CN101857634B - 纤维蛋白溶解系统激活蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纤维蛋白溶解系统激活蛋白，其是：1)SEQ IDNo.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或，2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由1)衍生的蛋白质。实验表明，该蛋白能够明显增强体内纤溶作用、促进血栓溶解，对血液流变学指标有明显改善，而且不影响凝血系统和抗凝指标，其是一种理想的用于治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍的药物。本发明具有广阔的应用前景，具有良好的经济价值和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物领域，具体涉及一种能够激活纤维蛋白溶解系统的蛋白质，该蛋白能够用于治疗和预防与血栓生成及微循环障碍有关疾病。
背景技术
本世纪八十年代未九十年代初出现全球性的老年社会，而危害中老年人生命的第一杀手就是心脑血管疾病。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年约有1200万人死于心脑血管疾病。中国中风发病率约219/10万，患病率为761/10万，全国约有900万人患有中风，在发病人数中约有2/3为缺血性中风，其血栓的形成是导致缺血性中风和其它一些心脑血管疾病的主要原因，据分析从八十年代初至九十年代初十年间，由于我国人在饮食结构、体力活动强度和其他工作生活条件的较大变化，按过去十年有关心脑血管发病因素的增长；情况，有关专家保守的估计，到二十一世纪初，我国中风发病率将上升60％，冠心病发病率将上升80％。
为此，科学家为寻求治疗血栓疾病的药物付出了极大的努力。目前应用于治疗血栓疾病主要有：链激酶、尿激酶、蛇毒蛋白、t-PA。但是距离人类抵抗这类疾病的要求还远远不够。
1986年，日本科学家美源恒首次应用现代生物技术方法提取蚯蚓中溶栓活性成分。确认口服蚯蚓粗蛋白提取物对血栓溶解、预防血栓形成以及降低血液粘度等方面有效。并且分离了六种蛋白酶组分，申请了专利——US 4,568,545。认为血栓溶解的活性组分就是这六个组分其中之一或几个的组合。这六个蛋白酶组分分别是：
F-O-HM-45分子量：24,500±2,000道尔顿
F-I-1-HM-54分子量：27,500±2,000道尔顿
F-I-2-HM-15分子量：27,000±2,000道尔顿
F-II-HM-64分子量：27,800±2,000道尔顿
F-III-1-HM-27分子量：32,400±2,000道尔顿
F-III-2-HM-89分子量：32,800±2,000道尔顿
在此基础上，我国科学家在90年代初推出了蚯蚓粗蛋白提取物口服溶栓胶囊，目前在我国有多家大型制药企业生产该类药物，如“江中制药”的“博洛克”、“青岛双龙”的“普恩复”等等。
CN 1393453A公开了一种血纤维蛋白溶解系统激活蛋白(fibrinolysis activating protein，FAP)分子量为16.2kDa，其具有一定的溶解血栓活性。
在此之后，对蚯蚓中溶栓活性有效组分的确定方面有大量的研究工作。但是，蚯蚓中溶栓活性组分的最终确定的研究一直没有进一步的进展。使蚯蚓的药用功能进一步应用受到限制。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的纤维蛋白溶解系统激活蛋白(FAP)。
本发明的第二个目的在于提供编码上述纤维蛋白溶解系统激活蛋白的基因。
本发明的再一个目的还在于提供上述纤维蛋白溶解系统激活蛋白的用途。
本发明从蚯蚓(Lumbricidae)中分离得到一种新的蛋白质，研究表明，该蛋白质没有直接降解纤维蛋白活力，但在体内有明显增强体内纤溶作用、促进血栓溶解；对血液流变学指标有明显改善；而且不影响凝血系统和抗凝指标。
通过提取的蚯蚓全RNA为模版，按照该蛋白质N端氨基酸序对应的mRNA5’端基因序列和所有mRNA共有的3’端polyA序列设计引物，经RT-PCR反应，获得该蛋白质的cDNA，其核苷酸序列如SEQID No.1所示，编码52个氨基酸所组成的蛋白质。经测定，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将第14位的Glu替换为Asp，将第20位的Gln替换为Asn，或者将最后一位氨基酸缺失，或者在N端增加氨基酸。因此，本发明蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，具有同等功能的由SEQID No.2组成的蛋白衍生得到的蛋白质。本发明还包括编码上述蛋白的基因。
上述衍生得到的蛋白质，包括但不限于：
1)截短的蛋白质或者多肽，其中从FAP的一端或两端或蛋白质的内部区域除去一个或多个氨基酸，而产生的分子仍然保持原有的活性。
2)加长了的蛋白质或多肽。其中在FAP蛋白质的一端或两至或中间位置加入一个或多个氨基酸，而产生的分子仍保持着原有的活性。
3)氨基酸残基经取代的蛋白质或多肽，包括其它分子(包括但不限于天然和非天然存在的氨基酸)在特异性位点发生的氨基酸的取代，这种取代后的分子仍然保持着原有的活性。
此外，本发明纤维蛋白溶解系统激活蛋白还包括上述蛋白质经修饰的衍生物，包括使用化学方法将FAP与其它分子结合。包括基于可以存在于氨基酸上的功能基团(氨基、巯基、羧基，酰胺、苯酚、咪唑)选择所说的结合技术。其它的对这些基团结合有效的各种试剂包括戊二醛、重氮化联苯胺、碳二亚胺和对苯醌。将FAP与同位素、酶、载体蛋白质、细胞毒性剂、荧光分子和其它具有多种用途的化合物通过化学方法结合。这些结合技术对本领域技术人员是公知的。
此外，还可以通过对本发明纤维蛋白溶解系统激活蛋白进行修饰，或取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得该蛋白的衍生物，该衍生物够专一性结合所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白受体，但不具备激活纤维蛋白溶解系统的功能。从而，这种衍生物可以作为血纤维蛋白溶解系统抑制剂进行使用。当然，这种衍生物可以改变FAP的生物活性和产生生物或者药理上的激活剂或者抑制剂(如经修饰后，蛋白质保持它的专一性，其活性丧失，被用于抑制FAP的目标物活性)。
纤维蛋白溶解系统激活蛋白(FAP)来源于蚯蚓中分离纯化所得，包括步骤：将蚯蚓匀浆后，用硫酸铵分级盐析，取50％硫酸铵盐析沉淀，透析过夜，离心取上清，依次用Sephadex G100凝胶层析柱、DEAE-Sepharose离子交换色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化得到活力组分。在获知FAP的氨基酸序列SEQ ID No：2后可以来源于其他许多途径。包括来源于重组微生物表达；来源于植入相关基因遗传上改变的动物或植物；来源于基因重组的细胞、肿瘤、细胞培养物以及其它生物途径；来源于酶促切割不同的分子(包括包含FAP片段同源或者等同性序列的前体；来源于化学(肽化学合成和体外酶催化前体分子)方法产生的FAP。例如在重组大肠杆菌、昆虫、酵母以及其它表达系统中产生FAP，并用柱层析进行纯化。在本发明实施例中将编码FAP的基因导入表达载体，进而转化宿主细胞，通过培养、诱导表达，最后分离纯化获得FAP。
可以用在特定位置的氨基酸取代，进行这些肽片段的合成以便体外和体内检测激活和抑制活性。可以使用与组织具有高度亲和性的肽片段在亲和性柱上分离FAP目标物。对于阐明FAP活性机理，FAP目标物的分离和纯化是根本步骤，这种方法有利于产生调节FAP目标物活性的药物。最终产生生物活性。这种目标物的分离使得可以构建使用原位和溶液杂交技术监测目标物位置及合成的核苷酸探针。
FAP的合成肽片段具有多种功能。将与FAP目标物以高度特异性和亲合力结合的肽进行放射性或其他化学标记，可用于定量结合物及显现结合位置。本发明提供了重要诊断和研究工具。FAP目标物的定量和位置的知识有利于研究与纤溶系统激活相关的传导机制和缺陷存在位置。
在这些合成的肽中进行氨基酸的系统取代产生与FAP目标物具有高亲和性的激活剂和抑制剂，它们可以促进或减弱FAP目标物的功能。这种处理可能具有治疗作用。FAP片断及衍生物也可以作为FAP作用目标物的抑制剂，由此阻断目标物的生物活性。这些肽也可用于分离FAP作用目标物。
FAP在体内作用的目标物
FAP的作用机理是：在体内FAP特异性作用于特定目标物，该目标物属于纤维蛋白溶解系统或可以进一步作用于可以纤维蛋白溶解系统。所以本发明还包括应用FAP鉴定其作用的特异性目标物的方法和由此鉴定和分离的目标物分子。
相关技术对本领域技术人员是公知的。例如：
用同位素或其它分子或蛋白质标记的FAP，所说的标记用分子或蛋白质在现有技术(包括但不限于：正电子发射断层摄影术、放射自显影术、流动细胞计量术、放射受体结合测定和免疫组织化学)中用于检测和显示FAP的作用目标物的存在数量和位置。
实验表明，可以通过向患有因血栓生成及微循环障碍有关疾病的患者，以足以溶解血栓的量的纤维蛋白溶解系统激活蛋白或FAP的组合物，用来治疗血管闭塞性疾病。包括脑血栓的形成，脑栓塞；心绞痛，心肌埂死；肺栓塞；高凝血症；周围动、静脉栓塞症。血栓形成引起的疾病或改善微循环的方法。本发明对急性缺血性心脑血管病、慢性动脉闭塞症、微循环障碍特别有用。
由此可见，本发明纤维蛋白溶解系统激活蛋白可以用于制备治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍药物。
进一步本发明提供一种用于治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍的药物，其含有有效剂量的上述纤维蛋白溶解系统激活蛋白。
本发明也包括治疗和预防血栓生成、微循环障碍有关疾病的方法，包括(但不限于)通过或向患者给药FAP、或者FAP激活剂与抑制剂、和/或FAP抗血清。另外的治疗方法包括施用FAP、FAP片段、FAP抗血清。
本发明纤维蛋白溶解系统激活蛋白可以与药学上可接受的载体或赋形剂制备成各种剂型，包括适用于口服、肌内、静脉内、真皮内、颅内、气管内、眼房内、鼻、局部(包括口腔和舌下)、腹膜内等等给药的FAP。所说的FAP制剂可以以方便的单位剂量的形式存在，并且可以通过常规的药物技术制备。
适用于肠胃外施用的制剂包括含水或不含水的无菌注射液(包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和能够使此制剂与将要治疗的患者的血液达到等渗的溶质)；含水或不含水的无菌悬液(包括延缓剂和增厚剂)。
此外，FAP可以与生物降解聚合物组合使用，这种聚合物可以使FAP持续释放，所说的聚合物植入到需要药物运输的附近(例如血栓位点)或植入聚合物以便FAP在全身进行缓慢释放。渗透微型泵也可以用来在控制高浓度FAP，通过插管达到所需的位置。
本发明FAP的剂量取决于疾病的状态或治疗状态、其他临床因素和给药途径。
本发明还包括FAP的特异性(包括特异性区域选择性)抗体和抑制FAP特异性抗体结合的抗体(抗独特型抗体)。这些抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。FAP特异性抗体可以用于检测试剂盒以便检测FAP的存在的数量和位置，这种FAP特异性抗体可以检测蚯蚓提取物中FAP的含量。用于标定蚯蚓提取物的药效。定位组织中FAP。进一步，可以将上述抗体制备成适于使用的检测试剂盒试剂盒。
本领域技术人员可以进一步通过测定上述特异性抗体，获知其可变区，通过体外表达大量制备该特异性抗体。本发明还包括编码所述特异性抗体的核酸序列。
本领域技术人员应当理解，由于密码子的简并性，本领域技术人员可以根据已知的氨基酸序列或者基因序列设计适于宿主表达的核酸序列，例如根据大肠杆菌的偏爱性设计适于大肠杆菌表达的编码序列。
本发明还包括与FAP的转录和翻译有关的核糖核酸与脱氧核糖核酸的分子探针。这些分子探针可以在组织和细胞中检测FAP。
本发明也包括FAP、FAP肽片段、FAP抗血请、或者与用于治疗和研究的溶栓作用有关的FAP作用目标物的激活剂和抑制剂。
可以合成完整的FAP分子的不同肽片段用于其它几种用途，例如作为产生特异性抗血清的抗原；作为纤溶系统的诘抗剂；结合标记物用于测定FAP在血液中的含量等等。
本发明纤维蛋白溶解系统激活蛋白能够明显增强体内纤溶作用、促进血栓溶解，对血液流变学指标有明显改善，而且不影响凝血系统和抗凝指标，其是一种理想的用于治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍的药物。本发明具有广阔的应用前景，具有良好的经济价值和社会效益。
附图说明
图1显示的是FAP对栓塞脑微血管血流量变化的影响；
图2显示的是反应标准曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 蚯蚓中FAP的分离纯化
材料与方法
蚯蚓：无锡郊区养殖蚯蚓(赤子爱胜蚓Eisenia fortida)FAP活力测定：采用实施例3(FAP体外纤溶酶活性和纤溶酶原激酶活性)、实施列4(FAP对光化学法诱导大鼠局灶性脑血栓的溶解作用)、实施例5(FAP抗体制备及应用)所述方法为检测手段，测定FAP生物活性和免疫活性。
FAP提取：将新鲜蚯蚓组织洗干净，匀浆后，加等量水，25℃抽提12-14h，8000r/min离心，上清液用20％、50％硫酸铵分级盐析，取50％盐析沉淀对水透析过夜，透析液17000r/min离心，上清液冷冻干燥。得到提取物A。
凝胶过滤：预先用0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液平衡过的SephadexG100凝胶层析柱(1.6×70cm)；提取物A以PBS缓冲液溶解至适当浓度(约20mg/ml)上样5ml，用相同的缓冲液洗脱，流速为24ml/h。分步收集洗脱液，每2ml一管，共收100管。测蛋白吸收和活力，将活力峰收集合并，得提取物B，冷冻干燥保存。
DEAE-Sepharose离子交换色谱纯化：DEAE-Sepharose离子交换凝胶柱(2.6×50cm)，提取物B用0.01mol/L pH 7.5Tris-HCl溶解至合适浓度上样(约2mg/ml)，以0～0.5mol/L NaCl，7.4～10.0，0.1mol/L硼酸缓冲液梯度洗脱，每4ml收集一管，测定各管蛋白含量和FAP活力。将含FAP活力的收集管合并，对水透析过夜，为提取物C。冷冻干燥保存。
制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳提取物C用pH8.3Tris-Gly(25mmol/LTris，250mmol/L Gly电极液)溶解至合适浓度(约1000μg/ml)，采用日本ATTO AE-6750S型制备电泳仪纯化。浓缩胶组成4.5％PAGE Tris-HCL缓冲液(pH 6.8)，分离胶组成：12.5％PAGE Tris-HCL缓冲液(pH8.8)，分离胶长20mm；电泳用缓冲液Tris-Gly缓冲液pH8.3，回收用缓冲液Tris-HCL(pH8.8)缓冲液+20％蔗糖，通电15mA恒定电流，泳动时间10小时，缓冲液温度6℃，分画时间5分钟，回收液量0.8ml/组分。测蛋白吸收和活力，将活力峰收集合并。对水透析过夜，为提取物D。冷冻干燥保存。
结果
提取物D经毛细管电泳鉴定纯度达到99％，生物活性测定结果如实施例3(FAP体外纤溶酶活性和纤溶酶原激酶活性)、实施列4(FAP对光化学法诱导大鼠局灶性脑血栓的溶解作用)。免疫活力测试结果如实施例5(FAP抗体制备及应用)。我们将提取物D命名为纤维蛋白溶解系统激活蛋白(FAP)。序列测定结果如SEQ ID NO.2所示。
实施例2 FAP的体外重组表达
一、FAP基因获取
A.蚯蚓mRNA提取
(1)称取0.2g新鲜蚯蚓(赤子爱胜蚓Eisenia fortida)，加1ml TRIzol试剂制备蚯蚓匀浆，4℃孵育5min。
(2)加0.2ml氯仿，盖紧盖后用力振摇15Sec，然后在冰上放置5min。
(3)4℃，12000×g，离心15min。
(4)将上层水相移入另一管，加0.5ml异丙醇，并在冰上孵育10min。
(5)4℃12000×g离心10min。
(6)弃上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗涤，旋涡混匀。
(7)4℃，10000×g离心5min，得到RNA沉淀。
(8)空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用。
B.引物设计
引物1 CCG
AAA AGA TGC AGG CGT GAG TTT CAC ATC GC
引物2
TTA TTA CGG AAA GGG GAG AAG AAA GTA
C.RT-PCR
(1)逆转录反应
(2)PCR反应
总体积20μl(50μl)
| 95℃ 5分 预变性94℃ 30秒 变性52℃ 40秒 退火72℃ 30秒 延伸72℃ 7分 终末延伸28-36循环，4℃保温 |
D.电泳纯化回收
1)1％Agarose胶电泳，将目的DNA片段用干净的手术刀割下，放入1.5ml离心管；
2)称重后，在1.5ml离心管中加入3倍胶体积的buffer QG(100mg加300μl)；
3)50℃水浴中放置10min(至胶完全溶解)，每2-3分钟混匀一次(溶胶液应于buffer QG颜色相同)；
4)加入1倍胶体积的异丙醇然后充分混匀，静置片刻；
5)将样品转移入柱子中(柱子的最大容量为800μL)，然后13000rpm离心1分钟；
6)取下柱子，弃流出液，将柱子放回到刚才那个收集管中；
7)加入0.75mL buffer PE至柱子，室温放置2-5min，然后13000rpm离心1分钟；
8)取下柱子，弃流出液，再次13000rpm离心1分钟；
9)将柱子放置在一支新的1.5mL离心管中，加入50μL EB buffer(或无菌H2O)至膜中央，静置片刻，然后13000rpm离心1分钟，然后测定浓度。
二、FAP-pMETαA质粒的构建
A.酶切
pMETαA质粒用Xho I和EcoR I双酶切，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理，乙醇沉淀。
PCR产物同样用Xho I和EcoR I双酶切；
混合两个双酶切产物，连接酶连接。得到FAP-pMETαA质粒。
B.FAP-pMETαA质粒扩增
FAP-pMETαA质粒导入原核宿主菌TOP10F中培养，扩增FAP-pMETαA质粒。
三、FAP表达
A.FAP-pMETαA质粒的线性化
SalI酶切pMETαA质粒-FAP，线性化质粒。
用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理酶切后的质粒DNA，防止载体质粒DNA的自身环化。
B.酵母菌株GS115电转化
1.挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；
2.取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5；
3.将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
4.按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
5.按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6.按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；
7.备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率(2周之内)。
8.将5～20μg的线性化DNA溶解在5～10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；
9.将电转化杯冰浴5min；
10.进行电击；电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。
11.电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；
12.将菌体悬液涂布于MD或RDB平板(含Zeocin)上，每200～600μl涂布一块平板；
13.将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
C.FAP诱导表达
1.挑选一单菌落，置于装有25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30℃/250-300rpm培养至OD600＝2-6(约16-18h)；
2.室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用MM重悬菌体，使OD600＝1.0左右(约100～200ml)；
3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃/250-300rpm的摇床上继续生长；
4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％；
5.60hr分离样品的上清液。
四、FAP纯化
1)FAP诱导表达上清液，加入硫酸铵至70％饱和度，离心收集沉淀，适量水溶解(蛋白浓度15mg/ml左右)。
2)SephadexG25凝胶色谱脱盐：凝胶柱1.6×70cm，0.01mol/L pH7.0磷酸缓冲液平衡，上样15ml，用相同的缓冲液洗脱，流速为24ml/h。收集蛋白峰。
3)DEAE-Sepharose离子交换色谱纯化 凝胶柱2.6×50cm，脱盐得蛋白峰30ml稀释一倍后上样，以0～0.5mol/LNaCl梯度洗脱，收集主蛋白峰。为纯化的FAP。
4)经检测FAP纯度达到96％以上；氨基酸序列检测表明，获得的蛋白与预期相一致。
实施例3 FAP的体外纤溶酶活性和纤溶酶原激酶活性测定
材料与方法
材料：FAP(来源于蚯蚓纯化)；纤溶酶原(牛血，每支相当12酪蛋白单位)；凝血酶(牛血，每支相当130BP单位)、尿激酶(每支相当730单位)和纤维蛋白原(每支可凝蛋白81mg)(中国，中国药品生物制品检定所)
纤维蛋白平板法测定FAP的激酶活性和纤溶酶活性测定方法 按照Doegny等的纤维蛋白平板法，略加改进：
1)纤溶酶原激酶活性测定：200μl纤溶酶原液+100μl凝血酶(牛血)。混合后加入到37℃预热的纤维蛋白原液，混合液倒入，56℃琼脂溶液中，迅速混匀，铺两块直径9cm平板，置于水平台静止凝固，打出直径2mm的小孔，选2-3个孔加已知活力单位的尿激酶原做标准，2-3个孔加PBS缓冲液，其余孔加样品，37℃倒置保温14-16hr。测量透明溶圈直径(mm)，呈十字测量2个数据取平均值。
2)纤溶酶活性测定：100μl凝血酶(牛血)，加入到37℃预热灭活的纤维蛋白原(牛血)，倒入，56℃琼脂溶液中，迅速混匀后，铺两块直径9cm平板，置于水平台静止凝固，打出直径2mm的小孔，选2-3个孔加PBS缓冲液，其余孔加样品，37℃倒置保温14-16hr，测量透明溶圈直径(mm)，呈十字测量2个数据取平均值。
蚯蚓组织蛋白质的提取与分离 将新鲜蚯蚓组织洗干净，匀浆后，加等量水，25℃抽提12-14h，8000r/min离心，上清液用20％、50％硫酸铵分级盐析，取50％盐析沉淀对水透析过夜，透析液17000r/min离心，上清液冷冻干燥。得到蚯蚓粗提物。使用时以PBS缓冲液溶解至适当浓度。
结果与讨论
蚯蚓粗提物和FAP的纤溶酶活力和纤溶酶原激酶活力测定结果见表4：
表4 蚯蚓粗提物和FAP体外纤溶活力
从表中可以看到，蚯蚓粗提物有很高的纤溶酶活力和纤溶酶原激酶的活力；但是FAP在纤维平板法测定中未显示有着两种酶的活力。提示FAP促进血栓溶解的能力不是直接作用于纤维蛋白和纤溶酶原。
实施例4 FAP对光化学法诱导大鼠局灶性脑血栓的溶解作用
1、实验材料
1.1相关药品
受试药：FAP(蚯蚓中纯化获得，实施例1)，白色冻干粉，2.8mg/瓶。
阳性药：Recombinant reteplase(r-tPA)，白色冻干粉，10.8×106 IU/瓶，美国centocor Inc.公司生产。批号：758613c。
四氯四碘荧光素二钠(Tetrachlorotetraiodo-fluorescein sodiumsalt，虎红)，上海试剂三厂，批号20021030。以生理盐水配制成2％溶液并经滤过膜(
0.22μm，法国Millipore SA.)过滤，4℃保存备用。
红四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium choloride，TTC)，上海试剂三厂，批号：980619。以PBS配制成2％溶液，4℃保存备用。
1.2实验动物
Wistar大鼠，雌雄各半，中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK11-00-0010。
1.3实验仪器
冷光源激光发射器，天津药物研究院新药评价中心、航天八三五八所研制。
JI-200A激光微循环动态分析仪，天津南开大学生物物理研究室研制。
病理图像采集与分析系统，北京航空航天大学图像中心提供。
WZ-50C2微量注射泵，浙江大学医学仪器有限公司提供。
2、试验方法
2.1手术过程
Wistar大鼠，体重320.0±22.8(284～350)g，12％水合氯醛(360mg/kg，ip)麻醉。仰卧位固定于手术台上，暴露双侧股静脉。俯卧位固定，头皮正中线切开，仔细分离去除左侧骨膜，将大鼠固定于立体定位仪上。左侧顶骨立体定位顶叶感觉皮层区(AP3，ML3)，将激光多普勒探头置于该点上方5mm处，测定该区域的血流量值。血流量稳定后，经右侧股静脉给予2％四氯四碘荧光素二钠光敏剂，剂量为20mg/kg，体积1ml/kg(假手术组动物给予等体积NS)，1min后，采用冷光激光发射器(光纤直径50μm，λ510nm，光强度10mW/cm2，颅骨表面温度36℃)特定波长的光束照射该定位区域1.5min，照射部位血管内的四氯四碘荧光素二钠可大量吸收能量，发生能级跃迁，并将能量传递给氧分子，使血液中的氧转变成氧自由基(单线态氧′O2)，氧自由基再氧化破坏血管内皮细胞，使内皮细胞损伤和/或基底膜暴露，引起血小板粘附、聚集，从而激活内、外源性凝血系统，同时，氧自由基又能损伤血小板膜，由于损伤的血小板可释放一系列促凝血因子并为凝血提供磷脂表面，因而可大大加速血栓的形成。脑组织血管内血栓形成后，该区域的血流量降低。
2.2分组与给药
动物按体重随机分为6组，每组10只。血栓形成并稳定30min后，经左侧股静脉开始药物。采用先静脉推注总剂量的10％(体积0.2ml，推注时间1min)，剩余90％静脉恒速输注(体积1.8ml，输注时间为1h)。假手术组和模型对照组给予生理盐水、受试药3个剂量组给予FAP，剂量分别为2.5、5.0、10.0mg/kg，阳性对照组给予r-tPA，剂量为40.0×104IU/kg。
2.3测定指标
经过计算机实时采样，记录脑组织多普勒相对血流量。分别测定基础值、血栓形成时、给药前及开始给药后5、10、15、20、30、45、60、90、120min的相对血流量。根据流量值，计算血管再通时间(血流量增加达到血栓形成后流量下降值的30％以上定为血管再通)、血管再闭塞时间(血管再通后流量又降至给药前值所需的时间)及再通率、再闭塞率。术后24h断头取脑，置2％TTC染色，数码成像，通过软件测定梗死面积、体积，及梗死体积占同侧半球的百分比。
2.4统计学处理
所有计量资料以均数±标准差
表示。计量资料采用配对t-检验比较给药前后均数差异显著性，非配对t-检验比较不同组间均数差异显著性；计数资料采用精确Fisher检验进行统计学处理。
3、试验结果
3.1对大鼠脑血栓溶解的影响
模型对照组在120min内，10只动物中没有出现血流再通现象，FAP 2.5、5.0、10.0mg/kg可使部分动物脑血栓溶解，血管再通，再通率分别为40％、40％、30％，再通时间分别为48.5±28.8、66.5±29.2、68.7±38.8min。再通动物中分别有1/4、0/4、1/3只动物出现再闭塞。阳性对照r-tPA在120min内可使动物再通率达到50％，其再通时间为41.4±29.5min。结果见表5。
表5 FAP对大鼠脑血栓溶解的影响(
n＝10)
注：与模型对照组精确Fisher检验比较，*P＜0.05.
3.2对大鼠脑血流量的影响
假手术组120min内脑血流量无明显变化，与正常比较无明显差异；模型对照组造型后流量明显降低，约占正常值的37％左右，与正常比较差异有显著意义，造型后120min内流量基本保持稳定，与给药前比较除在20min有所降低外，其它各点均无明显差异，各时间点与假手组比较差异有显著意义；FAP 10mg/kg，静脉给药后可使90min血流量增加。结果见表6。
表6 FAP对栓塞脑微血管血流量(PU)的影响(n＝11)
注：1.流量单位为多普勒流量灌注单位(PU)，“△”为给药前后的差值；2.与假手术组非配对t-检验比较：+++P＜0.0001；3.与模型对照组非配对t-检验比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；4.与等剂量rt-PA比较：P＞0.05。
3.3对大鼠脑梗死体积的影响
FAP 2.5、5.0、10mg/kg，静脉给药后可使脑梗死体积有所减小，减小百分率分别为45.8％、62.7％、74.6％，其中，10mg/kg静脉给药后梗死体积减小与模型对照组比较差异有显著意义。结果见表7。
表7 FAP对大鼠脑梗死体积的影响(
n＝11)
| 组别 | 剂量 | 梗死体积(mm3) | 占同侧皮层％ |
| 假手术 | - | - | - |
| 模型对照 | - | 6.0±4.5 | 1.7±1.2 |
| FAP | 2.5 | 3.2±3.1 | 0.8±0.8* |
| FAP | 5 | 2.2±2.8* | 0.6±0.8* |
| FAP | 10 | 1.5±1.9* | 0.4±0.5** |
| FAP | 5 | 2.7±2.5* | 0.7±0.6* |
注：与模型对照组比较(非配对t-检验)：*P＜0.05，**P＜0.01
实施例5 FAP抗体制备及应用
FAP特异性抗体可以用于检测试剂盒以便检测FAP的存在的数量和位置、可以检测蚯蚓提取物中FAP的含量、用于标定蚯蚓提取物的药效、定位组织中FAP的位置等。本例提供一种FAP多克隆抗体的制备方法和应用于定量定性分析的方法。
1、材料与方法
1.1材料：
FAP：来源于实施例1重组表达纯化(也可来源于蚯蚓中分离纯化)。使用时用5％ClNa配制成2mg/ml溶液
弗式完全佐剂(FCA)和弗式不完全佐剂(FICA)购自Sigma公司
雄性新西兰大白兔：江苏省农业科学院实验动物中心，普通级。
1.2实验方法：
1.2.1免疫程序
雄性新西兰大白兔2只，体重1.5kg左右。
免疫前1周采血制备阴性血清。
FAP溶液加等体积弗式完全佐剂(FCA)，混合乳化成油包水(W/O)状态，
首免，1mgFAP/·kg(免疫原/兔子体重)，背部皮下多点注射(20点左右/只)；
第3周以相同剂量的免疫原与弗式不完全佐剂(FICA)混合乳化，进行第一次加强免疫；
每隔2周加强免疫1次。每次加强后1周，从兔耳缘静脉采少量血，分离血清，测效价，
当效价稳定后，将2倍量免疫原用等体积生理盐水稀释，耳缘静脉注射，进行最后一次冲击免疫。
1周后心脏采血，制备血清，加入等体积甘油，添加硫柳汞至终浓度为0.01％，于-20℃保存备用。
1.2.2血清效价及工作浓度
用间接非竞争ELISA方法，以重组FAP为包被原分别对经免疫后的兔血清进行效价测定，以阳性血清(P)与阴性血清(N)OD450比值大于2.1时血清稀释度定为抗体效价。通过方阵滴定法确定抗体-包被原的最适工作浓度。
1.2.3间接竞争ELISA
用CBS(pH 9.6)稀释重组FAP至工作浓度，以100μl/孔加入96孔酶标板中，37℃孵育2h后，用含0.05％Tween-20的PBST液洗板3次，拍干；再以200μl/孔加入含1％OVA的PBS液，封闭1h后，洗板；将配好的系列浓度的FAP标准溶液或待测样品液与抗体在室温下等体积混合振荡均匀，静置20min后，以100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h；洗板后加入HRP-羊抗兔IgG(用含1％OVA的PBS液稀释至4000倍)，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板。以100μl/孔加入TMB底物溶液(含10mg·ml-1TMB-DMSO溶液和0.65％H2O2的柠檬酸盐缓冲液，现配现用)，显色15min后每孔加入50μl 2mol·L-1的H2SO4溶液中止反应，于450nm读取吸光值。
1.2.4检测灵敏度
PBS(pH 7.4)配制系列浓度(0.001～500μg·ml-1)的FAP标准溶液，按已优化的IC-ELISA方法测定FAP对抗体结合反应的抑制率。以不加FAP抑制时的OD值为B0，加入相应浓度标样抑制时的OD值为B，以抑制率1-B/B0为纵坐标，以FAP浓度对数(LgC)为横坐标，进行线性拟合，建立直线回归方程，计算FAP抑制中浓度IC50及方法最低检测限。
2、结果分析
2.1抗体效价及最适工作浓度
按所述方法，对FAP免疫的2只兔血清，分别以2μg·ml-1的蚯蚓中分离FAP和重组FAP包被检测，其效价依次为6.4×104和3.2×105；用方阵滴定法确定最适工作浓度(OD450值约为1.0时的包被原浓度与抗体稀释倍数)，即蚯蚓中分离FAP为2μg·ml-1，1∶6.0×104；重组FAP为1μg·ml-1，1∶5.0×104。
2.2方法检测灵敏度
据所述方法，在已优化的工作浓度下，测定了FAP对抗体结合反应的IC50值。结果表明：重组FAP的IC50为3.68μg·ml-1；蚯蚓中分离FAP的IC50分别为7.34μg·ml-1。并分别在0.01～100μg·ml-1和0.1～100μg·ml-1FAP浓度范围内，抑制率与浓度对数呈线性相关，线性回归方程分别为y＝23.231LgC+46.866，r＝0.9955和y＝26.495LgC+35.223，r＝0.9984，对FAP的最低检测限(IC10)分别为0.03μg·ml-1和0.10μg·ml-1。反应标准曲线见图2。
3、结论
重组FAP免疫动物后，获得的抗FAP多克隆抗体效价分别达6.4×104和3.2×105。以重组FAP为包被原建立的FAP IC-ELISA检测方法，对重组FAP，在0.01～100μg·ml-1范围内，检测限达0.03μg·ml-1，抑制中浓度为3.68μg·ml-1；对蚯蚓分离FAP，在0.1～100μg·ml-1FAP浓度范围内，检测限达0.10μg·ml-1，抑制中浓度为7.34μg·ml-1。重组FAP的特异性抗体可以应用于天然FAP和重组FAP的定量、定性检测分析。并且说明重组FAP和天然FAP的序列和高级结构有很好的同源性。
序列表
<110>成都瑞盛高技术有限责任公司
<120>纤维蛋白溶解系统激活蛋白
<130>KHP10112362.6
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>156
<212>DNA
<213>Eisenia fortida
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(156)
<400>1
tgc cgg agt gag ttt cat atc gca ata ctt cgg att ccc tac ctt tgg 48
Cys Arg Ser Glu Phe His Ile Ala Ile Leu Arg Ile Pro Tyr Leu Trp
1 5 10 15
ctt ctc ctc ttc aat atc ctg tca acc tcg ctt tgt tgc atc att tct 96
Leu Leu Leu Phe Asn Ile Leu Ser Thr Ser Leu Cys Cys Ile Ile Ser
20 25 30
tcg ata atg aca ctc tcg cga ttt ttg cta gtg ata cct tac ttt ctt 144
Ser Ile Met Thr Leu Ser Arg Phe Leu Leu Val Ile Pro Tyr Phe Leu
35 40 45
ctc ccc ttt ccg 156
Leu Pro Phe Pro
50
<210>2
<211>52
<212>PRT
<213>Eisenia fortida
<400>2
Cys Arg Arg Glu Phe His Ile Ala Ile Glu Lys Ser Ile Glu Leu Leu
1 5 10 15
Arg Leu Leu Gln Thr Gly Lys Ser Thr Ser Leu Cys Cys Ile Ile Ser
20 25 30
Ser Ile Met Thr Leu Ser Arg Phe Leu Leu Val Ile Pro Tyr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Phe Pro
50
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccgctcgaga aaagatgcag gcgtgagttt cacatcgc 38
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gaattcttat tacggaaagg ggagaagaaa gta 33
Claims (8)
1.纤维蛋白溶解系统激活蛋白，其是SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白在制备治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍中的应用。
3.一种治疗或预防血栓引起的疾病或微循环障碍的药物，其含有权利要求1所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白。
4.编码权利要求1所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
6.一种制备权利要求1纤维蛋白溶解系统激活蛋白的方法，其是将权利要求4或5所述的基因导入表达载体，进而转化宿主细胞，通过培养、诱导表达，最后分离纯化获得；或者，
将蚯蚓匀浆后，用硫酸铵分级盐析，取50％硫酸铵盐析沉淀，透析过夜，离心取上清，依次用Sephadex G100凝胶层析柱、DEAE-Sepharose离子交换色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化得到活力组分。
7.权利要求1所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白的特异性抗体。
8.权利要求7所述特异性抗体在检测权利要求1所述纤维蛋白溶解系统激活蛋白中的应用。
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