PT2158213E - Vm23 e vm24, dois péptidos de escorpião que bloqueiam canais de potássio de linfócitos t humanos (subtipo kv1.3) com elevada selectividade - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VM23 E VM24, DOIS PÉPTIDOS DE ESCORPIÃO QUE BLOQUEIAM CANAIS DE POTÁSSIO DE LINFÓCITOS T HUMANOS (SUBTIPO KV1.3) COM ELEVADA SELECTIVIDADE"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, em geral aos campos de bioquímica, biologia molecular, imunologia e electrofisiologia. São divulgados péptidos, suas composições farmacêuticas e métodos para a sua utilização para bloquear canais de potássio Kvl.3, sua utilização para o tratamento de diversos estados imunológicos e para aplicações de diagnóstico e métodos para a síntese química e processos de enrolamento correcto para péptidos correspondendo a dois componentes proteicos isolados do veneno do escorpião Mexicano Vaejovis mexicanus smithí (aqui a seguir abreviado: V. mexicanus) que constituem uma nova subfamília de ligandos específicos de canais de potássio, capazes de bloquearem com elevada afinidade e especificidade um subtipo de canais de potássio (hKvl.3) que se mostrou estarem implicados em doenças imunológicas e rejeições de enxertos. São divulgados os métodos e técnicas utilizados para a sua caracterização química e funcional, assim como os resultados de experiências in vivo na resposta de DTH de ratos sensibilizados, quando tratados com Vm24. Este péptido (Vm24), seu homólogo Vm23 e os seus análogos equivalentes funcionais, são compostos de primeira linha, candidatos para o tratamento de diversos estados imunológicos e aplicações de diagnóstico. 1

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Considerações gerais

Relativamente ao tema da invenção aqui descrito, vários aspectos devem ser tidos em consideração, entre os quais estão os importantes avanços nos campos da bioquímica, biologia molecular, imunologia e electrofisiologia, relacionados com o conhecimento gerado acerca de: 1) - presença de proteínas integrais de membranas biológicas, designadas "canais iónicos", desempenhando um papel fundamental na comunicação celular, vias de transdução de sinal e homeostasia geral de tecidos e diversas funções de órgãos; 2) - diferentes níveis de expressão destes canais em células do sistema imunitário, principalmente em linfócitos T, que se mostrou desempenharem um claro papel em eventos relacionados com o início de doenças auto-imunes; 3) - possível controlo da função de canal, por este motivo o possível tratamento de distúrbios, através da adição de diversas substâncias químicas, ligandos naturais e substâncias sinteticamente preparadas, reproduzindo o ligando como encontrado na natureza ou preparando derivados semelhantes (peptidomiméticos).

Foi identificado um sem-número de canais de potássio (K) e a sua existência reportada nos últimos quinze anos, permitindo o seu isolamento, expressão individual e análise funcional. 2

Estes são proteínas multiméricas implicadas na determinação do potencial de membrana celular, controlando desse modo, o tónus do músculo liso, excitabilidade sináptica, libertação de neurotransmissores e outros processos. Nesta invenção, deseja-se dar ênfase à importância de uma espécie de canal de K, o subtipo Kvl.3, e o seu papel na proliferação linfocítica e no controlo de doenças auto-imunes, por meio da inibição deste canal. Trata-se de um canal rectificador retardado, predominantemente expresso em linfócitos T [Grissmer et al., 1990; Lewis e Cahalan, 1995], diferente dos subtipos Kvl.l, Kvl.2, largamente distribuídos no cérebro ou Kvl.5 em tecido de coração, para mencionar apenas alguns dos subtipos de canais de K.

Os mecanismos pelos quais a modulação da actividade de canais Kvl.3 afecta a proliferação linfocítica veêm sendo investigados em vários laboratórios e foram o objecto de muitas publicações recentes (revistos em [Beeton e Chandy, 2005; Judge e Bever, 2006, Panyi et ai., 2006], incluindo algumas patentes (v. gr., documentos US 5397702 de Cahalan et ai. 1995 e US 6077680 de Kem et al. 2000).

As doenças auto-imunes são conhecidas pela sua considerável morbidade mundial. Entre estas doenças estão: diabetes Mellitus de tipo 1 (dependente de insulina), esclerose múltipla (MS) , artrite reumatóide, síndrome de Sjogren, doença de tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave, para mencionar apenas algumas delas. Um modelo experimental relevante para as doenças auto-imunes é a encefalomielite auto-imune experimental (EAE). É, em geral, aceite que estas doenças auto-imunes resultam da resposta do sistema imunitário, destruindo tecidos específicos por um ataque directo às células ou através da produção de auto-anticorpos. A 3 sobreexpressão de canais Kvl.3 é um traço característico das células T auto-reactivas proporcionando, desse modo, uma excelente oportunidade para a modificação da sua proliferação pelos bloqueadores de Kvl.3.

Nestas linhas de investigação e experimentação, várias substâncias foram descritas e até patenteadas. Um desses exemplos é a toxina ShK da anémona-do-mar Stichodactyla helianthus e vários derivados desta, reivindicados como tendo um efeito protector contra várias doenças auto-imunes (v. gr. , documento US 6077680 de Kem et al. 2000).

Entre outros ligandos naturais que são capazes de afectar a função de canais iónicos, estão os péptidos tóxicos isolados de venenos de escorpião. Os péptidos específicos de canais de K isolados destes venenos são péptidos de cadeia curta, contendo 22 a 42 aminoácidos, compactados por três ou quatro pontes dissulfureto. São bloqueadores de muitos subtipos diferentes de canais, com uma enorme variabilidade em selectividade e afinidade (revisto em [Giangiacomo et al., 2004; Rodriguez de la Vega e Possani, 2004]). Por exemplo, a caribdotoxina é um potente bloqueador dos canais Kvl.l, Kvl.2 e 1.3 rectificadores retardados do tipo Shaker mas também bloqueia os canais de K(Ca) maxi-tipo [Rauer et ai., 2000]. A margatoxina, outro péptido de veneno de escorpião, não tem actividade de bloqueio de canal de K(Ca), mas mantém um bloqueio de elevada afinidade dos canais Kvl.3. [Garcia-Calvo et ai., 1993]. A agitoxina, noxiustoxina, caliotoxina são exemplos de toxinas de escorpião que afectam diferentes tipos de canais de K com afinidades e selectividades distintas mas, habitualmente, modificam mais do que um subtipo de canais (recentemente revisto em [Panyi et ai., 2006]). Devido à sua estrutura tridimensional relativamente rígida, firmemente 4 mantida por pontes dissulfureto, alguns destes péptidos de escorpião foram utilizados como "calibradores moleculares" para medição de distâncias entre resíduos de aminoácidos de canais de K no vestíbulo externo dos canais [Krezel et al., 1995; Garcia et al. , 2000]. A estrutura tridimensional de muitas toxinas de escorpião específicas para canais de K foi resolvida por métodos de ressonância magnética nuclear e/ou difracção de raios X e, em conjunto com a estrutura conhecida de alguns canais de K, proporcionaram a pista para modelar a interacção entre o receptor (canal iónico) e o ligando (toxina de escorpião). A mutagénese dirigida de resíduos de aminoácidos nos canais iónicos e nos ligandos proporcionou informação para a identificação da putativa superfície de interacção entre este par de proteínas receptor-ligando [Rodriguez de la Vega et al., 2003]. Esta informação é fundamental para a concepção racional de possíveis fármacos com potenciais aplicações farmacológicas. 0 único problema na utilização destes péptidos de ocorrência natural como potenciais fármacos é a ausência de especificidade e afinidade. Presentemente, existem 20 subfamílias de toxinas de escorpião, compreendendo mais de 125 péptidos estruturalmente relacionados, classificados pelas suas semelhanças de sequência e possíveis funções [Tytgat et al., 1999; Rodriguez de la Vega e Possani, 2 0 0 4] .

Os seguintes exemplos também podem ser mencionados: BATISTA CESAR V F ET AL: (BIOCHEMICA ET BIOPHYSICA ACTA, Vol. 1601, N° 2, páginas 123 a 131) divulgam duas novas toxinas do escorpião da Amazónia Tityus cambridgei que bloqueiam os canais Kvl.3 e Shaker B k+; 0 documento WO 2006/116156 A divulga agentes terapêuticos peptídicos de toxina; o documento EP 0916681 A refere-se a péptidos 5 neuronais tendo origem no escorpião; e OLAMENDI-PORTUGAL et al. (2005) (TOXICON, ELMSFORD, NI, US, vol. 46, n° 4, páginas 418 a 419) refere-se a novos péptidos alfa-KTx do veneno do escorpião.

Base molecular para a terapia baseada no inibidor de Kvl.3 de doenças auto-imunes

Nesta secção, a requerente apresenta o conhecimento do estado da técnica no controlo de várias doenças imunológicas por aplicação simples de ligandos (péptidos ou compostos orgânicos) capazes de bloquearem, com elevada afinidade e elevada especificidade, os canais iónicos Kvl.3 de "células T de memória efectora" (Tem) de linfócitos.

Foi, anteriormente, demonstrado que o mecanismo pelo qual os inibidores de Kvl.3 interferem com os processos de activação de linfócitos, evocados por estimulação fisiológica antigénica ou mitogénios, é a despolarização da membrana e a consequente inibição do sinal de Ca2+ requerido para a progressão normal do ciclo celular para proliferação e produção dos clones de células T específicos para um antigénio provocador (revisto em [Cahalan et ai., 2001; Panyi et ai., 2004; Panyi et ai., 2006]). Existem dois tipos de canais de K que são responsáveis pela manutenção de um potencial de membrana suficientemente hiperpolarizado (-50, -60 mV) [Verheugen et ai., 1995] de células T, o canal activado por voltagem e despolarização, denominado como Kvl. 3 [Decoursey et al. , 1984; Matteson e Deutsh, 1984]; e o canal de K activado por Ca2+ de condutância intermédia, denominado como IKCal (ou KCa3.1 . de acordo com uma nomenclatura recente) [Grissmer et ai., 1993]. A actividade destes canais proporciona 6 o efluxo de carga positiva de contrabalanço requerido para a manutenção de um potencial de membrana negativo, durante o influxo de Ca2+ para o interior das células T, através da libertação de Ca2+ pelos canais de Ca2+ activados [Feske et ai., 2006; Yeromin et ai., 2006]. A contribuição destes dois tipos de canais de K para o potencial de membrana de células T depende do estado de activação das células (repouso vs. activadas) e do seu papel funcional no sistema imunitário, determinado pelo grau de diferenciação terminal das células T, como discutido abaixo [Wulff et ai., 2003].

Dois tipos de células T, as células T naive e de memória central (TCm)/· requerem forte estimulação antigénica e co-estimulação em órgãos linfóides periféricos (secundários) para serem activadas. As células T naive que não encontraram anteriormente um antigénio, transportam a expressão do marcador funcional CCR7+CD45RA+. As células T de memória central (TCmí CCR7+CD45RA~) , cujas células medeiam a memória reactiva, estão provavelmente imobilizadas em estádios intermédios de diferenciação terminal para se tornarem células de memória efectora (TEM) [Sallusto et ai., 2004]. Estas células têm pouca ou nenhuma função efectora, mas facilmente proliferam e diferenciam-se em células efectoras em resposta a estimulação antigénica. A memória protectora é determinada por células TEM de memória efectora (CCR7~CD45RA+/“) . As células TEM apresentam conjuntos caracteristicos de receptores de quimiocina e moléculas de adesão que são requeridos para o direccionamento para tecidos inflamados onde exercem função efectora imediata. Em várias doenças auto-imunes, incluindo esclerose múltipla (MS) (Wulff et al. , 2003), artrite reumatóide e diabetes Mellitus de tipo 1 [Beeton et al. , 2006], psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática e doença 7 periodontal de reabsorção óssea, as células TEM cronicamente activadas são responsáveis pela lesão tecidular, deste modo a inibição selectiva da proliferação e actividade funcional destas células é de extrema importância na gestão destas doenças (revisto em [Chandy et al. , 2004; Beeton e Chandy, 2005; Panyi et al., 2006 ] .

As naive humanas em repouso, TCm e TEm dos fenótipos CD4 + (auxiliar) ou CD8+ (citotóxico) expressam um número semelhante de canais Kvl.3 (200-300) e menos de 30 IKCal por célula [Wulff et al., 2003]. A transformação de células naive e TCm em células blásticas de proliferação por estimulação antigénica especifica é acompanhada por um modesto aumento (—1,5 vezes) no número de canais Kvl.3 por célula, ao passo que o número de canais IKCal aumenta dramaticamente (500 canais/célula) e, deste modo, adquire um fenótipo de canal iónico IKCalaltoKvl. 3baixo. Pelo contrário, a activação de TEm do fenótipo CD4+ ou CD8+ nos tecidos periféricos é acompanhada de um aumento dramático no número de canais Kvl.3 para ~1500/célula, sem qualquer alteração no nivel de IKCal, pelo que o fenótipo de canal de Tffl activado torna-se IKCalbaixoKvl. 3alto. A ligação causal entre TEM de Kvl.3alto e distúrbios auto-imunes é substanciada pelos seguintes dados obtidos em doenças humanas: 1) as células T reactivas a mielina do sangue periférico de doentes com MS são Kvl.3alto [Wulff et al. , 2 003] ; 2) as células T reactivas a mielina do sangue periférico de controlos saudáveis são Kvl.3baixo, consistente com um fenótipo inactivo/TcM; 3) a estimulação de células T de doentes com MS com antigénios irrelevantes, tais como péptido de insulina, ovalbumina ou com mitogénios convencionais não induziu a geração de Tffl com fenótipo de canal de Kvl. 3altoIKCalbaixo; 4) as células TEm Kvl. 3alto foram verificadas em infiltrados inflamatórios de cérebro de MS post mortem e no parênquima de lesões de MS desmielinizadas [Rus et al. , 2 0 05]; 5) as células T isoladas do fluido sinovial de doentes humanos que sofrem de Artrite Reumatóide (RA) expressam grandes quantidades de Kvl.3, em comparação com células T do mesmo dador, mas isoladas de sangue periférico. Estas células T Kvl.3alto eram CCR7~, indicando que são células TEm [Beeton et al., 2006]; 6) as linhas de células T CD4+ especificas de antigénio de curta duração (TCL), produzidas por linfócitos de sangue periférico de doentes humanos com Diabetes Mellitus de Tipo 1 (T1DM) e especificas para auto-antigénios de insulina associados a T1DM e GAD65 apresentam os traços caracteristicos de células Tbm, incluindo a ausência do antigénio CCR7 (CCR7“) e fenótipo do canal de Kvl.3alto [Beeton et al., 2006].

Como o controlo do potencial de membrana de células Tjm é exclusivamente determinado pela actividade dos canais Kvl.3, a proliferação destas células, sua actividade funcional e, deste modo, os sintomas da doença auto-imune, devem ser melhorados através da utilização de inibidores de Kvl.3. Os seguintes dados in vitro e in vivo na literatura sustentam este cenário: 9 1) A proliferação in vitro de linhas de células T humanas cronicamente activadas, contendo as características de TEM (CCR7~, Kvl.3alt0) e específicas para o antigénio de mielina [Wulff et al . , 2003] ou as células TEM isoladas do fluido sinovial de doentes com RA é totalmente e permanentemente suprimida por péptidos bloqueadores específicos de Kvl.3, tais como ShK [Wulff et al., 2003], ShK(L5) ou pelo bloqueador PAP-1 de pequenas moléculas de Kvl.3 [Beeton et al.f 2006]; 2) As experiências in vivo com Margatoxina, outro péptido bloqueador de Kvl.3 de elevada , mostraram que o bloqueio de Kvl.3 conduz à inibição de reacções de hipersensibilidade de tipo retardado em leitões; esta reacção é uma boa medida da actividade de células T de memória efectora [Koo et al., 1997]; 3) O tratamento de células T de rato específicas de MBP com

ShK ou ShK-Dap22 durante a sua estimulação in vitro com MBP (fase de sensibilização) , juntamente com aplicação repetida dos péptidos nos animais receptores (durante a fase efectora), preveniu a transferência adoptiva de

Encefalomielite Auto-imune Experimental (AT-EAE) em ratos de Lewis [Beeton et al. , 2001] . A EAE em ratos [Ben Nun e

Cohen, 1982], é o modelo mais bem caracterizado para a doença MS humana, caracterizado por patogénese e anomalias neurológicas semelhantes e a população de células T que causa a doença é a TEM específica de mielina tendo o fenótipo de canal de Kvl.3alto. A aplicação combinada de bloqueadores de canais Kvl.3 e IKCal também melhorou os 10 sintomas da EAE quando administrados após o seu começo [Beeton et ai., 2001]; 4) O modelo de artrite crónica restringido a MHC de classe II induzido por pristano (PIA) em ratos Dark Agouti é um modelo de rato para a doença humana Artrite Reumatóide. As injecções diárias únicas de ShK(L5) reduziram significativamente o número de articulações afectadas pela doença durante o período de ensaio (até 34 dias) [Beeton et ai., 2 0 0 6] ; 5) A eficácia de um inibidor de Kvl.3 para prevenir a diabetes auto-imune experimental (EAD, um modelo de rato para T1DM de humanos) foi estudada em ratos DP-BB/W restringidos a MHC de classe II [Beeton et al., 2006].

Mostrou-se que a administração diária repetida de PAP-1, um bloqueador de molécula pequena de elevada afinidade e selectividade de Kvl.3 reduziu a fracção de ratos mostrando os sintomas de EAD em -50% (ensaiados aos 110 dias de idade), em comparação com animais de controlo tratados apenas com veículo. Isto foi acompanhado de uma infiltração diminuída de células T e macrófagos de intra-ilhéus e destruição reduzida de células β no grupo tratado com PAP-1, em comparação com controlo tratado com veículo (ensaiados entre 35-70 dias de idade) [Beeton et al., 2006] . A inibição de proliferação de células T por inibidores específicos de Kvl.3 é específica de células TEM, o que faz destes compostos, ferramentas ideais para a gestão ou prevenção de doenças auto-imunes. Embora a proliferação induzida por antigénio de células naive em repouso e TCm seja parcialmente 11 sensível à inibição mediada por Kvl.3, a regulação positiva transcricional de canais IKCal supera isto em células T pré-activadas e faz com que a proliferação destas células seja sensível a inibidores de IKCal mas não a inibidores de Kvl.3 [Ghanshani et al. , 2000]. Esta acção restrita dos inibidores de

Kvl.3 e IKCal em diferentes subconjuntos de células T está na base da importância da selectividade de uma determinada molécula para Kvl.3 mais que para IKCal. Também se mostrou recentemente que a inibição da proliferação de TEm por inibidores de Kvl.3 pode ser superada por estimulação de antigénio excessiva, mimetizando a activação de células TEm por patógenos e antigénios vacinais durante reacções imunitárias de memória protectoras normais [Beeton et al., 2006]. Deste modo, a aplicação de inibidores de Kvl.3 de elevada afinidade e elevada selectividade visa, idealmente, as células TEM repetidamente activadas durante reacções auto-imunes, ao passo que deixa inalteradas outras funções protectoras do sistema imunitário.

Além dos linfócitos T e B humanos, os canais Kvl.3 também são expressos em vários órgãos e tecidos (incluindo o sistema nervoso central, rim, fígado, músculo esquelético) e o bloqueio dos canais Kvl.3 nas células pode dar origem a efeitos secundários consideráveis. Extensos testes toxicológicos in vitro e agudos e crónicos in vivo foram realizados anteriormente para ShK(L5) [Beeton et al., 2005; Beeton et al., 2006] a partir do grupo de bloqueadores peptídicos e para PAP-1 [Schmitz et al., 2005; Beeton et al., 2006] a partir do grupo de bloqueadores de moléculas pequenas. Estes estudos mostraram a ausência de sintomas clínicos para efeitos secundários neurológicos e cardíacos ou alterações histopatológicas em tecidos onde o Kvl.3 é expresso. Deste modo, os efeitos de tratamento, benéficos de bloqueadores de Kvl.3 listados acima, 12 combinados com efeitos secundários mínimos ou a sua ausência completa, apontam na direcção da aplicabilidade de bloqueadores de Kvl.3 selectivos na gestão de doenças auto-imunes.

Em resumo, os dados acima sugerem um papel crítico dos canais Kvl.3 de K na execução de uma resposta imunitária fisiológica e apontam para a aplicabilidade de uma intervenção terapêutica na doença auto-imune pela inibição dos canais Kvl.3.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à identificação e utilização de novos péptidos isolados do veneno do escorpião Mexicano V. mexicanus: Vm23, Vm24 e os seus análogos equivalentes funcionais que são capazes da inibição da função dos canais hKvl.3 de linfócitos humanos, com elevada afinidade e especificidade, através do bloqueio de uma condutância iónica específica. Noutras formas de realização da presente invenção, a requerente divulga composições farmacêuticas compreendendo Vm23, Vm24 e os seus análogos equivalentes funcionais, métodos para a sua utilização para bloquear os canais de potássio Kvl.3, para tratar diversos estados imunológicos e para diagnosticar aplicações e métodos para a sua síntese química e enrolamento correcto. Estes péptidos foram isolados por meio de cromatografia liquida de alta resolução convencional e tiveram a sua sequência de aminoácidos primária determinada por degradação de Edman e espectrometria de massa, mostrando a estrutura primária mostrada na SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2. 0 Vm24 contém 36 aminoácidos, com um peso molecular de 3863,5 Daltons. É uma molécula compacta, mantida por quatro pontes dissulfureto, estabelecidas por espectrometria de massa, como sendo entre 13 pares de cisteínas nas posições C6 e C26, C12 e C31, C16 e C33, e C21 e C36, onde a letra C representa a abreviatura de resíduos de cisterna e os números correspondem às suas posições relativas na sequência de aminoácidos. 0 aminoácido na extremidade carboxílica do péptido está amidado. 0 péptido completo foi quimicamente sintetizado utilizando o método de fase sólida de Merrifield e o enrolamento correcto do péptido sintético foi obtido e confirmado por análise química e funcional. 0 Vm24 não é tóxico para murganhos quando injectado a concentração relativamente elevada (ensaiada até 200 microgramas por murganho de 20 gramas de peso corporal, isto é: 10000 micrograma/quilograma de peso de murganho). Quando aplicado in vitro a linfócitos humanos, mostra uma afinidade extremamente elevada para canais hK.vl.3, ensaiada pela técnica de adesivo/grampo. Liga-se a estes canais num modo quase irreversível, mostrando um valor de Kd na gama picomolar inferior (inferior a 3 picomolar - 3 pM) . Não modifica as correntes de potássio dos seguintes canais iónicos: canais hKvl.4, Kvl.5, Kv2.1, hBK e hERG e as correntes do canal Na+ cardíaco dependente de voltagem (hNavl.5), quando ensaiados a uma concentração de 10 nanomolar (10 nM). A inibição de corrente à concentração de 10 nM para os canais hlKCal, mKvl.1 e hKvl.2 é, aproximadamente, 20 a 50%, em oposição a bloqueio de 100% para os canais hKvl. 3. A toxina bloqueia para cima de 50% da corrente de hKvl.3, a uma concentração tão baixa quanto 3 pM sendo, deste modo, aproximadamente, 1500 vezes mais eficaz neste canal do que qualquer dos outros canais ensaiados.

Os testes de mortalidade conduzidos com Vm24 não causaram sintomas observáveis de intoxicação, utilizando concentrações até 200 micrograma/20 grama de peso de murganho. 0 Vm24 aplicado ao modelo de rato para hipersensibilidade de tipo retardado 14 (DTH) protegeu os animais experimentais. A sensibilização de pele de ratos experimentais com dinitrofluorobenzeno (DNFB) causa uma considerável resposta imunológica (vermelhidão e inflamação grosseira das orelhas). Os grupos de ratos submetidos a uma única injecção de 10 microgramas de Vm24 no dia seis após inicio do tratamento mostram uma atenuação considerável da resposta imunitária; a inflamação das orelhas tratadas é significativamente diminuída (pelo menos, 60% menos inflamação), em comparação com ratos de controlo que receberam apenas tratamento com solvente.

Um péptido relacionado, denominado Vm23, também foi isolado do mesmo veneno e completamente sequenciado, como mostrado na SEQ ID N° 2. Este péptido é 83% idêntico a Vm24, tem 35 resíduos de aminoácidos, empacotados por quatro pontes dissulfureto e mostra um peso molecular de 3665 Daltons. O Vm23 exibe função equivalente a Vm24: elevada afinidade e especificidade para canais hKvl.3. O bloqueio das correntes para os canais hKvl.3, hlKCal, mKvl. 1 e hKvl.2, a concentração de 10 nM de Vm23, foi, aproximadamente 95%, 1%, 3% e 9%, respectivamente. A análise filogenética conduzida com ambos os péptidos, utilizando mais de 125 outros péptidos de escorpião conhecidos [Bagdany et al., 2005], específica para canais de K, mostrou que o Vm23 e Vm24 não se encontram abrangidos por qualquer das 20 subfamílias de estruturas de toxinas de escorpião já descritas. São os primeiros dois exemplos de uma nova subfamília estrutural que aqui se propõe denominar: a-KTx 21. Vm24 e Vm23 devem, deste modo, ser denominados a-KTx 21.1 e a-KTx 21.2, respectivamente. Entre os critérios utilizados para definir novas subfamílias de toxinas de escorpião específicas para canais de K, de acordo com um painel internacional de cientistas 15 que definem a nomenclatura sistemática agora em utilização (ver [Tytgat et ai., 1999]), estão a necessidade de que a estrutura primária seja diferente em, pelo menos, 50% dos outros. De facto, o Vm23 e Vm24 mostram menos de cerca de 50% de semelhança de sequência com as outras toxinas conhecidas.

Com base no estado do conhecimento da técnica do campo, estas propriedades fazem de Vm23, Vm24 e os seus análogos equivalentes funcionais, excelentes candidatos para a supressão imunitária e o diagnóstico e tratamento de doenças imunológicas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos incluídos neste documento fazem parte da presente descrição e são aqui incluídos para demonstrar, adicionalmente, determinados aspectos da presente invenção. A invenção completa pode ser mais bem compreendida através da complementação de um ou mais destes desenhos com a descrição detalhada de formas de realização específicas aqui apresentadas, especialmente na secção dos exemplos abaixo.

Fig. 1: Separação por HPLC de 1 mg do veneno solúvel do escorpião V. mexlcanus. Mais de 80 componentes diferentes foram separadamente obtidos por aplicação do veneno solúvel dentro de uma coluna de fase reversa C 18 (número de catálogo 218TP54, da Vydac, Hisperia, CA) , equilibrada com solução A (água em TFA a 0,10%), utilizando um gradiente desde 0% até 60% de solução B (acetonitrilo em TFA a 0,12%) ao longo de 6 0 min. Os números 1 e 2, nos tempos de retenção 23 e 24 min, indicam a posição de eluição de Vm23 e Vm24, respectivamente. Uma separação adicional de cada 16 uma destas duas fracções cromatográficas foi conduzida no mesmo sistema, mas utilizando um gradiente linear de solução A até 40% de solução B, durante 60 min, para ambos os péptidos. Os resultados são mostrados como inserção da figura. Os asteriscos nas inserções indicam a posição de eluição de péptidos altamente purificados.

Fig. 2: Sequência de aminoácidos de Vm23, Vm24 e consenso.

As sequências de Vm23 e Vm24 foram obtidas por degradação directa de Edman de péptidos nativos e amostras reduzidas e alquiladas, em combinação com análise de espectrometria de massa de péptidos obtidos por clivagem enzimática de péptido puro com enzimas especificas (endoprotease Arg-C e Lys-C), como indicado abaixo das sequências correspondentes. As sequências de aminoácidos dos péptidos purificados após hidrólise enzimática e separação por HPLC foram identificadas por análise de espectrometria de massa (MS/MS, significa fragmentação de espectrometria de massa por ionização electrospray). Sob cada sequência estão as indicações dos segmentos identificados pelos diversos métodos utilizados. Directo significa degradação de Edman, Arg-C e Lys-C são os fragmentos purificados após digestão enzimática. MS isoladamente significa identificação baseada na massa molecular do aminoácido em falta. A sequência consenso tem 30 residuos de aminoácidos que são idênticos aos de Vm23 ou Vm24. As posições marcadas como "x" poderiam ser: x1, qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, K ou P; x , qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhora ainda, L ou P; x3, qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, K 17 ou R; x4, qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, S ou N; x5, qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, K ou R e x6, qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, Y ou nenhum.

Fig. 3: O Vm24 possui um C terminal amidado. Dissociação Induzida por Colisão (CID) do C-terminal. [M+H]+, ião em m/z 909.4 a.m.u. (peso molecular monoisotópico) mostra 1.0 unidade inferior ao valor teórico esperado de [M+H]+ 910.5 a.m.u. A série do ião y (itálico) correspondendo a uma sequência C-terminal amidada é mostrada na inserção marcada 1) . Os valores teóricos da série do ião y para o péptido carboxilo terminal livre (TV-COOH), valores teóricos da série do ião y para o C-terminal amidado (IV-NH2) e valores experimentais da série do ião y (EXP.) são comparados na tabela inserida (inserção marcada 2).

Fig. 4: Heterodimeros de Vm24 para atribuição de dissulfureto. Os números 1 e 2 mostram os pesos moleculares e estruturas esquemáticas dos heterodimeros produzidos por clivagem proteolítica simultânea de Vm24, utilizando tripsina e quimotripsina, a pH 6,5. 0 ião [M+H]+ a 788.0 a.m.u. m/z, corresponde à massa molecular do heterodímero contendo o hemi-par de cistina C4-C8 (número 1) e o ião [M+H ]+, a 560,4 a.m.u. m/z, ao hemi-par de cistina C3-C7 (número 2).

Fig. 5: Hemi-pares de cistinas de Vm24. A) Espectro de massa correspondendo à estrutura do núcleo complexo 18 contendo os hemi-pares de cistinas, C1-C4 e C2-C6 com o ião [M+2H] +2 a 1099, 7 a.m.u. m/z. Este foi fragmentado para produzir o espectro MS/MS mostrado na figura 5B. Os valores da série do ião b, de 1137 a 1507 a.m.u., inequivocamente representam a cauda de GSPE, confirmando a atribuição dos últimos dois hemi-pares de cistina. B) . Mostra a disposição completa das pontes dissulfureto de Vm24, como determinada por análise de espectrometria de massa descrita na parte A desta figura.

Fig. 6: Purificação por HPLC de Vm24 sintético. 0 Vm24 sinteticamente preparado (50 miligrama de proteína) foi separado numa coluna preparativa de fase reversa C18. O número 1 indica a posição de eluição de Vm24 sintético e correctamente enrolado, ao passo que 2 e 3 indicam sequências incorrectamente enroladas ou truncadas. Uma separação adicional desta fracção cromatográfica foi conduzida no mesmo sistema, mas utilizando uma coluna analítica desenvolvida com um gradiente linear de solução A até 40% de solução B, durante 60 min. Os resultados são mostrados como inserção da figura.

Fig. 7: Comparação por HPLC de péptido Vm24 sintético e natural. A) A aplicação de 10 microgramas de Vm24 nativo numa coluna analítica C18 (número de catálogo 218TP54, da Vydac, Hisperia, CA) no sistema de HPLC descrito na Fig. 1 mostra que o péptido puro elui a 32,67 min, quando desenvolvido com um gradiente linear de solução A até 40% de solução B, durante 6 0 min. B) Cromatograma de 15 microgramas de Vm24 sinteticamente preparado e enrolado no mesmo sistema e condições. C) Co-injecção de uma mistura 1:1 de Vm24 sintético e natural (total de 8 microgramas), 19 mostrando que co-eluem com o mesmo tempo de retenção. Convém mencionar que o eixo X do gráfico está desviado para a direita para as letras B e C para que os três gráficos possam ser observados comparativamente, mas separadamente, de outro modo os tempos de eluição das três corridas de HPLC independentes cairiam no mesmo pico e tornar-se-iam indistinguíveis.

Fig. 8: Análises de sequência e f ilogenéticas de Vm23 e Vm24. A) Alinhamento de múltiplas sequências de Vm24 e Vm23 com os seus α-KTx mais estreitamente relacionados. 0 alinhamento foi realizado com o software CLUSTAL_X [Thompson et al. , 1997] e a identidade de sequência com Vm24 (%I, última coluna) calculada com BioEdit. B) Árvore filogenética simplificada calculada com MrBayes 3.0b4 [Huelsenbeck e Ronquist, 2001; Ronquist e Huelsenbeck, 2003]. O Vm23 e Vm24 estão aglomerados em conjunto e diferem substancialmente dos membros da subfamilia a-KTx 6.

Fig. 9: Bloqueio selectivo de canais iónicos linfociticos por Vm24. A) As correntes de potássio de célula inteira através de canais hKvl.3 foram evocadas de uma célula T humana em resposta a pulsos de despolarização de +50 mV de um potencial de repouso de -12 0 mV a cada 15 s. As correntes na ausência de Vm24 (controlo, indicado por uma seta) são quase completamente bloqueadas, quando Vm24 a 1 nM é administrado à célula por meio da perfusão do meio extracelular. A seta indica o Io pulso em Vm24. B) As correntes de pico normalizadas em função do tempo são mostradas após a aplicação de 1 nM (circulos a cheio) ou 0,3 nM (circulos vazios) de Vm24. A seta indica o inicio da aplicação da toxina. C) As correntes de pico normalizadas 20 de um linfócito em função do tempo são mostradas quando

Vm24 a 3 pM é aplicado à célula e, depois, removido (remoção por lavagem) do meio extracelular. A perfusão com um meio isento de toxina resultou numa recuperação parcial muito lenta do bloqueio, com um tempo constante de -3800 s. Os pulsos foram distribuídos a cada 30 s. D) A relação de dose-resposta para Vm24 foi obtida através da representação gráfica da fracção de corrente restante (RCF = I/Io) em função da concentração de toxina, onde I e Io são as correntes de pico medidas na presença e ausência da toxina, respectivamente, e do ajuste dos pontos dos dados com a função: RCF = Kdn/(Kdn + [Tx]n), onde [Tx] indica a concentração de toxina e Kd é a constante de dissociação. As barras de erro indicam SEM (n = 3-6) . A função de dose-resposta construída deste modo produz um Kd = 2,9 pM e um coeficiente de Hill n~l. E) Os canais de K activados por Ca2+ de linfócitos T (hlKCal) foram expressos em células Cos-7 e as correntes foram deduzidas por rampas de voltagem desde -120 a +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 10 s. São mostrados os traços de corrente registados antes da aplicação da toxina (controlo), após o equilíbrio do bloqueio na presença de Vm24 a 10 nM, durante 4,5 min e após remoção por lavagem (lavagem) da toxina, durante 2,5 min. F) A fracção restante da corrente de hlKCal, na presença de Vm24 a 1 nM e 10 nM, foi calculada s/s0, onde s e so são os declives das relações I-V evocadas por rampas de voltagem na presença e ausência de Vm24, respectivamente. As barras de erro indicam SEM (n = 3).

Fig. 10: O Vm24 é selectivo para hKvl. 3 entre a família de canais Shaker (Kvl.x). São mostrados os traços de corrente registados antes da aplicação da toxina (controlo), após o 21 equilíbrio do bloqueio por Vm24 a 10 nM e após remoção por lavagem (lavagem) da toxina. A) Os canais mKvl.l foram expressos por células L929 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 10 s. O bloqueio de equilíbrio desenvolveu-se em 6 min, a duração do período de remoção por lavagem foi 5 min. B) Os canais hKvl.2 foram expressos por células L929 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 10 s. O bloqueio de equilíbrio desenvolveu-se em 5,5 min, a duração do período de remoção por lavagem foi 7 min. C) Os canais hKvl.3 foram expressos endogenamente por linfócitos de sangue periférico e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 10 s. O bloqueio de equilíbrio desenvolveu-se em 3,5 min, a duração do período de remoção por lavagem foi 4,5 min. D) Os canais hKvl.4 (Κν1.4ΔΝ) removidos por inactivação rápida foram expressos por células Cos-7 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 10 s. As durações da aplicação de Vm24 e do período de remoção por lavagem foram 5 min e 4,5 min, respectivamente. E) Os canais Kvl.5 foram expressos por células MEL e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s. As durações da aplicação de Vm24 e do período de remoção por lavagem foram 6 min e 3,5 min, respectivamente.

Fig. 11: O Vm24 não bloqueia ou inibe uma variedade de canais iónicos biologicamente importantes. São mostrados os traços de corrente registados antes da aplicação da toxina (controlo) , após o equilíbrio do bloqueio por Vm24 a 10 nM 22 e após remoção por lavagem (lavagem) da toxina. A) Os canais rKv2.1 foram expressos por células Cos-7 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 30 s. As durações da aplicação de Vm24 e do período de remoção por lavagem foram 7 min e 3 min, respectivamente. B) Os canais hERG foram expressos por células HEK e as correntes foram evocadas por uma etapa de voltagem até +20 mV, seguida de uma etapa até -40 mV, durante a qual a corrente de pico foi medida. O potencial de repouso foi -80 mV, os pulsos foram distribuídos a cada 30 s. As durações da aplicação de Vm24 e do período de remoção por lavagem foram 5 min e 2.5 min, respectivamente. C) Os canais hBK (Kcal.l) foram expressos por células tsA-201 e as correntes foram evocadas por uma etapa de voltagem até +50 mV, precedida por uma hiperpolarização de 10 ms, até 120 mV de um potencial de repouso de 0 mV. Os pulsos foram distribuídos a cada 5 s. As durações da aplicação de Vm24 e do período de remoção por lavagem foram 4 min e 1 min, respectivamente. D) Os canais Navl. 5 foram expressos por células Cos-7 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até 0 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s. As durações da aplicação de Vm24 e do período de remoção por lavagem foram 1 min e, de novo, 1 min, respectivamente.

Fig. 12: Perfil de selectividade de Vm24. As barras indicam as fracções de corrente restante no bloqueio de equilíbrio dos canais indicados por Vm24 aplicado em concentração de 1 nM (A) ou 10 nM (B). Os dados são apresentados como média ±SEM, para n^3 experiências independentes. Para os sistemas de expressão e o cálculo de RCF e outras condições ver os detalhes nas legendas para as Fig. 9-11. 23

Fig. 13: Bloqueio de elevada afinidade de canais hKvl.3 por Vm24 sintético. A) As correntes de potássio de célula intacta através de canais hKvl.3 foram evocadas de uma célula T humana em resposta a pulsos de despolarização de + 50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 30 s. As correntes registadas na ausência do péptido (controlo, indicado por seta) são substancialmente bloqueadas (>90%), quando Vm24 (sVm24) sintético a 100 pM é administrado à célula por meio da perfusão do meio extracelular. A seta indica o Io pulso em sVm24. B) As correntes de pico normalizadas em função do tempo são mostradas após a aplicação de 100 pM de sVm24. A seta indica o inicio da aplicação da toxina. Não se alcançou recuperação significativa de bloqueio quando a célula foi perfundida com solução isenta de sVm24 (a seta indica o inicio do periodo de remoção por lavagem) . C) As barras indicam as fracções de corrente restante no bloqueio de equilíbrio de hKvl.3 por sVm24 e Vm24 aplicados em concentração de 100 pM. Os dados são apresentados como média ±SEM, para n>3 experiências independentes. Para os sistemas de expressão, o cálculo de RCF e outras condições ver os detalhes nas legendas para as Fig. 9-11.

Fig. 14: O Vm23 é selectivo para hKvl. 3. São mostrados os traços de corrente registados antes da aplicação da toxina (controlo) , após o equilíbrio do bloqueio por Vm23 a 10 nM e após remoção por lavagem (lavagem) da toxina. Os canais iónicos significativamente bloqueados por Vm24 em concentração de 10 nM foram seleccionados para definição de perfil farmacológico de Vm23. A) Os canais hKvl.3 foram expressos endogenamente por linfócitos de sangue periférico e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s. 0 bloco de equilíbrio desenvolveu-se em 3,5 min, a duração do período de remoção por lavagem foi 2 min. B) Os canais de K activados por Ca2+ de linfócitos T (hlKCal) foram expressos em células Cos-7 e as correntes foram deduzidas por rampas de voltagem desde -120 a +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s. As durações da aplicação de Vm23 e do período de remoção por lavagem foram 3,5 min e 2 min, respectivamente. C) Os canais mKvl.1 foram expressos por células L929 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s. As durações da aplicação de Vm23 e do período de remoção por lavagem foram 3,5 min e 1 min, respectivamente. D) Os canais hKvl.2 foram expressos por células Cos-7 e as correntes foram evocadas por etapas de voltagem até 50 mV de um potencial de repouso de -120 mV a cada 15 s. O bloco de equilíbrio desenvolveu-se em 3,5 min, a duração do período de remoção por lavagem foi 2 min.

Fig. 15: Perfil de selectividade de Vm23. As barras indicam as fracções de corrente restante em bloqueio de equilíbrio dos canais indicados por Vm24 aplicado em concentração de 1 nM (A) ou 10 nM (B). Os dados são apresentados como média +SEM, para n^3 experiências independentes. Para os sistemas de expressão e o cálculo de RCF e outras condições ver os detalhes nas legendas para as Fig. 9 e 14.

Fig. 16: Resposta de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) em ratos. Dois grupos de 3 ratos foram, cada, sensibilizados e provocados por aplicação de DNFB. Um grupo recebeu uma injecção de PBS isoladamente (controlo, número 1) e o outro recebeu uma única injecção de 10 microgramas 25 de Vm24 (grupo 2). As medições de orelha foram tomadas 24 horas após este tratamento. A barra de controlo mostra a espessura das orelhas após provocação com DNFB, para os ratos de controlo, ao passo que a barra correspondendo ao grupo de tratamento (grupo 2) mostra a espessura das orelhas dos ratos que foram tratados com Vm24. Foi observado um decréscimo de, aproximadamente, 60% na inflamação nos ratos recebendo Vm24, quando comparados com os ratos de controlo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como geralmente compreendido por alguém com conhecimentos gerais na técnica a que esta invenção pertence. Como aqui utilizados, os seguintes termos têm os significados a eles atribuídos, salvo indicado em contrário. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, são descritos os métodos e materiais preferidos. Para efeitos da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

Na presente invenção, os termos "péptido", "polipéptido" e "proteína" são utilizados indistintamente para referir as moléculas peptídicas da presente invenção. O termo "actividade de bloqueio de canal de potássio Kvl.3" refere-se, em geral, à estimativa real do grau de inibição do 26 fluxo de ioes de potássio através dos referidos canais Kvl.3, causada pela presença de um inibidor de canal de potássio Kvl.3. 0 termo "bloqueador de canal de potássio Kvl.3" significa, em geral, uma substância que inibe o fluxo de iões de potássio através de um canal de Kvl.3 da membrana celular que contém o referido canal, através da oclusão directa da via de condução iónica. 0 termo "análogo" significa, em geral, qualquer cadeia polipeptidica que partilha, pelo menos, 83% de identidade de sequência de pares ao longo das 36 posições alinhadas da SEQ ID N° 1, SEQ ID N 0 2 e SEQ ID N° 3 (30 correspondências ao longo de 36 posições) . Poderia incluir, mas não está limitado a até seis alterações de aminoácidos, um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais, derivatização química de um ou mais dos resíduos e extensões N-terminais e/ou C-terminais, por outros resíduos de aminoácidos ou outras fracções orgânicas. 0 termo "percentagem de identidade de sequência de pares" significa, em geral, o coeficiente entre posições de resíduos de aminoácidos que têm o mesmo aminoácido em duas sequências alinhadas ao longo de todas as posições, quando as duas sequências proteicas são alinhadas. 0 termo "equivalente funcional" significa, em geral, qualquer estrutura molecular que exibe afinidade e selectividade semelhantes para Kvl.3, como apresentado na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2, desde que partilhe os mesmos determinantes estruturais de afinidade e/ou especificidade que conferem a elevada afinidade e selectividade para canais Kvl.3 para estas sequências. Poderia ser um análogo ou peptidomimético. 27 0 termo "determinantes estruturais de afinidade e/ou especificidade" significa, em geral, todos os grupos funcionais e as suas posições tridimensionais na estrutura polipeptídica que confere SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2 com elevada afinidade e especificidade para canais hKvl.3. Estes determinantes estruturais de afinidade e especificidade podem ser relacionados com eles próprios, parcialmente sobrepostos ou diferentes residuos de aminoácidos. 0 termo "grupo funcional" significa, em geral, uma determinada fracção química na SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3, na principal cadeia polipeptídica ou nas cadeias laterais dos seus resíduos de aminoácidos que estabelece contactos específicos e fortes com canais hKvl.3 determinando, por este motivo, a afinidade e selectividade da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 para canais hKvl.3. 0 termo "análogo equivalente funcional" significa, em geral, qualquer cadeia polipeptídica que partilha, pelo menos, 83% de identidade de sequência de pares ao longo das 36 posições alinhadas da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3 (30 correspondências ao longo de 36 posições). Poderia incluir, mas não está limitado a um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais, derivatização química de um ou mais dos resíduos e extensões N-terminais e/ou C-terminais, por outros resíduos de aminoácidos ou outras fracções orgânicas que apresentam afinidade e selectividade semelhante para hKvl.3, como apresentado na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2. O termo "peptidomimético" significa, em geral, qualquer composto químico que exibe os mesmos grupos funcionais em posições tridimensionais semelhantes como as da SEQ ID N° 1, 28 SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 mimetizando, por conseguinte, os contactos específicos da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 com canais hKvl.3. 0 termo "Péptidos da presente invenção" significa, em geral, péptidos tendo uma SEQ ID N° 3, com uma estrutura terciária mantida por quatro pontes dissulfureto, estabelecidas entre pares de cisteínas nas posições C6 e C26, C12 e C31, C16 e C33 e C21 e C36, onde a letra C representa a abreviatura de resíduos de cisteína e os números correspondem às suas posições relativas na sequência de aminoácidos alinhada. Os péptidos exemplificativos preferidos são os que têm uma sequência SEQ ID N° 1 (Vm23) e SEQ ID N° 2 (Vm24) . Os referidos péptidos são capazes de bloquearem, com elevada afinidade e especificidade, o canal de potássio Kvl.3. Estão incluídos análogos equivalentes funcionais da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3, i. e., que partilham, pelo menos, 83% de identidade de sequência de pares ao longo das 36 posições alinhadas da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3 (30 correspondências ao longo de 36 posições), conservam a estrutura terciária mantida pelas quatro pontes dissulfureto e apresentam afinidade e selectividade semelhantes para hKvl.3, como apresentado na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer dos veículos, tampões e excipientes farmacêuticos padrão, incluindo solução salina tamponada com fosfatos, água e emulsões (tais como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo) e diversos tipos de agentes molhantes e/ou adjuvantes. Os veículos farmacêuticos adequados e suas formulações são descritos em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co. , Easton, 19a ed. 1995). Os veículos farmacêuticos preferidos 29 dependem do modo de administração pretendido do agente activo. Os modos de administração típicos são descritos abaixo. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais de adição de ácido não tóxicos, incluindo sais formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico e sais formados com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malónico. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem nitrato inorgânico, sulfato, acetato, malato, formato, lactato, tartarato, succinato, citrato, p-toluenossulfonato e semelhantes, incluindo mas não limitados a catiões à base dos metais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como sódio, litio, potássio, cálcio, magnésio e semelhantes, assim como amónio não tóxico, amónio quaternário e catiões de amina, incluindo mas não limitados a amónio, tetrametilamónio, tetraetilamónio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina e semelhantes. 0 termo "composição farmacêutica" significa uma composição adequada para utilização farmacêutica num indivíduo, incluindo um indivíduo mamífero ou um indivíduo humano. Uma composição farmacêutica compreende, em geral, uma quantidade eficaz de um agente activo e um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 termo "quantidade eficaz" significa uma dosagem de um agente activo particular, neste caso um péptido que tem uma actividade de bloqueio de canal de potássio Kvl.3 suficiente para produzir um resultado desejado, por exemplo suprimindo uma resposta imunitária num mamífero, tratando uma doença auto-imune 30 num indivíduo que dela necessita, suprimindo processos de activação de células T no sistema imunitário de um mamífero, atenuando vias de sinalização de cálcio num linfócito T. 0 resultado desejado pode compreender um melhoramento subjectivo ou objectivo no indivíduo (incluindo células) que recebe a dosagem. 0 termo "indivíduo" pretende significar um animal mamífero, incluindo um humano. Os mamíferos não humanos submetidos a tratamento incluem, por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos, cães e gatos. 0 termo "doença auto-imune" significa, em geral, um estado patológico dirigido por células imunitárias de um organismo que afectam a homeostasia do referido organismo. 0 termo "doença auto-imune associada a linfóci tos Tem" significa qualquer doença auto-imune onde a célula que ataca o organismo é uma célula de linfócito TEM. Entre estas doenças estão incluídas mas não limitadas a: esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática e doença periodontal de reabsorção óssea.

Um "tratamento profiláctico" é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença ou exibe apenas sinais iniciais de uma doença, em que o tratamento é administrado para os efeitos de diminuição do risco de desenvolvimento de uma situação patológica, particularmente uma doença auto-imune, de um modo mais específico uma doença auto-imune associada a linfócitos TEm- 31

Um "tratamento terapêutico" é um tratamento administrado a um indivíduo que exibe sinais de patologia, em que o tratamento é administrado para os efeitos de diminuição ou eliminação desses riscos patológicos, particularmente uma doença auto-imune, de um modo mais específico uma doença auto-imune associada a linfócitos TEM. 0 termo "órgão" significa sistemas corporais, tais como o coração, fígado, pulmão, rim, cérebro, supra-renais, sistema endotelial vascular, sistema imunitário e semelhantes. 0 termo "sonda molecular" significa, em geral, qualquer substância química ou biológica que pode ser utilizada especificamente para identificação de células alvo, estruturas celulares, receptores ou qualquer molécula a que a sonda se pode ligar com elevada afinidade e especificidade. 0 termo "aminoácido não essencial" significa, em geral, qualquer aminoácido nas SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 que poderia ser trocado por qualquer outro aminoácido, sem alterar substancialmente a afinidade ou especificidade do análogo resultante para canais Kvl.3.

Principais constatações 0 tema principal desta invenção refere-se a dois novos péptidos (Vm23 e Vm24), suas sequências de aminoácidos (SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2), assim como possíveis análogos equivalentes funcionais e a sua potencial utilização como agentes imunossupressores específicos. 0 Vm23 e Vm24 são bloqueadores altamente selectivos de canais iónicos potássicos 32 do subtipo Kvl.3, particularmente de linfócitos humanos (hKvl.3) e mostrou-se que, in vivo, diminuem a resposta inflamatória a reacções de hipersensibilidade de tipo retardado em ratos, por este motivo estes dois péptidos e os seus análogos equivalentes funcionais são compostos principais a serem utilizados para tratamento de algumas doenças imunológicas relacionadas com respostas de células T anormais. Antes de entrar nos detalhes destes agentes imunossupressores e os seus efeitos nos canais hKvl.3, é importante rever alguns conhecimentos básicos neste campo. A regulação do potencial de membrana de todas as células é mantida principalmente pela presença de canais iónicos permeáveis a iões de potássio, simplesmente denominados canais de K. As células individuais podem expressar vários canais de K distintos que podem abrir ou fechar em resposta a alterações na voltagem, niveis de cálcio intracelular ou ligandos específicos, embora os canais dependentes de voltagem sejam os mais comuns [Gutman et al. , 2005]. Entre os ligandos naturais que podem modular a função de canais de K, estão as toxinas de venenos de abelhas, escorpiões, cobras e anémona-do-mar [Castle et al., 1989; Jouirou et al. , 2004; Rodriguez de la Vega e Possani, 2004] . Os exemplos dessas toxinas são a noxiustoxina do escorpião Centruroides noxius [Carbone et al., 1982], caribdotoxina do escorpião Leiurus quinquestriatus [Miller et al., 1985], Anuroctoxina do escorpião Anuroctonus phayodactilus [Bagdány et al. , 2005], BgK da anémona Bundosoma qranulifera [Aneiros et al., 1993] e ShK de Stichodactyla helianthus [Castaneda et al., 1995]. Mostrou-se que estas toxinas bloqueiam uma variedade de diferentes tipos e subtipos de canais de K+, incluindo Kvl.3, com diferentes afinidades e especificidades [revisto por Panyi et al. 2006]. O canal de 33

Kvl. 3 foi implicado na proliferação de linfócitos T e produção de linfocina e os bloqueadores de Kvl. 3 são de interesse como potenciais imunossupressores [Panyi et ai. 2006]. Várias destas toxinas especificas de canal de K tiveram a sua estrutura tridimensional determinada (revisto em [Mouhat et al. , 2004] . Devido à solução da estrutura tridimensional de um par de canais de K dependentes de voltagem que contêm segmentos hexatransmembranares [Lee et al. , 2005: Long et al. , 2005] e às experiências conduzidas com mutantes duplos (toxinas e canais) por vários grupos [Goldstein et ai., 1994; Stampe et ai., 1994; Aiyar et ai., 1995; Hidalgo e Mackinnon, 1995], a superfície de contacto de vários destes ligandos com canais de K foi identificada. Relativamente às toxinas de escorpião conhecidas até à data, foram estudados mais de 125 péptidos diferentes, cujas sequências de aminoácidos foram referidas [Rodriguez de la Vega e Possani, 2004]. Estes péptidos foram agrupados em 20 subfamílias diferentes, com base principalmente em três critérios: semelhança de sequência primária, posição das pontes dissulfureto e especificidade de função. Para os efeitos da presente invenção ambos os péptidos (Vm23 e Vm24) foram isolados, purificados, sequenciados e ensaiados. A originalidade e informação registada importante obtida é a singularidade da sua estrutura primária e a função altamente específica, que não é evidente por simples observação das suas características estruturais, mas necessita de prova experimental de função, in vitro e in vivo, como mostrado e reivindicado nesta invenção.

Este trabalho teve início pela recolha no campo de escorpiões da espécie V. mexicanus e pela extracção do seu veneno por estimulação eléctrica. Os escorpiões foram recolhidos no Estado de Morelos, México. Os autores têm a autorização 34 oficial para este efeito (documento número SGPA/DGVS/02483, de 18 de Março de 2005, concedido pela Secretaria de Médio Ambiente y Recursos Naturales do Governo Mexicano). Habitualmente, eram ordenhados 30 escorpiões após anestesia com dióxido de carbono (CO2) · O veneno em bruto foi processado imediatamente ou mantido congelado, a -20 °C, até ser utilizado. O veneno solúvel foi subsequentemente separado por HPLC. 0 péptido purificado, objecto desta invenção, foi adicionalmente ensaiado in vivo,· utilizando murganhos como animais de modelo para possíveis efeitos tóxicos (testes de mortalidade) e teve a sua estrutura primária determinada por degradação de Edman e análise de espectrometria de massa. Os detalhes destas experiências são descritos no exemplo 1, abaixo.

Devido ao facto da quantidade destes péptidos ser relativamente pequena no veneno, de modo a adicionalmente caracterizar a sua funcionalidade e especificidade de acção em canais hKvl.3, uma quantidade substancial de Vm24 foi quimicamente sintetizada. Síntese química de Vm24 A síntese de um péptido por meio de métodos de fase sólida inclui a utilização de uma resina de fase sólida, tais como mas não limitadas a poliestireno, poliacrilamida, determinadas fibras ou outros polímeros estáveis. A derivatização da resina de fase sólida pode ser produzida com uma manipulação adequada, tais como cloreto de clorotritilo, cloreto de 2-clorotritilo, hidroximetilfenilo, Sasrin, como um meio para produzir o ácido C-terminal de modo funcional ou pode ser preparada por meio de 35 estabilização proteolítica por meio de um ligante resinico, tal como mas não limitado a um grupo 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoximetilo. 0 agrupamento de cadeia habitualmente inclui qualquer das estratégias de grupo protector, onde o grupo protector aminoácido é t-butiloxicarbonilo (Boc) ou 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (fmoc). As cadeias laterais reactivas dos diversos aminoácidos utilizados para a síntese do péptido estão, normalmente, protegidas. Os grupos protectores geralmente utilizados incluem: t-butilo, benzilo, tritilo, metiltritilo, benzil-metilbenzilo, tosilo, benziloximetilo, t-butiloxicarbonilo, 2-clorobenzilo, 2-bromobenzilo, metoxibenzilo, formilo, acetomidometilo, sulfonilo de pentametilcromano, pentametildi-hidrobenzofurano-sulfonilo, nitro para aminas de cadeia lateral, guanidina, fenóis, álcoois, ácidos, imidazoles, tióis e índoles. Poderiam ser inventados outros grupos protectores que realizassem o mesmo objectivo de eliminação de reacções laterais indesejáveis durante o agrupamento de cadeia primária. A síntese da ligação amida durante a adição de novos aminoácidos ao péptido em crescimento pode ser alcançada através da utilização de quaisquer métodos de activação de ácido, incluindo mas não limitados a anidridos simétricos (carbodiimida), ésteres de HOBT, fluoretos de acilo, activadores de urónio, tais como mas não limitados a TBTU, HATU ou HBTU, activadores de fosfónio, tais como mas não limitados a pb, PyBOP, PyBrOP. Estes são todos os métodos de activação do grupo carboxilo que se espera que os especialistas na técnica da síntese peptídica conheçam. 36 A síntese de estruturas análogas que incluem a substituição de aminoácidos não naturais nas sequências SEQ ID N° 1 (Vm23), SEQ ID N° 2 (V24) ou SEQ ID N° 3 (sequência consenso de Vm23 e Vm24) também pode ser útil para determinadas formas de realização da invenção. A utilização de métodos convergentes, pelos quais os fragmentos do péptido são agrupados num modo pelo qual o derradeiro produto é Vm23, Vm24 ou os seus análogos, também é conhecida e pode ser utilizada por especialistas na técnica. Os métodos para a remoção por clivagem do péptido sintético do suporte sólido no final do processo sintético e o enrolamento correcto das pontes dissulfureto para obter as sequências SEQ N° 1 e 2 ou os seus análogos, também são conhecidos e podem ser reproduzidos por especialistas no estado da técnica da área técnica. A clivagem final e desprotecção e enrolamento da toxina podem ser mas não estão limitados a HF ou TFA, dependendo da estratégia empregue para a síntese. A formação da ligação dissulfureto inclui qualquer abordagem ortogonal, onde a protecção diferencial com Cys poderia ser utilizada para posicionar as ligações dissulfureto na forma correcta: ligação de C6-C26, C12-C31, C16-C33 e C21-C36 para Vm24. Contudo, a formação da ponte dissulfureto também pode ser obtida por oxidação ao ar ou reacções de rearranjo assistidas pela presença de glutationo reduzido e oxidado em diversas proporções.

Seguindo esta metodologia básica, foram produzidas sinteticamente diversas toxinas de cobra de ocorrência natural, escorpião e anémona-do-mar, marcadas radioactivamente com I125 e utilizadas como sondas moleculares para investigar a estrutura e função do canal de potássio [Strong, 1990; Moczydlowski et al. , 1998; Garcia et al. , 2001, Kem et al. , Patente US 6077680].

Muitas destas toxinas são selectivas para subtipos particulares 37 de canal de K [Auguste et al., 1990; Galvez et al., 1990; Crest et al. , 1992; Garcia-Calvo et al. , 1993; Garcia et al . , 1994,

Kem et al., Patente US 6077680]. Entre os exemplos mais frequentemente utilizados estão a dendrotoxina do veneno da cobra Dendroaspis polylepsis [Harvey, 1997], BgK da anémona-do-mar Bunodosoma granulifera [Aneiros et al., 1993; Alessandri Haber et al. , 1999] e ShK da anémona Stichodactyla helianthus [Castaneda et al., 1995; Pennington et al., 1995] e várias toxinas de escorpião, tais como noxiustoxina de Centruroides noxius [Drakopoulou et al. , 1995] e caribdotoxina de Leiurus quinquestratus [Sugg et al. , 1990], para mencionar apenas algumas. Algumas destas toxinas, tal como ShK, bloqueiam os canais de K do tipo Kvl.3 em linfócitos T Jurkat, a concentrações muito baixas (< 1 nM). Contudo, muitas delas sofrem da ausência de especificidade. Isto é, a concentrações na ordem de 10 a 100 nM, também são capazes de bloquear outros subtipos de canais. Visto que, como será demonstrado nos exemplos a serem descritos abaixo, Vm23 e Vm24 são extremamente específicos para canais hKvl.3 e têm uma estrutura primária distinta dos outros péptidos descritos até agora na literatura, foi decidido preparar o Vm24 sinteticamente. A estrutura covalente de Vm24 foi obtida por síntese química de acordo com o sistema de fase sólida de Merrifield [Merrifield, 1964], utilizando aminoácidos fmoc, como anteriormente descrito pelo presente grupo [Drakopoulou et al., 1995] . A possibilidade de substituição de alguns dos aminoácidos da estrutura primária da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 por outros aminoácidos modificados, de modo a obter-se um péptido análogo com uma meia-vida superior in vivo reduzindo, 38 deste modo, a susceptibilidade dos péptidos nativos a proteases, está dentro do âmbito da presente invenção. Isto pode incluir a recolocação ou substituição de resíduos não essenciais com recolocações isostéricas conservativas; por exemplo: lisina por glutamina ou acetil-lisina, ou um aminoácido neutro, tal como alanina, ou substituição de aminoácido Na-metilado em determinadas posições para reduzir a degradação proteolítica dos péptidos biologicamente activos. Também o truncamento da sequência primária, por deleção de determinados aminoácidos não essenciais para a função, ou a adição de resíduos extra, pode proporcionar a estrutura análoga com uma estabilidade superior in vivo. Alguns resíduos não essenciais dos péptidos da presente invenção, identificados pelo alinhamento da SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2, incluem mas não estão limitados a: os resíduos nas posições N° 10, 13, 17, 23, 29 e 35 da SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2 alinhadas ou SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3 alinhadas.

Um péptido análogo equivalente funcional pode ser produzido por inclusão de aminoácidos D seleccionados ou por síntese química de um análogo retro-inverso, onde todos os resíduos são aminoácidos D e a sequência de aminoácidos é inversa [Jameson et al., 1994; Juwadi et al., 1996]. Estas modificações poderiam aumentar a estabilidade do produto.

Outra abordagem principal é o desenvolvimento de compostos de baixo peso molecular com base nos determinantes estruturais de afinidade e especificidade da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3, de modo a produzir não peptídico (peptidomimético). Nestes estudos, são concebidos e sintetizados esqueletos não peptídicos, que contêm grupos funcionais chave da superfície de ligação do canal potássio do polipéptido parental. Existem muitos exemplos onde se mostrou que os compostos não peptídicos, 39 de ocorrência natural de baixo peso molecular, mimetizam ou antagonizam o efeito de um ligando de polipéptido ou proteína. Os compostos peptidomiméticos foram concebidos e sintetizados para um número de péptidos terapeuticamente relevantes. Um gancho presente no receptor de CD4 que se liga à proteína gpl20 de VIH foi concebido e sinteticamente obtido [Chen et al., 1992] e mostrou-se que é um bloqueador eficaz da ligação de gpl20 ao receptor de CD4 a baixas concentrações micromolares. 0 FTI-276 é outro exemplo de um mimético da região C-terminal da proteína Ras que é um potente bloqueador da sinalização oncogénica de Ras [Lerner et al. , 1995] .

Como pode ser deduzido a partir do descrito acima, existem muitas formas de preparar análogos equivalentes funcionais destes dois péptidos, Vm23 e Vm24, que podem ser utilizados como fármacos de destaque para controlar funções anormais de linfócitos T. Sabe-se que a activação imprópria de linfócitos T causa doenças auto-imunes (tais como esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática e doença periodontal de reabsorção óssea) e rejeição de transplante, entre outras.

De modo a testar a eficiência de possíveis novos fármacos imunossupressores, existem muitos modelos animais que proporcionam ensaios in vivo adequados para teste da eficiência e possíveis efeitos secundários de um novo composto desconhecido, como é o caso da reacção conhecida por hipersensibilidade de tipo retardado (resposta de DTH) em ratos, que foi utilizada na presente invenção. Como será mostrado e discutido abaixo, para avaliar o efeito protector dos péptidos da presente invenção, foram testadas pequenas doses de Vm24 para 40 controlar a reacção inflamatória que ocorre na orelha de ratos, primeiramente sensibilizados com dinitrofluorobenzeno (DNFB). Este ensaio tem sido largamente utilizado e é aceite como modelo adequado para os efeitos da presente invenção [Phanuphak et al., 1974].

Imunossupres sor

Os imunossupressores, tais como ciclosporina e FK506, apresentam graves efeitos secundários que limitam a sua utilização terapêutica. A investigação conduzida com estes dois compostos foi capaz de identificar, pelo menos, alguns dos mecanismos moleculares que são responsáveis pelos efeitos secundários indesejáveis após a administração destes fármacos. A ciclosporina interage com a proteína ciclofilina que está presente em muitos tecidos diferentes, ao passo que FK506 causa toxicidade porque visa a proteína de ligação a FK, também encontrada em muitos tecidos diferentes. Por conseguinte, tem existido um importante esforço para identificar novos imunossupressores sem sérios efeitos secundários. Um dos principais objectivos é identificar novos alvos expressos, principalmente, nos linfócitos T, tal como o canal iónico Kvl.3. Os canais de potássio Kvl.3 expressos em linfócitos T são muito importantes para determinadas funções celulares, embora o ARN codificando para esta proteína também se encontre em outras células (linfócitos B, microglia, macrófagos, osteoclastos, plaquetas e algumas células do cérebro). Contudo, apenas nos linfócitos T, o Kvl.3 domina o potencial de membrana e o seu bloqueio tem consequências funcionais significativas. Devido ao mecanismo de acção distinto dos bloqueadores de Kvl.3 e da distribuição tecidular relativamente restringida dos canais 41

Kvl.3, espera-se que um bloqueador específico e de elevada afinidade de Kvl.3 exiba menos efeitos secundários tóxicos do que a ciclosporina e FK-506, por este motivo, pode revelar-se útil para o tratamento de doenças auto-imunes, assim como para terapia de transplantação.

Os cientistas da Merck Sharpe and Dohme mostraram que a margatoxina (outro péptido de toxina de escorpião) tem um potente efeito como bloqueador do canal de Kvl.3 e é capaz de suprimir a resposta imunitária num modelo animal (porco). Contudo, a margatoxina não é especifica para canais Kvl.3, mas também afecta o canal de Kvl.2 com potência semelhante. Visto que os tecidos do coração e cérebro também expressam canais Kvl.2, o seu bloqueio poderá ter sérios efeitos deletérios. Outro péptido isolado da anémona-do-mar, ShK, é um potente bloqueador de Kvl.3 (ver Kem et al., 2000, patente US 6077680) que também afecta outros canais Kvl relacionados mas é necessária uma concentração de mais de cem vezes superior para um bloqueio semelhante. Significa que os canais relacionados são >100 vezes menos sensíveis à sua aplicação, quando comparados com Kvl.3. Os péptidos Vm23 e Vm24, objectos desta invenção, são de uma fonte biológica diferente, têm uma estrutura primária distintamente diferente da de ShK e são mais específicos para canais hKvl.3 do que ShK. 0 Vm23 e Vm24 bloqueiam ^ 50% de um par de outros canais de K, quando aplicados a uma concentração mais de 3000 vezes superior à que é necessária para bloquear a mesma fracção de canais hKvl.3, como será mostrado e discutido em detalhe nos exemplos abaixo (exemplos 7 a 10).

Esta invenção também compreende a produção de Vm23, Vm24 e os seus análogos equivalentes funcionais pelo método de fase sólida. Os processos utilizados para a síntese química incluem 42 uma série de protocolos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como detalhado na descrição do exemplo 3.

Caracterização electrofisiológica 0 desenvolvimento de uma resposta imunitária eficiente contra antigénios estranhos ou auto-antigénios requer a activação e proliferação de linfócitos específicos para um dado antigénio. Isto requer uma interacção bem coordenada entre diferentes componentes celulares do sistema imunitário. A primeira etapa neste processo é a apresentação dos antigénios processados a linfócitos por células de apresentação de antigénios profissionais [Janeway et al. , 2001]. Dentro do tema da presente invenção está a regulação das respostas imunitárias mediadas por linfócitos T (e. g., hipersensibilidade de tipo retardado) por bloqueadores específico para o canal de K dependente de voltagem, Kvl.3. Deste modo, limita-se a elaboração do envolvimento de canais de K na activação linfocítica das células T. Contudo, deve mencionar-se que a proliferação de determinados subconjuntos de linfócitos B também depende da actividade dos canais Kvl.3 [Wulff et al., 2004]. O reconhecimento do antigénio apresentado pelo receptor antigénico de células T conduz à activação, proliferação e diferenciação terminal das células [Sallusto et al., 2004]. As vias de sinalização transmembranar provocadas pelo reconhecimento antigénico, incluem a activação de várias proteínas cinases e, consequentemente, a de fosfolipase C-γ (PLC-γ). A geração de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) por hidrólise mediada por PLC-γ do fosfolípido de membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PiP2) inicia o sinal de Ca2+ 43 bifásico requerido para provocar a proliferação nas células T [Lewis, 2001]. Ο IP3 difunde-se e liga-se aos seus receptores no reticulo endoplasmático (ER), o que resulta na libertação de Ca2+ para o citosol e numa subida significativa na concentração de cálcio livre citosólico ([Ca2+]i). A subida transiente em [Ca2+]i após a libertação do ER não é suficiente para a execução da cascata de transdução de sinal, é necessário um sinal prolongado de Ca2+. Isto é realizado pelo influxo de Ca2+ do espaço extracelular através de canais Ca2+ na membrana plasmática através de canais Ca2+ activados por cálcio (canais CRAC) [Zweifach e Lewis, 1993].

Embora os canais CRAC sejam inerentemente independentes de voltagem, a corrente de Ca2+ é sensível ao gradiente electroquimico para Ca2+ que é influenciado pelo potencial de membrana das células [Panyi et al., 2004]. O influxo de Ca2+ de despolarização tem de ser contrabalançado pela activação de canais de K para fixar o potencial de membrana em valores negativos e, deste modo, proporcionar uma força motora suficiente para entrada adicional de Ca2+ [Fanger et al. , 2001]. O efluxo de K+ selectivo, regulado, é um dos principais determinantes do potencial de membrana dos linfócitos T humanos que é cerca de -50 a -60 mV. Nestas células, sob condições fisiológicas, dois tipos de canais de K conduzem fluxos de K+ para o exterior. 0 canal de K dependente de voltagem dominante em linfócitos T humanos, Kvl.3, abre após despolarização da membrana, com um limiar de activação próximo do potencial de repouso das células [Matteson e Deutsch, 1984] . 0 canal de potássio activado por Ca2+ de células T humanas, IKCal (ou KCa3.1), é activado unicamente pela subida da concentração de cálcio livre citosólico acima de -200 nM, independentemente do potencial de membrana [Grissmer et al., 1993]. 44 A contribuição dos canais Kvl.3 e IKCal para o controlo do potencial de membrana de células T depende do estado de activação das células (repouso vs. activadas) e do seu papel funcional no sistema imunitário, determinado pelo grau de diferenciação terminal das células T [Wulff et al., 2003], como descrito em detalhes na secção de Antecedentes da Invenção. Do ponto da aplicabilidade terapêutica dos bloqueadores de Kvl.3 em doenças auto- -imunes , é importante realçar que a selectividade para canais Kvl. 3 mais que para canais IKCal é de extrema importância [Wulff et al., 2003] As células T de memória efectora (Tem) que medeiam a lesão tecidular em, e. g. , esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática e doença periodontal de reabsorção óssea, selectivamente regulam positivamente os canais Kvl.3 após activação e, deste modo, o controlo do potencial de membrana destas células é determinado unicamente pelos canais Kvl.3 [Beeton et al., 2006].

Consequentemente, a proliferação destas células pode ser suprimida eficazmente e persistentemente pelos inibidores selectivos de Kvl.3 [Wulff et al., 2003; Vennekamp et al., 2004;

Beeton et al. , 2005] . Pelo contrário, as células T de memória inactivas e centrais (TCM) escapam da inibição de proliferação mediada por bloqueio de Kvl.3 [Wulff et al. , 2003] por regulação positiva transcricional de IKCal [Ghanshani et al., 2000]. A proliferação destas células pré-activadas torna-se sensível aos inibidores de IKCal, mas não aos inibidores de Kvl.3. Deste modo, uma terapia baseada em Kvl.3 que suprime a activação de células TEM, sem prejuízo significativo da proliferação de células naive e TCM, poderá ter utilização na gestão de doenças auto-imunes, particularmente doenças auto-imunes associadas a linfócitos TEM, tais como diabetes Mellitus de tipo I [Viglietta et al. , 2002; Beeton et al., 2006], artrite reumatóide [Beeton 45 et al. , 2006], esclerose múltipla, reabsorção óssea inflamatória em doença periodontal experimental [Valverde et al., 2004] e estados associados à rejeição de órgãos, tais como rejeição de enxerto crónica e doença de enxerto-versus-hospedeiro, que são propostas como sendo sustentadas por células TEM cronicamente activadas [Yamashita et al. , 2004].

Avaliaçao de selectividade Vários bloqueadores peptídicos de elevada afinidade de Kvl.3 são selectivos para Kvl.3 mais do que para IKCal, de modo semelhante para Vm24. Estes incluem toxinas de escorpião, e. g., Margatoxina (MgTx), Noxiustoxina (Ntx), caliotoxina, Anuroctoxina e toxina ShK isolada da anémona-do-mar. Contudo, os canais iónicos importantes na excitabilidade neuronal e muscular também são inibidos por estas toxinas com afinidades nanomolar-picomolar, e. g., Kvl.1 por ShK [Kalman et ai., 1998] e caliotoxina [Grissmer et ai., 1994], ao passo que Kvl.2 é bloqueado por MgTx [Koch et ai., 1997], Ntx [Grissmer et ai., 1994] e Anuroctoxina [Bagdany et ai., 2005]. A ausência de especificidade das toxinas impõe a possibilidade de efeitos biológicos significativos. Os canais iónicos da familia Kv estão largamente distribuídos em células classicamente excitáveis e não excitáveis (ver [Gutman et al., 2005] para uma revisão abrangente). Em neurónios, células de músculo esquelético e cardíaco, estes canais são determinantes críticos da excitabilidade eléctrica. Contribuem para a manutenção do potencial de membrana de repouso, a modelação dos potenciais de acção através da influência da velocidade de repolarização e determinam a frequência de pico e neuronal após 46 hiperpolarização (ver [Gutman et al., 2005] para uma revisão abrangente). Os canais iónicos expressos no sistema nervoso central estão mais protegidos contra toxinas sistematicamente aplicadas devido à barreira hematoencefálica, contudo, na esclerose múltipla, que é uma potencial área de aplicação de inibidores de Kvl.3, esta barreira está comprometida, o que conduz a toxicidade neural em modelos animais de MS [Beeton et ai., 2005]. Devido ao contacto directo das células com a corrente sanguínea, os miócitos cardíacos estão mais susceptiveis ao potencial efeito secundário de um inibidor de Kvl.3 não selectivo. Nos miócitos atriais humanos Kvl.5 [Feng et al., 1997] e nos miócitos ventriculares Kvl.4 [Patel e Campbell, 2005] e hERG (revisto em [Sanguinetti e Tristani-Firouzi, 2006] ), os canais determinam criticamente a fase de repolarização do potencial de acção, ao passo que Navl. 5 é responsável pela fase de despolarização [Rogart et al., 1989].

Os canais de K activados por Ca2+ BK são ubíquos no corpo humano (cérebro, músculo esquelético, músculo liso, células dos ilhéus pancreáticos, etc., revisto em [Wei et ai., 2005]) e regulam uma variedade de funções fisiológicas, incluindo a excitabilidade eléctrica de neurónios e células de músculo esquelético e transientes de Ca no músculo liso. Os canais BK são bloqueados por toxinas na família α-KTxl.x (e. g., caribdotoxina [Miller et al., 1985]) . A disponibilidade da estrutura cristalográfica de raios X de um canal de K dependente de voltagem bacteriano [Doyle et ai., 1998] e humano [Long et al. , 2005] expandiu significativamente a presente compreensão da base molecular da especificidade de α-KTx para diferentes canais iónicos ao longo da última década [Giangiacomo et ai., 2004], contudo, até à data, a previsão para o perfil de select ividade de uma dada 47 toxina peptídica com base na sua estrutura primária não era possível. Isto fundamenta a determinação experimental da selectividade de Vm24 contra canais iónicos tendo significância biológica e susceptibilidade conhecida para bloquear por toxinas animais.

Os avanços da biologia molecular e a clonagem de genes de canais iónicos permitiram que fossem conduzidos estudos farmacológicos em canais iónicos recombinantes. A expressão de canais recombinantes em linhas celulares adequadas proporciona várias vantagens para experiências farmacológicas, e. g., a magnitude da correntes contaminantes é negligenciável e a amplitude das correntes é adequada para ensaios farmacológicos. Além disso, os canais recombinantes expressos mantêm as caracteristicas farmacológicas dos canais expressos em células nativas.

Composiçoes farmacêuticas A invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo os péptidos da presente invenção. Como já mencionado, estes péptidos são úteis para suprimir uma resposta imunitária num mamífero, onde é activado um subconjunto específico de células T. Em particular, as composições farmacêuticas compreendendo os péptidos da presente invenção são úteis para o tratamento ou prevenção de um estado, em que a resposta imunitária é o resultado de rejeição de órgão heterólogo (por exemplo, um coração, um pulmão, um fígado, um rim ou um pâncreas) ou o resultado de uma doença auto-imune associada a linfócitos TEM. 48

Num aspecto preferido da invenção, as composições farmacêuticas compreendem os péptidos da presente invenção, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A forma preferida destas composições farmacêuticas e a selecção do veiculo farmaceuticamente aceitável dependem do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidos. As composições farmacêuticas incluem (dependendo da formulação desejada) veiculos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, não tóxicos, que são definidos como veiculos geralmente utilizados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. Adicionalmente e opcionalmente, as composições farmacêuticas também podem compreender, pelo menos, um agente imunossupressor adicional que pode ter um efeito complementar no tratamento. São alguns agentes imunossupressores ilustrativos a ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona, toxina ShK, derivados de ShK e desoxispergualina, os seus derivados, ou um seu sal. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas como mencionado abaixo. Métodos terapêuticos e profilácticos

Esta invenção proporciona composições para utilização em métodos para terapêutica ou tratamento profiláctico de estados, onde é requerida a supressão de uma resposta imunitária num mamífero, especialmente quando as células T estão activadas em indivíduos que necessitam desse tratamento, em que os referidos estados incluem rejeição de órgão heterólogo (por exemplo um coração, um pulmão, um fígado, um rim ou um pâncreas) ou doenças auto-imunes (por exemplo, esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus 49 eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática e doença periodontal de reabsorção óssea). Estes indivíduos podem incluir humanos e outros mamíferos, tais como cães, gatos, cabras, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, para mencionar alguns deles. Num aspecto, a presente invenção proporciona composições para utilização em métodos para o tratamento profiláctico ou terapêutico de estados que são tratáveis, responsivos ou sensíveis à inibição de canais de potássio Kvl.3 em membranas celulares de células T de indivíduos a necessitarem desse tratamento. Estes métodos compreendem a administração, a um indivíduo que dele necessita, incluindo um humano, de uma quantidade eficaz de um péptido da presente invenção como descrito acima. Em geral, este péptido pode compreender os péptidos Vm24 com uma SEQ ID N° 1, Vm23 com uma SEQ ID N° 2 ou um péptido tendo uma sequência SEQ ID N° 3, ou os seus análogos equivalentes funcionais, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona composições para utilização em métodos especificamente dirigidos ao tratamento e prevenção de doenças auto-imunes associadas com a activação de células T ou responsivas à inibição de canais de potássio Kvl.3. Essas doenças auto-imunes incluem mas não estão limitadas a esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática e doença periodontal de reabsorção óssea. Estes métodos compreendem a administração, a um indivíduo que dele necessita, incluindo um indivíduo humano, de uma quantidade eficaz de um péptido da presente invenção como descrito acima. 50

Noutra forma de realização preferida, a presente invenção proporciona composições para utilização em métodos especificamente dirigidos ao tratamento e prevenção da rejeição de um órgão heterólogo (por exemplo, um coração, um pulmão, um fígado, um rim ou um pâncreas). Estes métodos compreendem a administração, a um indivíduo que dele necessita (i. e., um indivíduo que receberá ou recebeu uma transplantação de órgão), incluindo um humano, de uma quantidade eficaz de um péptido da presente invenção como descrito acima.

Dosagens e métodos de administração

Em aplicações terapêuticas, um péptido da invenção é adequado para administração a um indivíduo já sofrendo de uma doença ou um estado indesejável (e. g., doença auto-imune ou rejeição de órgão heterólogo, respectivamente), numa quantidade suficiente para tratar, curar, parcialmente parar ou, de um modo detectável, abrandar a progressão da doença e as suas complicações. Uma quantidade de um péptido da invenção, eficaz para utilização em aplicações terapêuticas, irá depender da gravidade do estado, do estado geral do indivíduo e da via de administração. A quantidade eficaz do péptido em aplicações terapêuticas estará, em geral, dentro de uma gama desde cerca de 0,1 micrograma por quilograma a cerca de 10 micrograma por quilograma do péptido (ou um seu sal farmaceuticamente aceitável) por dose.

Em aplicações profilácticas, os péptidos em questão, ou as suas composições farmacêuticas, são adequados para administração a indivíduos em risco mas não sofrendo já de uma doença ou um estado não desejado. A quantidade eficaz de péptido adequado 51 para ser administrado irá depender do estado de saúde do indivíduo e estado geral do sistema imunitário. A quantidade eficaz do péptido para utilização em aplicações profilácticas estará, em geral, dentro de uma gama de cerca de 0,1 micrograma por quilograma a cerca de 10 micrograma por quilograma do péptido por dose. A via de distribuição adequada dos péptidos e composições farmacêuticas da presente invenção é determinada pela doença ou indicação clínica e pelo local onde o tratamento é requerido. Para um determinado tipo de doença, limitada a uma área do corpo restrita, pode ser desejável aplicar o péptido ou sua composição no sítio local (aplicação tópica). Alternativamente, com a progressão da doença ou simultaneamente à aplicação tópica, poderá ser desejável administrar sistemicamente o péptido ou composição.

Para outras indicações, os péptidos e composições farmacêuticas da invenção podem ser adequados para distribuição por injecção intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intranasal e intradérmica, assim como por instilação intrabrônquica (e. g., através da utilização de um nebulizador) e distribuição transmucosal, sistémica, transdérmica (e. g. , com um veículo solúvel em lípido num adesivo cutâneo), oral e gastrointestinal (e. g., com uma cápsula ou comprimido).

Um ou mais péptidos da invenção podem ser adequados para administração em terapia de combinação. Por exemplo, um ou mais péptidos da invenção podem ser adequados para administração, em combinação com outros agentes imunossupressores (tal como os acima mencionados), a um indivíduo a necessitar desse tratamento. Existem algumas doenças auto-imunes idiopáticas, 52 tais como púrpura trombocitopénica imunitária [Cooper e Bussel, 2006] ou sindrome linfoproliferativa auto-imune [Oren et ai., 2002], onde o tratamento pode requerer uma abordagem multialvo, por conseguinte é necessária mais de uma substância imunossupressora.

Os péptidos da invenção podem ser adequados para administração isoladamente ou em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável, como descrito acima na secção "Composições farmacêuticas". Os péptidos podem ser adequados para administração em doses únicas ou múltiplas. Os veículos farmacêuticos adequados incluem diluentes sólidos inertes ou espessantes, soluções aquosas estéreis e diversos solventes orgânicos não tóxicos. As composições farmacêuticas formadas através da combinação de um péptido em questão com um veículo farmaceuticamente aceitável podem ser facilmente adequadas para administração numa variedade de formas de dosagem, tais como comprimidos, pastilhas, xaropes, soluções injectáveis e semelhantes. Se desejado, os veículos farmacêuticos podem conter ingredientes adicionais, tais como aromatizantes, aglutinantes, excipientes e semelhantes.

Para administração oral, comprimidos contendo diversos excipientes, tais como citrato de sódio, carbonato de cálcio e fosfato de cálcio, podem ser empregues juntamente com diversos desagregantes, tal como amido e, de um modo preferido, amido de batata ou tapioca, ácido algínico e determinados silicatos complexos, em conjunto com agentes de ligação, tais como polivinilpirrolidona, sacarose, gelatina e acácia. Os agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, laurilssulfato de sódio e talco também são adicionados para efeitos produção de comprimidos. As composições sólidas de um tipo semelhante também 53 podem ser empregues como espessantes em cápsulas de gelatina de sal e duras. Os materiais preferidos para este efeito incluem lactose ou açúcar do leite e polietilenoglicóis de elevado peso molecular. Quando são desejadas suspensões aquosas de elixires para administração oral, aqui o ingrediente peptidico activo essencial pode ser combinado com diversos agentes adoçantes ou aromatizantes, matéria colorida ou corantes e, se desejado, agentes de emulsificação ou suspensão, em conjunto com diluentes, tais como água, etanol, propilenoglicol, glicerina e suas combinações.

As soluções dos péptidos da presente invenção são adequadas para administração parentérica, por exemplo, em óleo de sésamo ou amendoim ou em polipropilenoglicol aquoso, assim como na forma de soluções salinas aquosas estéreis dos correspondentes sais metálicos farmaceuticamente aceitáveis solúveis em água anteriormente descritos. Se necessário, essa solução aquosa deve ser adequadamente tamponada e o diluente líquido tornado, em primeiro lugar, isotónico com suficiente solução salina ou glucose. Estas particulares soluções aquosas são especialmente adequadas para injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Os meios aquosos estéreis empregues são todos facilmente obteníveis por técnicas padrão bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Adicionalmente, os compostos acima mencionados podem ser adequados para administração tópica (por exemplo, através de um cateter colocado), através da utilização de uma solução apropriada, adequada para o efeito particular. 54

Vm23, Vm24 e análogos equivalentes funcionais como sondas moleculares

Além da utilização terapêutica dos péptidos da presente invenção, estes péptidos poderiam ser utilizados para detectar e caracterizar o nível de expressão de canais Kvl.3 numa ampla variedade de células, obtidas de tecidos animais ou culturas estáveis. A importância da caracterização da expressão de Kvl. 3 em células T já foi realçada neste documento, por conseguinte, esta invenção também se refere à utilização dos péptidos da presente invenção como sondas moleculares, para fisiologicamente caracterizar as células expressando canais Kvl.3. A detecção e caracterização da expressão de Kvl.3 pode ser feita por várias técnicas de detecção utilizando péptidos convenientemente marcados da presente invenção, incluindo mas não limitados a: citometria de fluxo, microscopia de fluorescência confocal e convencional, emissão de fluorescência total, ligação radioactiva e técnicas de deslocamento e ensaios de redução imunológica. A determinação quantitativa de canais Kvl. 3 expressos numa dada célula pode ser realizada por técnicas de detecção quantitativa, incluindo mas não limitadas a: contagem de canal por microscopia de varrimento laser confocal, detecção por imuno-ouro e ligação radioactiva e técnicas de deslocamento. Além disso, as modificações químicas da cadeia polipeptídica ou cadeias laterais de vários aminoácidos não essenciais poderiam proporcionar análogos equivalentes funcionais marcados que poderiam ser utilizados para detecção e quantificação de canais Kvl.3. Por sua vez, estes análogos equivalentes funcionais poderiam ser utilizados como sondas moleculares para pesquisar para ligandos específicos, desde que estes novos ligandos partilhem o mesmo sítio de ligação em Kvl.3 que Vm23, Vm24 e os seus análogos equivalentes funcionais. Qualquer dessas 55 modificações químicas deve deixar não modificados os determinantes estruturais de Vm23, Vm24 e os seus análogos equivalentes funcionais que lhes conferem elevada afinidade e especificidade para Kvl.3. A modificação química de cadeias polipeptídicas é um processo comum para a obtenção de sondas moleculares úteis; pode ser alcançada por vários métodos largamente disponíveis e é regularmente utilizada por especialistas neste campo. 0 marcador proporcionado pela modificação poderia incluir mas não está restringido a isótopo radioactivo, fracções fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogénicas e reticulação ou fusão com proteínas de cauda (anticorpos, biotina, proteína verde fluorescente ou os seus derivados).

Nos seguintes exemplos é descrito em detalhe de que modo estes novos péptidos da presente invenção foram isolados, purificados e quimicamente caracterizados. É descrita a síntese de um péptido exemplificativo, Vm24, e a acção selectiva de dois péptidos exemplificativos da presente invenção (Vm23 e Vm24) em canais Kvl.3 de linfócitos T humanos é exaustivamente descrita. Finalmente, também é descrita a acção protectora de Vm24, a baixa concentração, no ensaio in vivo para a resposta de DTH em ratos.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar as formas de realização preferidas típicas da invenção. Se os produtos finais compreenderem as sequências aqui mostradas (SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3), ou os seus análogos equivalentes funcionais, estão obrigados a reproduzir os mesmos 56 resultados que os aqui descritos e, deste modo, espera-se que funcionem bem na prática da invenção aqui reivindicada.

Exemplo 1. Isolamento, teste de mortalidade em murganhos e determinação de estrutura primária de Vm23 e Vm24

Todos os solventes e substâncias químicas utilizados eram de grau analítico e foi utilizada água duplamente destilada em todo o processo, como anteriormente descrito [Batista et ai., 2007].

Processos de isolamento

Os processos utilizados para o isolamento dos diversos ligandos naturais mencionados acima fazem utilização de técnicas cromatográficas. 0 veneno foi solubilizado em água e centrifugado, a 10000 x g, durante 5 min. 0 sobrenadante foi recuperado e separado por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) . Cem microlitros, contendo 1,0 miligrama da proteína de veneno solúvel, foram aplicados a uma coluna de fase reversa C18 analítica (dimensões 10 x 250 mm, número de catálogo 238TP) obtida da Vydac (Hisperia, CA, EUA), de um sistema de HPLC (Millenium Millipore, Milford, MA) . Os componentes foram purificados utilizando um gradiente linear de solução A (0,12% de ácido trif luoroacético - TFA em água) até 60% de solução B (TFA a 0,10% em acetonitrilo), corridos durante 60 min. A detecção foi monitorizada por absorvência a 230 nm e eluída a um caudal de 1 mL/min. As fracções foram recolhidas manualmente e secas utilizando um secador Speed-Vac Savant. Como mostrado na Fig. 1, foram recolhidas mais de 80 fracções distintas a partir 57 desta separação por HPLC. As fracções que eluem de 20 a 35 min de tempos de retenção habitualmente correspondem ao tempo de eluição da maioria das toxinas especificas de escorpião de canal de K de outros venenos de escorpião estudados [Batista et al. , 2007]. Por esta razão, foi dedicada especial atenção aos componentes de veneno eluindo a esses tempos. Especificamente, duas fracções: uma eluindo a 23 e outra a 24 minutos foram adicionalmente analisadas, porque a determinação por espectrometria de massa dos péptidos destes tempos de eluição era estreitamente relacionada com os valores verificados para outras toxinas especificas de canal de K conhecidas, e. g., tinham massas moleculares em torno de 4000 Daltons. Visto que estes componentes eram ainda não homogéneos, foi conduzida uma segunda separação cromatográfica utilizando o mesmo sistema de HPLC mas eluido com um gradiente distinto (solvente A até 40% de solvente B, durante 60 min, utilizando uma coluna C18, número de catálogo 218TP54, da Vydac, Hisperia CA) . Como mostrado nas inserções da Fig. 1, foi isolado um componente principal de cada destas fracções iniciais (marcado com asterisco). A inserção do lado esquerdo corresponde à fracção eluindo a 23 min e aquela no lado direito à fracção eluindo a 24 min. Sob análise por determinação de espectrometria de massa e sequenciação por degradação de Edman automática, verificou-se que ambos os péptidos eram homogéneos. Aquele eluindo a 24 min, na presente condição experimental, foi analisado em primeiro lugar. Era puro e mostrou uma massa molecular de 3864 unidades de massa atómica (a.m.u.). Neste documento, irá utilizar-se, com o mesmo significado, a.m.u. ou Daltons (abreviado, Da), para designar uma unidade de massa molecular. Por esta razão, o péptido foi denominado Vm24, que representa péptido do veneno de V. mexicanus que elui a 24 min nas presentes condições experimentais. O cromatograma mostrado na inserção do lado 58 esquerdo (Fig. 1) corresponde à separação do péptido denominado Vm23. Representa péptido do veneno de V. mexicanus que elui a 23 min. A massa molecular experimental para este componente foi determinada como sendo 3665 Da.

Determinação in vivo de toxicidade de veneno total de V. mexicanus e testes de mortalidade de Vm23 e Vm24 purificados 0 efeito dos venenos e péptidos puros é, habitualmente, conduzido no laboratório utilizando, pelo menos, três modelos biológicos: mamíferos, grilos e crustáceos, uma vez que se sabe que o veneno do escorpião contém toxinas específicas de espécie. Existem toxinas específicas para mamíferos ou para diferentes tipos de artrópodes (revisto em [Possani et al., 1999]). Para os efeitos desta invenção, conduziram-se as experiências utilizando murganhos como o modelo animal, porque os resultados seriam uma indicação fiável do que poderia suceder com humanos em contacto com o veneno ou toxinas purificadas. Os murganhos injectados com diversas quantidades de veneno solúvel (de 50 a 200 micrograma de proteína por murganho de 20 grama de peso corporal) de V. mexicanus não mostraram sintomas de intoxicação. Habitualmente, se o veneno contém toxinas para humanos, com estas quantidades de material, teria sido verificado um claro sintoma de intoxicação, tais como excitabilidade, salivação, insuficiência respiratória (dispneia), paralisia dos membros traseiros, diarreia, convulsões ou até morte [Possani el al . , 1985] . Diz-se que o péptido é "tóxico" se o animal injectado apresentar qualquer dos sintomas anteriores, mas recupera no espaço de 24 horas após a administração do péptido, ao passo que se o murganho morre, é denominado "letal". Os componentes não tóxicos são os que não induzem sintomas de intoxicação e produzem 59 comportamento semelhante que murganhos injectados com PBS-solução salina, pH 7,2 [Possani et al. , 1985]. Eventualmente, o veneno total, a dosagem relativamente baixa, não é tóxico, mas os péptidos purificados a doses semelhantes podem induzir sintomas de intoxicação, porque durante a purificação a amostra é enriquecida nesse componente particular. Por esta razão e tendo em consideração que o veneno solúvel de V. mexicanus não era tóxico a 200 micrograma/20 grama de peso de murganho, o péptido puro Vm24 foi injectado em murganhos a diversas concentrações. A dose mais elevada utilizada foi 200 micrograma/20 gramas, isto é: 10000 miligrama/quilograma de peso de murganho e não foram observados sintomas de intoxicação.

Isto está certamente em contraste com componentes letais, tal como toxina Cn2, purificados de outro escorpião Mexicano Centruroides noxius. A dose cinquenta por cento letal (LD50, significando a dose que causa 50% de mortalidade num grupo de animais ensaiados) para Cn2 em murganhos é 0,25 micrograma/20 grama de peso de murganho [Zamudio et al. , 1992] . Significa que o Vm24, a uma concentração de proteína 800 vezes superior, não é tóxico para murganhos, enquanto que o Cn2 mata metade da população.

Determinação da sequência de aminoácidos de Vm23 e Vm24

Foram utilizadas duas técnicas: degradação de Edman automática e análise de espectrometria de massa (MS). A determinação directa da sequência de aminoácidos da toxina pura foi realizada utilizando um Sequenciador de Proteína LF 3000 Beckman (Paio Alto, CA, EUA), com químicos e processos proporcionados pela empresa. Uma amostra reduzida e alquilada do 60 péptido puro foi enzimaticamente clivada com endopeptidase Arg-C (Roche Diagnostics, Basileia, Suiça) , utilizando processos semelhantes, como anteriormente descrito para outros componentes de escorpião [Valdez et al. , 2004; Batista et al. , 2007; Diego-Garcia et al., 2007]. Os correspondentes péptidos foram purificados por HPLC e sequenciados. Para a espectrometria de massa, as amostras foram directamente aplicadas num espectrómetro de massa de armadilha de iões LCQDU0 Finnigan (San Jose, CA) , utilizando um sistema de distribuição de bomba de seringa Surveyor MS. 0 eluato, a 10 microlitro/min, foi fraccionado, de modo a permitir que apenas 5% da amostra entre na fonte de nanospray (0,5 microlitro/min) . A voltagem de spray foi fixada a 1,7 kV e a temperatura de capilaridade a 130 °C. Para as experiências de MS/MS, a fonte de fragmentação foi operada com 25 V de energia de colisão, 35-45% (unidades arbitrárias) de energia de colisão normalizada e o varrimento com banda larga activada. Todos os espectros foram obtidos no modo iónico positivo. A aquisição de dados e a deconvolução dos dados foram realizadas com o software Xcalibur num sistema de PC Windows NT. Os espectros de MS/MS de péptidos enzimaticamente gerados foram analisados manualmente e pelo software Sequest [Batista et al., 2007].

As estruturas primárias de Vm23 e Vm24 (ver a Fig. 2) foram determinadas e os péptidos foram utilizados para experiências electrofisiológicas, como descrito abaixo (ver os exemplos 7 a 10 anexos desta invenção). O péptido nativo repurificado da fracção eluindo a 23 min (ver a inserção esquerda na Fig. 1) foi totalmente caracterizado. Verificou-se que a sua massa molecular experimental era 3665 Da. Um nanomole deste péptido foi carregado dentro do sequenciador e os primeiros 34 aminoácidos foram directamente identificados por degradação de Edman 61 (sublinhado Directo). Os resíduos de cisteína foram confirmados por redução e alquilação, utilizando a metodologia proporcionada pela empresa (Beckman). 0 último resíduo de Vm23 na posição 35 foi determinado por espectrometria de massa. A massa molecular média teórica esperada, com base na sequência determinada, foi 3665,51 Da confirmando, deste modo, a determinação inequívoca da sequência completa. As massas moleculares teóricas experimentalmente determinadas e esperadas eram iguais, dentro do erro do aparelho utilizado (espectrómetro de massa de barreira iónica LCQDu0 Finnigan.

De modo semelhante, uma nanomole do péptido Vm24 homogéneo (repurifiçado como mostrado na inserção à direita da Fig. 1) foi submetida a degradação de Edman automática, o que permitiu a identificação dos primeiros 28 resíduos de aminoácidos (Fig. 2, marcado Vm24). A análise conduzida com diversas alíquotas do péptido reduzido e alquilado foi utilizada para confirmação dos resíduos de cisteína e para digestão com endopeptidases. A digestão de Vm24 com endopeptidase ArgC produziu três subpéptidos, um que confirmou a sequência desde os resíduos Alai até Argl7 (não indicado na figura porque compreende a mesma sequência N-terminal já determinada aquando da análise do péptido nativo - sublinhado "directo"); outro desde Alal8 até Arg29 indicado pelo sublinhado "Arg-Cl" e o último desde Lys30 até Cys36 (sublinhado Arg-C2). Estas sequências foram obtidas por degradação de Edman, em combinação com fragmentação MS/MS (ver a Fig. 2, Vm24) . Visto que os últimos resíduos foram identificados por CID (fragmentação induzida por colisão), os aminoácidos nas posições 30 e 32 poderiam ter sido lisina ou glutamina (mesmas massas moleculares) . De modo a resolver a ambiguidade, foi conduzida uma clivagem enzimática adicional deste último subpéptido com tripsina. Três péptidos pequenos 62 foram separados por HPLC, cuja sequência de aminoácidos determinada por CID foi identificada como sendo desde as posições Cys26 até Lys30 (sublinhado Trpl), Cys26 até Lys32 (não indicado, para simplificação de notação) e Cys33 até Cys36 (também não indicado). Visto que a tripsina cliva as ligações peptidicas em C-terminal das lisinas, estas duas posições foram designadas como resíduos de lisina, resolvendo inequivocamente a sequência completa. Os últimos quatro aminoácidos mais em C-terminal também foram identificados por fragmentação MS/MS de um péptido isolado após hidrólise com endoprotease Lys-C (sublinhado Lys-C) . A massa molecular média teórica do péptido esperado, assumindo um aminoácido C-terminal amidado, foi 3863,64 Da e o valor verificado experimentalmente foi 3864,0 Da, confirmando a sequência completa. Visto que a exactidão das barreiras iónicas tridimensionais está na gama de 100 ppm para péptidos abaixo de 1000 Da, a pequena diferença de 0,36 unidades está dentro do valor esperado (para referência na exactidão do equipamento ver [Aebersold e Goodlett, 2001]).

Relevante para esta invenção, é importante realçar cinco características de Vm23 e Vm24: 1) As suas estruturas primárias, comparadas com todas as outras toxinas de escorpião conhecidas até à data, têm mais de 50% de diferença (ver o exemplo 6 abaixo) . Este facto justifica a existência de uma nova subfamília (desconhecida até hoje), aqui proposta como sendo o número a-KTx 21; exemplos oí-KTx21.1 e a-KTx21.2. É uma divulgação original e, definitivamente, mostra que ambos os péptidos são estruturalmente diferentes de quaisquer outros desses ligandos, incluindo os dos péptidos dos venenos da anémona-do-mar, abelhas e cobra. 63 2) Os segmentos N-terminais de ambas as sequências até ao aminoácido na posição 10 são idênticos e 7 das 8 posições de cisteínas que mantêm as pontes dissulfureto estão em localizações idênticas da estrutura primária. As oito cisteínas (C8 ) de Vm23 estão situadas na posição 35, no extremo do lado C-terminal, um aminoácido antes em comparação com Vm2 4. Por esta razão, o Vm24 tem 36 resíduos, ao passo que Vm23 tem 35 resíduos de aminoácidos. A última cisteína de Vm23 não está amidada, mas pressupõe-se que o enrolamento estrutural é o mesmo que o de Vm24. Visto que os efeitos fisiológicos de Vm23 e Vm24 são comparáveis, espera-se que a sequência de aminoácidos na região N-terminal seja crucial para actividade. Quando se comparam as estruturas primárias de Vm23 e Vm24, verificaram-se cinco diferenças nas posições: 10, 13, 17, 23 e 29, e uma inserção/delecção entre o último aminoácido e o anterior (Y34 em Vm23 e Y35 em Vm24) . A região mais variável é na parte central de ambos os péptidos (resíduos 10 até 30, nos quais estão localizadas cinco das seis diferenças), sugerindo que possivelmente estes resíduos não são assim tão críticos para a função de qualquer dos péptidos. Convém mencionar que as substituições nas posições 17 (R/K), 23 (N/S) e 29 (R/K) são modificações conservativas, porque a arginina (R) e lisina (K) são aminoácidos básicos carregados, ao passo que as asparaginas (N) e a serina (S) são resíduos de aminoácidos hidrófilos não carregados. A ausência de tirosina na posição 35 (substituída por cisteína em Vm23), em comparação com Vm24, sugere que apenas uma tirosina é suficiente para o mesmo enrolamento e função de ambos os péptidos. 64 3) A região mais variável está, deste modo, localizada na parte central, permitindo substituições conservativas. Estas podem ser facilmente concebidas por um especialista no campo e espera-se que as modificações ou substituições por aminoácidos com propriedades fisico-quimicas semelhantes nas posições alinhadas que partilham, pelo menos, 83% de identidade de sequência de pares (como aqui mostrado para o caso de Vm23 e Vm24) gerem um análogo equivalente funcional com propriedades semelhantes e, deste modo, deve encontrar-se abrangido pelo âmbito da presente invenção. 4) A característica mais importante, contudo, como mostrada e discutida nos exemplos 7 a 10 abaixo, é a elevada afinidade que o Vm23 e Vm24 têm para canais hKvl.3, quando comparados com outros subtipos de canais de potássio. O Vm23 e Vm24 têm afinidade mais elevada para hKvl.3 do que os outros bloqueadores conhecidos, tais como Caribdotoxina, Anuroctoxina, BgK, ShK, etc. [Panyi et al., 2006]. Os outros bloqueadores mencionados acima têm sequências de aminoácidos e/ou emparelhamentos dissulfureto altamente distintos ou apresentam uma distinta especificidade de acção e afinidade de ligação para canais Kvl.3. Da simples análise das estruturas primárias de Vm23 e Vm24, não é óbvio que devem afectar canais Kvl.3 em modos semelhantes aos mostrados para as outras toxinas de escorpião ou anémona-do-mar. Deste modo, as sequências relativamente às quais uma informação e utilização proprietárias são aqui reivindicadas para Vm23 e Vm24, não poderia ser evidente a partir do conhecimento dos outros péptidos que afectam canais Kvl.3. Esta invenção faz referência a sequências de aminoácidos completamente distintas e novas (ver as 65 SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 3) . Evidência adicional, mostrando que a sequência determinada é correcta, provém dos resultados obtidos com um Vm24 sinteticamente preparado. 0 Vm24 nativo e o sinteticamente preparado têm exactamente as mesmas acções fisiológicas, como mostrado abaixo (exemplo 9). 5) Finalmente, outro facto importante verificado com estes dois péptidos, é que não são tóxicos quando injectados em animais experimentais a concentração relativamente alta (até 10000 micrograma por 2 0 grama de peso de murganho) . Isto é mais significativo quando se compara com outras toxinas de veneno de escorpião conhecidas, e. g., Cn2 de Centruroides noxius, como mencionado anteriormente [Zamudio et al., 1992]. O Cn2 injectado dentro de murganhos, a uma dose cerca de 800 vezes mais baixa do que Vm24, causa 50% de mortalidade.

Exemplo 2: Análise de impressão digital de massa dos componentes presentes no veneno de V. mexicanus.

Os venenos de escorpião são misturas de componentes altamente complexas, compreendendo péptidos de cadeia curta e comprida, activos em canais iónicos (revisto em [Possani e Rodriguez de la Vega, 2006]), aminas livres, nucleótidos, hidratos de carbono, lípidos (revisto em Possani et al. , 1999), enzimas, tais como fosfolipases [Zamudio et al., 1997: Valdez et al., 2004], hialuronidases e lisozimas [Batista et al., 2007] e muitos outros componentes proteicos de função desconhecida [Diego-Garcia et al., 2007]. Adicionalmente, os escorpiões são criaturas muito antigas, com mais de trezentos milhões de anos 66 de evolução à superfície da Terra e tiveram tempo para seleccionar ferramentas específicas para caçarem as suas presas ou para se defenderem dos predadores. Por estas razões, é apelativo e sensato pesquisar nos seus venenos para a presença de componentes biologicamente activos. Devido aos recentes, quando comparado com outros subtipos de canais de potássio, o Vm23 e Vm24 têm afinidade mais elevada para hKvl.3 do que os outros bloqueadores conhecidos, tais como Caribdotoxina, Anuroctoxina, BgK, ShK, etc. [Panyi et al. , 2006]. Os outros bloqueadores mencionados acima têm sequências de aminoácidos e/ou emparelhamentos dissulfureto altamente distintos ou apresentam uma distinta especificidade de acção e afinidade de ligação para canais Kvl.3. Da simples análise das estruturas primárias de Vm23 e Vm24, não é óbvio que devem afectar canais Kvl.3 em modos semelhantes aos mostrados para as outras toxinas de escorpião ou anémona-do-mar. Deste modo, as sequências relativamente às quais uma informação e utilização próprias registadas são aqui reivindicadas para Vm23 e Vm24, não poderia ser evidente a partir do conhecimento dos outros péptidos que afectam canais Kvl.3. Esta invenção faz referência a sequências de aminoácidos completamente distintas e novas (ver as SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2). Evidência adicional, mostrando que a sequência determinada é correcta, provém dos resultados obtidos com um Vm24 sinteticamente preparado. O Vm24 nativo e o sinteticamente preparado têm exactamente as mesmas acções fisiológicas, como mostrado abaixo (exemplo 9). 5) Finalmente, outro facto importante verificado com estes dois péptidos, é que não são tóxicos quando injectados em animais experimentais a concentração relativamente alta (até 10000 micrograma por 2 0 grama de peso de murganho) . Isto é mais significativo quando se compara com outras 67 toxinas de veneno de escorpião conhecidas, e. g., Cn2 de Centruroides noxius, como mencionado anteriormente [Zamudio et ai., 1992] . 0 Cn2 injectado dentro de murganhos, a uma dose cerca de 800 vezes mais baixa do que Vm24, causa 50% de mortalidade.

Exemplo 2: Análise de impressão digital de massa dos componentes presentes no veneno de V. mexicanus.

Os venenos de escorpião são misturas altamente complexas de componentes, compreendendo péptidos de cadeia curta e comprida, activos em canais iónicos (revisto em [Possani e Rodriguez de la Vega, 2006]), aminas livres, nucleótidos, hidratos de carbono, lipidos (revisto em Possani et al., 1999), enzimas, tais como fosfolipases [Zamudio et ai., 1997: Valdez et ai., 2004], hialuronidases e lisozimas [Batista et ai., 2007] e muitos outros componentes proteicos de função desconhecida [Diego-Garcia et al. , 2007]. Adicionalmente, os escorpiões são criaturas muito antigas, com mais de trezentos milhões de anos de evolução à superfície da Terra e tiveram tempo para seleccionar ferramentas especificas para caçarem as suas presas ou para se defenderem dos predadores. Por estas razões, é apelativo e sensato pesquisar nos seus venenos para a presença de componentes biologicamente activos. Graças aos recentes avanços nas metodologias e equipamentos de espectrometria de massa, é agora possível obter-se uma análise de impressão digital de massa do veneno total. Por estas razões, um dos primeiros estudos conduzidos com o veneno solúvel de V. mexicanus foi a identificação das massas moleculares de todos os componentes, que poderiam ser identificados através da utilização de um espectrómetro de massa de barreira iónica 68 (EIS/MS) LCQduo Finnigan (San Jose, CA) e um aparelho de tempo-de-voo de desorção laser assistido por matriz (MALDI-TOF), modelo Ettan MALDI-TOF/Pro, da Amersham Biosciences (Uppsala, Suécia) . A estratégia utilizada foi pré-seleccionar, por separação por HPLC, péptidos puros ou famílias de componentes relacionados, eluindo como misturas na coluna reversa C18 (Fig. 1) e, depois, analisar a sua massa molecular por espectrometria de massa. Na Tabela 1, é listado o tempo de retenção das fracções recolhidas do sistema de HPLC, seguido das massas moleculares de componentes verificados em cada fracção. Foram determinados para cima de 340 componentes de massa molecular distinta. Convém mencionar que alguns componentes surgem em duas subfracções contíguas do sistema de separação por HPLC e, nesses casos, apenas um foi contado. Igualmente, algumas fracções não foram identificadas (marcadas ND). TABELA 1: RT Massa média RT Massa média 2, 92 222,334, 260,168, 372,815 27, 12 1340,203, 1642,177 2620,029 5, 06 272,055 28,24 2084,938, 2883,506 3770,697 B 5, 06 429, 1 28, 72 222,295, 373,089, 4037, 264, 4062,469, 4860,475 7, 40 - ND 29, 12 2028,249, 4044,625 4743,102 9, 84 1235,349 S 29,82 1989,272, 2117,962 69 (continuação) RT Massa média RT Massa média 3770,356, 3828,061, 4048,342, 5125,488 10, 78 994,899, 1047,829, 29,82 2368,289, 2514,764, 1234,056 3772,141, 4131,437, 4196,231, 5612,061, 5684,0 11,28 117,063, 1234,349 30,62 1219, 7, 2029,978, 2756,56, 4051,043, 5487,234 Bll,28 - ND 31,20 1894,409, 2288,761, 3544, 3695,567, 3873, 4053,615, 4623,314, 5309,113, 5468,43, 8340,499 13, 07 300,703 31,71 2526,804, 4053,34, 4256,777, 4623,389, 8184,727 14 1466,168, 1960,937, 32,22 2610,12, 3068,716, 2363,969, 4050,544, 4251,603, 2441,293,3091,036 4616,633, 8157,368 14,96 - ND 32,78 1727,988, 3115,418, 3838,78, 6231,008 15 272,091, 334,602, 33,47 1288,661, 1630,123, 427,197, 1086, 902, 1856,102, 2076,866, 1689,2 2116,85, 2306,616, 3302,189, 4160,467, 4322,925, 5434,357, (continuação) RT Massa média RT Massa média 8364,316, 9125,702, 15373,608 16,22 - ND 34, 11 1811,589, 2792,828, 2890,806, 3272,21, 4008,728, 4044,677 16,70 324,238, 418,72, 501, 4, S135,79 3032,485, 3862,668, 834, 6, 1049,296, 7469,49 1877,397 17,34 261,344, 1205,752, S2 2558,149, 3032,024, 1274,737, 35, 72 3987,629, 4232,375, 1876,767, 1886,725 8260,244 17,66 261,283, 1243,892 S3 3037,876, 3058,507, 35, 79 3738,686, 4027,624 18,35 208,909, 223,509, 35, 79 3038,075, 3738,649, 373,827, 1436,27, 4027,696, 8269,386 1652,505 19, 10 1148,738, 2096,296, 36,19 2814,497, 3038,868, 2297,193, 2318,577, 3564,677, 3721,56, 2353,524 3807,978, 3878,666, 4027,936, 8267,094, 13944,696 B 19,10 2377,208, 2593,419, 36,72 3588,529, 3610,297, 2610,334 3625,895, 3983,521, 4020,726, 4223,762 20,14, 2593,88 46,53 3915,145, 4051,546, 4319,845, 4710,326, 4782,406, 4868,122, 5107,706, 7067,905, 71 (continuação) RT Massa média RT Massa média 13435,689 20,14,2 1464,42, 2098,654, 46, 86 3920,472, 4236,709, 2594,163, 2610,477 5044,021, 5182,747, 8246,293, 11459,022, 13358,3, 16209,23 20,23 - ND 47, 82 4298,5, 4700,818, 5272,777, 12469,982 20,96 1866,081, 3777,92 48,70 2166,644, 2304,621, 2569,271, 2768,228, 3278,62, 3424,448, 3819,497, 3916,217, 4265,672, 4292,422 21,98 431, 4, 714, 7, 1259,696, 49 5953,928, 11315,991 3777,049 22,40 533, 5, 788, 5, 2286,744, 49,6 - ND 4024,456, 4980,605 23,39 1014,47, 1129, 8, 50,75 -ND 1390,042, 1521,099, 1902,299, 2111,018, 2228,143, 2311,791, 3665, 4025,1 S24,11 1048,604, 1657,949, 51,66 - ND 2310,809 S 24,11 1048,604, 1657,949, 52,34 - ND 2310,809 24,11 1952,328, 2166,86, 3864, 53,31 3460,978, 3807,741, 5338,229 5673,486, 10978,726, 16185,602 , 24611,234 72 (continuação) RT Massa média RT Massa média B 24,11 253,04, 875,42, 1398,661, 1948,124, 2436,139, 2679,346, 5336,308 53, 84 3548,378, 3591,69, 3899,344 25, 10 1489,6, 1511,315, 1617, 7, 2529,512, 3864,577 54, 27 -ND 25,10,2 253, 073, 590, 4, 1194,739, 1511,312, 1985,92, 2075,691 55, 20 - ND 25,52 1485,399, 1728,229, 2258,489, 2387,001 56,27 1603,661, 1640,656 26,10 422, 3, 462, 4, 1327, 008, 1495,436, 2258,772, 2620,03, 3870,226,3917,489 58,92 -ND 26,51 1234,369, 2621,099, 3871,574

Os componentes marcados com números a negrito significam que estavam presentes em concentração mais alta no veneno, ao passo que os em números em itálico significam que o componente foi identificado apenas no espectrómetro EIS/MS. Quando o tempo de retenção é precedido pela letra S significa que o pico cromatográfico não era simétrico e a fracção recolhida corresponde ao segmento ascendente da curva, ao passo que se a letra for B significa o segmento descendente da curva. Os 73 números em itálico significam que a massa molecular correspondente foi obtida apenas por EIS/MS. Alguns valores não foram determinados (ND).

Os diversos componentes registados na Tabela 1 foram analisados e arbitrariamente agrupados de acordo com o peso molecular em incrementos de mil, iniciando com os que tinham menos de 500 Da, depois, de 500-1000, 1000-2000 e assim por diante até 9000-10000 Da (cada grupo com diferença de 1000) . Mais de 90% dos componentes identificados têm massas moleculares abaixo de 10000 Da de peso molecular. Três grupos tinham, pelo menos, 60 componentes diferentes. Encontram-se abrangidos pela gama de 1000-2000; 2000-3000 e 3000 até 4000 Da. Mais de 40 componentes tinham massas moleculares desde 4000 até 5000 Da.

Estes resultados foram importantes para a escolha dos péptidos apropriados para a análise funcional. A base racional utilizada é discutida e publicada num artigo recente pelo grupo da requerente, utilizando o escorpião Tityus stigmurus [Batista et al., 2007], na qual foi conduzida uma análise comparativa tendo em consideração diversas análises de impressão digital de massa de diferentes espécies de escorpiões (V. mexicanus não incluído). É comum verificar-se que os péptidos com pesos moleculares na ordem de 4000 Da são específicos para o reconhecimento de canais iónicos permeáveis a iões K+. Por esta razão, seleccionaram-se péptidos nesta gama de massas moleculares para os estudos fisiológicos, descritos abaixo. Seguindo esta estratégia, os dois péptidos: Vm23 e Vm24 foram seleccionados para determinação de estrutura primária (Fig. 2) e ensaios fisiológicos adicionais (ver abaixo, exemplos 7-10). 74

Exemplo 3: Caracterização da sequência de aminoácidos C-terminal de Vm23 e Vm24

Relativamente ao último resíduo na sequência de aminoácidos C-terminal de Vm23, os resultados são claros. A análise de sequência descrita no exemplo 1 desta descrição, cuja sequência é mostrada na figura 2, não deixa muitas dúvidas de que o último resíduo não está amidado e termina a estrutura primária com um resíduo de cisterna de carboxilo livre.

Contudo, para Vm24, os resultados de espectrometria de massa sugerem que o resíduo C-terminal poderia estar amidado. A literatura refere exemplos onde a amidação do último aminoácido de um dado péptido é importante para a definição da sua função biológica. Um desses exemplos é o caso verificado para a toxina HsTxl do escorpião Heterometrus spinnifer [Lebrun et ai., 1997]. As experiências electrofisiológicas demonstraram que a forma amidada desta toxina é 5 vezes mais potente do que a forma carboxilo terminal livre e é até 300 vezes mais activa em experiências de ligação a sinaptossomas de cérebro de rato [Lebrun et ai., 1997] . Por esta razão, é muito importante ter a certeza da forma química do último resíduo de Vm24. Como mencionado na discussão do exemplo 1, a massa molecular experimental verificada para Vm24 foi 3864 Da e o peso molecular teórico esperado a partir da sequência de aminoácidos mostrado na Fig. 2 foi 3864, 6 Da. Os dois valores são diferentes em 0,6 a.m.u, o que poderia ser atribuído à presença de um resíduo C-terminal amidado de Vm24. As experiências de dissociação induzida por colisão (CID), realizadas com o péptido C-terminal (909,4 a.m.u. - massa monoisotópica) produzido por clivagem com Arg-C, mostram todos os valores da série do ião y 1,0 a.m.u. mais baixa do que os teoricamente esperados para um péptido 75 carboxilo terminal livre e valores exactos para a série de iao b, confirmando que o C-terminal da toxina está amidado (Fig. 3) .

Para esta experiência, uma alíquota de 25 microgramas de proteína de Vm24 foi enzimaticamente clivada com a enzima Arg-C, utilizando o mesmo processo descrito no exemplo 1 acima [Valdez et al. , 2004; Batista et al. , 2007]. O produto da hidrólise enzimática foi separado por HPLC no mesmo sistema como descrito na Fig. 1. Todos os péptidos na forma homogénea foram sistematicamente analisados por MS e o péptido com massa molecular de 909,5 a.m.u. foi submetido a análise MS/MS. O protocolo experimental montado para a fonte de ionização de nanospray do espectrómetro de massa foi 130 °C para o capilar de aquecimento e 1,65 kV como voltagem de spray. O sistema de distribuição de solvente Surveyor foi operado com 0,6 microlitro/min, utilizando acetonitrilo (AcCN) a 50% no modo linear. Os varrimentos MS/MS foram definidos com 200 varrimentos/milissegundo de tempo de injecção, banda larga activada, 25 V de energia de colisão, 1,0 (m/z) de largura de isolamento e 40% de energia de colisão normalizada. Os dados foram analisados manualmente e automaticamente, utilizando a ferramenta MS-product do Protein Prospector (http://prospector.ucsf.edu/), desenvolvida pela Universidade da Califórnia — San Francisco Mass Spectrometry Facility. A ferramenta MS-product permitiu a estimativa dos possíveis fragmentos iónicos produzidos para o péptido KCKCYYC, utilizando massa monoisotópica, cisteínas não modificadas e resíduo N-terminal não bloqueado. O cálculo foi realizado para ácido carboxílico terminal livre e para o péptido C-terminal amidado. Para esta avaliação, foi escolhido um instrumento de barreira iónica ESI. A fragmentação teórica do péptido C-terminal amidado foi realizada utilizando o Protein Prospector, que mostrou 76 exactamente os mesmos valores que para os obtidos experimentalmente para b (232,11, 360,21, 463,22, 626,28 e 789,34) e para os iões y (782,27, 679,26, 551,16, 448,15, 285,09 e 122,03). Por conseguinte, o péptido Vm24 possui o C-terminal amidado, isto é, um resíduo de cisteinamida.

Exemplo 4: Determinação das pontes dissulfureto de Vm24

Devido à sua dimensão reduzida, a toxina Vm24 é uma molécula ideal para o estudo de relações estrutura-função. O péptido contém oito resíduos de cisteína, localizados nas posições 6, 12, 16, 21, 26, 31, 33 e 36 que formam quatro ligações dissulfureto intramoleculares. Este exemplo descreve a determinação do padrão de ligação dissulfureto de Vm24 utilizando determinação de degradação de Edman e espectrometria de massa de péptidos purificados por colunas RP-HPLC, após clivagem com enzimas proteolíticas. 0 emparelhamento dissulfureto foi determinado por análise de espectrometria de massa de fragmentos peptídicos, obtidos após clivagem com endopeptidase de toxina pura e sua separação por HPLC. Uma amostra de toxina contendo 25 microgramas de proteína foi incubada com uma mistura igual (0,5 micrograma cada) de quimotripsina e tripsina (Boehring Manheim, Alemanha) em Tris-HCl a 150 mM, pH 6,8, durante 12 h, a 37 °C. Os péptidos gerados foram separados por HPLC utilizando uma coluna de fase reversa C18 (número de catálogo 218TP54, da Vydac, Hisperia, CA). Um gradiente linear de solvente A (TFA a 0,12% em água) até 60% de solvente B (TFA a 0,10% em acetonitrilo) foi aplicado à coluna e corrido durante 60 minutos. Os picos efluentes foram recolhidos e imediatamente liofilizados. Os péptidos individuais 77 foram analisados por fragmentação de espectrometria de massa (MS/MS) a partir da qual foi obtida a sequência de aminoácidos. Visto que a estrutura primária era conhecida, a atribuição das pontes dissulfureto poderia ser inferida. A comparação de massa molecular das formas reduzida e oxidada de Vm24 mostra exactamente 8 a.m.u. de diferença; a massa molecular experimental verificada para o péptido nativo foi 3864,0 a.m.u. e para o péptido reduzido completo foi 3872 a.m.u, confirmando que todas as cisteinas estão envolvidas na formação de pontes dissulfureto. Foram obtidos três fragmentos peptídicos principais da digestão simultânea com quimotripsina e tripsina, a pH 6,8 (pH ligeiramente acidico, de modo a prevenir rearranjos dissulfureto mistos), mostrando massas moleculares monoisotópicas de [M+H]+ 788,0, [M+H]+ 560,4 e [M+2H]2+ 1099, 7 a.m.u. (Fig. 4-1, 4-2 e 5A) . O péptido com [M+H]+ 788,0 corresponde exactamente ao peso molecular esperado dos pares de cistina (C4-C8), do sequência de aminoácidos do heterodimero AQGCK-CY (Fig. 4-1) . A segunda ponte dissulfureto determinada foi C3-C6, que tem valores teóricos e experimentais iguais de 560.4 a.m.u. (Fig. 4-2). Ambos os péptidos foram adicionalmente caracterizados por experiências CID, mostrando as sequências de aminoácidos esperadas. O sinal em m/z [M+2H]2+ 1099,7 a.m.u. (massa deconvoluta 2197,4) provém do núcleo do heterodimero contendo os últimos dois hemi-pares de cistina (Fig. 5A) . Este fragmento foi analisado directamente. A série dos iões CID do sinal em m/z [M+2H]2+ 1099, 7 mostra dois valores iónicos que satisfazem a condição para a determinação completa dos últimos dois pares de cistina. O ião b em 1507, 4 e o ião y em 691,3, que são produtos da mesma ligação de clivagem de amida entre o ácido glutâmico (Eli) e Cisteina (C12), claramente atribuem os hemi-pares C1-C5 e C2-C7. Além disso, os 78 valores de fragmentação in tandem do ião b 1710,5 no ião b 1137,3 caracterizam o marcador interno (GSPEC-C) com valores de massa inequívocos, confirmando a disposição das pontes dissulfureto esquematicamente representada na Fig. 5B).

Exemplo 5: Sintese quimica de Vm24

Neste exemplo, e antes de descrever a síntese química de Vm24, é importante abordar alguns conceitos básicos no tema da química peptídica e a base racional para a produção de ligandos por síntese química, em vez de por extracção natural dos produtos existentes.

Muitos polipéptidos tóxicos foram purificados de fontes de veneno e mostraram ser valiosas ferramentas para o estudo da comunicação celular, pois afectam a distribuição iónica na membrana biológica através da ligação a receptores (maioritariamente, canais iónicos para o caso das toxinas de escorpião) e causarem a despolarização da célula ou modulação dos potenciais eléctricos nas membranas, controlando, deste modo, a função celular. Por estas razões, a pesquisa de péptidos tóxicos específicos que possam discriminar tipos ou subtipos distintos de canais iónicos são avanços terapêuticos valiosos no tratamento de uma gama de estados fisiológicos ou anormais de animais experimentais e, eventualmente, para o tratamento de patologias humanas. A maioria dos péptidos conhecidos são estruturas curtas, bem enroladas e compactas, apresentando uma série de vantagens sobre outros compostos orgânicos, tais como elevada potência, boa especificidade de direccionamento, elevada solubilidade e rápido começo de acção. Além disso, são frequentemente proteínas pequenas intercruzadas por várias 79 pontes dissulfureto. Estas características estruturais conferem a estes péptidos um elevado grau de estabilidade, embora o correcto enrolamento de um derivado sinteticamente preparado coloque alguns problemas adicionais a uma sintese conveniente. Contudo, as quantidades destes polipéptidos presentes em fontes de veneno são, habitualmente, bastante pequenas. Com efeito, visto serem tão específicos e eficientes nas suas acções fisiológicas, o animal que produz estes péptidos não necessita de produzir grandes quantidades de modo a utilizá-los num modo eficaz, para a captura das suas presas ou na sua própria defesa de predadores. Embora as quantidades destes diversos péptidos directamente isolados das fontes sejam, habitualmente, suficientes para caracterizar o mecanismo de acção geral e tenham permitido, no passado, a condução da caracterização estrutural do péptido, principalmente por técnicas de ressonância magnética nuclear, habitualmente é necessário produzir o mesmo péptido, ou os seus derivados sinteticamente, dependendo do âmbito pretendido pela investigação ou aplicações clínicas. A determinação da estrutura tridimensional do péptido e da identificação da superfície implicada no reconhecimento dos lados do receptor (canais iónicos) são fundamentais para a concepção de versões modificadas do modelo inicial ou para a síntese de peptidomiméticos.

Descreve-se aqui a síntese química de Vm24. Historicamente, o Vm24 foi identificado antes do Vm23. Por esta razão, a maior parte do trabalho detalhado, tema desta invenção, foi realizado e aqui descrito para o caso de Vm24 e, depois, foi confirmado como sendo verdadeiro para ambos os péptidos. 80

Um análogo linear de Vm24 foi sintetizado pela metodologia de fase sólida em resina Rink Amide MBHA, (Calbiochem-Novabiochem Corp) . Os aminoácidos Fmoc (Calbiochem-Novabiochem Corp) foram utilizados com a seguinte protecção de cadeia lateral Arg(Pbf), Asn(Trt), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu),

Lys(Boc), Ser(tBu) e Tyr(tBu).

0 grupo Fmoc foi removido por tratamento com piperidina a 20% em dimetilformamida (DMF), durante 20 min, seguido de lavagem com DMF. Os aminoácidos Fmoc (0,5 mmol) foram ligados como ésteres activos pré-formados em DMF com HBTU (2-(1-H-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametil-urónio hexafluorofosfato)/DIEA (diisopropiletilamina) (0,45 mmol/0,75 mmol, activação de 2 min) como agentes de activação. Os tempos de ligação foram 30 min. As aminas livres não reagidas ou desbloqueadas foram monitorizadas através do teste de ninidrina (Sarin et al. 1981), em cada ciclo da síntese peptídica. Durante toda a síntese, antes da ligação do aminoácido seguinte, as aminas livres residuais indesejáveis foram bloqueadas por acetilação. Todas as operações foram realizadas manualmente, num recipiente de reacção de vidro de 50 mL, com uma tampa de rosca revestida com Teflon. A resina do péptido foi agitada por suave inversão durante a desprotecção de Na e etapas de ligação. (1,7 gramas) foram clivadas da resina e simultaneamente desprotegidas utilizando reagente K [Drakopoulou et al. 1995], durante duas horas, à temperatura ambiente. Após a clivagem, o péptido em bruto foi precipitado e lavado com éter t-butílico gelado, depois, dissolvido em 20% de ácido acético aquoso. O produto foi liofilizado e mantido desidratado, a -20 °C, até ser utilizado. 81 A reacção de ciclização para preparar as correspondentes pontes dissulfureto da molécula foi efectuada em NaCl a 0,1 M, glutationo reduzido a 5 mM, glutationo oxidado a 0,5 mM, Na2HP04 a 20 mM (pH 7,8) e 30 μΜ de Vm24 sintético não enrolado. 0 produto ciclizado em bruto foi purificado em duas etapas por HPLC. A primeira utilizou uma coluna preparativa Cis (238TP1022 Vydac) , com um gradiente linear de solução A (TFA a 0,12% em água) até solução B (TFA a 0,1% em acetonitrilo) corrido até 60% de B, em 6 0 min. 0 perfil do cromatograma obtido é mostrado na Fig. 6. 0 componente principal (marcado número 1 na figura 6) foi finalmente purificado utilizando uma coluna analítica Cis (218TP54 Vydac) corrida com gradiente linear de solvente A até 40% de B, em 60 min (inserção da Fig. 6). A estrutura e a pureza da toxina sintética foram confirmadas por HPLC analítico, determinação de sequência de aminoácidos e espectrometria de massa. A sequência de aminoácidos foi efectuada num Sequenciador de Proteína LF3000 Beckman (Fullerton, CA) e a análise de espectrometria de massa foi feita num espectrómetro LCQDuo Finnigan (San Jose, CA. USA). A exactidão da sequência de aminoácidos foi verificada por degradação de Edman directa até ao resíduo número 30. O tempo de eluição da coluna de HPLC coincidiu exactamente com o tempo onde o péptido nativo elui da mesma coluna em condições idênticas. Os exemplos do padrão de eluição obtidos com Vm24 nativo (Fig. 7A) , Vm24 sintético como aqui descrito (Fig. 7B) e uma mistura equimolar de Vm24 nativo e sintético (Fig. 7c) são mostrados na figura 7. A massa molecular determinada por espectrometria de massa foi 3864 Da, mostrando que corresponde exactamente à da sequência esperada. Convém notar que a resina utilizada está concebida para a produção de um péptido amidado C-terminal, exactamente como é o caso para Vm2 4 . 82

De cerca de 1,7 gramas de resina contendo o péptido sinteticamente preparado com a sequência primária esperada de Vm24, foram obtidos cerca de 300 miligramas de péptido correctamente enrolado, representando um rendimento de 30% de valor esperado teórico (da resina de partida).

Exemplo 6: Comparação de sequência de aminoácidos

As sequências da SEQ N° 1 e SEQ N° 2 mostram alguma semelhança com outras toxinas de escorpião de cadeia curta, classificadas dentro da família α-KTx [Tytgat et ai., 1999], tal como cadeia peptídica curta, rica em resíduos de aminoácidos básicos e padrão de cisteína semelhante. Todos os membros desta família são estruturalmente relacionados e desempenham funções semelhantes como bloqueadores de canais de potássio; não obstante, apresentam selectividade variável para determinados tipos e subtipos de canais de potássio [Rodriguez de la Vega e Possani, 2004; Panyi et ai., 2006]. A base racional seguida pelo painel internacional de especialistas que propuseram a classificação foi que uma dada subfamília poderia ser identificada por uma elevada percentagem de semelhança entre os seus membros e uma baixa identidade com membros de outras subfamílias [Tytgat et ai., 1999]. Mais tarde, foi demonstrado que esta distinção espelhava, até certo ponto, o espectro farmacológico da maioria das subfamílias (Rodriguez de la Vega et ai., 2003; Zhu et ai., 2004] . Por este motivo, tendo em consideração a variabilidade relativamente restringida da família — devido ao seu reduzido tamanho — é importante identificar as características moleculares e estruturais que conferem um dado espectro funcional. Este género de análise é, habitualmente, realizada por comparação de sequência e 83 inferência filogenética. A ideia subjacente a estas comparações baseia-se na suposição de que as proteínas pertencendo à mesma linhagem devem ser aparentadas por eventos de especiação seguidos ou concomitantes a duplicação e divergência do gene ou genes ancestrais, tornando possível a reconstrução da sua história evolutiva por análises bioinformáticas e ajudando a depurar o panorama de ajuste num dado espaço de sequência [Thornton and DeSalle, 2000; Orengo e Thomton, 2005] .

Utilizando programas que realizam pesquisas heurísticas dentro de alinhamentos locais (BLAST [Altschul et al. , 1990] e FASTA 3 [Pearson e Lipman, 1988]) para a identificação de semelhanças de sequência de Vm24 e Vm23, foram identificados poucos parentes com valores esperados bastante baixos (valor E >10-5). Uma inspecção mais minuciosa contra todas as toxinas de cadeia curta referidas até à data sugere que Vm24 e Vm23 são, possivelmente, novos membros da subfamília 6 de a-KTx (seguindo a proposta de [Tytgat et al., 1999]). A comparação de pares, contudo, revela baixa identidade com outros membros da subfamília (Figura 8) . A extensa diversificação de sequência da família α-KTx torna muito difícil determinar se Vm24 e Vm23 pertencem ou não a qualquer das 20 subfamilias de a-KTx anteriormente caracterizadas. De modo a clarificar a relação com a família de α-KTx, foi realizada uma análise de inferência filogenética Bayesiana, como descrito anteriormente [Bagdany et al., 2005] com MrBayes 3.04b [Huelsenbeck e Ronquist, 2001;

Ronquist e Huelsenbeck, 2003], utilizando o alinhamento de múltiplas sequências de 92 sequências pertencendo à família a-KTx. A inferência filogenética Bayesiana estima a probabilidade posterior de uma dada topologia de árvore, por um processo de amostragem baseado na cadeia de Markov de Monte Cario (MCMC), ao longo de n-1 árvores estocasticamente produzidas. Uma cadeia de 84

Markov permanece pesquisando heuristicamente na topologia de árvore com a melhor probabilidade posterior a uma dada etapa do processo de amostragem; avaliada sob um modelo de substituição de aminoácidos especificado (o processo global é denominado Monte Cario de cadeia de Markov de ligação de Metropolis ou MC3) . Para esta análise, foram produzidas quatro cadeias com 250000 árvores cada, sob o modelo de substituição de aminoácidos JTT e amostradas a cada 250 iterações. A coalescência foi obtida com, aproximadamente, 175000 iterações e as restantes 250 árvores com melhores probabilidades posteriores foram fundidas para calcular uma árvore de consenso de regra maioritária de 50%. Esta árvore claramente mostra que a subfamilia 6 de a-KTx segrega-se, em 92% do conjunto de árvores final, como um grupo monofilético incluindo todos os seus membros e duas toxinas estreitamente relacionadas da subfamilia 7. A análise também coloca Vm24 e Vm23 como um grupo congénere desta clade (a partição especifica prevalece em 81% das árvores finais, ver a Figura 8); que sustenta fortemente que Vm24 e Vm23 constituem uma nova subfamilia α-KTx. Com base nestas análises e tendo em consideração as directrizes propostas pelo painel internacional de especialistas que classificaram as toxinas de escorpião especificas para canais de K [Tytgat et al. , 1999], é certo que Vm23 e Vm24 constituem uma nova subfamilia de toxina de escorpião que reconhece canais de K. A identidade de sequência mais elevada entre estas toxinas está localizada na porção C-terminal, como outras subfamilias bloqueadoras de canais de K. O segmento N-terminal é a região mais variável desta subfamilia e apenas Vm24 e Vm23 apresentam um segmento de tripla Alanina continuo invulgar no inicio da sequência. 85

Exemplo 7: Vm24 bloqueia mais selectivamente o canal hKvl.3 dependente de voltagem do que hlKCal de canal de K activado por Ca2+ de células T

Bloqueio de elevada afinidade de canais hKvl.3 por Vm24 0 bloqueio de canais hKvl.3 por Vm24 foi caracterizado em canais expressos endogenamente em células T de sangue periférico humano [Peter et ai., 2001; Bagdany et ai . , 2005]. A breve descrição do processo para obtenção de células T para experiências electrofisiológicas é como se segue. 0 sangue venoso periférico humano heparinizado foi obtido de voluntários saudáveis. As células mononucleares foram separadas por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. As células recolhidas foram lavadas duas vezes com solução de Hank isenta de Ca2+ e Mg2+ contendo tampão HEPES a 25 mM (pH 7,4) . As células foram cultivadas numa incubadora com CO2 a 5%, a 37 °C, em placas de cultura de 24 poços em RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS/Hyclone (Logan, Utah, EUA), 100 micrograma/mL de penicilina, 100 micrograma/mL de estreptomicina e L-glutamina a 2 mM, a 0,5 x 106/mL de densidade, durante 3-4 dias. O meio de cultura também continha 6 ou 8 micrograma/mL de fitohemaglutinina A (PHA-P, Sigma-Aldrich Kft, Hungria) para aumentar a expressão de canais de K [Deutsch et ai., 1986] . Os linfócitos T foram seleccionados para registo de corrente por incubação com CD2 de murganho anti-humano (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EUA), seguida de adesão selectiva a placas de Petri revestidas com anticorpos IgG de cabra anti-murganho (Biosource, Camarilo, CA, EUA), como descrito por Matteson e Deutsch (Matteson et ai., 1984). As placas foram suavemente lavadas, cinco vezes, com 1 mL de meio de banho extracelular normal (ver abaixo) para as experiências de adesivo/grampo. 86

As correntes de células intactas foram medidas em células T grampadas com voltagem, utilizando os amplificadores Axopatch 200A ou Multiclamp 700B conectados a computadores pessoais, utilizando hardware de aquisição de dados Axon Digidata 1200 ou Digidata 1322A. Foi utilizada compensação de resistência em série até 85% para minimizar os erros de voltagem e alcançar boas condições de voltagem-grampo. Para a aquisição e análise de dados foi utilizado o pacote de software pClamp8 ou pClamp9 (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA) . Antes da análise, os traços de corrente de células intactas foram corrigidos para fugas óhmicas e digitalmente filtrados (filtragem boxcar de 3 pontos) . A determinação das correntes de pico a elevado grau de bloco de corrente foi feita através do ajuste de uma função exponencial de quarta potência de subida aos dados de traços [modelo de Hodgkin-Huxley], com constantes de tempo fixadas às determinadas na ausência da toxina para isolar a amplitude do componente de subida.

As pipetas foram obtidas de capilares de vidro de borosilicato Clark GC 150 F-15 em cinco fases e polidas ao lume, resultando em eléctrodos tendo resistência de 2-3 megaOhm no banho. A solução do banho consistia em (em mM) : NaCl a 145, KC1 a 5, MgCl2 a 1, CaCl2 a 2,5, glucose a 5,5, HEPES a 10 (pH 7,35), suplementado com albumina de soro bovino a 0,1 mg/mL (Sigma). A osmolaridade medida da solução externa foi entre 302 e 308 miliosmol (mOsm). A solução de enchimento de pipeta (solução interna) consistia em (mM) : KF a 140, MgCl2 a 2, CaCl2 a 1, HEPES a 10, EGTA a 11 (pH 7,22). A osmolaridade medida das soluções internas foi, aproximadamente, 295 mOsm. A perfusão de banho em torno da célula medida com diferentes soluções de teste foi alcançada utilizando uma configuração de perfusão de fluxo por gravidade, com 6 linhas de entrada e ponta de débito de tubo de 87 polietileno PEIO com abertura com rebordo para reduzir a turbulência do fluxo. 0 fluido em excesso foi removido continuamente. 0 protocolo de voltagem padrão para evocar correntes de voltagem K+ em células T consistiu numa série de despolarizações de 14 ms de duração até +50 mV de um potencial de repouso de -120 mV. O tempo entre pulsos de voltagem foi fixado em 15 s, de modo a evitar inactivação cumulativa de canais hKvl.3. Os traços de corrente representativos na solução de banho normal são mostrados na Fig. 9A (controlo). Sob as condições experimentais aplicadas (a ausência de Ca2+ na solução de enchimento de pipeta e a natureza do protocolo de voltagem), as correntes de células intactas foram conduzidas exclusivamente por canais hKvl.3 [Peter et al. , 2001] . A Fig. 9A exibe correntes de K+ macroscópicas através de canais hKvl.3 registadas sequencialmente na mesma célula, antes (traços de controlo) e após a adição de Vm24 a 1 nM à solução externa por perfusão. A corrente de Kvl.3 desapareceu completamente ao 12° pulso (correspondendo a 3 min) na presença de Vm24 a 1 nM.

As cinéticas do desenvolvimento do bloqueio a concentrações de Vm24 a 1 nM (círculos cheios) e 0,3 nM (círculos vazios) são mostradas na Fig. 9B. Após o 4o pulso na solução de controlo, a perfusão extracelular foi trocada para uma solução contendo toxina e os pulsos de despolarização continuaram a cada 15 s. As correntes de pico foram determinadas e normalizadas para a corrente de pico na solução de controlo e representadas graficamente em função do tempo. A figura mostra que a concentração de toxina mais elevada, a cinética do desenvolvimento do bloqueio é mais rápida como esperado de uma reacção de pseudo-primeira ordem entre a toxina e os canais, 88 contudo, a ambas as concentrações de toxina é alcançado um bloqueio total da corrente de Kvl.3 de células intactas. Os dados para a concentração de Vm24 a 1 nM são da experiência mostrada na Fig. 9A. A perfusão da câmara de registo com solução de controlo isenta de toxina resultou num alivio muito pequeno do bloqueio nos primeiros 8 minutos (não mostrado). Durante um período de 10,5 minutos da aplicação da toxina à concentração de 3 pM (Fig. 9C) , a perda da corrente parece saturar-se a -36% do pico registado na solução de controlo. Este período foi seguido de um período de lavagem de 30 minutos (a seta indica o início da perfusão com solução isenta de toxina), durante o qual um terço da corrente bloqueada recupera, com uma cinética extremamente lenta (a constante de tempo estimada para lavagem é -3800 s, correspondendo a uma velocidade de subtracção de -2,6χ10~4 s 1) . O mecanismo geral pelo qual as toxinas de escorpião bloqueiam canais de K é o tamponamento da via de condução iónica após a sua ligação ao vestíbulo extracelular do canal [Goldstein e Miller, 1993]. A lenta e incompleta reversibilidade da redução das correntes na presença de Vm24, contudo, poderá indicar um efeito não especifico do péptido na membrana, em vez de bloqueio de hKvl.3. Argumenta-se contra este cenário, como se segue: 1) a velocidade para o desenvolvimento da perda de corrente (a concentrações elevadas de toxina) dependia da concentração de Vm24, sendo mais rápida a elevadas concentrações de toxina (Fig. 9B) ; 2) a corrente de fuga não aumentou na presença da toxina, indicando a ausência da lesão geral da membrana por Vm2; 3) o Vm24 não inibiu várias outras correntes K+ ou inibiu-as rapidamente e reversivelmente (ver mais tarde no perfil de selectividade da toxina), o que argumenta muito fortemente contra a acção não específica da toxina na estrutura da membrana 89 plasmática ou uma perda induzida por toxina da função de proteínas de membrana em geral; 4) a aplicação simultânea de ChTx, um bloqueador de poros de Kvl.3 bem conhecido, e Vm24 mostrou competição entre as duas toxinas pelo mesmo sítio de ligação que foi evidente a partir do abrandamento da cinética de bloqueio de Vm24 com concentrações crescentes de ChTx (dados não mostrados) .

As velocidades de adição e subtracção muito lentas da toxina impuseram limitações na geração da relação de dose-resposta, são apresentadas no painel D da Fig. 9. Em geral, para o bloqueio de equilíbrio dos canais a diferentes concentrações peptídicas, a fracção de corrente restante (RCF) é calculada como 1/Io, onde I e Io são as correntes de pico registadas na presença e ausência da toxina, respectivamente. Devido à velocidade de adição muito lenta a concentrações peptídicas baixas, a determinação de I foi problemática, visto que a quebra na corrente de pico de episódio-em-episódio foi tão pequena que foi observada uma aparente saturação durante a recolha de dados, embora o bloqueio pudesse não ter atingido ainda o seu valor de equilíbrio. A utilização de aplicações de toxina mais longas foi limitada pela estabilidade das correntes de pico num registo de patch clamp de células intactas. Além disso, a redução dos picos não pôde ser determinada independentemente, devido ao tempo de remoção por lavagem extremamente longo do péptido. Deste modo, os dados apresentados na Fig. 9D representam limites superiores para valores de 1/Io a diferentes concentrações de toxina, por conseguinte, o Kd estimado a partir da relação de dose-resposta também é uma sobreestimativa do Kd real. A relação de dose-resposta na Fig. 9D foi ajustada com a função RCF = Kdn/(Kdn + [Tx]n), onde [Tx] indica a concentração de toxina, Kd é a constante de dissociação e n é o coeficiente de 90

Hill. A linha a cheio sobreposta mostra o melhor ajustamento com parâmetros Kd= 2,9 pM e um coeficiente de Hill ~1. As barras de erro indicam SEM (n = 3-6) . 0 valor n~l para o coeficiente de Hill indica que uma única molécula de toxina interage com o canal (estequiometria 1:1) . Tanto quanto se sabe, o Vm24 tem a afinidade mais elevada como um bloqueador de hKvl.3 em ensaios electrofisiológicos. 0 Vm24 é um bloqueador de baixa afinidade de canais hlKCal

Como esboçado na introdução ao exemplo 7, um dos requisitos mais importantes para que um péptido seja um imunossupressor selectivo é a sua selectividade para Kvl.3 mais do que para IKCal. Os canais IKCal também são expressos endogenamente em células T [Grissmer et ai., 1993]. A corrente transportada pelos canais IKCal pode ser medida utilizando uma solução de enchimento de pipeta, tendo concentração de 1 μΜ de Ca2+ livre, que é suficiente para activar totalmente estes canais [Grissmer et ai., 1993]. Contudo, a presença simultânea de canais Kvl.3 nas mesmas células torna a caracterização farmacológica dos canais IKCal dificil e limita o estudo aos potenciais de membrana, onde os canais Kvl.3 não estão activados [Grissmer et ai., 1993; Bagdany et ai., 2005] . Isto e o número relativamente pequeno de canais IKCal, mesmo em células T estimuladas, motivaram o estudo da farmacologia de IKCal utilizando canais recombinantes. 0 gene de IKCal humano com cauda de EGFP (AF033021) foi transfectado em células Cos-7 utilizando o reagente Lipofectamina 2000, de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Mostrou-se anteriormente que o 91 clone de hlKCal com cauda de EGFP tem propriedades biofísicas e farmacológicas idênticas ao IKCal nativo em células T e, deste modo, foi largamente utilizado em estudos farmacológicos [Wulff et al. , 2001] . As células Cos-7 foram mantidas em condições padrão de cultura celular [Bagdany et al. , 2005]. As correntes foram registadas 2-3 dias após transfecção. Os transfectantes positivos para GFP foram identificados num microscópio de fluorescência TE2000U Nikon e utilizados para registos de corrente. A solução extracelular normal é a mesma que a descrita acima. A composição da solução de enchimento de pipeta foi (em mM) K-aspartato a 150, HEPES a 5, EGTA a 10, CaCl2 a 8,7, MgCl2 a 2, (pH 7,2) . Esta solução continha concentração de 1 μΜ de Ca2+ livre para activar totalmente a corrente de hlKCal. Todas as outras condições de registo (aquisição de dados, perfusão etc.) foram idênticas à descrição acima para canais Kvl.3.

Foram utilizadas rampas de voltagem de duzentos milissegundos de duração de -120 mV até +50 mV a partir de um potencial de repouso de -120 mV para deduzir correntes de hlKCal em células Cos-7 (velocidade de rampa 0,85 mV/ms). As rampas de voltagem foram corridas a cada 10 s. O traço de corrente registado na ausência de Vm24 (controlo) na Figura 9E mostra que as correntes de hlKCal puras, não dependentes de voltagem, foram evocadas pelo protocolo de voltagem aplicada. O potencial inverso da corrente é -75 mV que é característico de uma condutância de K+ com base na composição iónica das soluções de registo. Para as correntes de IKCal, o(s) declive(s) da relação linear de corrente-voltagem pode(m) ser utilizado(s) para caracterizar o bloqueio de corrente [Grissmer et al. , 1993]. O valor de s é reduzido para -52% do controlo na presença de Vm24 a 10 nM durante as experiências mostradas na Fig. 9E, o bloqueio de equilíbrio é alcançado em 4,5 min (27 episódios). O bloqueio 92 de corrente reverteu totalmente em 2,5 min, após troca da perfusão para solução extracelular isenta de toxina (Fig. 9 E, lavagem). As fracções de corrente restante a concentrações de 1 nM e 10 nM de Vm24 foram calculadas como sis o, onde s e So são os declives das relações I-V evocadas por rampas de voltagem na presença e ausência de Vm24, respectivamente, e apresentadas na Fig. 9F. As barras de erro indicam SEM para n=3 experiências independentes. À concentração de 1 nM, o Vm24 praticamente não bloqueia canais hlKCal (Fig. 9F) , ao passo que à mesma concentração o péptido bloqueia completamente canais hKvl.3 (Fig. 9D). 0 Kd de Vm24 para hlKCal pode ser estimado a partir de um modelo, onde 1 molécula de toxina interage com 1 canal para dar um Kd de ~14 nM. Considerando o Kd determinado para hKvl.3 (2,9 pM) , a selectividade de Vm24 para hKvl.3 é, pelo menos, mais 4500 vezes do que para hlKCal.

Exemplo 8: Perfil de selectlvidade de Vm24

Todas as construções de canal utilizadas neste estudo são rotineiramente utilizadas em ensaios farmacológicos e biofísicos e a sua aplicabilidade é confirmada nas referências listadas.

Transfecções transientes: As células Cos-7 foram utilizadas para expressar os canais de Kv2.1 de rato (rKv2.1, simpática oferta do Dr. S. Korn, U. de Connecticut) [Immke et al. , 1999]; Kvl.2 humano (hKvl.2, vector pcDNA3/Hygro contendo a sequência codificante completa para Kvl.2, simpática oferta do Dr. S. Grissmer, U. de Ulm, Alemanha) [Visan et al., 2004]; Kvl. 4 humano (hKvl.4AN: o mutante de deleção de bola de inactivação de Kvl.4, uma simpática oferta do D. Fedida, Universidade da Colúmbia Britânica, Vancouver, Canadá) [Kurata et al., 2004] e 93

Navl. 5 humano (simpática oferta de R. Horn, Universidade de Thomas Jefferson, Filadélfia, PA, EUA) [0'Leary et al . , 1995; Ahern et al. , 2005]. As células tsA-201 foram utilizadas para expressar canais hBK (gene hSlol (U11058), no plasmideo pCI-neo, oferta de Toshinori Hoshi, Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, PA) [Avdonin et al., 2003]. Todos estes clones de canais foram co-transfectados de forma transiente com um plasmideo codificando a proteína verde fluorescente (GFP), a razões molares de 1:5, utilizando o reagente Lipofectamina 2000 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e cultivados sob condições padrão. As correntes foram registadas 2-3 dias após transfecção. Os transfectantes positivos para GFP foram identificados num microscópio de fluorescência TE2000U Nikon e utilizados para registos de corrente (taxa de sucesso >70% para co-transfecção).

Linhas celulares estáveis: As células L929 expressando, de um modo estável, mKvl. 1 e células MEL expressando, de um modo estável, canais hKvl.5 foram descritas anteriormente [Grissmer et al. , 1994] e foram simpáticas ofertas do Dr. Heike Wulff (UC Davis, CA, EUA). Os canais hERG foram expressos num modo estável numa linha celular HEK-293.

As correntes de células intactas foram registadas como descrito no exemplo 7. Em todos os casos, foram utilizadas soluções padrão extracelulares e de enchimento de pipeta (ver o exemplo 7) , excepto para o registo de correntes de hBK, onde a composição da solução de enchimento de pipeta foi (em mM) KC1 a 140, EGTA a 10, CaCl2 a 9,69, HEPES a 5 (pH 7,2). A concentração de Ca2+ livre desta última solução é [Ca2+] int = 5 micromolar, que permite o registo de correntes de BK a potenciais de despolarização moderados [Avdonin et al., 2003]. Todas as outras 94 condições experimentais (aquisição de dados, princípios de análise, perfusão) foram as mesmas como descrito no exemplo 7.

Os traços de correntes obtidos para membros da familia Kvl (mKvl.l, hKvl.2, hKvl.3, hKvl.4ΔΝ, Kvl.5) em solução extracelular padrão (controlo) são mostrados na Fig. 10A até 10E. Em todos os casos, as células foram mantidas ao potencial de repouso de -120 mV e repetidamente despolarizadas para +50 mV para deduzir as correntes. A duração dos pulsos de despolarização (indicada separadamente em cada painel da Fig. 10) foi fixada para permitir activação total das correntes e minimizar a inactivação. Em todos os casos, foi permitido tempo suficiente entre pulsos no potencial de repouso (-120 mV) para a recuperação completa dos canais de qualquer inactivação residual (os intervalos interpulso variaram de 15 a 30 segundos). Foi utilizada neste estudo a versão removida de rápida (tipo N) inactivação de hKvl.4 (hKvl.4AN, os 147 aminoácidos N-terminais estão delecionados) . Na ausência da inactivação de tipo N, a determinação do bloqueio de corrente é mais fácil e mais precisa, visto que as correntes de pico neste clone não são influenciadas pelo rápido processo de inactivação (constante de tempo: 15-20 ms, [Kurata et al., 2004]). No canal de tipo selvagem, devido à competição entre activação e inactivação de corrente dependente do tempo, as correntes de pico são subestimadas, o que complica a análise do bloqueio de corrente. A Figura 10 mostra os traços de correntes registados antes da aplicação da toxina (controlo), após o equilíbrio do bloqueio por Vm24 a 10 nM e após remoção por lavagem (lavagem) da toxina. A análise dos painéis indica que os canais hKvl.4 e Kvl.5 são praticamente insensíveis a Vm24 (ver também o gráfico de barras na Fig. 12B) . Contudo, o Vm24 na concentração de 10 nM, que é 95 -3500 vezes o Kd para hKvl.3, bloqueia canais mKvl.1 (RCF=0, 80 + 0, 02, n=3) e canais hKvl.2 (RCF=0 ,54+0,08, n=3) significativamente. Além disso, o bloqueio de hKvl.2 não é totalmente reversível. 0 bloqueio da corrente de hKvl.3, à concentração de 10 nM de Vm24 (registado em células T humanas) é mostrado na Fig. 10C, para comparação mais fácil da potência de Vm24 como um bloqueador de canais Kvl (RCF=0, 01±0:01, n=3). Devido ao bloqueio significativo das correntes de Kvl.1 e hKvl.2, o Vm24 também foi testado em concentração inferior (1 nM) (Fig. 12A) . À concentração de 1 nM, os valores de RCF foram 0,97±0,02 (n=3) e 0,81±0,015 (n=3) para correntes de mKvl.1 e hKvl.2, respectivamente. A partir dos valores de RCF, a afinidade de Vm24 para estes canais pode ser estimada de um modelo onde 1 molécula de toxina interage com 1 canal para dar valores de Kd entre 30-40 nM para mKvl. 1 e entre 5-10 nM para hKvl.2. Considerando o Kd determinado para hKvl.3 (2,9 pM) , a selectividade de Vm24 para hKvl. 3 é, pelo menos, mais -1000 vezes e 1500 vezes, respectivamente, do que para mKvl.1 e hKvl.2. A potência de Vm24 inibindo a actividade de outros canais iónicos tendo efeito biológico e susceptibilidade significativas para bloquear por toxinas animais também foi determinada. Estes incluíram os canais de K dependentes de voltagem rKv2.1 e hERG (Kvll.l), o canal de K hBK activado por Ca2+ (KCal.l) e o canal Navl.5 cardíaco de sódio dependente de voltagem. A Fig. 11 mostra correntes de células intactas representativas deduzidas com protocolos de voltagem apropriados para um dado canal em solução extracelular padrão (controlo). As correntes de pico de Kv2.1 e Navl.5 foram determinadas de registos obtidos em resposta a despolarizações a +50mV e OmV, respectivamente, de um potencial de repouso de -120 mV (Fig. 11A e 11D) . As células HEK293 96 expressando canais hERG foram mantidas a -80 mV, despolarizadas a +20 mV, durante 2,5 s, para activar e inactivar os canais (Fig. 11B) . Isto foi seguido de uma etapa a -40 mV, à qual os canais inactivados rapidamente recuperam e o pico de corrente de hERG pode ser determinado. Este complicado protocolo de voltagem é padrão para o registo de corrente de hERG. Os canais BK são activados pela despolarização da membrana (Fig. 11 B) , contudo, a dependência de voltagem da probabilidade aberta depende da concentração de Ca2+ livre intracelular. A uma concentração de 5 micromolar de [Ca2+] livre aplicada neste estudo, mais de 50% dos canais são activados a +50 mV, deste modo, é possível a comparação dos efeitos de Vm24 a potenciais de membrana idênticos aos utilizados para outros canais de Kv. A activação total de canais BK a +50 mV requereria [Ca2+] incompatível com registo estável de células intactas, de modo contrário, a activação total de canais BK a 5 micromolar de [Ca2+] livre requereria despolarização para >+100 mV. Deste modo, a combinação de potencial de teste de 5 micromolar [Ca2+] e +50 mV foi um compromisso razoável para estudar o efeito de Vm24. 0 pulso para -120 mV precedendo o pulso de teste foi utilizado para a avaliação da fuga não específica. 0 potencial de repouso entre os protocolos de pulso foi 0 mV, ao qual todos os canais de Kv se inactivam totalmente reduzindo, desse modo, a possibilidade da contaminação dos registos por correntes de Kv endógeno esporadicamente verificados em células tsA-201. A este potencial de membrana, os canais BK já estão activos, como é demonstrado pela significativa corrente de repouso no início do pulso.

Para ensaiar os efeitos de Vm24 em diferentes canais mostrados na Fig. 11, as células foram repetidamente despolarizadas para deduzir corrente em diferentes soluções 97 extracelulares. A Fig. 11 mostra os traços de correntes representativos registados antes da aplicação da toxina (controlo), após a aplicação de Vm24 a 10 nM, durante 4-7 min, e após remoção por lavagem (lavagem) da toxina. Todos os painéis da Fig. 11 mostram que as correntes registadas na presença de Vm24 são indistinguíveis das registadas em solução de controlo e após remoção por lavagem, indicando a ausência de bloqueio destes canais. A análise estatística é apresentada na Fig. 12B, onde a média e o SEM das fracções de corrente restante são mostrados na presença de Vm24 a 10 nM (n^3).

Os dados apresentados na Fig. 12 indicam que a ordem da potência de bloqueio de Vm24 para diversos canais de K é hKvl.3 >>> hKvl . 2 > hlKCal > mKvl . 1 >>> hKvl . 4 % hKvl . 5 » rKv2.1 » hERG s; hBK s; hNavl. 5. Com base no valor de Kd obtido para hKvl. 3 da relação de dose-resposta e nas estimativas de ponto único dos valores de Kd para os outros canais (i. e., calculados a partir dos dados a 10 nM de Vm24 e a restante fracção da corrente assumindo estequiometria 1:1 de toxina-canal), a selectividade de Vm24 para hKvl.3 é >1500 vezes mais do que para outros canais ensaiados neste estudo. Este valor está bem acima dos critérios geralmente aceites para a selectividade [Giangiacomo et al., 2004], que é definida como a diferença de 100 vezes na constante de dissociação de equilíbrio ou uma diferença na energia livre de ligação para uma ligação de α-KTx a dois canais de potássio diferentes, Chi e Ch2, de AÚGChi;ch2 > 2,72 kcal/mol. 98

Exemplo 9: O Vm24 sintético é um bloqueador igualmente potente de hKvl.3 à toxina natural

Como descrito no exemplo 5, as considerações teóricas e práticas conduziram à síntese química de Vm24. Como descrito, a estrutura e a pureza da toxina sintética foram confirmadas por HPLC analítico, determinação de sequência de aminoácidos e espectrometria de massa. Todas estas abordagens indicaram que a sequência primária de Vm24 sintético (sVm24) é idêntica à do péptido natural. Além disso, o protocolo para a geração de sVm24 utilizou grupos protectores distintos para os grupos tiol concebidos para garantir que o enrolamento é restringido ao mesmo emparelhamento dissulfureto como no péptido nativo. Estes dados, contudo, não garantem que a actividade biológica do péptido é mantida. As superfícies complementares do canal e do péptido que medeiam o bloqueio de elevada afinidade são muito complicadas e desvios mínimos da estrutura do péptido nativo poderão comprometer a eficácia de sVm24 no bloqueio de Kvl.3 [Giangiacomo et al., 2004]. A actividade biológica de sVm24 foi ensaiada nos canais Kvl.3 de células T humanas. As condições experimentais para este estudo foram exactamente as mesmas como descritas no Exemplo 7. Um linfócito T de célula intacta de grampo de adesivo foi despolarizado repetidamente a +50 mV desde um potencial de repouso de -120 mV, a cada 30 s, na presença de diferentes soluções (Figura 13A) . A corrente de hKvl.3 medida na ausência de sVm24 (controlo) gradualmente e quase completamente desapareceu após a administração de sVm24 a 100 pM, por meio do aparelho de perfusão. Após o 16° pulso, a câmara de registo foi perfundida com solução extracelular isenta de toxina. A remoção da toxina da solução de perfusão não resultou num alívio 99 significativo do bloqueio de hKvl.3 no espaço de 5 minutos. Isto é demonstrado mais claramente na Figura 13B, onde as correntes de pico, normalizadas para as registadas na solução de controlo antes da aplicação de sVm24 (pico normalizado) , são mostradas em função do tempo. As setas indicam o inicio da perfusão com sVm24 (sVm24 a 100 pM) e a troca da perfusão para solução isenta de toxina (remoção por lavagem). As fracções de corrente restante (RCF), medidas após equilibração do bloqueio com 100 pM de sVm24 ou Vm24 são comparadas na Figura 13B (n=6 e n=4, respectivamente, as barras indicam SEM). A comparação estatística (teste t) indicou que as RCF são estatisticamente não diferentes entre os dois grupos (p=0,57) . A conclusão é que o sVm24 é tão potente quanto a toxina natural no bloqueio dos canais hKvl.3.

Exemplo 10: Análise da actividade biológica de Vm23 em diferentes canais iónicos O veneno de uma dada espécie frequentemente contém péptidos com elevado grau de identidade de sequência, como no caso de Vm23 e Vm24 de V. mexicanus (ver o exemplo 1). Habitualmente, um elevado grau de identidade de sequência dos péptidos confere actividade biológica idêntica às moléculas individuais. Isto provém do facto de a interacção das toxinas peptídicas com o receptor de toxina localizado no vestíbulo externo de canais iónicos ser determinada por múltiplos mecanismos, incluindo interacções electrostáticas de longo alcance, electrostáticas de curto alcance e de contacto próximo e o efeito líquido destes factores determinam a afinidade e selectividade de ligação [Park e Miller, 1992; Peter et al. , 2001; Giangiacomo et al. , 2004].

Demonstrou-se anteriormente que dois péptidos do mesmo escorpião 100 diferindo apenas num único (Pi2 e Pi3 de P. imperator) , aminoácido, bloqueiam ambos Kvl.3 em concentrações subnanomolares [Peter et al., 2001]. A partir do trabalho pioneiro de Miller e colaboradores [Goldstein et al., 1994] também é evidente que até as substituições de aminoácidos não conservadoras em várias posições de caribdotoxina são bem toleradas e a toxina retém a sua afinidade para o canal de potássio Shaker (e. g., T9K e N22K) . De modo a verificar se as diferenças entre Vm23 e Vm24 eram não significativas, para alterar a sua afinidade e especificidade para Kvl.3, o perfil farmacológico de Vm23 também foi examinado em detalhe, como mostrado abaixo. A potência de bloqueio do canal iónico de Vm23 foi ensaiada para os canais Kvl.3 de células T humanas e para os canais mKvl.l, hKvl.2 e hlKCal. Estes canais foram incluídos no estudo com base no bloqueio de baixa afinidade (mKvl.l, hKvl.2 e hlKCal) ou elevada afinidade (hKvl.3) destes canais pelo péptido relacionado, Vm24, que partilha 83% de identidade de sequência com Vm23. As condições experimentais foram exactamente as mesmas como descritas para os correspondentes canais no Exemplo 7 e Exemplo 8.

Um linfócito T de célula intacta de grampo de adesivo foi despolarizado repetidamente a +50 mV desde um potencial de repouso de -120 mV, a cada 15 s, na presença de diferentes soluções (Figura 14A) . A corrente de hKvl.3 medida na ausência de Vm23 (controlo) quase completamente desapareceu no espaço de 3,5 min após a administração de Vm23 a 10 nM, por meio do aparelho de perfusão. O traço indicou que "Vm23 a 10 nM" foi registado após o equilíbrio do bloqueio. Após o 19° pulso, a câmara de registo foi perfundida com solução extracelular isenta 101 de toxina (remoção por lavagem). A remoção da toxina da solução de perfusão não resultou num alivio significativo do bloqueio de hKvl.3 no espaço de 2 minutos. As fracções de corrente restante (RCF) , medidas após equilibração do bloqueio com 10 nM de Vm23 são mostradas na Figura 15 (n=3, as barras indicam SEM) . Estes resultados indicam que as caracteristicas do bloqueio mediado por Vm23 de canais hKvl.3 são muito semelhantes às do bloqueio mediado por Vm24: o bloqueio é de elevada afinidade e a velocidade de subtracção da toxina é extremamente lenta, para além dos limites de tempo utilizados neste ensaio. A quantidade limitada de Vm23 (inferior a 0,5% do veneno é Vm23) excluiu a determinação da relação de dose-resposta de bloqueio e hKvl.3 da comparação estatística conveniente da constante de dissociação com a de Vm24. A comparação das correntes registadas antes (controlo), 3,5 minutos após a adição de Vm23 a 10 nM e após a remoção por lavagem da toxina (2 min) mostra que Vm23 a 10 nM praticamente não bloqueia os canais hlKCal (Fig. 14B) ou canais mKvl.1 (Fig. 14C) (ver detalhes experimentais nas correspondentes secções do Exemplo 7 e Exemplo 8). A completa ausência de bloqueio de hlKCal por Vm23 é diferente do efeito de Vm24, que bloqueou -40% dos canais na mesma concentração (ver a Fig. 9F) .

Por outro lado, os canais hKvl.2 foram ligeiramente bloqueados por Vm23 a 10 nM (Fig. 14D) para dar um valor de RCF de 0,9110,02 (n=3, SEM, Fig. 15) e o bloqueio não foi facilmente reversível no espaço de 2 min. A mesma concentração de Vm2 4 bloqueou -46% dos canais (ver o Exemplo 8). A comparação das fracções de corrente restante para hKvl.3, hlKCal, mKvl. 1 e hKvl.2, na presença de Vm23 a 10 nM (Fig. 15), com os dados obtidos para Vm24 (Fig. 12 A e B) indica que o 102 perfil de selectividade de Vm23 para hKvl.3 é ligeiramente melhor para os canais testados. Também pode ser concluído da comparação que, não obstante, as diferenças na estrutura primária de Vm23 e Vm24, é mantido o bloqueio de elevada afinidade de hKvl.3 com notável selectividade.

Exemplo 11: Efeitos imunológicos de Vm24 in vivo

Milhões de pessoas a nível mundial são afectadas por doenças auto-imunes, tais como mas não limitadas a esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática, doença periodontal de reabsorção óssea, púrpura trombocitopénica imunitária e sindrome linfoproliferativa auto-imune, entre outras. Pensa-se, actualmente, que o começo destas doenças envolve a activação de células T auto-reactivas específicas de doença latentes, que são transformadas em células T de memória efectora (TEM). As células T auto-reactivas poderão diferenciar-se de um estado inactivo em células T de memória continuamente activadas, devido a estimulação de autoantigénio repetida e contribuir para lesão inflamatória através da migração para dentro de tecidos, segregando citocinas inflamatórias e exibindo função efectora imediata [Sallusto et ai., 1999]. 0 mecanismo envolvido na hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) é outro exemplo de lesão cutânea causada por células Tem [Soler et al. , 2003]. A patogénese de muitas doenças auto-imunes também poderá dever-se a células B de memória, especialmente as pertencendo ao subconjunto CD27+IgD~ de troca de classe [Iglesias et al. , 2001; 0'Connor et al., 2001; Corcione et al. , 2004] . Por estas razões, é desejável desenvolver agentes terapêuticos que possam visar selectivamente 103 células B de memória TEM e de troca de classe, sem prejudicar a actividade de outros subconjuntos de linfócitos de células, evitando, neste modo, o compromisso de respostas imunitárias agudas. Como mencionado anteriormente nos exemplos 7 a 10 desta invenção, os canais Kvl.3 dependentes de voltagem são novos alvos terapêuticos para a imunomodulação de células B de memória TEM e de troca de classe. As células Tffl regulam positivamente Kvl.3 após activação e a sua proliferação dirigida por antigénio é bastante sensível a substâncias conhecidas que bloqueiam canais Kvl.3 [Wulff et al. , 2003]. Pelo contrário, as inactivas e T cm são muito menos sensíveis a bloqueadores de Kvl.3 e rapidamente se tornam resistentes ao bloqueio de Kvl.3 através da regulação positiva do canal de K KCa 3.1 activado por cálcio [Wulff et al., 2003; Chandy et al., 2004]. Durante o processo de diferenciação, as células B e células T alteram a sua dependência de canais de potássio de KCa 3.1 para Kvl.3 [Wullf et al. , 2004] . Devido a este facto, os bloqueadores de canais Kvl.3 inibem a proliferação destas células, sem afectar as células de memória inactivas e CD27+IgD+. Deste modo, a utilização dos bloqueadores específicos para canais Kvl.3 afectaria de um modo preferido, células B de memória TEM e de troca de classe, sem comprometerem a maior parte da resposta imunitária, mas melhorando as condições de saúde desenvolvidas como uma consequência das doenças auto-imunes. 0 bloqueio dos canais Kvl.3 melhora a encefalomielite auto-imune experimental (EAE), reabsorção óssea em doenças periodontais e resposta de DTH em modelos animais, sem causar efeitos secundários óbvios [Koo et al. , 1997; Beeton et al., 2001; Valverde et al. , 2004].

Visto que o bloqueio dos canais Kvl.3 por péptidos é prontamente reversível, permite o controlo do curso do tratamento, o que não é o caso quando são utilizados agentes quimioterapêuticos ou anticorpos monoclonais, o que leva meses a diminuir. Obviamente, 104 um principal problema é encontrar péptidos altamente selectivos para este tratamento terapêutico [Chandy et al., 2004].

Como mostrado nos exemplos 7-10 descritos anteriormente, ambos os péptidos (Vm23 e Vm24), tema desta invenção, são bloqueadores potentes e muito específicos de canais Kvl.3 in vitro. As experiências foram conduzidas directamente em linfócitos T humanos em cultura, assim como utilizando outras células expressando vários canais de K dependentes de voltagem, de modo a verificar a selectividade da acção. Para os efeitos de "prova-de-conceito", as experiências in vivo foram conduzidas com ratos sensibilizados com dinitrofluorobenzeno (DNFB), como um agente capaz de deduzir uma importante resposta de DTH.

De modo a realizar este género de experiência, implementou-se um protocolo para estudar a resposta de DTH em ratos. O sistema utilizado é, basicamente, o descrito por Phanuphak et al., 1974. Resumidamente, dois grupos de ratos (3 ou 5 animais cada) foram sensibilizados por aplicações de 40 microlitros de DNFB a 0,7% em proporção 4:1 de solução de acetona: azeite, em dois dias consecutivos (dias um e dois), após suave remoção dos pelos da região traseira dorsal dos animais. Após 7 dias da segunda aplicação da solução de sensibilização, os animais foram provocados por uma única aplicação de 20 microlitros de DNFB a 0,4% dissolvido na solução de acetona:azeite, descrita acima. Esta solução foi espalhada sobre a superfície dorsal das orelhas do lado direito e deixada secar, ao passo que as orelhas do lado esquerdo foram espalhadas apenas com a solução de veículo (acetona:azeite). No dia oito do protocolo, foi aplicada uma injecção subcutânea de 100 microlitros de tampão de solução salina com fosfato, pH 7,8 (PBS) a cada um dos animais utilizados como controlo, ao passo 105 que ao grupo experimental de ratos, foi subcutaneamente aplicada uma quantidade de 10 microgramas de Vm24 puro em 100 microlitros de PBS. A espessura de ambas as orelhas de todos os animais foi medida 24 horas após a aplicação de Vm24.

Os resultados das experiências são mostrados na Fig. 16. Pode ser claramente verificado que os animais de controlo, não recebendo injecção de Vm24, tinham um valor médio de inflamação da orelha na ordem de 0,32 mm (marcado controlo), ao passo que os ratos que foram tratados com uma dose de 10 microgramas de Vm24 tinham uma inflamação reduzida, não superior a 0,10 mm de espessura. Estes valores correspondem a processos reais de inflamação, visto que a espessura das orelhas não provocadas (orelhas do lado esquerdo) foi subtraída. Isto representa uma diminuição liquida do processo de inflamação acima de 60%. Em conclusão, estes resultados sustentam a ideia de que o Vm24 é um importante agente imunossupressor para a resposta de DTH em ratos. Deste modo, é certamente um componente principal que merece ser ensaiado como um inibidor de doenças imunológicas dependentes da activação de linfócitos T e B, onde a contribuição dos canais Kvl.3 é importante para deduzir ou manter a doença.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSSANI POSTAY, Lourival Domingos GURROLA-BRIONES, Georgina SALAS-CASTILLO, Saida Patrícia FERREIRA BATISTA, Cesar Vicente 120 VARGA, Zoltán S. PANYI, Gyõrgy GÁSPÁR Rezsõ <120> Vm23 E Vm24, dois péptidos de escorpião que bloqueiam canais de potássio de linfócitos T humanos (subtipo kvl.3) com elevada selectividade <13 0> Vm <16 0> 3 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Vaejovis mexicanus <40 0> 1

Ala Ala Ala Ile Ser Cys Vai Gly Ser Lys Glu Cys Leu Pro Lys Cys 1 5 10 15 Lys Ala Gin Gly Cys Lys Ser Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Lys 20 25 30 Cys Tyr Cys 35

<210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Vaejovis mexicanus smithi <400> 2

Ala Ala Ala lie Ser Cys Vai Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys 15 10 15 121

Arg Ala Gin Gly Cys Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys 20 25 30

Cys Tyr Tyr Cys 35 <210> 3 <21.1> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> PODE SER ISOLADO DE Vaejovis mexicanus smithi OU ARTIFICIALMENTE SINTETIZADO <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (10)..(10) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, Lys ou Pro <220> <221> CARACTERÍ STICA_MISC <222> (13)..(13) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, Leu ou Pro <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (17)..(17) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido, desde que não dissocie o enrolamento tridimensional da proteína ou, melhor ainda, Lys ou Arg <220>

<221> CARACTERÍ STICA_MISC 122 <222> (23)..(23) nao ou, <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido, desde que dissocie o enrolamento tridimensional da proteina melhor ainda, Ser ou Asn <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (29)..(29) não ou, <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido, desde que dissocie o enrolamento tridimensional da proteina melhor ainda, Lys ou Arg <220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC <222> (35)..(35) nao ou, <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido, desde que dissocie o enrolamento tridimensional da proteina melhor ainda, Tyr ou nenhum <400> 3

Ile Ser Cys Vai Gly Ser Xaa Glu Cys Xaa Pro Lys Cys 5 10 15 Gly Cys Lys Xaa Gly Lys Cys Met Asn Xaa Lys Cys Lys 20 25 30 Cys

Ala Ala Ala 1

Xaa Ala Gin

Cys Tyr Xaa 35

Lisboa, 14 de Março de 2012 123

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Péptido isolado e purificado, tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo na SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 e os seus análogos equivalentes funcionais, os referidos análogos equivalentes funcionais partilhando, pelo menos, 83% de identidade de sequência de pares ao longo das 36 posições alinhadas da SEQ ID N° 3, sendo o referido péptido capaz de bloquear com elevada afinidade e especificidade um canal de potássio Kvl.3.
2. 2. Péptido, como definido na reivindicação 1, para utilização na atenuação da via de sinalização de cálcio em células de linfócitos T de um mamífero, em que a utilização compreende a colocação em contacto de uma população das referidas células de linfócitos T com o péptido, de um modo preferido, em que o referido mamífero é um humano.
3. 3. Método de inibição in vitro da actividade do canal de potássio Kvl.3 numa célula de mamífero, compreendendo a colocação em contacto da referida célula de mamífero com uma quantidade eficaz de um péptido, como definido na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, de um modo preferido, em que a referida célula de mamífero é uma célula de linfócito humano.
4. 4. Método de atenuação in vitro da via de sinalização de cálcio numa célula de linfócito T, compreendendo a colocação em contacto da referida célula de linfócito T com 1 uma quantidade eficaz de um péptido como definido na reivindicação 1.
5. 5. Péptido, como definido na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização na supressão de um processo de activação de célula T no sistema imunitário de um mamífero, em que a utilização compreende a colocação em contacto de uma população das referidas células T com o péptido, de um modo preferido, em que o referido mamífero é um humano.
6. 6. Péptido da reivindicação 5, em que a referida activação de célula T é causada por uma resposta imunitária no referido mamífero, de um modo preferido, em que a referida resposta imunitária é o resultado de rejeição de órgão heterólogo ou, de um modo preferido, em que a referida resposta imunitária é o resultado de uma doença auto-imune.
7. 7. Composição compreendendo um péptido como definido na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização na supressão de uma resposta imunitária em mamíferos, de um modo preferido, em que a referida resposta imunitária é o resultado de rejeição de órgão heterólogo ou, de um modo preferido, em que a referida resposta imunitária é o resultado de uma doença auto-imune.
8. 8. Composição compreendendo um péptido como definido na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento profiláctico ou terapêutico de rejeição de órgão heterólogo num indivíduo que dele necessita, de um modo preferido, em que o referido órgão rejeitado é um coração, um pulmão, um fígado, um rim ou um 2 pâncreas, ou em que o indivíduo a necessitar do referido tratamento é um humano.
9. 9. Composição compreendendo um péptido como definido na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento profiláctico ou terapêutico de uma doença auto-imune associada a TEm de linfócito num indivíduo que dele necessita, de um modo preferido, em que o indivíduo a necessitar do referido tratamento é um humano, ou em que a referida doença auto-imune associada a Tem de linfócito é seleccionada do grupo consistindo em esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes de tipo I, psoríase auto-imune, lúpus eritematoso, colite ulcerosa, oftalmia simpática, doença periodontal de reabsorção óssea, púrpura trombocitopénica imunitária e síndrome linfoproliferativa auto-imune.
10. 10. Composição da reivindicação 9, compreendendo, adicionalmente, pelo menos, um agente imunossupressor adicional para ser administrado ao referido indivíduo, de um modo preferido, em que o agente imunossupressor adicional é seleccionado do grupo consistindo em ciclosporina, rapamicina, azatioprina, prednisona, toxina ShK, derivados de ShK e desoxispergualina, seus derivados ou um seu sal.
11. 11. Composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um péptido como definido na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, pelo menos, um agente imunossupressor adicional, de um modo preferido, em que o agente imunossupressor adicional é seleccionado do grupo 3 consistindo em prednisona, toxina desoxispergualina, seus ciclosporina rapamicina, azatioprina, ShK, derivados de ShK e derivados ou um seu sal.
12. 12. Composição da reivindicação 8 ou reivindicação 9 que é adequada para ser administrada topicamente, sistemicamente, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intranasalmente, transdermicamente, oralmente ou por injecção intradérmica, instilação intrabrônquica, distribuição gastrointestinal ou distribuição transmucosal.
13. 13. Péptido de acordo com a reivindicação 1 que compreende, adicionalmente, uma fracção marcadora.
14. 14. Péptido marcado da reivindicação 13, em que a fracção marcadora é seleccionada do grupo consistindo num isótopo radioactivo, numa fracção fluorescente, numa fracção quimioluminescente, num cromóforo, num ligando, tal como biotina e numa proteína, de um modo preferido, em que a proteína marcadora é um anticorpo ou proteína verde fluorescente ou uma proteína derivada da proteína verde fluorescente com espectros de emissão distintos.
15. 15. Método para identificação in vitro de células expressando canais Kvl.3, compreendendo as etapas de: a) colocação em contacto de uma população das células alvo com um péptido marcador como definido na reivindicação 13 ou reivindicação 14; e b) detecção da ligação do péptido marcado aos canais de potássio Kvl.3 presentes na referida população de células alvo por uma técnica de detecção, de um modo 4 preferido, em que as referidas células são linfócitos humanos.
16. 16. Método para quantificação in vitro do número de canais Kvl. 3 expressos numa determinada célula, compreendendo as etapas de: a) colocação em contacto da referida célula com péptido marcado como definido na reivindicação 13 ou reivindicação 14; e b) detecção e quantificação da ligação do péptido marcado aos canais de potássio Kvl.3 presentes na referida população de células alvo por uma técnica de detecção quantitativa, de um modo preferido, em que as referidas células são linfócitos humanos. Lisboa, 14 de Março de 2012 5