CN1804032A

CN1804032A - 新的蚯蚓纤溶酶及其编码序列与用途

Info

Publication number: CN1804032A
Application number: CN 200510023241
Authority: CN
Inventors: 储炬; 黄文华; 秦奕辉; 庄英萍; 张嗣良
Original assignee: GUOYUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI; East China University of Science and Technology
Current assignee: GUOYUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI; East China University of Science and Technology
Priority date: 2005-01-12
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2025-01-12
Also published as: CN100355884C

Abstract

本发明属于生物技术和医学领域，提供了一种基因工程改构的新的蚯蚓纤溶酶，命名为EFE－3D，及其编码该纤溶酶的多核苷酸序列。这种经基因工程修饰的纤溶酶，能够适合在酵母Pichia Pastoris中的表达，从而更适合利用重组技术来产生蚯蚓纤溶酶EFE－3D。本发明还公开了该蚯蚓纤溶酶用于治疗多种疾病的方法，如用于血栓栓塞性疾病等疾病。本发明还提供了含该蚯蚓纤溶酶的药物组合物。

Description

新的蚯蚓纤溶酶及其编码序列与用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及新的蚯蚓纤溶酶，命名为EFE-3D，及其编码该纤溶酶的多核苷酸序列，本发明还涉及利用基因重组技术制备该纤溶酶的方法，以及该纤溶酶在治疗血栓栓塞性疾病等方面的用途，还涉及含该纤溶酶的药物组合物。

背景技术

蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓中提取到的一类能水解血纤维蛋白(原)的酶类。它存在于蚯蚓的消化道内，分子量从15,000到60,000道尔顿。蚯蚓纤溶酶不是单一的一种酶，而是具有相同功能的多种蛋白水解酶的总称。

研究结果表明蚯蚓纤溶酶具有双重功能，除了能直接水解纤维蛋白外，还能激活血纤维蛋白溶酶原成血纤维蛋白溶酶，从而具有间接水解纤维蛋白的作用。体外药理实验的结果指出，蚯蚓纤溶酶除了能直接溶解血块外，还能刺激血管内皮细胞释放tPA，从而增强体内的纤溶作用。体内及体外血栓形成模型实验及人工血栓溶解实验结果均指出，蚯蚓纤溶酶具有明显的抗栓和溶栓作用。

基于蚯蚓纤溶酶这样一种特性，国内外已将它制成口服胶囊用于临床上治疗血栓栓塞性疾病。例如，商品名为龙心、蚓激酶、博洛克、普恩复及溶栓胶囊等药物都是以蚯蚓纤溶酶作为原料制成的。但至今蚯蚓纤溶酶的结构还鲜为人知，而且没有报道过任何一种具体蚯蚓纤溶酶的氨基酸序列或核苷酸序列。

鉴于纤溶酶在治疗血栓栓塞性疾病等方面具有巨大的应用前景，因此本领域迫切需要开发新的纤溶酶。但是，天然蚯蚓纤溶酶在蚯蚓中的含量极低，约为蚯蚓体重的1/20万，这就为提取该酶带来了很大的技术障碍，也耗费了大量的自然资源。因此，本发明对天然蚯蚓纤溶酶进行基因工程改造，使其能够适合在酵母Pichia Pastoris中的表达，并适合于基因工程生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种经基因工程改构的新的蚯蚓纤溶酶。

本发明的另一目的是提供编码上述纤溶酶的多核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供生产上述纤溶酶的方法以及上述纤溶酶和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供一种新的基因工程改构的蚯蚓纤溶酶蛋白质，命名为EFE-3D，该蛋白质来自在天然蚯蚓纤溶酶基因编码基础上的改构产物，它包含具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质；它与天然蚯蚓纤溶酶基因显著的区别在于：新的经基因工程改造的纤溶酶基因序列是酵母偏爱型基因，能够整合到酵母染色体中并稳定传代和复制；新的经基因工程改造的纤溶酶基因序列中替代了天然蚯蚓纤溶酶基因中的部分氨基酸，而这种替代明显地改进了纤溶酶在基因工程生产中的表达量。

在本发明的第二方面，提供一种基因工程改构的多核苷酸，该多核苷酸包含具有选自如下一组的一种核苷酸序列：

(a)编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；

(b)互补于以上(a)的核苷酸序列。

该多核苷酸是具有SEQ ID NO：1中16-738位的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞(Pichia Pastoris)。

在本发明的第四方面，提供了一种利用基因重组技术制备如权利要求1所述的蚯蚓纤溶酶的方法，该方法包含：(a)在适合表达EFE-3D的条件下，培养上述被转化的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有纤溶酶活性的蛋白质。

在本发明的第五方面，提供了上述的蚯蚓纤溶酶EFE-3D或者编码它的多核苷酸在治疗血栓栓塞性疾病方面的用途。还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的蚯蚓纤溶酶EFE-3D或者编码它的多核苷酸以及药学上可接受的载体。

本发明首先从多种蚯蚓已知序列进行分析，保留了其中共有的保守DNA序列，同时采用氨基酸替代的方法，替代了天然纤溶酶中不适合在酵母中表达的氨基酸序列，同时采用酵母偏爱型密码子替代天然纤溶酶中的保守DNA序列，命名它为纤溶酶EFE-3D。然后将纤溶酶EFE-3D的编码序列插入合适载体并转入合适的宿主细胞，表达并分离了纤溶酶EFE-3D。并通过Western印迹分析加以鉴定。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的纤溶酶EFE-3D蛋白质。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码纤溶酶EFE-3D蛋白质的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

宿主细胞是酵母Pichia Pastoris细胞。

本发明的蚯蚓纤溶酶EFE-3D有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接作为药物治疗血栓栓塞性疾病的疾病。用表达的重组纤溶酶EFE-3D筛选蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激纤溶酶功能的蛋白质分子。

利用本发明纤溶酶EFE-3D，通过各种常规筛选方法，可筛选出与纤溶酶发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明纤溶酶EFE-3D及其抗体、抑制剂、激动剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的蛋白质可直接用于疾病治疗，例如，用于血栓方面的治疗。在使用本发明纤溶酶EFE-3D时，还可同时使用其他治疗剂，如抗肿瘤药物等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明纤溶酶EFE-3D蛋白质以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制各。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的纤溶酶EFE-3D施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/天，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/天-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

一种检测样品中是否存在纤溶酶EFE-3D的方法是利用纤溶酶EFE-3D的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与纤溶酶EFE-3D特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在纤溶酶EFE-3D。

本发明的优点在于：蚯蚓中含有10多种的纤溶酶。从蚯蚓中分离纯化其中的一种成分至单一的纯度，在工艺上有一定的难度。本发明是对多种蚯蚓纤溶酶基因，分析其基因保守序列，剔除其一级结构中很难在酵母中顺利表达的基因结构，并成功地进行了表达，而且该表达产物分泌于培养液中，更有利于分离纯化。这些研究成果，不仅为今后开发研究基因工程产品创造了良好的条件，也为今后开发纤溶酶针剂提供了必要的化学结构资料。此外，本发明的纤溶酶EFE-3D为治疗血栓栓塞性疾病等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了纤溶酶EFE-3D的PCR扩增条带，泳道1为DNA标准；泳道2，3为PCR扩增产物(750bp)。

图2显示了MFL基因与纤溶酶EFE-3D的PCR扩增条带。泳道1为DNA标准；泳道2，3为PCR扩增产物MFL基因与纤溶酶EFE-3D融合基因(1000bp)

注：图1，2中DNA标准分子量自上而下为：2000，1000，750，500，250和100bp。

图3显示了表达纤溶酶EFE-3D的重组酵母Pichia Pastoris的构建过程。

图4显示了纤溶酶EFE-3D表达产物的SDS-PAGE图谱和western图谱。

其中：1：天然蚯蚓中多个纤溶酶组份都与抗体结合呈阳性；2：不含EFE-3D基因的酵母菌；3，4，5：含EFE-3D基因的酵母菌。

图5显示了纤溶酶EFE-3D与天然蚯蚓纤溶酶活性比较。下半部中最大的纤溶圈为天然蚯蚓纤溶酶5微克量，其他为含EFE-3D基因的酵母菌，不同菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

从蚯蚓中分离纯化天然的蚯蚓纤溶酶

取鲜活蚯蚓(威廉壮尾蚓)若干，经机械粉碎，迅速冷却至4-10摄氏度，10000rpm，4℃冷冻离心，并收集上清液。加入50％硫酸铵，搅拌10小时，10000rpm冷冻离心，收集沉淀。沉淀溶于适量的蒸馏水中，经离子交换柱，亲和层析柱，分子筛柱等多步分离纯化，得到蚯蚓纤溶酶精制样品。样品经HPLC法，或SDS电泳分析，呈现单一条带。

实施例2

兔抗蚯蚓纤溶酶抗体的制备

取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。以1mg蚯蚓纤溶酶样品加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在兔颈部多点注射。饲养半个月后，以1mg蚯蚓纤溶酶样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状，再在兔颈部多点注射。一个月后，用1.5mg蚯蚓纤溶酶样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。半个月后，再用1mg蚯蚓纤溶酶样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。饲养半个月后，颈动脉取血，4℃静置过夜，2,000rpm离心3分钟。上层血清即为兔抗蚯蚓纤溶酶抗体。

实施例3

纤溶酶EFE-3D的基因设计

根据多个已知蚯蚓纤溶酶基因序列，重新设计新的EFE-3D纤溶酶基因序列如下：

cgcctcgaga aaagaatcct tggtggtact aaggctcgtg ttggtgagat cccatggcaa 60

cttagtcaac aacgtggtgg tagtcacagt tgtggtgcta gtcttcttcg tccaggtagt 120

gctcttagtg ctgctcactg tgttgacggt gctccaccag ctgacgttcg tatcgttgct 180

ggtcttcacc ttcgtagtga cgagagtact gctgttgcta gtcttgctga gagtttcctt 240

atccacccaa gttacaacgt tggtgagggt actttcccaa acgacatcgc tatcatctac 300

cttcttacta acatcaacag tgctccagtt gagaacatcg acttcgctct tcttccacca 360

gacaacgttg agcaattcgt tggtttcact tgtgttctta gtggttgggg tcgtactagt 420

gctagtaacg ttcttccaga cgctcttcaa aaggttagta tcgacgttat cactactgct 480

gagtgtgaca gtcgtatggc tgctgttgct ggtgctgact gtactgacgc tcacatcgct 540

gttttcgacc cagctcttca aaagggtagt tgtaacggtg acagtggtgg tccaatgaac 600

tgtccactta gtggtgagtt cgttgttgct ggtgttacta gttggggtat cagtggtggt 660

ggtgcttgtc ttccagagta cccaagtgtt tacactcgta ctggtttcta ccgtcaatgg 720

atccttgaca acatccgtta gaattctc 748

实施例4

纤溶酶EFE-3D基因合成

据实施例3中设计的纤溶酶EFE-3D基因序列，分成32个DNA片段，其中正义链16个片段，反义链16个片段，经人工基因合成拼接；并采用PCR扩增，得到一条750bp左右的DNA专一条带。见图1所示。

实施例5

纤溶酶EFE-3D基因与酵母MFL基因的融合连接

酵母α-MFL(酿酒酵母分泌基因)(270bp)基因源自Invitrogen公司提供的pPIC9K载体(质粒)，经PCR扩增后，通过内部的Xho I内切酶与纤溶酶EFE-3D基因连接，再经PCR反应，得到一条1000bp左右的MFL与EFE-3D的融合基因。见图2所示。α-MFL基因为前导肽基因，能够帮助表达后的EFE-3D基因分泌到培养液中。

实施例6

纤溶酶EFE-3D的表达和鉴定

采用Invitrogen公司提供的系统构建重组细胞。其中质粒构建图谱见图3。

(1)表达

质粒转化于菌株Pichia Pastoris细胞中。经PCR筛选获得含EFE-3D外源基因的重组细胞株，待细胞生长到一定密度时，采用甲醇进行诱导。离心收集上清液。具体操作步骤，按照Invitrogen公司提供的方法.

(2)鉴定

SDS-PAGE结束后，取下电泳胶在冰浴的条件下100V电转2h至尼龙膜上。将膜放入杂交袋，加入5mL封闭液(5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)，在摆动平台上摇动1h.。用封闭液以1∶1000稀释第一抗体(实施例2中制得的兔抗蚯蚓纤溶酶抗体)。打开杂交袋，倒掉封闭液，加入稀释好的第一抗体，摇动1h.。用磷酸盐缓冲液洗涤尼龙膜3次，每次15min。将洗涤好的膜与封闭液稀释好的羊抗兔碱性磷酸酶(1∶3000稀释)杂交1h.。膜用碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH 9.5，5mmol/L MgCl₂，100mmol/LNaCl)洗涤后，用BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-一吲哚磷酸/氮蓝四唑)显色。

杂交结果显示，表达的EFE-3D蛋白质与蚯蚓纤溶酶抗体专一性地结合。见图4。

实施例7

纤溶酶EFE-3D的活性测定

按Deogny等人所描述的纤维蛋白平板法(Clinica ChimicaActa，1975，60，85)，根据溶圈的面积大小计算纤溶酶的活性。所采用的对照样品为实施例1中提取的天然蚯蚓纤溶酶，活力测定的结果分别为：天然蚯蚓纤溶酶为21,000mm²/mg蛋白质，纤溶酶EFE-3D为20,000mm²/mg蛋白质。见图5。

两者活力相当。根据测定活性时点样量计算，对照品含5微克天然蚯蚓纤溶酶，测定组为25微升发酵液。计算出，EFE-3D蛋白质的表达量为0.2克/升。当采用50升发酵时，就可获得10克EFE-3D蛋白质，而采用天然提取的方法同样制备10克天然蚯蚓纤溶酶需要2吨蚯蚓。可见，本发明述及的方法和采用的新基因在生产中显示出明显的技术进步和技术优势。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>华东理工大学，上海国源生物技术有限公司

<120>新的蚯蚓纤溶酶及其编码序列与用途

<130>说明书，权利要求书

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>748

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cgcctcgaga aaagaatcct tggtggtact aaggctcgtg ttggtgagat cccatggcaa 60

cttagtcaac aacgtggtgg tagtcacagt tgtggtgcta gtcttcttcg tccaggtagt 120

gctcttagtg ctgctcactg tgttgacggt gctccaccag ctgacgttcg tatcgttgct 180

ggtcttcacc ttcgtagtga cgagagtact gctgttgcta gtcttgctga gagtttcctt 240

atccacccaa gttacaacgt tggtgagggt actttcccaa acgacatcgc tatcatctac 300

cttcttacta acatcaacag tgctccagtt gagaacatcg acttcgctct tcttccacca 360

gacaacgttg agcaattcgt tggtttcact tgtgttctta gtggttgggg tcgtactagt 420

gctagtaacg ttcttccaga cgctcttcaa aaggttagta tcgacgttat cactactgct 480

gagtgtgaca gtcgtatggc tgctgttgct ggtgctgact gtactgacgc tcacatcgct 540

gttttcgacc cagctcttca aaagggtagt tgtaacggtg acagtggtgg tccaatgaac 600

tgtccactta gtggtgagtt cgttgttgct ggtgttacta gttggggtat cagtggtggt 660

ggtgcttgtc ttccagagta cccaagtgtt tacactcgta ctggtttcta ccgtcaatgg 720

atccttgaca acatccgtta gaattctc 748

<210>2

<211>241

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Ile Leu Gly Gly Thr Lys Ala Arg Val Gly Glu Ile Pro Trp Gln Leu

1 5 10 15

Ser Gln Gln Arg Gly Gly Ser His Ser Cys Gly Ala Ser Leu Leu Arg

20 25 30

Pro Gly Ser Ala Leu Ser Ala Ala His Cys Val Asp Gly Ala Pro Pro

35 40 45

Ala Asp Val Arg Ile Val Ala Gly Leu His Leu Arg Ser Asp Glu Ser

50 55 60

Thr Ala Val Ala Ser Leu Ala Glu Ser Phe Leu Ile His Pro Ser Tyr

65 70 75 80

Asn Val Gly Glu Gly Thr Phe Pro Asn Asp Ile Ala Ile Ile Tyr Leu

85 90 95

Leu Thr Asn Ile Asn Ser Ala Pro Val Glu Asn Ile Asp Phe Ala Leu

100 105 110

Leu Pro Pro Asp Ash Val Glu Gln Phe Val Gly Phe Thr Cys Val Leu

115 120 125

Ser Gly Trp Gly Arg Thr Ser Ala Ser Asn Val Leu Pro Asp Ala Leu

130 135 140

Gln Lys Val Ser Ile Asp Val Ile Thr Thr Ala Glu Cys Asp Ser Arg

145 150 155 160

Met Ala Ala Val Ala Gly Ala Asp Cys Thr Asp Ala His Ile Ala Val

165 170 175

Phe Asp Pro Ala Leu Gln Lys Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly

180 185 190

Pro Met Asn Cys Pro Leu Ser Gly Glu Phe Val Val Ala Gly Val Thr

195 200 205

Ser Trp Gly Ile Ser Gly Gly Gly Ala Cys Leu Pro Glu Tyr Pro Ser

210 215 220

Val Tyr Thr Arg Thr Gly Phe Tyr Arg Gln Trp Ile Leu Asp Asn Ile

225 230 235 240

Arg

Claims

1.一种基因工程改构的蚯蚓纤溶酶，其特征在于它是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质。

2.一种基因工程改构的多核苷酸，其特征在于它包含具有选自如下一组的一种核苷酸序列：

(b)互补于以上(a)的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于该多核苷酸是具有SEQ IDNO：1中16-738位的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于它含有如权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸，并经甲醇诱导后分泌表达权利要求1所述的蚯蚓纤溶酶。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于它是酵母Pichia Pastoris细胞。

7.一种利用基因重组技术制备如权利要求1所述的蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于，该方法包含：

(a)用权利要求2所述的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(b)在适合表达纤溶酶的条件下，培养宿主细胞；

(c)从培养物中分离出具有纤溶酶蛋白质活性的蛋白质。

8.权利要求1的蚯蚓纤溶酶或者权利要求2的多核苷酸在治疗血栓栓塞性疾病方面的用途。

9.一种药物组合物，其特征在于它含有安全有效量的权利要求1的蚯蚓纤溶酶或者权利要求2的多核苷酸以及药学上可接受的载体。