BRPI0721664A2 - vm23 e vm24, dois peptÍdeos de escorpiço que bloqueiam canais de potÁssio de linfàcitos-t humanos(sub-tipo kv13) com alta seletividade e diminuem as resposta de dthnvivoemratos - Google Patents

Abstract

VM23 E VM24, DOIS PEPTÍDEOS DE ESCORPIçO QUE BLOQUEIAM CANAIS DE POTÁSSIO DE LINFOCITOS-T HUMANOS (SUB-TIPO KV1.3) COM ALTA SELETIVIDADE E DIMINUEM AS RESPOSTA DE DTH N VIVO EM RATOS. Canais de potássio KvI.3 são conhecidos por estarem envolvidos em doenças imu- nológicas e na rejeição de implantes. Se descrevem aqui peptídeos capazes de bloquear com alta afinidade e especificidade canais de potássio Kvl.3, suas composições farmacêuticas e métodos para utilização como bloqueador de canais de potássio Kvl.3, tratamento de várias condições imunológicas e aplicações de diagnóstico. Também são apresentados mé- 10 todos para suas sínteses químicas e correcta formação estrutural. Estes peptídeos (Vm23 e Vm24) correspondem a componentes protéicos isolados do veneno do escorpião Mexicano Vaejovis mexicanus smithi. Vm23 e Vm24 se ligam a canais hKvl.3 de forma quase irrever- sível, possuindo um valor de Kd na ordem de 3 picomolares quando aplicados em linfócitos humanos in vitro. Vm24 foi quimicamente sintetizado e usado em experimentos in vivo com ratos exitosamente sensibilizados (resposta DTH). Nenhuma das formas, nativas e sintéticas de Vm24, é tóxica para camundongos quando injetados com doses relativamente altas (tes- tados até 10,000 microgramas por quilograma de peso corporal de camundongo). Estes peptídeos (Vm24 e Vm23), e seus análogos funcionais equivalentes com pelo menos 83% de identidade sequencial, são moléculas biologicamente ativas e fortes candidatos para o tratamento de várias condições imunolágicas e para aplicações de diagnóstico.

Description

5

DE ΡοΓ^α Γ ' EPT'DE0S °Ε ESC0RPI° °UE BLOQUE'AM CANAIS

DE POTÁSSIO DE LINFOCITOS-T HUMANOS (SUB-TIPO KV1 3) COM ALTA

SELETIVIDADE E DIMINUEM AS RESPOSTA DE DTH Λ, WKO EM RATOS

CAMPO DA INVENÇÃO

Nn. · A Tesente inVenÇâ° eSta relaci0nada de ,0rma 9eral - *« da bioquímica Wo9,a molecular, ImunCogia e ele^sioiogia. Se apresentam aqui dois peptídeos

ζπγ; ΓΤΓ mé,odos para apncaçao—*«

para síntese au " * ^ '^o'6^' ' ~

o Zs C Γο T e Pr0Cedi™n0S Para °b,enÇâ0 da C0TO,a * Pep-

ndeos corre,acionados com os dois componentes protélcos isolados do veneno do escorpião Mex,cano VaeJovls mexlcanus smith„ ^ ^ „ ° ~

em uma nova sub-familia de ligandos especfflcos para canais de po, Jo. capazTd!T quear com a,te afinidade e espeoflcidade suMipos de canais de potessio hKvl 3, In e dos por estarem envolvidos em doenças lmuno,6gicas e na rejeito de enlertos. OsTé I dos e técnicas usados para suas caraças químicas e funcionais são demostrados ass,m como os resultedos dos ensaios In wVo sobre a resposta-DTH em rates sens^dos

,"Γ ES'e PeP,ide° <Vm24)' h°m6,09° ^23 6 - "**» funciona v:

~carPOnTS ,armaC0'09,~ — « P3-a o tratamento de vé-

nas condiçoes imunologrcas e aplicações de diagnóstico.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Considerações Gerais

Diversos aspectos devem ser levados em consideração com relação ao objetivo da

ΓΧΓ" Τ"'' en,re 38 eSB0 im~ - - Cm

d" sobt 3Γ· 'mUn0l09la 6 e'e,r0flS'0l09ia re'ad0nad0S 0

"canais ilicoTT * * bi<"Ó^s

canais ,on,oos , que tem um pape, fundamentei na comunicação ce,ular, nas vlas de trans

de SmalS' "a — tecidos e na função de vários órgãos·

2> diferentes níveis de expressão destes canais em células do sistema imune prin- cipalmente em Iinfacitos T, demonstraram ter um Caro envolvimento em eventos relaciona dos com o inicio de doenças autoimunes;

ra doenc31' ° T" " ^ ^ * ^ consld^ Possíveis tratementos pa- ra doenças, poder,a se realizar através da adição de diferentes grupos químicos, Ilgandos

-.ura,s ou substancias sintéticas, seja reproduzindo o ligando como é encontrado η na,u!

reza ou por preparações de derivados similares (peptideomiméticos)

últimoi Um 9rande nÚmer° ^ άθ P0,áSSi° (K) ,em Sld0 descobe^ · -Podado nos últimos qu,nze anos, os quais foram isolados, expressados individualmente e funciona,men- 30

35

te analizados.

Eles são proteínas multiméricas envolvidos na determinação do potencial de mem- branas celulares, através do controle do tonus de músculo liso, excitabilidad sináptica Iibe- raçao de neurotransmissores e outros processos. Nesta invenção nós queremos enfatizar a importancia de uma espécie de canal de potássio, o sub-tipo Kv1.3 e seu envolvimento na proliferação de linfócitos e no controle de doenças autoimunes através da inibição deste canal. Ele e um canal de retificação retardado predominantemente expresso em linfócitos T [Grissmer e outro, 1990; Lewis e Cahalan, 1995], que são diferentes dos sub-tipos Kv1 1 e

KV1.2 amplamente distribuídos nos tecidos cerebrais e cardíacos, apenas para mencionar uns poucos sub-tipos de canais de potássio.

Os mecanismos pelos quais a modulação da atividade dos canais Kv1 3 afeta a

proliferação de linfócitos estão sendo pesquisados em vários laboratórios e foram objetos de

recentes publicações (revisados em [Beeton and Chandy, 2005; Judge and Bever 2006

Pany, et al, 2006]), incluindo algumas patentes (v. Gr. US 5,397,702 por Cahalan e outro 1995 e US 6,077,680 por Kem e outro 2000).

As doenças autoimunes são conhecidas por sua considerável morbidez a nível mundial. Entre estas doenças estão: diabete melito (insulino-dependente), esclerose múltipla (EM), artrite reumatóide (AR), síndrome de Sjogren, doença de tecido conectivo mixta Iupus entematoso sistêmico (LES)1 mistenia grave, para mencionar apenas algumas delas Um relevante modelo experimental para doenças autoimunes é a encefalomielite autoimune ex- perimental. E geralmente aceitado que estas doenças autoimunes são o resultado da res- posta do sistema imune destruindo tecidos específicos, tanto através de um ataque direto as células ou pela produção de auto-anticcrpos. A super-expressão de canais Kv1 3 é uma característica das células T autorreativas, que proporciona um excelente oportunidade para a modificaçao de sua proliferação por bloqueadores de Kv1.3.

Nestas linhas de pesquisa e experimentação, inúmeras substancias foram descritas e também patentadas. Um destes exemplos é a toxina ShK da anemona marinha Sticho- dactyla helianthus e seus diversos derivados, que tem sido divulgado como um protetor con- tra diferentes doenças autoimunes (v. Gr. US 6,077,680 by Kem e outro 2000).

Entre outros produtos naturais capazes de afetar a função de canais iônicos estão os peptideos isolados de venenos de escorpião. Os peptídeos específicos para canais de potássio isolados destes venenos são peptídeos de cadeia curta contendo entre 22 a 42 am.noac.do8 compactados por três ou quatro pontes de dissulfeto. Eles são bloqueadores de vários sub-tipos de canais, com uma grande variabilidade na seletividade e afinidade (re- visado em [Giangiacomo e outro, 2004; Rodriguez de Ia Vega e Possani, 2004]). Por exem- plo, a caribdotoxina é um potente bloqueadorde Kv1.1„ Kv1.2 e Kv1.3 e Shaker 1 3 que são tpos de canais de retificação retardados, mas também bloqueiam canais maxi-type K (Ca)

20 [Rauer e outro, 2000], Margatoxina1 uma outra toxina de escopião, não possui atividade con- tra canais K(Ca)1 mas mantém uma alta afinidade de bloqueio contra canais Kv1.3 [Gracia- Calvo e outro, 1993]. Agitoxina, noxiustoxina e kaliotoxina são exemplos de toxinas de es- corpião que afetam diferentes tipos de canais de potássio com afinidades e seletividades distintas, mas usualmente modificam mais que um sub-tipo de canal (recentemente revisado por [Panyi e outro, 2006]). Devido a suas estruturas tri-dimensionais relativamente rígidas, firmemente mantidas pelas pontes de dissulfeto, muitos destes peptídeos de escorpião tem sido usados como "compasso de calibre molecular" para medir distâncias entre os resíduos de aminoácidos de canais de potássio especialmente no vestíbulo externo dos canais [Kre- zel e outro, 1995; Garcia e outro, 2000], A estrutura tri-dimensional de muitas toxinas de escorpião, específicas para canais de potássio, foram resolvidas pelos métodos de resso- nância magnética nuclear e/ou por difração de raios X e, em conjunção com conhecidas estruturas de alguns canais de potássio, tem proporcionado o indício para modelar a intera- ção entre o receptor (canal iônico) e o ligando (toxina de escorpião). Mutagênese sítio- dirigida de resíduos de aminoácidos em ambos, canais iônicos e ligandos, tem proporciona- do informação para a identificação da interação putativa de superfície entre este par proteico ligando-receptor [Rodríguez de Ia Vega e outro, 2003], Esta informação é fundamental para o desenho racional de possíveis fármacos com potenciais aplicações farmacológicas. O úni- co problema na utilização destes peptídeos naturais como fármacos potenciais é a falta de especificidade e afinidade. Atualmente existem 20 sub-famílias de toxinas de escorpião que compreendem mais de 125 peptídeos estruturalmente relacionados, classificados por sua similaridade de seqüência e possíveis funções [Tytgat e outro, 1999; Rodríguez de Ia Vega and Possani, 2004].

Base molecular para a terapia de doençaas autoimunes baseado na inibição de

Kv1.3

Nesta sessão os inventores apresentam o conhecimento de último nível sobre o controle de doenças imunológicas através da aplicação de ligandos (peptídeos e compostos orgânicos) capazes de bloquear com alta afinidade e especificidade os canais iônicos Kv1.3

de linfócitos T efetores de memória das células. Ha sido reportado anteriormente que o mecanismo pelos quais os inibidores de

Kv1.3 interferem no processo de ativação de linfócitos provocados por estimulação de antí- genos fisiológicos ou mitógenos, é através da despolarização da membrana e a conseqüen- te inibição do sinal de cálcio requerido para a progressão normal do ciclo celular para a pro- liferação e a produção de clones de células T específicos para antígenos competidores (re- visado em [Cahalan e outro, 2001; Panyi e outro, 2004; Panyi e outro, 2006]). Existem dois tipos de canais de potássio que são responsáveis pelo manutenção de um suficiente poten- cial de membrana hiperpolarizado (-50, -60 mV) [Verheugen e outro, 1995] das células T, a 10

15

35

dependência de voltagem e a despolarização de canais ativados denotado como Kv1.3 [De- coursey e outro, 1984; Matteson and Deutsh1 1984]; e canais de potássio ativados por cálcio de condutância intermediária denotado como IKCaI (ou KCa3.1 de acordo com recente no- menclatura) [Grissmer e outro, 1993]. A atividade destes canais propicia um contrabalanço de efluxo de carga positiva requerido para a manutenção do potencial de membrana negati- vo durante o influxo de cálcio para o interior das células T através da liberação de Ca2+ pe- los canais de cálcio ativados [Feske e outro 2006; Yeromin e outro, 2006]. A contribuição destes dois tipos de canais de potássio para o potencial de membrana das células T depen- de do estado de ativação das células (repouso χ ativado) e seus envolvimentos funcionais no sistema imune determinado pelo grau de diferenciação terminal das células T, como é discutido abaixo [Wulff e outro, 2003],

Os dois tipos de células T, células T de memória central (Tcm) e naive, requerem forte estimulação antigênica e uma co-estimulação em órgãos linfóides periféricos para se- rem ativados. As células T naive que não encontraram previamente uma expressão de mar- cador funcional CCR7+CD45RA+ que transporta antígeno. As células T de memória central (Tcm, CCR7+CD45RA"), cujas células mediam a memória reativa, são provavelmente detidas nos estágios intermediários da diferenciação terminal para tornarem-se células efetoras de memória (Tem) [Sallusto e outro, 2004], Estas células tem pouco ou nenhuma função efetora, mas rapidamente se proliferam e diferenciam para células efetoras em resposta de uma es- timulação antigênica. A memória protetora é dirigida por células Tem efetoras de memória (CCR7"CD45RA+/ ). Células Tem exibem conjuntos característicos de receptores de quimo- quinas e moléculas de adesão que são requeridas para localizar tecidos inflamados onde eles exercem imediata função efetora. Em várias doenças autoimunes, incluindo esclerose múltipla (EM) [Wulff e outro, 2003], artrite reumatóide e diabete melito do tipo I [Beeton e outro, 2006], psoríase autoimune, Iupus eritematoso, colite ulcerativa, oftalmia simpatética e doença periodontal de reabsorção óssea, as células Tem ativadas cronicamente são respon- sáveis pelo dano tecidual, então a inibição seletiva da proliferação e da atividade funcional destas células são de extrema importância no contrle destas doenças (revisado em [Chandy e outro, 2004; Beeton e Chandy, 2005; Panyi e outro, 2006],

Células naive humanas, Tcm e Tem de ambos fenotipos CD4+ (ajudante) ou CD8+ (Citotóxica) expressam um número similar (200-300) de canais Kv1.3 e menos de 30 canais IKCal por célula [Wulff e outro, 2003], A transformação de células naive e Tcm a células pro- Iiferativas blastocísticas através da estimulação antigênica específica é acompanhada por um modesto aumento (~1.5 vezes) do número de canais Kv1.3 por célula, onde o número de canais IKCaI aumenta dramaticamente (500 canais/célula) e então adquirem um fenotipo de IKCaIalto e Kv1. Ibaixo Em contraste, a ativação de Tem de ambos CD4+ ou CD8+ nos tecidos periféricos é acompanhada por um dramático aumento no número de canais Kv1.3 de

25

30 -1500/célula sem nenhuma mudança nos níveis de IKCaI1 dessa forma o fenotipo dos ca- nais TEM ativados torna-se IKCaIbaixo e Kv1.1alt0.

A conexão casual entre Kv1.3alt0 Tem e as desordens autoimunes é substancializado pelos seguintes dados obtidos de doenças humanas:

1. Células T reativas à mielina de sangue periférico de pacientes com EM são Kv1.3alt0 [Wulff e outro, 2003];

2. Células T reativas à mielina de sangue periférico de controles saudáveis são Kv1.3baixo, consistente com um fenotipo naiveílcu,

3. Estimulação de células T de pacientes com EM com antígenos irrelevantes tal como insulina ou com mitógenos convencionais não induzem a geração de Tem com fenoti- pos de canal Kv1.3alt0IKCalbaiX0.

4. Células Kv1.3alt0 foram encontradas postmortem em infiltrados inflamatórios de cérebro e no parênquima de lesões EM desmielinizadas [Rus e outro, 2005];

5. Células T isoladas de fluído sinovial de pacientes humanos com artrite reumatói- de expressam grandes quantidades de Kv1.3 quando comparada com células T do mesmo doador, mas isoladas de sangue periférico. Estas células T Kv1.3alt0 foram CCR7", indicando que estas são células Tem [Beeton e outro, 2006],

6. Linhas celulares CD4+ antígeno específicas de curta duração (TCLs) geradas por linfócitos de sangue periférico de pacientes humanos com diabete mélitus do tipo 1 e espe- cíficos para autoantígenos de insulina associados a T1DM e GAD65 mostram características de células Tem incluindo a falta de antígeno CCR7 (CCR7 ) e fenotipo de canal Kv1.3alt0 [ Beeton e outro, 2006].

Como o controle do potencial de membrana das células Tem é exclusivamente go- vernado pela atividade dos canais Kv1.3, a proliferação destas células, sua atividade funcio- nal e portanto os sintomas de doenças autoimunes, deveriam ser melhoradas pelo uso de inibidores de Kv1.3. Os seguintes dados disponíveis na literatura, de experimentos in vivo e in vitro, suportam este cenário:

1 .A proliferação in vitro de linhas celulares humanas T ativados de forma crônica correlacionado as características de Tem (CCR7", Kv1.3alt0) e específico para antígeno de mielina [Wulff e outro, 2003] ou células Tem isoladas de líquido sinovial de pacientes AR é completa e permanentemente suprimido por peptídeos bloqueadores específicos de Kv1.3 como ShK [Wulff e outro, 2003], Shk(L5) ou por pequenas moléculas bloqueadoras como PAP-1 [Beeton e outro, 2006];

2.Ensaios in vivo com Margatoxina, outro peptídeo bloqueador de canais Kv1.3 de alta afinidade mostrou que o bloqueio de Kv1.3 resulta na inibição de reações de hipersen- sibilidade tipo-retardada en minisuinos; esta reação é uma boa medida da atividade das cé- lulas T efetoras de memória [Koo e outro, 1997], 3.Tratamento de células T MBP-específicas de rato com ShK ou ShK-Dap durante sua estimulação in vitro com MBP (fase de sensibilização) ao longo de repetidas aplicações dos peptídeos aos animais (durante a fase efetora) previniu a transferência adotiva da Encé- falo-mielite Autoimune Experimental (TA-EAE) em ratos Lewis [Beeton e outro, 2001]. EAE em ratos [Ben Dun and Cohen1 1982], é o melhor modelo caracterizado para a doença EM em humanos caracterizada por patogênese similar e anormalidades neurológicas, tendo como causa da doença na população de células T a Tem mielino-específica com um fenotipo de canais Kv1.3alt0. A aplicação combinada de bloqueadores de canais Kv1.3 e IKCaI tam- bém melhorou os sintomas de EAE quando administrada seguindo este princípio [Beeton e outro, 2001],

4.0 modelo de artrite crônica MHC de classe Il restringida e induzida por Pristane em ratos Dark Agouti é um modelo murino para a artrite reumatóide humana. Aplicações injetáveis diárias de ShK (L5) reduziram significativamente juntas afetadas pela doença du- rante o período de triagem (até 34 dias) [Beeton e outro, 2006].

5.A eficiência de um inibidor de Kv1.3 para prevenir diabete autoimune experimen- tal (DAE, um modelo murino para T1DM de humanos) foi estudado em MHC de classe Il- restringido de ratos DP-BB/W [Beeton e outro, 2006]. Foi demonstrado que administrações diárias repetidas de PAP-1, um bloqueador de Kv1.3 de baixo peso molecular com grande afinidade e seletividade, reduziu aproximadamente 50% dos sintomas de DAE em ratos com esta sintomatologia (testados aos 110 dias de idade) quando comparado com os controles animais tratados apenas com o veículo. Esta redução foi acompanhada por um decréscimo nas intra-ilhotas de células T e infiltração de macrófagos e redução na destruição de células beta no grupo tratado com PAP-1 em comparação com o grupo controle que recebeu ape- nas o veículo, (testado entre 35-70 dias de idade) [Beeton e outro, 2006].

A inibição da proliferação de células T por inibidores específicos de Kv1.3 é especí- fico para células TEM, o que torna estas moléculas ferramentas ideais para o trtamento e prevenção de doenças autoimunes. Embora, a proliferação induzida por antígeno de células naíve e Tcm seja parcialmente sensível a inibição mediada por Kv1.3, a sobre-regulação transcricional de canais IKCaI transforma esta em células T pré-ativadas e permite a prolife- ração destas células ser sensível a inibidores IKCaI mas não a inibidores Kv1.3 [Ghanshani e outro, 2000], Esta ação restringida de inibidores Kv1.3 e IKCaI sobre diferentes sub-séries de células T demonstra a importância da selitividade de uma dada molécula para Kv1.3 so- bre IKCal. Também foi demonstrado recentemente que os inibidores da proliferação Tem por inibidores de Kv1.3 pode ser superada por uma excessiva estimulação antigênica mimeti- zando a ativação das células Tem por patógenos e antígenos de patógenos durante as rea- ções normais de memória imune protetora [Beeton e outro, 2006], Então, a aplicação de inibidores Kv1.3 de alta afinidade e seletividade, idealmente tem como alvo células TEM 10

repetidamente ativadas por reações autoimunes, enquanto deixam outras funções proteto- ras do sistema imune inalteradas.

Adicionalmente, canais Kv1.3 de linfócitos TeB humanos são também expressa- dos em diversos órgãos e tecidos (incluindo o sistema nervoso central, rins, fígado e múscu- lo esquelético), e o bloqueio de canais Kv1.3 celulares pode aumentar consideravelmente os efeitos colaterais. Extensivos testes toxicológicos agudos in vitro e crônicos in vivo foram realizados previamente com ShK(L5) [Beeton e outro, 2005; Beeton e outro, 2006] do gru- po de bloqueadores peptídicos e para PAP-1[Shmitz e outro, 2005; Beeton e outro, 2006] do grupo de bloqueadores de pequenas moléculas. Estes estudos demonstraram um desa- parecimento dos efeitos colaterais neurológicos e cardíacos e mudanças histopatológicas em tecidos onde Kv1.3 é expressado. Então, os efeitos beneficiosos do tratamento com blo- queadores Kv1.3 listados previamente, combinados com um mínimo ou completa ausência de efeitos colaterais indicam uma potencial aplicação de bloqueadores seletivos de Kv1.3 no controle das doenças autoimunes.

Em resumO, os dados descritos sugerem um envolvimento crítico de canais Kv1.3

na execução da resposta imune fisiológica e revela um forte potencial de aplicação na inter- venção terapêutica de doenças autoimunes pela inibição de canais Kv1.3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a identificação e uso de novos peptídeos isolados do veneno do escorpião Mexicano \/. Mexicanus: Vm23, Vm24 e seus análogos funcionais e- quivalentes, os quais são capazes de inibir a função de canais hKv1.3 de linfócitos humanos com alta afinidade e especificidade, pelo bloqueio da condutância iônica específica. Em ou- tras secções desta invenção, os autores apresentam as composições farmacêuticas incluin- do Vm23, Vm24 e seus análogos funcionais equivalentes, métodos para bloquear canais de potásio Kv1.3, tratamento de várias condições imunológicas, aplicações de diagnóstico e métodos para suas síntese química e correta estruturação. Estes peptídeos foram isolados através de cromatografía líquida de alta eficiencia convencional e a secuenciação de seus aminoácidos realizado por degradação de Edman e espectrometria de massas, demons- trando estruturas primárias mostradas em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2. Vm24 contém 36 aminoácidos com um peso molecular de 3863.5 Daltons. É uma molécula compacta mantida por quatro pontes de dissulfeto, as quais foram estabelecidas por espectrometria de massas como sendo pares de cisteínas nas posicoes C6 e C26, C12 e C31, C16 e C33 e C21 e C36, onde a letra C significa a abreviação dos resíduos de cisteína e os números corres- pondem a suas posições relativas na seqüência de aminoácidos. O aminoácido do terminal carboxílico do peptídeo está amidado. O peptídeo completo foi sintetizado usando o método de fase sólida de Merrifield e a correta estruturação do peptídeo sintético foi obtida e confir- mada por análisis química e funcional. Vm24 não é tóxica para camundongos quando inje-

20

25

35 tada a concentrações relativamente altas (testada até 200 microgramas em camundongos de 20 gramas de peso corporal, que é: 10,000 microgramas/quilograma de peso de camun- dongo). Quando aplicado em linfócitos humanos in vitro, demostrou alta afinidade pelos ca- nais hKv1.3 testados pela técnica de patch-clamp. Ele se liga a estes canais de uma forma quase irreversível, mostrando um valor de Kd a nível de baixo picomolar (menos de 3 pimo- Iar- 3 pM). Ele não modifica as correntes de potássio dos seguintes canais iônicos: hKv1.4, hKv1.5, rKv2.1, hBK e hErg e também as correntes de canais de sódio cardíacos dependen- tes de voltagem (hNav1.5) quando testados a uma concentração de 10 nanomolar (10 nM). A inibição de corrente a concentração de 10nM para canais hlKCal, mKv1.1 e , hKv1.5, hKv1.2, é de aproximadamente 20 a 50%, em contraste com os 100% de bloqueio para os canais hK1.3. A toxina bloqueia mais de 50% da corrente dos hKv1.3 a uma concentração tão baixa como 3 pM, sendo então aproximadamente 1500 vezes mais efetivo sobre este canal do que qualquer dos outros canais testados.

Os testes de Ietalidade realizados com Vm24 não causou sintomas de intoxicação observáveis quando se usou concentrações até 200 microgramas/20gramas de peso de camundongo. Vm24 aplicado a modelos murinos para hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) protegeu os animais. A sensibilização de pele de ratos experimentais com dinitrofluo- robenzeno (DNFB) causou uma resposta imunológica considerável (vermelhidão e extensa inflamação das orelhas). Grupos de ratos sujeitos a apenas uma injeção de 10 microgramas deVm24, no sexto dia após o início do tratamento, mostraram uma considerável atenuação da resposta imune; a inflamação das orelhas nos animais tratados diminuiu significativamen- te (60% menos inflamadas) quando comparadas aos ratos controle que receberam somente o solvente.

O peptídeo relacionado Vm23 foi também isolado do mesmo veneno e completa- ) mente sequênciado, como mostrado em SEQ ID NO:2. Este epeptídeo é 83% idêntico a Vm24 , tem 35 resíduos de aminoácidos, estruturado por quatro pontes de disulfeto e possui uma massa molecular de 3565 Daltons. Vm23 mostra uma função equivalente a Vm24: alta afinidade e especificidade pelos canais hKv1.3. O bloqueio de corrente para os canais hKv1.3, hlKCal, mKv1.1 e hKv1.2 a concentração de 10mM de Vm23 foram aproximada- mente 95%, 1%, 3% e 9% respectivamente.

Análise filogênica realizada com os dois peptídeos, usando mais de 125 outros co- nhecidos peptídeos de escorpião [Bagdany e outro, 2005], específicos para canais de po- tássio, demostrou que Vm23 e Vm24 não pertencem a qualquer das 20 sub-famílias de es- truturas de toxinas de escorpião já descritas. Eles são os primeiros dois exemplos de uma nova sub-família estrututral, que aqui se propõe nomear: a-KTx 21. Vm24 e Vm23 deverão ser então chamadas de a-KTx 21.1 e cc-KTx 21.2, respectivamente. Entre os critérios usados para definir novas sub-famílias de toxinas de escorpião específicas para canais de potássio, 10

15

de acordo com um comjunto de cientistas internacionais que assim definiram a nomenclatu- ra sistemática atualmente em uso (ver [Tytgat e outro, 1999], é a necessidade de que a es- trutura primária deja diferente pelo menos em 50% das outras. Na verdade ambas, Vm23 e

Vm24, mostram menos de 50% de similaridade de seqüência com as outras toxinas conhe- cidas.

Baseado no mais alto conhecimento na área, estas propriedades fazem Vm23, Vm24 e seus análogos funcionais equivalentes, excelentes candidatos para a supressão imune, diagnóstico e tratamento de doenças imunológicas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos incluídos nesta exposição formam parte da presente especificação e são incluídos aqui para demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção como um todo pode ser melhor ententida pela complementação de um ou mais destes experimen- tos com a detalhada descrição das secções apresentadas aqui, especialmente na secção dos exemplos abaixo.

Fig. 1: Separação por HPLC de 1 mg de veneno solúvel do escorpião V. Mexicanus Mais de 80 diferentes componentes foram separadamente obtidos pela aplicação de veneno solúvel em uma coluna de fase reversa C18 (número do catálogo 218TP54 Vy- dac, Hisperia, CA) equilibrada com solução A (água com 0,10% de TFA), usando um gradi- ente de 0% a 60% de solução B (acetonitrila em 0,12% de TFA) por 60 min. Os números 1 e 2 com tempos de retenção de 23 e 24 min indicam a posição de eluição de Vm23 e Vm24, respectivamente. Uma separação adicional de cada uma destas frações cromatográficas foi realizada no mesmo sistema, mas usando um gradiente linear de solução A até 40% de so- lução B, durante 60 min para ambos peptídeos. Os resultados são mostrados no inserto da

figura. Os asteríscos no inserto indicam as posições de eluição dos peptídeos altamente purificados.

Fig. 2: Seqüência de aminoácidos de Vm23, Vm24 e consenso. As seqüências de Vm23 e Vm24 foram obtidas por degradação de Edman direta dos petídeos nativos e amos- tras reduzidas e alquiladas em combinação com análise por espectrometria de massas dos peptídeos obtidos por clivagem enzimática de amostras puras com enzimas específicas (endoprotease Arg-C e Lis-C) como está indicado abaixo das seqüências correspondentes. A seqüência de aminoácidos dos peptídeos purificados após a hidrólise enzimática e sepa- ração por HLPC foram identificados através da análise espectrométrica (MS/MS, que signifi- ca fragmentação espectrométrica por ionização com Electro-Spray). Abaixo de cada se- qüência estão as indicações dos segmentos identificados pelos vários métodos utilizados. Direto significa degradação de Edman, Arg-C e Lis-C são os fragmentos purificados após a digestão enzimática. MS sozinho significa identificação baseada na massa molecular do aminoácido não sequênciado. A seqüência consenso tem 30 resíduos de aminoácidos que

20

30

35 15

20

5

)

são idênticos as seqüências de Vm23 e Vm24. As posições marcadas com "x" podem ser: χ1, qualquer aminoácido que não desfaça a estrutura tri-dimensional da proteína ou ainda melhor que as substituições de K ou P; x2, qualquer aminoácido que não desfaça a estrutu- ra tri-dimensional da proteína ou ainda melhor que as substituições L ou P; x3, qualquer aminoácido que não desfaça a estrutura tri-dimensional da proteína ou ainda melhor que as substituições K ou R; x4, qualquer aminoácido que não desfaça a estrutura tri-dimensional da proteína ou ainda melhor que as substituições S ou N; x5, qualquer aminoácido que não desfaça a estrutura tri-dimensional da proteína ou ainda melhor que as substituições K ou R; X61 qualquer aminoácido que não desfaça a estrutura tri-dimensional da proteína ou ainda melhor que as substituições Y ou absolutamente nenhum.

Fig. 3: Vm24 possui C-terminal amidado. Dissociação Induzida por Colisão (CID) do

íon de com m/z 909.4 u.m.a. [M+H]+ (massa molecular monoisotópica) mostrou 1.0 u.m.a.

menos que o valor teórico esperado de [M+H]+ 910.5 u.m.a. Os íons da série y (itálico) que

correspondem a seqüência de um C-terminal amidado é mostrado no inserto marcado 1).

Valores teóricos de íons da série y para o peptídeo com C-terminal livre e carboxilado (TV-

COOH), valores teóricos de íons da série y para o peptídeo com C-terminal amidado (TV-

NH2) e valores de íons da série y experimentais (EXP.) são comparados na tabela insertada (inserto 2).

Fig.4: Heterodímeros de Vm24 para a determinação de dissulfetos. Os números 1 e 2 mostram pesos moleculares e estruturas esquemáticas dos heterodímeros produzidos pela clivagem proteolítica simultânea de Vm24 usando tripsina e quimotripsina a pH 6.5 O íon de m/z [M+H]+ de 788.0 u.m.a. corresponde a massa molecular do heterodímero que contém o par de cisteínas C4-C8 (número 1) e o íon de m/z [M+H]+ de 560.4 u.m.a. corres- ponde ao par de cisteínas C3-C7 (número 2).

Fig. 5: Pares de cisteínas de Vm24. A) Espectro de massas correspondente a estru- tura do núcleo complexo contendo ambos pares de cisteínas, C1-C4 e C2-C6 do íon de m/z [M+H]2+ 1099.7 u.m.a. Este sinal de m/z foi fragmentado e produziu o espectro de MS/MS mostrado na figura 4B. Os valores dos íons da série b de 1137 a 1507 u.m.a. representam de forma inequívoca a etiqueta estrutural GSPE confirmando a determinação dos últimos dois pares de cisteínas. B) Mostra o arranjo completo das pontes de dissulfeto de Vm24, como determinado através da análise espectrométrica descrita na parte A desta figura.

Fig. 6: Purificação de Vm24 sintético por HPLC. Vm24 preparado sinteticamente (50 miligramas de proteína) foi separado em uma coluna de fase reversa C18. Número 1 indica a posição de eluição de Vm24 sintético e correctamente estruturado, enquanto 2 e 3 indicam formas incorretamente estruturadas e seqüências truncadas. Uma separação adicional des- ta fração cromatográfica foi realizada no mesmo sistema, mas usando uma coluna analítica com um gradiente linear de solução A para 40% de solução B, durante 60 min. Os resulta- 10

15

20

dos são mostrados no inserto da figura.

Fig. 7: Comparação dos peptídeos Vm24 sintético e natural por HPLC. A) A aplica- ção de 10 microgramas de Vm24 nativo em uma coluna C18 (número do catálogo: 218TP54 Vydac1 Hisperia, CA) no sistema HPLC descrito na figura 1, mostra que o peptídeo em forma homogênea elui a 32.67 min quando analizado com um gradiente linear de solução A até 40% de solução B1 durante 60 min. B) Cromatograma de 15 microgramas do peptídeo Vm24 sinteticamente preparado e estruturado no mesmo sistema e nas mesmas condições. C) Co- aplicação de uma mixtura 1:1 dos peptídeos sintético e natural (total de 8 microgramas) mostrando que estes co-eluem no mesmo tempo de retenção. É importante mencionar que o eixo X do gráfico está movido para a direita pelas letras B e C1 para que os três gráficos possam ser comparados, mas separadamente, de outra forma os tempos de eluição das três corridas independentes de HPLC cairiam no mesmo pico e se tornariam indistinguíveis.

Fig. 8: Análise seqüencial e filogenética de Vm23 e Vm 24. A) Alinhamento múltiplo de seqüências de Vm24 e Vm23 com seus mais correlacionados peptídeos da família «- KTxs. O alinhamento foi realizado com o programa CLUSTAL_X [Thompson et al, 1997] e a identidade de seqüência com Vm24 (%l, última coluna) calculado com o BioRdit. B) Árvore filogenética simplificada calculada com MrBayes 3.0Ò4 [Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Huelsenbeck and Ronquist, 2003], Vm23 e Vm24 estão juntas e diferem substancialmente dos outros membros da sub-família a-KTx 6.

Fig. 9: Bloqueio seletivo de canais iônicos de linfócitos por Vm24. A) As correntes de potássio da célula total através dos canais hKv1.3 foram evocadas de uma célula T hu- mana em resposta a pulsos de despolarização de +50mV de um potencial de repouso de - 120mV cada 15s. As correntes na ausência de Vm24 (controle, indicado por flecha) são quase completamente bloqueados quando 1 nM de Vm24 é administrado a célula via perfu- são do meio extracelular. As flechas indicam o 1o pulso em Vm24. B) As correntes de pico normalizadas em função do tempo são mostradas seguindo a aplicação de 1nM (círculos cheios) ou 0,3 nM (círculos vazios) de Vm24. As flechas indicam o princípio da aplicação da toxina. C) As correntes de pico normalizadas de um linfócito em função do tempo são mos- tradas quando 3pM de Vm24 é aplicado a célula e então removidos (lavagem) do meio ex- tracelular. A perfusão com um meio sem toxina resultou em uma recuperação parcial lenta do bloqueio com uma constante de aproximadamente 3800 s. Os pulsos foram aplicados cada 30 s. D) A relação dose-resposta para Vm24 foi obtida pela representação gráfica da fração de corrente remanescente (RCF=IZIo) como função da concentração da toxina, res- pectivamente, e ajustando os dados com a função: RCF=Kd"/(Kd" + [Tx]n), onde [Tx] indica a concentração da toxina e Kd é a constante de dissociação. As barras de erros indicam SEM (n= 3-6). A função de dose resposta construída desta forma produziu uma Kd= 2.9 pM e um coeficiente de Hill n~1. E) Canais de potássio ativados por Ca2+ de linfócitos (hlKCal) foram 15

25

30

35

expressados em células Cos-7 e as correntes elicitadas por rampas de voltagem de -120 a +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 10s. São mostrados os traços de corrente obtidos antes da aplicacao da toxina (controle), seguindo o equilíbrio do bloco na presença de 10nM de Vm24 por 4.5. min e seguindo a lavagem da toxina por 2.5 min F) A fraçao restante de corrente de hlKCal na presença de 1nM de Vm24 foi calculado usando s/so onde s e so são os declives da relação I-V evocadas por rampas de voltagem na pre- sença e ausência de Vm24, respectivamente. Barras de erro indicam SEM (n=3).

Fig. 10: Vm24 é seletivo para hKv1.3 entre a família de canais Shaker (Kv1 x) São mostrados os traços de corrente registrados antes da aplicação da toxina (controle) seguin- do do equilíbrio do bloco por 10mM de Vm24 e lavagem da toxina. A) Canais mKvl 1 foram expressados em células L929 e as correntes foram evocadas por passos de voltagem a +50mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 30 s. Equilíbrio do bloco desenvolvido em 6 min., a duração do período de lavagem foi de 5 min. B) Canais hKv1.2 foram expres- sados por células Cos-7 e as voltagens foram evocadas por passos de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 30 s. O equilíbrio do bloco foi realizado em 5.5 min., a duração do período de lavagem foi de 7 min. C) Canais hKv1.3 foram expressa- dos endogicamente por linfócitos sangüíneos periféricos e as correntes evocadas por pas- sos de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 15 s. O equilí- bno do bloco foi desenvolvido em 3.5 min., a duração do período de lavagem foi 4 5 min D) Os canais hKvl (hKv1.4AN) de rápida remoção de inativação foram expressados por células Cos-7 e as correntes evocadas por passos de voltagem até +50mV de um potencial de re- pouso de -120 mV cada 30 s. A duração da aplicação de Vm24 e período de lavagem foram de 5 min. e 4.5 min., respectivamente. E) Canais hKv1.5 foram expressados por células MEL e as correntes foram evocadas por passos de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 5 s. A duração da aplicação de Vm24 e do período de lavagem foram 6 min. e 3.5 min., respectivamente.

Fig. 11: Vm24 não bloqueia ou inibe uma variedade de canais biologicamente im- portantes. Traços de corrente registrados antes da aplicação da toxina (controle), seguido de equilíbrio do bloco por 10 nM de Vm24 e lavagem da toxina são demonstrados. A) Ca- na.s rKv2.1 foram expressados por células Cos-7 e as correntes evocadas por passos de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 30 s. A duração da apli- cação de Vm24 e o período de lavagem foi de 7 e 3 min., respectivamente. B) Canais hERG foram expressados por células HEK e as correntes evocadas por etapas de voltagem de +20mV seguido por um passo até -40mV durante os quais a corrente do pico foi medida O potencial de repouso foi de -80 mV, os pulsos foram aplicados a cada 30 s. A duração da aplicação de Vm24 e o período de lavagem foram de 5 e 2.5 min., respectivamente. C) Ca- na.s hBK (KcaI1I) foram expressados por células tsA-201 e as correntes foram evocadas por

20 15

20

25

30

35

um passo de voltagem de +50 mV precedida por uma hiperpolarização de 10ms até -120 mV de um potencial de repouso de 0 mV. Os pulsos foram aplicados cada 5 s. A duração da aplicação de Vm24 e de lavagem foram de 4 e 1 min., respectivamente. D) Canais Nav1 5 foram expressados por células Cos-7 e as correntes evocadas por passos de voltagem de 0 mV de um potencial de -120 mV cada 15s. A duração da aplicação de Vm24 e do período de lavagem foram de 1 e novamente 1 min., respectivamente.

Fig. 12: Perfil de seletividade de Vm24. As barras indicam as frações de corrente remanescentes no bloco de equilíbrio dos canais indicados pela aplicação de Vm24 em con- centrações de 1 nM (A) ou 10 nM (B). Os dados são apresentados como ±SEM, para n>3 experimentos independentes. Para o sistema de expressão e cálculo de RCF e outras con- dições, ver detalhes nas legendas das figuras 9-11.

Fig. 13: Bloqueio de alta afinidade dos canais hKv1.3 por Vm24 sintético. A) As cor- rentes de potássio da célula total, através dos canais hKv1.3, foram evocadas de célula T humana em resposta aos pulsos de despolarização para +50 mV de um potencial de repou- so de -120 mV a cada 30 s. As correntes regsitradas na ausência do peptídeo ( controle, indicado por flecha) são substancialmente bloqueadas (>90%) quando 100 pM de Vm24 sintético é administrado a célula via perfusão do meio extracelular. Flecha indica o 1° pulso em sVm24. B) São mostradas correntes de pico normalizadas como função do tempo segui- do da aplicação de 100 pM de sVm24. A flecha indica o princío da aplicação da toxina. Não fo. encontrada uma recuperação significativa do bloco quando a célula foi perfusionada com uma solução livre de sVm24 (flecha indica o princípio do período de lavagem). C) As barras indicam as frações de correntes remanescentes no bloco de equilíbrio de hKv1.3 por sVm24 e Vm24 aplicado em uma concentração de 100 PM. Os dados são apresentados como ±SEM, para n>3 experimentos independentes. Para o sistema de expressão, o cálculo de RCF e outras condições, ver detalhes nas legendas das figuras 9-11.

Fig. 14: Vm23 é seletiva para hKv1.3. São demonstrados traços de corrente regis- trados antes da aplicação da toxina (controle), seguido do equilíbrio do bloco por 10 nM de Vm23 e lavagem da toxina. Canais iônicos bloqueados significativamente por Vm24 em concentrações de 10 nM foram selecionados para os testes farmacológicos de Vm23. A) Canais hKv1.3 foram expressados endogicamente em linfócitos de sangue periférico e as correntes foram evocadas por passos de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 15 s. O equilíbrio do bloco foi desenvolvido em 3.5 min. e a duração do período de lavagem foi de 2 min. B) Canais de potássio ativados por Ca2+ de linfócitos T (hlKCal) foram expressados em células Cos-7 e as correntes elicitadas por rampas de volta- gem de -120 até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 5 s. A duração da aplicação de Vm23 e do período de lavagem foram de 3.5 e 2 min, respectivamente. C) Ca- nais mKv1.1 foram expressados por células L929 e as correntes evocadas por passos de 15

voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 15 s. A duração da apli- cação de Vm23 e o período de lavagem foram de 3.5 e 1 min., respectivamente. D) Canais hKvl .2 foram expressados por células Cos-7 e as correntes foram evocadas por passos de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 15 s. O equilíbrio do bloco desenvolvido foi de 3.5 min. e a duração do período de lavagem foi de 2 min.

Fig. 15: Perfil de seletividade de Vm23. As barras indicam as frações de corrente

remanescentes no bloco de equilíbrio dos canais indicados pela aplicação de Vm 23 em

concentrações de 10 nM. Os dados são apresentados como ±SEM, para n>3 experimentos

independentes. Para o sistema de expressão, cálculo de RCF e outras condições, ver deta- lhes nas legendas das figuras 9 e 14.

Fig. 16: Resposta a hipersensibilidade do tipo retardada em ratos. Dois grupos de 3 ratos foram sensibilizados e provocados pela aplicação de DNFB. Um grupo recebeu uma injeção somente de PSB (controle, número 1) e o outro recebeu apenas uma injeção de 10 microgramas de Vm24 (grupo 2). A medida da orelha foi realizada 24 horas depois do trata- mento. O controle de barras mostra a espessura da orelha depois da aplicação de DNFB para os ratos controle, enquanto a barra correspondente ao grupo tratado (grupo 2) mostra a espessura das orelhas dos ratos que foram tratados com Vm24. Aproximadamente 60% de

diminuição da inflamação foi observado nos ratos que receberam Vm24, quando compara- dos com os ratos controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

A menos que definido de outra forma, todas as técnicas e termos científicos usados aqui tem o mesmo significado como entendido normalmente por aqueles com habilidades comuns na área de pertinência desta invenção. Como usado aqui, os seguintes termos pos- suem os significados atribuídos a eles, a menos que definidos de outra forma. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes a aqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou para testes da presente invenção, os métodos e materiais preferi- dos são descritos. Com o propósito da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

Na presente invenção os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usados indistintivamente para referir-se as moléculas peptídicas da presente invenção.

O termo "atividade de bloqueio de canais de potássio Kv1.3" geralmente se refere a estimação atual do grau de inibição do fluxo de íons através de ditos canais, causado pela presença de um inibidor de canais de potássio Kv1.3.

O termo "bloqueador de canais de potássio Kv1.3" geralmente significa a substân- cia que inibe o fluxo de íons potássio através de canais Kv1.3 de membrana celular que con- tém dito canal, pela oclusão direta da via de condução de íons.

5

) 15

O termo "análogo" geralmente significa qualquer polipeptídeo que comparta ao me- nos 83% de indentidade com pares de seqüências sobre 36 posicoes alinhadas de Seq ID No:1, Seq ID No:2 e Seq ID No:3 (30 acertos sobre 36 posições). Isto poderia incluir, mas não de forma restrita, até 6 mudanças de aminoácidos, um ou mais resíduos de aminoáci- dos não naturais, derivação química de um ou mais resíduos e extensões de N-terminal e/ou C-terminal, ambos por outros resíduos de aminoácidos ou outras moléculas orgânicas.

O termo "porcentagem de identidade de seqüências pares" geralmente significa o coeficiente entre as posições dos resíduos de aminoácidos que tem o mesmo resíduo de aminoácido nas duas seqüências alinhadas sobre todas as posições quando duas sequên- cias de proteínas são alinhadas.

O termo "equivalente funcional" geralmente significa qualquer molécula que mostre afinidade ou seletividade aos canais Kv1.3 como determinado para Seq ID No:1 ou Seq ID No:2, propiciando dados que este comparte a mesmas determinantes estruturais de afinida- de e/ou especificidade que confere a alta afinidade e seletividade através dos canais Kv1.3 para estas seqüências. Este poderia ser qualquer análogo ou peptídeomimético.

O termo "determinates estruturais de afinidade e/ou especificidade" geralmente sig- nifica todos os grupos funcionais e suas posições tri-dimensionais na estrutura do polipeptí- deo as quais conferem a SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2 alta afinidade e especificidade sobre os canais hKv1.3. Estas determinantes de afinidade e especificidade podem estar relaciona- dos aos mesmos, parcialmente sobrepostos ou diferentes resíduos de aminoácidos.

O termo "grupo funcional" geralmente significa uma dada molécula química dentro de SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2 ou SEQ ID No:3; qualquer que seja na cadeia polipeptídica principal ou nas cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos, as quais tornam específico e de forte contato com os canais hKv1.3 e que a partir destas características determinam a > afinidade e seletividade de SEQ ID No: 1, SEQ ID No:2 sobre os canais hKvl .3.

O termo "análogo funcional equivalente" geralmente significa qualquer cadeia poli- peptídica que comparta pelo menos 86% de identidade de seqüência sobre as 36 posições de SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 e SEQ ID No:3 (30 coincidências iguais sobre as 36 posi- ções). Este pode incluir, mas não restringidamente, a um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais, derivação química de um ou mais aminoácidos e extensões do N-terminal e/ou C-terminal, seja por outro resíduo de aminoácido ou moléculas orgânicas, as quais permitam

afinidade e seletividade similar sobre hKv1.3 como determinado em SEQ ID No:1 ou SEQ ID No:2.

O termo "peptideomimético" geralmente significa qualquer componente químico que demonstre os mesmos grupos funcionais nas posições tri-dimensionais similares a aquelas de SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 ou SEQ ID No:3, portanto mimetizando contatos específicos de SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2 com os canais hKv1.3. 15

20

25

30

35

O termo "peptídeos da presente invenção" geralmente significa peptídeos que pos- suam uma seqüência SEQ ID No:3, com uma estrutura mantida por quatro pontes de dissul- feto estabelecidas entre pares de cisteína nas posições C6 e C26, C12 e C31, C16 e C33 e C21 e C36, onde as letras C representam a abreviação dos resíduos de cisteína e os núme- ros correspondem a suas posições relativas na seqüência de aminoácidos alinhada. Os pep- tídeos preferidos para exemplificar são aqueles que possuam uma seqüência SEQ ID No:1 (Vm23) e SEQ ID No:2 (Vm24). Ditos peptídeos são capazes de bloquear com alta afinida- de e especificidade os canais de potássio Kv1.3. Estão incluídos análogos funcionais equi- valentes de SEQ ID Νο.Ί, SEQ .D No:2 ou SEQ ID No:3, isto é, que compartam pelo menos 83% de identidade de seqüência por pares sobre as 36 posições de SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 e SEQ ID No:3 (30 coincidências sobre as 36 posições), eles compartem a estrutura terciária mantida por quatro pontes de dissulfeto e apresentam afinidade e seletividade simi- lar sobre hKv1.3 como determinado em SEQ ID No:1 ou SEQ ID No:2.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer das formas farma- cêuticas estandares, tampões e excipientes, incluindo solução salina tamponada com fosfa- to, água, emulsões (tais como emulsões óleo/água ou água/óleo) e vários tipos de agentes umectantes e/ou adjuvantes. Formas farmacêuticas adequadas e suas formulações são descritas em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., Eas- ton, 19th ed. 1995). As formas farmacêuticas de eleição são dependentes do modo que se

pretende administrar o agente ativo. As formas mais típicas de administração são descritas abaixo.

O termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a adição de sais ácidos não- tóxicos, incluindo sais formados por ácidos inorgânicos, tais como ácido hidroclorídrico, áci- do hidrobromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico e sais formados com ácidos orgânicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido malêico, ácido málico, ácido tar- tárico, ácido cítrico, ácido succínico e ácido malônico. Outros sais farmaceuticamente acei- táveis incluem nitrato inorgânico, sulfato, acetato, malato, formato, lactato, tartarato, succina- to, citrato, p-toluenosulfato e correlacionados, incluindo, mas não limitados a estes, cátions baseados em metais alcalinos e metais alcalino terrosos, como sódio, lítio, potássio, cálcio e magnésio e correlacionados, incluindo também amônia, amônio quaternário e aminas cató- nicas, incluindo, mas não limitado a amônia, tertra-metilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trietilamina, etilamina e correlacionados.

O termo "composição farmacêutica" significa uma composição adequada para uso farmacêutico em um sujeito, incluindo mamíferos ou humanos. Uma composição farmacêu- tica geralmente compreende de uma quantidade suficiente de um agente ativo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

O termo "quantidade efetiva" significa a dose de um agente ativo em particular, nes- 10

15

te caso um peptídeo que possua atividade de bloqueio a canais de potássio Kv1.3, que seja suficiente para produzir o resultado desejado, por exemplo, suprimir a resposta imune em mamíferos, tratar uma doença autoimune em um sujeito que a necessite, suprimir o proces- so de ativação das células T no sistema imune de mamífero e atenuar as vias de sinalização de cálcio em linfócitos Τ. O resultado desejado pode abranger uma melhora subjetiva ou objetiva no sujeito (incluindo células) as quais receberam a dose.

O termo "sujeito" significa um animal mamífero, incluindo o homem. Mamíferos não humanos como sujeitos de tratamento incluem, por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cava- los, cachorros e gatos.

O termo "doença autoimune" geralmente significa uma condição patológica dirigida por células de um organismo que afete a homeostasia do mesmo .

O termo "doença autoimune associada a linfócitos TEM" significa qualquer doença autoimune onde as células que atacam o organismo é uma célula linfocítica linfócito TEM. Entre estas doenças estão incluídas, mas não restringidas a estas: esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete tipo I, psoríase autoimune, Iupus eritematoso, colite ulcerativa, oftalmia simpatética e doença periodontal de reabsorção óssea.

Um "tratamento profilático" é o tratamento administrado a um sujeito que não exibe sinais da doença ou mostra apenas os primeiros sintomas da doença, em que o tratamento é administrado com o propósito de diminuir o risco de desenvolvimento de um quadro pato- lógico, particularmente uma doença autoimune, mais especificamente, uma doença autoi- mune associada a linfócitos TEM.

Um "tratamento terapêutico" é o tratamento administrado a um sujeito que mostra sinais patológicos, em que o tratamento é administrado com o propósito de diminuir ou eli- minar os sinais patológicos, particularmente uma doença autoimune e, mais especificamen- te, uma doença autoimune associada a linfócitos TEM.

O termo "órgão" significa sistemas corporais como coração, fígado, pulmão, rin, cé- rebro, sistema adrenal, sistema endotelial vascular, sistema imune e correlacionados.

O termo "sonda molecular" geralmente significa qualquer substância química ou biológica que pode ser usada especificamente para a identificação de alvos celulares, estru- turas celulares ou qualquer molécula a qual a sonda pode ligar-se com alta afinidade e es- pecificidade.

O termo "aminoácido não essencial" geralmente significa qualquer aminoácido den- tro de SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 ou SEQ ID No:3 que podem ser mudados por qualquer

aminoácido sem que a mudança afete substancialmente a afinidade ou especificidade do análogo resultante sobre canais Kv1.3.

Principais descobrimentos

O tema principal desta invenção se refere a dois novos peptídeos (Vm23 e Vm24),

20

30 suas seqüências de aminoácidos (SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2), bem como possíveis aná- logos funcionais equivalentes e seus usos potenciais como agentes imunossupressores. Vm23 e Vm24 são bloqueadores altamente seletivos de canais de potássio do sub-tipo Kv1.3, particularmente de linfócitos humanos (hKvl .3) e demonstaram in vivo diminuir a res- posta inflamatória de reações de hipersensibilidade do tipo retardada em ratos, desta forma, estes dois peptídeos e seus análogos funcionais equivalentes são componentes potenciais para serem usados no tratamento de algumas doenças imunológicas relacionadas a respos- ta anormal de células T. Antes de entrar em detalhes sobre estes agentes imunossupresso- res e seus efeitos sobre canais hKv1.3 é importante revisar alguns conhecimentos básicos nesta área.

A regulação do potencial de membrana de todas as células é mantido principalmen- te pela presença de canais iônicos permeáveis a íons de potássio, chamados simplesmente de canais de potássio. De forma individual as células podem expressar diversos tipos de canais de potássio, os quais podem abrir e fechar em resposta a mudanças de voltagem níveis de cálcio intracelular e Iigandos específicos, embora os canais dependentes de volta- gem sejam os mais comuns [Gutman e outro, 2005], Entre os Iigandos naturais que podem modular a função dos canais de potássio estão as toxinas de venenos de abelhas, escorpi- ões, serpentes e anêmonas [Castle e outro, 1989; Jouirou e outro, 2004; Rodriguez de Ia Vega e Possani, 2004], Exemplos destas toxinas são a noxiustoxina do escorpião Centruroi- des noxius [Carbone e outro, 1982], caribdotoxina do escorpião Leiurus quinquestriatus [Mil- Ier e outro, 1985], anuroctoxina do escorpião Anuroctonus phayodactilus [Bagdány e outro, 1985], BgK da anêmona Bundosoma granulifera [Aneiros e outro, 1993] e ShK de Sticho- daetyla helianthus [Castaneda e outro, 1995], Foi demonstrado que estas toxinas bloqueiam diferentes tipos e subtipos de canais de potássio, incluindo Kv1.3 com diferentes afinidades e especificidades [revisado por Panyi e outro, 2006]. Canais Kv1.3 estão envolvidos na proli- feração dos linfócitos T, na produção de Iinfocinas e, os bloqueadores de Kv1.3 são de inte- resse como potenciais imunossupressores [Panyi et., 2006],

Várias destas toxinas específicas para canais de potássio têm tido suas estruturas tri-dimensionais determinadas (revisado por [Mouhat e outro, 2004], Se agradece pela reso- lução da estrutura tri-dimensional de um par de canais de potássio dependentes de volta- gem que contém seis segmentos transmembranais [Lee e outro, 2005; Long e outro, 2005] e também pelos experimentos realizados com duplas mutantes (toxinas e canais) por diversos grupos [Gosdstein e outro, 1994; Stampe e outro, 1994; Aiyar e outro, 1995; Hidalgo e Mac- kinnon, 1995] que permitiram que o contato de superfície de muitos destes Iigandos com canais de potássio fossem identificados. Com relação as toxinas de escorpião conhecidas até o momento, mais de 125 diferentes peptídeos foram estudados, cujas seqüências de aminoácidos foram estudadas (Rodríguez de Ia Vega e Possani, 2004], Estes peptídeos

20 )

foram agrupados em 20 diferentes sub-famílias baseado principalmente em três critérios: similaridade de seqüência primária, posição das pontes de dissulfeto e especificidade da função. Para o propósito da presente invenção, ambos peptídeos (Vm23 e Vm24) foram isolados, purificados e testados. A importante originalidade e propriedade da informação obtida é a singularidade única de sua estrutura primária e a função altamente específica, as quais não são evidentes a simples observação de suas características estruturais, porém necessita de evidência experimental da função, in vitro e in vivo, como demonstrado e rei- vindicado nesta invenção.

Este trabalho começou com a coleta dos escorpiões da especie V. Mexicanus no campo e a extração do seu veneno por eletro-estimulação. Os escorpiões foram coletados no estado de Morelos, México. Os autores têm a autorização oficial para este propósito (do- cumento número SGPA/DGVS/02483 de 18 de Março, 2005, dado pela Secretaria do Meio Ambiente e Recursos Naturais do Governo Mexicano). Usualmente 30 escorpiões foram ordenhados após anestesia com dióxido de carbono (CO2). O veneno crú foi processado imediatamente ou mantido a -20°C até ser usado.

O veneno solúvel foi subseqüentemente separado por HPLC. O peptídeo purificado objeto desta invenção, foi então testado in vivo usando ratos como modelos animais para possíveis efeitos tóxicos (testes de letalidade) e tiveram sua estrutura primária determinada por degradação de Edman e análisis espectrométrica de massas. Os detalhes destes expe- rimentos são descritos no exemplo 1, abaixo.

Devido ao fato que a quantidade destes peptídeos é relativamente baixa no veneno para caracterizar sua funcionalidade e especificidade de ação sobre canais Kv1.3, uma substancial quantidade de Vm24 foi sintetizada quimicamente.

Síntese química de Vm24

A síntese de um peptídeo via método de fase-sólida inclui o uso de resinas de fase sólida, tais como, mas não limitado ao poliestireno, poliacrilamida, certas fibras e outros po- límeros estáveis. A derivatização da resina de fase-sólida pode ser produzida com adequa- do manuseo de cloreto de clorotritila, cloreto de 2-clorotritila, hidroximetilfenila, Sasrin como uma forma para produzir o C-terminal ácido funcional ou pode ser preparado através de es- tabilização proteolítica via uma resina-ligando, tal como, mas nao limitado ao grupo 4-(2',4'- dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)- fenoximetil.

A montagem da cadeia usualmente inclui qualquer estratégia de grupos protetores, onde o grupo protetor do aminoácido é t-butiloxicarbonila (Boc) ou 9- fluorenilmetiloxicarbonila (fmoc). As cadeias laterais reativas de vários aminoácidos usados para a síntese de um peptídeo são normalmente protegidos. Os grupos de proteção mais comumente usados incluem: t-butila, benzila, metiltritila, benzil-metilbenzila, tosila, benzilo- ximetila, t-butiloxicarbonila, 2-clorobenzila, 2-bromobenziila, metoxibenzila, formila, acetami-

5 10

15

20

25

30

35

dometila, pentametilcromano, sulfonila, pentametildiidrobenzofurano-sulfonila, nitro para as aminas das cadeias laterais, guanidinas, fenóis, álcoois, ácidos, imidazóis, tióis e indóis. Outros grupos de proteção podem ser inventados para realizar o mesma função de elimina- ção de reações secuendárias não desejáveis durante a montagem da cadeia primária.

A síntese da ligação amida durante a adição de um novo aminoácido para o peptí- deo que está crescendo pode ser realizada pelo uso de qualquer dos métodos de ativação ácida, incluindo mas não limitado a anidridos simétricos (carbodiimida), ésteres HOBT, fluo- retos de acila, ativadores de urânio tais como mas não limitados ao TBTU1 HATU ou HBTU1 ativadores de fosfônio tais como, mas não limitados a BP, PyBOP1 PyBrOP. Estes são to- dos os métodos de ativação do grupo carboxilo que se espera que saibam os espertos que se dedicam a síntese de peptídeos.

Sínteses de análogos estruturais que incluam substituição de aminoácidos não na- turais dentro das seqüências SEQ ID No:1 (Vm23), SEQ ID No:2 (Vm24) ou SEQ ID No:3 (seqüência concenso de Vm23 e Vm24) podem também serem usados em certas inclusões desta invenção. O uso de métodos convergentes onde os fragmentos do peptídeo são mon- tados de uma maneira em que o produto último seja Vm23, Vm24 e seus análogos conheci- dos, podem também ser usados por especialistas na área. Os métodos para clivagem do peptídeo sintético do suporte sólido no final do procedimento sintético e a correta estrutura- ção das pontes de dissulfeto para obter as seqüências SEQ No:1 e 2 ou seus análogos são também conhecidos e podem ser reproduzidos por especialistas no assunto. A clivagem final, desproteção e estruturação da toxina podem ser, mas não limitado a qualquer dos áci- dos HF ou TFA dependendo da estratégia empregada na síntese. A formação das pontes de dissulfeto inclui qualquer estratégia onde a proteção diferencial das Cys possa ser usada para colocar as pontes de dissulfeto na forma correta: C6-C26, C12-C31, C16-C33 e C21- C36 em relação a Vm24. Entretanto a formação das pontes de dissulfeto podem também ser obtidas pela oxidação do ar ou reações de intercâmbio dirigidas pela presença de glutation redutor e oxidante em várias proporções.

Seguindo esta metodologia básica, várias toxinas naturais de serpente, escorpião e anêmonas marinhas foram produzidas sinteticamente, radiomarcadas com I125 e usadas como sondas moleculares para a pesquisa de estrutura e função de canais de potássio [S- trong, 1990; Moczydlowski e outro, 1998; Garcia e outro, 2001; Kem e outro, Patent US6,077,680], Muitas destas toxinas são seletivas para sub-tipos particulares de canais de potássio [Auguste e outro, 1990; Galvez e outro, 1990; Crest e outro, 1992; Garcia-Calvo e outro, 1993; Garcia et al, 1994; Kem e outro, Patent US6,077,680], Entre os mais freqüen- temente exemplos usados estão a dendrotoxina do veneno da anêmona marinha Bunodo- soma granulifera [Aneiros e outro, 1993; Alessandri Haber e outro, 1999] e ShK da anêmona Stichodactyla helianthus [Castaneda e outro, 1995; Pennington e outro, 1995] e diversas 10

15

toxinas de escorpião como a noxiustoxina de Centruroides noxius [Frakopoulou e outro, 1995] e caribdotoxina de Leiurus quinquestratus [Sugg e outro, 1990], para mencionar ape- nas algumas. Muitas destas toxinas, como a ShK, bloqueiam canais de potássio Kv1.3 de linfócitos T Jurkat em concentrações muito baixas (< 1 nM). Entretanto, muitos deles sofrem por falta de especificidade. Isto é, a concentrações na ordem de 10 para 100 nM eles são capazes de bloquear outros sub-tipos de canais. Desde que, como será demonstrado nos exemplos a serem descritos abaixo, Vm23 e Vm24 são finamente específicos para canais hKv1.3 e tem uma estrutura primária diferente dos outros peptídeos já descritos na literatura, nós decidimos preparar Vm24 sinteticamente.

A estrutura covalente de Vm24 foi obtida por síntese química de acordo com o sis- tema de fase sólida de Merrifield [Merrifield, 1964], usando aminoácidos-fmoc, como descrito previamente por nosso grupo [Drakopoulou e outro, 1995],

A possibilidade de substituição de alguns aminoácidos na estrutura primária de SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 ou SEQ ID No:3 por outros aminoácidos modificados para obter um peptídeo análogo com vida média mais alta in vivo, então reduzindo a susceptibilidade a proteases dos peptídeos naturais está dentro da abrangência da presente invenção. Isto pode incluir recolocação ou substituição de resíduos não essenciais por substituições isosté- ricas conservativas; por exemplo: Iisina por glutamina ou acetil-lisina, ou um aminoácido neutro como alanina ou a substituição de um aminoácido Na-metilado em certas posições para reduzir a degradação proteolítica dos peptídeos biologicamente ativos. Também o trun- camento da estrutura primária, pela deleção de aminoácidos não-essenciais, ou adição de resíduos extras pode produzir estruturas análogas com uma estabilidade in vivo mais alta. Alguns resíduos não-essenciais dos peptídeos da presente invenção identificados pelo ali- nhamento de SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2 incluem mas não são restritos a: resíduos nas posições No. 10, 13, 17, 23, 29 e 35 dos alinhados SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2 ou SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 e SEQ ID No:3.

Um peptídeo análogo funcionalmente equivalente pode ser produzido pela inclusão

de D-aminoácidos selecionados ou por síntese química de um análogo retro-invertido, onde

todos os resíduos são D-aminoácidos e a seqüência de aminoácidos é reversa [Jameson e

outro, 1994; Juwadi e outro, 1996], Estas modificações podem aumentar a estabilidade do produto.

Uma outra estratégia importante é o desenvolvimento de componentes de baixo peso molecular baseado nas determinantes estruturais de afinidade e especificidade de SEQ ID No:1, SEQ ID No:2 e SEQ ID No:3 para gerar não-peptídicos (peptideomimético). Nestes estudos, a estrutura básica não-peptídica é desenhada e sintetizada, a qual contém os grupos funcionais chaves das superfícies de contato dos canais de potássio do polipeptí- deo precursor. Existem muitos exemplos onde componentes naturais não peptídicos de bai-

30

35 10

xo peso molecular, hão demonstrado mimetizar ou antagonizar o efeito de um polipeptídeo ou proteína ligante. Componentes peptidiomiméticos tem sido desenhados e sintetizados por um número de peptídeos terapeuticamente relevantes. Um "loop" presente sobre o re- ceptor CD4 os quais se ligam a proteína gp120 de HIV foi desenhada e sinteticamente obti- da [Chen e outro, 1992] e mostraram ser efetivos bloqueadores da ligação de gp120 ao re- ceptor CD4 a concentrações micromolares baixas. FTI-276 é outro exemplo de um mimético da região C-terminal da proteína Ras a qual é um potente bloqueador da sinalização de Ras oncogênico [Lerner e outro, 1995].

Como pode ser deduzido da descrição acima, existem várias formas de preparar análogos funcionais equivalente destes dois peptídeos Vm23 e Vm24 que podem ser usa- dos como fármacos potenciais para o controle de funções anormais dos linfócitos Τ. A ativa- ção imprópria de linfócitos T são conhecidos por causar doenças autoimunes (tais como esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete do tipo I, psoríase autoimune, Iupus eritema- toso, colite ulcerativa, oftalmia simpatética e doença periodontal de reabsorção óssea) e rejeição de transplantes entre outros.

Para testar a eficiência de possíveis novos fármacos imunossupressores existem muitos modelos animais, os quais permitem ensaios adequados in vivo para testar a eficiên- cia e possíveis efeitos colaterais de um novo componente desconhecido, como é o caso de uma reação conhecida como hipersensibilidade do tipo retardada (resposta DTH) em ratos, que tem sido usada na presente invenção. Como isto será mostrado e discutido abaixo, para acessar o efeito de proteção dos peptídeos da presente invenção, pequenas doses de Vm24 foram testadas para o controle de reações inflamatórias que ocorrem na orelha de ratos pre- viamente sensibilizados com dinitrofluorobenzeno (DNFB). Este ensaio tem sido amplamen- te usado e é aceitado como um modelo adequado para os propósitos da presente invenção [Phanuphak e outro, 1974],

Imunossupressores

Imunossupressores como as ciclosporinas e FK506 apresentam severos efeitos co- laterais, os quais limitam seu uso terapêutico. Pesquisas realizadas com estes dois compo- nentes foram capazes de identificar pelo menos alguns dos mecanismos moleculares res- ponsáveis pelos efeitos colaterais não desejáveis com a administração destes fármacos. A ciclosporina interage com a proteína ciclofilina a qual está presente em diferentes tecidos, enquanto FK506 causa toxicidade porque seu alvo é a proteína de ligação a FK, também encontrado em diferentes tecidos. A partir deste fato os maiores esforços tem sido feitos para identificar novos imunossupressores que não produzam sérios efeitos colaterais. Uma das principais metas é identificar novos alvos expressados principalmente em linfócitos T, tal como o canal ionico Kv1.3. Os canais de potássio Kv1.3 expressados em linfócitos T são muito importantes para certas funções celulares, embora o RNA que codifica para estas pro-

20

30

35 10

15

20

25

30

35

teínas são também encontrados em outras células (linfócitos B microglia, macrófagos, oste- oclastos, plaquetas e algumas células cerebrais. Entretanto, somente em linfócitos T1 Kv1.3 domina o potencial de membrana e seu bloqueio produz conseqüências funcionais significa- tivas. Devido ao distinto mecanismo de ação dos bloqueadores de Kv1.3 e a relativa distri- buição tecidual restringida dos canais Kv1.3, com uma afinidade e alta especificidade de bloqueio de Kv1.3 se espera obter efeitos colaterais menos tóxicos do que a ciclosporina e FK-506, por tanto, isto pode ser útil para o tratamento de doenças autoimunes bem como para a terapia de transplantes.

Cientistas da Merck Sharpe e Dohme mostraram que a margatoxina (outra toxina peptídica de escorpião) tem um potente efeito como bloqueador de canais Kv1.3 e é capaz de suprimir a resposta imune em um modelo animal (suíno). Entretanto, margatoxina não é específico para canais Kv1.3, e também afeta canais Kv1.2, este bloqueio pode ter sérios efeitos deletérios. Outro peptídeo isolado de anêmona marinha, ShK é um potente bloquea- dor de Kv 1.3 (ver Kem e outro 2000, patente US6,077,680), que também afeta outros canais Kv1 relacionados, mas é necessário uma concentração cem vezes maior para um bloqueio similar. Isto significa que canais relacionados são >100 vezes menos sensíveis a sua aplica- ção, quando comparado com Kv1.3. Os peptídeos Vm23 e Vm24, objeto desta invenção, são de uma fonte biológica diferente, tem uma diferente estrutura primária em relação a ShK e são mais específicos para canais hKvl .3 do que ShK. Vm23 e Vm24 bloqueiam < 50% de um par de outros canais hKv1.3 quando aplicados a uma concentração maior que 3000 mais alta do que é necessário para bloqueara mesma fração de canais Kv1.3, isto será mostrado e discutido em detalhes nos exemplos abaixo (exemplos 7 a 10).

Esta invenção também comprende a produção de Vm23, Vm24 e seus análogos funcionais equivalentes pelo método de fase sólida. Os procedimentos usados para síntese química incluem uma série de protocolos bem conhecidos por especialistas na área, como detalhado dentro da descrição do exemplo 3.

Caracterização Eletrofisiológica

O desenvolvimento de uma resposta imune contra não próprios ou antígenos re- querem a ativação e proliferação de linfócitos específicos para um dado antígeno. Isto re- quer uma bem coordenada interação entre diferentes componentes celulares de um sistema imune. A primeira etapa deste processo é a apresentação do antígeno processado aos linfó- citos por células profissionais de apresentação de antígeno [Janeway e outro, 2001], Dentro do tema da presente invenção esta a regulação de linfócitos T mediada por resposta imune (p.e. hipersensibilidade do tipo retardada) por bloqueadores específicos para o canal de po- tássio dependente de voltagem, Kv1.3. Então, nós restringimos a elaboração do envolvimen- to de canais de potássio na ativação linfocítica das células T. Entretanto, nós devemos men- cionar que a proliferação de certos subconjuntos de linfócitos B também dependem da ativi- 10

dade dos canais Kv1.3 [Wulff e outro, 2004],

O reconhecimento de um antígeno apresentado pelo receptor de antígenos de célu- las T envolve a ativação, proliferação e diferenciação terminal das células [Sallusto e outro, 2004], As vias de sinalização transmembranais desencadeadas pelo reconhecimento de antígeno inclui a ativação de muitas proteínas quinases e consequentemente da fosfolipase C-γ (PLC-γ). A geração de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) pela hidrólise mediada por PLC-γ da membrana, o fosfolipídio fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PiP2) inicia o sinal de Ca2+ bifásico requerido por compromisso para a proliferação das células T [Lewis, 2001]. IP3 se difunde e se liga a seus receptores no retículo endoplasmático (RE), que resulta na liberação de Ca2+ dentro do citosol com um aumento significativo na concentração citosólica de cálcio livre ([Ca2+]i). O aumento transitório en [Ca2+]i seguindo a liberação do RE não é suficiente para a execução da cascata de transdução de sinais, é necessário um sinal mantido por Ca2+. Isto é realizado pelo influxo de Ca2+ do espaço extracelular através dos canais de Ca2+ na

membrana plasmática por canais de Ca2+ ativados para liberação de Ca2+ (canais CRAC) [Zweifach and Lewis, 1993].

Embora os canais CRAC sejam inerentemente independentes de voltagem, a cor- rente de Ca2+ é sensível a gradiente eletroquímico para Ca2+, que é influenciado pelo poten- cial de membrana das células [Panyi e outro, 2004], A despolarização do influxo de Ca2+ tem que ser contrabalanceado pela ativação de canais de potássio para fixar o potencial de membrana em valores negativos e então, providenciar uma suficiente força de direção para a entrada de mais Ca2+ [Fanger e outro, 2001], O efluxo de K+ regulado e seletivo é um dos principais determinantes do potencial de membrana de linfócitos T humanos, o qual está entre -50 a -60 mV. Dois tipos de canais de K+ conduzem fluxos de K de fora sobre condi- ções fisiológicas nestas células. O dominante canal de K dependente de voltagem em linfó- citos T humanos, Kv1.3, abre sobre a despolarização da membrana com um limiar de ativa- ção perto do potencial de repouso das células [Matteson and Deutsch, 1984], Os canais de potássio ativados por Ca2+ de células T humanas, IKCaI (ou KCa3.1), é ativado unicamente pelo aumento da concentração de cálcio livre no citosol acima de ~200nM, independente- mente do potencial de membrana [Grissmer e outro, 1993],

A contribuição dos canais Kv1.3 e IKCaI para o controle do potencial de membrana de células T depende do estado de ativação das células (repouso vs. ativado) e seu envol- vimento funcional no sistema imune determinado pelo grau de diferenciação terminal das células T [Wulff e outro, 2003], como descrito em detalhes na secção de Restrospectiva da Invenção. Do ponto de vista da aplicabilidade de bloqueio de Kv1.3 em doenças autoimunes é importante enfatizar que a seletividade para canais Kv1.3 sobre canais IKCaI é de suma importância [Wulff e outro, 2003]. Células T efetoras de memória (TEM), as quais mediam o dano tecidual, por exemplo, na esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete tipo I, psoríase

20

25

30 15

autoimune, Iupus eritematoso, colite ulcerativa, oftalmia simpatética e doença periodontal de reabsorção óssea, seletivamente sobre regulam os canais Kv1.3 sobre ativação, e então, o potencial de membrana destas células é governado unicamente por canais Kv1.3 [Beeton e outro 2006], Consequentemente, a proliferação destas células pode ser suprimida efetiva- mente e persistentemente por inibidores seletivos de Kv1.3 [Wulff e outro, 2004; Beeton e outro, 2005], Ao contrário células T de memória central (Tcm) e naíve escapam da inibição da proliferação mediada por bloqueio de Kv1.3 [Wulff e outro, 2003] pela sobre regulação transcricional de IKCaI [Ghanshani e outro, 2000], A proliferação destas células pré-ativadas tornam-se sensíveis a inibidores de IKCal, mas não aos inibidores Kv1.3. Então, uma terapia baseada em Kv1.3 que suprime a ativação das células Tcm poderia ser usada no controle de doenças autoimunes, particularmente em doenças autoimunes associadas a linfócitos TEM, tais como diabete melito do tipo I, artrite reumatóide [Beeton e outro, 2006], esclerose múlti- pla, reabsorção óssea inflamatória [Valverde e outro, 2004] e condições associadas a rejei- ção de órgãos, tais como rejeição crônica de enxertos e enxerto contra doença do hospedei- ro as quais são propostas serem mantidas por células Tem ativadas cronicamente [Yamashi- ta e outro, 2004],

Acesso a Seletividade

Muitos bloqueadores peptídicosde alta afinidade de Kv1.3 são seletivos para Kv1.1 mais que para IKCal, de forma similar a Vm24. Estes incluem toxinas de escorpião como a Margatoxina (MgTx), Noxiustoxina (Ntx), Kaliotoxina, Anurotoxina e a toxina ShK de anêmo- na marinha. Entretanto, canais iônicos importantes na excitabilidade de neurônios e músculo são também inibidos por estas toxinas com afinidades de nanomolar a picomolar, por exem- plo Kv1.1 por ShK [Kalman e outro, 1998] e Kaliotoxina [Grissmer e outro, 1994], enquanto

Kv1.2 é bloqueado por MgTx [Koch e outro, 1997], Ntx [Grissmer e outro, 1994] e Anurotoni- xa [Bagdany et., 2005],

A falta de especificidade das toxinas impõe a possibilidade de significantes efeitos biológicos. Canais iônicos da família Kv são amplamente distribuídos em células classica- mente excitáveis e não excitáveis. Eles contribuem para a manutenção do potencial de re- pouso da membrana, a forma dos potenciais de ação pela influência na proporção de repo- Iarização e determina a freqüência de ponto neuronal depois da hiperpolarização (ver [Gut- man e outro, 2005] para uma revisão compreensiva). Canais iônicos expressados no siste- ma nervoso central são mais protegidos contra a aplicação sistemática de toxinas devido a barrera hemato-encefálica, entretanto, na esclerose múltipla, que é uma área potencial de aplicação dos inibidores de Kv1.3, esta barreira esta comprometida, a qual está envolvida na toxicidade neural em modelos animais de MS [Beeton e outro, 2005], Devido ao contato di- reto das células com o fluxo sangüíneo, miócitos cardíacos são mais suscetíveis aos poten- ciais efeitos colaterais de um inibidor Kv1.3 não seletivo. Os canais Kv1.5 em miócitos atriais

35 10

15

20

25

30

35

humanos [Feng et al. 1997] e Kv1.4 em miócitos ventriculares [Patel e Campbell, 2005] e canais hERG (revisado em [Sanguinetti e Tristani-Firouzi, 2006]) determinam criticamente a fase de repolarização [Rogart e outro, 1989], Canais BK de K ativados por Ca2+ são onipre- sentes no corpo humano (cérebro, músculo esquelético, músculo liso, ilhotas pancreáticas . etc, revisado em [Wei e outro, 2005]) e regulam uma variedade de funções fisiológicas inclu- indo excitabilidade elétrica dos neurônios, células de músculo esquelético e cálcio transiente

em músculo liso. Os canais BK são bloqueados por toxinas da família α-ΚΤχ1.χ (caribdoto- xina [Miller e outro, 1985]).

A avaliabilidade da estrutura cristalográfica de uma bactéria [Doyle e outro, 1998] e um canal de potássio dependente de voltagem [Long e outro, 2005] expandiu significativa- mente nosso conhecimento da base molecular da especificidade de α-KTx para diferentes canais iônicos na última década [Giangiacomo e outro, 2005], entretanto, até hoje, a predi- ção do perfil de seletividade de uma dada toxina peptídica, baseada em sua estrutura primá- ria, não é possível. Isto substancia a determinação experimental da seletividade de Vm24 contra canais iõnicos tendo significância biológica e conhecida susceptibilidade para blo- quear através de toxinas de animais.

O avanço da biologia molecular e a clonação de gens de canais iônicos permite que estudos farmacológicos sejam conduzidos sobre canais iônicos recombinantes. A ex- pressão de canais recombinantes em linhas celulares adequadas nos dá muitas vantagens para os experimentos farmacológicos, por exemplo, a magnitude das correntes contaminan- tes são insignificantes e a amplitude das correntes adequadas para testes farmacológicos. Além do mais, os canais recombinantes expressados mantêm as características farmacoló- gicas dos canais expressados em células naturais.

Composições farmacêuticas

A invenção permite composições farmacêuticas que abrangem os peptídeos da presente invenção. Como já foi mencionado, estes peptídeos são úteis para suprimir a res- posta imune em mamíferos onde uma específica sub-série de células T é ativada. Em parti- cular, composições farmacêuticas que abrangem os peptídeos desta invenção são úteis para o tratamento e prevenção de condições em que a resposta imune é o resultado de uma rejeição de órgão heteróloga (por exemplo, coração, pulmão, fígado, rin ou pâncreas) ou o resultado de uma doença autoimune associada a linfócitos TEM.

Em um aspecto prereferido da invenção, as composições farmacêuticas abrangem os peptídeos da presente invenção ou um derivado salino farmaceuticamente aceitável e um veículo farmaceuticamente aceitável. A forma preferida destas composicoes farmacêuticas e a seleção de um veículo farmaceuticamente aceitável depende da forma que se pretende fazer a administração e a aplicação terapêutica. As composições farmacêuticas incluem (dependendo da formulação desejada) veículos e diluentes não tóxicos farmaceuticamente 10

15

20

25

30

35

aceitáveis, os quais são definidos como veículos comumente usados para formular compo- sições farmacêuticas para administração humana ou animal. Adicional e opcionalmente, as composições farmacêuticas podem também abranger pelo menos um agente imunossu- pressor adicional, os quais podem ter efeitos complementares no tratamento. Alguns ilustra- tivos agentes imunossupressores são ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona, to- xina ShK, derivados ShK e deoxispergualina, seus derivados e derivados salinos. As com- posições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas como mencionado abaixo.

Métodos terapêuticos e profifáticos

Esta invenção fornece métodos para o tratamento terapêutico ou profilático de con- dições onde a supressão da resposta imune em mamíferos é requerida, especialmente quando as células T são ativadas em sujeitos que necessitem tal tratamento, onde ditas condições incluam rejeição de órgãos heterólogo (por exemplo, coração, pulmão, fígado, rin ou pâncreas) ou doenças autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete do tipo I, psoríase autoimune, Iupus eritematoso, colite ulcerativa, oftalmia simpatéti- ca e doença periodontal de reabsorção óssea). Estes temas podem incluir humanos e outros mamíferos, como cachorros, gatos, cabras, bovinos, cavalos, suínos, ovelhas, para mencio- nar apenas alguns. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para o tratamento terapêutico e profilático para condições que são tratáveis, responsivas ou sensíveis através da inibição de canais de potássio Kv1.3 em membranas de células T de sujeitos que neces- sitem de tal tratamento. Estes métodos compreendem a administração a um sujeito em ne- cessidade dele, incluindo humanos, efetiva quantidade de peptídeo da presente invenção é descrita acima. Em geral, este peptídeo pode compreender peptídeos Vm24 com uma SEQ ID No:1, Vm 23 com uma SEQ ID No:2, ou um peptídeo tendo uma seqüência SEQ ID No:3,

ou análogos funcionais equivalentes destes ou um derivado salino farmaceuticamente acei- tável destes.

Em uma inclusão pre-referenciada, a presente invenção fornece métodos especifi- camente direcionados ao tratamento e prevenção de doenças autoimunes associadas com a ativação ou resposta a inibição de canais de potássio Kv1.3. Cada doença autoimune inclui mas não se limita a esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete do tipo I, psoríase autoi- mune, Iupus eritematoso, colite ulcerativa, oftalmia simpatética e doença periodontal de re- absorção óssea. Estes métodos comprendem a administração a um sujeito em necessidade deles, incluindo sujeitos humanos, uma efetiva quantidade de peptídeo da presente inven- ção é descrita acima.

Em outra inclusão pre-referida, a presente invenção fornece métodos especifica- mente direcionados para o tratamento e prevenção da rejeição de um órgão heterólogo (por exemplo, coração, pulmão, fígado, rin ou pâncreas). Estes métodos comprendem a adminis- 10

15

20

25

30

35

tração a um sujeito em necessidade deles (por exemplo, que receberá ou tem recebido um órgão transplantado), incluindo humanos, uma efetiva quantidade de um peptídeo da pre- sente invenção como descrito acima.

Doses e métodos de administração

Em aplicações terapêuticas, um peptídeo da invenção pode ser administrado a um sujeito que já sofre de uma doença ou de uma condição indesejada (por exemplo, doença autoimune, rejeição de órgão heterólogo, respectivamente), em uma quantidade suficiente para tratar, curar, parcialmente reter ou detectavelmente diminuir a progressão da doença e suas complicações. A quantidade efetiva de um peptídeo da invenção para uso em aplica- ções terapêuticas dependerá da gravidade da condição, estado geral do sujeito e da via de administração. A quantidade efetiva de peptídeo em aplicações terapêuticas será geralmen- te dentro de um alcance de 0,1 microgramas por quilograma até 10 microgramas por quilo- grama de peptídeo (ou um derivado salino farmaceuticamente aceitável) por dose.

Em aplicações profiláticas, os peptídeos em questão ou composições farmacêuticas deles são administrados a sujeitos em risco, mas não que já estejam sofrendo de uma do- ença ou de uma condição indesejável. A quantidade efetiva de peptídeo a ser administrado dependerá do estado de saúde do sujeito e do estado geral do sistema imune. A quantidade efetiva de peptídeo em aplicações profiláticas em geral está na ordem de 0,1 micrograma por quilograma a 10 microgramas por quilograma de peptídeo por dose.

A rotina de liberação dos peptídeos e composições farmacêuticas da presente in- venção é determinado pela doença ou indicação clínica e o local onde o tratamento é reque- rido. Para certos tipos de doenças, limitado a uma certa região do corpo, pode ser desejável aplicar o peptídeo ou composições deste no local (aplicação tópica). Alternativamente, com a progressão da doença ou simultaneamente a aplicação tópica poderia ser desejável admi- nistrar o peptídeo ou composição de forma sistêmica.

Para outras indicações, peptídeos e composições farmacêuticas da invenção po- dem ser administrados via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrana- sal e injeções intradérmicas, bem como por instilação intrabronquial (por exemplo, usando um nebulizador), transmucosa, sistêmico, transdérmico (por exemplo, com veículo lípido-

solúvel em adesivos de pele), oral e liberações gastro-intestinais (por exemplo, com cápsu- las ou tabletes).

Um ou mais peptídeos da invenção podem ser administrados em terapia combina- da. Por exemplo, um ou mais peptídeos podem ser administrados em combinação com ou- tro agente imunossupressor (tais como aqueles mencionados acima) ao sujeito em necessi- dade de tal tratamento. Existem algumas doenças autoimunes idiopáticas, como a tromboci- topenia púrpura imune [Cooper e Bussel, 2006] ou síndrome Iinfoproliferativa autoimune [Oren e outro, 2002], onde o tratamento poderia requerer uma estratégia de múltiplos alvos, portanto mais que uma substância imunossupressora é necessária.

Os peptídeos da invenção podem ser administrados de forma individual ou em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável como descrito acima na secção "Composições farmacêuticas". Os peptídeos podem ser administrados em uma ou em múlti- plas doses. Veículos farmacêuticos adequados incluem diluentes sólidos inertes ou compu- tadores, soluções aquosas estéries e vários solventes orgânicos não tóxicos. As composi- ções farmacêuticas formadas pela combinação de um peptídeo em questão com um veículo farmaceuticamente aceitável pode ser prontamente administrado em uma variedade de for- mas de dosagem tais como tabletes, pastilhas, charopes, soluções injetáveis e similares. Se desejado, os veículos farmacêuticos podem conter ingredientes adicionais, como flavorizan- tes, ligadores, excipientes e similares.

Para administração oral, tabletes contendo vários excipientes, tais como citrato de sódio, carbonato de cálcio e fosfato de cálcio, podem ser empregados juntos com vários desintegrantes, como goma e preferivelmente com goma de batata ou tapioca, ácido algíni- co e certos silicatos complexos, juntos com agentes de ligação como o polivinilpirrolidona, sacarose, gelatina e acácia. Agentes lubrificantes, como o estearato de magnésio, Iauril sul- fato de sódio e talco são também adicionados para a produção de tabletes. Composições sólidas de um tipo similar podem também serem empregadas como preenchedores em sal e cápsulas de gelatina bem cheias. Os materiais preferidos para este propósito incluem Iacto- se ou doce de leite e polietileno glicóis de alto peso molecular. Quando suspensões aquosas de elixires são requeridos para administração oral, o peptídeo ativo essencial contido pode ser combinado com vários adoçantes ou flavorizantes, colorantes e tinturas e, se desejado, agentes de suspensão ou emulsificantes, juntos com diluentes como ãgua, etanol, propileno glicol, glicerina e combinações destes.

Para administração parenteral, soluções de peptídeos da presente invenção podem ser empregados em óleo de sésamo ou amendoim ou em polipropileno glicol aquoso, bem como soluções salinas aquosas estériles dos correspondentes sais metálicos solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis. Como uma solução aquosa deve ser convenientemente tamponado se necessário e o diluente líquido primeiro deixado isotônico com solução salina ou glicose. Estas soluções aquosas em particular são especialmente convenientes para in- jeções intravenosa, subcutânea e intraperitoneal. As soluções aquosas estéreis empregadas são todas facilmente obtidas por técnicas padronizadas bem conhecidas pelos especialistas na área. Adicionalmente, os componentes supracitados podem ser administrados topica- mente (por exemplo, através de colocação de sonda) pelo uso apropriado de uma solução conveniente para este particular propósito.

Vm23, Vm24 e análogos funcionais equivalentes como sondas moleculares

Afora o uso terapêutico dos peptídeos da presente invenção, estes peptídeos po- 15

dem ser usados para detectar e caracterizar o nível de expressão de canais iônicos Kv1.3 em uma ampla variedade de células, obtidas tanto de tecidos animais como de culturas es- táveis. A importância de caracterizar a expressão de Kv1.3 em células T já tem sido desta- cado neste documento, portanto esta invenção também relata o uso dos peptídeos da pre- sente invenção como sondas moleculares para caracterização fisiológica de canais Kv1.3 expressados em células. A detecção e caracterização da expressão de Kv1.3 pode ser feita por diversas técnicas de detecção usando os peptídeos da presente invenção marcados convenientemente incluindo mas não restringido a: citometria de fluxo, microscopia de flo- rescência convencional ou confocal, emissão de fluorescência total, marcação radioativa, técnicas de deslocamento e testes de decaimento imunológico. A determinação quantitativa de canais Kv1.3 expressados em uma dada célula pode ser realizada por técnicas de detec- ção quantitativa, incluindo mas não restringida a: contagem de canal por microscopia de escaneamento lazer confocal, detecção por imuno-ouro e marcação radioativa e técnicas de deslocamento. Além do mais, modificações químicas de cadeias polipeptídicas ou cadeias laterais de diversos aminoácidos não-essenciais podem prover análogos funcionais equiva- lentes marcados que podem ser usados para a detecção de canais Kv1.3 e quantificação. Desta forma, estes análogos funcionais equivalentes podem ser usados como sondas mole- culares para buscar Iigandos específicos, comprovando que estes novos Iigandos compar- tem o mesmo sítio de ligação sobre Kv1.3 como Vm23, Vm24 e seus análogos funcionais equivalentes. Qualquer modificação química deverá deixar sem modificação as determinan- tes funcionais de Vm23, Vm24 e seus análogos funcionais equivalentes, os quais conferem a eles alta afinidade e especificidade através de Kv1.3. Modificações químicas de cadeias polipeptídicas é um procedimento comum para a obtenção de sondas moleculares úteis; isto pode ser obtido por diversos métodos disponíveis e regularmente usados por especialistas na área. A marcação fornecida pela modificação poderá incluir, mas não é restringida a isó- topos radioativos, fluorescência, quimoluminiscência, moléculas cromogênicas e ligação

cruzada ou fusão com etiquetas de proteínas (anticorpos, biotina, proteína fluorescente ver- de ou seus derivados).

Nos seguintes exemplos é descrito em detalhe como estes novos peptídeos da pre- sente invenção, foram isolados, purificados e quimicamente caracterizados. A síntese de um peptídeo exemplar, Vm24, é descrito e a ação seletiva dos dois peptídeos exemplares da presente invenção (Vm23 e Vm24) sobre canais Kv1.3 de linfócitos T humanos é completa- mente descrita. Finalmente, a ação protetiva de Vm24, a baixas concentrações nos ensaios in vivo de resposta DTH em ratos é também descrita. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar tipicamente inclusões da in- venção pre-referidos. Muitas mudanças podem ser feitas nas específicas inclusões dos e-

20 15

xemplos reportados e ainda se obtém um equivalente ou similar resultado sem sair do espí- rito e do alcance desta invenção, pelos especialistas na área. Se os produtos finais abran- gem as seqüências mostradas aqui (SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3) ou seus aná- logos funcionais equivalentes, êles estão limitados a reproduzir o mesmo resultado daqueles

descritos aqui e então é esperado que funcionem bem na prática da invenção reivindicada aqui.

Exemplo 1. Isolamento, teste de Ietalidade em ratos e determinação da estrutura primária de Vm23 e Vm24

Todos os solventes e químicos usados foram de grau analítico e água bi-destilada foi usada em todo o procedimento como descrito previamente [Batista e outro, 2007], Procedimento de Isolamento

Os procedimentos usados para o isolamento de vários Iigandos naturais menciona- dos acima fazem uso das técnicas de cromatografia. O veneno foi solubilizado em água e centrifugado a 10,000 χ gr por 5 min. O sobrenadante foi recuperado e separado por croma- tografia líquida de alta eficiencia (HPLC). Cem microlitros contendo 1.0 miligramas de prote- ínas do veneno solúvel foi aplicado a uma coluna analítica de fase reversa C18 (dimensões χ 250 mm, catálogo número 238TP) obtida da Vydac (Hisperia, CA1 USA), de um sistema de HPLC (Millenium Millipore1 Milford, MA). Os componentes foram purificados usando um gradiente linear de solução A (ácido trifluoroacético 0,12% -TFA em água) a 60% de solução B (0.10 TFA em acetonitrila), corrido por 60 min. A detecção foi monitorada por absorbância a 230 nm e eluída com um fluxo de 1 ml/min. As frações foram coletadas manualmente e secas em um Iiofilizador a vácuo Savant Speed-Vac. Como mostra a figura 1, mais de 80 diferentes frações foram coletadas da separação por HPLC. Frações que eluíram de 25 a 30 min de tempo de retençõo usualmente correspondem ao tempo de eluiçõo das principais toxinas de escorpião específicas para canais de potássio em relação às outras toxinas de escorpião já estudadas [Batista e outro, 2007], Por esta razão, uma atenção especial foi de- dicada aos componentes que eluiam nestes tempos. Especificamente, duas frações: uma eluindo a 23 e outra a 24 minutos que foram melhor analizadas, porque as determinações de espectrometria de massas dos peptídeos destes tempos de retenção estavam bem corre- lacionados com os valores encontrados para outras toxinas específicas para canais de po- tássio, elas tinham massas moleculares ao redor de 4,000 Daltons. Visto que estes compo- nentes não estavam ainda em forma homogênea, uma segunda separação cromatográfica foi conduzida usando o mesmo sistema de HPLC mas eluídos com um gradiente diferente (solvente A até 40% de solvente B por 60 min, usando uma coluna C18, número de catálogo 218TP54 da Vydac, Hisperia, CA). Como esta demonstrado nos insertos da Fig.1, o compo- nente majoritário foi isolado de cada uma destas frações iniciais (marcadas com asterisco). O inserto do lado esquerdo corresponde a fração eluída a 23 min e a do lado direito a fração

20 10

15

eluída a 24 min. Ambos peptídeos foram tidos como em forma homogênea depois da análi- se por espectrometria de masas e sequênciamento por degradação automática de Edman. O que eluiu a 24 min em nossas condições experimentais foi analizado primeiro. Ele estava puro e mostrou uma massa molecular de 3864 unidades de massa atômica (a.m.u.). Neste documento nós usaremos intercambiavelmente os termos a.m.u. ou Daltons (abreviado Da) para designar uma unidade de massa molecular. Por esta razão o peptídeo foi nomeado Vm24, o qual se refere ao peptídeo do veneno de V. mexicanus que elui a 24 min em nos- sas condições experimentais. O cromatograma mostrado no inserto do lado esquerdo (Fig. 1) corresponde a separação do peptídeo chamado Vm23. Ele se refere ao peptídeo do ve- neno de V. mexicanus que elui a 23 min. A massa molecular experimental deste componen- te foi determinado como 3665 Da.

Determinação in vivo da toxicidade do veneno total de V. mexicanus e testes de ie- talidade de Vm24 eVm23 purificados

O efeito dos venenos e peptídeos puros são geralmente conduzidos em laboratório utilizando pelo menos três modelos biológicos: mamíferos, grilos e crustáceos, já que é co- nhecido que os venenos de escorpião posuem toxinas espécie-específica. Existem toxinas específicas para mamíferos ou para diferentes tipos de artrópodos (revisado em [Possani e outro, 1999]). Para o propósito desta invenção, nós conduzimos experimentos usando ratos como modelo animal porque os resultados poderiam ser uma real indicação do que poderia ocorrer com humanos quando em contato com o veneno ou toxinas purificadas. Ratos inje- tados com várias quantidades do veneno solúvel (de 50 a200 microgramas de proteína por camundongo de 20 gramas de peso corporal) de V. mexicanus não mostrou sintomas de intoxicacao. Em geral se o veneno contém toxinas para humanos, com estas quantidades de material, sintomas claros de intoxicação deveriam ter sido vistos, tais como excitabilidade, salivação, problemas respiratórios (dispnea), paralisia dos membros traseiros, diarréia, con- vulsões ou mesmo morte [Possani e outro, 1985], Um peptídeo é dito como "tóxico" se o animal injetado apresenta qualquer dos sintomas acima, mas se recupera dentro de 24 ho- ras seguida da administração do peptídeo, visto que se o camundongo morre, ele é chama- do de letal. Componentes não-tóxicos são aqueles que não produzem sintomas de intoxica- ção ou produzem comportamentos similares aos camundongos injetados com solução de PBS salina a pH 7.2 [Possani e outro, 1985], Eventualmente o veneno total a doses relati- vamente baixas não é tóxico, mas peptídeos purificados em doses similares podem induzir sintomas de intoxicação, porque durante a purificação a amostra é enriquecida em um com- ponente em particular. Por esta razão e tomando em conta que o veneno solúvel de V. me- xicanus não foi tóxico a 200 microgramas/20 gramas de peso de camundongo, o peptídeo Vm24 puro foi injetado em ratos a diferentes concentrações. A concentração mais alta utili- zada foi de 200 microgramas/20 gramas, que é: 10,000 miligramos/quilograma de peso de

20 camundongo e nenhum sintoma de intoxicação foi observado.

Isto é certamente contrastante com os componentes letais, como a toxina Cn2, puri- ficada de outro escorpião Centruroides noxius. A dose letal 50 (LD50, que significa a dose que causa 50% de mortalidade em um grupo de animais testados) para Cn2 em ratos é de 0,25 microgramas/20 gramas de peso de camundongo [Zamudio e outro, 1992]. Isto signifi- ca que Vm24 a uma concentração de proteínas 800 vezes maior não é tóxica para ratos, enquanto Cn2 mata a metade da população.

Determinação da seqüência de aminoácidos de Vm23 e Vm24 Duas técnicas foram utilizadas: degradação automática de Edman e análise por es- pectrometria de massas (MS). A determinacao direta da seqüência de aminoácidos da toxi- na pura foi realizada usando um sequênciador de proteínas Beckman LF 3000 (Paio Alto, CA, USA) com reagentes químicos e procedimentos fornecidos pela companhia. Uma a- mostra eduzida e alquilada do peptídeo puro foi digerido enzimaticamente com endopepti- dase Arg-C (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), usando procedimentos similares aos descritos anteriormente para outros componentes de escorpião [Valdez e outro, 2004; Batis- ta e outro, 2007; Diego-Garcia e outro, 2007], Os peptídeos correspondentes foram purifica- dos por HPLC e sequênciados. Para espectrometria de massas as amostras foram direta- mente aplicadas em um espectrômetro de massas Ion Trap LCQduo (San Jose, CA) usando uma bomba Surveyor sistema de eluição. O eluato de 10 microlitros/min foi separado para permitir que apenas 5% do fluxo levasse a amostra para a fonte de nanospary (0.5 microli- tros/min). A voltagem do "spray" foi colocada a 1.7 kV e a temperatura do capilar de aqueci- mento a 130°C. Para os experimentos de MS/MS a fonte de fragmentação foi operada com 25V de energia de colisão, 35-45% (unidades arbitrárias) de energia de colisão normalizada e escaneamento com faixa ampla ativada. Todos os espectros foram obtidos com modo de detecção para íons positivos. A aquisição dos dados e deconvolução dos dados foram reali- zados com o programa Xcalibur em um sistema PC Windows NT. Os espectros de MS/MS dos peptídeos enzimaticamente gerados foram analizados manualmente e pelo programa computacional Sequest [Batista e outro, 2007].

As estruturas primárias de ambosVm23 e Vm24 (ver Fig. 2) foram determinadas e os peptídeos foram usados para os experimentos de eletrofisiologia como descrito abaixo (ver exemplos acompanhados 7 a 10 desta invenção). O peptídeo nativo repurificado da fração que eluiu a 23 min (ver inserto a esquerda na Fig. 1) foi completamente caracteriza- do. Sua massa molecular experimental foi de 3665 Da. Um nanomol deste peptídeo foi car- regado no sequênciador e os primeiros 34 aminoácidos foram diretamente identificados por degradação de Edman (Direto sublinhado). Os resíduos de cisteínas foram confirmados pela redução e alquilação, usando a metodologia recomendada pela companhia (Beckman). A massa molecular média teórica baseada na seqüência determinada foi de 3665.51, confir- 10

15

3

mando então a determinacao inequívoca da seqüência total. Ambos massas moleculares, determinada experimentalmente e a teórica esperada foram as mesmas, dentro do erro do equipamento usado (espectrometro de massas Finnigan ion trap LCQduo).

De forma similar, um nanomol do peptídeo Vm24 en forma homogênea (re- purificado como mostrado no inserto a direita da Fig. 1) foi submetido a degradação automá- tica de Edman, a qual permitiu a identificação dos primeiros 28 resíduos de aminoácidos (Fig.2, maçado Vm24). Análise realizada com várias alíquotas do peptídeo reduzido e alqui- Iado foi UtiIIizado para confirmação dos resíduos de cisteínas e para digestões com endo- peptidases. A digestão de Vm24 com endopeptidase Arg-C produziu três sub-peptídeos, um que confirmou a seqüência dos resíduos Alai até Arg17 (não indicado na figura porque ele possui a mesma seqüência N-terminal já determinada quando analizado o peptídeo nativo, marcado abaixo "direto"); outro de Ala18 até Arg29 indicado pela marcação abaixo "Arg-C1 e o último de Lis30 até Cis36 (marcado abaixo Arg-C2). Estas seqüências foram obtidas por degradação de Edman em combinação com fragmentação por MS/MS (ver Fig 2, Vm24). Desde que os últimos resíduos foram analizados por CID (collision induced dissociation), os aminoácidos nas posições 30 a 32 poderiam ter sido Iisina ou glutamina (massas molecula- res muito próximas). Para resolver a ambigüidade uma clivagem enzimática adicional com tripsina foi realizada com este último sub-peptídeo. Três pequenos peptídeos foram separa- dos por HPLC, cujas seqüências de aminoácidos determinadas por CID foram identificadas por estarem nas posições Cis26 a Lis30 (marcado abaixo Trp1), Cis 26 a Lis32 (não indica- da, para simplificar a anotação) e Cis33 a Cis36 (também não indicada). Já que tripsina cor- ta as ligações peptídicas no C-terminal de lisinas, estas duas posições foram determinadas ser resíduos de lisinas, resolvendo a ambigüidade da seqüência completa. Os últimos quatro aminoácidos finais do C-terminal foram também identificados por fragmentação MS/MS do peptídeo isolado depois da hidrólise com endoprotease Lis-C (marcado abaixo Lys-C). A massa molecular teórica média do peptídeo esperado, assumindo um aminoácido C-terminal amidado, foi 3863.64 Da e o valor experimental encontrado foi 3864.0 Da. Já que a exatidão dos espectrômetros ion-traps tri-dimensionais está na ordem de 100 ppm para peptídeos abaixo de 1,000 Da, a pequena diferença de 0,36 unidades está dentro do valor esperado (para referência sobre a exatidão do equipamento ver [Aebersold e Goodlett, 2001]).

Com relevância para esta invenção é importante destacar cinco características da Vm23 e Vm24:

1) Suas estruturas, quando comparadas com todas as outras toxinas de escorpião conhecidas até o momento, possuem mais de 50% de diferença (ver exemplo 6 abaixo). Este fato justifica a existência de uma nova família (desconhecida até hoje), proposta aqui ser o número a-KTx 21; exemplos a-KTx 21.1 e a-KTx 21.2. Esta é uma conytibuição origi- nal e definitivamente mostra que ambos peptídeos são estruturalmente diferentes de qual- quer outro ligando, incluindo os de anêmona marinha e peptídeos de venenos de abelhas e serpentes.

2) Os segmentos N-terminais de ambas seqüências até o aminoácido na posição são idênticos e 7 de 8 posições de cisteínas que mantém as pontes de dissulfeto estão em idênticas localizações na estrutura primária. A oitava cisteína (C8) de Vm23 está locali- zada na posição 35, no lado extremo do C-terminal, um animo ácido antes quando compa- rado com a Vm24. Por esta razão Vm24 tem 36 resíduos, enquanto Vm23 tem 35 resíduos de aminoácidos. A última cisteína de Vm23 não está amidada, mas nós assumimos que o dobramento estrutural é o mesmo da Vm24. Já que os efeitos fisiológicos de ambos, Vm23 e Vm24, são comparáveis, se espera que a seqüência de aminoácidos da região N-terminal seja crucial para a atividade. Quando se compara as estruturas primárias de Vm23 e Vm24 cinco diferenças foram encontradas nas posições: 10,13, 17, 23 e 29 , e uma deleção entre o último aminoácido e o prévio (Y34 na Vm23 e Y35 na Vm24). A região mais variável está na parte central de ambos peptídeos (resíduos 10 ao 30, onde cinco das seis diferenças estão localizadas), sugerindo que possivelmente estes resíduos não são críticos para a fun- ção de qualquer um dos peptídeos. Vale a pena mencionar que as substituições nas posi- ções 17 (R/K), 23 (N/S) e 29 (R/K) são modificações conservativas, porque ambas arginina (R) e Iisina (K) são aminoácidos carregados positivamente, enquanto asparagina (N) e seri- na (S) são resíduos de aminoácidos hidrofílicos não carregados. A falta de tirosina na posi- ção 35 (substituída por cisteína na Vm23) quando comparada com a Vm24, sugere que a- penas uma tirosina é suficiente para a mesma estruturação e função dos dois peptídeos.

3) A região mais variável está então localizada na parte central, conferida por subs- tituições conservadas. Isto pode ser desenhado facilmente por um especialista na área e, modificações ou substituições por aminoácidos com propriedades físico-químicas similares em posições alinhadas que compartem pelo menos 83% por pares de seqüência idêntica (como mostrado aqui para o caso da Vm23 e Vm24) são esperados gerar um análogo fun- cional equivalente com propriedades semelhantes e deverá cair dentro da abrangência da presente invenção.

4) A característica mais importante entretanto, como mostrado e discutido nos e- xemplos de 7 a 10 abaixo, é a alta afinidade que ambos Vm23 e Vm24 tem sobre os canais hKv1.3, quando comparados com outros sub-tipos de canais de potássio. Vm23 e Vm24 tem uma maior afinidade sobre os canais hKvl .3 que outros conhecidos bloqueadores, tais co- mo caribdotoxina, anurotoxina, BgK, ShK1 etc. [Panyi e outro, 2006], Os outros bloqueadores mencionados acima possuem seqüências de aminoácidos muito diferentes e/ou pares de dissulfeto ou possuem uma distinta especificidade e afinidade de ligação aos canais Kv1.3. Com uma simples análise da estrutura primária de Vm23 e Vm24 não é óbvio que eles pos- sam afetar canais Kv1.3 de maneira similar àqueles mostrados por outras toxinas de escor- 10

15

20

25

30

35

pião ou anêmona marinha. Desta forma, as seqüências pelas quais a propriedade de infor- mação e uso é reinvindicado aqui de Vm23 e Vm24 poderiam não ser evidente baseado no conhecimento de outros peptídeos que afetam canais Kv1.3. Esta invenção reporta seqüên- cias de aminoácidos (see SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2) completamente distintas e novas. Mais evidência mostrando que a determinação da seqüência é correta vem dos resultados obtidos com um preparado sintético da Vm24. Ambas, nativa e sinteticamente preparada, têm exatamente as mesmas ações fisiológicas, como mostrado abaixo (exemplo 9).

5) Finalmente, outro importante fato encontrado com estes dois peptídeos é que e- Ies não são tóxicos quando injetados em animais experimentais a concentrações reativa- mente altas (até 10,000 microgramas por grama de peso de camundongo). Isto é mais signi- ficativo quando nós comparamos com outras toxinas de venenos de escorpião, por exemplo a Cn2 de Centruroides noxius, como mencionado previamente [Zamudio e outro, 1992], Cn2

injetada em camundongos com doses de até 800 vezes mais baixas do que Vm24 causa 50% de mortalidade.

Exemplo 2: Análise da impressão digital de massas dos componentes presentes no veneno de V. Mexicanus

Venenos de escorpião são mixturas altamente complejas de componentes, que comprendem peptídeos de cadeias curtas e longas que são ativos em canais iônicos [revi- sado em [Possani e Rodríguez de Ia Vega, 2006], aminoácidos livres, nucleotídeos, carbohi- dratos, lipídios (revisado em Possani e outro, 1999), enzimas como fosfolipases [Zamudio e outro 1997, Valdez e outro 2004], hialuronidases e Iisozimas [Batista e outro, 2007] e muitos outros componentes de função desconhecida [Diego-Gracía e outro, 2007]. Adicionalmente, escorpiões são criaturas muito antigas com mais de trezentos milhões de anos de evolução na superfície da terra e tem tido tempo para selecionar ferramentas específicas para caçar suas presas ou para defender a eles mesmos de predadores. Por estas razões se constitu- em em um apelo sábio a pesquisa da presença de componentes biologicamente ativos em seus venenos. Graças ao recente avanço na metodologia da espectrometria de massas e equipamentos é agora possível obter análise de impressão digital de massas moleculares de venenos totais. Por estas razões um dos primeiros estudos conduzidos com o veneno solúvel de \/. Mexicanus foi a identificação das massas moleculares de todos os componen- tes, que pudessem ser determinados através do uso de um espectrómetro de massas (ESI/MS) Finnigan LCQduo (San Jose, CA) e de um espectrómetro MALDI-TOF (Matrix- Assisted Laser Desorption/lonization-Time of Flight) modelo Ettan MALDI-TOF/Pro da Amer- sham Biosciences (Uppsala, Sweden). A estratégia usada foi pré-selecionar por separação por HPLC os peptídeos puros ou famílias de componentes relacionados eluindo como mixtu- ras na coluna C18 de fase reversa (Fig 1.) e então analisar suas massas moleculares por espectrometria de massas. Na Tabela 1, os tempos de retenção das frações coletadas do 10

15

sistema de HPLC são listados seguidos pelas massas moleculares dos componentes encon- trados em cada fração. Mais de 340 diferentes massas moleculares foram detrminadas. É importante mencionar que alguns componentes aparecem em duas sub-frações contíguas do sistema de separação por HPLC e, em muitos casos, somente uma foi contada. Algumas frações também não foram identificadas (marcadas ND). Componentes marcados com ne- grito significa que eles estão presentes em mais altas concentrações no veneno, enquanto aqueles marcados com itálico significa que o componente foi identificado somente pelo es- pectrômetro ESI/MS. Quando o tempo de retenção é precedido pela letra S significa que o pico cromatográfico não foi simétrico e a fração coletada corresponde ao segmento ascen- dente da curva, enquanto a letra B significa o segmento descendente da curva. Alguns valo- res não foram determinados (ND).

Os vários componentes registrados na Tabela 1 foram analizados e arbitrariamente agrupados de acordo com seus pesos moleculares em aumentos de mila, começando com aqueles de menos de 500 Da, então de 500-1000, 1000-2000 e assim por diante até 9000- 10000 Da (cada grupo por diferença de 1000). Mais de 90% dos componentes identificados possuem massas moleculars abaixo de 10,000 Da. Três grupos tem pelo menos 60 compo- nentes diferentes. Eles caem dentro da abrangência de 1000-2000; 2000-3000 e 3000 a 4000 Da. Mais de 40 componentes possuem massas moleculares de 4000 a 5000 Da.

Estes resultados foram importantes para escolher os peptídeos para a análise fun- cional. O uso racional é discutido e publicado em uma recente publicação realizada por nos- so grupo usando o escorpião Tityus stigmurus [Batista e outro, 2007], no qual uma análise comparativa é realizada tomando em consideração várias análises de impressão digital de massas de diferentes espécies de escorpião (V. Mexicanus não está incluído). É comum encontrar que peptídeos com pesos moleculares na ordem de 4,000 Da são específicos pa- ra o reconhecimento de canais iônicos permeáveis a íons K+. Por esta razão nós seleciona- mos peptídeos dentro desta faixa de massas moleculares para os estudos fisiológicos, des- critos abaixo. Seguindo esta estratégia os dois peptídeos, Vm23 e Vm24, foram seleciona- dos para determinação da estrutura primária (Fig 2.) e detalhados ensaios fisiológicos (ver abaixo, exemplos 7-10).

Exemplo 3: Caracterização da seqüência de aminoácidos C-terminal de Vm23 e

Vm24

Com relação ao último resíduo de aminoácido da seqüência C-terminal de Vm23 os

resultados são claros. A análise de seqüência descrita no exemplo 1 desta exposição, cuja

seqüência é mostrada na figura 2, deixa pouca dúvida que o último aminoácido não está

amidado e termina a estrutura primária com um resíduo de cisteína com grupo carboxilo livre.

Entretanto para Vm24 os resultados de espectrometria de massas sugerem que o

0 resíduo C-terminal poderia estar amidado. A literatura reporta exemplos onde a amidação do último aminoácido de um dado peptídeo é importante para definir sua função biológica. Um destes exemplos é o caso reportado para a toxina HsTxI do escorpião Heterometrus spinni- fer [Lebrum e outro, 1997], Experimentos eletrofisiológicos tem demonstrado que a forma amidada desta toxina é cinco vezes mais potente do que a forma com o carboxilo terminal livre e é até 300 vezes mais ativo nos experimentos de ligação a sinaptossomas cerebrais de rato [Lebrum e outro, 1997], Por esta razão foi muito importante estar seguro da forma química do último aminoácido de Vm24. Como mencionado na discussão do exemplo 1, a massa molecular experimental encontrada para Vm24 foi de 3864 Da e o peso molecular teórico esperado da seqüência de aminoácidos mostrada na Fig 2. foi 3864.6 Da. Os dois valores diferem por 0,6 a.m.u., o qual poderia ser atribuído a presença de uma amidação no resíduo C-terminal de Vm24. Experimentos de CID (collision-induced dissociation) realiza- dos com o peptídeo C-terminal (909.4 a.m.u.-massa monoisotópica) produzido por clivagem com Arg-C mostrou todas os valores da série iônica y com valores de 1.0 a.m.u menores do que aquelas teoricamente esperadas para um peptídeo com um grupo carboxílico terminal

livre e valores exatos para a série iônica b, confirmando que o C-terminal da toxina está a- midado (Fig. 3).

Para este experimento uma alíquota de 25 microgramas de proteína de Vm24 foi enzimaticamente clivada com a enzima Arg-C, usando o mesmo procedimento descrito no exemplo 1 acima [Valdez e outro, 2004; Batista e outro, 2007], O produto da hidrólise enzi- mática foi separado por HPLC no mesmo sistema descrito na Fig. 1. Todos os peptídeos em forma homogênea foram sistematicamente analizados por espectrometria de massas e o peptídeo com massa molecular de 909.5 a.m.u. foi submetido a análise por MS/MS. O pro- tocolo experimental determinado para a fonte de ionização por nanospray do espectrómetro ) de massas foi 130°C para o capilar de aquecimento e 1.65 kV de voltagem do spray. O sis- tema de liberação do solvente Surveyor foi operado com 0,6 microlitros por minuto usando acetonitrila (AcCN) a 50% em modo linear. Os escaneamentos por MS/MS foram definidos com 200 escaneamentos/milisegundos de tempo de injeção, banda larga ativada, 25 V de energia de colisão, 1.0 (m/z) de largura de isolamento e 40% de energia de colisão normali- zada. Os dados foram analizados manual e automaticamente usando a ferramenta "MS- product" do "Protein Prospector" (http:prospector.ucsf.edu/) desenvolvido pela Universidade da Califórnia - San Francisco Mass Spectrometry Facility. A ferramenta "MS-product" permi- tiu estimar os possíveis fragmentos iônicos produzidos pelo peptídeo KCKCYYC usando massas monoisotópicas, cisteínas não modificadas e resíduo N-terminal não-bloqueado. Os cálculos foram realizados para ambos, terminal carboxílico livre e C-terminal amidado. Um instrumento ESI-Ion Trap foi escolhido para esta avaliação. Os fragmentos teóricos do pep- tídeo com C-terminal amidado foi realizado usando o Protein Prospector, o qual mostrou 10

15

20

exatamente os mesmos valores dos obtidos experimentalmente para a série b (232.11,

360.21, 463.22, 626.28 e 789.34) e para os íons (782.27, 679.26, 551.16, 448.15, 285.09 e

122.03). Portanto, o peptídeo Vm24 possui um C-terminal amidado, que é um resíduo cistei- namida.

Exemplo 4: Determinação das pontes de dissulfeto de Vm24

Devido a seu pequeno tamanho, Vm24 é uma molécula ideal para estudos de rela- ção estrutura-atividade. Os peptídeos contêm oito resíduos de cisteína, localizados nas po- siçoes 6, 12, 16, 21, 26, 31, 33 e 36, que formam quatro pontes de dissulfeto intramolecula- res. Este exemplo descreve a determinação do padrão de ligação de dissulfuros de Vm24 usando degradação de Edman e espectrometria de massas dos peptídeos purificados por colunas de HPLC de fase reversa, após clivagem com enzimas proteolíticas.

Os pares de dissulfetos foram determinados por análisis por espectrometria de massas dos fragmentos peptídicos obtidos após clivagem da toxina pura e sua separação por HPLC. Uma amostra de toxina contendo 25 microgramas de proteína foi incubada com uma mixtura igual (0.5 microgramas de cada) de quimiotripsina e tripsina (Boehring Ma- nheim, Germany) em 150 mM de Tris-HCI, pH 6.8, por 12 h a 37° C. Os peptídeos genera- dos foram separados por HPLC usando uma columna C18 de fase reversa (Catálogo núme- ro 218TP54, da Vydac, Hisperia, CA). Um gradiente linear de solvente A (0.12% de TFA em água) até 60% de solvente B (0.10% de TFA em acetonitrila) foi aplicado a coluna e corrido por 60 minutos. Os picos efluentes foram coletados e imediatamente secos a baixa tempera- tura. Os peptídeos foram analizados de forma individual por fragmentação espectrométrica (MS/MS) do qual a seqüência de aminoácidos foi obtida. Já que a seqüência de aminoáci- dos era conhecida, a determinação das pontes de dissulfeto poderia ser inferida.

A comparação das massas moleculares das formas reduzidas e oxidadas de Vm24 mostra exatamente a diferença de 8 a.m.u.; a massas molecular experimental encontrada para o peptídeo nativo foi de 3864.0 a.m.u. e para a forma completamente reduzida foi de 3872 a.m.u., confirmando que todas as cisteínas estão envolvidas na formação das pontes de dissulfeto. Três fragmentos peptídicos principais foram obtidos da digestão simultânea com quimiotripsina e tripsina a pH 6.8 (pH levemente ácido para prevenir rearranjo e mixtura de dissulfetos), mostrando massas moleculares mono isotópicas de [M+Hf 788.0, [M+H]+ 560.4 e [M+2H]2+ 1099.7 a.m.u. (Figs 4-1, 4-2 e 5A). O peptídeo com [M+H]+ 788.0 corres- ponde exatamente ao peso molecular esperado para o par de cisteínas (C4-C8) do hetero- dímero com seqüência de aminoácidos AQGCK-CY (Fig 4-1). A segunda ponte de dissulfeto determinada foi C3-C6 que possui valores teóricos e experimentais iguais de 560.4 a.m.u. (Fig 4-2). Ambos peptídeos foram amplamente caracterizados por experimentos de CID mostrando a esperada seqüência de aminoácidos. O sinal a m/z [M+2H]2+ 1000.7 a.m.u. (2197.4 massa deconvolucionada) vem do núcleo do heterodímero que contém os últimos 10

15

20

dois pares de cisteínas (Fig. 5a). Este fragmento foi diretamente analizado. As séries ionicas produzidas por CID do sinal a m/z [M+2H]2+ 1000.7 mostra dois valores de ions que satisfa- zem a condição para a completa determinação dos dois últimos pares de cisteínas. O ion b de 1507.4 e o ion y de 691.3 que são produtos da clivagem da mesma ligação amídica entre o ácido glutâmico (E11) e a cisteína (C12) claramente determina os pares C1-C5 e C2-C7. Além do mais, os valores da fragmentação em cadeia do ion b 1710.5 ao ion b 1137.3 ca- racteriza o fragmento interno (GSPEC-C) com valores de massas inequívocos confirmando o arranjo das pontes de dissulfeto esquematicamente representado na Fig. 5B.

Exemplo 5: Síntese química de Vm24

Neste exemplo, e antes de descrever a síntese química de Vm24, é importante re- ver alguns conceitos básicos no tema da química de peptídeos e o raciocínio para a produ- ção de Iigandos por síntese química, ao invés da extração de produtos naturais já existen- tes.

Muitos polipeptídeos tóxicos foram purificados a partir de venenos e foram demons- trados ser ferramentas valiosas para o estudo da comunicação celular, porque eles afetam a distribuião iônica através de membranas biológicas pela ligação a receptores (principalmen- te canais iônicos para o caso das toxinas de escorpião) e causam polarização celular ou modulação de potenciais elétricos através da membrana, controlando desta forma a função celular. Por estas razões, a descroberta de peptídeos tóxicos que podem discriminar diferen- tes tipos ou sub-tipos de canais iônicos são valiosos fármacos potenciais no tratamento de condições fisiológicas normais e anormais em animais de experimentação e, eventualmente, para o tratamento de patologias humanas. Muitos dos peptídeos conhecidos são pequenos, bem estruturados e empacotados apresentando uma série de vantagens sobre outros com- postos orgânicos, como alta potência, boa especificidade, alta solubilidade e pricípio rápido de ação. Além do mais eles são em geral pequenas proteínas intercruzadas por diversas pontes de dissulfuro. Estas características estruturais conferem a estes péptidos um alto grau de estabilidade, embora a correta estruturação de um derivado preparado sintetica- mente possui alguns problemas adicionais para uma síntese apropriada. Entretanto, as quantidades destes polipeptídeos presente nos venenos são em geral muito pequenas. Na verdade, já que eles são tão específicos e eficientes em suas ações fisiológicas, os animais que produzem estes peptídeos não necessitam produzir grandes quantidades para usar-los de uma maneira efetiva, ambos, para capturar suas presas ou defender-se de predadores. Embora a quantidade destes diferentes peptídeos isolados diretamente da fonte usualmente são suficientes para caracterizar o mecanismo geral de ação e tem permitido no passado, a condução da caracterização estrutural de peptídeos, principalmente por técnicas de resso- nância magnética nuclear é necessário produzir o mesmo peptídeo ou seus derivados sinté- ticos, dependendo do alcance requerido na investigação ou aplicações clínicas. A determi- 10

15

20

nação da estrutura tri-dimensional de peptídeos e a identificação de superfícies implicadas no reconhecimento de partes de um receptor (canais iônicos) são fundamentais para o de- senho de versões modificadas do modelo inicial ou para a síntese de peptídeomiméticos.

Aqui nós descrevemos a síntese química de Vm24. Historicamente Vm24 foi identi- ficada primeiro que a Vm23. Por esta razão, muito do trabalho detalhado, objeto desta in- venção, foi feito e descrito aqui por causa da Vm24 e então foi confirmada ser verdadeira para ambos peptídeos.

Um análogo linear da Vm24 foi sintetizado através da metodologia de fase-sólida sobre resina Rink Amide MBHA (Calbiochem-Novabiochem Corp). Aminoácidos Fmoc (Cal- biochem-Novabiochem Corp) foram usados com os seguintes grupos protetores de cadeia lateral Arg(Pbf)1 Asn(Trt)1 Cys (Trt)1 GIn(Trt)1 GIu(OtBu)1 Lys (Boc)1 Ser(tBu) e Tyr(tBu).

O grupo Fmoc foi removido pelo tratamento com 20% de piperidina em dimetilfor- mamida (DMF) por 20 min seguido de lavagem com DMF. Os aminoácidos Fmoc (0.5 mmol) foram acoplados como ésteres ativos pré-formados em DMF com HBTU (2-(1-H- benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametyl-uroniuim hexafluorofosfato)/DIEA (Diisopropiletilamina (0.45 mmol/0.75 mmol, 2 min de ativacao) como agentes ativantes. Os tempos de ativação foram de 30 min. Aminas livres não reativas ou desbloqueadas foram monitoradas através do teste de ninhidrina (Sarin e outro, 1881) em cada ciclo da síntese de peptídeos. Durante toda a síntese, antes de acoplar o seguinte aminoácido, os resíduos de aminas livres não desejáveis foram bloqueadas por acetilação. Todas as operações foram realizadas manual- mente em ampola de reação de vidro de 50 ml com tampa de rosca de teflon. A resina pep- tídica foi agitada por inversão suave durante a desproteção dos <x-N e etapas de acoplamen- to.

Para a remoção final dos grupos Fmoc, a resina peptídica (1.7 gramas) foi clivada da resina e simultaneamente desprotegida usando reagente K [Drakopoulou e outro, 1995] por duas horas a temperatura ambiente. Seguido a clivagem, o peptídeo bruto foi precipitado e lavado com éter t-butílico em gelo e então dissolvido em solução aquosa de ácido acético a 20%. O produto foi Iiofilizado e mantido em dessecador a -20°C até seu uso.

A reação de ciclização para obter as pontes de dissulfeto correspondentes da mo- lécula foi realizada em 0,1 M de NaCI1 5 mM de glutation reduzido, 0,5mM de glutation oxi- dado, 20 mM de Na2HPO2 (pH7.8) e 30 uM de Vm24 sintético não estruturado. O produto bruto ciclizado foi purificado em duas etapas por HLC. Na primeira se usou uma coluna C18 preparativa (238TP1022, Vydac), com um gradiente linear de solução A (0.12% de TFA em água) a solução B (0.1% de TFA em acetonitrila) corrida até 60% de B em 60 min. O perfil cromatográfico obtido é mostrado na Fig. 6. O componente principal (marcado como número 1 na figura 6), foi finalmente purificado usando uma coluna C18 analítica (218TP54, Vydac) corrida com gradiente linear de solvente A até 40% de solvente B em 60 min (inserto da Fig. 15

6). A estrutura e a pureza da toxina sintética foram confirmadas por HPLC analítico, seqüên- cia de aminoácidos e por determinação espectrométrica. A seqüência de aminoácidos foi realizada em um sequênciador de proteínas Beckman LF3000 (Fullerton1 CA) e a análise por espectrometria de massas foi feita em um espectrômetro Finnigan LCQduo (San Jose1 CA1 USA). A seqüência correta de aminoácidos foi verificada diretamente por degradação de Edman até o resíduo 30. O tempo de eluição da coluna de HPLC coincidiu exatamente com o tempo onde o peptídeo nativo elui da mesma coluna em idênticas condições. Exem- plos do padrão de eluição obtida com o peptídeo nativo Vm24 (Fig. 7A), Vm24 sintético co- mo é descrito qui (Fig. 7B) e uma mixtura equimolar de Vm24 nativo e sintético (Fig. 7C) são mostrados na figura 7. A determinação da massa molecular por espectrometria de massas foi 3864 Da1 mostrando que ele corresponde exatamente a seqüência esperada. É importan- te mencionar que a resina usada é desenhada para a produção de peptídeos com C- terminal amidado, exatamente como é o caso de Vm24.

Das aproximadamente 1.7 gramas de resina contendo o peptídeo sinteticamente preparado com a seqüência primária esperada para Vm24, foram obtidas 300 miligramas de peptídeo corretamente estruturado, representando um rendimento de 30% do valor teórico esperado (da resina inicial).

Exemplo 6: Comparação da seqüência de aminoácidos

As seqüências de SEQ ID No:1 e SEQ ID No:2 mostram alguma semelhança com outras toxinas de escoprião de cadeia curta classificadas dentro da família α-KTx [Tytgat e outro, 1999], como um peptídeo de cadeia curta, rico em resíduos de aminoácidos básicos e padrão similar de cisteínas. Todos os membros desta família são estruturalmente relaciona- dos e realizam funções similares como bloqueadores de canais de potássio; não obstante eles apresentam seletividade variável para certos tipos e sub-tipos de canais de potássio > [Rodríguez de Ia Vega e Possani, 2004; Panyi e outro, 2006], O raciocínio seguido por um painel internacional de especialistas os quais propuseram a classificação foi que uma dada subfamília poderia ser identificada por um alto porcentage de similaridade entre seus mem- bros e uma baixa identidade com membros de outras subfamílias [Tytgat e outro, 1999], Mais tarde isso foi demonstrado que esta distinção reflexa, até certo ponto, o espectro far- macológico de muitas famílias e subfamílias [Rodríguez de Ia Verga e outro, 2003; Zhu e outro, 2004]. Assim, tomando em consideração a estrita relação variabilidade da família - devido ao seu reduzido tamanho - isto é importante para identificar as características mole- culares e estruturais que confere dado espectro funcional. Este tipo de análise é usualmente realizado pela comparação de seqüência e inferência filogenética. A idéia subjacente destas comparações se basa no pressuposto que estas proteínas pertencem a mesma linhagem, deveria ser relacionado por eventos de especiação seguido ou concomitantemente com a duplicação e divergência do gen (s) ancestral, tornando possível a reconstrução de suas 10

15

histórias evolutivas por análise bioinformática e ajudando a depurar uma melhor paisagem

dentro de um dado espaço de seqüência [Thornton and DeSaIIe1 2000; Orengo and Thorn- ton, 2005],

Usando programas que realizam pesquisas heurísticas dentro de alinhamentos lo- cais (BLAST [Altschul e outro, 1990] e FASTA 3 [Pearson and Lipman, 1988]) para a identifi- cação de seqüências similares de Vm24 e Vm23, poucos relativos foram identificados com muito baixos valores de probabilidade (valor E>10-5). Uma inspeção mais próxima contra todas as toxinas de cadeia curta reportadas até esta data sugere que Vm24 e Vm23 são possivelmente novos membros da sub-família α-KTx (seguindo a proposta de [Tytgat e ou- tro, 1999]). A comparação por pares, entretanto, revela baixa identidade com outros mem- bros da sub-família (Figura 8). A extensiva diversificação de seqüência da família a-KTx torna muito difícil resolver se Vm23 e Vm24 pertencem ou não a qualquer das 20 sub- familias de α-KTx previamente caracterizadas. Para esclarecer a relação com a família <x- KTx, análise de inferência filogenética Bayesiana como descreveu previamente [Bagdany e outro, 2005]) com MrBayes 3.04b [Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist e Huelsen- beck, 2003], usando um alinhamento seqüencial múltiplo de 92 seqüências pertencentes a família α-KTx. Inferência filogenética Bayesiana estima a probabilidade posterior de uma dada árvore topológica através de uma cadeia Markov baseada em um processo de amos- tragem Monte Cario (MCMC) sobre árvores geradas estocasticamente sobre n-1. Uma ca- deia Markov permanece heuristicamente pesquisando dentro da topologia da árvore com melhores probabilidades posteriores em uma dada etapa do processo de amostragem; ava- liado sobre um modelo de substituição específica de um aminoácido (todo o processo é chamado Metrópolis acoplando-se a uma cadeia Monte Cario ou MC3). Para esta análise, quatro cadeias com 250,000 árvores foram geradas sobre o modelo de substituição JTT e amostrado a cada 250 interações. A coalescência foi obtida aproximadamente a 175,000 interações e as 250 árvores remanescentes com melhor probabilidade posterior foram fun- didas para calcular uma árvore concenso de regra majoritária de 50%. Esta árvore mostra claramente que a sub-família α-KTx segrega 6, em 92% do ajuste da árvore final, como um grupo monofilético incluindo todos seus membros e duas toxinas muito relacionadas da fa- mília 7. A análise também coloca Vm23 e Vm24 como um grupo de irmãs desta clade (a partição específica prevalece em 81% das árvores finais, ver Figura 8); os quais fortemente suportam que Vm24 e Vm23 constituem uma nova sub-família α-KTx. Baseado nestas aná- lises e tomando em considerção as orientações propostas pelo painel internacional de espe- cialistas que classificou as toxinas de escorpião específicas para canais de K [Tytgat e ou- tro, 1999] é correto que Vm23 eVm24 constituem uma nova sub-família de toxinas de escor- pião que reconhecem canais de Κ. A mais alta identidade de seqüência entre estas toxinas esta localizado na porção C-terminal, como outras sub-famílias de bloqueadores de canais

20

25

30 de Κ. O segmento N-terminal é a porcao mais variável desta sub-família e somente Vm24 e

Vm23 apresentam um incomum segmento contínuo de triplas Alaninas no começo da se- quência.

Exemplo 7: Vm24 bloqueia mais seletivamente canais hKvl .3 dependentes de vol- tagem do que os canais hlKCal ativados por Ca2+ de células T

Bloqueio de alta afinidade de canais hKv1.3por Vm24

O bloqueio de canais hKv1.3 por Vm24 foi caracterizado em canais expressos en- dogicamente em células T de sangue periférico humano [Reter e outro, 2001; Bagdany e outro, 2005], A seguir é mostrado uma breve descrição do procedimento para obter células T para os experimentos de eletrofisiologia. Sangue periférico humano heparinizado foi obtido de voluntários saudáveis. Célu.as mononucleares foram separadas por centrifugaçâo usan- do gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. As células coletadas foram lavadas duas vezes com solução de Hank livre de Ca2+ e Mg2+ contendo 25 mM de tampão HEPES (pH 7 4) As células foram cultivadas em uma incubadora con 5% de CQ2 a 37°C em placas de 24 poços em RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS/Hyclone (Logan, Utah, USA), 100 micro- gramas/m. de penicilina, 100 microgramas/ml de Streptomicina e 2mM de L-glutamina a 0 5 x 10 /ml de densiade por 3-4 dias. O meio de cultura também continha 6 ou 8 microgra- mas/ml de fitohemaglutinina A (PHA-P, SigmaAIdroch Kft, Hungria) para aumentar a expres- sao dos canais de potássio [Deutsch e outro, 1986], Os linfócitos T foram selecionados para registro de corrente pela incubação com CD2 anti-humano de camundongo (Becton- D,ckinson, Sa Jose, CA, USA) seguido de adesão seletiva a placas de Petri revestidas com anticorpo IgG de cabra anti-camundongo (Biosource, Cmarillo, CA, USA), como descrito por Matteson e Deutsch [Matteson e outro, 1984], As placas foram lavadas suavemente por cin-

co vezes com 1 ml de meio de extracelular norma, (ver abaixo) para os experimentos de to patch-clamp.

As corrente celulares totais foram medidas em células T clamped com voltagem u- sando amplificadores Axopatch 200A ou um Multiclamp 700B conectados a computadores usando os programas de aquisição de dados Axon Digidata ou Digidata 1322A Séries de compensação de resistência até 85% foram usadas para minimizar erros de voltagem e para encontrar boas condições para o Camp de voltagem. Para aquisição e análise dos dados foram usados os programas pClamp8 ou pClamp9 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale CA) Antes da análise os traços de corrente da célula total foram corrigidos por vazamento ôhmi- co e filtrado digitalmente (normalização de 3 pontos de bloco fechado). A determinação das correntes de pico a altos graus de bloco de corrente foi realizado pelo ajustamento da fun- ção exponencial de poder de quarto aumento aos dados de traço (Hodgkin-Huxley model)

com tempos constantes fixados aos determinados na ausência da toxina para isolar a ampli- tude do componente em aumento.

30 As pipetas foram obtidas da Clark GC 150 F-15 capilares de vidro de borosilicato em cinco estágios e polidos a fogo resultando em eletrodos com 2-3 mega Ohms de resis- tência no banho. A solução de banho consistiu de (in mM): 145 NaCI1 5 KCI1 1 MgCI2, 2.5 CaCI2l 5.5 glicose, 10 HEPES )pH 7.35) suplementado com 0,1 mg/ml de albumina de soro bovino (Sigma). As medidas de osmolaridade da solução externa foi entre 302 e 308 milios- mols (mOsm). A solução de enchimento da pipeta (solução interna) consistiu de (mM): 140 KF1 2 MgCI2l 1 CaCI2, 10 HEPES1 11 EGTA (pH 7.22). A medida de osmolaridade das solu- ções internas foi de aproximadamente 295 mOsm. A perfusão do banho ao redor da célula medida com diferentes soluções testes foi determinada usando parâmetros de perfusão de fluxo com gravidade com 6 linhas de entrada e ponta de saída com tubo de polietileno PE10

com borda levantada para reduzir a turbulência do fluxo. O excesso de fluído foi removido continuamente.

O protocolo padrão de voltage para evocar correntes de voltagem de K+ nas células T consistiram de uma série despolarizações de 14 ms de duração até +50 mV de um poten- ciai de repouso de -120 mV. O tempo entre os pulsos de voltagem foi determinado em 15 s para prevenir inativação cumulativa de canais kKv1.3. Traços de corrente representativos em soluções de banho normal são mostradas na Fig. 9A (controle). Sobre as condições ex- perimentais aplicadas (a falta de Ca2+ na solução de preenchimento da pipeta e a natureza do protocolo de voltagem) as correntes totais da célula foram conduzidas exclusivamente por canais hKvl .3 [Peter e outro, 2001]. Fig. 9A mostra correntes macroscópicas de K+ atra- vés dos canais hKv1.3 gravados seqüencialmente na mesma célula, antes (controle de tra- ços) e seguido da adição de 1nM de Vm24 a solução externa por perfusão. A corrente Kv1.3 desapareceu completamente com o 12° pulso (correspondendo a 3 min) na presença de InMde Vm24.

> A cinética de desenvolvimento do bloco a concentrações de 1 nM (círculos preen-

chidos) e 0,3 nM (círculos vazios) de Vm24 são mostrados na Fig. 9B. Seguindo o quarto pulso na solução controle, a perfusão extracelular foi trocada pela solução contendo a toxina e os pulsos despolarizantes continuados a cada 15 s. As correntes de pico foram determi- nadas e normalizadas com as correntes da solução controle e marcadas como função de tempo. A figura mostra que a altas concentrações da toxina, a cinética de desenvolvimento do bloco é mais rápida como se poderia esperar de uma reação de pseudo-primeira ordem entre a toxina e os canais, entretanto, ambas concentrações da toxina um bloco completo de corrente Kv1.3 da célula total foi encontrado. Dados para a concentração de 1 nM de Vm24 são dos experimentos mostrados na Fig.9A. Perfundindo a câmara de registro com solução controle da toxina livre resultou em uma pequena diminuição do bloco dentro dos primeiros 8 minutos (não mostrado). Durante um período de 10.5 min da aplicação da toxina a con- centração de 3 pM (Fig.9C) a perda de corrente parece saturar a -36% do pico registrado na 10

15

20

5

)

solução controle. Este período foi seguido por um período de 30 minutos de lavagem (a fle- cha indica o começo da perfusão com solução livre de toxina) durante o qual um terço da corrente bloqueada foi recuparada com uma cinética extremamente baixa (constante de

tempo estimada para a lavagem é -3800 s correspondendo a um índice de saída de -2 6 i x10-4S1).

O mecanismo geral pelo qual as toxinas de escorpião bloqueiam os canais de K+ é através do tamponamento da via de condução iônica por sua ligação ao vestíbulo extracelu- Iar do canal [Goldstein and Miller, 1993], A lenta ou incompleta reversibilidade da redução das correntes na presença de Vm24, entretanto, poderia indicar um efeito não específico do peptídeo sobre uma membrana ao invés de bloquear hKv1.3. Nós argumentamos contra esta possibilidade da seguinte maneira: 1) o índice para o desenvolvimento de perda de cor- rente (a altas concentrações da toxina) dependeu da concentração de Vm24, sendo mais alta a mais altas concentrações de toxina (Fig. 9B); 2) a fuga de corrente não aumentou na presença da toxina, indicando falta de dano geral da membrana por Vm24; 3) Vm24 não inibiu outras diferentes correntes de K+ ou inibiu rápida e reversivelmente (ver mais tarde no perfil de seletividade da toxina) que argumenta fortemente contra a ação não específica da toxina sobre a estrutura da membrana plasmática ou uma perda de função de proteínas de membrana em geral por indução da toxina; 4) a aplicação simultânea de ChTx1 um bloquea- dor de poro de Kv1.3 bem conhecido, e Vm24 mostrou competição entre as duas toxinas por o mesmo sítio de ligação, a qual foi evidente pela diminuição da cinética de bloqueio de Vm24 com aumentos da concentração de ChTx (dados não mostrados).

Os índices muito lentos de ligação e desligado da toxina impõem limitações na ge- ração da relação dose-resposta que são apresentados no painel D da Fig. 9. Em geral para o equilíbrio do bloco de canais a diferentes concentrações do peptídeo, a fração de corrente remanescente (RFC) é calculada como l/lo onde / e Io são as correntes de pico obtidas na presença e ausência da toxina, respectivamente. Devido ao lentíssimo índice de ligação a baixas concentrações do peptídeo a determinação de / foi problemática desde que uma caí- da na corrente do pico de episódio a episódio foi tão pequena que uma aparente saturação foi observada durante a coleta de dados, embora o bloco poderia ainda não ter alcançado seu valor de equilíbrio. O uso de aplicações mais longas da toxina foi limitada pela estabili- dade das correntes de pico obtida no patch clamp da célula total. Além do mais, a diminui- ção dos picos poderia não ser determinado de forma independente devido ao longo tempo de lavagem do peptídeo. Então, os dados apresentados na Fig. 9D representa os limites superiores para os valores l/lo a diferentes concentrações da toxina, portanto, a Kd estimada da relação dose-resposta é também um sobreestimado da Kd real. A relação dose-resposta na Fig 9D se ajusta com a função RCF=Kd7(Kd"+[Tx]"), onde [Tx] indica a concentração da toxina, Kd é a constante de dissociação e η é o coeficinete de Hill de ~1. A barra de erros 10

30

35

indica SEM (η= 3-6). O valor n~1 para o coeficiente de Hill indica que somente uma molécu- la interage com o canal (estequeometria 1:1). No melhor de nosso entendimento Vm24 tem a mais alta afinidade como bloqueador de hKv1.3 em ensaios de eletrofisiologia. Vm 24 é um bloqueador de baixa afinidade para canais hlKCai Como esboçado na introdução do exemplo 7, um dos mais importantes requerimen- tos para um peptídeo ser um imunossupressor seletivo é sua seletividade para canais Kv1.3 sobre IKCal. Os canais IKCaI são expressos endogicamente em células T [Grissmer e ou- tro, 1993]. As correntes carregadas por canais IKCaI podem ser medidas usando uma pipeta cheia de solução contendo uma concentração de 1 uM de Ca2+ livre, a qual é suficiente para ativar completamente estes canais [Grissmer et al 1993], Entretanto, a presença simultânea de canais Kv1.3 na mesma célula torna a caracterização farmacológica dos canais IKCaI difícil e restringe o estudo dos potenciais de membrana onde canais Kv1.3 não são ativados [Grissmer e outro, 1993; Bagdanyi e outro, 2005], Isto e o relativamente baixo número de canais IKCaI mesmo em células T ativadas, nos motivou a estudar farmacologicamente os IKCaI usando canais recombinantes.

O gen humano IKCaI etiquetado EGFP (AF033021) foi transferido para as células Cos-7 usando o reagente Lipofectamina de acordo com o protocolo do fabricante (Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA). O clone hlKCai etiquetado EGFP foi mostrado previamente ter idênticas propriedades biofísicas e farmacológicas que o IKCaI nativo de células T e assim tem sido usado amplamente em estudos farmacológicos [Wulff e outro, 2001], Células Cos-7 foram mantidas em condições de cultura padrão para células [Bagdanyi e outro, 2005], As correntes foram obtidas após 2-3 dias da transfecção. Transfectantes GFP positivas foram identificadas em um microscópio de fluorescência Nikon TE2000U e usadas para a obten- ção das correntes. A solução extracelular normal é a mesma descrita acima. A composição da solução de preenchimento da pipeta foi (em mM) 150 K-aspartato, 5 HEPES, 10 EGTA, 8.7 CaCI2 e 2 MgCI2 (pH 7.2). Esta solução continha 1 uM de Ca2+ livre para ativar comple- tamente a corrente hlKCai. Todas outras condições eperimentais (aquisição de dados, per- fusão, etc.) foram idênticas as descritas para os canais Kv1.3.

Rampas de voltagem com duração de 200 milisegundos de -120 mV a +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV foram usados para elicitar as correntes hlKCai em células Cos-7 (velocidade de subida de 0,85mV/ms). As rampas de voltagem foram realiza- das a cada 10 s. Os traços de corrente obtidos na ausência de Vm24 (controle) na Fiura 9E mostra que, pura, as correntes de hlKCai não dependentes de voltagem foram evocadas pelo protocolo de voltagem aplicado. O potencial reverso de corrente é -75mV, a qual é ca- racterística para uma condutância baseada na composição iônica das soluções de experi- mentação. Para correntes IKCaI o declive (slope:s) da relação linear corrente-voltagem pode ser usado para caracterizar as correntes do bloco [Grissmer e outro, 1993], O valor de s é

20

25 reduzido a -52% do controle em presença de 10nM de Vm24 durante os experimentos mos- trados na Fig. 9E, o equilíbrio do bloco é alcancado 4.5 min (27 episódios). A corrente do bloco é completamente invertida em 2.5 min mudando a perfusão para a solução extracelu- Iar livre de toxina (Fig. 9E, lavagem). As frações de corrente remanescentes a concentra- ções de 1 nM e 10 nM de Vm24 foram calculadas como s/s0 onde s e S0 são os declives da relação I-V evocados por rampas de voltagem na presença e ausência de Vm24, respecti- vamente e representados na Fig. 9F. As barras de erro indicam SEM para n=3 experimentos independentes. A concentração de 1 nM de Vm24 os canais IKCaI praticamente não são bloqueados (Fig. 9F) enquanto a mesma concentração do peptídeo bloqueia os canais Kv1.3 completamente (Fig. 9D). A Kd de Vm24 para hlKCal pode ser estimada de um mode- lo onde uma molécula de toxina interage com um canal para dar uma Kd de ~14nM. Consi- derando a Kd determinada para hKv1.3 (2.9 pM), a seletividade de Vm24 para hKv1.3 sobre hlKCal é pelo menos -4500 vezes.

Exemplo 8: Perfil de seletividade de Vm24

Todos os canais construídos usados neste estudo são rotinamente usados em en- saios farmacológicos e biofísicos e sua aplicabilidade é confirmado na lista de referências.

Transfeccões transitórias: Células Cos-7 foram usadas para expressar os canais Kv2.1 de ratos (rKv2.1, um gentil presente do Dr. S. Korn1 U. of Connecticut) [lmmke e outro, 1999]; Kv1.2 humano (hKv1.2, vetor pcDNA3/Hygro contendo a seqüência codificante com- pleta para Kv1.2, um gentil presente do Dr. S. Grissmer, U. of Ulm1 Germany) [Visan e outro, 2004]; Kv1.4 humano (hKv1.4AN:, o mutante de deleção da bola de inativaçao de Kv1.4, um gentil presente do Dr. D. Fedida, University of British Columbia, Vancouver, Canadá) [Kurata e outro, 2004]; e Nav1.5 (um gentil presente do Dr. R. Horn, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA, USA) [0'Leary e outro, 1995; Ahern e outro, 2005], Células tsA-201 foram usadas para expressar canais hBK (gen hSlol (U11058), em plasmídio pCI-neo, presente de Toshinori Hoshi, University of Pensilvania, Philadelphia, PA) [Avdonin e outro, 2003], To- dos estes clones de canais foram transitoriamente co-transfectados com um plamídio codifi- cante para a proteína verde fluorescente (GFP) a relações molares de 1:5 usando o reagen- te Lipofectamina 2000 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad1 CA, USA) e cultivado sobre condições padrão. As correntes foram adquiridas após 2-3 da trans- fecção. Transfectantes GFP positivas foram identificadas em um microscópio de florescên- cia Nikon TE2000U e usado para a gravação de correntes (índice >70% de sucesso para co- transfecção).

Linhagens Celulares Estáveis: Células L929 estavelmente expressando mKv1.1 e células MEL estavelmente expressando canais hKv1.5 tem sido descritos anteriormente [Grissmer e outro, 1994] e foram um gentil presente do Dr. Heike Wulff (UC Davis, CA, USA). Canais hERG foram expressados de uma forma estável em uma linhagem celular ΗΕΚ-239.

25

30

35

Correntes da célula total foram adquiridas como descrito no exemplo 7 Em todos os casos soluções extracelulares padrão de preenchimento da pipeta foram usados (ver exemplo 7) exceto para aquisição de correntes hBK onde a composição da solução de pre- enchimento da pipeta foi (em nM) 140 KCI1 10 EGTA1 9,69 CaC2l 5 HEPES (pH 7 2) A con- centro de Ca2+ livre desta solução foi de [Ca-]im=5 micromolar, a qual permitiu a aquisi- ção de correntes BK a potenciais despolarizantes moderados [Avdonin β outro 2003] Todos

as outras condições experimentais (aquisição de dados, princípios da análise, perfusão) toram as mesmas descritas no exemplo 7.

Traços de corrente obtidos para membros da família Kv1.1, hKvl 2 hKvl 3

hKv1.4AN, hKv1.5) em solução extracelular estandar (controle) sâo mostrados na Fig 10A ate 10E. Em todos os casos as células foram mantidas a -120 mV de potencial de repouso e repetidamente despolarizadas a +50 mV para elicitar as correntes. A duração dos pulsos de despolarizaçâo (indicados separadamente em cada painel da Fig. 10) foi flxada para permitir completa ativação das correntes e minimizar a inativaçâo. Em todos os casos foi dado suflciente tempo entre os pulsos no potencial de repouso (-120 mV) Para a completa recuperação dos canais de qualquer inativaçâo residual (intervalos de Interpulso variaram entre 15 e 30 segundos). A versão removida de inativaçâo rápida (tipo-N) de Kv1.4 foi usada neste estudo (hKv1.4AN, o N-terminai de 147 aminoãcidos foi deletado). Na ausência de inativaçâo tipo-N a determinação do bloco de corrente é mais fácil e mais precisa, já que as correntes de pico neste clone não são influenciados pelo processo de inativaçâo muito rápi- do (constante de tempo: 15-20 ms, [Kurata e outro, 2004J). No canal nativo devido a compe- tição entre ativação de corrente tempo-dependente e inativaçâo das correntes de pico são subestimados a qual complica a análise do bloco de corrente.

A figura 10 registra a corrente de traços adquirida antes da aplicação da toxina (controle), seguido da equilíbrio do bloco por 10nM de Vm24 e seguido de lavagem da toxi- na. A análise dos painéis indica que cs canais hKv1.4 e hKv1.5 são praticamente Insensi- ve,s a Vm24 (ver também a barra do gráfico na Fig. 12B). Entretanto, Vm24 em concentra- ção de 10 nM, a qual é -3500 vezes a Ka para hKv1.3, bloqueia os canais mKvl 1 (RCF=O,80±0,02, n=3) e canais hK»1.2 (RCF=0,54±0,08. n=3) significativamente. Além do mais, o bloqueio de hKv1.2 não é completamente reversível. O bloqueio de correntes de hKv1.3 a concentrações de 10 nM de Vm24 (adquiridos de células humanas T) é mostrado na Fig. 10C para melhor comparação de potência de Vm24 como um bloqueador de canais Kv1 (RCF=O,01±0,01, n=3). Devido ao significativo bloqueio de correntes de mKvl 1 e hKvl .2, Vm24 também foi testada em concentrações baixas (1 nM) (Fig.12A). A concentra- ção de 1 nM os valores de RCF foram 0,97±0,02 (n=3) e αβ«0.016 (n=3) para correntes de mKvll e hKv1.2, respectivamente. Dos valores de RCF a afinidade de Vm24 para estes canais podem ser estimados de um modelo onde uma molécula de toxina interage com um canal para dar valores de Kd entre 30-40 nM para mKv1.1 e entre 5-10 nM para hKv1.2. Considerando a Kd determinada para hKv1.3 (2,9 pM) a seletividade de Vm24 para hKv1.3 sobre mKv1.1 e hKv1.2 são pelo menos ~10000 vezes e 1500 vezes, respectivamente.

A potência da atividade de inibição de Vm24 de outros canais iônicos que tem signi- ficante efeito biológico e suscetibilidade para serem bloqueados por toxinas humanas tam- bém foram determinadas. Estas incluem os canais de potássio dependentes de voltagem rKv2.1 e hERG (Kv11.1), canal de K+ ativado por Ca2+ (Kcal.1) e o canal de sódio cardíaco dependente de voltagem Nav1.5. A Fig. 11 mostra correntes da célula total elicitados com protocolos de voltagem apropriados para um dado canal em solução extracelular padrão (controle). Correntes de pico Kv2.1 e Nav1.5 foram determinados de aquisições obtidas em resposta a despolarizações a +50mV e 0 mV, respectivamente, de um potencial de repouso de -120mV (Figs. 11A e 11 D). Células HEK 293 expressando canais hERG foram mantidas a -80mV, despolarizadas a +20 mV por 2.5 s para ativar e desativar os canais (Fig. 11B). Este foi seguido por um passo para -40 mV na qual canais inativados rapidamente se recu- peram e a corrente de pico hERG pode ser determinada. Este complicado protocolo de vol- tagem é padrão para adquirir correntes hERG. Canais BK são ativados pela despolarização da membrana (Fig. 11B), entretanto, a dependência de voltagem da probabilidade de aber- tura depende da concentração de Ca2+ intracelular livre. A uma concentração de 5 micromo- Iar de Ca2+ livre aplicada neste estudo, mais de 50% dos canais são ativados a +50mV, en- tão, a comparação dos efeitos de Vm24 a idênticos potenciais de membrana para aqueles usados para outros canais Kv é possível. A ativação completa dos canais BK exigiria [Ca2+] incompatível com aquisição estável Da célula inteira, contrariamente, a ativação completa dos canais BK a 5 micromolar livre de [Ca2+] exigiria despolarizações para >+100mV. Então, a combinação de 5 micromolar de [Ca2+] e um potencial de teste de +50 mV foi um acordo razoável para estudar o efeito de Vm24. O pulso de -120 mV que precede o pulso teste foi usado para avaliação do vazamento não específico. O potencial de repouso entre os proto- colos de pulso foi 0 mV na qual todos os canais Kv são completamente inativados reduzindo assim a possibilidade de contaminação das aquisições por correntes Kv endógenas espora- dicamente encontradas em células tsA-201. A este potencial de membrana os canais BK já são ativos, como está demonstrado por uma significativa corrente de repouso no começo do pulso.

Para testar os efeitos de Vm24 sobre diferentes canais mostrados na Fig 11, as cé- lulas foram repedidamente despolarizadas para elicitar correntes em diferentes soluções extracelulares. Fig. 11 mostra traços representativos de corrente adquiridos antes da aplica- ção da toxina (controle), seguido da aplicação de 10 nM de Vm24 por 4-7 min., e seguido da retirada (lavagem) da toxina. Todos os painéis da Fig. 11 mostram que as correntes regis- tradas na presença de Vm24 são indistinguíveis daquelas registradas em solução controle e depois da lavagem, indicando a falta de bloqueio destes canais. A análise estatística é re- presentada na Fig. 12B onde o significado e o SEM das frações de corrente remanescentes são mostradas na presença de 10 nM de Vm24 (n>3).

Os dados apresentados na Fig. 12 indicam que a ordem do potencial de bloqueio de Vm24 par vários canais de K é

hKvl .3»>hKv1.2>hlKCa1 >mKv1.1»>hKv1.4«hKv1.5»rKv2.1 »hERG«hBK«hNav1.5. Base- ado nos valores de Kd obtidos para hKvl .3 da relação dose-resposta e da estimativa de pon- to-único dos valores de Kd para os outros canais (por exemplo, calculado dos dados a 10nM de Vm24 e da fração remanescente de corrente assumindo uma estequeometria toxina- canal de 1:1) a seletividade de Vm24 para Kv1.3 sobre os outros canais testados neste es- tudo é >1500 vezes. Este valor está bem acima dos critérios geralmente aceitados para se- letividade [Giangiacomo et al., 2004], que é definido como a diferença de 100 vezes na constante de equilíbrio ou uma diferença na energia livre de ligação para uma ligação de a- KTx a dois diferentes canais de potássio, Ch 1 e Ch2 de AAGChi;ch2>2.72 kcal/mol.

Exemplo 9: Vm24 sintética é igualmente um potente bloqueador de hKv1.3 como a toxina natural.

Como foi descrito no Exemplo 5, considerações práticas e teóricas levaram a sínte- se química de Vm24. Como descrito, a estrutura e a pureza da toxina sintética foram confir- mados por HPLC analítico, seqüência de aminoácidos e determinação por espectrometria de massas. Todos estes procedimentos indicaram que a seqüência primária da Vm24 sinté- tica (sVm24) é idêntica a do péptideo natural. Além disso, o protocolo para a geração de sVm24 usou diferentes grupos protetores para os grupos tióis projetados para assegurar que a estruturação está restringida aos mesmos pares de dissulfeto como no peptídeo nati- vo. Estes dados, entretanto, não garantem que a atividade biológica do peptídeo seja manti- da. As superfícies complementares do canal e o peptídeo que media o bloqueio de alta afi- nidade são muito complicados e desviações mínimas da estrutura do peptídeo nativo pode- ria comprometer a eficiência de sVM24 no bloqueio de Kv1.3 [Giangiacomo e outro, 2004],

A atividade biológica de sVM24 foi testada sobre canais Kv1.3 de células T huma- nas. As condições esperimentais para este estudo foram exatamente as mesmas descritas no exemplo 7. Um linfócito T total patch clamped foi despolarizado repetidamente a +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV cada 30s na presença de diferentes soluções (Fig 13A). As correntes hKv1.3 medidas na ausência de sVm24 (controle) desapareceu gradual- mente e quase completamente sobre a aplicação de 100pM de sVm24 através do equipa- mento de perfusão. Após o 16° pulso a câmara de registro foi perfundida com uma solução extracelular livre de toxina. A remoção da toxina da solução de perfusão não resultou em uma significante diminuição do bloqueio em 5 minutos. Isto está mais claramente demons- trado na Figura 13B onde as correntes de pico, normalizadas àqueles registrados na solu- ção controle antes da aplicação de sVm24 (pico normalizado), são mostrados como uma função de tempo. As flechas indicam o começo da perfusão com sVm24 (100pM sVm24) e a mudança da perfusão para uma solução livre de toxina (lavagem). As frações de corrente remanescentes (RCF) medidas depois do equilíbrio do bloco com 10OpM de sVm24 ou Vn24 são comparadas na Figura 13B (n=6 e n=4, respectivamente, as barras indicam SEM) A

comparação estatística (teste /) indicou que sVm24 é tão potente como a toxina nativa no bloqueio dos canais Kv1.3.

Exemplo 10: Análise da atividade biológica de Vm23 sobre diferentes canais iônicos Os venenos de escorpiões contêm uma superabundância de peptídeos bioativos. O

veneno de uma dada espécie freqüentemente contém peptídeos com alto grau de identida- de de seqüência, como é o caso de Vm23 e Vm24 de V. Mexicanus (ver exemplo 1) Um alto grau de identidade de seqüência de peptídeos geralmente confere as atividades biológi- cas idênticas às moléculas individuais. Isto se origina do fato que a interação de toxinas peptidicas com o receptor da toxina localizado na parte exterior do vestíbulo dos canais é determinado por múltiplos mecanismos incluindo interações eletrostáticas de longo e curto prazo e interações de contato fechado, e os efeitos líquidos destes fatores determinam a afinidade de ligação e seletividade [Park e Miller, 1992; Peter etal., 2001; Giangiacomo e outro, 2004], Foi mostrado previamente que dois peptídeos do mesmo escorpião (Pi2 e Pi3 de P. imperator), diferem-se em apenas um aminoácido, ambos bloqueiam Kv1.3 em con- centrações sub-nanomolar [Peter e outro, 2001], Do trabalho pioneiro de Miller e colabora- dores [Goldstein e outro, 1994] é também evidente que mesmo substituições de aminoáci- dos não conservados em diversas posições da caribdotoxina são bem tolerados e a toxina retém sua atividade para os canais de potássio Shaker (por exemplo, T9K e N22K) Para verificar que as diferenças entre Vm23 e Vm24 não são significativas para mudar suas afini- dades e especificidade sobre Kv1.3 o perfil farmacológico de Vm23 foi também examinado em detalhes como é mostrado a abaixo.

A potência de bloqueio de canais de Vm23 foi testada em canais Kv1.3 de células T humanas e para canais mKv1.1, hKv11.2 e hlKCal. Estes canais foram incluídos no estudo ) baseado na baixa afinidade (mKv1.1, hKv11.2 e hlKCal) ou alta afinidade de bloqueio (Kv1.3) destes canais com o peptídeo relacionado, Vm24, o qual comparte 83% de identida- de de seqüência com Vm23. As condições experimentais foram exatamente as mesmas descritas para os canais correspondentes no exemplo 7 e Exemplo 8.

Um linfócito T de grampo de emplastro de célula total foi despolarizado repetida- mente a +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s na presença de dife- rentes soluções (Figura 14A). A corrente de hKv1.3 medida na ausência de Vm23 (controle) quase desapareceu completamente dentro dos 3.5 minutos sobre a administração de 10 nM 15

de Vm23 através do aparato de perfusão. O traço indicado como "10 nM de Vm23" foi regis- trado depois do equilíbrio do bloco. Após o 19° pulso a câmara de registro foi perfusionada com solução extracelular sem toxina (lavagem). A remoção da toxina da solução de perfu- são não resultou em uma diminuição significativa do bloqueio de hKv1.3 dentro de 2 minu- tos. As frações de corrente remanescentes (RCF) medidas após o equilíbrio do bloco com nM de Vm23 são mostradas na Figura 15 (n=5), as barras indicam SEM). Estes resulta- dos indicam que as características de Vm23 mediando o bloqueio de canais Kv1.3 são muito similares a aquelas mediadas por Vm24: o bloqueio é de alta afinidade e o offrate da toxina é extremamente baixo, além dos limites de tempo usados neste teste. A quantidade limitada de Vm23 (menos de 5% do veneno é Vm23) impediu a determinação da relação dose-

resposta de bloqueio de hKv1.3 e a comparação estatísta apropriada da constante de disso- ciação com a de Vm24.

A comparação de corrente registrada anteriormente (controle), 3,5 minutos depois da adição de 10 nM de Vm23 e seguido do esgotamento da toxina (2 min) mostrou que 10 nM de Vm 23 praticamente não bloqueiam ambos canais hlKCal ou mKv1.1 (Fig. 14C (ver detalhes experimentais nas secções correspondentes Exemplo 7 e Exemplo 8). A completa ausência de bloqueio de hlKCal por Vm23 é diferente do efeito de Vm24, a qual bloqueou -40% dos canais na mesma concentração (ver Fig 9F). Por outro lado, os canais hKv1.2 foram levemente bloqueados por 10 nM de Vm23 (Fig. 14D) para dar um valor de RCF de 0,91 ±0,02 (n=3, SEM, Fig. 15) e o bloqueio não foi rapidamente reversível dentro de 2 min. A mesma concentração de Vm24 bloqueou -46% dos canais (ver exemplo 8).

A comparação das frações de corrente remanescentes para hKv1.3, hlKCal, mKv1.1 e hKv1.2 na presença de 10 nM de Vm23 (Fig. 15) com os dados obtidos para Vm24 (Fig. 12A e B) indicam que o perfil de seletividade de Vm23 para hKv1.3 é levemente melhor para os canais testados. Pode também ser concluído a partir da comparação que, apesar das diferenças na estrutura primária de Vm23 e Vm24, a alta afinidade de bloqueio de hKv1.3 com seletividade é mantida.

Exemplo 11: Efeitos imunológicos de Vm24 in vivo

Milhões de pessoas no mundo inteiro são afetadas por doenças autoimunes, tais como mas não limitadas à esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabete tipo I, psoríase au- toimune, Iupus eritematoso, colite ulcerativa, oftalmia simpatética, doença periodontal de reabsorção óssea, púrpura trombocitopênica imune e síndrome Iinfoproliferativa autoimune, entre outras. Atualmente se pensa que o princípio destas doenças envolve a ativação de doenças dormentes de células T autorreativas específicas, que são transformadas em célu- las T efetoras de memória (TEM). As células T autorreativas poderiam se diferenciar do esta- do naive para células T de memória ativadas continuamente devido à repetida estimulação de autoantígeno e contribui ao dano inflamatório pela migração dentro dos tecidos, secre- 10

tando citocinas inflamatórias e exibindo imediata função efetora [Sallusto e outro, 1999], O mecanismo envolvido na hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) é outro exemplo de le- são de pele causada por células Tem [Soler e outro, 2003], A patogênese de muitas doenças autoimunes poderiam também ser devido a células B, especialmente aquelas que perten- cem àclasse mudada de CD27+lgD- [lglesias e outro, 2001; 0'Connor e outro, 2001; Corcio- ne e outro, 2004], Por estas razões é desejável desenvolver agentes terapêuticos que pos- sam atingir seletivamente TEM e as células B de memória de classe-trocada sem prejudicar a atividade de outras sub-séries de linfócitos das células prevenindo desta forma o compro- misso de respostas imunes agudas. Como mencionado anteriormente nos exemplos de 7 a 9 desta invenção, os canais Kv1.3 dependentes de voltagem são novos alvos terapêuticos para a imunomodulação de Tem e células B de memória de classe-trocada. As células Tem sobre regulam a sobre ativação e sua proliferação antígeno-dirigida é bastante sensível a conhecidas substâncias que bloqueiam canais Kv1.3 [Wulff e outro, 2003], No contrário, naive e TCM são muito menos sensíveis aos bloqueadores de Kv1.3 e rapidamente tornam- se resistentes ao bloqueio de Kv1.3 pela sobre regulação de canais de K ativados por cálcio, Kca 3.1 [Wulff e outro, 2003; Chandy e outro, 2004], Durante o processo de diferenciação células BeT mudam sua dependência de canais de potássio de KCa3.1 para Kv1.3 [Wulff e outro, 2004], Devido a este fato os bloqueadores de canais Kv1.3 inibem a proliferação des- tas células, sem afetar naive e células de memória CD27+lgD+. Então, o uso de bloqueado- res específicos para canais Kv1.3 poderiam afetar preferencialmente TEM e células B de memória de classe-trocada, sem comprometimento do volume da resposta imune, mas me- lhorando as condições de saúde desenvolvidas como uma conseqüência de doenças autoi- munes. O bloqueio de canais Kv1.3 melhora a encefatite autoimune experimental (EAE), reabsorção óssea na doença periodontal e a resposta DTH em modelos animais sem causar efeitos colaterais óbvios [Koo e outro, 1997; Beeton e outro, 2001; Valverde e outro, 2004], Já que o bloqueio de canais Kv1.3 por peptídeos é prontamente reversível, isto permite con- trolar o curso do tratamento, que não é o caso quando agentes quimioterápicos e anticorpos monoclonais são usados, os quais levam meses para reverter. Obviamente o principal pro- blema é encontrar peptídeos altamente seletivos para este tipo de tratamento terapêutico [Chandy e outro, 2004],

Como mostrado nos exemplos 7-10 descritos anteriormente, ambos peptídeos (Vm23 e Vm24), tema desta invenção, são bloqueadores potentes e muito específicos de canais Kv1.3 in vitro. Os experimentos foram conduzidos diretamente sobre linfócitos T hu- manos em cultura assim como outras células expressando diversos canais de potássio de- pendentes de voltagem para verificar a seletividade de ação. Para o propósito de "prova-de- conceito", experimentos in vivo foram conduzidos com ratos sensibilizados com dinitrofluo- robenzeno (DNFB), agente capaz de elicitar uma importante resposta DTH.

35 10

Para realizar este tipo de experimento nós construímos um protocolo para estudar a resposta DTH em ratos. O sistema usado é basicamente o que foi descrito por Phanuphak e outro, 1974. Resumidamente, dois grupos de ratos (3 e 5 animais cada) foram sensibilizados por apl,cações de 40 microlitros de DNFB a 0,7% em uma proporção de 4:1 de aceto- na:solução de óleo de oliva, em dois dias consecutivos (dias um e dois), depois de raspar suavemente a região dorsal traseira dos animais. Após 7 dias da segunda aplicação da so- lução de sensibilização, os animais foram estimulados por uma só aplicação de 20 microli- tros de DNFB a 0,4% dissolvido em acetona: solução de óleo de oliva descrito acima Esta solução foi espalhada sobre a superfície dorsal do lado direito das orelhas e se deixou se- car, enquanto o lado esquerdo das orelhas aplicado somente a solução veículo (aceto- na:oleo de oliva). No oitavo dia do protocolo, uma injeção subcutânea de 100 microlitros de tampão fosfato salino pH 7.8 (PBS) foi aplicado a cada um dos animais usados como contro- le, enquanto o grupo experimental de ratos, uma quantidade de 10 microgramas de Vm24 pura em 100 microlitros de PBS foi aplicada subcutaneamente. A espessura de ambas ore- lhas de todos os animais foram medidas 24 horas após a aplicação de Vm24.

Os resultados dos experimentos são mostrados na Fig. 16. Pode ser claramente observado que os animais controle, que não receberam a injeção de Vm24, tinham um valor med,o de inflamação na orelha na ordem de 0,32 mm (controle marcado) enquanto que os ratos que foram tratados com 10 microgramas de Vm24 tinham reduzido a inflamação, não mais que 0,10 mm de espessura. Estes valores correspondem ao processo real de inflama- ção, desde que a espessura das orelhas não provocadas (orelhas do lado esquerdo) foram subtraídas. Isto representa um decaimento líquido acima de 60% do processo de inflama- ção. Em conclusão, estes resultados suportam a idéia que Vm24 é um importante agente -munossupressor para a resposta DTH em ratos. Portanto este é certamente um potencial componente que merece ser testado como um inibidor de doenças imunológicas dependen- tes da ativação de linfócitos T e B, onde a contribuição dos canais Kv1.3 é importante para eliciar e manter a doença.

Claims (36)

1. Peptídeo isolado e purificado que consiste em SEQ ID NO: 3 ou um análogo e- quivalente funcional do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato do dito peptídeo ser capaz de bloquear com especificidade e afinidade altas um canal de potássio Kv1.3.

2. Peptídeo isolado e purificado de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de consistir em SEQ ID NO: 1.

3. Peptídeo isolado e purificado de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de consistir em SEQ ID NO: 2.

4. Método de inibir a atividade de canal de potássio Kv1.3 em uma célula de mami fero, CARACTERIZADO pelo fato de compreender contatar a dita célula de mamífero com uma quantidade efetiva de um peptídeo para bloquear a referida atividade de canal na dita célula em que o dito peptídeo tem uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Nozl1 SEQ ID No:2 e SEQ ID No:3 ou um análogo equiva- lente funcional do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato da dita célula de mamífero ser uma célula de linfócito humano.

6. Método de atenuar a série de reação de sinalização de cálcio em uma célula de linfócito T, CARACTERIZADO pelo fato de compreender contatar a dita célula de linfócito T com uma quantidade eficaz de um peptídeo tendo uma atividade de bloqueio de canal de potássio Kv1.3. em que o dito peptídeo tem a seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3 e análogos funcion- almente equivalentes do mesmo.

7. Método de suprimir processo de ativação de célula T no sistema imune de um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de compreender contatar uma população das referi- das células T com uma quantidade eficaz de um peptídeo tendo uma atividade de bloqueio de canal de potássio Kv1.3, em que o dito peptídeo tem seqüência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e análo- gos equivalentes funcionais do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato do refer- ) ido mamífero ser um humano.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato da dita ativação de célula T ser causada por uma resposta imune no referido mamífero.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da dita resposta imune ser o resultado de rejeição de órgão heteróloga.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato da dita resposta imune ser o resultado de uma doença auto-imune.

12. Método de suprimir uma resposta imune em mamíferos, CARACTERIZADO pe- Io fato de compreender administrar ao referido mamífero uma composição compreendendo um peptídeo tendo um atividade de bloqueio de canal de potássio Kv1.3, em uma quanti- dade eficaz para suprimir a referida resposta no referido mamífero, em que o dito peptídeo tem seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO-1 SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3 e análogos equivalentes funcionais do mesmo, ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato da dita resposta imune ser o resultado de rejeição de órgão heteróloga.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato da dita resposta imune ser o resultado de uma doença auto-imune.

15. Método para o tratamento profilático ou terapêutico de rejeição de órgão heteró- loga em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de compre- ender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um peptídeo tendo uma atividade de bloqueio de canal de potássio Kv1.3, em que o dito peptídeo tem seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e análogos equivalentes funcionais do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do dito orgao rejeitado ser um coração, um pulmão, um fígado, um rim ou um pâncreas.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do in- divíduo em necessidade do referido tratamento ser um humano.

18. Método para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma doença auto-imune associada a linfócito Tem em um indivíduo em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma com- posição comprendendo um peptídeo tendo uma atividade de bloqueio de canal de potássio Kvl.3, em que o dito peptídeo tem seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ .D NO:2, SEQ ID NO:3 e análogos equivalentes fun- cionais do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato do in- divíduo em necessidade do referido tratamento ser um humano.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato da dita doença auto-imune associada a linfócito Tem ser selecionada a partir do grupo que consiste em esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes tipo I, psoríase auto-imune, lúpus erite- matoso, colite ulcerativa, oftalmia simpática, doença periodontal de reabsorção óssea, púr- pura trombocitopênica imune e síndrome Iinfoproliferativa auto-imune.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, também CARACTERIZADO pelo fa- to de compreender administrar ao referido indivíduo pelo menos um agente imunossupres- sor adicional.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato do a- gente imunossupressor adicional ser selecionado a partir do grupo que consiste em ci- cloeponna, rapamicina, azatioprina, prednisona, toxina de ShK, derivados de ShK e desox- ispergualina, seus derivados, ou um sal dos mesmos.

23. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos um peptídeo tendo uma atividade de bloqueio de canal de potássio Kv1.3, CARACTERIZADO pelo fato do dito pep- tídeo ter a seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 3 e análogos equivalentes funcionais das mesmas ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas, e um veículo farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente pelo menos um agente imunossupressor adicional.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato do agente imunossupressor adicional opcional ser selecionado a partir do grupo que consiste em ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona, toxina de ShK, derivados de ShK e desoxispergualina, seus derivados, ou um sal dos mesmos.

25. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato da composição ser administrada topicamente, sistemicamente, intravenosamente, intraperito- nealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intranasalmente, transdermicamente, oralmente, ou por injeção intradérmica, instilação intrabronquial, liberação gastrointestinal, ou liberação transmucosal.

26. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato da composição ser administrada topicamente, sistemicamente, intravenosamente, intraperito- nealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intranasalmente, transdermicamente, oralmente, ou por injeção intradérmica, instilação intrabronquial, liberação gastrointestinal, ou liberação transmucosal.

27. Peptídeo rotulado tendo alta afinidade e ligação de especificidade ao canal de potássio Kv1.3, CARACTERIZADO pelo fato do dito peptídeo ter a seqüência de ami- noácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:3 e análogos equivalentes funcionais dos mesmos.

28. Peptídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato da porção de rotulagem ser selecionada a partir do grupo que consiste em um isótopo radioativo, uma porção fluorescente, porção quimioluminescente, um cromóforo e uma pro- teína.

29. Peptídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato da proteína de rotulagem ser um anticorpo.

30. Peptídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato da proteína de rotulagem ser biotina.

31. Peptídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato da proteína de rotulagem ser a proteína fluorescente verde.

32. Peptídeo rotulado, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato da proteína de rotulagem ser uma proteína derivada da proteína fluorescente verde com espectros de emissão distintos.

33. Método para identificação de células expressando canais de Kv1 3 CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: a) contatar uma população das células alvo com um peptídeo rotulado tendo alta afinidade e ligação de especificidade ao canal de potássio Kv1.3, em que o dito peptídeo rotulado tem seqüência de aminoácido se- lecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO.2, SEQ ID N0 3 e análogos equivalentes funcionais das mesmas convenientemente rotulados; e b) detectar a ligação de peptídeo rotulada aos canais de potássio Kv1.3 presentes na referida população de células alvo por uma técnica de detecção.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato das re- feridas células serem linfócitos humanos.

35. Método para quantificação do número de canais de Kv 1.3 expressos em uma determinada célula, CARACTERIZADO pelo fato de contatar as etapas de: a) compreender a dita célula com peptídeo rotulado tendo alta afinidade e ligação de especificidade ao canal de potássio Kv 1.3, em que o dito peptídeo rotulado tem seqüência de aminoácido selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e análo- gos equivalentes funcionais das mesmas convenientemente rotulados; e b) detectar e quan- Micar a ligação de peptídeo rotulada aos canais de potássio Kv1.Spresentes na referida po- pulação de células alvo por uma técnica de detecção quantitativa.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células são linfócitos humanos.