CN104341495A

CN104341495A - 一种蝎毒耐热多肽和制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104341495A
Application number: CN201310330290.1A
Authority: CN
Inventors: 张万琴
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明提供一种蝎毒耐热多肽和制备方法及其应用，属于多肽及其制备领域。本发明主要从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch，BmK)的蝎毒中，去除不耐热和耐热的有毒成分，获取一种更安全的蝎毒耐热多肽；该多肽用于防治难治性癫痫（Intractable Epilepsy）、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)、老年性痴呆(Alzheimer's disease，AD)等疾病，具有共同的作用靶点，而且又具有各自的特殊药效，本发明制备工艺稳定、简单、可控。

Description

一种蝎毒耐热多肽和制备方法及其应用

技术领域

本发明属于多肽及其制备领域，特别涉及一种耐热多肽和制备方法及应用。

背景技术

蝎是最古老的生物之一，有4亿4千万年进化史。蝎毒（Scorpion venom,SV）是蝎子捕食和受到激惹时，由蝎尾节毒囊腺排放的毒液，是蝎子捕食、卸敌的武器，也是全蝎的药用有效部位。

临床报道，从古至今，全蝎或蝎毒入药具有镇痉熄风、攻毒散结、搜风通络等功效。现代医学研究证明，蝎毒的毒性成分由神经毒和细胞毒两部分组成，其神经毒素被划分为长链和短链毒素，已被作为研究离子通道的工具药使用。1988年沈阳药科大学周新华首次从BmK蝎毒中纯化出“抗癫痫肽”Zhou，X.H.，Yang，D.，Zhang，J.H.，Liu，C.M.&Lei，K.J.(1989)Purification and N-terminal partial sequence of anti-epilepsy peptide from venomof the scorpion Buthus martensi Karsch，Biochem.J，257，509-517.)分别从尾静脉注入抗癫痫肽（0.284mg/kg)和蝎毒(0.30mg/kg），发现抗癫痫肽对马桑内酯(2.51mg/kg i.p.)诱发的大脑皮层癫痫波的强度和持续时间，具有较强的抑制作用。但蝎毒组有25%的动物出现死亡。我们的动物毒性试验证明昆明种小鼠尾静脉注射0.42mg/kg可引起实验动物全部死亡。蝎毒的毒性限制了它的临床应用。2001年，专利CN1324621，公开了从BmK蝎毒中，分离出安全有效的耐热组分，但本申请发现，当其剂量增大到55.5mg/kg时，仍可引起实验动物全部死亡，本发明发现其原因是尚未去除耐热的有毒成分。

发明内容

本发明的目的是提供一种蝎毒耐热多肽和制备方法及其用途。主要从东亚钳蝎(Buthusmartensii Karsch，BmK)的蝎毒中，去除不耐热和耐热的有毒成分，获取一种更安全的蝎毒耐热多肽；该多肽用于防治难治性癫痫（Intractable Epilepsy）、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)、老年性痴呆(Alzheimer's disease，AD)等疾病，具有共同的作用靶点，而且又具有各自的特殊药效，本发明制备工艺稳定、简单、可控。

本发明纯化的蝎毒耐热多肽其分子量为6290.495道尔顿。

本发明的蝎毒耐热多肽为以BmK提取的新鲜蝎毒毒液为原料，离心，取上清液，隔水加热，高速离心，取上清液，离心超滤，离心超滤管滤膜的截留分子量为50kDa，经离心超滤后，收集其滤出液，然后将收集液置于有30kDa滤膜的离心超滤管中，进行离心超滤，取上槽液，得到蝎毒耐热多肽提取液，利用制备型高效液相色谱仪从蝎毒耐热多肽提取液中纯化出单一成分的蝎毒耐热多肽；制备型高效液相色谱，采用avant25系统，十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相为含有0.08%三氟乙酸的乙腈，检测波长为280nm或258nm或214nm，蝎毒耐热多肽分子量为6290.495道尔顿。

本发明的蝎毒耐热多肽，其制备方法为：

1、从BmK提取的新鲜蝎毒毒液；

2、用三蒸水将BmK蝎毒稀释，离心，取上清液，即得BmK蝎毒原液，备用（见图1泳道1-3及图2）

3、取BmK蝎毒原液，将其置于恒温水浴槽中，100℃隔水加热，4h后，取出，当其温度降至室温后，离心，取上清液，再次高速离心，留取高速离心后的上清溶液，得蝎毒耐热组分，备用(见图1泳道5-8及图3)；

4、将蝎毒耐热组分，置于离心超滤管中，离心超滤管滤膜的截留分子量为50kDa，经离心超滤后，收集其滤出液，然后将收集液置于有30kDa滤膜的离心超滤管中，进行离心超滤，取上槽液，得到蝎毒耐热多肽提取液(见图4)；

5、利用·制备型RP-HPLC对蝎毒耐热多肽提取液进行纯化。样品前处理:将样品0.1%三氟乙酸的水溶解到0.6ml，离心（12000RPM，离心10分钟）取上清;系统:avant25；柱子:Zorbax SB-C18 4.6x2505μm;进样体积:1000ul；缓冲液:平衡缓冲液:0.1%三氟乙酸水，洗脱缓冲液:0.08%三氟乙酸的乙腈;洗脱梯度:0–40%0.08%三氟乙酸的乙腈4个柱体积、40 –100%0.08%三氟乙酸的乙腈，0.5个柱体积、100%0.08%三氟乙酸的乙腈，1.5个柱体积;流速:0.8ml/min，检测波长为:280nm或258nm或214nm；获取纯度>95%的蝎毒耐热多肽的单一成分(见图5)，其分子量为6290.495道尔顿（见图6）。

本发明中的原料蝎毒具有仅次于蛇毒的毒性，原料蝎毒经持续高温、高速离心、离心超滤等制备方法处理后，蝎毒粗毒的成分及其安全性发生明显变化。由于癫痫、PD、AD等由兴奋性毒引起的脑损伤、脑内免疫炎症等引起的脑疾病均具有神经元损伤、胶质增生和小胶质细胞活化等神经病理特征，这是具有神经元损伤等脑疾病不能根治的原因所在。蝎毒耐热多肽用于防治难治性癫痫、PD、AD具有明确的药效活性药效作用靶点:包括对成体脑内神经发生区的内源性神经干细胞具有明显的促发生作用（图7）;具有抑制胶质增生或抑制胶质瘢痕形成作用（图8）;具有强的抑制脑内神经炎症、抗氧化和强的清除羟自由基的作用（图9）。目前，治疗癫痫、PD、AD等脑损伤、脑疾病的药物，主要是对症或替代作用，并且基本上都存在对神经系统的毒副作用，特别是目前已上市的抗癫痫药物，对儿童神经系统影响很大，有的药物强调儿童慎用或6岁以下儿童禁用。本发明提供的蝎毒耐热多肽不仅安全性进一步明显提高,而且对难治性癫痫、PD和AD伴发的学习记忆障碍均具有明显改善作用。

附图说明

图1.BmK蝎毒原液、蝎毒耐热组分SDS-PAGE电泳结果：泳道1-3为BmK蝎毒原液，泳道5-8为蝎毒耐热组分；

图2.蝎毒原液RP-HPLC结果，检测波长为258nm；

图3.蝎毒耐热组分RP-HPLC结果；

图4.蝎毒耐热多肽提取液RP-HPLC结果；

图5.蝎毒耐热多肽制备型RP-HPLC结果；

图6.蝎毒耐热多肽的分子量测定结果；

图7.蝎毒耐热多肽增加海马SGZ区干细胞的迁移;a，NS正常对照组；b，单独用药(蝎毒耐热多肽50μg/kgBW i.p.)组；c，NMDA损伤模型组；d，NMDA损伤模型组+蝎毒耐热多肽治疗组；e，MPTP PD模型组；f，MPTP PD模型组+蝎毒耐热多肽治疗组；

图8.蝎毒耐热多肽抑制脑内胶质瘢痕形成；

图9.蝎毒耐热多肽抑制LPS神经炎症剌激引起的小胶质细胞激活的形态学改变。

具体实施方式

以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。

实施例1

1、从河南宜昌BmK提取的新鲜蝎毒毒液，冷冻干燥后-20℃下贮存备用。

2、用三蒸水将BmK蝎毒的冷冻干粉溶介，其浓度为50mg/ml，4500rpm/min、4℃下、离心15min，取离心后取上清的蝎毒原液；

3、用50ml无菌、耐高温、带盖的塑料管分装上清液（1）；将塑料管盖钻孔后，塑料管加盖并旋紧;将其置于恒温水浴槽中，持续4小时，100℃隔水加热;4h后，取出、自然降温至室温后，7500rpm/min4℃下，离心15min;取离心后的上清液（2），再用19000rpm/min、4℃、高速离心40min;留取高速离心后的上清液（3），即为蝎毒耐热组分；

4、将蝎毒耐热组分，置于15ml离心超滤管中，离心超滤管滤膜的截留分子量为50kDa，经离心超滤后，收集其滤出液，然后将收集的滤出液置于有30kDa滤膜的离心超滤管中，进行离心超滤，取上槽液，每次离心超滤后，可获得200μl左右上槽液，即蝎毒耐热多肽提取液，在这一环节中，去除蝎毒中耐热有毒成分；将多次离心超滤获取的上槽液混合、定量分装后，冷冻干燥呈干粉、-20摄氏度下保存备用。

5、利用制备型RP-HPLC对蝎毒耐热多肽提取液进行纯化。样品前处理:将样品用0.1%三氟乙酸的水溶解到0.6ml，离心（12000RPM，离心10分钟）取上清;系统:avant25;柱子:Zorbax SB-C18(4.6×250 5um);进样体积:1000ul；缓冲液:平衡缓冲液为0.1%三氟乙酸水，洗脱缓冲液为0.08%三氟乙酸的乙腈;洗脱梯度:0–40%为0.08%三氟乙酸的乙腈4个柱体积、40–100%为0.08%三氟乙酸的乙腈，0.5个柱体积、100%为0.08%三氟乙酸的乙腈，1.5个柱体积;流速:0.8ml/min，检测波长为:280nm或258nm或214nm获取纯度>95%的蝎毒耐热多肽的单一成分(见图5)。

实施例2

MALDI-TOF检测蝎毒耐热多肽分子量方法及仪器参数。

1.试剂和仪器

水(Milli Q)、乙腈（CAN，Fisher Scientific公司）、三氟乙酸(三氟乙酸，Merck公司)

MALDI TOF-Target（MTP 384,Bruker Daltonics公司）

Bruker Daltonics Autoflex(Bruker Daltonics Billerica,MA,USA)

2.实验步骤

1)样品处理

用10微升TA液洗溶解少许样品，取溶液上清直接点在样品靶上，室温挥干吸取0.6微升基质溶液覆盖在样品及校准标准品上，室温挥干

2)上机检测

仪器操作条件

延迟提取时间：（Delayed extraction） 190ns

检测模式：Line mode/positive ion mode

激光频率：（Laser frequency）100HZ

加速电压：（Accelerating voltage） 20KV.

图形叠加：（Sum shots） 100次

校正模式：External calibration

校正标样：Protein1、Protein2calibration standard（Bruker Daltonics Billerica,Mass.USA）

基质：2,5二羟基苯甲酸(Bruker Daltonics Billerica,Mass.USA)

3)检测结果:蝎毒耐热多肽其分子量为6290.495道尔顿(见图6)。

实施例3

蝎毒耐热多肽可增加海马SGZ区干细胞的迁移，见图7，PSA-NCAM免疫反应阳性细胞数增多，灰白色为PSA-NCAM，黑灰色为DAPI(核)。a，NS正常对照组；b，单独用药(蝎毒耐热多肽50μg/kgBW)组；c，NMDA损伤模型组；d，NMDA损伤模型组+蝎毒耐热多肽治疗组；e，MPTP PD模型组；f，MPTP PD模型组+蝎毒耐热多肽。结果显示，治疗组红色PSA-NCAM均有所增加，说明蝎毒耐热多肽对脑内神经发生区的内源性神经干细胞具有明显的促发生作用。

实施例4

难治性癫痫动物脑内，海马CA1部位神经原损伤严重，纤维性星形胶质细胞反应性增生形成的胶质瘢痕，形成的胶质瘢痕分布在神经元受损部位（见图8左上）。蝎毒耐热多肽可使难治性癫痫动物脑内海马CA1部位星型胶质细胞的形态特征发生明显变化：胞体变大、突起缩短；其分布的部位发生明显变化(：互不重叠的分布在海马CA1锥体细胞层两侧，未见胶质瘢痕的形成（图8右上）。原代培养的Ⅱ型星形胶质细胞（图8左下），用药后的变化（图8右下），与体内结果类似，胞体变大、突起变短、分散分布这可能是用药后，不形成胶质瘢痕的细胞基础。

实施例5

蝎毒耐热多肽抑制LPS神经炎症剌激引起的小胶质细胞激活的形态学改变，见图9免疫荧光染色，横向第一排图，显示.Iba-1免疫反应阳性小胶质细胞，在原代神经原和胶质细胞混合培养体系中;横向第二排图显示原代混合胶质培养体系中;横向第三排图显示小胶质BV-2细胞活性，用OX-42抗体进行免疫细胞化学检测。

对照组(CTRL)、单独给药(蝎毒耐热多肽，SVHRP20μg/ml)组、模型组(LPS100ng/ml)与小胶质细胞共同孵育;模型给药组(LPS+SVHRP)，予先用SVHRP20μg/ml处理小胶质细胞24h，然后再与LPS 100ng/ml共孵育。静息的小胶质细胞，胞体小、突起薄而长;激活的小胶质细胞胞体变大、突起变短。Bar=20μm

对照组(CTRL)、单独给药(蝎毒耐热多肽，SVHRP 20μg/ml)组、模型组(LPS 100ng/ml)与小胶质细胞共同孵育;模型给药组(LPS+SVHRP)，予先用SVHRP20μg/ml处理小胶质细胞24h，然后再与LPS 100ng/ml共孵育。静息的小胶质细胞，胞体小、突起薄而长;激活的小胶质细胞胞体变大、突起变短。Bar=20μm.(见图9)。

实施例6

腹腔注射途径给药，不同给药组对动物急性毒性和安全性影响

表1腹腔注射途径给药，不同给药组对动物急性毒性和安全性影响。

结果表明，蝎毒耐热多肽的毒性明显降低。

实施例7

静脉途径给药情况下，蝎毒耐热多肽的急性毒性和安全性

表2.静脉途径给药情况下，蝎毒耐热多肽的急性毒性和安全性。

结果表明，蝎毒耐热多肽的毒性明显降低。

实施例8

空间搜索实验

空间搜索实验是Morris水迷宫行为学测定内容之一

Morris水迷宫DMS-2系统为中国医学科学院药物研究所研制生产的水迷宫自动记录仪，该实验装置外接动态轨迹摄像和计算机分析系统（DMS-2）。主体为一个不锈钢圆形水池(直径120cm，高50cm)，内侧池壁上标有东南西北4个入水点的红色标记，圆形水池被通过圆心的两条假想垂线划分为4个象限；目标象限(target quad)的正中水域放置一可移动圆柱形隐藏平台(有机玻璃站台，直径为9cm，高27cm)，整个实验期间其位置保持不变，平台低于水面2～3cm；测试时水池中加入1kg脱脂奶粉以排除空间定位以外的其它因素；水温保持在26±1℃；SD大鼠头部以染发剂涂黑，便于摄像；试验开始前1天，将大鼠放入水池中(不放平台)自由游泳2分钟，上、下午各一次，让其熟悉迷宫环境和学会游泳；实验过程中，水迷宫外周围参照物保持不变，水迷宫上方安置连接显示系统的摄象机，同步适时记录动物运动轨迹，Morris水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图象结果。

1、隐藏平台获得实验(hidden-platform acquisition training)，即定位航行实验。4组动物，于癫痫发作敏感性检验实验后连续测试4天，在每天的同一时间内每只大鼠训练1次，每次60秒。随机分别从东、西、南、北4个入水点背对池壁中点放入水中，如大鼠自动登上平台则让其在平台上停留20秒，如超过60秒未找到平台，则将其引放在平台上20秒作为强化提示。图象采集及分析系统自动保存大鼠的运动轨迹、寻找平台所需时间即逃避潜伏期(escape latency)，测试动物的空间学习能力

2、空间搜索实验(probe trial testing)。在实验的第5天撤除平台，任选一个入水点将大鼠放入水中，记录大鼠60秒内搜寻到平台的运动轨迹，在目标象限(target quadrant)及对侧象限(opposite quadrant)游泳时间和路径长度占总时间和总路径的百分比。同时记录大鼠的寻找平台的搜索策略、运动轨迹、寻找站台的潜伏期及穿越目标次数。

在第1、2、3、4天，与对照给药组大鼠(n=7)、模型给药组大鼠(n=7)和盐水对照组(n=6)大鼠比较，模型组(n=6)空间学习记忆能力明显降低（ANOVA P<0.01）而盐水对照组、模型给药组及对照给药组之间没有显著性差异（ANOVA P>0.05）。数据为每天检测的平均潜伏期的均数±标准差，见表3。

表3.Morris水迷宫、空间搜索试验结果

给药剂量为50微克/公斤体重/每天、腹腔注射、连续给药一周。

Claims

1.一种蝎毒耐热多肽，其特征在于：蝎毒耐热多肽为以BmK提取的新鲜蝎毒毒液为原料，离心，取上清液，隔水加热，高速离心，取上清液，离心超滤，离心超滤管滤膜的截留分子量为50kDa，经离心超滤后，收集其滤出液，然后将收集液置于有30kDa滤膜的离心超滤管中，进行离心超滤，取上槽液，得到蝎毒耐热多肽提取液，利用制备型高效液相色谱仪从蝎毒耐热多肽提取液中纯化出单一成分的蝎毒耐热多肽；制备型高效液相色谱，采用avant25系统，十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相为含有0.08%三氟乙酸的乙腈，检测波长为280nm或258nm或214nm，蝎毒耐热多肽分子量为6290.495道尔顿。

2.一种权利要求1所述的蝎毒耐热多肽的制备方法如下：

（1）从BmK提取的新鲜蝎毒毒液；

（2）用三蒸水将BmK蝎毒稀释，离心，取上清液，即得BmK蝎毒原液；

（3）取BmK蝎毒原液，将其置于恒温水浴槽中,100℃隔水加热，4h后，高速离心，取上清溶液，即得蝎毒耐热组分，备用；

（4）将蝎毒耐热组分置于离心超滤管中，离心超滤管滤膜的截留分子量为50kDa，经离心超滤后，收集其滤出液，然后将收集液置于有30kDa滤膜的离心超滤管中，进行离心超滤，取上槽液，得到蝎毒耐热多肽提取液；

（5）利用制备型RP-HPLC对蝎毒耐热多肽提取液进行纯化：样品前处理:将样品用0.1%三氟乙酸的水溶解到0.6ml，离心（12000RPM，离心10分钟）取上清；系统:avant25;柱子为Zorbax SB-C18，规格为4.6×250mm，柱子的粒径5μm；进样体积:1000ul；缓冲液:平衡缓冲液:0.1%三氟乙酸-水，洗脱缓冲液:0.08%三氟乙酸的乙腈；洗脱梯度：0–40%0.08%三氟乙酸的乙腈4个柱体积、40–100%0.08%三氟乙酸的乙腈，0.5个柱体积、100%0.08%三氟乙酸的乙腈，1.5个柱体积；流速:0.8ml/min，检测波长为:280nm或258nm或214nm；获取纯度>95%的蝎毒耐热多肽的单一成分，其分子量为6290.495道尔顿。

3.权利要求1所述的蝎毒耐热多肽在制备抗癫痫、帕金森、老年性痴呆药物中的应用。