CN1876682A - 转铁蛋白(Tf)－神经生长因子(NGF)偶联物的制备方法 - Google Patents

转铁蛋白(Tf)－神经生长因子(NGF)偶联物的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种能有效发挥NGF临床疾病防治作用的偶联物，其制备工艺是首先分别从哺乳动物血浆及眼镜蛇毒中用生化方法提取纯化Tf及NGF，再用蛋白偶合剂使Tf与NGF偶联形成Tf－NGF偶联物，用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、NGF，得Tf－NGF偶联物纯品。该偶联物具有与Tf受体结合及NGF的生物活性，可将Tf作为一种转运因子与血管内皮细胞上的受体结合介导大分子药物NGF进入脑组织，发挥NGF临床疾病的防治作用，主要用于防治帕金森氏病、老年性痴呆症等脑神经元损伤性疾病。

Description

转铁蛋白(Tf)-神经生长因子(NGF)偶联物的制备方法
                             技术领域
本发明属生物药物特别是转铁蛋白(Tf)-神经生长因子(NGF)偶联物制备方法领域。
                             背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor NGF，以下简称NGF)是1986年诺贝尔医学奖的项目，大量的实验证明该物质对神经细胞的发育、分化、生存和功能修复有调控作用，同时也发现脑及脊髓损伤性疾病、特别是如帕金森氏病、老年性痴呆症等疾病，与神经细胞的变性、凋亡与NGF等神经营养因子水平的变化密切相关。有关报道已证实了NGF对神经损伤性疾病的预防及治疗作用。但由于NGF为非亲脂性生物大分子，难以进入细胞，尤其难以通过脑毛细血管壁内皮的血脑屏障(Blood Brain Barrier BBB)，这给用NGF防治这些疾病带来了困难。目前由转铁蛋白(Transferrin Tf，以下简称Tf)及其受体(Transferrin Receptor TfR)介导的胞体转运作用已被证实。近年来对以Tf或其受体的抗体为载体偶联药物作为导向治疗的方法展开了广泛研究，并取得了一定的效果。但一直没有发现技术比较成熟的制备工艺报道。
                             发明内容
本发明要解决的技术问题是针对病因与NGF水平密切相关的帕金森氏等疾病，提供一种能有效发挥NGF的临床疾病防治作用药物的制备方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
Tf-NGF偶联物的制备方法是：
第一步：用生化方法分别从哺乳动物血浆及眼镜蛇毒中提取及纯化Tf及NGF。
第二步：用蛋白偶合剂使Tf与NGF偶联形成Tf-NGF偶联物，用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、NGF，得Tf-NGF偶联物纯品，经滤菌、检测NGF活性，检验合格的Tf-NGF偶联物可供疾病动物模型进行药效实验用。
Tf-NGF偶联物具有与Tf受体结合及NGF的生物活性，可将Tf作为一种转运因子与血管内皮细胞上的受体结合介导大分子药物NGF穿越血脑屏障进入脑组织，有效地发挥NGF临床疾病的防治作用，主要用于防治脑神经元损伤性疾病，如帕金森氏病、老年性痴呆症等脑部疾病。
                          具体实施方式
用本发明转铁蛋白(Tf)-神经生长因子(NGF)偶联物的制备方法，可生产出能有效发挥NGF临床疾病防治作用的Tf-NGF偶联物。
将Tf与NGF进行偶联形成Tf-NGF偶联物的制备工艺步骤为：
a.分别从哺乳动物血浆及眼镜蛇毒中用生化方法提取、纯化Tf及NGF。
b.用蛋白偶合剂使Tf与NGF偶联形成Tf-NGF偶联物，另将部分NGF标记上同位素碘125再与Tf偶联形成Tf-NGF-I125偶联物。分别用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、NGF、I125。得Tf-NGF偶联物、Tf-NGF-I125偶联物纯品，经滤菌、检测NGF活性，检验合格的Tf-NGF偶联物，可供疾病动物模型进行药效实验用。
用生产出的Tf-NGF偶联物进行小鼠血脑屏障穿透试验时，分别用NGF-I125、Tf-NGF-I125偶联物进行鼠颈动脉灌注，10分钟后用生理盐水对动物灌流，冲洗脑血管内残留的NGF-I125、Tf-NGF-I125，取出脑组织测定同位素含量。结果如下表：
Figure A20061001958700041
脑组织中Tf-NGF-I125组I125含量大于NGF-I125组约6.9倍。
制造鼠帕金森氏病动物模型时，用亲神经性损害剂甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)注射试验鼠。再用上述Tf-NGF偶联物对模型治疗组试验鼠进行保护性治疗，用免疫组织化学、电子显微技术及生化分析等手段，均可观察到实验动物脑组织、黑质胆碱能神经细胞等受到良好的保护。如黑质部位TH阳性细胞计数显示MPTP组797.0±121.4，Tf-NGF偶联物组2330.0±260.3，正常对照组2381.0±158.0，实验表明，Tf-NGF偶联物组细胞存活数显著高于MPTP组，而Tf-NGF偶联物组与正常对照组的细胞存活数不存在显著性差异。
以下是制备Tf-NGF偶联物的实施例：
实施例1：
一.Tf提取纯化：
1.盐析：取大鼠血浆200ml，加入0.1mol/LNaHCO3 54ml，混匀，滴加三氨乙酸-Cl3 5.4ml，25℃搅拌5小时，再加入硫酸铵63克，25℃放置3小时。然后7000rpm离心30分钟，弃上清液，取沉淀用30ml PH7.8 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，装入透析袋中，对上述缓冲液透析12小时，中间换液三次。
2.柱层析：取上述盐析提取物上QAE-Sephadex A-25柱，用PH7.4 0.05mol/L磷酸缓冲液平衡洗脱，再分别用含0.075mol/L NaCl、0.125mol/L NaCl、0.175mol/L NaCl的磷酸缓冲液作阶梯梯度洗脱，收集第3组份，第3组份为Tf。将第3组份对蒸馏水透析、冻干保存。
二.NGF提取纯化：
1.凝胶过滤层析：取眼镜蛇毒2克，用1％冰乙酸(V/V)25ml溶解，上Sephadex G-50柱，用1％冰乙酸平衡洗脱。收集第2组份，第2组份含NGF。用2mol/L NaOH调pH值至6.0备用。
2.离子交换层析：取上述凝胶过滤层析收集的第2组份上SP-sephadex C-25柱，用PH7.40.05mol/L磷酸缓冲液平衡洗脱，再分别用含0.075mol/L NaCl、0.125mol/L NaCl、0.175mol/L NaCl的磷酸缓冲液作阶梯梯度洗脱，收集第3组份，第3组份为NGF。将第3组份对蒸馏水透析、冻干保存。
三.Tf-NGF偶联物制备工艺：
1.NGF活化反应：取NGF 400mg用含0.001mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16mol/L硼酸缓冲液溶解，滴加用7ml同样缓冲液溶解的2-亚氨氢氯化硫醇20mg。搅拌反应1.5小时，加入37mg甘氨酸终止反应。反应液上sephadex G-25柱，用0.001mol/L EDTA的PH7.40.01mol/L磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
2.Tf活化反应：取Tf 400mg用PH 7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液溶解，滴加用3ml二甲亚砜溶解的45mgN-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应1.5小时，反应液上sephadex G-25柱，用PH7.40.01mol/L磷酸缓冲液平衡洗脱，收集第1组份。
3.Tf、NGF结合反应：将上述活化反应后的Tf及NGF组份相混合，搅拌反应3小时。反应液经浓缩上sephadex G-200柱，用PH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液平衡洗脱，第1组份为Tf-NGF偶联物。进一步滤菌、冻干保存。
实施例2：
一.Tf提取纯化同实施例1。
二.NGF提取纯化：
1.凝胶过滤层析同实施例1；
2.离子交换层析：取凝胶过滤层析收集的第2组份上CM-sephacell柱，用PH5.8 0.05mol/L醋酸缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol/L NaCl的醋酸缓冲液作线性梯度洗脱，收集第3组份，第3组份为NGF。将第3组份对蒸馏水透析、冻干保存。
三.Tf-NGF偶联物的制备：
1.NGF活化反应：取NGF 400mg用含0.001mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16mol/L硼酸缓冲液溶解，滴加用7ml同样缓冲液溶解的2-亚氨氢氯化硫醇30mg。其余同实施例1。
2.Tf活化反应：取Tf400mg用PH 7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液溶解，滴加用3ml二甲亚砜溶解的30mg N-羟基琥珀酰亚胺，其余同实施例1。
3.Tf、NGF结合反应同实施例1。
实施例3：
一.Tf提取纯化同实施例1。
二.NGF提取纯化：
1.凝胶过滤层析同实施例1；
2.离子交换层析：取凝胶过滤层析收集的第2组份上SP-sephadex C-25柱，用PH7.4 0.05mol/L磷酸缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol/L NaCl的磷酸缓冲液作线性梯度洗脱，收集第3组份，第3组份为NGF。将第3组份对蒸馏水透析、冻干保存。
三.Tf-NGF偶联物的制备：
1.NGF活化反应：取NGF 400mg用含0.001mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的0.16mol/L硼酸缓冲液溶解，滴加用7ml同样缓冲液溶解的2-亚氨氢氯化硫醇43mg。其余同实施例1。
2.Tf活化反应：取Tf 400mg用PH 7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液溶解，滴加用3ml二甲亚砜溶解的20mg N-羟基琥珀酰亚胺，其余同实施例1。
3.Tf、NGF结合反应同实施例1。
以下是Tf-NGF偶联物的应用实例：
本发明Tf-NGF偶联物对小鼠帕金森病模型的药理效应：
选用40日龄小鼠(14-16克)随机分成3组：1、MPTP实验组(制造帕金森模型)；2、Tf-NGF治疗组(针对帕金森模型治疗)；3、对照组(注射生理盐水)。实验结果：实验进行30天后将实验小鼠用戊巴比妥钠麻醉，依次用生理盐水和4％多聚甲醛作动脉灌流，取脑组织进行实验观察。HE染色光镜分析和电镜分析，分别显示MPTP实验组脑组织神经元胞核固缩，出现空泡变性，Nissl体溶解；大量明显的髓鞘脱落。而在正常对照组及Tf-NGF治疗组中未见上述病理改变的形成。免疫组化分析：脑黑质部位多巴胺细胞计数显示，Tf-NGF治疗组细胞存活数显著高于MPTP实验组(P＜0.05)，而与正常对照组不存在显著性差异(P＞0.05)。实验结果表明Tf-NGF偶联物可以通过血脑屏障，对小鼠帕金森病模型能产生良好的药理效应。

Claims (1)

1.一种将转铁蛋白Tf与NGF进行偶联形成Tf-NGF偶联物的制备方法，其特征是工艺步骤为：
a.分别从哺乳动物血浆及眼镜蛇毒中用生化方法提取纯化Tf及NGF；
b.用蛋白偶合剂使Tf与NGF偶联形成Tf-NGF偶联物，用层析法清除偶合剂及非结合部分的Tf、NGF，得Tf-NGF偶联物纯品，经滤菌，检测NGF活性，检验合格产品可供疾病动物模型进行药效实验用。
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