CN110772631A

CN110772631A - 一组与烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力能快速起效的眼镜蛇神经毒素分子在镇痛上的应用

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Publication number: CN110772631A
Application number: CN201910674298.7A
Authority: CN
Inventors: 祁展楷; 祁·海亚特
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Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2020-02-11

Abstract

眼镜蛇神经毒素由于能和神经触突后烟碱乙酰胆碱受体结合阻断神经触突离子流而起到镇痛作用，但目前市场上此类产品需2小时才能起效且疗效不稳定，故无法满足临床需求。这是因为神经毒素需通过血脑屏障在大脑中枢才能起到镇痛作用，而市场上的产品无明确组分，包含各种大小分子量蛋白，故透过血脑屏障速度慢；同时它们和烟碱乙酰胆碱受体的亲和力也不一致。本发明筛选出一组和烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力的神经毒素分子单体，能迅速通过血脑屏障，30分钟起效镇痛且疗效稳定。神经毒素分子单体克服了混合物无法具体说明究竟是哪一种神经毒素，无蛋白质一级结构；无法精确控制质量的缺陷，使质量控制，临床安全性及有效性都得到了更好的保证。

Description

一组与烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力能快速起效的眼镜蛇神经毒素分子在镇痛上的应用

技术领域

本发明涉及一组具有高度亲和力、起效迅速、且蛋白质一级结构明确的眼镜蛇神经毒素分子和一种治疗疼痛的方法，该方法能用于治疗癌症引起的顽固性疼痛；同时也可用于治疗与神经性疾病、类风湿关节炎、病毒感染和其他相关病变引起的疼痛。该组眼镜蛇神经毒素分子在可接受的药物载体中用于注射、口服、舌下、鼻喷、直肠或透皮给药，属于生物制药领域。

背景技术

早在20世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，我国自1952 年起就开展对蛇毒的镇痛作用研究，开发了蛇毒粗毒制剂和蛇毒神经毒素制剂，用于临床治疗疼痛。

眼镜蛇毒素就是其中一种，但眼镜蛇毒素种类繁多，已知成分有神经毒素、细胞毒素、心脏毒素、神经生长因子、溶血素(DLP)、CVA蛋白、膜活性多肽、眼镜蛇毒因子等及其他成分，如碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白水解酶等，其中眼镜蛇神经毒素是烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂，它与肌型和神经元型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)呈拮抗性和缓慢可逆性结合，此类眼镜蛇神经毒素因其能阻断烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的功能被称作为突触后神经毒素或α神经毒素。[1，2] 烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)参与感觉、认知、疼痛和神经元的保护作用和神经体液传递，故烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)被阻断后认知、疼痛、神经元保护等作用就会受到不同程度的影响。

眼镜蛇神经毒素从种类上讲有其多样性，虽然他们的空间结构相似，由3个相邻环(loop)组成独特结构，4个保守二硫键相互交联形成球型疏水核心，像3个伸出的“手指”，被称为三指蛋白，[3，4]但进一步细分的话，此类神经毒素又大致可分3种类型：即短链神经毒素(含 60～62个氨基酸和4对二硫键)、长链神经毒素(含66～75个氨基酸和5对二硫键)和非传统三指神经毒素。[3]由此可见眼镜蛇神经毒素不是单一的一种毒素分子，每种短链，长链和非传统三指神经毒素中都包含着多种不一样的毒素分子，不同种类的毒素分子的氨基酸链的长短和氨基酸序列是不一样的，而且它们对烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的亲和力也是不一样的。

目前市场上所有的神经毒素产品都是以提取物的形式出现，没有明确指出到底是哪一类神经毒素、或是哪一个毒素分子、或是它们的混合物。“科博肽“是根据Cobratide意为眼镜蛇的肽的英文发音翻译过来的，是一种从中华眼镜蛇(Naja Naja Atra)蛇毒中提取出的神经毒素的统称，它不是指专门的哪一个毒素分子，其质量控制标准只是要求神经毒素蛋白含量》 80％，这种提取物被用于晚期癌症疼痛、慢性关节痛、坐骨神经痛等慢性疼痛的治疗。所以所有已上市的眼镜蛇神经毒素提取物无法明确告知究竟是哪一个毒素分子、或是那一类神经毒素、还是2种、甚至是2种以上的混合物。

对于眼镜蛇毒素制剂，混合物会对临床安全性构成非常大的隐患，这是因为毒素混合物的协同作用是蛇毒中存在的一种重要现象，这可能是在进化过程中一种增强毒性的策略。各种蛇毒中不同类的毒素或同类毒素复合物之间存在协同作用，主要毒素如磷脂酶A2、三指毒素 (神经毒素)在协同过程中发挥着重要作用。[5]

一系列蛇种他们的毒素之间存在着协同作用。两种或两种以上的毒素成分直接或间接地相互作用，使毒性增强到超过其个体毒性总和的水平。从分子的角度来看，协同作用一般可能存在两种形式：(1)分子间协同作用，当两种或两种以上的毒素与一种或多种(相关)生物途径上的两种或两种以上的靶点相互作用时，引起协同增加的毒性。(2)超分子协同作用，当两种或两种以上毒素以协同方式与同一靶点相互作用或两种或两种以上毒素结合时创造一种毒性增加的复合物。[6]

分子间协同作用的一个例子是来自于眼镜蛇科的α-神经毒素与其他毒素的结合，导致协同有效的毒性效应，导致受害者和猎物出现松弛性麻痹和呼吸衰竭。[6]在一项关于黑曼巴蛇 (眼镜蛇)毒液如何导致高死亡率的研究中，科学家发现钾通道阻断活性只是其中之一，还有各种各样的途径，不同的毒素在不同器官水平诱导的综合毒性才是高死亡率的担忧。[7] Strydom和Botes的研究(1970年)表明，单独使用48小时后，从相关的东方绿曼巴(眼镜蛇)毒液中分离出的毒液组分没有杀伤力，而以类似剂量使用时，整个毒液在10分钟内就可以是致命的。[8]

已知协同毒素可增强某些毒素的毒性，单独而言，这些蛋白质毒性较低，但当它们联合注射到小鼠体内时，会起到很强的毒性作用。这些毒素在氨基酸序列和半半胱氨酸数量上与神经毒素或细胞毒素相似，这种协同作用的毒素称为协同毒素。[9]

根据公开发表的文献，已知的单个眼镜蛇神经毒素蛋白分子超过20个，在我国市场上销售的眼镜蛇神经毒素蛋白产品并没指明是哪一种类型的神经毒素蛋白或分子，唯一的质量控制方法是组分中神经毒蛋白的含量应在80％以上，缺乏确切的活性成分和残留杂质的信息可能会引起严重的安全性问题，因为混合物协同作用会导致致命毒副反应。

“科博肽”的主要副作用是呼吸抑制和/或过敏，研究表明呼吸窘迫、[10]呼吸麻痹、[11] 和呼吸衰竭[12]是毒蛇咬伤后的结果，同时也是混合毒素协同作用的结果。

除毒素混合物的协同作用导致致命毒副作用外，眼镜蛇神经毒素提取物存在着镇痛起效慢、约2小时左右起效、临床疗效不稳定等现象，如下列报道：

1.现有市售科博肽产品，存在原料批次间含量和纯度相对低、临床疗效不稳定、起效时间慢。陈汝筑，吴秀荣.眼镜蛇神经毒素的镇痛作用[J].中国药理学通报，1988，4(2)：113。[13]

2.实验动物注射眼镜蛇神经毒素后2小时，大鼠痛阈显著上升，3小时后达到较佳效果，神经毒素镇痛作用起效慢，但维持时间长。陈燕，许云禄.舟山眼镜蛇神经毒素的分离纯化及镇痛作用研究[J].海峡药学，2007，19(12)：27。[14]

3.小鼠动物实验显示，给药后2小时起效，4小时作用达峰值。朱天新，袁彩君，任晚琼. 眼镜蛇神经毒素的规模化制备及其镇痛作用的研究[J].华西药学杂志，2007，22(3)：247～249。[15]

研究表明中枢神经系统(CNS)是眼镜蛇神经毒素镇痛的主要靶点部位，[16，17，18，]根据药代动力学研究，靶点的暴露和药物与靶点的结合被认为是药物成功的2个关键因素，药物与靶点结合的先决条件是靶点在超过药理学效应的浓度下暴露足够的时间。[19]

对眼镜蛇神经毒素镇痛作用的研究表明，分子量大小从6.5KDa～15kDa的神经毒素蛋白分子可产生镇痛作用，[20，21]这些蛋白的SDS-PAGE分析如附图1所示。眼镜蛇神经毒素具有亲水性，其通过血脑屏障(BBB)的主要机制是被动转运。15kDa的毒素分子要比6.5kDa的分子需要更多的时间穿过血脑屏障，因为分子量的增加会减少血脑屏障的通透性。[22]神经毒素蛋白混合物达到药物靶点充分暴露浓度的总时间在很大程度上取决于混合物中高分子量和低分子量神经毒素蛋白的比例。

此外，由于不同的神经毒素蛋白分子对烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)具有不同的亲和力，因此神经毒素蛋白混合物与靶点的亲和力就不稳定；同时在提取过程中由于水解，温度和化学品等因素会导致蛋白质变性的发生，但目前的质量控制标准无法检测到这种变性；所以上述这些因素都可能会影响到起效的时间和稳定的临床效果。

最后，蛋白质药物要求氨基酸序列的一致性，这就需要对氨基酸进行测序，保证蛋白药物序列的完整性和准确性是药品质量控制的关键，这是因为大多蛋白药物的氨基酸段为药物与靶点的结合部位，只有保证蛋白药物序列的正确性才能保证药物疗效的可靠性。

作为一种生物药品，如胰岛素，奥曲肽，降钙素等都有其明确的蛋白质一级结构，但目前市场上用于疼痛治疗的眼镜蛇神经毒素提取物都还没有明确的蛋白质一级结构即氨基酸序列。

发明内容

本发明公开了一组从中华眼镜蛇和孟加拉眼镜蛇中分离出来的，具有和烟碱乙酰胆碱受体 (nAChR)具有高度亲和力的，蛋白质一级结构明确的眼镜蛇神经毒素分子。使用该组毒素分子能避免由于混合毒素协同作用导致的严重副反应；同时由于该组毒素分子的分子量低、纯度高、故容易透过血脑屏障，30分钟即可起效镇痛，为一般眼镜蛇神经毒素提取混合物起效时间的1/3左右；最后由于该组毒素分子具有和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)具有高度亲和力，故临床疗效稳定。本发明对提升眼镜蛇神经毒素产品的纯度，质量控制、稳定性、临床安全性和疗效性提供了更为可靠的保证。

实施方法

a)首先对中华眼镜蛇粗毒和孟加拉眼镜蛇粗毒进行分离纯化，将眼镜蛇粗毒进行阳离子交换，分离各种毒素；

b)鉴别出与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)具有高度亲和力的眼镜蛇神经毒素；

c)对具有高度亲和力的眼镜蛇神经毒素进行氨基酸序列测定，确定神经毒素分子种类；

d)对与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)具有高度亲和力的氨基酸序列明确的眼镜蛇神经毒素分子进行小鼠镇痛试验以确认临床疗效；

e)对以上具有高度亲和力的眼镜蛇神经毒素分子与眼镜蛇神经毒素混合物的脑内药代动力学特征进行比较，以了解他们不同起效时间镇痛的机理。

实施步骤

a)对中华眼镜蛇粗毒进行分离纯化，将中华眼镜蛇粗毒经通过TSK CM-650(M)柱进行阳离子交换，分离各种毒素的方法包括下述步骤：

(一)样品准备-将1g中华眼镜蛇粗毒溶解在25ml 0.025摩尔PH6.0的醋酸铵缓冲液中，低温离心，取上清液；

(二)平衡-用0.025摩尔PH6.0的醋酸铵溶液平衡TSK CM-650(M)柱；

(三)洗脱-上样后用0.1～0.5摩尔和0.7～1.0摩尔，pH5.9醋酸铵缓冲液进行2厢阶梯梯度洗脱，紫外检测参数：280nm；洗脱流速：48ml/h；

(四)按记录谱图收集各种毒素组分，收集液中洗脱出12个蛋白峰，如附图2：

b)鉴别出与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)有高度亲和力的中华眼镜蛇毒素，方法是通过12 个蛋白峰与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)亲和力试验。

亲和力试验原理：

因为α-银环蛇毒素与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)具有高度的亲和力，所以α银环蛇毒素在后期研究中被作为nAChR的最佳标记物[23，24]，随后在其他蛇毒的研究中也发现与此类似的蛋白，尤其是在眼镜蛇科毒素中。所以眼镜蛇神经毒素与α-银环蛇毒素会竞争性的与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)结合，只有与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)结合的被放射性核素125I 标记的α-银环蛇毒素才能沉淀后被γ免疫计数仪测到，没结合的会被洗脱。

故通过对12个分离出的蛋白各自对α-银环蛇毒素与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的结合抑制率来测量分离出的蛋白各自和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的亲和能力即他们的活性，活性度可通过γ免疫计数仪测每秒计数值(Bq)为蛋白活性度指标，具体方法用对125I放射标记的-α-银环蛇毒素和烟碱乙酰胆碱受体结合抑制率(％)来体现每种蛋白的活性高低。

鉴别出与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)有高亲和力的眼镜蛇神经毒素的方法包括下述步骤：

(一)取上述分离的蛇毒蛋白(每次加入一种12个蛋白峰纯化的蛇毒组分)和大鼠骨骼肌nAChR 提取物，，1μl抗乙酰胆碱烟碱受体单克隆抗体(mAb35)5.9mg/ml，放射性核素125I 标记的α-银环蛇毒素1μl(125I-nα-Btx)0.18μg/ml，混匀后4℃静置10小时以上；

(二)次日加入兔抗-大鼠IgG(4.5mg/ml)10μl，4℃静置2小时；

(三)用13,000rpm离心5min，沉淀物以Triton X-100洗液洗涤3遍；

(四)用γ免疫计数仪测蛋白活度性指标每秒计数值(Bq)；

(五)CαBtx、CBSA、C蛇毒分别指阳性对照αBtx、阴性对照BSA及各蛇毒组分的活性度Bq值；

(六)125I-αBtx-nAChR结合抑制率(％)的计算：以α-银环蛇毒素(αBtx)(终浓度4μg/ml) 为阳性对照(即100％抑制)，以牛血清白蛋白(BSA)(4μg/ml)为阴性对照(即0％抑制)；

(七)125I-αBtx-nAChR结合抑制率(％)＝100×(CBSA-C蛇毒)/(CBSA-CαBtx)。

结果显示，峰A和峰B的抑制率可高达40～50％之间，与nAChR有高度的亲和力；而其余峰的抑制率均小于20％，由此判断出A峰和峰B是与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)有高度亲和作用的蛋白分子。

c)峰A和峰B蛋白质的一级结构分析即氨基酸测序

对有高亲和力的眼镜蛇神经毒素进行氨基酸序列测定方法包括下述步骤：

(一)对峰A和峰B用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)柱(4.6×250mm，VYDAC RP-C8，5μm) 对其蛋白进行纯化和脱盐；

(二)用美国ABI公司491蛋白序列分析仪进行N端和C端氨基酸序列测定；

(三)对测序得到的N末端氨基酸进行BLSAT分析，比对结果，推算出被测眼镜蛇神经毒素的理论氨基酸序列；

(四)对眼镜蛇神经毒素的肽段覆盖率进行分析，采用的实验方法是使用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶分别对蛋白质供试品进行酶解；然后使用LC-MS/MS(XevoG2-XSQTof waters)对酶解后的肽段样品进行分析；

(五)使用UNIFI(1.8.2，Waters)软件对LC-MS/MS数据进行分析，根据算法结果确定供试品的肽段覆盖率。

(六)最后用Edman降解法对序列进行确认。

测序得到峰A蛋白质一级结构的氨基酸序列为：(见核苷酸和氨基酸序列表<400>2，对应核苷酸序列见<400>1)。对应的氨基酸序列Fasta形式为：

lechnqqssq tptttgcsgg etncykkrwr dhrgyrterg cgcpsvkngi einccttdrcnn

根据美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的命名方式，此氨基酸序列下的眼镜蛇毒素分子被命名为A链眼镜蛇毒素(Chain A， Cobrotoxin)；但也可被命名为B链眼镜蛇毒素(Chain B，Cobrotoxin)，不同的晶型，本专利申请是基于氨基酸序列，并不区分晶型，为了便于表达，把此氨基酸序列下的眼镜蛇毒素分子统一命名为A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)。

测序得到峰B蛋白质一级结构的氨基酸序列为：(见核苷酸和氨基酸序列表<400>4，对应核苷酸序列见<400>3)。对应的氨基酸序列Fasta形式为：

lechnqqssq tpttktcsge tncykkwwsd hrgtiiergc gcpkvkpgvn lnccttdrcnn

根据美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的命名方式，此氨基酸序列下的眼镜蛇毒素分子被命名为A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)。

重复与上述类似的对中华眼镜蛇毒素的分离纯化方法，我们从孟加拉种眼镜蛇毒素中也提取分离到了2个和上述中华眼镜蛇毒素蛋白质一级结构完全一致的这两个神经毒素，也就是说，无论是中华眼镜蛇还是孟加拉种眼镜蛇，他们的神经毒素中都存在A链眼镜蛇毒素(Chain A， Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)。

d)A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B) 的小鼠镇痛效果试验以确认临床疗效

方法：醋酸扭体法

原理：给小鼠腹腔注射一定容积和浓度的醋酸，由于刺激腹膜而致小鼠出现持续性疼痛，导致腹部间隙性收缩内凹、躯干与后肢伸张、臂部高举等扭体反应。镇痛药可缓解或抑制这种反应。

从中华眼镜蛇分离纯化的A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素 (Chain A，Cobrotoxin B)小鼠镇痛效果试验方法包括下述步骤：

(一)取小鼠60个，体重20±2克，雌雄各半，随机分为6组，每组10个；

(二)分别给与生理盐水及不同剂量的眼镜蛇毒素，空白组小鼠尾静脉注射0.2ml/只生理盐水，给药组小鼠尾静脉注射0.2ml/只不同剂量的眼镜蛇毒素；

(三)给药后30分钟给小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液0.2ml/只造模；

(四)观察记录空白组和给药组15分钟内受试小鼠的扭体次数。

镇痛效果用扭体抑制率表示：抑制率％＝(空白组平均扭体次数-用药组平均扭体次数)/ 空白组平均扭体次数×100％

表一

每组小鼠＝10个

表二

每组小鼠＝10个

表一和表二的数据显示，两种眼镜蛇毒素在高中低三个不同剂量组均显示有镇痛效果，且镇痛作用与用药剂量呈正相关性，观察到的镇痛起效时间为30分钟。

两种眼镜蛇毒素对小鼠扭体试验镇痛效果维持时间的时效性试验

(一)取小鼠80个，体重20±2克，雌雄各半随机分为8组，每组10个；

(二)空白组小鼠尾静脉注射0.2ml/只生理盐水，给药组小鼠尾静脉注射60μg/kg眼镜蛇毒素+生理盐水0.2ml/只；

(三)按给药后时间30分钟、2小时、8小时、12小时分别给小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液 0.2ml/只造模；

(四)观察记录小鼠扭体次数。

表三

每组小鼠＝10个剂量＝60μg/kg

表四

每组小鼠＝10个剂量＝60μg/kg

表三和表四为两种眼镜蛇毒素给药后对小鼠扭体镇痛效果维持时间的时效性数据，

以上数据显示，30分钟时镇痛效果已经显现，直到12小时时仍有镇痛作用。

两种眼镜蛇毒素小鼠口服镇痛试验

用同样的试验方法，只是改变小鼠的给药途径为灌胃给药，不同剂量的眼镜蛇毒素用生理盐水配制成灌胃液，剂量如下表所示。给药后30分钟给小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液0.2ml/只造模，观察记录15分钟内受试小鼠的扭体次数。

表五

每组小鼠＝10个

表六

每组小鼠＝10个

两种眼镜蛇毒素小鼠鼻滴镇痛试验

用同样的试验方法，只是改变小鼠的给药途径为鼻滴给药，不同剂量的眼镜蛇毒素配制成滴鼻剂型，剂量如下表所示。给药后30分钟给小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液0.2ml/只造模，观察记录15分钟内受试小鼠的扭体次数。

表七

每组小鼠＝10个

表八

每组小鼠＝10个

根据表五～表八的数据显示不同剂量的A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)通过口服或鼻腔给药都能起到镇痛作用，起效时间为30分钟。

从孟加拉种眼镜蛇分离纯化的A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素B (Chain A，Cobrotoxin B)的小鼠镇痛效果试验

方法包括下述步骤：

(三)给药后30分钟给小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液0.2ml/只造模；

(四)观察记录空白组和给药组15分钟内受试小鼠的扭体次数。

(五)镇痛效果用扭体抑制率表示：抑制率％＝(空白组平均扭体次数-用药组平均扭体次数)/空白组平均扭体次数×100％

表一

每组小鼠＝10个

表二

每组小鼠＝10个

(二)空白组小鼠尾静脉注射0.2ml/只生理盐水，给药组小鼠尾静脉注射8μg/kg眼镜蛇毒素 +生理盐水0.2ml/只；

(四)观察记录小鼠扭体次数。

表三

每组小鼠＝10个剂量＝60μg/kg

表四

每组小鼠＝10个剂量＝60μg/kg

表三和表四为两种眼镜蛇毒素给药后对小鼠扭体镇痛效果维持时间的时效性数据，以上数据显示，30分钟时镇痛效果已经显现，直到12小时时仍有镇痛作用。

两种眼镜蛇毒素小鼠口服镇痛试验

表五

每组小鼠＝10个

表六

每组小鼠＝10个

两种眼镜蛇毒素小鼠鼻滴镇痛试验

表七

每组小鼠＝10个

表八

每组小鼠＝10个

根据以上小鼠镇痛效果试验数据显示，无论是从孟加拉眼镜蛇毒素或是从中华眼镜蛇毒素中分离纯化的A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素B(ChainA，Cobrotoxin B)，他们具有类似的镇痛效果，且与报道中的中华眼镜蛇神经毒素相比镇痛的起效时间有了很大的缩短，从2个小时缩短至30分钟，从很大程度上提高了临床疗效。

e)对以上得到的眼镜蛇神经毒素分子与眼镜蛇神经毒素混合物的脑内药代动力学特征进行比较，以了解他们不同起效时间镇痛的机理

根据研究发现，眼镜蛇神经毒素镇痛起效的主要部位在大脑中枢，比如中国中山大学和美国弗吉尼亚州大学的研究院联合研究发现在小鼠侧脑室注射从中华眼镜蛇分离的神经毒素，通过小鼠甩尾试验来测试小鼠的镇痛反应，发现神经毒素能产生镇痛效应但这种镇痛效应可被阿托品阻断；另一试验发现胆碱能神经元在下丘脑被眼镜蛇神经毒素选择性的抑制，说明眼镜蛇神经毒素的作用是在中枢神经系统的水平；[16，17，18]广西医科大学蛇毒研究所的研究发现在中脑导水管灰质区域注射α-蛇毒素，20分钟后通过热辐射测试小鼠的尾摆动试验，显示疼痛阈值升高247％。研究结果说明大脑中枢的胆碱能神经元是重要的眼镜蛇神经毒素作用靶点；[25]福建医科大学省立临床学院，福建省立医院福建医科大学蛇毒研究所，福建中医药大学药学系的研究揭示眼镜蛇神经毒素对电刺激引起的疼痛效果最好，对醋酸诱发的扭体反应，对热板所致疼痛效果次之。热板法舔爪的反应在低位脑干和脊髓水平进行整合，但电刺激小鼠嘶叫反应涉及大脑边缘系统等间脑的整合部位，可以推测神经毒素的镇痛活性可能涉及脑内较高的整合部位。[26]

根据药代动力学，药物起效有三个要素：1.药物是否能在靶点周围形成有效药物浓度并维持一段时间；2.药物能否和靶点有效结合；3.产生的药理作用是否和临床期待的疗效相吻合。然而药物有效暴露浓度和时间是能否和靶点高效结合及药物发挥期望的药理作用的前提条件，眼镜蛇神经毒素提取混合物起效慢和临床效果不稳定的原因和药物在靶点的有效暴露浓度过慢而且药物和靶点的结合性不稳定相关。

从已有的对眼镜蛇神经毒素发表的研究结果来看，他们的分子量可从6.5KD～15KD，我们通过比较神经毒素混合物和A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)及A链眼镜蛇毒素B(Chain A， Cobrotoxin B)的药代动力学特征来比较它们给药后脑内有效浓度的差异。

眼镜蛇神经毒素大鼠脑内药代动力学测试的技术手段：

定量微透析(QMD)是唯一能够测定清醒动物脑细胞外液(bECF)未结合的药物浓度的技术，微透析原理是通过对动物脑组织中插入的微透析探针进行灌流，分析流出液(即透析液)中药物的浓度。但由于探头中的半透膜内外的药物在灌流速度下无法完全达到平衡，所以透析液中药物浓度小于其在探针膜周围的细胞间隙液浓度，如附图3所示。也就是说，溶质或被分析药物在透析液中的浓度是其在细胞间隙液浓度的一部分。所以微透析的第一步是要了解被分析药物的回收率，它是计算分析组织细胞间液中药物浓度的前提条件。在微透析实验中，回收率将用来校正透析液中被测组分的含量，使其接近于它在细胞间液中的实际水平。

具体步骤：

定量微透析(QMD)测定A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)，A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)；以及眼镜蛇神经毒素混合物的脑内药代动力学特征的方法包括下述步骤：

(一)大鼠脑微透析手术操作：

大鼠腹腔注射麻醉药后，固定于脑立体定位仪上。颅顶皮肤消毒后用牙科高速钻机在颅骨上钻开一直径约0.5mm的小孔，插入微透析带管心针底座，以硬脑膜为标准向腹侧垂直插入 4.5mm后将微透析底座固定于颅骨上，缝合皮肤。术后大鼠在标准环境中单笼恢复6天，自由饮食和饮水。

(二)125I标记的-A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)，A链眼镜蛇毒素B(ChainA，Cobrotoxin B)和眼镜蛇神经毒素混合物微透析脑探针在体回收率测定：

将微透析探针(MD-2200)插入微透析底座中。以125I-标记的A链眼镜蛇毒素(Chain A， Cobrotoxin)，A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)；以及眼镜蛇神经毒素混合物的灌流液灌流，每种毒素都以3种不同的浓度(5，10和15ng/mL)灌流，流量为2μL/分钟，收集1小时。所有透析液样品在SN-695B放免γ测量仪上测定放射性计数 (cpm，min-1)，再将cpm折算成毒素浓度，最后根据下述公式计算探针的在体(丢失)回收率：回收率＝灌流液浓度-透析液浓度/灌流液浓度×100％。

(三)125I标记的-A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)，A链眼镜蛇毒素B(ChainA， Cobrotoxin B)；以及眼镜蛇神经毒素混合物大鼠腹腔注射给药及微透析：

取雄性大鼠15只，随机分成三组。125I-A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)组；125I A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)组及125I-镜蛇神经毒素混合物组(100μg；1.61 ×10⁷Bq/kg)大鼠腹腔注射给药。实验时向探针内灌注人工脑脊液，流速2μL/分钟。平衡 30分钟，同时收集透析液，间隔10分钟(每管20μL)，收集360分钟。将透析液在 SN629B放免γ测量仪中测定cpm，并折算成眼镜蛇神经毒素浓度。利用已经测得的在体平均回收率校正各时间点眼镜蛇神经毒素实际浓度。

(四)结果：

125I标记的-A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)，A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)及眼镜蛇神经毒素混合物大鼠腹腔注射给药后大鼠脑内的平均血药浓度-时间曲线见附图 4。

机理分析

由于眼镜蛇神经毒素是在大脑中和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)结合而起到镇痛效应，故不同大小分子量的神经毒素通过血脑屏障的速度以及他们在大脑中达到有效浓度的时间将是影响它们疗效的主要因素。从以上3种神经毒素的脑中血药浓度的曲线来看，无论有效镇痛浓度的数值是多少，相对分子量较小的A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)，二者分子量在6.9KD左右，达到有效血药浓度的时间始终要快于混合物；另外，眼镜蛇神经毒素在肾脏中的排泄速度要远远大于进入大脑的速度， [27]由于神经毒素混合物包含不同大小分子量的蛋白，这些蛋白因其亲水属性而在血脑屏障中主要靠被动渗透，故分子量越大的蛋白，其透过血脑屏障的速度就越慢而被肾快速排泄的机会就越高，故大分子量蛋白在大脑中有效浓度就会低于小分子量的蛋白；另外，亲和力试验显示A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)和A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B) 较混合物对靶点有更大的亲和力，所有这些导致了A链眼镜蛇毒素(ChainA，Cobrotoxin)， A链眼镜蛇毒素B(Chain A，Cobrotoxin B)和混合物镇痛起效时间的不同。

综上所述，具有高度亲和力的眼镜蛇毒素分子单体的应用可能是有效解决眼镜蛇神经毒素提取物在临床应用中起效时间长，疗效不稳定的一种方法，更重要的是单体能避免眼镜蛇毒素混合物的协同作用而导致的严重毒副反应，为提高药品的安全性完成了关键的一步。

A链眼镜蛇毒素和A链眼镜蛇毒素B的小鼠皮下注射半数致死量(LD50)为124±68μg/Kg，经含有丙酮，过氧化氢、高锰酸钾、二氧化锰、碘乙酰胺、碘乙酸或碘乙酸盐等一种或一种以上化学试剂的缓冲液浸泡处理后，其小鼠皮下注射半数致死量(LD50)可至少上升至160 ±60μg/Kg。这种灭活方法可以使得眼镜蛇神经毒素在蛋白质分子的某些原子上引入某种基团而氨基酸序列不发生变化，保留了眼镜蛇神经毒素的关键性功能结构，故仍保留了其镇痛的功效。

以A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)为主要成分的不同剂型的药物组合物

实施例1.

冻干粉针剂(规格70ug或140ug/支2ml)

(一)把上述分离纯化的A链眼镜蛇毒素(Chain A，Cobrotoxin)作为主药，取70mg或140mg 加入配制药液总量80％的注射用水中溶解，再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8，无菌滤过；

(二)洗西林瓶，洗塞，灭菌；

(三)无菌过滤处理后上述滤液进行西林瓶无菌分装；

(四)压盖在线灭菌；

(五)冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶.

实施例2。

胶囊(规格280ug/粒(25mg))

配方

A链眼镜蛇毒素	1.12克
		甘露醇	400克
微晶纤维素	100克
		硬脂酸镁	10克
交联羧甲基纤维素钠	80克
		玉米定粉	400克
微粉硅胶	8.88克

(一)将经过冷冻干燥后分离纯化的蛇毒蛋白A链眼镜蛇毒素与上述其他辅料混合；

(二)过18目筛；

(三)然后在40℃下干燥，整粒、杀菌；

(四)装胶囊40,000粒。

实施例3.

片剂(规格200μg/片(25mg))

配方

A链眼镜蛇毒素	0.2克
		甘露醇	19克
微晶纤维素	4.72克
		硬脂酸镁	0.35克
交联羧甲基纤维素钠	0.73克

(一)将A链眼镜蛇毒素和甘露醇在混合器混合制粒；

(二)向所得混合物中加入交联羧甲基纤维素钠和硅化微晶纤维素并继续混合；

(三)将硬脂酸镁加入到该混合物中，继续混合；

(四)然后将粉末混合物在冲床中压实，得1000片重量为25毫克的片剂。

实施例4.

直肠栓剂(规格280μg/栓(2g))

配方

A链眼镜蛇毒素	0.14克
		可可豆脂	980克
聚山梨酯80	20ml

(一)取上述量的可可豆脂在45℃水浴上熔化；

(二)把上述量的A链眼镜蛇毒素溶于20ml的生理盐水中与聚山梨酯80混合均匀，加入上述熔化的可可豆脂基质中；

(三)保温缓慢搅拌均匀后保温灌模；

(四)冷凝后取出即得栓剂500个。

实施例5.

滴鼻液或鼻腔喷雾液(规格140μg/瓶(100ml))

配方

A链眼镜蛇毒素	0.14克
		生理盐水	10升
薄荷醇	250克
		冰片	250克
β-羟丙基环糊精	200克
		吐温80	200克
防腐剂	1克

把主药和辅药按以上比例混合，杀菌后灌装100瓶滴鼻液或鼻腔喷雾液。

需要理解的是，上述案例并不对本发明申请所要求保护的剂型和配方方案有任何的限制，事实上，凡以相同或近似原理对所述药物组合物的各种成分进行的改变或替换，都在本发明申请所要求的技术范围之内。

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Claims

1.一种治疗病人或宿主疼痛的方法，通过使用该方法含有的治疗有效量的眼镜蛇毒素多肽的药物可接受载体的组合物来抑制或控制疼痛。

2.根据权利要求(1)以上所述眼镜蛇神经毒素多肽，其特征在于，它是具有A链眼镜蛇毒素，或A链眼镜蛇毒素B所示的氨基酸序列的眼镜蛇神经毒素多肽；或分别与A链眼镜蛇毒素，或A链眼镜蛇毒素B中的眼镜蛇神经毒素多肽具有70％或以上同源性的多肽，该多肽的功能与A链眼镜蛇毒素，或A链眼镜蛇毒素B所示的氨基酸序列的眼镜蛇神经毒素多肽功能相同或相似。

3.权利要求(1-2)以上所述眼镜蛇神经毒素多肽，其特征在于，它们可来自于从天然蛇毒中分离提取，或化学多肽合成，或是使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

4.根据权利要求(1-3)以上所述重组生产的眼镜蛇神经毒素多肽，根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；可以是包含二硫键的，或可以是不包含二硫键的。本发明中所述的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

5.权利要求(1-4)以上所述眼镜蛇神经毒素多肽，其特征还在于本发明中所述的多肽可包括上述各种眼镜蛇神经毒素多肽经过水解或酶解后的片段、用物理和化学方法处理后的衍生物和类似物，他们是基本保持着与上述眼镜蛇神经毒素多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明中所述的片段、衍生物或类似物可以是一个或多个氨基酸残基被取代的多肽或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇、脂肪链融合所形成的多肽)，或附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽。根据本文的描述，这些片段、衍生物和类似物都属于本领域熟练技术人员公知的范围。

6.权利要求(1)的方法，其中所述疼痛是急性疼痛或慢性疼痛，包括创伤性疼痛、躯体性疼痛、内脏性疼痛、神经性疼痛(包括糖尿病神经性疼痛)、手术后疼痛、癌症疼痛、纤维肌痛、牙痛、痛经、肾痛、头疼、胆绞痛、关节痛、背痛、关节镜后疼痛、妇科腹腔镜后疼痛、及烧伤、关节炎、关节损伤、偏头痛、眼内高压等引起的疼痛。

7.权利要求(1)的方法包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、关节腔内注射、口服、舌下、鼻腔、直肠、真皮内、腹膜内或鞘內给药或经皮给药。

8.权利要求(7)所述的给药方法的药物组合物的各种剂型。

9.根据权利要求(8)所述的剂型，其特征在于：包括冻干分针剂、水针剂、片剂、胶囊、口腔和舌下吸收剂、直肠吸收栓剂、鼻腔吸收剂及微球型缓释制剂。

10.权利要求(1)的方法的眼镜蛇神经毒素多肽剂量包括从1μg/Kg到350μg/kg每次，注射频率从每天一次到每天多次；或一年多次。