CN113234708A - 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸 - Google Patents

纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸 Download PDF

Info

Publication number
CN113234708A
CN113234708A CN202110505073.6A CN202110505073A CN113234708A CN 113234708 A CN113234708 A CN 113234708A CN 202110505073 A CN202110505073 A CN 202110505073A CN 113234708 A CN113234708 A CN 113234708A
Authority
CN
China
Prior art keywords
active protein
amino acid
acid sequence
solution
eluent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110505073.6A
Other languages
English (en)
Inventor
杜守颖
刘海
杨万青
吴娅丽
马韫楠
汪文杰
钟宛凌
李鹏跃
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chinese Medicine
Original Assignee
Beijing University of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chinese Medicine filed Critical Beijing University of Chinese Medicine
Priority to CN202110505073.6A priority Critical patent/CN113234708A/zh
Publication of CN113234708A publication Critical patent/CN113234708A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
    • C12N9/6408—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种纤维蛋白溶解活性蛋白，所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中的任意一个：(Ⅰ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(Ⅱ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；(Ⅲ)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列；所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有直接水解纤维蛋白活性，同时可以激活纤溶酶原，从而进一步增强其水解纤维蛋白的活性，对体外血栓的溶解作用很强，可将其应用于治疗血栓性疾病药物的制备。

Description

纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合 物和编码该蛋白的核酸
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物。
背景技术
许多严重危害人类健康的疾病如心肌梗死、缺血性脑卒中、弥漫性血管内凝血等均与血栓的形成关。防治血栓形成多从促进纤溶活性、降低血小板功能、保护血管内皮、抑制血液凝固等环节采取措施，临床上相应的药物在使用过程存在一定的不足。阿司匹林常用作抗血小板药物，其副作用是易出现胃粘膜损伤及消化道出血；华法林常用作抗凝药物，但华法林因剂量个体差异大及需要实时监测，限制了其使用；溶栓药物链激酶、尿激酶由于特异性差易导致出血等严重不良反应。目前，溶栓药已从最初的链激酶和尿激酶发展到第三代瑞替普酶等，但在临床应用中由于瑞替普酶等第三代溶栓药价格高昂，而尿激酶仍在广泛使用。
动物类中药的应用在中国有着悠久的历史，研究发现中药水蛭、地龙、蜈蚣、蝎子以及蝮蛇等均有抗血栓的作用。其中地龙早在《本草纲目》中就记载有定惊通络的功效，同时在东南亚，干蚯蚓作为抗凝血和纤溶药物也已应用了几百年。据报道，蚯蚓消化道分泌的酶可直接溶解纤维蛋白及激活纤溶酶原，此蛋白水解酶一般称之为蚓激酶。蚓激酶一方面可通过激活纤溶酶原而溶解纤维蛋白，同时也能通过直接降解纤维蛋白原而抑制纤维蛋白的生成，因此蚓激酶可以预防和溶解纤维蛋白血栓。同时由于其副作用小，已被广泛用于预防和治疗血栓性疾病。但蚓激酶是蛋白混合物，急需从蚯蚓中分离出强纤溶活性的单一蛋白，并将其作为理想的抗血栓药物进行开发。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种纤维蛋白溶解活性蛋白，所述纤维蛋白溶解蛋白为单一组分蛋白，具有强纤溶活性的，比活高，可将其应用于治疗血栓性疾病药物的制备。
根据本发明第一方面，本发明提供一种纤维蛋白溶解活性蛋白，所述维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(Ⅰ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；
(Ⅲ)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。
本发明第二方面提供一种前述纤维蛋白溶解活性蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将蚯蚓匀浆加入去离子水中，调节pH为6-9,分离得到第一溶液，第一溶液通过至少一次乙醇沉淀，分离得到第二溶液；第二溶液通过至少一次乙醇沉淀、分离得到第一提取物；
(2)通过第一柱层析对第一提取物进行分离提纯，收集第一洗脱液后用去离子水置换第一洗脱液中的溶剂，脱盐、浓缩得到第二提取物；
第一层析柱为离子交换色谱柱；
第一洗脱液包含：流动相A为20mM Tris-HCl溶液，pH为7-7.6；流动相B为20mMTris-HCl-1M NaCl溶液，pH为7-7.6；
(3)通过第二柱层析对第二提取物进行分离提纯；收集主峰对应第二洗脱液，用去离子水置换第二洗脱液中的溶剂，脱盐、浓缩得到纤维蛋白溶解活性蛋白；
第二层析柱为分子筛凝胶色谱柱；
第二洗脱液为20mM Tris-HCl-0.3M NaCl，pH为7.3-7.6。
本发明第三方面提供一种核酸，该核酸编码前述的纤维蛋白溶解活性蛋白。
本发明第四方面提供一种通过基因重组由基因工程菌或细胞表达而获得所述纤维蛋白溶解活性蛋白。
本发明第五方面提供一种所述的纤维蛋白溶解活性蛋白在治疗血栓性疾病药物中的应用。
本发明第六方面提供一种药物组合物，该药物组合物包含前述纤维蛋白溶解活性蛋白。
本发明从蚯蚓中分离出一种新的单一组分蛋白，分子量约为25.1KD，该蛋白具有强纤溶活性，比活高，可将其应用于治疗血栓性疾病药物的制备。同时也为采用重组蛋白表达的方式大规模生产打下基础，意义重大。
附图说明
图1为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白SDS-PAGE电泳图；
图2为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白水解纤维蛋白及激活纤溶酶作用考察；
图3为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白最佳孵育pH考察图；
图4为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白pH稳定性考察图；
图5为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白最佳孵育温度考察图；
图6为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白热稳定性考察图；
图7为本发明纤维蛋白溶解活性蛋白不同浓度下与血栓块共孵育4h后的形态。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
根据本发明第一方面，本发明提供一种纤维蛋白溶解活性蛋白，所述纤维蛋白为一种新的单一组分蛋白，该蛋白具有强纤溶活性，比活高，所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(Ⅰ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；
(Ⅲ)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。
根据本发明，优选地，所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅲ)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列。
根据本发明，优选地，所述纤维蛋白溶解活性蛋白氨基酸序列具有如 SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列时，与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白相比，酶活力不低于95％，优选为不低于97％；更优选为不低于98％。
本发明提供的纤维蛋白溶解活性蛋白还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质,本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的纤维蛋白溶解活性蛋白具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。
所述修饰包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化、羧基化、糖基化。
所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如 D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ- 氨基酸等)的类似物。
这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。
根据本发明第二方面，本发明提供的所述纤维蛋白溶解活性蛋白可以通过分离纯化、人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得，本发明提供一种所述纤维蛋白溶解活性蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将蚯蚓匀浆加入去离子水中，调节pH为6-9,分离得到第一溶液，第一溶液通过至少一次乙醇沉淀，分离得到第二溶液；第二溶液通过至少一次乙醇沉淀、分离得到第一提取物；
(2)通过第一柱层析对第一提取物进行分离提纯，收集第一洗脱液后用去离子水置换第一洗脱液中的溶剂，脱盐、浓缩得到第二提取物；
第一层析柱为离子交换色谱柱；
第一洗脱液包含：流动相A为20mM Tris-HCl溶液，pH为7-7.6；流动相B为20mMTris-HCl-1M NaCl溶液，pH为7-7.6；
(3)通过第二柱层析对第二提取物进行分离提纯；收集主峰对应第二洗脱液，用去离子水置换第二洗脱液中的溶剂，脱盐、浓缩得到纤维蛋白溶解活性蛋白；
第二层析柱为分子筛凝胶色谱柱；
第二洗脱液为20mM Tris-HCl-0.3M NaCl，pH为7.3-7.6。
根据本发明，为了分离得到纯度更高的所述纤维蛋白溶解活性蛋白，优选地，步骤(1)中，蚯蚓匀浆与去离子水的质量比为1:2-6。
根据本发明，为了分离得到纯度更高的所述纤维蛋白溶解活性蛋白，优选地，乙醇沉淀、分离步骤包括：
往第一溶液中加入无水乙醇至乙醇浓度为70％～75％，再2-8℃至少冷藏 12小时，分离得到第二溶液；往第二溶液中加入无水乙醇至乙醇浓度为 78％～85％，再2-8℃至少冷藏12小时，分离得到沉淀物。
根据本发明，为了分离得到纯度更高的所述纤维蛋白溶解活性蛋白，优选地，步骤(2)中，洗脱液包括65％～100％的流动相A和0～35％的流动相 B。
根据本发明，为了分离得到纯度更高的所述纤维蛋白溶解活性蛋白，优选地，步骤(2)中，洗脱液为65％～100％的流动相A和0～35％的流动相B，通过梯度洗脱对第一提取物进行分离提纯，收集包含80％～90％的流动相A 和10％～20％的流动相B的洗脱液。
优选地，所述纤维蛋白溶解活性蛋白的制备方法包括：
采用水提醇沉法、离子交换层析法、分子筛凝胶层析法对中药地龙中纤溶活性蛋白进行分离纯化，得到氨基酸序列为SEQ ID NO.1的纤维蛋白溶解活性蛋白；包括：
所述水提醇沉法具体为将鲜地龙匀浆后，加入2-6倍重量的去离子水提取，调节pH值至6-9，搅拌混匀后离心收集上清液；向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为70％，于4℃冰箱中冷藏过夜；离心收集上清液，向上清液中无水乙醇至乙醇浓度为80％，于4℃冰箱中冷藏过夜；离心收集沉淀，加入适量去离子水溶解沉淀，将溶液冻干得地龙纤溶活性蛋白初提物；
所述离子交换法具体为以蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用离子交换色谱柱，以不同比例的20mM Tris-HCl(pH 7.5)(流动相A)和20mM，以0-35％B液进行梯度洗脱，收集10％-20％B液洗脱流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管超滤脱盐、浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白活性部位；
所述分子筛凝胶层析法具体为以蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用分子筛凝胶色谱柱，以20mM Tris-HCl-0.3M NaCl(pH 7.5)溶液为洗脱溶剂进行洗脱，收集主峰对应流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管超滤脱盐、浓缩，得活性蛋白溶液，冷冻干燥即得纤维蛋白溶解活性蛋白粉末。
本发明第三方面提供一种核酸，该核酸编码前述的纤维蛋白溶解活性蛋白。
根据本发明第四方面，本发明提供的所述纤维蛋白溶解活性蛋白可以通过分离纯化、人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得，本发明提供一种通过基因重组由基因工程菌或细胞表达而获得所述纤维蛋白溶解活性蛋白。
本发明提供的重组载体含有能编码本发明所提供的蛋白的基因。
重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pPic9k质粒。
本发明提供的重组菌株含有本发明提供的重组载体。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆状菌(如大肠杆菌 (Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))或酵母菌(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
优选地，所述纤维蛋白溶解活性蛋白(EPF3)的制备方法包括：培养前述重组菌株，诱导编码纤维蛋白溶解活性蛋白的基因表达；分离提纯所表达的EPF3。
优选地，所述培养条件为常规的培养条件，如使用LB培养基，在35-37℃下培养至OD600为0.6。
由于本发明提供的重组菌株中含有编码EPF3的基因，其可以高效地表达EPF3。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的EPF3。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯，在此不再赘述。
根据本发明第五方面，本发明提供一种纤维蛋白溶解活性蛋白在治疗血栓性疾病药物中的应用。
根据本发明第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括前述的纤维蛋白溶解活性蛋白。
本发明提供的纤维蛋白溶解活性蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下所示：
ILGGTEARVGEIPWQLSQQRGGSHSCGASLLRPGSALSAAHCVDGAP PADVRIVAGLHLRSDESTAVASLAESFLIHPSYNVGEGTFPNDIAIIYLLTN INSAPVENIDFALLPPDNVEQFVGFTCVLSGWGRTSASNVLPDALQKVSID VITTAECDSRMAAVAGADCTDAHIAVFDPALQKGSCNGDSGGPMNCPLS GEFVVAGVTSWGISGGGACLPEYPSVYTRTGFYRQWIIDNIR。
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
如无特殊说明，本发明中所涉及的操作和处理方法属于本领域常规方法。
如无特殊说明，本发明中所采用的仪器为本领域常规仪器。
下面结合制备例和实施例对本发明作进一步说明，但应当理解本发明的保护范围并不受实施例的限制。
实施例1
(1)将鲜地龙(冰冻)匀浆得地龙浆液，称取地龙浆液，加入2倍重量的去离子水提取，调节pH值至9，搅拌15分钟，离心收集上清液；向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为70％，于4℃冰箱中冷藏12h；离心收集上清液，向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为78％，于4℃冰箱中冷藏12h；离心收集沉淀，加入适量去离子水溶解沉淀，将溶液冻干得地龙纤溶活性蛋白初提物；
(2)采用离子交换法对地龙纤溶活性蛋白初提物进行分离纯化：以NGC 蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用GE公司的离子交换色谱柱 (HiTrap Q HP，5mL)，设置检测器波长为280nm，流速为5mL/min，以不同比例的20mM Tris-HCl(pH 7.5)(流动相A液)和20mM Tris-HCl-1M NaCl (pH 7.5)(流动相B液)为洗脱溶剂，以包含100-65％A液和0-35％B液的洗脱液进行梯度洗脱，收集包含10％-20％B液阶段流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管(截止分子量3KDa)超滤脱盐，直至在滤过液中滴加 1％AgNO3无白色絮状物产生；最后以超滤方式对蛋白溶液进行浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白活性部位；
(3)采用分子筛层析法对纤溶活性蛋白活性部位进行分离纯化：以NGC 蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用GE公司的分子筛凝胶色谱柱 (Superdex 75Increase10/300GL)，设置检测器波长为280nm，以20mM Tris-HCl-0.3M NaCl(pH 7.5)溶液为洗脱溶剂；以0.5mL/min的流速洗脱；收集主峰对应流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管(截止分子量3KDa) 超滤脱盐，直至在滤过液中滴加1％AgNO3无白色絮状物产生；最后以超滤方式对蛋白溶液进行浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白，冷冻干燥即得纤维蛋白溶解活性蛋白粉末。通过测序验证，得到的纤维蛋白溶解活性蛋白粉末具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
实施例2
(1)将鲜地龙(冰冻)匀浆得地龙浆液，称取地龙浆液，加入6倍重量的去离子水提取，调节pH值至6，搅拌15分钟，离心收集上清液；向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为75％，于4℃冰箱中冷藏12h；离心收集上清液，向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为85％，于4℃冰箱中冷藏12h；离心收集沉淀，加入适量去离子水溶解沉淀，将溶液冻干得地龙纤溶活性蛋白初提物；
(2)采用离子交换法对地龙纤溶活性蛋白初提物进行分离纯化；以NGC 蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用GE公司的离子交换色谱柱 (HiTrap Q HP，5mL)，设置检测器波长为280nm+，流速为5mL/min，以不同比例的20mM Tris-HCl(pH 7.5)(流动相A液)和20mM Tris-HCl-1M NaCl(pH 7.5)(流动相B液)为洗脱溶剂，以包含100-65％A液和0-35％B液的洗脱液进行梯度洗脱，收集包含12％-18％B液阶段流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管(截止分子量3KDa)超滤脱盐，直至在滤过液中滴加 1％AgNO3无白色絮状物产生；最后以超滤方式对蛋白溶液进行浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白活性部位；
(3)采用分子筛层析法对纤溶活性蛋白活性部位进行分离纯化；以NGC 蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用GE公司的分子筛凝胶色谱柱 (Superdex 75Increase10/300GL)，设置检测器波长为280nm，以20mM Tris-HCl-0.3M NaCl(pH 7.5)溶液为洗脱溶剂；以0.5mL/min的流速洗脱。收集主峰对应流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管(截止分子量3KDa) 超滤脱盐，直至在滤过液中滴加1％AgNO3无白色絮状物产生。最后以超滤方式对蛋白溶液进行浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白，冷冻干燥即得纤维蛋白溶解活性蛋白粉末。通过测序验证，得到的纤维蛋白溶解活性蛋白粉末具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
实施例3
(1)将鲜地龙(冰冻)匀浆得地龙浆液，称取地龙浆液，加入4倍重量的去离子水提取，调节pH值至7.5，搅拌15分钟，离心收集上清液；向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为70％，于4℃冰箱中冷藏12h；离心收集上清液，向上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为80％，于4℃冰箱中冷藏 12h；离心收集沉淀，加入适量去离子水溶解沉淀，将溶液冻干得地龙纤溶活性蛋白初提物。
(2)采用离子交换法对地龙纤溶活性蛋白初提物进行分离纯化。以NGC 蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用GE公司的离子交换色谱柱 (HiTrap Q HP，5mL)，设置检测器波长为280nm，流速为5mL/min，以不同比例的20mM Tris-HCl(pH 7.5)(流动相A液)和20mM Tris-HCl-1M NaCl (pH 7.5)(流动相B液)为洗脱溶剂，以包含100-65％A液和0-35％B液的洗脱液进行梯度洗脱，收集包含15％-18％B液阶段流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管(截止分子量3KDa)超滤脱盐，直至在滤过液中滴加 1％AgNO3无白色絮状物产生。最后以超滤方式对蛋白溶液进行浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白活性部位。
(3)采用分子筛层析法对纤溶活性蛋白活性部位进行分离纯化。以NGC 蛋白层析系统为分离纯化装置，层析柱选用GE公司的分子筛凝胶色谱柱 (Superdex 75Increase10/300GL)，设置检测器波长为280nm，以20mM Tris-HCl-0.3M NaCl(pH 7.5)溶液为洗脱溶剂。以0.5mL/min的流速洗脱。收集主峰对应流分，以去离子水为置换溶剂采用超滤管(截止分子量3KDa) 超滤脱盐，直至在滤过液中滴加1％AgNO3无白色絮状物产生。最后以超滤方式对蛋白溶液进行浓缩，得一定浓度的纤溶活性蛋白，冷冻干燥即得纤维蛋白溶解活性蛋白粉末。通过测序验证，得到的纤维蛋白溶解活性蛋白粉末具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
测试例1
采用纤维蛋白平板法考察纤溶活性，采用BCA法测定蛋白浓度，以样品的活性浓度(U/mL)与其蛋白浓度(μg/mL)的比值作为该样品的比活(U/μg)。测得纤维蛋白溶解活性蛋白比活为197.1U/μg，而采购于中检院的蚓激酶标准品比活为43.5U/μg，本发明提供的纤维蛋白溶解活性蛋白的比活是蚓激酶标准品的4.5倍。
测试例2
测定纤维蛋白溶解活性蛋白纤溶活性比活：采用15％的SDS-PAGE变性凝胶电泳考马斯亮蓝染色法对纤维蛋白溶解活性蛋白进行蛋白分析，如图 1所示，说明所述纤维蛋白溶解活性蛋白分子量约为25.1KD。
测试例3
采用纤维蛋白平板法，考察纤维蛋白溶解活性蛋白对纤溶酶原的激活作用。取纤维蛋白溶解活性蛋白溶液与纤溶酶原溶液混合，37℃下孵育1h，得待测样品。在纤维蛋白平板中加入10μL混合溶液及纤维蛋白溶解活性蛋白溶液(二者终浓度相同)，按照纤维蛋白平板法分别于3、6、18h测定纤溶环直径。
实验结果见图2(a为纤维蛋白溶解活性蛋白b为纤维蛋白溶解活性蛋白与纤溶酶原共孵育)，结果显示：纤维蛋白溶解活性蛋白对应纤溶环面积随时间的增加而增加；同时，与纤溶酶原共孵育后，其在纤维蛋白平板上的纤溶环面积明显增加，在纤维蛋白平板上孵育18h,与纤溶酶原共孵育的样品纤溶环面积增加20％。因此，纤维蛋白溶解活性蛋白可以直接且持续水解纤维蛋白，同时可以激活纤溶酶原，从而进一步增强其水解纤维蛋白的活性。
测试例4
新型纤溶活性蛋白的酶学性质的检测
(1)最佳孵育pH值和pH稳定性的测定
最佳孵育pH值测定：配制pH值为6、6.6、7.2、7.4、7.8、8.2、9.2缓冲液，并采用上述缓冲液制备纤维蛋白平板，按纤维蛋白平板法测定纤溶活性。以其中最高的纤溶活性作为100％，计算各孵育pH值下对应的纤溶活性。结果(见图3)显示：新型纤溶活性蛋白的最佳孵育pH值为7.8。
pH稳定性考察：将样品母液与pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11 的缓冲溶液混合，于4℃下放置24h，按纤维蛋白平板法测定纤溶活性。以其中最高的纤溶活性作为100％，计算各各样品对应的纤溶活性。结果(见图4)显示：新型纤溶活性蛋白在偏酸性的环境下稳定性较差；在偏碱性环境下，稳定性较好(pH值7-11，活性保持80％以上)；随着pH值3-11不断变化，其残留活性逐步增加，到达最大值后又逐步减小；在pH为9时，残留活性最大，即在pH为9时新型纤溶活性蛋白最稳定。
(2)最佳孵育温度和热稳定性的测定
最佳孵育温度考察：制备纤维蛋白平板，将加样后的纤维蛋白平板分别置于25、30、37、40、50、55、60、65℃恒温恒湿箱中，孵育18h,测定纤溶活性。以其中最高的纤溶活性作为100％，计算各温度对应的纤溶活性。最佳孵育温度考察结果(见图5)显示：新型纤溶活性蛋白的最适孵育温度为 50℃
热稳定性考察：将样品溶液置于25、30、37、40、50、55、60、65℃水浴中保温1h，按纤维蛋白平板法测定纤溶活性。以其中最高的纤溶活性作为 100％，计算各样品对应的纤溶活性。热稳定性考察结果(见图6)显示：新型纤溶活性蛋白在25-40℃下热稳定性较好，活性均保持在约90％以上；温度为50℃时，EPF3纤溶活性下降明显；在65℃下保温1h，纤溶活性完全丧失。
测试例5
体外血栓溶解实验：取正常SD大鼠，采用水合氯醛麻醉后，经腹主动脉取血于普通采血管中，于37℃水浴中保温4h，凝固弃血清后，采用生理盐水冲洗后用滤纸吸干，得血栓条。将血栓条切割成大小相近的血栓块，置于预先称重的1.5mL离心管中，计算栓块重量。
血栓溶解实验设置以下几组：PBS、蚓激酶(0.260mg/mL、0.520mg/mL)、 EPF3(0.130mg/mL、0.260mg/mL、0.520mg/mL、1.04mg/mL)。向栓块中分别加入各药物溶液100μL，37℃水浴中孵育，于0、0.5、1、2、4h称量血栓重量，计算血栓溶解率，血栓溶解率＝(栓块初始重量-药物作用后栓块重量)/栓块初始重量×100％。实验结果：不同浓度的EPF3对血栓块的溶解率见表1。
表1不同浓度的EPF3对血栓块的溶解率
Figure BDA0003058068230000141
由表1结果可知，EPF3对体外血栓的溶解作用很强，且具有剂量依赖性和时间依赖性。EPF3(0.520mg/mL)孵育4h，可溶解54.80％血栓，而对应浓度的蚓激酶仅溶解16.24％血栓；PBS对血栓几乎无溶解作用，而EPF3 随着浓度和孵育时间的增加，血栓溶解率逐渐增大，低浓度的EPF3(0.130 mg/mL)孵育4h后，血栓的溶解率达到29.25％，而高浓度的EPF3(1.04mg/mL) 孵育4h后，血栓的溶解率则达到66.50％。
血栓块与PBS、不同浓度的蚓激酶和EPF3共孵育4h后，栓块形态如图7所示。从图中可以看出蚓激酶对栓块的溶解较少，而与EPF3共孵育后的血栓明显变小，且随着浓度和孵育时间的增加血栓变小越明显。在高浓度的EPF3(1.04mg/mL)孵育4h后，部分血栓快被溶解完全。
从以上实施例可以看出，本发明的提供的纤维蛋白溶解活性蛋白有如下特点：
(1)在偏碱性环境下，稳定性较好，pH值7-11，活性保持80％以上， pH值为9时最稳定；纤维蛋白溶解活性蛋白的最佳孵育pH值为7.8。在25-40℃下热稳定性好，活性均保持在约90％以上
(2)具有直接水解纤维蛋白活性，同时可以激活纤溶酶原，从而进一步增强其水解纤维蛋白的活性。
(3)对体外血栓的溶解作用很强，且具有剂量依赖性和时间依赖性。
综上所述，本发明的提供的纤维蛋白溶解活性蛋白比活高，纤溶活性强，溶解血栓能力强，在血栓性疾病治疗药物的制备上具有广阔的应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京中医药大学
<120> 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸
<130> GZI00736GNYXY
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 蚯蚓
<400> 1
Ile Leu Gly Gly Thr Glu Ala Arg Val Gly Glu Ile Pro Trp Gln 15
Leu Ser Gln Gln Arg Gly Gly Ser His Ser Cys Gly Ala Ser Leu 30
Leu Arg Pro Gly Ser Ala Leu Ser Ala Ala His Cys Val Asp Gly 45
Ala Pro Pro Ala Asp Val Arg Ile Val Ala Gly Leu His Leu Arg 60
Ser Asp Glu Ser Thr Ala Val Ala Ser Leu Ala Glu Ser Phe Leu 75
Ile His Pro Ser Tyr Asn Val Gly Glu Gly Thr Phe Pro Asn Asp 90
Ile Ala Ile Ile Tyr Leu Leu Thr Asn Ile Asn Ser Ala Pro Val 105
Glu Asn Ile Asp Phe Ala Leu Leu Pro Pro Asp Asn Val Glu Gln 120
Phe Val Gly Phe Thr Cys Val Leu Ser Gly Trp Gly Arg Thr Ser 135
Ala Ser Asn Val Leu Pro Asp Ala Leu Gln Lys Val Ser Ile Asp 150
Val Ile Thr Thr Ala Glu Cys Asp Ser Arg Met Ala Ala Val Ala 165
Gly Ala Asp Cys Thr Asp Ala His Ile Ala Val Phe Asp Pro Ala 180
Leu Gln Lys Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Asn 195
Cys Pro Leu Ser Gly Glu Phe Val Val Ala Gly Val Thr Ser Trp 210
Gly Ile Ser Gly Gly Gly Ala Cys Leu Pro Glu Tyr Pro Ser Val 225
Tyr Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Arg Gln Trp Ile Ile Asp Asn Ile 240
Arg 241

Claims (10)

1.一种纤维蛋白溶解活性蛋白，其特征在于，所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(Ⅰ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；
(Ⅲ)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1中所述的活性蛋白，其中，所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅲ)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1中所述的活性蛋白，其中，所述纤维蛋白溶解活性蛋白具有(Ⅱ)所示的氨基酸序列，与具有(Ⅰ)所示的氨基酸序列的蛋白相比，酶活力不低于95％。
4.一种权利要求1-3中任意一项所述纤维蛋白溶解活性蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将蚯蚓匀浆加入去离子水中，调节pH为6-9,分离得到第一溶液，第一溶液通过至少一次乙醇沉淀，分离得到第二溶液；第二溶液通过至少一次乙醇沉淀、分离得到第一提取物；
(2)通过第一柱层析对第一提取物进行分离提纯，收集第一洗脱液后用去离子水置换第一洗脱液中的溶剂，脱盐、浓缩得到第二提取物；
第一层析柱为离子交换色谱柱；
第一洗脱液包含：流动相A为20mM Tris-HCl溶液，pH为7-7.6；和/或流动相B为20mMTris-HCl-1M NaCl溶液，pH为7-7.6；
(3)通过第二柱层析对第二提取物进行分离提纯；收集主峰对应第二洗脱液，用去离子水置换第二洗脱液中的溶剂，脱盐、浓缩得到纤维蛋白溶解活性蛋白；
第二层析柱为分子筛凝胶色谱柱；
第二洗脱液为20mM Tris-HCl-0.3M NaCl，pH为7.3-7.6。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，步骤(1)中，蚯蚓匀浆与去离子水的质量比为1:2-6；和/或
乙醇沉淀、分离步骤包括：
往第一溶液中加入无水乙醇至乙醇浓度为70％～75％，再2-8℃至少冷藏12小时，分离得到第二溶液；往第二溶液中加入无水乙醇至乙醇浓度为78％～85％，再2-8℃至少冷藏12小时，分离得到沉淀物。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，步骤(2)中，洗脱液为65％～100％的流动相A和0～35％的流动相B，通过梯度洗脱对第一提取物进行分离提纯，收集包含80％～90％的流动相A和10％～20％的流动相B的洗脱液。
7.一种核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1-3中任意一项所述的纤维蛋白溶解活性蛋白。
8.一种权利要求1-3中任意一项所述的纤维蛋白溶解活性蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括通过权利要求7中的所述核酸通过基因重组由基因工程菌或细胞表达而获得所述纤维蛋白溶解活性蛋白。
9.一种权利要求1-3中任意一项所述的纤维蛋白溶解活性蛋白在治疗血栓性疾病药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3中任意一项所述的纤维蛋白溶解活性蛋白。
CN202110505073.6A 2021-05-10 2021-05-10 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸 Pending CN113234708A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110505073.6A CN113234708A (zh) 2021-05-10 2021-05-10 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110505073.6A CN113234708A (zh) 2021-05-10 2021-05-10 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113234708A true CN113234708A (zh) 2021-08-10

Family

ID=77133088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110505073.6A Pending CN113234708A (zh) 2021-05-10 2021-05-10 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113234708A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1361280A (zh) * 2000-12-29 2002-07-31 中国科学院上海生物化学研究所 新的纤溶酶、其编码序列及用途
CN1804032A (zh) * 2005-01-12 2006-07-19 华东理工大学 新的蚯蚓纤溶酶及其编码序列与用途
CN101857634A (zh) * 2010-05-17 2010-10-13 成都瑞盛高科技有限责任公司 纤维蛋白溶解系统激活蛋白
CN102389442A (zh) * 2011-11-23 2012-03-28 南京中医药大学 一种具有抗血栓作用的地龙提取物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1361280A (zh) * 2000-12-29 2002-07-31 中国科学院上海生物化学研究所 新的纤溶酶、其编码序列及用途
CN1804032A (zh) * 2005-01-12 2006-07-19 华东理工大学 新的蚯蚓纤溶酶及其编码序列与用途
CN101857634A (zh) * 2010-05-17 2010-10-13 成都瑞盛高科技有限责任公司 纤维蛋白溶解系统激活蛋白
CN102389442A (zh) * 2011-11-23 2012-03-28 南京中医药大学 一种具有抗血栓作用的地龙提取物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张经纬 等: "通俗环毛蚓抗血栓活性蛋白成分的快速富集及活性考察", 《中国实验方剂学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6334061B2 (ja) 腫瘍血管遮断剤であるポリペプチド、遺伝子、発現ベクター、腫瘍血管遮断剤の組成物、及び腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドの調製方法
CN112745394B (zh) 一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用
JP2003511034A (ja) フィブリン溶解活性ポリペプチド
CN107011430B (zh) 一种具有生物学活性的截短的生长分化因子11及其制备方法
Kuan-Hong et al. Identification and characterization of a novel elastase inhibitor from Hirudinaria manillensis
CN113234708A (zh) 纤维蛋白溶解活性蛋白及其制备方法和应用、以及药物组合物和编码该蛋白的核酸
US8017750B2 (en) Haemocoagulase
EP2143790B1 (en) A purified recombinant batroxobin with high specific activity
EP0811687A2 (en) Polypeptides having l-asparaginase activity
JP2008517585A (ja) 組換え型プロトロンビン活性化プロテアーゼ（ｒＬＯＰＡＰ）を単量体の形態で取得するための方法；組換え型プロトロンビン活性化プロテアーゼ（ｒＬＯＰＡＰ）及びそのアミノ酸配列；デフィブリノゲナーゼ剤としての該プロテアーゼの使用および異常プロトロンビン血症のための診断キット
CN108517009B (zh) Sj13多肽及其在制备抗血栓药物中的应用
JP3819540B2 (ja) Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有する哺乳類由来のポリペプチド
US20090036647A1 (en) BITORAN WHICH IS TRYPSIN-INHIBITOR-LIKE PROTEIN DERIVED FROM BITIS ARIETANS VENOM, AND USE THEREOF AS BLOOD COAGULATION FACTOR Xa INHIBITOR
JPH0315389A (ja) アンクロッド様ポリペプチドをコードする新規ｄｎａ配列およびそれらの発現生成物より成る組成物
KR100453574B1 (ko) 곤충 유래의 혈전용해성 세린프로테아제와 그 추출방법 및이를 이용한 식·의약조성물
CN109295042A (zh) 一种天然方格星虫纤溶酶的制备方法及其应用
KR101884394B1 (ko) 비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소 및 이의 용도
JP3648548B2 (ja) 血液凝固阻害活性を有するハマダラカ由来のＡｓ−１蛋白質
RU2403284C1 (ru) Способ получения ингибитора коллагеназ с антикоагулянтным действием из гепатопанкреаса камчатского краба
WO2002053590A1 (fr) Nouvelle enzyme fibrinolytique, polynucleotide codant ce polypeptide et utilisation correspondante
RU2346983C1 (ru) Способ получения активатора плазминогена
CN108314720B (zh) Sj12多肽及其在制备抗凝血药物中的应用
US20110200541A1 (en) Recombinant preparation of bromelain inhibitors and bromelain inhibitor precursor
KR101841646B1 (ko) 암 억제 표적 단백질인 ａｉｍｐ－ｄｘ2의 제조방법
CN106928334A (zh) 约安巨马陆抗血栓肽Joannsin及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination