JP6847828B2

JP6847828B2 - 新規なカリウムチャネルブロッカー及び自己免疫疾患の治療におけるそれらの使用

Info

Publication number: JP6847828B2
Application number: JP2017508102A
Authority: JP
Inventors: レイモンドエスノートン; シーチエチャン; マイケルダブリューペニントン; クリスティンビートン; ブライアンジェイ．スミス
Original assignee: Peptides International Inc; Baylor College of Medicine
Current assignee: Peptides International Inc; Baylor College of Medicine
Priority date: 2014-08-15
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2021-03-24
Anticipated expiration: 2035-08-14
Also published as: WO2016023072A1; EP3180365A4; AU2015303825B2; EP3180365B1; JP6953579B2; US10246496B2; AU2015303825A1; JP2020127419A; US20170362286A1; JP2017525357A; EP3180365A1

Description

本発明は、イソギンチャクペプチドであるスチコダクチラ・ヘリアンサス（Stichodactyla helianthus）毒素ＳｈＫの新規なアナログ、及び例えば自己免疫疾患を治療するための治療剤としてのそれらの使用に関する。

優先権書類
本出願は、２０１４年８月１５日に出願された表題「新規なカリウムチャネルブロッカー」のオーストラリア特許仮出願第２０１４９０３１８９号の優先権を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み込む。

参照による組込
以下の特許明細書を以下の説明において参照する：
表題「Ｋｖ１．３の選択的で強力なペプチド阻害剤」の国際公開第２０１０／１０８１５４号パンフレットの国際特許明細書。この特許明細書の内容は、全体を参照により本明細書に組み込む。

ほぼ７０の異なる自己免疫疾患が知られており、世界中で数百万の人々が患っている。これには、体内の様々な器官、例えば、関節（例えば、関節リウマチ；ＲＡ，rheumatoid arthritis）、心臓、肺（例えば、喘息）、中枢神経系（ＣＮＳ，central nervous system）（例えば、多発性硬化症；ＭＳ，multiple sclerosis）、内分泌器官（例えば、１型糖尿病；Ｔ１ＤＭ，type-1 diabetes mellitus）及び皮膚（例えば、乾癬）が関与する。典型的には、少なくとも一部には自己反応性Ｔリンパ球（Ｔ細胞）によって引き起こされる組織破壊が特徴である。Ｔ細胞は繰り返し抗原刺激を受けると、最終分化型（terminally-differentiated）エフェクターメモリーＴ（Ｔ_ＥＭ）細胞に分化し（Sallusto F et al., Annu Rev Immunol 22:745-763 (2004)）、これらの細胞は、電位依存性カリウムチャネルＫｖ１．３の発現が高いこと（活性化後）並びにこれらの細胞の表面上にはケモカイン受容体ＣＣＲ７及びホスファターゼＣＤ４５ＲＡのいずれも存在しないことが特徴である（Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003)）。前述の自己免疫疾患において、ＲＡ（滑膜Ｔ細胞）、ＭＳ（ミエリン抗原に特異的）、Ｔ１ＤＭ（ＧＡＤ６５抗原に特異的）、喘息（誘発喀痰中Ｔ細胞）及び乾癬の患者における疾患関連Ｔ細胞は全てＴ_ＥＭ細胞である（Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003)；Beeton C et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:17414-17419 (2006)；Fasth A et al., Scand J Immunol 60:199-208 (2004)；Friedrich M et al., Arch Dermatol Res 292:519-521 (2000)；Koshy S et al., J Biol Chem 289:12623-12632 (2014)；Lovett-Racke AE et al., J Clin Invest 101:725-730 (1998)；及びViglietta V et al., J Clin Invest 109:1511-1511 (2002)）。さらに、Ｂ細胞は、抗原刺激の反復によって、クラススイッチされたＢ細胞に分化し、ＭＳ（Corcione A et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:11064-11069 (2004)）及びその他の自己免疫疾患にも関係し、これらの細胞はＲＡ、ＭＳ及びＴ１ＤＭにおいて直接的な組織損傷を引き起こすＩｇＧ自己抗体の主要な原料である（Berger T et al., New Engl J Med 349:139-145 (2003)；O’Connor KC et al., J Clin Immunol 21:81-92 (2001)；Atkinson MA et al., Lancet 358:766 (2001)及びDorner T et al., Curr Opin Rheumatol 15:246-252 (2003)）。Ｔ_ＥＭ細胞と同様に、クラススイッチされたＢ細胞は活性化によってＫｖ１．３カリウムチャネルを上方制御し、Ｋｖ１．３を阻害することによってこれらの増殖は抑制することができる（Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003)及びWulff H et al., J Immunol 173:776-786 (2004)）。他方で、ＣＣＲ７^＋ナイーブセントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）細胞は、活性化によってＫＣａ３．１チャネルを上方制御するのでＫｖ１．３の阻害に対して感受性が低く（Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003)）、Ｋｖ１．３ブロック剤に対してもやはり感受性ではないナイーブＩｇＤ^＋ＣＤ２７^＋メモリーＢ細胞と同様である（Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003)）。結果として、Ｋｖ１．３の選択的ブロック剤は、全身性免疫抑制（generalised immunosuppression）を誘導することなく自己免疫疾患の重症度を低下させることが期待される（Beeton C et al., Inflamm Allergy Drug Targets 10:313-321 (2011)及びChi V et al., Toxicon 59:529-546 (2012)）。近年、Ｋｖ１．３チャネルをブロックすると、さらに治療の見込みがあることも示された。例えば、Ｋｖ１．３をＳｈＫ、サソリ毒素マルガトキシン（ＭｇＴＸ，scorpion toxin margatoxin）及びカリブドトキシン（ＣｈＴＸ，charybdotoxin）などのペプチドでブロックすると、ＣＤ８^＋細胞傷害性エフェクターメモリーＴ細胞の増殖及び神経細胞に毒性のあるグランザイムＢ（ＧｒＢ，granzyme B）の分泌を妨害する（Hu LN et al., Plos One 8 (2013)）。これらの発見は、Ｋｖ１．３が免疫調節の魅力的な治療標的であるだけでなく、ニューロン保護において重要な役割も担うことを示唆している。

Ｋｖ１．３チャネルの最も強力な阻害剤の１つは、Ｋｖ１．３を１１ｐＭのＩＣ_５０でブロックするイソギンチャクペプチドＳｈＫである（Kalman K et al., J Biol Chem 273:32697-32707 (1998)）。ＳｈＫは、３個のジスルフィド架橋によって安定化された、アミノ酸１４〜１９及び２１〜２４を含む２つの短いαヘリックスからなる３５残基のポリペプチドである（Tudor JE et al., Nat Struct Biol 3:317-320 (1996)）。ＳｈＫは、Ｋｖ１．３チャネルテトラマーの４つのサブユニット全てと相互作用して、Ｌｙｓ２２がチャネルのポアを閉塞する（Kalman K et al., J Biol Chem 273:32697-32707 (1998)）。ＳｈＫは、Ｔ_ＥＭ細胞の増殖を抑制し、ＭＳの２つの動物モデル（すなわち、慢性再発−寛解実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＣＲ−ＥＡＥ，chronic relapse-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis）及び実験的自己免疫性脳脊髄炎の養子移植（ａｔ−ＥＡＥ，adoptive transfer of experimental autoimmune encephalomyelitis）（Beeton C et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:17414-17419 (2006)））、ＲＡのプリスタン誘導性関節炎（ＰＩＡ，pristane-induced arthritis）モデル並びに喘息及び乾癬の動物モデル（Koshy S et al., J Biol Chem 289:12623-12632 (2014)及びGilhar A et al., J Invest Dermatol 131:118-124 (2011)）の症状を改善することが示された。しかし、ＳｈＫは治療上高い潜在能力を持っているが、残念なことに、ＣＮＳ及び心臓に見いだされるごく近縁のＫｖ１チャネルサブタイプ、Ｋｖ１．１にも結合する（Ｋｄ＝１６ｐＭ）（Gutman GA et al., Pharmacol Rev 57:473-508 (2005)）。Ｋｖ１．１欠損マウスはてんかん活性を伴う心機能不全を表すことが示されたので（Glasscock E et al., J Neurosci 30:5167-5175 (2010)）、血液脳関門（ＢＢＢ，blood-brain barrier）が破壊されているか、又は損なわれていて外来性ペプチド及びタンパク質がＣＮＳに入り込むことができる（Bennett J et al., J Neuroimmunol 229:180-191 (2010)）ＭＳの患者において特に、心臓及び神経における毒性の可能性を回避するために、Ｋｖ１．３選択的アナログを開発する必要がある。

Ｋｖ１．３選択性が高いＳｈＫのいくつかのアナログが合成されたことがある。しかし、これら従来のアナログの多くは、非天然（すなわち、非標準）アミノ酸によるアミノ酸置換及び／又はＮ末端への非タンパク質伸長を含んでいた（Kalman K et al., J Biol Chem 273:32697-32707 (1998)；Beeton C et al., J Biol Chem 278:9928-9937 (2003)及びPennington MW et al., Mol Pharmacol 75:762-773 (2009)）。ＳｈＫ−１８６としても知られるこのような１つのＳｈＫアナログは、最近一連の自己免疫疾患の治療のための臨床試験に入った。このアナログは、Ｎ末端ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）及びＣ末端アミドを含有し、後者はカルボキシペプチダーゼ分解を回避するために導入され、結合親和性に影響を及ぼさなかった（Tarcha EJ et al., J Pharmacol Exp Ther 342:642-653 (2012)）。しかし、ＳｈＫ−１８６は、インビボで迅速に脱リン酸化され（Tarcha EJ et al., J Pharmacol Exp Ther 342:642-653 (2012)）、さらに、力価の低い抗ＳｈＫ−１８６抗体の産生を誘導するので（Beeton C et al., J Biol Chem 278:9928-9937 (2003)）、あまり満足の行くものではない。ＳｈＫ−１９２としても知られている別のＳｈＫアナログは、メチオニン（Ｍｅｔ２１）がノルロイシン（Ｎｌｅ）によって置換されて酸化的代謝の能力が低下していること、及び、リン酸部分が非加水分解性ホスホノ基によって置き換わっていることがＳｈＫ−１８６とは異なっている。ＳｈＫ−１９２は、Ｋｖ１．３チャネルに対する結合親和性がわずかに低いが、Ｋｖ１．１に対するよりも著しく高い選択性レベルを示すことが見いだされており、Ｓｈｋ−１９２の末端の負に荷電したホスホノ基がチャネルの細胞外面に結合し、Ｋｖ１．３のＬｙｓ４１１の側鎖アンモニウム基と塩架橋を形成することが予測される（Pennington MW et al., Mol Pharmacol 75:762-773 (2009)）。

Sallusto F et al., Annu Rev Immunol 22:745-763 (2004) Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003) Beeton C et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:17414-17419 (2006) Fasth A et al., Scand J Immunol 60:199-208 (2004) Friedrich M et al., Arch Dermatol Res 292:519-521 (2000) Koshy S et al., J Biol Chem 289:12623-12632 (2014) Lovett-Racke AE et al., J Clin Invest 101:725-730 (1998) Viglietta V et al., J Clin Invest 109:1511-1511 (2002) Corcione A et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:11064-11069 (2004) Berger T et al., New Engl J Med 349:139-145 (2003) O’Connor KC et al., J Clin Immunol 21:81-92 (2001) Atkinson MA et al., Lancet 358:766 (2001) Dorner T et al., Curr Opin Rheumatol 15:246-252 (2003) Wulff H et al., J Immunol 173:776-786 (2004) Beeton C et al., Inflamm Allergy Drug Targets 10:313-321 (2011) Chi V et al., Toxicon 59:529-546 (2012) Hu LN et al., Plos One 8 (2013) Kalman K et al., J Biol Chem 273:32697-32707 (1998) Tudor JE et al., Nat Struct Biol 3:317-320 (1996) Gilhar A et al., J Invest Dermatol 131:118-124 (2011) Gutman GA et al., Pharmacol Rev 57:473-508 (2005) Glasscock E et al., J Neurosci 30:5167-5175 (2010) Bennett J et al., J Neuroimmunol 229:180-191 (2010) Beeton C et al., J Biol Chem 278:9928-9937 (2003) Pennington MW et al., Mol Pharmacol 75:762-773 (2009) Tarcha EJ et al., J Pharmacol Exp Ther 342:642-653 (2012)

本発明につながる研究では、Ｋｖ１．１チャネルよりもＫｖ１．３チャネルに対する選択性を高めるために、出願人等は計算手法を使用してＳｈＫ毒素に有望な修飾を調べた。調べた修飾には、テトラペプチド配列ＥＳＳＳ（配列番号１）によるＳｈＫのＮ末端伸長が含まれ、これはこの伸長がＳｈＫ−１９２アナログのホスホノ部分を模倣することができるという仮説に基づいている。その後、分子動力学（ＭＤ，Molecular dynamics）シミュレーションによってテトラペプチドの３位のトリプトファン（Ｔｒｐ）はＫｖ１．３のＰｒｏ３７７との安定した相互作用の形成に有利であることが示されたので、ＥＷＳＳ（配列番号２）のＮ末端伸長を含むＳｈＫアナログも調べた。したがって、新規なＮ末端テトラペプチド伸長を有するＳｈＫアナログを設計し、産生し、電気生理学の結果によって、アナログ［ＥＷＳＳ］ＳｈＫはＫｖ１．３に対して３４ｐＭのＩＣ_５０で効力を保持していることが示されたが、Ｋｖ１．１チャネルと比べたＫｖ１．３チャネルに対する選択性（selectivity for Kv1.3 channels over Kv1.1 channels）が著しく高いレベルであることが示された。これらの結果は、［ＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログ及び関連するアナログが、例えば、自己免疫疾患を治療するための治療剤としての使用に適し得ることを示している。

したがって、第１の態様では、本発明は、スチコダクチラ・ヘリアンサス毒素ＳｈＫのアナログであって、ＳｈＫ毒素ポリペプチドと、式（Ｉ）：
（Ｉ）ａ−Ｘ^−４Ｘ^−３Ｘ^−２Ｘ^−１−ｂ（配列番号３）
［式中、Ｘ^−４はＤ、Ｅ若しくはその他の負に荷電したアミノ酸又はそれらの誘導体であり、
Ｘ^−３はＥ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｗ又はトリプトファン誘導体であり、
Ｘ^−２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ^−１は任意のアミノ酸であり、
ａは存在しないか、又は第１の付加部分（additional moiety）であり、
ｂは存在しないか、又は第２の付加部分（additional moiety）である］
によるアミノ酸配列を含むＮ末端伸長（N-terminal extension）とを含む、前記アナログを提供する。

したがって、ＳｈＫアナログは式（II）：
（II）ａ−Ｘ^−４Ｘ^−３Ｘ^−２Ｘ^−１−ｂ−［ＳｈＫ毒素ポリペプチド］
の通りであってもよい。

好ましくは、Ｘ^−４はＥであり、Ｘ^−３はＷであり、Ｘ^−２及びＸ^−１はＳ及びＴから独立して選択される。

第２の態様では、本発明は、対象におけるＴリンパ球又はクラススイッチされたＢ細胞の増殖の阻害方法であって、前記対象に、第１の態様のアナログの有効量を、任意で薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することを含む、前記方法を提供する。

さらに、第３の態様では、本発明は、対象における自己免疫疾患の治療方法であって、前記対象に、第１の態様のアナログの有効量を、任意で薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することを含む、前記方法を提供する。

第４の態様では、本発明は、自己免疫疾患、好ましくはＲＡ及びＭＳなどのＴ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患の治療における第１の態様のアナログの使用を提供する。

さらに、第５の態様では、本発明は、自己免疫疾患、好ましくはＲＡ及びＭＳなどのＴ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患の治療のための医薬品の調製における第１の態様のアナログの使用を提供する。

Ｋｖ１．３との複合体におけるＳｈＫアナログのホモロジーモデリングを示した図である：（Ａ）膜平面に対して垂直に見たときのＫｖ１．３を有する複合体におけるＳｈＫ−１９２を示し、チャネルはリボンで表しＳｈＫアナログは透過性の面で表す。Ｋｖ１．１とＫｖ１．３との間で異なるチャネル表面上のアミノ酸の側鎖原子を球として例示する；（Ｂ）ＳｈＫアナログのＮ末端ＧｌｕとチャネルのＬｙｓ４１１との間のMODELLERエネルギー及び分離の比較を示す。ＳｈＫの１個（濃い三角、Ｅ）、２個（四角、ＥＳ）、３個（ひし形、ＥＳＳ）及び４個（薄い三角、ＥＳＳＳ）のアミノ酸残基の伸長。（Ｃ）Ｋｖ１．３との複合体における本発明によるアナログ、すなわち［ＥＳＳＳ］ＳｈＫの相同性モデルを示す。チャネルのＰｒｏ３７７及びＬｙｓ４１１の側鎖原子は球として表す。４−アミノ酸残基伸長、ＥＳＳＳ（配列番号１）の側鎖原子は球として表す。（Ｄ）Ｋｖ１．３との複合体における本発明によるさらなるアナログ、この場合［ＥＷＳＳ］ＳｈＫの相同性モデルを示す。チャネルのＰｒｏ３７７及びＬｙｓ４１１の側鎖原子を強調する。４−アミノ酸残基伸長、ＥＷＳＳ（配列番号２）の最初の２つの残基（ＥＷ）の側鎖原子は球として表す。Ｋｖ１．１及びＫｖ１．３カリウムチャネルのそれぞれの膜貫通領域の配列アライメントを示した図である。注釈は２つの配列の間の配列保存を強調する（アスタリスク＝保存されている）。２つの配列の間で異なる表面露出残基は灰色で強調し、選択フィルター内の残基は四角で囲い、ヘリックスには下線を引く。本発明によるＮ末端伸長ＳｈＫアナログの選択性を示す結果を示した図である。（Ａ）Ｋｖ１．３及びＫｖ１．１チャネル電流に対する［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ（上）、［ＥＥＳＳ］ＳｈＫ（中央）及び［ＥＷＳＳ］ＳｈＫ（下）の効果。（Ｂ）ｍＫｖ１．３又はｍＫｖ１．１で安定してトランスフェクトしたＬ９２９線維芽細胞に対してそれぞれホールセルパッチクランプ法によって測定し（Grimmer S et al., Mol Pharmacol 45:1227-1234 (1994)）、ヒルの式に当てはめた（濃度当たりＮ＝３細胞）［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ（（白丸）点線）、［ＥＥＳＳ］ＳｈＫ（（黒四角）実線）、［ＥＷＳＳ］ＳｈＫ（（黒丸）実線）及びＳｈＫ（（白四角）点線）のＫｖ１．３又はＫｖ１．１チャネル電流に対する効果。左のパネルは、ホールセルのＫｖ１．３の電流を示し、右のパネルはホールセルのＫｖ１．１の電流を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表す。

天然又は「野生型」（ＷＴ，wild-type）ＳｈＫポリペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号４）。

ＳｈＫポリペプチドの構造は、Ｃｙｓ３〜Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１２〜Ｃｙｓ２８及びＣｙｓ１７〜Ｃｙｓ３２の間の３個のジスルフィド架橋によって安定化した、アミノ酸１４〜１９及び２１〜２４を含む２つの短いαヘリックスからなる（Tudor JE et al., Nat Struct Biol 3:317-320 (1996)）。ＳｈＫは、イオン透過経路の外口の狭い「前庭」と相互作用して４つのサブユニット全てに結合することによってＫｖ１．３カリウムチャネルをブロックする（Lanigan MD et al., Biochemistry 41(40):11963-11971 (2002)）。この位置では、ＳｈＫポリペプチドのＬｙｓ２２残基が「瓶のコルク栓」のようにチャネルのポアを塞ぐと考えられる（Kalman K et al., J Biol Chem 273:32697-32707 (1998)；Lanigan MD et al., Biochemistry 41(40):11963-11971 (2002)）。

新規なＮ末端テトラペプチド伸長を有するＳｈＫアナログを設計し、組換え又は化学合成によって産生した。これらのアナログはＳｈＫ活性を保持している（すなわち、Ｋｖ１．３をブロックすることができる）が、Ｋｖ１．３チャネルに対して（すなわち、Ｋｖ１．１チャネルと比べて）非常に高いレベルの選択性も有し得ることが発見された。したがって、ＳｈＫアナログは、全身性免疫抑制並びに標的外チャネル、特にＫｖ１．１の阻害による心臓及び神経における毒性の可能性を回避しながら、自己免疫疾患の治療のための治療剤としての大きな可能性をもたらす。

したがって、第１の態様では、本発明は、スチコダクチラ・ヘリアンサス毒素ＳｈＫのアナログであって、ＳｈＫ毒素ポリペプチドと、式（Ｉ）：
（Ｉ）ａ−Ｘ^−４Ｘ^−３Ｘ^−２Ｘ^−１−ｂ（配列番号３）
［式中、Ｘ^−４はＤ、Ｅ若しくはその他の負に荷電したアミノ酸又はそれらの誘導体であり、
Ｘ^−３はＥ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｗ又はトリプトファン誘導体であり、
Ｘ^−２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ^−１は任意のアミノ酸であり、
ａは存在しないか、又は第１の付加部分であり、
ｂは存在しないか、又は第２の付加部分である］
によるアミノ酸配列を含むＮ末端伸長とを含む、アナログを提供する。

ＳｈＫ毒素ポリペプチドは、配列番号４として上記で示したものに対応するアミノ酸配列を含んでいてもよい。しかし、当業者であれば、ＳｈＫ毒素ポリペプチドはまた、好ましくは、ペプチドの機能を実質的に変化させない（例えば、変動があっても、ペプチドがカリウムチャネルＫｖ１．３に結合し、その活性化をブロックする能力を維持する）１又は２以上の小さな配列変動を含んでいてもよい配列番号４のバリアントアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよいことを理解していると予想される。このような変動は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ及びＰ、Ｎα−アルキルアミノ酸などの１又は２以上の保存されたアミノ酸置換を含んでいてもよい。その他の置換は、１又は２以上のＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸による置換を含んでいてもよい。好ましくは、任意のアミノ酸置換には、遺伝子コードによってコードされる２０個（２０）の標準的アミノ酸（すなわち、標準アミノ酸）から選択されるアミノ酸による置換が含まれる。しかし、例えば、ある種のＮα−アルキルアミノ酸（例えば、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）及びＮ−メチルアラニン）並びに２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、アミノイソ酪酸、３−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、オルニチン、シトルリン、アミノオキシセリン、ホモアルギニン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、アミノスベリン酸並びにβ−２−及びβ−３−ナフチルアラニン、環置換フェニルアラニン（Ｐｈｅ）誘導体（例えば、２、３、４、５、６−ペンタフルオロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、メチル−フェニルアラニン及びホスホノ−フェニルアラニン）、ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）、セレノシステイン及びセレノメチオニンなどのその他のアミノ酸などの非標準アミノ酸によるアミノ酸置換も考えられる。存在してもよいその他の配列変動には、１又は２以上のアミノ酸欠失又は付加（例えば、挿入）が含まれる。例えば、Ｃ末端配列に行うことができるその他の付加は、様々な付加機能又は特性、例えば、生物学的利用率、タンパク質回収若しくは発現（例えば、融合相手）の改善を付与することができる１個のアミノ酸（例えば、Ａｌａ）、短いアミノ酸配列（例えば、２〜１０個の長さのアミノ酸）又は長いアミノ酸配列（例えば、１１個以上のアミノ酸）の付加を含むことができるが、典型的には、アミノ酸配列付加によってもたらされるポリペプチドの全長は、約７５個以下のアミノ酸、より好ましくは約５０個以下のアミノ酸である。Ｃ末端配列に行うことができる付加の好ましい１例は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ，cell-penetrating peptide）の付加である。ＣＰＰは、ペプチド又はポリペプチドなどの分子カーゴ（molecular cargo）の細胞取込を促進することができる短いペプチドである。したがって、ＣＰＰを本発明のＳｈＫアナログと共に使用すると、ＳｈＫアナログを細胞の細胞質に送達することができ、そこでミトコンドリアのＫｖ１．３チャネル（ｍｉｔｏＫｖ１．３）をブロックするように作用することができる。ミトコンドリアＫｖ１．３チャネルは、アポトーシス促進性Ｂａｘ及びＢａｋタンパク質（チャネルのポアに直接結合して「毒素様機構」でチャネルを阻害することによってｍｉｔｏＫｖ１．３を阻害する；Leanza L et al., Cell Calcium 58:131-138 (2015)）の標的となることによって細胞死に直接関与することが示された。したがって、本発明のＳｈＫアナログなどのミトコンドリアＫｖ１．３チャネルを阻害する化合物（例えば、クロファジミン；Leanza L et al., Leukemia 27:1782-1785 (2013)）は、がん並びにその他の増殖性疾患及び障害を治療するための治療剤として使用するために適していることがある。本発明のＳｈＫアナログと共に使用するのに適したＣＰＰは当業者には周知で、例えば、ＨＩＶ−１Ｔａｔ由来ＣＰＰ（アミノ酸４８〜６０；Wagstaff KM and DA Jans, Curr Med Chem 13(12):1371-1387 (2006)）及びその９アミノ酸形質導入ドメイン断片（Ruben S et al., J Virol 63:1-8 (1989)及びFawell S et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:664-668 (1994)）、ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質由来ＣＰＰ（アミノ酸３４〜５０）及びドロソフィラ・アンテナペディア（Drosophila Antennapedia）由来ＣＰＰ（アミノ酸４３〜５８）が含まれる。

本発明のアナログにおいて使用することができる特定のＳｈＫバリアントポリペプチドは、Ｍｅｔ２１残基のＮｌｅによる置換を含むものである。この置換は、ＳｈＫアナログ、ＳｈＫ−１９２において見いだされる。あるいは、Ｍｅｔ２１は、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ及びＬｅｕのいずれか１つで置換されていてもよい。このような置換は、ＳｈＫポリペプチドのこの位置の酸化に対する安定化効果を付与することができる。

本発明のアナログにおいて使用することができるその他の特定のＳｈＫバリアントポリペプチドは、全内容を本明細書に参照として組み込んだ国際公開第２０１０／１０８１５４号パンフレットの国際特許明細書に記載されている。これらの中で、Ｓｅｒ２のＧｌｕによる置換；Ｉｌｅ４のＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｌａによる置換；Ｓｅｒ１０のＡｒｇ又はＧｌｕによる置換；Ｐｈｅ１５のＡｌａによる置換；Ｌｙｓ３０のＡｒｇ又はＧｌｕによる置換；Ｔｈｒ３１のＮａｌによる置換及びＴｈｒ３４のＮａｌによる置換を含むＳｈＫポリペプチドが記載されている。これらの置換は全て、Ｋｖ１．３のＳｈＫポリペプチド阻害を改善すること（すなわち、ＷＴＳｈＫポリペプチドに対して）が見いだされた。以下のアミノ酸置換を含むその他のＳｈＫポリペプチドは、Ｋｖ１．３阻害活性を実質的に変化させることなくＫｖ１．３に対する選択性の改善を示すこと（すなわち、ＷＴＳｈＫポリペプチドに対して）が見いだされた：Ｉｌｅ７のＬｙｓによる置換；Ｓｅｒ１０のＡｌａによる置換；Ｇｌｎ１６のＬｙｓ又はＮａｌによる置換；Ｓｅｒ２０のＬｙｓ又はＡｒｇによる置換；Ｌｙｓ２２のＡｌａによる置換；Ｔｙｒ２３のＡｌａによる置換；Ｓｅｒ２６のＮａｌによる置換；Ｐｈｅ２７のＮａｌによる置換及びＡｒｇ２９のＬｙｓ又はＮａｌによる置換。したがって、本発明のアナログにおいて使用することができるＳｈＫバリアントポリペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列の１つからなるポリペプチドから選択することができる。
ＲＳＣＩＤＴＫＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１１）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＡＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１２）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１３）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＫＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１４）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＲＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１５）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＡＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１６）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＡＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１７）
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＫＫＴＣＧＴＣ（配列番号１８）

Ｘ^−４は、Ｄ、Ｅ若しくはその他の負に荷電したアミノ酸又はＫｖ１．３チャネルのＬｙｓ４１１の側鎖アンモニウム基と塩架橋を形成することができるそれらの誘導体（例えば、γ−カルボキシグルタミン酸などのグルタミン酸誘導体及び２−アミノヘキサン二酸（２−アミノアジピン酸としても知られている））である。

式（Ｉ）のアミノ酸配列のいくつかの好ましい実施形態では、Ｘ^−４はＥである。

Ｘ^−３は、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｗ又はトリプトファン誘導体（例えば、蛍光アザトリプトファン）であるが、より好ましくはＥ、Ｓ、Ｗ又はトリプトファン誘導体から選択される。

式（Ｉ）のアミノ酸配列のいくつかの好ましい実施形態では、Ｘ^−３はＷである。

Ｘ^−２及びＸ^−１は、いかなるアミノ酸であってもよく、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、それぞれは２０個（２０）標準アミノ酸、より好ましくは、Ｓ及びＴから独立して選択される。しかし、Ｘ^−２及びＸ^−１の１つ又は両方は、段落［００２２］で前述したものなどの非標準アミノ酸であってもよい。２位及び１位に存在することができる好ましい非標準アミノ酸には、例えば、セリン（例えば、アミノオキシセリン）及びトレオニン（例えば、β−ヒドロキシノルバリン（Ｈｎｖ））の誘導体又はアナログなどの２０個（２０）の標準アミノ酸の誘導体が含まれる。

式（Ｉ）のアミノ酸配列のいくつかの好ましい実施形態では、Ｘ^−２はＳである。

式（Ｉ）のアミノ酸配列のいくつかの好ましい実施形態では、Ｘ^−１はＳである。

いくつかの好ましい実施形態では、ａ及びｂはいずれも存在しない。

ａが存在する場合、ａは、アミノ酸（例えば、任意の標準又は非標準アミノ酸）、短いアミノ酸配列（例えば、２〜３０個、好ましくは２〜１５個の長さのアミノ酸）、又はその他の化学基などの部分から選択することができる。したがって、付加部分ａは、フルオレセインイソチオシアネート（５−ＦＩＴＣ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−Ｆａｍ）、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン］（５，６−ＴＡＭＲＡ）、Alexa Fluor（登録商標）色素（Life Technologies Corporation社、Carlsbad、CA、United States of America）、シアニン色素、近赤外線色素、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、２−（４，７−ビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７−トリアゾナン−１−イル）酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）などのバイオケミカルタグ（biochemical tag）若しくはキレート剤などの機能部分、又は、例えば、このようなバイオケミカルタグ若しくはキレート剤を結合するためのβ−アラニン、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（「ミニ−ＰＥＧ（商標）」）及び１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸（「ミニ−ＰＥＧ３（商標）」）などのＮ末端へのスペーサー／リンカー部分であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、ａはアミノ酸であり（この場合、ａはＸ^−５と見なすことができ、Ｘ^−５は任意のアミノ酸である）、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選択する。ａが存在するいくつかの特に好ましい実施形態では、ａはＳｅｒである。また、いくつかの実施形態では、ａは段落［００２２］で前述したものなどの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含んでいてもよい。

ｂが存在する場合、ｂは、アミノ酸（例えば、任意の標準又は非標準アミノ酸）、短いアミノ酸配列（例えば、２〜５個の長さのアミノ酸）、又はその他の化学基などの部分から選択することができる。したがって、付加部分ｂは、（式（Ｉ）の）Ｎ末端伸長をＳｈＫ毒素ポリペプチドに結合するためのスペーサー／リンカー基などの機能部分であってもよい。いくつかの実施形態では、ｂはＡｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸である。

ＳｈＫアナログに含めるために適したＮ末端伸長の例には、ＥＳＳＳ（配列番号１）、ＥＷＳＳ（配列番号２）、ＥＥＳＳ（配列番号５）、ＥＷＳＴ（配列番号６）、ＥＷＴＴ（配列番号７）、ＥＷＴＳ（配列番号８）及びＳＥＷＳＳ（配列番号９）が含まれる。

上記にもかかわらず、本発明のＳｈＫアナログはさらに又は代わりに、翻訳後プロセシングなどの天然の方法によって、又は当業者に周知のもの（例えば、ペグ化）などの化学修飾技術によって修飾したアミノ酸配列を含んでいてもよい。このような修飾は、例えば、ペプチド骨格内、アミノ酸側鎖及び／又はＣ末端を含むアナログのどの場所でも行うことができる。同じ種類の修飾がアナログ内のいくつかの部位に同じ又は様々な程度で存在していてもよいことも理解されよう。化学修飾の好ましい１例は、Ｃ末端アミド化である。したがって、本発明のアナログは、好ましくはＣ末端にアミド基を有していてもよい。ペプチドのＣ末端のアミド化（例えば、α−アミド化）の方法は当業者には周知で、例えば、Kim K-H et al.（Kim K-H et al., Biotechnol Bioprocess Eng 6:244-251 (2001)）によって記載された方法が含まれる。Ｃ末端アミドによって、アナログのカルボキシペプチダーゼ分解を回避することができる。

好ましくは、アナログは、ＷＴＳｈＫポリペプチドと同じパターンのジスルフィド架橋（すなわち、Ｃｙｓ３〜Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１２〜Ｃｙｓ２８及びＣｙｓ１７〜Ｃｙｓ３２）を示すか、そうでなければ配列番号４として示したアミノ酸配列の３／３５、１２／２８及び１７／３２に対応する位置のシステイン残基間に３個のジスルフィド架橋を有するポリペプチドである。したがって、アナログが配列番号４のバリアントアミノ酸配列を含むポリペプチド（すなわち、前述の１又は２以上の小さな変動を含むアミノ酸配列）の場合、好ましくは、アナログはＷＴＳｈＫポリペプチドと同じパターンのジスルフィド架橋を示す（又は、そうでなければ、アミノ酸配列内に変動が存在するにもかかわらず、配列番号４で示したアミノ酸配列の３／３５、１２／２８及び１７／３２に対応する位置のシステイン残基間に３個のジスルフィド架橋を有する）と理解されたい。さらに、このようなアナログはまた、好ましくは、ＷＴＳｈＫポリペプチドと実質的に同じ立体配置で２つの短いαヘリックスを示す。

好ましくは、アナログはアミノ酸配列：
ＥＷＳＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１０）
からなるポリペプチドである。

３位にＴｒｐ残基を含むＮ末端伸長ＥＷＳＳ（配列番号２）を含むアナログは、Ｔｒｐを欠如しているＷＴＳｈＫポリペプチドと比較していくつかの利点をもたらす。すなわち、Ｔｒｐ残基は、蛍光アザトリプトファン（例えば、（４−アザ）Ｔｒｐ又は（５−アザ）Ｔｒｐ（Lepthien S et al., Proc Natl Acad Sci USA 105:16095-16100 (2008)）又は最近開発された（２，７−アザ）Ｔｒｐ（Shen JY et al., Nat Commun 4:2611 (2013)））などのトリプトファン誘導体で置換することができ、これらは組換え技術を使用してポリペプチドに組み込むことができる。アザトリプトファンを含むＳｈＫアナログは、例えば、ポリペプチド送達のバイオアッセイのための光学プローブとして、又は神経若しくはがん組織におけるＫｖ１．３チャネル分布を調べるために、使用することができる。

本発明のアナログは、当業者に周知の合成又は組換え技術を使用して産生することができる。

好ましくは、アナログは単離された形態で提供する。

当業者には、Ｋｖ１．３チャネルブロッカーはＴリンパ球の増殖の強力な阻害剤であることは公知である。Ｋｖ１．３チャネルブロッカーが、心臓及び神経における毒性を回避しながら、Ｔ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）及び多発性硬化症（ＭＳ）の治療のためにかなり有望であることも知られている。さらに、当業者には、Ｋｖ１．３選択性を示すアナログが、その他の免疫細胞サブセットを損なうことなく、それによって、（重篤な感染又は悪性腫瘍を引き起こし得る）全身性免疫抑制を回避して、疾患関連Ｔ細胞及びクラススイッチされたＢ細胞を標的化することができることは認識されている。したがって、本発明のアナログは、自己免疫疾患の治療及び／又はＴリンパ球又はクラススイッチされたＢ細胞の増殖の阻害のための治療方法の開発のために適することができる。

したがって、第２の態様では、本発明は、対象におけるＴリンパ球又はクラススイッチされたＢ細胞の増殖の阻害方法であって、前記対象に、第１の態様のアナログの有効量を、任意で薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することを含む、前記方法を提供する。

第３の態様の方法によって治療される自己免疫疾患は、好ましくはＴ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患である。このような疾患の例には、ＲＡ、喘息、ＭＳ、Ｔ１ＤＭ及び乾癬が含まれる。第３の態様の方法によって治療することができるその他の自己免疫疾患には、潰瘍性大腸炎が含まれる（Koch Hansen L et al., J Crohns Colitis 8(11):1378-91 (2014)）。

治療する対象は典型的にはヒトである。しかし、本発明はまた、例えば、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ及びウマ）、エキゾチックアニマル（例えば、トラ、ライオン、ゾウなど）及び伴侶動物（イヌ及びネコなど）などの非ヒト対象に適用することができる。

アナログは、対象に投与すると前記アナログの有効量が対象に送達されることが確実である方法又は医薬品で投与、適合及び／又は製剤化することが好ましい。したがって、アナログは、例えば、経口、頬側（buccal）、経鼻、皮下、筋肉内、吸入及び静脈内投与用の医薬組成物などの任意の適切な医薬品に製剤化することができる。典型的には、このような医薬組成物は、治療効果を実現するために有効な、したがって、１日につき体重１ｋｇ当たりアナログ約０．０１〜約１００μｇ、より好ましくは１日につき体重１ｋｇ当たりアナログ０．０５〜２５μｇを提供することができる量で対象に投与する。適切な医薬組成物は、最も効果的な結果を実現するために必要ならば、一日につき単回の投与、一日につき複数回の投与、又は制御放出若しくは持続性放出を目的としてもよい。しかし、上記にもかかわらず、当業者であれば、アナログの投与量及び任意の特定の対象のための投与頻度は変更可能で、アナログの活性、アナログの代謝安定性及び作用時間、年齢、体重、性別、投与形態及び投与時間、アナログの排泄速度、治療される自己免疫疾患の重症度を含む様々な要素によって左右されることを理解しているだろう。適切な医薬組成物は、吸入投与（エアロゾルの形態など）、経口投与（錠剤、カプセル、顆粒又は散剤の形態など）、経鼻投与（例えば、スプレー又は吸入可能な粉末の形態など）又は非経口投与（皮下、静脈内又は筋肉内注射若しくは注入など）のために製剤化することができる。

第４の態様では、本発明は、自己免疫疾患、好ましくはＲＡ及びＭＳのようなＴ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患の治療における第１の態様のアナログの使用を提供する。

前述のように、本発明のアナログは、当業者に周知の組換え技術を使用して産生することができる。したがって、本発明のさらなる態様では、本発明は、第１の態様のアナログ、好ましくは、配列番号１０で示したアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子（好ましくは、単離された形態）を提供する。さらなる態様では、本発明はこのようなポリヌクレオチド分子を含むクローニング又は発現ベクターを提供する。さらに、よりさらなる態様では、本発明は、ポリヌクレオチド分子又はクローニング若しくは発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、原核若しくは真核細胞）であって、例えば、培養中アナログを発現することができる、前記宿主細胞を提供する。

上記にもかかわらず、本発明のアナログは、自己免疫疾患以外の疾患及びその他の症状、例えば、肥満（Tucker K et al., Int J Obes (Lond) 32(8):1222-1232 (2008)及びXu J et al., Hum Mol Genet 12(5):551-559 (2003)）、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）（Xu J et al., Proc Natl Acad Sci USA 101(9):3112-3117 (2004)）、歯周病における骨吸収（Valverde P et al., J Dent Res 84(6):488-499 (2005)）及びがん（例えば、固形腫瘍、白血病及びリンパ腫）（Leanza L et al., Cell Calcium 58:131-138 (2015)）の治療のための治療方法の開発のために適することがある。ＳｈＫアナログのこのような使用は、本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。

上記で示したように、がん及びその他の増殖性疾患又は障害の治療のために、本発明のＳｈＫアナログは細胞の細胞質に送達し、そこでミトコンドリアのＫｖ１．３チャネル（ｍｉｔｏＫｖ１．３）をブロックするように作用することができるように適合させることができる。これは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をＳｈＫアナログのアミノ酸配列（好ましくはＣ末端）又はＮ末端伸長（すなわち、式ＩのａにＣＰＰを含めることができる）に添加することによって実現することができる。しかし、低分子担体（ＳＭｏＣ，small molecule carrier；Okuyama M et al., Nat Methods 4(2):153-159 (2007)）としても知られているＣＰＰの結合した低分子模倣体の使用、「クリックケミストリー」（例えば、Sharpless KB and R Manetsch, 2006、Kolb HC et al., Agnew Chem Int Ed Engl 40:2004-2021 (2001)及びTornoe CW et al., J Org Chem 67:3057-3064 (2002)によって記載された方法のいずれかを使用する）を使用するＣＰＰのＳｈＫアナログへの結合、及びＣＰＰのＳｈＫアナログへの非共有結合（例えば、Ｐｅｐ−１として知られているＣＰＰに関与するMorris MC et al., Nat Biotechnol 19:1173-1176 (2001)に記載された方法を使用する）を含むその他の取り組みもまた適している。さらに、又は代わりに、ＳｈＫアナログは細胞の細胞質に送達するために製剤化することができ、例えば、ＳｈＫアナログはリポソーム調製物（特に、「エンドソーム脱出」のためのｐＨ感受性リポソームを含む調製物；Torchilin VP et al., J Liposome Res 3:201-255 (1993)）として製剤化することができる。

本発明は、以下の非限定的実施例及び添付の図面によって以下にさらに説明する。

イソギンチャク毒素ＳｈＫアナログの設計及び評価
材料及び方法
分子モデリング−Ｋｖ１．３に結合したＳｈＫの誘導体の複合体のモデリングは、既に開発されたマウスＫｖ１．３（ｍＫｖ１．３）に結合したＳｈＫ−１９２のモデル（Pennington MW et al., Mol Pharmacol 75:762-773 (2009)）から開始した。このモデルは、鋳型としてストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のＫ^＋チャネル（ＫｃｓＡ、ＰＤＢｉｄ１ＢＬ８）のＸ線結晶構造を使用し、これにＳｈＫ−１９２のモデルをドッキングさせた。ＳｈＫへのＮ末端伸長のループモデリングは、MODELLERプログラム（Eswar N et al., Curr Protoc Bioinformatics Chapter 5, Unit 5 6 (2006)）を使用して実施した。各複合体について、２５の初期モデルを作製し、これらのモデルそれぞれについて、２５のループモデル（Ｎ末端伸長残基のみからなる）を考案し、全部で６２５のモデルをそれぞれの長さのＮ末端伸長について作製した。

［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＥＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＩＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＬＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＶＳＳ］ＳｈＫ及び［ＥＷＳＳ］ＳｈＫと、ｍＫｖ１．３との複合体のＭＤシミュレーションは、YASARAプログラム（Yet Another Scientific Artificial Reality Application、www.yasara.org: YASARA Biosciences GmbH社、Vienna、Austria）を使用して実施した；（チャネルとの複合体における）［ＥＳＳＳ］ＳｈＫのＳｅｒ−３はそれぞれＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｒｐに変異させた。複合体はホスファチジル−エタノールアミンのみからなる膜に埋め込まれ、膜面の溶質よりも約１５Å広がり、水は膜に垂直に溶質よりも約１０Å伸長している。境界条件は、周期境界条件に設定した。残基は、ｐＨ７．４で予測された状態に応じてイオン化した。ナトリウム及び塩素イオンは水分子と置き換わって、最終イオン濃度０．９％を達成した。ＭＤシミュレーションはさらに、［ＧＥＷＳＳ］ＳｈＫ及び［ＳＥＷＳＳ］ＳｈＫで実施した。

標準ＡＭＢＥＲ０３力場パラメーター（Duan Y et al., J Comput Chem 24:1999-2012 (2003)）を適用して非結合相互作用全てについて７．８６Åのカットオフを用い、一方長距離クーロン相互作用は、パーティクルメッシュエワルドのアルゴリズムを用いて計算した。分子内力について１．２５ｆｓ、分子間力について２．５ｆｓの短い時間刻みの使用を必要とする拘束は適用しなかった。シミュレーションは全て、温度２９８Ｋで実施し、全圧は１バールで維持した。初期に２５０ｐｓ持続する拘束平衡シミュレーションを適用して、溶媒の干渉を受けずに脂質を溶質周囲に閉じ込めた。この後に拘束をかけないＭＤシミュレーションを１．０ｎｓ行った。

Ｎ末端伸長ＳｈＫアナログの合成−［ＥＥＳＳ］ＳｈＫ及び［ＥＳＳＳ］ＳｈＫは、Preludeペプチド合成機で標準Ｆｍｏｃ−ｔＢｕ方法を使用して合成した。基本のポリペプチドＳｈＫは、Ｒｉｎｋアミド樹脂（Peptides International, Inc社、Louisville、KY、United States of America）から合成を開始した。カップリングは全て、ジイソプロピルカルボジイミド及び６−クロロ−ヒドロキシベンゾトリアゾールで媒介した。３５個のアミノ酸ＳｈＫ配列の合成が完了した後、樹脂を等分し、ＥＳＳＳ（配列番号１）又はＥＥＳＳ（配列番号５）のＮ末端伸長を２つに分けた部分（aliquots）に添加した。ペプチド直鎖を固相構築した後、ポリペプチドを固相支持体から切断し、同時に試薬Ｋを使用して室温（ＲＴ，room temperature）で２時間脱保護した。粗ポリペプチドを氷冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、徹底的に洗浄して切断混合物から陽イオン捕捉体を除去し、５０％酢酸水溶液に溶解し、水で希釈した後ＮＨ_４ＯＨでｐＨを８．０に調整した。

ジスルフィド結合形成は、還元及び酸化したグルタチオンでＳｈＫのために以前に使用したプロトコールに従って（Rauer H et al., J Biol Chem 274:21885-21892 (1999)）促進した。折り畳みの進行は、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａＣ１８カラムを使用したＲＰ−ＨＰＬＣ（Phenomenex Inc.社、Torrance、CA、United States of America）によってアセトニトリル対ＴＦＡ０．０５％を含有するＨ_２Ｏの１０〜７０％の勾配を用いて３５分かけて追跡した。３個のジスルフィド結合の折り畳みはまた、ＥＳＩ−ＭＳによる測定によって粗材料から６質量単位が失われることによって確認した。

［ＥＷＳＳ］ＳｈＫの発現及び精製−［ＥＷＳＳ］ＳｈＫは、以前に記載されたように発現させ精製した（Chang SC et al., Toxicon 60:840-850 (2012)）。簡単に説明すると、［ＥＷＳＳ］ＳｈＫは、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（E.coli）細胞において封入体を形成するチオレドキシン融合タンパク質として発現させた。これらを可溶化し、インビトロで再度折り畳み、エンテロキナーゼで切断して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって均一になるまで精製し、その後凍結乾燥した。

電気生理学的分析−ＲＴでホールセル型標準パッチクランプ技術を使用して細胞を研究した。バッチ溶液は（ｍＭで）ＮａＣｌ１６０、ＫＣｌ４．５、ＣａＣｌ_２２、ＭｇＣｌ_２１、ＨＥＰＥＳ１０を含有し、ｐＨ７．２、３００ｍＯｓｍであった。パッチピペットは（ｍＭで）ＫＦ１４５、ＨＥＰＥＳ１０、ＥＧＴＡ１０及びＭｇＣｌ_２２を含有するｐＨ７．２、２９０ｍＯｓｍの溶液を充填し、抵抗を２〜４ＭΩとした。Ｋｖ電流は、保持電位−８０ｍＶ〜４０ｍＶまでの２００ｍｓ脱分極パルスを３０秒毎に反復適用することによって惹起した。ポートアパッチパッチクランプ系（Nanion Technologies GmbH社、Munich、Germany）及びＮＰＣ−１チップも２〜３．５ＭΩの抵抗で併用した。ＫｖブロッカーのＩＣ_５０値は、４０ｍＶで測定したピーク電流の低下にヒルの式を当てはめることによって計算した。

結果
ＳｈＫのＮ末端伸長のモデリング−Ｋｖ１．３に結合したＳｈＫ−１９２のモデルにおいて、Ｎ末端の負に荷電したホスホノ基は、Ｋｖ１．３チャネルのＬｙｓ４１１の側鎖アンモニウム基と塩架橋を形成することが予測された。ホスホノ基は、チャネルに対するこのアナログの高い親和性におそらく関与するが、免疫原になりやすい可能性も示され、その産生及びペプチドへの結合には化学合成が必要で、これらの問題はホスホノ基の代わりに標準アミノ酸を使用することによって克服することができるという仮説がたてられた。ＳｈＫ−１９２との複合体におけるＫｖ１．３の相同性モデルにおいて（図１Ａ）、ホスホノ基はＷＴＳｈＫ毒素Ｎ末端から約８Åのところにあり、これはＮ末端と完全に伸長したＧｌｕ残基のカルボキシレートとの間の距離（約４．７Å）のほぼ２倍であることが見いだされた。したがって、必要な距離に届き、チャネルへの親和性を維持するために、ホスホノ基とそのリンカーの置き換えに２個以上のアミノ酸がおそらく必要であることが考えられた。

したがって、ホスホノ基及びリンカーを有するＳｈＫ−１９２アナログのＮ末端Ｇｌｕが０、１若しくは２個の介在性Ｓｅｒ残基で置き換えられた相同性モデルは、MODELLERプログラムを使用して作製し、Ｓｅｒアミノ酸は溶解性を維持し、ＳｈＫ−１９２におけるミニ−ＰＥＧスペーサーの特性をほぼ模倣するのを助けるために選択された。ＧｌｕがＷＴＳｈＫ毒素Ｎ末端に直接付加されたモデルは、Ｇｌｕ−１のカルボキシレートがチャネルのＬｙｓ４１１の側鎖アンモニウムとの塩架橋を形成することができるように作製することができた。しかし、これらのモデルは塩架橋が存在しないその他のモデルとエネルギー的に区別することはできなかった（図１Ｂ）。同様に、１個又は２個の介在性Ｓｅｒ残基があると、必要な塩架橋を備えたモデルを作製することはできたが、またこれらのモデルは塩架橋が存在しないモデルよりもエネルギーがあまり低くなかった。３個の介在性Ｓｅｒアミノ酸があると、ＥＳＳＳ（配列番号１）伸長が生じ、Ｎ末端ＧｌｕカルボキシレートとチャネルのＬｙｓ４１１のアンモニウムの間に必要な相互作用を有する低エネルギーモデルを得ることができた。［ＥＳＳＳ］ＳｈＫの最低エネルギーモデルにおいて（図１Ｃ）、Ｇｌｕ−４とＫｖ１．３のＬｙｓ４１１の間の塩架橋とは異なり、チャネルの伸長の唯一のその他の相互作用はＳｅｒ−３の側鎖とＰｒｏ３７７である；その他のＳｅｒ伸長残基（１及び２の位置）は溶媒中に突き出す。

構造−活性の関係及び［ＥＷＳＳ］ＳｈＫのモデリング−Ｋｖ１．３選択的ＳｈＫアナログの設計は、Ｋｖ１．３とＫｖ１．１チャネルとの間のアミノ酸配列変動を利用した（図２）。２つのチャネルの相同性は高く、それらの間で違うのは表面に露出した７個の残基のみで、これらの違いのほとんどは類似のタイプの残基の間、例えば、Ｋｖ１．３のＡｓｐ３７５とＫｖ１．１のＧｌｕ３７５（Ｄ３７５Ｅ）である。その他の違いは、これらのＤ３７６Ｅ、Ｐ３７７Ａ、Ｓ３７８Ｅ、Ｇ３８０Ｈ、Ｎ３８２Ｓ及びＨ４０４Ｙ（図１Ａ）で、最初の４つの残基はＳ５とポアヘリックス（pore helices）の間のタレット（turret）にあり、一方Ｈ４０４はポアとＳ６ヘリックスを連結するループ内にある。さらに、マウス及びヒトＫｖ１．３は非常に類似していて、マウスとヒトの間の表面露出残基の唯一の違いは、Ｓ３７８Ｔ及びＮ３８２Ｓであり；マウス及びヒトＫｖ１．１の配列は膜貫通領域及び選択的フィルター領域では同一である。

Ｋｖ１．３とＫｖ１．１の間の７個の表面残基の違いのうち、Ｋｖ１．３のＰｒｏ３７７のみが複合体のモデルにおいて［ＥＳＳＳ］ＳｈＫのＮ末端伸長のＳｅｒ−３と接触する。この位置で置換したＩｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌの疎水性側鎖は全て、このＰｒｏ残基の側鎖と有利に相互作用することが予測された（Liwo A et al., J Comput Chem 18:849-873 (1997)）が、Ａｌａ（Ｋｖ１．３のＰｒｏ３７７に対応するＫｖ１．１における残基）に対するＰｒｏの結合親和性は状況次第のようである（すなわち、側鎖が溶媒に露出しているか、又はタンパク質の内側に埋め込まれているかに左右される）。しかし、３位で置換されたＴｒｐの側鎖は、その環境とは独立してＡｌａよりもＰｒｏの側鎖と強く結合することが予測された。重要な点は、ＴｒｐはＰｒｏとＡｌａとの間を最も良く区別することが予測され（すなわち、２０個の標準タンパク質アミノ酸の全ての最も大きな結合エネルギー差を示す）、したがって、Ｋｖ１．３とＫｖ１．１とを最もよく区別すると予想される。

これらの所見に基づいて、［ＥＳＳＳ］ＳｈＫアナログのＳｅｒ−３をＴｒｐと置換し、得られたモデルにＭＤシミュレーションを行った。ＭＤの１．０ｎｓ後の最終モデルを図１Ｄに表す。［ＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログのＴｒｐ−３の側鎖は、Ｋｖ１．３チャネルのＰｒｏ３７７の側鎖と相互作用し、と同時にＧｌｕ−４カルボキシレートとＬｙｓ４１１との相互作用を維持することが予測された。このアナログのＳｅｒ−１の側鎖ヒドロキシルはまた、隣接するチャネルモノマーのＡｓｐ４３３（Ｋｖ１．３とＫｖ１．１の間で保存された残基）のカルボキシレートと水素結合を形成し、さらに複合体を安定化することが予測された。

ＳｈＫ誘導体［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＩＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＬＳＳ］ＳｈＫ及び［ＥＶＳＳ］ＳｈＫのＭＤシミュレーションによって、Ｓｅｒ−３、Ｉｌｅ−３、Ｌｅｕ−３及びＶａｌ−３それぞれの側鎖がＰｒｏ３７７のアルカン側鎖と安定した相互作用を形成しないことが示され（すなわち、Ｐｒｏ３７７を含有するループはシミュレーション中、伸長から遠ざかった）、大きな側鎖基（Ｔｒｐ中のインドール基など）がこの距離を結ぶために必要であることが示唆された。しかし、Ｇｌｕ−４のカルボキシレートとＫｖ１．３のＬｙｓ４１１の間の塩架橋は、シミュレーション全てにおいて維持された。

Ｋｖ１．３との複合体において、Ｓｅｒ−３をＧｌｕで置き換えた［ＥＥＳＳ］ＳｈＫアナログのさらなるＭＤシミュレーションでは、Ｐｒｏ３７７との最初の結合からまた切り離されたＧｌｕ−３が生じたが、アナログのＧｌｕ−４のカルボキシレートとＫｖ１．３のＬｙｓ４１１との間の塩架橋はまた、インバリアントチャネル残基Ｖａｌ４０６及びＴｈｒ４０７のアルカン側鎖にＧｌｕ−３の側鎖のアルカン面を詰め込んで維持することができる。

［ＧＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログのＭＤシミュレーションにおいて、Ｇｌｕ−４のカルボキシレートとＬｙｓ４１１のアンモニウムとの間の相互作用が喪失すると、付随してＴｒｐ−３とＰｒｏ３７７との間の相互作用の喪失が生じることが見いだされたが、［ＳＥＷＳＳ］ＳｈＫとＫｖ１．３のドッキングのモデリングによってこのアナログがＧｌｕ−４のカルボキシレートとＫｖ１．３のＬｙｓ４１１との間の塩架橋を維持しており、Ｔｒｐ−３残基をＰｒｏ３７７の側部のＫｖ１．３チャネルの結合部位に「ぴったり」寄り添わせることが示された。したがって、ペンタペプチドＮ末端伸長を含むＳｈＫアナログ、特に［ＳＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログは、効果的なＫｖ１．３チャネルブロッカーとしてかなり有望であることが示された。

［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ及び［ＥＥＳＳ］ＳｈＫの合成−これらのポリペプチドは、標準Ｆｍｏｃ−ｔＢｕ固相ペプチド合成を使用して構築した。その他多くのＳｈＫアナログのためにうまく使用されたことがあるグルタチオン媒介酸化的折り畳み条件を使用して粗生成物を酸化した。ポリペプチドは迅速に折り畳まれ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって主要なピークが先に溶出し、その後に誤って折り畳まれた副生成物種が溶出する典型的パターンが生じた。［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ及び［ＥＥＳＳ］ＳｈＫは、調製ＲＰ−ＨＰＬＣによって均一になるまで精製した。各ポリペプチドはＥＳＩ−ＭＳによって正確な質量を有し（データは示さず）、３個のジスルフィド結合が形成されたことが示された。収率は、ポリペプチドそれぞれに対する開始樹脂の量をベースにした理論収率の約１６％であった。

［ＥＷＳＳ］ＳｈＫの発現及び精製−可溶化したＨｉｓタグ融合タンパク質を変性させ、前述のようにＮＴＡカラムにローディングし（Chang SC et al., Toxicon 60:840-850 (2012)）、結合したタンパク質は変性剤を徐々に除去することによって再度折り畳んだ。次に溶出した融合タンパク質をエンテロキナーゼで切断して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって均一になるまで精製した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって、精製したＳｈＫアナログは本質的に均一であることが示された。［ＥＷＳＳ］ＳｈＫの高分解能エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ，electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry）によって、平均質量４５４４Ｄａが生じ、この値は６個のシステイン全てが３個の天然のジスルフィド結合に関与している［ＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログの理論的質量４５４４Ｄａと一致した（Pohl J et al., 1995）。［ＥＷＳＳ］ＳｈＫの収率は約２ｍｇ／Ｌであった。

Ｋ^＋チャネルブロッキング活性−よく確立されたホールセルパッチクランプ電気生理学アッセイを実施して、［ＥＳＳＳ］ＳｈＫ、［ＥＥＳＳ］ＳｈＫ並びに［ＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログのＫｖ１．３及びＫｖ１．１チャネルに対する効力及び選択性を測定した（図３Ａ）。［ＥＳＳＳ］ＳｈＫは、Ｋｖ１．３をＩＣ_５０６５７±７９ｐＭで阻害し、Ｋｖ１．１に対してはＩＣ_５０１３２７±３８６ｐＭの低い親和性を示し、Ｋｖ１．１と比べてＫｖ１．３に対して２倍の選択性となった。［ＥＥＳＳ］ＳｈＫはＫｖ１．３に対して［ＥＳＳＳ］ＳｈＫよりも少し高い親和性を表し、ＩＣ_５０は４０４±５８ｐＭで、Ｋｖ１．１に対するＩＣ_５０は８３０±１１６ｐＭであった。［ＥＥＳＳ］ＳｈＫは、［ＥＳＳＳ］ＳｈＫと比較して、Ｋｖ１．１よりもＫｖ１．３に対して１．６倍高い親和性を有することが見いだされ（表１、図３Ｂ）、また、Ｋｖ１．１と比べたＫｖ１．３に対する選択性も２倍であった。このように、両アナログのＫ^＋チャネルに対する親和性は低下しており、Ｋｖ１．１と比べたＫｖ１．３に対する選択性は比較的低いレベルを示した。それが意味することは、Ｓｅｒ−３もＧｌｕ−３も、Ｋｖ１．３のＰｒｏ３７７とＫｖ１．１の対応するＡｌａとをあまり区別することはできないということである。しかし、組換え［ＥＷＳＳ］ＳｈＫはＫｖ１．３に対して高い親和性を示し、ｍＫｖ１．３に対するＩＣ_５０は３４±８ｐＭであったが、Ｋｖ１．１チャネルに対する親和性は著しく低下していた（ＩＣ_５０＝５３７１±９１２ｐＭ）（表１）。したがって、［ＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログはＫｖ１．３に対してＳｈＫ−１９２と類似の選択性レベルを示すが、親和性は４倍高かった。

考察
標準アミノ酸のみからなるＮ末端伸長を有する新規なＳｈＫアナログを調べた。これらのアナログのいくつかは、Ｋｖ１．１チャネルよりもＫｖ１．３チャネルに対して選択性を示し、最も顕著なものはＮ末端のＥＷＳＳ（配列番号２）テトラペプチド伸長を有するアナログである。この［ＥＷＳＳ］ＳｈＫアナログは、Ｋｖ１．１に対してごく弱い阻害を示すが、Ｋｖ１．３チャネルに対して高い効力を維持していた（ＩＣ_５０３３±７ｐＭ）。モデリング研究によって、ＥＷＳＳ（配列番号２）テトラペプチド伸長は、アナログＳｈＫ−１９２におけるホスホノ部分と親水性リンカーについて予測されたＫｖ１．３チャネルとの相互作用を模倣することができることが示唆された。テトラペプチド伸長はまた、ホスファターゼによる加水分解を受けにくい。本発明によるＳｈＫアナログは、当業者に周知の合成又は組換え技術を使用して産生することができる。これらは、全身性免疫抑制並びに標的外チャネル、特にＫｖ１．１の阻害による心臓及び神経における毒性の可能性を回避しながら、自己免疫疾患の治療のための治療剤の基礎として大きな可能性を提供する。

本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の解釈が必要でない限り、語句「含む（comprise）」及び「含む（include）」並びに「含んでいる（comprising）」及び「含んでいる（including）」などの変化形は、記述されたもの又はものの群を含むが、その他のいかなるもの又はものの群も排除しないことを意味するものと理解されたい。

本明細書におけるいかなる先行技術の参照も、このような先行技術が共通の一般的知識の一部を形成することを承認するいかなる形態の示唆であるとも捉えられるものではなく、捉えられるべきではない。

当業者であれば、本発明は記載した特定の適用にその使用を制限しないことを理解していると予想される。本明細書で記載又は示した特定の要素及び／又は特徴に関して、本発明はその好ましい実施形態に制限されない。本発明は、開示した実施形態又は実施形態類に限定されないが、以下の特許請求の範囲によって記載し定義した本発明の範囲を逸脱することなく、数多くの再構成、改変及び置換が可能であることが理解されると予想される。

（参考文献）
Atkinson MA et al., Lancet 358:766 (2001)
Beeton C et al., J Biol Chem 278:9928-9937 (2003)
Beeton C et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:17414-17419 (2006)
Beeton C et al., Inflamm Allergy Drug Targets 10:313-321 (2011)
Bennett J et al., J Neuroimmunol 229:180-191 (2010)
Berger T et al., New Engl J Med 349:139-145 (2003)
Chang SC et al., Toxicon 60:840-850 (2012)
Chi V et al., Toxicon 59:529-546 (2012)
Corcione A et al., Proc Natl Acad Sci USA 101:11064-11069 (2004)
Dorner T et al., Curr Opin Rheumatol 15:246-252 (2003)
Duan Y et al., J Comput Chem 24:1999-2012 (2003)
Eswar N et al., Curr Protoc Bioinformatics Chapter 5, Unit 5 6 (2006)
Fasth A et al., Scand J Immunol 60:199-208 (2004)
Fawell S et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:664-668 (1994)
Friedrich M et al., Arch Dermatol Res 292:519-521 (2000)
Gilhar A et al., J Invest Dermatol 131:118-124 (2011)
Glasscock E et al., J Neurosci 30:5167-5175 (2010)
Grimmer S et al., Mol Pharmacol 45:1227-1234 (1994)
Gutman GA et al., Pharmacol Rev 57:473-508 (2005)
Hu LN et al., Plos One 8 (2013)
Kalman K et al., J Biol Chem 273:32697-32707 (1998)
Kim K-H et al., Biotechnol Bioprocess Eng 6:244-251 (2001)
Koch Hansen L et al., J Crohns Colitis 8(11):1378-91 (2014)
Kolb HC et al., Agnew Chem Int Ed Engl 40:2004-2021 (2001)
Koshy S et al., J Biol Chem 289:12623-12632 (2014)
Leanza L et al., Leukemia 27:1782-1785 (2013)
Leanza L et al., Cell Calcium 58:131-138 (2015)
Lepthien S et al., Proc Natl Acad Sci USA 105:16095-16100 (2008)
Lanigan MD et al., Biochemistry 41(40):11963-11971 (2002)
Liwo A et al., J Comput Chem 18:849-873 (1997)
Lovett-Racke AE et al., J Clin Invest 101:725-730 (1998)
Morris MC et al., Nat Biotechnol 19:1173-1176 (2001)
O’Connor KC et al., J Clin Immunol 21:81-92 (2001)
Okuyama M et al., Nat Methods 4(2):153-159 (2007)
Pennington MW et al., Mol Pharmacol 75:762-773 (2009)
Rauer H et al., J Biol Chem 274:21885-21892 (1999)
Ruben S et al., J Virol 63:1-8 (1989)
Sallusto F et al., Annu Rev Immunol 22:745-763 (2004)
Sharpless KB and R Manetsch, Expert Opin Drug Discov 7:489-501 (2012)
Shen JY et al., Nat Commun 4:2611 (2013)
Tarcha EJ et al., J Pharmacol Exp Ther 342:642-653 (2012)
Torchilin VP et al., J Liposome Res 3:201-255 (1993)
Tornoe CW et al., J Org Chem 67:3057-3064 (2002)
Tucker K et al., Int J Obes (Lond) 32(8):1222-1232 (2008)
Tudor JE et al., Nat Struct Biol 3:317-320 (1996)
Valverde P et al., J Dent Res 84(6):488-499 (2005)
Viglietta V et al., J Clin Invest 109:1511-1511 (2002)
Wagstaff KM and DA Jans, Curr Med Chem 13(12):1371-1387 (2006)
Wulff H et al., J Clin Invest 111:1703-1713 (2003)
Wulff H et al., J Immunol 173:776-786 (2004)
Xu J et al., Hum Mol Genet 12(5):551-559 (2003)
Xu J et al., Proc Natl Acad Sci USA 101(9):3112-3117 (2004)

Claims

スチコダクチラ・ヘリアンサス毒素ＳｈＫのアナログであって、ＳｈＫ毒素ポリペプチドと、ＥＷＳＳ（配列番号２）、ＥＷＳＴ（配列番号６）、ＥＷＴＴ（配列番号７）及びＥＷＴＳ（配列番号８）からなる群から選択されるＮ末端伸長とを含む、前記アナログ。
ＳｈＫ毒素ポリペプチドが、ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号４）に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のアナログ。
ＳｈＫ毒素ポリペプチドが、Ｍｅｔ２１の置換を含むバリアントアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のアナログ。
Ｎ末端伸長がＥＷＳＳ（配列番号２）である、請求項１〜３のいずれかに記載のアナログ。
Ｃｙｓ３〜Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ１２〜Ｃｙｓ２８及びＣｙｓ１７〜Ｃｙｓ３２の間にジスルフィド架橋を有するポリペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載のアナログ。
さらに細胞透過性ペプチドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のアナログ。
請求項１〜６のいずれかに記載のアナログを含む、対象におけるＴリンパ球又はクラススイッチされたＢ細胞の増殖の阻害剤であって、任意で薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、前記阻害剤。
請求項１〜６のいずれかに記載のアナログを含む、対象における自己免疫疾患の治療剤であって、任意で薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、前記治療剤。
治療される自己免疫疾患が、Ｔ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患である、請求項８に記載の治療剤。
自己免疫疾患の治療のための医薬品の調製における、請求項１〜６のいずれかに記載のアナログの使用。
治療される自己免疫疾患が、Ｔ_ＥＭ細胞によって媒介される自己免疫疾患である、請求項１０に記載の使用。
請求項１〜６のいずれかに記載のアナログを含む、対象におけるがんの治療剤であって、任意で薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、前記治療剤。
がんが固形腫瘍、白血病又はリンパ腫である、請求項１２に記載の治療剤。
がんの治療のための医薬品の調製における、請求項１〜６のいずれかに記載のアナログの使用。
がんが固形腫瘍、白血病又はリンパ腫である、請求項１４に記載の使用。
請求項１〜６のいずれかに記載のアナログをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子。
請求項１６に記載のポリヌクレオチド分子を含むクローニング又は発現ベクター。
請求項１６に記載のポリヌクレオチド分子又は請求項１７に記載のクローニング若しくは発現ベクターを含む宿主細胞であって、培養中にアナログを発現することができる、前記宿主細胞。