CN113491763B - 眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用 - Google Patents

眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用，具体提供了科博肽治疗帕金森病的新用途和一个科博肽神经保护作用的新靶点。这个靶点是科博肽通过激活NGF‑pTrkA信号转导通路发挥神经保护作用，可作为NGF‑pTrkA信号转导通路激活剂使用；本发明发现了给予腹腔注射科博肽有很好的治疗帕金森病的作用，同时在治疗剂量中没有发现明显毒副作用；具有用量小、安全、可经皮给药和注射和给药等优点。

Description

眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的 药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病药物中的应用。
背景技术
运动失调是指尽管没有肌肉异常，但也不能有秩序地进行复杂运动的状态。人体姿势的保持和随意运动的完成，是通过来自肌肉、关节等的深部感觉和小脑、大脑、眼、前庭器官的作用来进行调节的。这些系统的损害将导致运动的协调不良、平衡障碍等，包括帕金森氏病(帕金森病，Parkinson disease，PD)、帕金森综合征(Parkinsonism)、亨廷顿舞蹈病、共济失调症、肌张力障碍等。运动失调症有很多种类，病因不同。不同原因的运动失调治疗需要不同的药物，疗效差异很大，如共济失调的病因有小脑性共济失调、深感觉障碍性共济失调、大脑性共济失调、前庭性共济失调，帕金森病的震颤和运动迟缓的治疗有很大的差别。帕金森症突出的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡、纹状体DA含量显著减少以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，而确切的病因至今未明。遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。如今临床对这些不同病因的运动失调症的治疗仍然缺乏有效的药物或方法。
帕金森病，又称原发性震颤麻痹，是第二大神经退行性疾病，具有发病率高、病程渐进性、致残率高、和不可逆的特点。近年来，我国的帕金森病患者逐年上升，流行病学显示，患病率为15～328/10万人口，>55岁人群约1％，发病率为10～21/10万人口/年。
目前我国已进入老年化社会，神经退行性疾病的发病率及对国人的影响将有进一步增加的趋势，因此研究帕金森症的病理机制及防治一直是医药界的重要任务。该疾病以中脑黑质区多巴胺神经元缺损为主要病理基础；理论上，针对多巴胺神经元损伤的药物(神经保护剂)可保护脑细胞，提高对帕金森病的遗传及环境致病因素的耐受性；从目前的研究结果看，大多数在动物实验中具有疗效的药物，在临床试验中往往以失败告终。目前最有效的对症治疗药物为左旋多巴，但是左旋多巴长期应用后随着多巴胺神经元的不断丢失，将左旋多巴转化成多巴胺的能力进一步丧失，逐渐失去疗效。而且长期使用左旋多巴会产生迟发性运动障碍的并发症，严重影响PD病人的生活质量和生活自理能力。
因此，寻找帕金森病新的致病机制，新的治疗靶点，对于疾病防治和药物开发具有重要现实意义。
眼镜蛇家族分布广泛，有10多个物种主要分布在非洲和亚洲，包括澳大利亚和海洋还分布其他50多种。我国民间医药以及中医应用蛇毒治病历史悠久，主要在癌肿、关节炎和疼痛领域。神经毒素是眼镜蛇属蛇毒的主要活性成分，也是镇痛的主要活性成份，根据作用部位与方式可分为α和β两类，共有50多种结构类型。眼镜蛇毒的α-神经毒素(科博肽)镇痛作用已经被发现多年并用于临床，眼镜蛇毒的镇痛作用的研究主要集中在泰国眼镜蛇和中华眼镜蛇。泰国眼镜蛇含有的cobratoxin是长链α-神经毒素，由71个氨基酸组成，有5个二硫键。中华眼镜蛇含有三种短链α-神经毒素，其中cobrotoxin(中文名称：科博肽)由62个氨基酸组成，有4个二硫键，这些二硫键被认为是维持活性所必需的。另外两种短链神经毒素具有相似的结构和药理作用。美国的顺势疗法药典(homeopathic pharmacopoeia)收载了制备亚洲眼镜蛇毒用于疼痛的方法。美国药局批准的眼镜蛇毒制剂有Nyloxin，cobraxin和peperon，这些制剂含有α-神经毒素成分，具有和短链α-神经毒素相似的药理作用。我国昆明动物所早年从中华眼镜蛇分离出短链神经毒素，并制成镇痛药克痛宁，后又研制出复方制剂-复方克痛宁，含眼镜蛇神经毒素cobratoxin、曲马多和布洛芬。这个眼镜蛇神经毒素就是早期被命名的克痛宁和科博肽(实际为cobrotoxin，这里将中华眼镜蛇的短链神经毒素错误地命名为泰国的长链神经毒素cobratoxin)。后者曾经临床用于癌症等引起的疼痛取得较好的效果，但目前已停产。现在临床应用的还有科博肽注射液(cobratide，早年命名为克痛宁)，用于镇痛。
我们从中华眼镜蛇毒中分离了一种短链神经毒素，经全长氨基酸测序证明是属于短链α-神经毒素cobrotoxin(中文名称：科博肽)，由62个氨基酸组成，含有4个二硫键，这些二硫键被认为是维持活性所必需的，分子量6948道尔顿，属于三指蛋白家族成员。我们的早期研究表明科博肽的镇痛作用与激活M-型胆碱能受体以及阻滞低电压钙通道有关，科博肽还有抑制炎症和调节免疫反应的作用(参见《蛇毒cobrotoxin对小鼠DRG神经元离子通道和兴奋性的调节作用及其机制的研究》，CN103751766A和CN104974238A)。目前未见眼镜蛇神经毒素及其制剂在治疗帕金森病方面的相关报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的新应用。研究发现眼镜蛇神经毒素科博肽通过激活神经生长因子(NGF)-pTrkA通路发挥治疗帕金森病的作用。这一发现阐明了科博肽对帕金森病全新的作用机制，以及科博肽及其制剂预防和治疗帕金森病中的新用途，获得了针对帕金森病中脑黑质区多巴胺神经细胞损伤的药物干预的新靶点和药物，为研究防治帕金森病和其它神经退行性疾病的新药提供新思路。
为此，本发明提供了眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用。
进一步地，所述药物具有如下(1)-(3)中至少一项应用；
(1)所述药物用于改善运动协调性和/或改善运动迟缓症；
(2)所述药物用于提升肌肉力量；
(3)所述药物用于改善脑组织黑质纹状体系统病变。
进一步地，所述改善肌肉能力包括提升抓力。
进一步地，所述改善脑组织黑质纹状体系统病变包括提升黑质区多巴胺神经元数目、提升黑质和纹状体区多巴胺和/或其代谢物的含量以及提升酪氨酸羟化酶含量中的至少一种。
本发明还提供了眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备NGF-pTrkA通路激活剂中的应用。
进一步地，所述眼镜蛇神经毒素选自cobrotoxin(科博肽)。
进一步地，所述眼镜蛇神经毒素选自眼镜蛇长链α-神经毒素和/或眼镜蛇短链α-神经毒素。
进一步地，所述眼镜蛇神经毒素选自科博肽(cobrotoxin)和/或泰国眼镜蛇毒素(cobratoxin)。
进一步地，所述眼镜蛇神经毒素制剂选自科博肽注射液(cobratide，或称克痛宁)、Nyloxin、cobraxin和peperon中的至少一种。
所述药物包括药学上有效量的眼镜蛇神经毒素和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。例如生理盐水、水或者缓冲液等。其中，水可以采用蒸馏水、注射用水等，缓冲液可以采用磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等。
进一步地，所述药物为口服和口腔给药剂型、鼻腔给药剂型、经皮给药剂型或者注射剂型；优选为注射剂型。
进一步地，口服剂型选自口服液、胶囊剂、泡腾片、口服药膜；鼻腔给药剂型选自喷雾剂，滴鼻剂等常规剂型。注射剂型选自粉针剂和水针剂等常规剂型。经皮给药剂型可以采用微针贴片、涂剂、巴布剂等常规剂型，所述的微针贴片包括可溶性微针和不可溶性微针。
进一步地，所述药物的给药方式包括外用给药和口服给药。口服给药包括口腔、舌下。外用给药包括经皮，皮下或肌注、静脉注射或静脉滴注等方式。
进一步地，所述药物中还包括另一种治疗帕金森的额外治疗剂，优选地，所述额外治疗剂选自合成小分子药物、基因工程药物、生物制剂或者基因治疗药物。该额外治疗剂可以是同样能够激动NGF-pTrkA信号转导通路的治疗剂，也可以是治疗帕金森病的其他药物，例如抗胆碱能药、金刚烷胺、左旋多巴和外周多巴胺脱羧酶抑制剂组成的复方制剂等。科博肽可以从中华眼镜蛇或其它种属的蛇毒(如印度、泰国、马来西亚等眼镜蛇中提取、或经基因工程表达获得，或经人工合成获得。
本发明人研究发现的科博肽有调节NGF-pTrkA信号转导的作用，减少多巴胺神经元丢失，增加脑内多巴胺含量，减轻运动障碍症状，在治疗帕金森病中有重要应用价值，可以用于作为治疗PD药物开发。本发明人通过研究科博肽是否在帕金森病理进程中保护中脑黑质区多巴胺神经元免受神经毒素损伤，发现了调节一条神经营养作用途径的药物科博肽、以及调节这条神经营养通路在帕金森病中的神经保护作用，从而可以作为治疗帕金森病的治疗药物和靶点。因此，本发明提供了一种科博肽治疗帕金森病的新用途。具体的，本发明人经研究发现科博肽通过激活NGF-pTrkA信号转导通路，保护多巴胺神经元免受神经毒素MPTP损伤作用。通过帕金森病小鼠MPTP神经毒素造模前腹腔注射科博肽可显著改善帕金森病小鼠行为障碍，延长转轮实验运动时间、缩短小鼠爬杆时间、增加前爪和前后爪握持力量，上调黑质区多巴胺神经元数量，增加纹状体多巴胺神经递质含量，促进小鼠中脑黑质区星形胶质细胞合成NGF，并上调NGF相关受体TrkA在苏氨酸490位点的磷酸化水平，提示科博肽)对帕金森病神经毒素损伤起保护作用。这一发现，将为帕金森病的病理机制研究提供新的思路和策略，对于神经保护剂的新靶点的发现产生重大的影响，发现科博肽是一个有效的治疗帕金森病的药物。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的新应用，研究发现科博肽治疗帕金森病的新用途和一个科博肽神经保护作用的新靶点。这个靶点是科博肽通过激活NGF-pTrkA信号转导通路发挥神经保护作用，可作为NGF-pTrkA信号转导通路激活剂使用；本发明发现了给予腹腔注射科博肽有很好的治疗帕金森病的作用，同时在治疗剂量中没有发现明显毒副作用；具有用量小、安全、可经皮给药和注射和给药等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为科博肽对帕金森病小鼠运动协调性的影响，纵坐标为小鼠在转轮上的停留时间。
图2为科博肽对帕金森病小鼠运动迟缓的影响，左图纵坐标为小鼠从开始运动到完全转为头向下的时间；右图纵坐标为小鼠小鼠从开始运动到到达杆底的时间。
图3为科博肽对帕金森病小鼠前后肢抓力的影响。
图4为科博肽对帕金森病小鼠中脑黑质区多巴胺神经元数量的影响。
图5为科博肽对帕金森病小鼠纹状体酪氨酸羟化酶含量的影响。
图6为科博肽对帕金森病小鼠纹状体多巴胺及其代谢物含量的影响。
图7为科博肽对帕金森病小鼠中脑黑质区星形胶质细胞中NGF蛋白表达的影响。
图8为科博肽对帕金森病小鼠腹侧中脑中NGF含量的影响。
图9为科博肽对帕金森病小鼠腹侧中脑中TrkA蛋白磷酸化水平的影响。
图10为不同浓度过氧化氢处理对科博肽纯度的影响。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例科博肽通过激活NGF-pTrkA信号转导通路阻遏神经毒素MPTP导致的帕金森病理进程的实验
(1)实验材料
清洁级雄性C57bl/6小鼠，质量25-28g，南通大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2014-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2017-0046。室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄食摄水。实验前，将雄小鼠在饲养环境中适应2d。
科博肽的来源可以通过人工合成、半合成，生物提取获得。本实验中使用的科博肽由苏州人本药业从中华眼镜蛇毒中提取，纯度98％，蛋白含量93％。经蛋白全覆盖氨基酸测序得到氨基酸序列为lechnqqssq tptttgcsgg etncykkrwr dhrgyrterg cgcpsvkngieinccttdrc nn(参见SEQ ID No：1)。与基因库中cobrotoxin的氨基酸序列一致。质谱质量测定分子量为6948，与理论计算的分子量一致。
(2)实验方法
1)MPTP帕金森病小鼠模型的制备：
60只C57bl/6小鼠随机均分为4组(对照组、帕金森病模型组、科博肽低剂量和高剂量治疗组)。帕金森病模型组、科博肽低剂量和高剂量治疗组腹腔连续注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP M0896，购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，当天每隔2小时注射1次，共4次，每次剂量均为20mg·kg-1，构建急性帕金森病(PD)小鼠模型，对照组予等体积0.9％生理盐水腹腔注射。科博肽低剂量(3μg·kg-1)治疗组于造模前5日(包括造模当天)开始注射0.3μg·ml-1的科博肽水溶液，科博肽高剂量(9μg·kg-1)治疗组于造模前5日(包括造模当天)开始注射0.9μg·ml-1的科博肽水溶液，两组均每日腹腔注射1次，直至动物处死取材(药物干预共12天)。MPTP造模后次日做行为学分析，7日后处死动物取材。期间各组无动物死亡。
2)动物行为学检测：
A转轮实验(Rotarod test)此实验需要动物在转轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的评估动物运动协调性的实验。MPTP模型鼠该项评分减低，并与纹状体酪氨酸羟化酶含量高度相关。该测试要求小鼠在匀速旋转杆上保持平衡，并记录其在转棒上的运动时间。测试中缓慢的加速限制了个体间表现的差异性。所需道具包括：(1)仪器：滚轮轴心的直径为5cm左右，由坚固的塑料制作而成，外面包裹灰色的橡胶泡沫。正式测定前动物共训练5天，每天3次。仪器设定为在300s内从4转/min加速到40转/min。仪器在开始前以4转/min的恒速运转，记录动物在转轮上的停留时间。
B爬杆实验(Pole test)爬杆测试用于评估MPTP导致小鼠运动迟缓。实验采用杆径1cm、杆长50cm的木制直杆，杆顶部有直径2.5cm圆球，外面覆盖纱布以防止小鼠滑落。小鼠面向杆顶放置于距离杆顶约10cm，分别记录小鼠从开始运动到完全转为头向下的时间和小鼠到达杆底的时间。MPTP模型鼠两者均有延长，并且与纹状体多巴胺含量高度相关。同样，小鼠在正式测定前共训练5天，每天3次。最长记录时间为120s。
C抓力实验(Grip strength test)小鼠抓力仪用于评价疾病对动物肢体力量的影响。分别让小鼠前肢或前后肢握持配套金属网格，实验者轻轻拖动鼠尾直至小鼠脱离网格，仪器记录其最大抓力。MPTP模型鼠出现运动功能障碍，握力显著下调，与纹状体内多巴胺浓度高度相关。小鼠共训练5天，每天3次。
3)组织免疫化学检测：
①C57bl/6小鼠造模7d后予水合氯醛麻醉，依次用0.01M PBS及含0.01M PBS的4％多聚甲醛溶液心脏灌流固定脑组织。快速取脑，放置于4％多聚甲醛后固定6h后，将脑组织转移至20％蔗糖溶液中，4℃保存。待沉降至容器底部，再转移至30％的蔗糖溶液中。待沉降至容器底部，进行冠状面冰冻切片，脑片厚度40μm。脑片储存于抗冻液置-30℃保存备用。②取出相应实验组脑片，用PBS漂洗3次，每次15min；加0.1％的TritonX-100干预0.5h打孔，5％马血清常温封闭1h，加第一抗体酪氨酸羟化酶-小鼠单克隆抗体(mouse monoclonalantibody，TH，1:1500，T1299，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，在常温下振摇1h，4℃孵育过夜。③次日PBS漂洗3次，每次15min，加相应的第二抗体-生物素标记抗小鼠二级抗体(biotin-conjugated anti-mouse secondary antibody，1:500，Vector Labs，Burlingame，CA，USA)，常温避光孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min。加入VECTASTAIN ABC标准试剂盒(VECTASTAIN ABC Standard Kit，PK-4000，Vector Labs)提供的ABC工作液(PBS分别加A、B，1:100，混匀，放置脑片前室温放置30min)室温孵育1.5h。④DAB试剂盒显色，PBS冲洗后梯度脱水(75％乙醇2min，85％乙醇2min，95％乙醇3min，无水乙醇2min)，透明(二甲苯5min，新的二甲苯3min)，封片(中性树脂/二甲苯1:1)，倒置显微镜观察。
4)组织免疫荧光检测：
脑片制备见上述方法介绍。取出相应实验组脑片，用PBS漂洗3次，每次15min；加0.1％的TritonX-100干预0.5h打孔，5％马血清常温封闭1h，同时加入第一抗体GFAP-Cy3小鼠单克隆抗体(C9205,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA,1:1000)和NGF兔单克隆抗体(ab52918,Abcam,Cambridge,MA,USA,1:500)，在常温下振摇1h,4℃孵育过夜。③次日PBS漂洗3次，每次15min，加相应的第二抗体FITC-标记山羊抗兔IgG(1:800)，常温避光孵育1h，PBS漂洗3次，每次15min。④加入DAPI染核15min，PBS漂洗15min后将24孔板中的脑片挑到载玻片上用荧光抗淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜镜下观察NGF在星形胶质细胞中表达情况。
5)免疫印迹法蛋白检测：
①将小鼠腹侧中脑于下述溶液中低温匀浆：50mM Tris–HCl、pH 7.4,150mM NaCl,2.0mM EDTA，10mMβ巯基乙醇，1.0mM钒酸钠，50mM氟化钠，1.0mM AEBSF，10μg/ml抑肽酶(aprotinin)，10μg/ml白蛋白(leupeptin)和10μg/ml胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)，-80摄氏度冰箱保存。②裂解液(125mM Tris–HCl，pH 6.8，2％SDS，10％甘油，10％β巯基乙醇，0.004％溴酚蓝)处理脑组织匀浆液，煮沸5min变性，lorry法测蛋白含量，用组织裂解液将上样蛋白浓度调成一致。③SDS-PAGE电泳：准备玻璃板，用乙醇清洗，干燥，安装好。配制8％分离胶，在顶层缓慢加入双蒸水做覆盖液，以阻止空气氧对凝胶的抑制作用。凝胶聚合完毕之后，配制积层胶。浓缩胶聚合完毕后，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，按次序上样，电泳电压100V。电泳结束后，用蛋白转移装置将蛋白转到硝酸纤维素膜上。在转移缓冲液中，将滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜重叠置于海绵上，确定膜与胶之间有无气泡。两侧加上海绵，整体夹入三明治转移装置，移入己置有冰盒的转移槽缓冲液中，通电转移，330V，150min。转膜后将硝酸纤维素膜加入5％脱脂牛奶中置常温摇动1h封闭结束后，将硝酸纤维素膜放入一塑料袋中，配制一抗：TrkA多克隆抗体(#2505，Cell Signaling Technology，Danvers,Massachusetts,USA，1:1000)，Phospho-TrkA多克隆抗体(Tyr490，#9141，Cell SignalingTechnology，Danvers，Massachusetts，USA，1:1000)，β-actin小鼠单克隆抗体(A5441，Sigma-Aldrich,St.Louis，MO，USA，1:5000)后装入袋中，去除袋内所有气泡，用封膜机封口，4℃摇动过夜。次日TBS-T漂洗15min×3次，TBS漂洗15min×1次，将膜置于ECL显色液中(临用前A、B液等体积混匀)，室温1min。压片、曝光、显影。
6)ELISA蛋白检测：
将小鼠腹侧中脑低温匀浆(50mM Tris–HCl，pH 7.4,150mM NaCl，2.0mM EDTA，10mMβ巯基乙醇，1.0mM钒酸钠，50mM氟化钠，1.0mM AEBSF，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml白蛋白和10μg/ml胃蛋白酶抑制剂)，采用小鼠NGF ELISA试剂盒(EM9RB，Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)并按照试剂盒说明书记载的方法定量检测NGF含量。组织匀浆液14,000g离心30min，取出100μL上清，与标准品和对照品一起，在96孔板中室温低速摇床下孵育2.5h。清洗后加入100μLbiotin conjugate溶液，孵育1小时后清洗，继续加入100μLStreptavidin-HRP溶液孵育45min。最后加入100μL显色底物，30min反应后加入终止液。在450nm波长下酶标仪检测，计算标准曲线，并使用每个标本的蛋白总量标化最终结果。
7)HPLC-ECD检测：
小鼠断头后迅速取出全脑，在4℃冰浴中迅速分离出纹状体，称重后立即投入干冰中，在预冷匀浆液(0.4mol/L高氯酸，0.01％EDTA，1:10，w/v)中超声处理。然后4℃15,000g离心30min，上清液用0.22μm滤膜滤过，取10μl样品进样(717自动进样器，Waters,Milford,MA,USA)，连接高效液相色谱仪(Waters 1525)，电化学检测器(Waters 2465)分析多巴胺及其代谢物高香草酸HVA和3,4-二羟笨乙酸DOPAC含量。流动相溶液内含50mM磷酸二氢钠、0.25mM 1-辛烷磺酸、50mM柠檬酸钠、2mM NaCl、20mg乙二胺四乙酸二钠和乙腈(1:3,v/v)，PH值用磷酸调至4.3，泵流速1ml/min。制定标准曲线后，计算值用纹状体重量标化定量。
8)HPLC-纯度检测：科博肽分别在体积百分数为5％、10％、20％的过氧化氢水溶液条件下室温孵育12h，0.22μm滤膜滤过，取10μl样品进样，流动相A为乙腈，B为0.1％三氟乙酸水，流速为1ml/min梯度洗脱，高效液相色谱仪(LC-2030C)分析科博肽纯度。
9)统计学分析：
利用SPSS20.0统计软件对实验结果进行数据分析，GraphPad Prism8制图。数据显示为均数±标准差，统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为统计学差异有显著性。
(3)实验结果
结果如下：
图1为科博肽对帕金森病小鼠运动协调性的影响。转轮实验测试小鼠平衡运动能力结果显示，和MPTP模型组小鼠运动协调性相比，科博肽低、高剂量组中小鼠虽然没有显著性差异(P>0.05)，但治疗组各剂量组在转轮上的运动时间有上升的趋势，提示科博肽可能提高小鼠平衡运动能力；其中n＝12。
图2为科博肽对帕金森病小鼠运动迟缓的影响。爬杆试验显示MPTP干预24h后小鼠运动能力显著迟缓(P<0.001，P<0.0001)；与模型组相比，药物治疗低剂量组的小鼠转身时间没有显著性差异，但有减少的趋势(P>0.05)，而到达杆底的时间显著性缩短(P<0.05)；科博肽高剂量组则能够缩短小鼠转身时间(P<0.001)和总时间(P<0.01)；其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝12。
图3为科博肽对帕金森病小鼠前后肢抓力的影响。模型组小鼠的前后肢抓力均显著低于对照组小鼠(P<0.01，P<0.05)；科博肽低剂量组未能显著增加前后肢抓力，但有上升趋势(P>0.05)；和MPTP模型鼠相比，科博肽高剂量组能够显著增加小鼠的前肢抓力(P<0.01)和前后肢抓力(P<0.05)；其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，n＝12。
图4为科博肽对帕金森病小鼠中脑黑质区多巴胺神经元数量的影响。神经毒素MPTP造成小鼠中脑黑质区多巴胺神经元数量显著减少(P<0.0001)；科博肽低剂量组未能显著增加黑质区多巴胺神经元数目，但有上升趋势(P>0.05)；而科博肽高剂量治疗组则能够显著上调小鼠中脑黑质区多巴胺神经元的数量(P<0.05)；其中*表示P<0.05，****表示P<0.0001，n＝6。
图5为科博肽对帕金森病小鼠纹状体酪氨酸羟化酶含量的影响。免疫组化结果显示：神经毒素MPTP显著下调小鼠纹状体内酪氨酸羟化酶含量(P<0.0001)；与模型组相比，科博肽低剂量组未能显著增加纹状体内酪氨酸羟化酶含量，但有上升趋势(P>0.05)；而科博肽高剂量治疗组则能够显著上调小鼠纹状体内酪氨酸羟化酶含量(P<0.05)；其中*表示P<0.05，****表示P<0.0001，n＝6。
图6为科博肽对帕金森病小鼠纹状体多巴胺及其代谢物的影响。纹状体内单胺类神经递质检测结果显示：多巴胺及其代谢产物DOPAC、HVA的含量和其酪氨酸羟化酶量变化一致，模型组中多巴胺及其代谢物量均显著降低(P<0.0001)；与模型组相比，科博肽低剂量组未能显著增加纹状体内多巴胺及其代谢产物DOPAC、HVA含量，但有上调趋势(P>0.05)；而科博肽高剂量治疗组则能够显著增加小鼠纹状体内多巴胺及其代谢物含量(P<0.01，P<0.05)；其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，****表示P<0.0001，n＝8。
图7为科博肽对帕金森病小鼠中脑黑质区星形胶质细胞中NGF蛋白表达的影响。组织免疫荧光检测结果显示：科博肽各剂量治疗组能够在不影响星型胶质细胞数量的前提下，增加其胞内NGF蛋白表达量；Scale bar＝10μm。
图8为科博肽对帕金森病小鼠腹侧中脑中NGF含量的影响。ELISA检测结果显示：科博肽低剂量腹腔注射能够显著上调小鼠腹侧中脑内总NGF含量(P<0.001)；科博肽高剂量治疗组则显示小鼠腹侧中脑内NGF含量也显著性增高(P<0.0001)；其中***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝8。
图9为科博肽对帕金森病小鼠腹侧中脑中TrkA蛋白苏氨酸490位点磷酸化水平的影响。各组中，腹侧中脑中总TrkA蛋白表达量无差异(P>0.05)；科博肽药物干预后，pT490TrkA则显著性上调(P<0.05，P<0.001)；其中*表示P<0.05，***表示P<0.001，n＝5。
图10为不同浓度过氧化氢对科博肽纯度的影响。随着过氧化氢使用浓度的升高，处理后的科博肽降解比例越大，纯度越低。科博肽在体积百分数为5％、10％、20％的过氧化氢处理12小时后，纯度分别降为69.49％，50.09％，21.74％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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<120> 眼镜蛇神经毒素及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森药物中的应用
<130> SHA202100204
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Leu Glu Cys His Asn Gln Gln Ser Ser Gln Thr Pro Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Lys Arg Trp Arg Asp His
20 25 30
Arg Gly Tyr Arg Thr Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Ser Val Lys Asn
35 40 45
Gly Ile Glu Ile Asn Cys Cys Thr Thr Asp Arg Cys Asn Asn
50 55 60

Claims (12)

1.科博肽及其制剂在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物具有如下（1）-（3）中至少一项应用：
（1）所述药物用于改善运动迟缓；
（2）所述药物用于提升肌肉力量；
（3）所述药物用于提升黑质多巴胺神经元数目、提升纹状体多巴胺和/或其代谢物的含量以及提升纹状体酪氨酸羟化酶含量中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，科博肽及其制剂能够激活NGF-pTrkA通路。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述制剂选自科博肽注射液。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包括药学上有效量的科博肽和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自生理盐水、水或者缓冲液。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为口服和口腔给药剂型、鼻腔给药剂型、经皮给药剂型或者注射剂型。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂型。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括另一种治疗帕金森的额外治疗剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述额外治疗剂选自合成小分子药物或者生物制剂。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述生物制剂包含基因工程药物。
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中国优秀硕士学位论文全文数据库医药 卫生科技辑;王荣飞;中国优秀硕士学位论文全文数据库医药 卫生科技辑(第第3期期);摘要、第34页第1段至第35页第2段 *

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