CN110357950B - 酸性氨基酸扫描法设计的免疫抑制多肽及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了酸性氨基酸扫描法设计的免疫抑制多肽及应用。涉及生物技术领域。本发明运用多肽与钾离子通道相互模式的“人工控制识别”的药物设计技术，通过天冬氨酸扫描技术动态调整分子模板BmKTX识别钾离子通道Kv1.3的键合界面，可多样地作用靶标钾离子通道Kv1.3，设计出了序列高度相似的候选免疫抑制多肽药物，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1~21所示。本发明的多肽在各实验模型中表现良好，具体效果为给予本发明提供的多肽治疗后，大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎的症状均得到显著改善；大鼠足跖肿胀度与模型阴性对照组相比显著降低。提示其在钾离子通道Kv1.3相关疾病的治疗或预防中具有重要的开发和应用价值。

Description

酸性氨基酸扫描法设计的免疫抑制多肽及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及作用钾离子通道Kv1.3免疫抑制多肽的分子设计及制备与应用。
背景技术
淋巴细胞膜上钾离子通道Kv1.3已成为治疗自身免疫性疾病的药物靶标。当前，国内外科研机构主要运用药物筛选法、化学修饰法、氨基酸残基截短法、多肽键合界面调控法等不同方法研发靶向钾离子通道Kv1.3的免疫抑制多肽药物(请见申请人与法国科研人员联合发表的作用钾离子通道Kv1.3多肽药物研发的综述文章：Treating autoimmunedisorders with venom-derived peptides.Expert Opin Biol Ther.2017,17(9):1065-1075)。
申请人团队基于亿年演化蝎活性多肽与钾离子通道的作用规律，发现了蝎活性多肽中特征分布的酸性氨基酸残基对多肽键合界面定位的调控功能，建立了多肽与钾离子通道相互模式的人工控制识别的药物设计技术(Protein-Protein Recognition Control byModulating Electrostatic Interactions.Journal of Proteome Research,2010,9:3118-3125)，初步设计了多个作用钾离子通道Kv1.3的候选多肽药物，并且这些多肽运用不同的分子表面作为键合界面作用钾离子通道Kv1.3的细胞外孔区部分(ZL200710053679.0；ZL201310208475.5；Structural Basis of a Potent Peptide Inhibitor Designed forKv1.3Channel,a Therapeutic Target of Autoimmune Disease.J Biol Chem,2008,283:19058-19065；Unusual binding mode of scorpion toxin BmKTX onto potassiumchannels relies on its distribution of acidic residues.Biochem Biophys ResCommun,2014,447(1):70-76；Toxin acidic residue evolution function-guideddesign of de novo peptide drugs for immunotherapeutic targetKv1.3channel.Scientific Reports,2015,5:9881)。但筛选与设计高效低毒靶向钾离子通道Kv1.3多肽药物仍具有挑战性。
发明内容
有鉴于此，本发明运用多肽与钾离子通道相互模式的“人工控制识别”的药物设计技术，以含有37个氨基酸残基的蝎活性肽BmKTX为模板(ZL200710053679.0；ZL201310208475.5；Structural Basis of a Potent Peptide Inhibitor Designed forKv1.3Channel,a Therapeutic Target of Autoimmune Disease.J Biol Chem,2008,283:19058-19065；Unusual binding mode of scorpion toxin BmKTX onto potassiumchannels relies on its distribution of acidic residues.Biochem Biophys ResCommun,2014,447(1):70-76；Toxin acidic residue evolution function-guideddesign of de novo peptide drugs for immunotherapeutic targetKv1.3channel.Scientific Reports,2015,5:9881)，通过改变分子模板BmKTX内酸性氨基酸扫描技术调节多肽识别钾离子通道Kv1.3的键合界面，设计序列高度相似的候选免疫抑制多肽药物。
本发明提供一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示。
本发明仍以多肽BmKTX(序列：VGINVKCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCINGKCDCTPK)为分子模板通过天冬氨酸扫描法设计了21个可能作用于钾离子通道Kv1.3的免疫抑制多肽，其氨基酸序列如下：
ADIP-4  VGIDVKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-5  VGINDKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-6  VGINVDCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-8  VGINVKCDHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-9  VGINVKCKDSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-10 VGINVKCKHDGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-11 VGINVKCKHSDQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-12 VGINVKCKHSGDCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-14 VGINVKCKHSGQCDKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-15 VGINVKCKHSGQCLDPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-16 VGINVKCKHSGQCLKDCKKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-18 VGINVKCKHSGQCLKPCDKAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-19 VGINVKCKHSGQCLKPCKDAGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-20 VGINVKCKHSGQCLKPCKKDGMRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-22 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGDRFGKCINGKCKCTPK
ADIP-24 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGMRDGKCINGKCKCTPK
ADIP-28 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCDNGKCKCTPK
ADIP-29 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCIDGKCKCTPK
ADIP-31 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGDCKCTPK
ADIP-35 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCDPK
ADIP-37 VGINVKCKHSGQCLKPCKKAGMRFGKCINGKCKCTPD
由于所设计的ADIP-4～37多肽中天冬氨酸处于分子内不同的位置。根据发明人先前发现多肽分子内酸性氨基酸对多肽键合界面的定位功能(ZL200710053679.0；ZL201310208475.5；Structural Basis of a Potent Peptide Inhibitor Designed forKv1.3Channel,a Therapeutic Target of Autoimmune Disease.J Biol Chem,2008,283:19058-19065；Unusual binding mode of scorpion toxin BmKTX onto potassiumchannels relies on its distribution of acidic residues.Biochem Biophys ResCommun,2014,447(1):70-76；Toxin acidic residue evolution function-guideddesign of de novo peptide drugs for immunotherapeutic targetKv1.3channel.Scientific Reports,2015,5:9881)，这些多肽与模板BmKTX多肽以差异的分子表面识别人源钾离子通道Kv1.3，因而它们活性也相应会发生变化：ADIP-4多肽IC50为0.017nM、ADIP-5多肽IC50为5.4nM、ADIP-6多肽IC50为0.76nM、ADIP-8多肽IC50为5.92nM、ADIP-9多肽IC50为21.26nM、ADIP-10多肽IC50为5000nM、ADIP-11多肽IC50为11.53nM、ADIP-12多肽IC50为3.06nM、ADIP-14多肽IC50为4.32nM、ADIP-15多肽IC50为0.64nM、ADIP-16多肽IC50为3.40nM、ADIP-18多肽IC50为0.13nM、ADIP-19多肽IC50为0.005nM、ADIP-20多肽IC50为2.65nM、ADIP-22多肽IC50为1.11nM、ADIP-24多肽IC50为5400nM、ADIP-28多肽IC50为3.88nM、ADIP-29多肽IC50为1000nM、ADIP-31多肽IC50为3.60nM、ADIP-35多肽IC50为1000nM、ADIP-37多肽IC50为8.83nM。因此，本发明提供的多肽是靶向钾离子通道Kv1.3系列候选免疫抑制多肽药物。
本发明提供的多肽作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。
动物实验表明，本发明提供的多肽可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎。鉴于钾离子通道Kv1.3在不同疾病药物治疗中的靶标功能，因此本发明提供的多肽可作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。因此，本发明提供的多肽可以用于制备治疗或预防钾离子通道Kv1.3相关疾病的药物。钾离子通道Kv1.3相关疾病包括迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病。
本发明还提供了上述多肽在治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的应用。
本发明提供的多肽治疗或预防的迟发性超敏反应相关疾病包括器官移植免疫排斥、接触性皮炎或肉芽肿病。
本发明提供的多肽治疗或预防的血管内膜增生相关的心血管疾病为动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症或血管成形术后再狭窄。
本发明提供的多肽治疗或预防的自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、红斑狼疮或银屑病。
作为优选，用于治疗或预防迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物包括本发明提供的多肽及药学上可接受的辅料。
优选的，本发明提供的药物为口服制剂或注射制剂。
更优选的，口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。
更优选的，注射制剂为粉针剂或注射液。
本发明提供一种核酸分子，该核酸分子由编码前述氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽的核苷酸序列组成。
本发明提供包含上述核酸分子任一项的质粒。
本发明提供包含上述任一项核酸分子或能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽的表达载体。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明提供的质粒、或本发明提供的表达载体，优选用所述质粒或载体转化。
本发明提供能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽的细胞。
优选地，本发明提供的宿主细胞或细胞，其是细菌、真菌或酵母细胞。
本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽、或编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽的核酸分子、或氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的多肽中的两种及以上、以及药学上可接受的的佐剂、稀释剂或赋形剂和可选择的其他治疗成分。
本发明提供上述药物组合物在制备治疗或预防钾离子通道Kv1.3相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述钾离子通道Kv1.3相关疾病包括迟发性超敏反应相关疾病、血管内膜增生相关的心血管疾病或自身免疫性疾病的药物中的应用。
优选地，所述迟发性超敏反应相关疾病包括器官移植免疫排斥、接触性皮炎或肉芽肿病。
优选地，所述血管内膜增生相关的心血管疾病为动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症或血管成形术后再狭窄。
优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、红斑狼疮或银屑病。
本发明运用多肽与钾离子通道相互模式的“人工控制识别”的药物设计技术，以含有37个氨基酸残基的蝎活性肽BmKTX为模板，通过天冬氨酸扫描技术动态调整分子模板BmKTX识别钾离子通道Kv1.3的键合界面，可多样地作用靶标钾离子通道Kv1.3，设计出了序列高度相似的靶向钾离子通道Kv1.3系列候选免疫抑制多肽药物。本发明涉及的多肽在各实验模型中表现良好，具体效果为给予本发明提供的多肽治疗后，大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎的症状均得到显著改善；大鼠足跖肿胀度与模型阴性对照组相比显著降低。提示其在钾离子通道Kv1.3相关疾病的治疗或预防中具有重要的开发和应用价值。
附图说明
图1示本发明提供的重组多肽的色谱分离纯化图；
其中，图1(A)为重组多肽ADIP-4的色谱分离纯化图；图1(B)为重组多肽ADIP-5的色谱分离纯化图；图1(C)为重组多肽ADIP-6的色谱分离纯化图；图1(D)为重组多肽ADIP-8的色谱分离纯化图；图1(E)为重组多肽ADIP-9的色谱分离纯化图；图1(F)为重组多肽ADIP-10的色谱分离纯化图；图1(G)为重组多肽ADIP-11的色谱分离纯化图；图1(H)为重组多肽ADIP-12的色谱分离纯化图；图1(I)为重组多肽ADIP-14的色谱分离纯化图；图1(J)为重组多肽ADIP-15的色谱分离纯化图；图1(K)为重组多肽ADIP-16的色谱分离纯化图；图1(L)为重组多肽ADIP-18的色谱分离纯化图；图1(M)为重组多肽ADIP-19的色谱分离纯化图；图1(N)为重组多肽ADIP-20的色谱分离纯化图；图1(O)为重组多肽ADIP-22的色谱分离纯化图；图1(P)为重组多肽ADIP-24的色谱分离纯化图；图1(Q)为重组多肽ADIP-28的色谱分离纯化图；图1(R)为重组多肽ADIP-29的色谱分离纯化图；图1(S)为重组多肽ADIP-31的色谱分离纯化图；图1(T)为重组多肽ADIP-35的色谱分离纯化图；图1(U)为重组多肽ADIP-37的色谱分离纯化图。
图2示本发明提供的重组多肽的质谱分析图；
其中，图2(A)为重组多肽ADIP-4的质谱分析图；图2(B)为重组多肽ADIP-5的质谱分析图；图2(C)为重组多肽ADIP-6的质谱分析图；图2(D)为重组多肽ADIP-8的质谱分析图；图2(E)为重组多肽ADIP-9的质谱分析图；图2(F)为重组多肽ADIP-10的质谱分析图；图2(G)为重组多肽ADIP-11的质谱分析图；图2(H)为重组多肽ADIP-12的质谱分析图；图2(I)为重组多肽ADIP-14的质谱分析图；图2(J)为重组多肽ADIP-15的质谱分析图；图2(K)为重组多肽ADIP-16的质谱分析图；图2(L)为重组多肽ADIP-18的质谱分析图；图2(M)为重组多肽ADIP-19的质谱分析图；图2(N)为重组多肽ADIP-20的质谱分析图；图2(O)为重组多肽ADIP-22的质谱分析图；图2(P)为重组多肽ADIP-24的质谱分析图；图2(Q)为重组多肽ADIP-28的质谱分析图；图2(R)为重组多肽ADIP-29的质谱分析图；图2(S)为重组多肽ADIP-31的质谱分析图；图2(T)为重组多肽ADIP-35的质谱分析图；图2(U)为重组多肽ADIP-37的质谱分析图。
图3示本发明提供的重组多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图，
其中，图3(A)为重组多肽ADIP-4对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(B)为重组多肽ADIP-5对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(C)为重组多肽ADIP-6对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(D)为重组多肽ADIP-8对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(E)为重组多肽ADIP-9对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(F)为重组多肽ADIP-10对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(G)为重组多肽ADIP-11对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(H)为重组多肽ADIP-12对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(I)为重组多肽ADIP-14对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(J)为重组多肽ADIP-15对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(K)为重组多肽ADIP-16对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(L)为重组多肽ADIP-18对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(M)为重组多肽ADIP-19对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(N)为重组多肽ADIP-20对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(O)为重组多肽ADIP-22对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(P)为重组多肽ADIP-24对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(Q)为重组多肽ADIP-28对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(R)为重组多肽ADIP-29对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(S)为重组多肽ADIP-31对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(T)为重组多肽ADIP-35对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图；图3(U)为重组多肽ADIP-37对靶标钾离子通道Kv1.3电流分析图。
具体实施方式
本发明提供了靶向钾离子通道Kv1.3活性多肽的分子设计及制备与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1：不同天冬氨酸残基分布的序列重组多肽的分离纯化
本发明采用了发明人先前专利和发表文章中同样以BmKTX为模板的基因工程技术(ZL200710053679.0；ZL201310208475.5；Structural Basis of a Potent PeptideInhibitor Designed for Kv1.3Channel,a Therapeutic Target of AutoimmuneDisease.J Biol Chem,2008,283:19058-19065；Unusual binding mode of scorpiontoxin BmKTX onto potassium channels relies on its distribution of acidicresidues.Biochem Biophys Res Commun,2014,447(1):70-76；Toxin acidic residueevolution function-guided design of de novo peptide drugs forimmunotherapeutic target Kv1.3channel.Scientific Reports,2015,5:9881)制备系列多肽，通过反相高效液相色谱技术分离重组多肽。SEQ ID NO：1～21多肽分离色谱谱图如图1所示。
实施例2：不同天冬氨酸残基分布的序列重组多肽的鉴定
采用质谱对本发明提供的具有如SEQ ID NO：1～21所示氨基酸序列的多肽进行质谱分析，结果如图2所示。经过质谱分析，这些多肽测定分子量与根据氨基酸序列推断的理论分子量一致。
实施例3：不同天冬氨酸残基分布的序列重组多肽的对钾通道Kv1.3的药理学活性分析
将HEK-293T细胞在含10％的胎牛血清的DMEM培养基37℃、5％CO2条件下培养，将钾通道Kv1.3重组质粒分别用SofastTM的转染试剂盒转染，转染细胞在0.8mg/mL Geneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA，Elektronik,Lambrecht，Germany)，对具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的多肽的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse软件(Elektronik，Lambrecht，Germany)来控制。仪器的滤波器设置为10kHz(Bessel)，电极阻抗为2～5MΩ，在电极与细胞膜之间形成高阻(1～5GΩ)封接后，进行快电容自动补偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(c-slow)，在-70mV的钳制电位下，从-60mV起给予10mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，将多肽通过MPS-2(INBIO Inc，Wuhan，China)灌注系统实现精确灌注。将3种活性多肽溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录细胞100μm左右。具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的多肽阻断靶标钾离子通道Kv1.3电流的浓度依赖关系如图3所示。通过浓度依赖试验进一步获得这些多肽的药理学活性(IC50值)，结果表明：ADIP-4多肽IC50为0.17±0.04nM、ADIP-5多肽IC50为5.40±1.72nM、ADIP-6多肽IC50为0.76±0.07nM、ADIP-8多肽IC50为5.92±2.11nM、ADIP-9多肽IC50为21.26±7.83nM、ADIP-10多肽IC50为1500±823nM、ADIP-11多肽IC50为11.53±5.06nM、ADIP-12多肽IC50为3.06±2.35nM、ADIP-14多肽IC50为4.32±1.14nM、ADIP-15多肽IC50为0.64±0.13nM、ADIP-16多肽IC50为3.40±1.34nM、ADIP-18多肽IC50为0.13±0.02nM、ADIP-19多肽IC50为0.005±0.003nM、ADIP-20多肽IC50为2.65±0.19nM、ADIP-22多肽IC50为1.11±0.29nM、ADIP-24多肽IC50为23000±8700nM、ADIP-28多肽IC50为3.88±0.49nM、ADIP-29多肽IC50为1100±530nM、ADIP-31多肽IC50为3.60±0.55nM、ADIP-35多肽IC50为1058±620nM、ADIP-37多肽IC50为8.83±5.40nM。这些数据表明了本发明提供的具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的多肽可多样地作用靶标钾离子通道Kv1.3。这些结果说明了酸性氨基酸残基扫描技术导致了多肽活性的显著差异性。
实施例4：不同天冬氨酸残基分布的序列重组代表性多肽治疗多发性硬化症的药效实验
实验动物：选取近交系雌性Wistar大鼠(6-8周龄,体重150±10g)，豚鼠(300g～400g购自武汉大学实验动物中心)。
主要试剂：福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(购自上海生物制品所)，豚鼠MBP(购自Sigma)。
全脊髓匀浆-福氏完全佐剂混合乳剂(GPSCH-CFA)的配制：将豚鼠处死后，迅速取出脊髓，用超声破碎仪(Sonics&Materials Inc,America)制成50％的PBS匀浆，与等量的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/mL)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。
诱导Wistar大鼠EAE模型：Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射0.4mLGPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约1×1010百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。
将实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠随机分为三组：正常对照组(阴性对照组为健康大鼠)、模型对照组(模型鼠，给予生理盐水)、给药组(患病鼠给予具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的代表性多肽)，每组10只。给药组将具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的代表性多肽按100μg·kg-1剂量分别对模型树进行皮下注射，每天上午1次，正常对照组和模型对照组皮下注射等量生理盐水，连续给药。给药14天后，观察大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表1。
评分标准为:无任何临床症状，0分；尾部张力消失，可见轻度步态笨拙，1分；双后肢无力，被动翻身后可以恢复，2分；双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，3分；四肢瘫痪伴尿、便失禁，4分；濒死状态或死亡，5分。
表1EAE模型中各实验组大鼠的评分
Figure BDA0002147644820000101
Figure BDA0002147644820000102
实验结果表明：在没有药物治疗情况下，模型对照组得分最高(2.86±0.32)；给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:1(ADIP-4)、SEQ ID NO:3(ADIP-6)、SEQ ID NO:10(ADIP-15)所示的氨基酸序列的多肽治疗后，大鼠的症状均得到显著改善，平均临床评分依次为1.29±0.24，1.338±0.38和1.38±0.41。由此可见，本发明提供的具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的多肽能治疗多发性硬化症。
实施例5：不同天冬氨酸残基分布的序列重组代表性多肽治疗类风湿性关节炎的药效实验
选取无特定病原体(SPF)级近交系Wistar大鼠(购自武汉大学实验动物中心)40只，♀，体重150±10g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2mL/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2周即出现类风湿性关节炎症状。
将关节炎大鼠随机分为：正常对照组(阴性对照组为健康大鼠)、模型阴性对照组(模型鼠给予生理盐水)、模型阳性对照组(模型鼠给予氨甲喋呤)、给药组(患病鼠给予本发明提供具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的代表性多肽)，每组10只。给药组按100μg·kg-1剂量皮下注射，每天上午1次，连续给药；正常对照组和模型阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组按1.75mg·kg-1剂量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天1次，连续给药。
给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。观察大鼠患类风湿性关节炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表2。
评分标准为:大鼠一个关节红肿，1分；大鼠二个关节红肿，2分；大鼠各个关节红肿，3分；大鼠整个肢体严重关节炎，4分。
表2各实验组大鼠的关节炎评分
Figure BDA0002147644820000111
Figure BDA0002147644820000112
从实验第8天起，每周测1次大鼠后足跖容积并记录，并根据足跖在造模前后容积之差计算肿胀度(mL)，连续观察28天，结果见表3。
表3各实验组大鼠的足跖肿胀度
Figure BDA0002147644820000121
Figure BDA0002147644820000122
由表2可知，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组关节评分最高(3.69±0.65)；给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:1(ADIP-4)、SEQ ID NO:3(ADIP-6)、SEQ IDNO:10(ADIP-15)所示的氨基酸序列的多肽治疗后，大鼠的症状得到显著改善，评分依次为1.86±0.43，1.76±0.52和1.79±0.57，与氨甲喋呤治疗组结果相近(1.74±0.54)。表3测量各实验组大鼠的足跖肿胀度的结果显示，给予本发明提供的具有如SEQ ID NO:1(ADIP-4)、SEQ ID NO:3(ADIP-6)、SEQ ID NO:10(ADIP-15)所示的氨基酸序列的多肽的大鼠足跖肿胀度与模型阴性对照组相比显著降低。结果表明，本发明提供的具有如SEQ ID NO:1～21所示的氨基酸序列的多肽能治疗类风湿性关节炎。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
                         序列表
<110>  武汉大学
<120>  酸性氨基酸扫描法设计的免疫抑制多肽及应用
<160>  21
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
Val Gly Ile Asp Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  2
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
Val Gly Ile Asn Asp Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  3
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
Val Gly Ile Asn Val Asp Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  4
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Asp His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  5
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys Asp Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  6
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Asp Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  7
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  7
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Asp Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  8
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  8
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Asp Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  9
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  9
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Asp Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  10
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  10
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Asp Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  11
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  11
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Asp
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  12
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  12
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Asp Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  13
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  13
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  14
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  14
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Asp Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  15
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  15
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Asp Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  16
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  16
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Asp Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  17
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  17
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Asp Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  18
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  18
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asp Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  19
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  19
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Asp Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Lys
        35
<210>  20
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  20
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Asp Pro Lys
        35
<210>  21
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  21
Val Gly Ile Asn Val Lys Cys Lys His Ser Gly Gln Cys Leu Lys Pro
1               5                   10                  15
Cys Lys Lys Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Ile Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Cys Thr Pro Asp
        35

Claims (15)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21任一项所示。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是钾离子通道Kv1.3的抑制剂。
3.一种多肽在制备治疗或预防钾离子通道Kv1.3相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的钾离子通道Kv1.3相关疾病为多发性硬化症或类风湿性关节炎，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、10任一项所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的治疗或预防钾离子通道Kv1.3相关疾病的药物还包括药学上可接受的辅料。
5.根据权利要3或4所述的应用，其特征在于，所述的药物为口服制剂或注射制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的注射制剂为粉针剂或注射液。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1所述的任一项多肽。
9.包含权利要求8所述任一项的核酸分子的质粒。
10.包含权利要求8所述任一项的核酸分子或能够表达氨基酸序列如SEQ IDNO：1-21所示的任一项多肽的表达载体。
11.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求9所述的质粒或权利要求10所述的表达载体。
12.能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽的细胞。
13.根据权利要求11所述的宿主细胞或权利要求12所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞或细胞是细菌、真菌。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有氨基酸序列如SEQ IDNO：1-21所示的任一项多肽、或编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1-21所示的任一项多肽的核酸分子以及药学上可接受的的佐剂、稀释剂或赋形剂和可选择的其他治疗成分。
15.一种药物组合物在制备治疗或预防钾离子通道Kv1.3相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的钾离子通道Kv1.3相关疾病为多发性硬化症或类风湿性关节炎，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、10任一项所示。
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