又はＣ１８逆カラム（図１）において混合物として溶出する関連成分のファミリーによって予め選択し、次いで、質量分析によってその分子量を分析することであった。表１において、ＨＰＬＣシステムから収集した画分の保持時間は、各画分で見られた成分の分子量に従ってリストに記載されている。３４０を超えた異なる分子量の成分を決定した。一部の成分は、ＨＰＬＣ分離システムの隣接する二つのサブ画分に現れるが、この場合、一つしか数えないことにについて言及する価値がある。また、一部の画分を同定していない（ＮＤとラベルされている）。
Figure 2010528988
Figure 2010528988
太字でラベルした成分は、それが毒液中高濃度で存在することを意味しており、一方、イタリック文字のものは、その成分がＥＩＳ／ＭＳスペクトルでしか同定されなかったことを意味する。文字Ｓが保持時間に先行する場合は、クロマトグラフィーのピークが対称でなく、収集した画分が曲線の上昇部分に対応することを意味しており、一方、文字がＢである場合は、それが曲線の下降部分を意味する。イタリック文字は、対応する分子量がＥＩＳ／ＭＳのみによって得られたことを意味する。一部の値を決定しなかった（ＮＤ）。
表１に記入された各種成分を分析し、１０００単位の分子量によって任意にグループ化した。５００Ｄａ未満の成分から始めて、次いで５００〜１０００、１０００〜２０００、それ以後は（各グループ１０００の違いで）９０００〜１００００Ｄａまである。同定した９０％を超える成分は、１００００Ｄａ未満の分子量を有する。三つのグループは、少なくとも６０の異なる成分を有した。それらは、１０００〜２０００、２０００〜３０００及び３０００〜４０００Ｄａの範囲に含まれた。４０を超える成分が、４０００〜５０００Ｄａの分子量を有した。
その結果は、機能分析に関する適切なペプチドを選択するのに重要であった。使用した論拠は、我々のグループによるＴｉｔｙｕｓ ｓｔｉｇｍｕｒｕｓサソリを用いた最近の論文［Batista et al., 2007］の発表により述べられており、ここで、異なる種類のサソリ（Ｖ．メキシカナスを含まない）の質量フィンガープリント分析を考慮してながら、比較分析を行った。４０００Ｄａ程度の分子量を持つペプチドが、Ｋ＋イオンに対して透過性があるイオンチャンネルの認識に特異的であることを見出すことは一般的である。このため、我々は、後述するように生理学的研究に関してこの範囲の分子量のペプチドを選択した。この戦略に従って、二つのペプチドＶｍ２３及びＶｍ２４を一次構造決定（図２）と更なる生物学的アッセイ（以下、例７〜１０参照）に対して選択した。
例３：Ｖｍ２３及びＶｍ２４のＣ末端アミノ酸配列の特徴付け
Ｖｍ２３のＣ末端アミノ酸配列での最終残基に関して、結果は明確である。本明細書の例１において説明した配列分析は、その配列は図２において示されるが、最終残基がアミド化されず遊離カルボキシルシステイン残基を有する一次構造を終結させるということをほぼ明確にする。
しかしながら、Ｖｍ２４についての質量分析の結果は、Ｃ末端残基がアミド化されていることを示唆する。文献は、所定のペプチドの最終アミノ酸のアミド化がその生物学的特性を明確にするのに重要であるという例を報告する。かかる例の一つは、サソリＨｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ ｓｐｉｎｎｉｆｅｒの毒ＨｓＴｘ１について見出した場合である［Lebrun et al, 1997］。電気物理学的実験は、この毒のアミド化形態が遊離カルボキシ末端形態より５倍強力であり、それはラットの脳シナプトソームへの結合実験において最大で３００倍大きい活性があることを示した［Lebrun et al, 1997］。このため、Ｖｍ２４の最終残基の化学的形態を確信することが非常に重要であった。例１の説明において述べたように、Ｖｍ２４に対する実験的分子量は３８６４Ｄａであり、図２に示すアミノ酸配列から予想された理論的分子量は３８６４．６Ｄａであった。この２つの値は、０．６ａ．ｍ．ｕ．異なっており、Ｖｍ２４のアミド化Ｃ末端の存在に起因している可能性がある。Ａｒｇ−Ｃ切断によって生成したＣ末端ペプチド（９０９．４ａ．ｍ．ｕ．モノアイソトピック質量）で行った衝突誘起解離（ＣＩＤ）実験は、遊離カルボキシ末端ペプチドについて予想される理論値より１．０ａ．ｍ．ｕ．低いｙイオンシリーズ値と、ｂイオンシリーズの正確な値とを示し、毒のＣ末端がアミド化されていることを裏付ける（図３）。
この実験については、Ｖｍ２４の２５マイクログラムタンパク質の一定分量を、上述の例１と同じ手順を用いて、酵素Ａｒｇ−Ｃによって酵素的に切断した［Valdez et al., 2004; Batista et al., 2007］。酵素的加水分解の生成物を、例１と同じシステムのＨＰＬＣによって分離した。全てのペプチドは、均質であり、ＭＳによって系統的に分析され、９０９．５ａ．ｍ．ｕ．の分子量を持つペプチドをＭＳ／ＭＳ分析にかけた。質量分析計のナノスプレーイオン化源についての実験プロトコールの設定は、加熱毛細管が１３０℃で、スプレー電圧が１．６５ｋＶであった。測量溶媒送達システムを、線形モードで５０％アセトニトリル（ＡｃＣＮ）を用い、０．６マイクロリットル／分で操作した。ＭＳ／ＭＳスキャンは、注入時間ミリ秒当たり２００スキャン、活性化した広帯域、２５Ｖの衝突エネルギー、１．０（ｍ／ｚ）の単離幅、及び４０％正規化衝突エネルギーによって規定された。データを手動及びカリフォルニア大学−サンフランシスコ質量分析施設によって開発されたプロテイン・プロスペクター（http://prospector.ucsf.edu/）のＭＳ-プロダクト・ツールを用いた自動で分析した。ＭＳ-プロダクト・ツールは、モノイソトピック質量、未修飾システイン及びブロック化されていないＮ末端残基を用いて生成したペプチドＫＣＫＣＹＹＣについての可能性のあるイオン断片の推測を可能にした。その計算を遊離カルボン酸末端及びアミド化Ｃ末端ペプチドの両方に対して行った。ＥＳＩイオントラップ装置をこの評価のために選択した。アミド化Ｃ末端ペプチドの理論的断片化を、プロテイン・プロスペクターを用いて行い、ｂ（232.11, 360.21, 463.22, 626.28及び789.34）及びｙイオン（782.27, 679.26, 551.16, 448.15, 285.09及び122.03）に対して実験的に得られた値と正確に同一な値を示した。従って、Ｖｍ２４ペプチドは、アミド化したＣ末端、即ち、システインアミド残基を所有する。
例４：Ｖｍ２４のジスルフィド架橋の決定
大きさが小さいため、Ｖｍ２４の毒は、構造−機能の関係を研究するための理想分子である。該ペプチドは、位置６、１２、１６、２１、２６、３１、３３及び３６に位置する８のシステイン残基を含有し、四つの分子内ジスルフィド結合を形成する。この例は、タンパク質酵素で切断した後、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製したペプチドのエドマン分解及び質量分析決定を用いた、Ｖｍ２４のジスルフィド結合パターンの決定について説明する。
ジスルフィド対形成を純毒のエンドペプチダーゼ切断及びＨＰＬＣによる分離後に得られたペプチド断片の質量分析によって測定した。タンパク質２５マイクログラムを含有する毒のサンプルを、ｐＨ６．８で１５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中のキモトリプシン及びトリプシン（Boehring, Mnhein, Germany）の等量混合物（各０．５マイクログラム）と共に３７℃で１２時間インキュベートした。生成したペプチドを、Ｃ１８逆相カラム（Vydac, Hisperia, CAのカタログ番号218TP54）を用いたＨＰＬＣによって分離した。溶媒Ａ（０．１２％ＴＦＡの水）から６０％溶媒Ｂ（０．１０％ＴＦＡのアセトニトリル）までの線形勾配を上記カラムに適用して、６０分間流した。流出ピークを収集し、すぐに凍結乾燥した。個々のペプチドを質量分析断片化（ＭＳ／ＭＳ）によって分析し、アミノ酸配列を得た。一次構造は知られているため、ジスルフィド架橋の決定を推測した。
Ｖｍ２４の還元形態及び酸化形態の分子量比較は、正確に８ａ．ｍ．ｕ．の差を示す。天然ペプチドに対する実験的分子量は、３８６４．０ａ．ｍ．ｕ．であり、完全に還元したペプチドについては、３８７２ａ．ｍ．ｕ．であり、全てのシステインがジスルフィド架橋形態で含まれていることを確認した。主な三つのペプチド断片を、ｐＨ６．８（混合ジスルフィド再編成を防ぐためのわずかに酸性のｐＨ）でキモトリプシン及びトリプシンの同時消化から得、［Ｍ＋Ｈ］＋７８８．０、［Ｍ＋Ｈ］＋５６０．４及び［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０９９．７ａ．ｍ．ｕのモノアイソトピック分子量を示した（図４−１、４−２及び５Ａ）。［Ｍ＋Ｈ］＋７８８．０のペプチドは、ヘテロ二量体アミノ酸配列ＡＱＧＣＫ−ＣＹのシステイン対（Ｃ４−Ｃ８）の期待される分子量に正確に一致する（図４−１）。決定された第二のジスルフィド架橋は、５６０．４ａ．ｍ．ｕ．の等しい理論値及び実験値を有するＣ３−Ｃ６であった（図４−２）。更に、両ペプチドは、期待されるアミノ酸配列を示すＣＩＤ実験によって特徴付けられた。ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０９９．７ａｍｕ（デコンボリューション質量２１９７．４）のシグナルは、最後の二つのシステイン半ペアを含有するヘテロ二量体コアに由来する（図５Ａ）。この断片を直接分析した。ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０９９．７のシグナルからのＣＩＤイオンシリーズは、最後の二つのシステインペアの完全な決定についての条件を満たす二つのイオン値を示す。１５０７．４でのｂイオン及び６９１．３でのｙイオンは、グルタミン酸（Ｅ１１）とシステイン（Ｃ１２）間での同一のアミド切断結合からの生成物であり、Ｃ１−Ｃ５及びＣ２−Ｃ７の半ペアを明確に割り当てる。更に、ｂ-イオン１７１０．５からｂ-イオン１１３７．３のタンデムでの断片化値は、図５Ｂにおいて模式的に表されるジスルフィド架橋配置を確認する明確な質量を持つ内部タグ（ＧＳＰＥＣ−Ｃ）を特徴づける。
例５：Ｖｍ２４の化学合成
この例では、Ｖｍ２４の化学合成を説明する前に、ペプチド化学のテーマにおける一部の基本概念と、存在する生成物の自然抽出よりむしろ化学合成によってリガンドを生成する論理的証拠について取り上げることが重要である。
多くの毒性ポリペプチドは、毒液源から精製され、細胞情報交換を研究するのに役立つ手段であった。なぜなら、それらは、受容体（サソリ毒の場合、大部分はイオンチャンネル）に結合することによって生体膜を介したイオン分布に影響を与え、それらは、該膜を介した細胞脱分極又は電位調節を引き起こし、このようにして細胞機能を制御するからである。この理由により、異なる種類又は亜型のイオンチャンネルを区別できる特異的毒性ペプチドの発見は、実験動物の生理学的又は異常状態の範囲の治療、最終的にはヒトの病理学の治療に役立つ治療の導出である。既知のペプチドの大部分は、短く、十分に折り畳まれ詰められた構造であり、高い効力、良好な標的特異性、高い可溶性及び作用の早い開始等の他の有機化合物に対して一連の利点を示す。更に、それらは、幾つかのジスルフィド架橋によって架橋結合した小ペプチドである場合が多い。その構造的特性は、該ペプチドに高度な安定性を与えるが、合成的に調製した誘導体の正しい折り畳みは、適切な合成に対して幾つか追加の問題をもたらす。しかしながら、毒液源に存在するポリペプチドの量は、通常かなり少ない。実際、それらは生理学的作用においてかなり特異的で且つ効果的であるため、上記ペプチドを生成する動物は、その餌を狩ったり又は捕食動物から自身を守るのに効果的に該ペプチドを使用するため、大量に生成する必要がない。毒液源から直接単離した各種ペプチドは、通常、作用の一般的な機構を特徴付けるのに十分であり、過去には、主に核磁気共鳴技術によってペプチドの構造的特徴付けを可能にしてきたが、通常、調査又は臨床適用によって探求された範囲に応じて、同一のペプチド又はその誘導体を合成的に生成することが必要である。ペプチドの三次元構造の決定及び受容体側（イオンチャンネル）の認識に関与する表面の同定は、最初のモデルの修飾したバージョンの設計又はペプチド模倣物の合成の基礎である。
ここで、我々は、Ｖｍ２４の化学合成について説明する。歴史的に、Ｖｍ２４は、Ｖｍ２３より前に同定された。このため、本発明の目的である、詳細の研究の大部分が、Ｖｍ２４の場合に対してここで実施及び説明され、その後両方のペプチドが本物であることを確認した。
Ｖｍ２４の線状類似体をリンク・アミド・ＭＢＨＡ樹脂（Calbiochem-Novabiochem Corp）上での固相法によって合成した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Calbiochem-Novabiochem Corp）は、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（Ｏｔｂｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）及びＴｙｒ（ｔＢｕ）の側鎖保護が使用された。
Ｆｍｏｃ基は、２０％ピぺリジンジのメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液で２０分間処理し、その後ＤＭＦで洗浄することによって除去された。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）は、活性化剤としてＨＢＴＵ（２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）／ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（０．４５ｍｍｏｌ／０．７５ｍｍｏｌ、２分間活性化）を用いてＤＭＦ中で予備形成してなる活性エステルとして、カップリングされた。カップリング時間は、３０分であった。未反応又は非ブロック化の遊離アミノ酸を、ペプチド合成のすべてのサイクルおいて、ニンヒドリン試験で監視した（Sarin et al 1981）。全体の合成中で、次のアミノ酸をカップリングする前に、望ましくない残留遊離アミンをアセチル化によってブロック化した。全ての操作は、テフロン（登録商標）で内張りしたねじ蓋を備えた５０ｍｌガラス反応容器中で手動にて行われた。ペプチド樹脂は、Ｎα−脱保護及びカップリング工程の間緩徐な反転によって攪拌された。
Ｆｍｏｃ基の最終除去の後、ペプチド樹脂（１．７グラム）を樹脂から切断し、同時に室温にて２時間試薬Ｋ［Drakopoulou et al 1995］を用いて脱保護した。切断後、粗ペプチドを沈殿させ、氷冷ｔ−ブチルエーテルで洗浄し、２０％酢酸水溶液に溶解させた。生成物を凍結乾燥し、使用まで−２０℃で乾燥保存した。
対応する分子のジスルフィド架橋を作るための環化反応を、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．８）及び３０μＭの折り畳まれていない合成Ｖｍ２４中で行った。環化した粗生成物をＨＰＬＣによる二つの工程で精製した。最初は、溶液Ａ（０．１２％ＴＦＡの水）から溶液Ｂ（０．１％ＴＦＡのアセトニトリル）までの線形勾配のＣ１８調製カラム（238TP1022 Vydac）を用いて、６０分で６０％のＢまで流した。得られたクロマトグラムのプロファイルを図６に示す。主成分（図６中で番号１とラベルされている）を最終的に溶媒Ａから６０分で４０％Ｂまでの線形勾配で流したＣ１８分析カラム（238TP54 Vydac）を用いて精製した（図６の差し込み図）。合成毒の構造及び純度を分析ＨＰＬＣ、アミノ酸配列及び質量分析決定によって確認した。アミノ酸配列をＢｅｃｋｍａｎ ＬＦ３０００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Fullerton, CA）で実行し、また、質量分析をＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱＤｕｏスペクトロメーター（San Jose, CA. USA）において行った。アミノ酸配列の正確性をエドマン分解によって残基番号３０まで確認した。ＨＰＬＣカラムからの溶出時間は、天然ペプチドが同一条件で同一カラムから溶出する時間と正確に一致した。天然Ｖｍ２４（図７Ａ）、ここに記載の合成Ｖｍ２４（図７Ｂ）並びに天然及び合成Ｖｍ２４の等モル混合物（図７Ｃ）によって得た溶出パターンの例を図７に示す。質量分析によって決定した分子量は、３８６４Ｄａであり、予想した配列と完全な一致を示した。用いた樹脂は、正確にはＶｍ２４の場合に、Ｃ末端アミド化ペプチドの生成に対して設計されることについて言及する価値がある。
Ｖｍ２４の予想した一次配列を持つ合成的に調製したペプチドを含有する約１．７グラムの樹脂から、正確に折り畳まれたペプチドを約３００ミリグラム得、（開始樹脂から）予想した理論値の３０％の収率を示した。
例６：アミノ酸配列比較
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列は、短いペプチド鎖、リッチな塩基性アミノ酸残基、類似のシステインパターン等、α−ＫＴｘファミリー内で分類される他の短鎖サソリ毒［Tytgat et al., 1999］との類似点をいくらか示す。このファミリーの全てのメンバーは、構造的に関連しており、カリウムチャンネル遮断薬として類似の機能を果たす。それにもかからわず、それらは、特定の種類及び亜型のカリウムチャンネルに対して多様な選択性を示す［Rodriguez de la Vega and Possani, 2004; Panyi et al., 2006］。分類を提案した研究者の国際発表による論理的根拠は、所定のサブファミリーがそのメンバーの中で高い割合の類似性及び他のサブファミリーのメンバーとの低い同一性によって識別できることであった［Tytgat et al., 1999］。その後、この識別がほとんどのサブファミリーの薬理学的スペクトルを反映することが実証された［Rodriguez de la Vega et al., 2003; Zhu et al., 2004)］。従って、相対的に制限されたファミリーの多様性を−そのサイズを詰めて−考慮すると、所定の機能スペクトルを与える分子特性及び構造特性を同定することは重要である。この種の分析は、通常、配列比較及び系統発生学的推測により行われる。該比較の基礎にある考えは、同一系列に属するタンパク質が一つ又は複数の先祖遺伝子の複製及び分岐に従って又は付随した種分化の現象に関係しているという仮説によるものであり、生物情報学分析によるその進化史の再構築を可能にし、所定の配列空間内での適応度地形を浄化するのに役立つ［Thornton and DeSaIIe, 2000; Orengo and Thornton, 2005］。
Ｖｍ２４及びＶｍ２３の配列類似性の同定のため、局所アライメント（ＢＬＡＳＴ［Altschul et al., 1990］及びＦＡＳＴＡ ３［Pearson and Lipman, 1988］）内で発見的探索を実行するプログラムを用いが、かなり低い期待値（Ｅ値＞１０−５）でわずかな関係物しか同定されなかった。これまで報告された全ての短鎖毒に対しより密接な検査は、Ｖｍ２４及びＶｍ２３がα−ＫＴｘサブファミリー６の新規のメンバーである可能性を示唆する（［Tytgat et al., 1999］の提案に従う）。しかしながら、対比較は、該サブファミリーの他のメンバーと同一性がほとんどないことを示す（図８）。α−ＫＴｘファミリーの広い配列多様性は、Ｖｍ２４及びＶｍ２３が先に特徴付けられた２０のα−ＫＴｘサブファミリーのいずれかに属するかどうかについて解明することを困難にする。α−ＫＴｘファミリーとの関係を明確にするため、先に説明されたように［Bagdany et al., 2005］、α−ＫＴｘファミリーに属する９２の配列の多配列アライメントを用いた、ＭｒＢａｙｅｒｓ３．０４ｂ［Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist and Huelsenbeck, 2003］によって、Ｂａｙｅｓｉａｎの系統発生学的推論分析を行った。Ｂａｙｅｓｉａｎの生理学的推論は、ｎ−１の確率的に生成した樹上でのマルコフ連鎖モンテカルロ法（ＭＣＭＣ）に基づいたサンプリング手順によって、所定の樹トポロジーの事後確率を推定する。一のマルコフ連鎖は、所定のサンプリング手順の工程での最高の事後確率を有する樹トポロジー内で発見的探索したままであり、特定のアミノ酸モデルで評価した（全プロセスは、メトロポリス・カップリング・マルコフ連鎖モンテカルロ法又はＭＣ３と呼ばれる）。この分析に対して、それぞれ２５００００の樹を有する四つの鎖をＪＴＴアミノ酸置換モデル下で生成し、２５０回の反復毎にサンプリングした。合一が１７５０００の反復でほぼ得られ、最高の事後確率を有する残りの２５０樹を一つにまとめて、５０％多数決合意樹を求めた。この樹は、α―ＫＴｘサブファミリー６が、最終的な樹の組の９２％において、その全てのメンバーとサブファミリー７から密接に関係がある二つの毒を含む単系統グループとして分離することを明らかに示す。また、分析は、この分岐群の姉妹群としてＶｍ２４及びＶｍ２３を置き（特定の仕切りが最終樹の８１％で見られる。図８参照）、これは、Ｖｍ２４及びＶｍ２３が新規のα−ＫＴｘのサブファミリーを構成することを強く支持する。これらの分析に基づき、Ｋチャンネルに特異的なサソリ毒を分類した研究者の国際発表によって提案されたガイドラインを考慮すると［Tytgat et al., 1999］、Ｖｍ２３及びＶｍ２４がＫチャンネルを認識するサソリ毒の新規のサブファミリーを構成することが明らかである。これらの毒間での最高の配列同一性は、他のＫチャンネル遮断薬サブファミリーのように、Ｃ末端部分に位置している。Ｎ末端セグメントは、このサブファミリーの最も多様性のある領域であり、Ｖｍ２４及びＶｍ２３のみが、配列の初めに珍しい連続トリプルアラニンセグメントを示す。
例７：Ｖｍ２４は、Ｔ細胞のＣａ２＋活性化ＫチャンネルｈＩＫＣａ１に優先して、選択的に電位開口型ｈＫｖ１．３チャンネルを遮断する。
Ｖｍ２４によるｈＫｖ１．３チャンネルの高親和性遮断
Ｖｍ２４によるｈＫｖ１．３チャンネルの遮断は、ヒト末梢血Ｔ細胞で内因的に発現したチャンネルにおいて特徴付けられた［Peter et al., 2001; Bagdany et al］。電気生理学的実験用のＴ細胞を得るための手順の簡単な説明は以下の通りである。ヘパリン化ヒト末梢静脈血を健康なボランティアから得た。単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ濃度勾配遠心分離によって分離した。収集した細胞を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を含有するＣａ２＋及びＭｇ２＋遊離ハンク溶液で２回洗浄した。３７℃の５％ＣＯ２恒温器中、１０％のＦＣＳ／Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）、１００マイクログラム／ｍｌのペニシリン、１００マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬグルタミンが補給されたＲＰＭＩ−１６４０の２４ウェル培養皿において、０．５×１０６／ｍｌの密度で３〜４日間細胞を培養した。また、培地は、フィトヘマグルチニンＡ（ＰＨＡ−Ｐ，Sigma-Aldrich Kft, Hungary）を６又は８マイクログラム／ｍｌ含有し、Ｋチャンネル発現を増加させた［Deutsch et al., 1986］。Ｔリンパ球は、Ｍａｔｔｅｓｏｎ及びＤｅｕｔｓｃｈ（Matteson et al., 1984）によって説明されるように、マウスの抗ヒトＣＤ２（Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA）とのインキュベーションと、その後のヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Biosource, Camarilo, CA, USA）でコーティングしたペトリ皿に対する選択的接着とによって電流を記録するために選択された。上記皿を、パッチクランプ試験のため、１ｍｌの正常な細胞外バス培地（以下、参照）で５回穏やかに洗浄した。
細胞全体での電流は、電圧固定Ｔ細胞において、Ａｘｏｎ Ｄｉｇｉｄａｔａ １２００又はＤｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ データ収集ハードウエアを用いたパーソナルコンピュータに接続したＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ａ又はＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器を用いて測定された。最大８５％の直列補償によって、電圧誤差を最小化し、良好な電圧固定条件を達成した。データ収集及び分析にｐＣｌａｍｐ８又はｐＣｌａｍｐ９ソフトウエアパッケージ（Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA）を用いた。分析に先立ち、細胞全体での電流追跡を漏れ抵抗に対して補正し、デジタルフィルタ処理を行った（３点ボックスカースムージング）。高度な電流遮断でのピーク電流の決定は、時定数が毒の不在下で決定したものに固定されたときのデータ追跡に、上昇する４次の指数関数を適合させることによって行われ［Hodgkin-Huxley model］、上昇成分の振幅を分離した。
５段階で、Ｃｌａｒｋ ＧＣ１５０Ｆ−１５ホウケイ酸ガラス毛細管からピペットを引き出し、先端熱加工し、バス中で２〜３メガオーム抵抗を有する電極をもたらした。バス溶液は、（ｍＭで）１４５のＮａＣｌ、５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ２、２．５のＣａＣｌ２、５．５のグルコース、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Sigma）が補充された１０のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）からなった。外液の測定オスモル濃度は、３０２〜３０８ミリオスモル（ｍＯｓｍ）の間であった。ピペット注入溶液（内液）は、（ｍＭで）１４０のＫＦ、２のＭｇＣｌ２、１のＣａＣｌ２、１０のＨＥＰＥＳ、１１のＥＧＴＡ（ｐＨ７．２２）からなった。内液の測定オスモル濃度は、約２９５ｍＯｓｍであった。異なる試験溶液での測定した細胞周囲のバスのかん流は、６の入力ライン及びフランジ開口部を持つＰＥ１０ポリエチレンチューブ出力チップを備えた重力流かん流セットアップによって達成され、乱流を低減した。過剰な液体は、連続的に除去された。
Ｔ細胞に電圧Ｋ＋電流を誘起するための標準的な電圧プロトコールは、−１２０ｍＶの保持電圧からの＋５０ｍＶまでの一連の１４ｍｓ長の脱分極からなる。電圧パルス間の時間を１５秒に設定し、ｈＫｖ１．３チャンネルの累積的不活性化を回避した。正常のバス溶液の代表的な電流追跡を図９Ａにおいて示す（対照）。適用した実験条件下（ピペット注入溶液中のＣａ２＋の欠如及び電圧プロトコールの性質）、細胞全体での電流をｈＫｖ１．３チャンネル単独で行った［Peter et al., 2001］。図９Ａは、同じ細胞において連続して記録したｈＫｖ１．３チャンネルを通過する巨視的Ｋ＋電流を示しており、かん流によって外液に１ｎＭのＶｍ２４を加える前（対照追跡）と後である。Ｋｖ１．３電流は、１ｎＭのＶｍ２４の存在下、第１２パルス（３分に相当する）によって完全に消去された。
Ｖｍ２４濃度１ｎＭ（黒丸）及び０．３ｎｍ（白丸）での遮断発生の動態を図９Ｂに示す。対照溶液の第４パルスの後に、細胞外かん流は毒含有溶液に切り替え、脱分極パルスは１５秒毎に連続させた。ピーク電流を決定し、対照溶液のピーク電流に対して正規化し、時間に応じてプロットした。図は、毒濃度が高いほど、遮断発生動態が毒及びチャンネル間の擬似一次反応から期待されるように速くなるが、両毒濃度にて細胞全体のＫｖ１．３電流の完全遮断が達成されることを示す。１ｎｍのＶｍ２４濃度のデータは、図９Ａに示す実験からのものである。毒のない対照溶液での記録チャンバーのかん流は、最初の８分以内で非常に小さい遮断の軽減をもたらした（図示せず）。３ｐＭの濃度での１０．５分間の毒の適用（図９Ｃ）では、電流損失が対照溶液で記録したピークの約３６％で飽和するように見える。この時間の後、３０分間の洗浄時間が続き（矢印は毒のない溶液での環流の開始を示す）、その間遮断した電流の３分の１が極めて緩徐に回復する（洗浄の推測時定数は、約３８００秒であり、２．６×１０−４ｓ−１のオフ率に対応する）。
サソリ毒がＫチャンネルを遮断する一般機構は、チャンネルの細胞外前庭への結合上でのイオン伝導経路の閉塞である［Goldstrein and Miller, 1993］。しかしながら、Ｖｍ２４の存在下での電流低下の緩徐で不完全な可逆性は、ｈＫｖ１．３の遮断よりむしろ膜上でのペプチドの非特異的効果を示唆する。我々は、このシナリオに対して以下のように論じる。１）（高毒濃度での）電流損失の発生速度は、Ｖｍ２４の濃度によって決まり、毒の濃度が高いほど速くなる（図９Ｂ）。２）リーク電流は、毒の存在下で増加せず、Ｖｍ２による膜の一般的な損傷の欠如を示す。３）Ｖｍ２４は、幾つかの他のＫ＋電流を阻害しないか、又はそれらを素早く不可逆的に阻害し（毒の選択性プロファイルにおいて後述する）、細胞膜構造に対する毒の非特異的作用又は一般的な膜タンパク質の毒誘起の機能損失に対して非常に強く主張する。４）Ｋｖ１．３のポア遮断薬としてよく知られるＣｈＴｘ及びＶｍ２４の同時適用は、同一の結合部位に対する二つの毒間での競争を示し、これは、ＣｈＴｘの濃度増加に従いＶｍ２４の遮断動態が緩徐になることから明らかであった（データを示さず）。
用量反応関係の発生に制限を定めた毒の非常に緩徐なオン・オフ速度は、図９のパネルＤ中に含まれる。概して、異なるペプチド濃度でのチャンネルの平衡遮断について、残留電流割合（ＲＣＦ）を、Ｉ／Ｉ０として求め、ここで、Ｉ及びＩ０は、それぞれ毒の存在下及び不在下で記録された。低いペプチド濃度での非常に緩徐なオン速度のため、Ｉの決定には、各症状によるピーク電流の下降がデータ収集の間見かけ上の飽和を観察するのに十分小さいものの、依然として遮断がその平衡値に達することはなかったために問題があった。より長い期間の毒適用の使用は、細胞全体でのパッチ・クランプ記録におけるピーク電流の安定性によって制限された。更に、ピークの減少は、ペプチドの極めて長い洗い流し時間のために独立して測定できなかった。よって、図９Ｄに示すデータは、異なる毒濃度でのＩ／Ｉ０値の上限を示し、従って、用量反応関係から推定したＫｄも実際のＫｄの過大評価である。図９Ｄにおける用量反応関係は、ＲＣＦ＝Ｋｄ ｎ／（Ｋｄ ｎ＋[Ｔｘ]ｎ）の関数で適合され、ここで、[Ｔｘ]は、毒濃度を示し、Ｋｄは、解離定数であり、ｎは、Ｈｉｌｌ係数である。重ね合わせた実線は、パラメータＫｄ＝２．９ｐＭ及び約１のＨｉｌｌ係数の場合に最適な適合を示す。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝３〜６）を示す。Ｈｉｌｌ係数のｎ〜１値は、単一の毒分子がチャンネルと相互作用することを示す（１：１化学量論）。我々の知っている限り、Ｖｍ２４は、電気生理学的分析においてｈＫｖ１．３の遮断薬として最高の親和性を有する。
Ｖｍ２４は、ｈＩＫＣａ１チャンネルの低親和性遮断薬である
例７の導入にて概要を述べたように、ペプチドが選択的免疫抑制剤であるために最も重要な要求の一つは、ＩＫＣａ１を越えたＫｖ１．３への選択性である。また、ＩＫＣａ１チャンネルは、Ｔ細胞で内因的に発現する［Grissmer et al., 1993］。ＩＫＣａ１チャンネルによって運ばれる電流は、１μＭの遊離Ｃａ２＋濃度を有するピペット注入溶液を用いて測定でき、そのチャンネルを完全に活性化させるのに十分である［Grissmer et al., 1993］。しかしながら、同一細胞中でのＫｖ１．３チャンネルの同時存在は、ＩＫＣａ１チャンネルの薬理学的な特徴付けを困難にし、Ｋｖ１．３チャンネルを活性化しない場合の膜電位の研究を制限する［Grissmer et al., 1993; Bagdany et al., 2005］。このことと、刺激したＴ細胞中でさえ比較的少数のＩＫＣａ１チャンネルとが、我々に組換えチャンネルを用いたＩＫＣａ１薬理学を研究させる動機付けとなった。
ＥＧＦＰでタグ付けしたヒトＩＫＣａ１遺伝子（ＡＦ０３３０２１）は、リポフェクタミン２０００試薬を用い、製造者のプロトコールに従って、Ｃｏｓ−７細胞内に形質移入された（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）。ＥＧＦＰでタグ付けしたｈＩＫＣａ１クローンは、Ｔ細胞中の天然ＩＫＣａ１に対して同一の生理学的特性及び薬理学的特性を有することが先に示されており、従って、薬理学的研究において広く用いられている［Wulff et al., 2001］。Ｃｏｓ−７細胞を標準的な細胞培養条件において維持した［Bagdany et al., 2005］。形質移入後、電流を２〜３日間記録した。ＧＦＰ陽性細胞の形質導入をＮｉｋｏｎ ＴＥ２０００Ｕ蛍光顕微鏡において同定し、電流の記録に用いた。正常な細胞外溶液は、上述のものと同一である。ピペット注入溶液の組成は、（ｍＭで）１５０のＫ−アスパラギン酸塩、５のＨＥＰＥＳ、１０のＥＧＴＡ、８．７のＣａＣｌ２、２のＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２）であった。この溶液は、１μＭの遊離Ｃａ２＋濃度を有しており、ｈＩＫＣａ１電流を完全に活性化した。他の全ての記録条件（データ収集、かん流等）は、Ｋｖ１．３チャンネルについての説明と同一である。
保持電位−１２０ｍＶからの−１２０ｍＶ〜＋５０ｍＶの２００ミリ秒長さの電圧ランプを用いて、Ｃｏｓ−７細胞中にｈＩＫＣａ１電流を誘発した（ランプ速度０．８５ｍＶ／ｍｓ）。電圧ランプを１０ｓ毎に流した。図９ＥにおけるＶｍ２４なしで記録した電流追跡（対照）は、非電位開口型の純ｈＩＫＣａ１電流が適用した電圧プロトコールによって誘起されたことを示す。電流の逆電位は、−７５ｍＶであり、記録溶液のイオン組成に基づいてＫ＋伝導性に対して特徴的である。ＩＫＣａ１電流について、線形の電流−電圧関係の傾き（ｓ）を用いて、電流遮断を特徴付けすることができる［Grissmer et al., 1993］。ｓの値は、図９Ｅに示す実験中、１０ｎＭのＶｍ２４の存在下において対照の約５２％まで減少し、平衡遮断に４．５分で到達する（２７の発症）。電流遮断は、かん流を毒のない細胞外溶液に切り替えると、２．５分で完全に逆になった（図９Ｅ、洗浄）。１ｎＭ及び１０ｎＭのＶｍ２４濃度での残留電流割合をｓ／ｓ０として計算し、ここで、ｓ及びｓ０は、それぞれＶｍ２４の存在下及び不在下で電圧ランプによって誘起したＩ−Ｖ関係の傾きであり、図９Ｆに示される。エラーバーは、ｎ＝３の独立した実験に対するＳＥＭを示す。１ｎＭの濃度で、Ｖｍ２４は、ｈＩＫＣａ１チャンネルを実質的に遮断せず（図９Ｆ）、一方、同じ濃度で該ペプチドはｈＫｖ１．３チャンネルを完全に遮断する（図９Ｄ）。ｈＩＫＣａ１に対するＶｍ２４のＫｄは、一の毒分子が一のチャンネルと相互作用し、約１４ｎＭのＫｄを与えるモデルから評価できる。ｈＫｖ１．３（２．９ｐＭ）で決定したＫｄを考慮すると、ｈＩＫＣａ１よりもｈＫｖ１．３に対するＶｍ２４の選択性は、少なくとも約４５００倍である。
例８：Ｖｍ２４の選択性プロファイル
本研究で用いた全てのチャンネル構築は、薬理学的アッセイ及び生理学的アッセイにおいて日常的に使用されており、その適用性はリストに挙げた参考文献において確認されている。
一過性形質転換：Ｃｏｓ−７細胞は、ラットＫｖ２．１（ｒＫｖ２．１、Dr. S. Korn, U. of Connectientから贈り物）［Immke et al., 1999］；ヒトＫｖ１．２（ｈＫｖ１．２、Ｋｖ１．２の完全コード配列を含有するｐｃＤＮＡ３／Ｈｙｇｒｏベクター、Dr. S. Grissmer, U. of Ulm, Germenyからの贈り物）［Visan et al., 2004］；ヒトＫｖ１．４（ｈＫｖ１．４ΔＮ：Ｋｖ１．４の不活性化球欠失変異体、D. Fedia, University of British Columbia, Vancouver, Canadaからの贈り物）［Kurata et al., 2004］；及びヒトＮａｖ１．５（R. Horn, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA, USAからの贈り物）［O'Leary et al., 1995; Ahern et al., 2005］チャンネルを発現するのに使用された。ｔｓＡ−２０１細胞は、ｈＢＫチャンネル（ｈＳｌｏ１遺伝子（Ｕ１１０５８）、ｐＣＩ−ネオプラスミド、Toshinori Hoshi, Uniersity of Pennsylvania, Philadelphia, PAからの贈り物）［Avdonin et al., 2003］を発現するのに使用された。その全てのチャンネルクローンは、製造者のプロトコールに従い、リポフェクタミン２０００試薬を用いて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をモル比１：５でコード化したプラスミドにより、一過性に同時形質導入され（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、標準条件下で培養された。形質導入後、電流を２〜３日間記録した。ＧＦＰ陽性細胞の形質導入をＮｉｋｏｎ ＴＥ２０００Ｕ蛍光顕微鏡において同定し、電流の記録に用いた（同時形質導入では＞７０％の成功率）。
安定な細胞株：ｍＫｖ１．１チャンネルを安定に発現するＬ９２９細胞及びｈＫｖ１．５チャンネルを安定に発現するＭＥＬ細胞は、前に説明され［Grissmer et al., 1994］、Ｄｒ．Ｈｅｉｋｅ Ｗｕｌｆｆ（UC Davis, CA, USA）の贈り物であった。ｈＥＲＧチャンネルは、ＨＥＫ−２９３細胞株において安定な方法で発現した。
細胞全体での電流を例７で説明されるように記録した。全ての場合で、ピペット注入溶液の組成が（ｍＭで）１４０のＫＣｌ、１０のＥＧＴＡ、９．６９のＣａＣｌ２、５のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）である場合のｈＢＫ電流を記録することを除いて、標準的な細胞外及びピペット注入溶液を用いた（例７参照）。この後者の溶液での遊離Ｃａ２＋濃度は、[Ｃａ２＋]ｉｎｔ＝５マイクロモル濃度であり、適切な脱分極電位でのＢＫ電流の記録を可能にする［Avdonin et al., 2003］。他の全ての実験条件（データ収集、分析原理、かん流）は、例７で記載したものと同一である。
標準的な細胞外溶液においてＫｖ１ファミリーのメンバー（ｍＫｖ１．１、ｈＫｖ１．２、ｈＫｖ１．３、ｈＫｖ１．４ΔＮ、ｈＫｖ１．５）について得た電流追跡（対照）を図１０Ａ〜１０Ｅに示す。全ての場合において、細胞を−１２０ｍＶの保持電位で保持し、＋５０ｍＶまで繰り返し脱分極させて、電流を誘発した。脱分極パルスの持続時間（図１０の各パネルにおいて分けて示す）を設定し、電流の完全な活性化を可能にし、不活性化を最小化した。全ての場合で、残留不活性化からのチャンネルの完全な回復のため、保持電位（−１２０ｍＶ）でのパルス間で十分な時間が許可された（パルス間隔は１５〜３０秒に及んだ）。ｈＫｖ１．３のバージョンを除いた速い（Ｎ型）不活性化をこの研究に用いた（ｈＫｖ１．４ΔＮ、１４７のＮ末端アミノ酸を除去する）。Ｎ型不活性化が無い場合、電流遮断の決定は、このクローンのピーク電流が非常に速い不活性化処理によって影響されないため、より容易で、より正確である（時定数：１５〜２０ｍｓ［Kurata et al., 2004］）。野生型チャンネルにおいては、時間依存電流活性化と不活性化間の競争によって、ピーク電流が推測され、電流遮断の分析を完結する。
図１０は、毒の適用前（対照）、１０ｎＭのＶｍ２４による遮断平衡後、及び毒の洗い流し（洗浄）後に記録した電流追跡を示す。パネルの分析は、ｈＫｖ１．４及びｈＫｖ１．５チャンネルが、Ｖｍ２４に対して部分的に非感受性であることを示す（図１２Ｂの棒グラフも参照）。しかし、１０ｎＭ濃度のＶｍ２４は、ｈＫｖ１．３に対するＫｄの約３５００倍であり、ｍＫｖ１．１チャンネル（ＲＣＦ＝０．８２±０．０２，ｎ＝３）及びｈＫｖ１．２チャンネル（ＲＣＦ＝０．５４±０．０８，ｎ＝３）を顕著に遮断する。更に、ｈＫｖ１．２の遮断は、完全に可逆的でない。１０ｎＭのＶｍ２４濃度でのｈＫｖ１．３の遮断（ヒトＴ細胞にて記録）は、Ｋｖ１チャンネル（ＲＣＦ＝０．０１±０．０１，ｎ＝３）の遮断薬としてのＶｍ２４の効力についての簡単な比較のため、図１０Ｃに示される。ｍＫｖ１．１及びｈＫｖ１．２電流の顕著な遮断によって、Ｖｍ２４を低濃度（１ｎＭ）でも試験した（図１２Ａ）。１ｎＭの濃度にて、ＲＣＦ値は、ｍＫ．１．１及びｈＫｖ１．２電流についてそれぞれ０．９７±０．０２（ｎ＝３）及び０．８１±０．０１５（ｎ＝３）であった。ＲＣＦ値から、そのチャンネルに対するＶｍ２４の親和性は、一の毒分子が一のチャンネルと相互作用し、ｍＫｖ１．１では３０〜４０ｎＭの間の及びｈＫｖ１．２では５〜１０ｎＭの間のＫｄ値を与えるモデルから評価できる。ｈＫｖ１．３（２．９ｐＭ）について決定したＫｄを考慮すると、Ｖｍ２４のｍＫｖ１．１及びｈＫｖ１．２を越えたｈＫｖ１．３に対する選択性は、それぞれ少なくとも約１００００倍及び１５００倍である。
また、動物の毒による遮断に対する顕著な生物学的効果及び感受性を有する他のイオンチャンネルの活性を阻害するＶｍ２４の効力を決定した。これには、ｒＫｖ２．１及びｈＥＲＧ（Ｋｖ１１．１）電位開口型Ｋチャンネルと、Ｃａ２＋活性化ＫチャンネルｈＢＫ（ＫＣａ１．１）及び心臓電位開口型ナトリウムチャンネルＮａｖ１．５が含まれる。図１１は、標準的な細胞外溶液における所定のチャンネルに適切な電圧プロトコールで誘発した代表的な細胞全体での電流を示す（対照）。Ｋｖ２．１及びＮａｖ１．５のピーク電流は、それぞれ保持電位−１２０ｍＶからの＋５０ｍＶ及び０ｍＶまでの脱分極に対応して得た記録から決定された（図１１Ａ及び１１Ｄ）。ｈＥＲＧチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞は、−８０ｍＶで保持され、２．５秒間で＋２０ｍＶまで脱分極し、チャンネルを活性化及び不活性化した（図１１Ｂ）。これは、−４０ｍＶまでのステップによってもたらされ、ここで、不活性化チャンネルは急速に回復し、ｈＥＲＧピーク電流を決定することができる。この複雑な電圧プロトコールは、ｈＥＲＧ電流を記録するのに標準的である。ＢＫチャンネルは、膜の脱分極によって活性化されるが（図１１Ｂ）、開確率の電圧依存性は、細胞内遊離Ｃａ２＋濃度によって決まる。この研究で適用した５マイクロモル濃度の遊離[Ｃａ２＋]濃度で、５０％を超えるチャンネルが＋５０ｍＶで活性化され、他のＫｖチャンネルに対して使用したものと同一の膜電位でのＶｍ２４の効果の比較が可能となる。＋５０ｍＶでのＢＫの完全な活性化は、安定な細胞全体での記録と不適合な[Ｃａ２＋]を必要とし、逆に、５マイクロモル濃度の遊離[Ｃａ２＋]でのＢＫチャンネルの完全な活性化は、＞＋１００ｍＶまでの脱分極を必要とする。従って、５マイクロモル濃度の[Ｃａ２＋]と＋５０ｍＶの試験電位の組み合わせは、Ｖｍ２４の効果を研究するのに合理的な妥協案である。試験パルスを進行する−１２０ｍまでのパルスを非特異的なリークの評価に用いた。パルスプロトコール間の保持電位は０ｍＶであり、ここで、全てのＫｖチャンネルは完全に不活性化され、それにより、ｔｓＡ−２０１細胞で散発的に見られた内因性Ｋｖ電流によって記録の混入の可能性を低減する。この膜電位で、ＢＫチャンネルはすでに活性であり、パルス開始時での顕著な保持電流によって実証されている。
図１１に示す異なるチャンネル上でのＶｍ２４の効果をアッセイするため、細胞を繰り返し脱分極し、異なる細胞外溶液に電流を誘発した。図１１は、毒の適用前（対照）、１０ｎＭのＶｍ２４の４〜７分間の適用後、及び毒の洗い流し後（洗浄）に記録した代表的な電流追跡を示す。図１１の全パネルは、Ｖｍ２４の存在下で記録した電流が対照溶液及び洗い流し後に記録したものと区別ができないことを示し、該チャンネルの遮断の欠如を示す。統計的分析を図１２Ｂに示し、ここで、残留電流割合の平均及びＳＥＭを１０ｎＭのＶｍ２４の存在下で示す（ｎ≧３）。
図１２に示すデータは、各種Ｋチャンネルに対するＶｍ２４の遮断効力の順序が、ｈＫｖ１．３＞＞＞ｈＫｖ１．２＞ｈＩＫＣａ１＞ｍＫｖ１．１＞＞＞ｈＫｖ１．４≒ｈＫｖ１．５≒ｒＫｖ２．１≒ｈＥＲＧ≒ｈＢＫ≒ｈＮａｖ１．５であることを示す。用量反応関係からのｈＫｖ１．３に対して得られるＫｄ値と、他のチャンネルに対するＫｄ値の単一点評価に基づいて（即ち、１０ｎＭのＶｍ２４及び１：１の毒−チャンネル化学量論をと仮定した電流の残留割合から計算した）、Ｖｍ２４のｈＫｖ１．３に対するこの研究でアッセイした他のチャンネルを越えた選択性は、＞１５００倍である。この値は、選択性に対して一般に認められた規準を十分に越えるものであり［Giangiacomo et al., 2004］、平衡分解定数における１００倍の差異又は二つの異なるカリウムチャンネルＣｈ１及びＣｈ２に結合するα―ＫＴｘについての結合自由エネルギーの差、ΔΔＧＣｈ１；Ｃｈ２＞２．７２ｋｃａｌ／ｍｏｌとして決定される。
例９：合成Ｖｍ２４は、天然毒と等しく強力なｈＫｖ１．３の遮断薬である
例５で説明したように、理論上及び実施上の考慮すべき事項がＶｍ２４の化学合成に導いた。説明のとおり、合成した毒の構造及び純度を分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸配列及び質量分析決定によって確認した。その全てのアプローチは、合成したＶｍ２４（ｓＶｍ２４）の一次配列が天然ペプチドのものと一致することを示した。更に、ｓＶｍ２４の生成に対するプロトコールは、折り畳みが天然ペプチドの場合と同じジスルフィド対形成に制限されるように設計されたチオール基のための異なる保護基を用いた。しかしながら、このデータは、ペプチドの生理学的活性が維持されることを保証しない。高親和性の遮断を媒介するチャンネル及びペプチドの相補的表面は、非常に複雑であり、天然ペプチドの構造からの最小限の逸脱は、Ｋｖ１．３を遮断する際のｓＶｍ２４の効果を落とし得る［Giangiacomo et al., 2004］。
ｓＶｍ２４の生物活性をヒトＴ細胞のＫｖ１．３チャンネル上でアッセイした。この研究の実験条件は、例７に説明されるものと完全に同一であった。細胞全体でパッチクランプしたＴリンパ球は、異なる溶液の存在下、保持電圧−１２０ｍＶから＋５０ｍＶまで３０秒毎に繰り返し脱分極した（図１３Ａ）。ｓＶｍ２４の不在下で測定したｈＫｖ１．３電流（対照）は、徐々に、そして、かん流装置を介して１００ｐＭのｓＶｍを投与したときにほぼ完全に消滅した。第１６パルスの後、記録チャンバーを毒のない細胞外溶液でかん流した。かん流溶液からの毒の除去は、５分以内にｈＫｖ１．３遮断の顕著な軽減につながらなかった。これは、図１３Ｂにおいてより明確に実証されており、ここで、ｓＶｍ２４の適用前の対照溶液にて記録したピーク電流に対して正規化したピーク電流（正規化ピーク）を時間に応じて示す。矢印は、ｓＶｍ２４（１００ｐＭのｓＶｍ２４）を用いたかん流の開始及び毒のない溶液（洗い流し）へのかん流の切り替えを示す。１００ｐＭのｓＶｍ２４又はＶｍ２４での遮断の平衡後に測定した残留電流割合（ＲＣＦ）を図１３Ｂにおいて比較する（それぞれｎ＝６及びｎ＝４で、バーはＳＥＭを示す）。統計的比較（ｔテスト）は、ＲＣＦが二つのグループ間で統計的に違いがないことを示した（ｐ＝０．５７）。我々の結論は、ｓＶｍ２４がｈＫｖ１．３チャンネルを遮断する点において天然毒と同程度強力であるということである。
例１０：異なるイオンチャンネル上でのＶｍ２３の生物活性の分析
サソリ毒液は、大量の生物活性ペプチドを含む。所定の種の毒液は、Ｖ．メキシカナスのＶｍ２３及びＶｍ２４の場合のように、高度な配列同一性を有するペプチドを含む場合が多い（例１参照）。ペプチドの高度な配列同一性は、通常個々の分子に対して異なる生物活性を与える。これは、イオンチャンネルの外部前庭に位置する毒受容体とのペプチド毒の相互作用が、長距離静電相互作用、短距離静電相互作用及び密接相互作用を含めた複数の機構によって決定され、その要因の正味効果は、結合親和性及び選択性を決定する［Park and Miller, 1992; Peter et al., 2001; Giangiacomo et al., 2004]。以前示されたことには、同じサソリの二つのペプチド（Ｐ．ｉｍｐｅｒａｔｏｒのＰｉ２及びＰｉ３）は、単一のアミノ酸のみが異なり、その両方がサブナノモル濃度の濃度にてＫｖ１．３を遮断する［Peter et al., 2001］。また、Ｍｉｌｌｅｒ及び共同研究者の先駆けの研究から［Goldstein et al., 1994］明らかであるのは、チャリーブドトキシンの幾つかの位置における非保存的なアミノ酸置換でさえ十分に許容され、毒は、Ｓｈａｋｅｒカリウムチャンネルに対する親和性を維持する（例えば、Ｔ９Ｋ及びＮ２２Ｋ）。また、Ｖｍ２３とＶｍ２４間の差異がＫｖ１．３に対する親和性及び特異性を変化させるのに重要でないことを検証するため、Ｖｍ２３の薬理学的プロファイルを以下に示されるように詳細に試験した。
Ｖｍ２３のイオンチャンネル遮断効力をヒトＴ細胞のＫｖ１．３チャンネルに対して、またｍＫｖ１．１、ｈＫｖ１．２及びｈＩＫＣａ１チャンネルに対してアッセイした。それらのチャンネルは、Ｖｍ２３と８３％配列同一性を共有する関連ペプチドＶｍ２４によって該チャンネルの低親和性遮断（ｍＫｖ１．１、ｈＫｖ１．２及びｈＩＫＣａ１）又は高親和性遮断（ｈＫｖ１．３）に基づく研究において、それらのチャンネルが挙げられた。実験条件は、例７及び例８の対応するチャンネルについて記載されたものと完全に同一であった。
細胞全体をパッチ固定したＴリンパ球は、異なる溶液の存在下で１５秒毎に保持電位−１２０ｍＶから＋５０ｍＶまで繰り返し脱分極された（図１４Ａ）。Ｖｍ２３の不在下で測定したｈＫｖ１．３電流（対照）は、かん流装置を介した１０ｎＭのＶｍ２３の投与により３．５分以内で完全に消滅した。「１０ｎＭのＶｍ２３」として示した追跡は、遮断の平衡の後に記録された。第１９パルス後、記録チャンバーは、毒のない細胞外溶液でかん流された（洗い流し）。かん流溶液からの毒の除去は、２分以内でのｈＫｖ１．３遮断の顕著な軽減につながらなかった。１０ｎＭのＶｍ２３での遮断の平衡後に測定した残留電流割合（ＲＣＦ）を図１５に示す（ｎ＝３、バーはＳＥＭを示す）。その結果は、ｈＫｖ１．３チャンネルのＶｍ２３で媒介した遮断の特性がＶｍ２４で媒介した遮断の特性と非常に似ていることを示し、このアッセイで用いた時間制限を過ぎても、遮断は高親和性であり、毒のオフ速度は極めて遅い。制限された量のＶｍ２３（毒液の０．５％未満がＶｍ２３）は、ｈＫｖ１．３遮断の用量反応関係の決定及びＶｍ２４との解離定数の適切な統計的比較を妨げた。
１０ｎＭのＶｍ２３を加える前（対照）、３．５分後、及び該毒の洗い流し後（２分）に記録した電流の比較は、１０ｎＭのＶｍ２３がｈＩＫＣａ１チャンネル（図１４Ｂ）又はｍＫｖ１．１チャンネル（図１４Ｃ）を実質的に遮断しないことを示す（例７及び例８の対応するセクションにおいて実験的詳細を参照）。Ｖｍ２３によるｈＩＫＣａ１遮断の完全な欠如は、Ｖｍ２４の効果と異なり、同じ濃度で約４０％のチャンネルを遮断した（図９Ｆ参照）。一方、ｈＫｖ１．２チャンネルは、１０ｎＭのＶｍ２３によってわずかに遮断され（図１４Ｄ）、０．９１±０．０２のＲＣＦ値を与え（ｎ＝３、ＳＥＭ、図１５）、その遮断は、２分以内で容易に逆にできなかった。同一濃度のＶｍ２４は、約４６％のチャンネルを遮断した（例８参照）。
１０ｎＭのＶｍ２３の存在下でのｈＫｖ１．３、ｈＩｋＣａ１、ｍＫｖ１．１及びｈＫｖ１．２に対する残留電流割合（図１５）のＶｍ２４について得られたデータ（図１２Ａ及びＢ）との比較は、ｈＫｖ１．３に対するＶｍ２３の選択性プロファイルが、試験したチャンネルについてわずかに良いことを示す。また、その比較から、結論としてはＶｍ２３及びＶｍ２４の一次構造の差異にもかかわらず、顕著な選択性を持つｈＫｖ１．３の高親和性遮断が維持される。
例１１：Ｖｍ２４の生体内での免疫効果
世界中の何億人もの人々は、限定されないが、特に、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎、骨吸収歯周病、免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性リンパ球増殖性症候群等の自己免疫疾患によって影響される。最近考えられていることには、これらの疾患の発症は、エフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ）に形質転換される休止状態の疾患特異的な自己反応性Ｔ細胞の活性化を伴う。自己反応性Ｔ細胞は、組織内への移動、炎症サイトカインの分泌及び即時性エフェクター効果の発揮による反復自己抗原刺激及び炎症損傷への寄与のため、未処理状態と連続活性化メモリＴ細胞を区別し得る［Sallusto et al., 1999］。遅延型過敏症（ＤＴＨ）に関する機構は、ＴＥＭ細胞に引き起こされる皮膚損傷の他の例である［Soler et al., 2003］。また、多くの自己免疫疾患の発症は、メモリＢ細胞、特にはクラス転換ＣＤ２７＋ＩｇＤ−サブセットに属するものに起因することがある［Iglesias et al., 2001; O'Connor et al., 2001; Corcione et al., 2004］。これらの理由により、細胞の他のリンパ球サブセットの活性を損なわず、選択的にＴＥＭ及びクラス転換メモリＢ細胞を標的とできる治療薬を開発することが望ましく、この方法で急性免疫反応の障害を避ける。本発明の例７において述べたように、電圧開口型Ｋｖ１．３チャンネルは、ＴＥＭ及びクラス転換メモリＢ細胞の免疫修飾のための新規な治療上の標的である。ＴＥＭ細胞は活性化時にｋＶ１．３を上方制御し、その抗原駆動の増殖は、Ｋｖ１．３チャンネルを遮断する既知の物質に対してかなり感受性がある［Wulff et al., 2003］。逆に、未処理細胞及びＴＥＭは、Ｋｖ１．３遮断薬に対して感受性がほとんどなく、カルシウムで活性化したＫチャンネルＫＣａ３．１を上方制御することで、Ｋｖ１．３に対してすぐに抵抗性を持つようになる［Wulff et al., 2003; Chandy et al., 2004］。分化過程の間、Ｂ細胞及びＴ細胞は、ＫＣａ３．１からＫｖ１．３にそのカリウムチャンネル依存性を変化させる［Wullf et al., 2004］。この事実により、Ｋｖ１．３チャンネル遮断薬は、未処理細胞及びＣＤ２７＋ＩｇＤ＋メモリ細胞に影響を与えることなく、該細胞の増殖を阻害する。従って、Ｋｖ１．３チャンネルに特異的な遮断薬の使用は、ＴＥＭ及びクラス転換メモリＢ細胞に優先的に影響を与え、免疫反応の大半を落とすことがないが、自己免疫疾患の結果として発生した健康状態を改善する。Ｋｖ１．３チャンネルの遮断は、動物モデルにおいて、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、歯周病骨吸収及びＤＴＨ反応を、明らかな副作用を引き起こすことなく、改善する［Koo et al., 1997; Beeton et al., 2001; Valverde et al., 2004］。ペプチドによるＫｖ１．３チャンネルの遮断はすぐに逆にできるため、化学療法剤又はモノクローナル抗体を用いたときの場合ではなく、正常なレベルに戻るまで数ヶ月かかる治療の過程を制御することができる。明らかなことには、主な問題は、この治療上の処置に対して非常に選択的なペプチドを発見することである［Chandy et al., 2004］。
先に説明した例７〜１０において示されるように、本発明の目的である両ペプチド（Ｖｍ２３及びＶｍ２４）は、生体内でＫｖ１．３チャンネルの強力で且つ非常に特異的な遮断薬である。実験は、作用の選択性を多様化するため、培養中でのヒトＴリンパ球について直接行われ、そして、幾つかの電圧依存性Ｋチャンネルを発現する他の細胞を用いて行われた。「概念実証」のため、生体内での実験は、重要なＤＴＨ反応を誘発することが可能な薬剤としてのジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）で感作されたラットで行われた。
この種の実験を行うため、我々は、ラットにおけるＤＴＨ反応を研究するプロトコールを設定する。使用したシステムは、基本的にＰｈａｎｕｐｈａｋらにより１９７４年に開示されている。簡単に言うと、ラットの二つのグループ（それぞれ３又は５匹）を、背部を穏やかに剃った後、０．７％のＤＮＦＢの４：１の割合のアセトン：オリーブ油溶液４０マイクロリットルの適用により、連続する２日（１日目及び２日目）で感作された。感作溶液を２回目に適用してから７日後、動物を上述のアセトン：オリーブ油溶液に溶解させた０．４％ＤＮＦＢの２０マイクロリットルの単回適用によって検証された。この溶液は、右側の耳の背部表面に広がり、乾燥させるが、左側の耳は、媒体溶液（アセトン：オリーブ油）のみが広がった。プロトコールの８日目、ｐＨ７．８のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００マイクロリットルの皮下注射を対照として使用した各動物に行い、一方、ラットの実験グループに対しては、１００マイクロリットルのＰＢＳ中１０マイクログラムの量の純Ｖｍ２４を皮下に適用した。全ての動物の両耳の厚さをＶｍ２４の適用後２４時間で測定した。
実験の結果を図１６に示す。明らかなことに、Ｖｍ２４を注入されていない対照動物は、０．３２ｍｍ程度の耳の炎症の平均値を有し（対照とラベルされている）、一方、１０マイクログラムのＶｍ２４を１回投与したラットは、炎症を低減し、わずか０．１０ｍｍの厚みであった。それらの値は、検証されていない耳（左側の耳）の厚さを引いたため、実際の炎症過程に対応する。これは、炎症過程の６０％以上の減少を示す。結論として、これらの結果は、Ｖｍ２４がラットにおけるＤＴＨ−反応に対する重要な免疫抑制剤であるという考えを支持する。従って、それは明らかに、Ｔ及びＢリンパ球の活性化に依存する免疫疾患の阻害剤としてアッセイされる価値があるリード成分であり、Ｋｖ１．３チャンネルの寄与は、疾患を誘発又は維持するのに重要である。
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Claims (36)

  1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を共有する単離精製されたペプチドであって、高い親和性及び特異性でカリウムチャンネルＫｖ１．３を遮断することができることを特徴とする単離精製されたペプチド。
  2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から構成されることを特徴とする請求項１に記載の単離精製されたペプチド。
  3. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から構成されることを特徴とする請求項１に記載の単離精製されたペプチド。
  4. 哺乳類細胞においてＫｖ１．３カリウムチャンネル活性を阻害する方法であって、
    前記哺乳類細胞において前記チャンネル活性を遮断するのに効果的な量のペプチドと、前記哺乳類細胞とを接触させる工程を含み、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３からなる群から選択されるアミノ酸配列もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を共有する機能的に同等なその類似体、又はその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする方法。
  5. 前記哺乳類細胞がヒトリンパ球細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. Ｔ-リンパ球細胞においてカルシウムシグナル経路を減衰させる方法であって、
    前記Ｔ-リンパ球細胞を、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有するペプチドの効果的な量と接触させる工程を含み、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
  7. 哺乳動物の免疫系においてＴ-細胞活性化過程を抑制する方法であって、
    前記Ｔ-細胞を、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有するペプチドの効果的な量と接触させる工程を含み、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする方法。
  8. 前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記Ｔ-細胞の活性化が、前記哺乳動物の免疫反応によって引き起こされることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  10. 前記免疫反応が、異種臓器拒絶反応の結果であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 前記免疫反応が、自己免疫疾患の結果であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  12. 哺乳動物の免疫反応を抑制する方法であって、
    前記哺乳動物に対して、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有するペプチドを含む組成物を、前記哺乳動物の前記反応を抑制するのに効果的な量で投与する工程を含み、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする方法。
  13. 前記免疫反応が、異種臓器拒絶反応の結果であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 前記免疫反応が、自己免疫疾患の結果であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 異種臓器拒絶反応の予防的な処置又は治療上の処置を必要とする対象において、異種臓器拒絶反応の予防的な処置又は治療上の処置を行う方法であって、
    前記対象に対して、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有するペプチドを含む組成物を効果的な量で投与する工程を含み、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする方法。
  16. 拒絶された臓器が、心臓、肺、肝臓、腎臓又は膵臓であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記処置を必要とする対象がヒトであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  18. リンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患の予防的な処置又は治療上の処置を必要とする対象において、リンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患の予防的な処置又は治療上の処置を行う方法であって、
    前記対象に対して、Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有するペプチドを含む組成物を効果的な量で投与する工程を含み、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする方法。
  19. 前記処置を必要とする対象がヒトであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 前記リンパ球ＴＥＭに関連した自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性乾癬、紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、交感性眼炎、骨吸収歯周病、免疫性血小板減少性紫斑病及び自己免疫性リンパ球増殖性症候群からなる群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  21. 更に、前記対象に対して少なくとも一つの追加の免疫抑制剤を投与する工程を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  22. 前記追加の免疫抑制剤が、シクロスポリン、ラパマイシン、アザチオプリン、プレドニゾン、ＳｈＫ毒素、ＳｈＫ誘導体及びデオキシスパガリン、それらの誘導体、又はそれらの塩からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  23. Ｋｖ１．３カリウムチャンネル遮断活性を有する少なくとも一つのペプチドと、薬学的に許容されるキャリアーと、任意には少なくとも一つの追加の免疫抑制剤とを含む医薬品組成物であって、
    前記ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする医薬品組成物。
  24. 前記追加の免疫抑制剤が、シクロスポリン、ラパマイシン、アザチオプリン、プレドニゾン、ＳｈＫ毒素、ＳｈＫ誘導体及びデオキシスパガリン、それらの誘導体、又はそれらの塩からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の医薬品組成物。
  25. 前記組成物を局所的、全身的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、経皮的もしくは経口的に投与するか、又は皮内注射、気管支内点滴、胃腸内送達もしくは経粘膜的送達によって投与することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  26. 前記組成物を局所的、全身的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、経皮的もしくは経口的に投与するか、又は皮内注射、気管支内点滴、胃腸内送達もしくは経粘膜的送達によって投与することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  27. Ｋｖ１．３カリウムチャンネルに結合する高い親和性及び特異性を有する標識ペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする標識ペプチド。
  28. 標識付け部分が、放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、発色団及びタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の標識ペプチド。
  29. 標識付けタンパク質が、抗体であることを特徴とする請求項２８に記載の標識ペプチド。
  30. 標識付けタンパク質が、ビオチンであることを特徴とする請求項２８に記載の標識ペプチド。
  31. 標識付けタンパク質が、緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項２８に記載の標識ペプチド。
  32. 標識付けタンパク質が、異なる発光スペクトルを有する前記緑色蛍光タンパク質由来のタンパク質であることを特徴とする請求項２８に記載の標識ペプチド。
  33. Ｋｖ１．３チャンネルを発現する細胞を同定する方法であって、
    ａ）Ｋｖ１．３カリウムチャンネルに結合する高い親和性及び特異性を有する標識ペプチドと標的細胞の集団を接触させる工程であって、前記標識ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、都合よく標識化されている工程と、
    ｂ）検出技術によって、前記標的細胞の集団に存在するＫｖ１．３カリウムチャンネルに結合した標識ペプチドを検出する工程と
    を含むことを特徴とする方法。
  34. 前記細胞がヒトリンパ球であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
  35. 所定の細胞に発現したＫｖ１.３チャンネルの数を定量化する方法であって、
    ａ）Ｋｖ１．３カリウムチャンネルに結合する高い親和性及び特異性を有する標識ペプチドと前記細胞を接触させる工程であって、前記標識ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の３６の整列位置に対して少なくとも８３％の対配列同一性を有する機能的に同等なその類似体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、都合よく標識化されている工程と、
    ｂ）定量的な検出技術によって、前記標的細胞の集団に存在するＫｖ１．３カリウムチャンネルに結合した標識ペプチドを検出する工程と
    を含むことを特徴とする方法。
  36. 前記細胞がヒトリンパ球であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
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