CN109295042A - 一种天然方格星虫纤溶酶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然方格星虫纤溶酶制备方法及其应用。本发明所述方格星虫纤溶酶，其部分氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明方格星虫纤溶酶在抗血栓方面具有非常好的疗效。

Description

一种天然方格星虫纤溶酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种天然方格星虫纤溶酶的制备方法及其药物应用。

背景技术

血栓形成是个体正常生理反应中一个非常重要的保护机制，当机体遭受创伤后能够有效止血，从而达到保护作用。止血和血栓的形成有3个主要影响因素：血管内血液流速、血小板和凝血因子。相对于生理性止血，病理性血栓形成则发生在血管腔内，如果累及到动脉，则导致器官、组织缺血和(或)坏死；如果发生在静脉内，则会导致血液回流障碍。某一部位形成的血栓还可以沿血流方向到其他部位的血管，这个过程叫栓塞。正常人体内血管内壁应该是光滑的，并且无斑块和狭窄，而病变患者则可能出现动脉粥样硬化的早期病变，即脂质条纹，随年龄增长逐渐演变为动脉粥样硬化斑块，斑块会越来越大。在斑块形成的早期可以没有任何症状，狭窄发展到一定程度就会出现稳定的缺血症状，在心脏表现为稳定性心绞痛，下肢表现为间歇性跛行。如果斑块不稳定，并在一定外因作用下发生破裂，则在斑块破裂的基础上发生保护作用，形成血栓，继而发生血管病变，甚至导致血管性死亡，这就是动脉粥样硬化血栓形成。

血栓相关疾病主要分为三类：动脉粥样血栓形成、动脉血栓栓塞和静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)。动脉管腔细，压力高，血液流速快，血液对血管壁的剪切应力大，因此血小板容易被激活，尤其在血管狭窄或者损伤的部位，应强化抗血小板治疗，只有在病变急性期或者急性损伤情况下才使用抗凝药物。静脉管腔粗，压力低，血液流速慢，血液对血管壁的剪切应力小，血小板不容易被激活，形成的血栓是以纤维蛋白作为网架结构的红色血栓，治疗则主要针对抑制凝血酶的产生及级联反应，抗血小板治疗效果不佳甚至无效

影响静脉血栓形成的主要因素有：血流滞缓、血液粘稠及血管壁损伤。当静脉血流迟缓，血液高凝状态及血管内膜损伤条件下，静脉发生急性非化脓性炎症，并继发血栓形成静脉血栓栓塞疾病。绝大多数静脉血栓形成发生在盆腔及下肢的深静脉。血栓形成早期易于脱落，可造成大片肺梗塞，这也是常常造成猝死原因之一。因此，早期应选用溶栓药物进行治疗，继而用抗凝药物进行预防，避免血栓再形成及扩展，是有效的预防治疗手段。

对于已经形成的血栓，最佳的治疗途径就是溶栓。溶栓治疗包括动脉内溶栓、静脉内溶栓、动静脉联合溶栓、器械辅助溶栓、超声波溶栓等方法。目前临床上已正式批准使用的溶栓剂有：组织型纤溶酶激活剂(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)、重组t-PA(rt-PA)、对-2-甲氧苯甲酚纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)、重组型葡萄球菌激酶(STAR)、和TNK-tPA等。

从溶栓剂开始作为药物使用到现在，溶栓剂的开发基本分为三代。

第一代溶栓剂包括链激酶(SK)和尿激酶(UK)，它们虽然具有较好的溶栓效果，但缺乏纤维蛋白选择性，除了能激活血栓表面的纤溶酶原外也能激活血浆中游离的纤溶酶原，使抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解，产生全身性出血的副作用，且SK重复使用容易造成过敏反应。UK为人尿中提取的一种蛋白水解酶，能激活纤溶酶原，预防血栓再形成。由于源自人体，无特异性抗原性，溶栓效率高，因此国内脑血栓溶栓治疗仍以UK为主。但是UK半衰期较短(约15min)，长期大量用药会有全身性出血的倾向，口服一般无效。

第一代溶栓分子具有自身难以克服的缺陷如出血负作用大等，已经被淘汰。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)和对-甲氧苯甲酰(茴香酰) 纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)均属于第二代溶栓剂。t-PA和pro-UK 体外和动物实验中都有明显的纤维蛋白亲和性，出血副作用较小。第二代溶栓剂已有所改进，但还不理想。今后研究目标是：提高对纤维蛋白的特异性，减少出血等副作用；提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性；延长其在血液循环中的作用时间；增加导向溶栓性能；在溶栓的同时，起到抗血栓形成的效果。静脉溶栓治疗通过静脉注入溶栓剂来达到溶解血栓的目的，该方法在临床应用最早，积累的经验最多，应用也比较普遍。由于操作简便，给药及时，无需特殊设备，因而至今仍广为应用。其主要缺点是用药量大、特异性低、疗效欠佳且并发出血的可能性较大。

正在研究开发的第三代溶栓药均为t-PA变异体，如TNKase(teneplase, TNK-t-PA)、Monteplase、Lanoteplase(Lanateplase,n-PA)等，其共同特点是能快速溶栓、开通堵塞的冠状动脉、恢复血液循环，治愈率达到73％～83％，而且勿须在医院内进行静脉注射、不需依体重而调整剂量、半衰期长等优点，但同时也具有价格高昂，伴随有副作用的缺点。

随着人口的老龄化到来，中风的发病率有持续增加的趋势。据WHO报导，到2020年中风将成为全球导致死亡和残疾的主要疾病之一，而缺血性中风将占 85％。在美国，每年有137,000由于中风而死亡，仅次于心血管疾病与癌症。在我国，每年新发病例也有195万(其中75％以上是缺血性中风)，死亡达到156万，死亡率高于癌症和心脏病，居三大死因之首。不仅如此，幸存者中1/3以上的病人成为残疾，给家庭和社会造成沉重的负担。所以，中风的防治，特别是针对缺血性中风，具有十分重要的意义。

血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管疾病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞。随着我国人民生活水平的提高和人口老龄化的到来，血栓栓塞性疾病现在已成为我国发病率，致残率和死亡率最高的疾病。溶栓药物的发展已经经历了四代，或多或少都存在一些缺点，如靶向性差，副作用强，价格昂贵等，使其应用受到了限制，因此大家开始着眼于从天然生物中分离纯化新的纤溶酶，如纳豆激酶、蚓激酶等。而海洋资源丰富，高压，缺氧的环境造就大量新物质的产生，因此科学家们希望最终可以寻找和开发一种新型的海洋溶栓候选药物，能够用以治疗血栓性疾病。通过对其溶栓性质的研究，从而研发出抗栓效果更好，而副作用更低的溶栓药物。

星虫动物门(Sipuncula)是动物界的一个小门类，属具闭管式循环系统。身体柔软，长筒状，形似蠕虫，无疣足，不具体节，亦无刚毛。一般体长约10厘米，最大的可达30～40厘米。营底栖穴居生活。体前端有一细长能伸缩的吻，是摄食和钻穴的辅助器官。吻前为口，口的周围有触手，展开似星芒状，因而称为星虫。生物体一直是溶栓药物的主要来源，其中来源于蚯蚓体内的溶栓剂---蚓激酶 (Lumbrokinase/Earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)，属国家Ⅱ类新药，目前已在美国、加拿大、日本及东南亚等国家和地区上市。而中国福建沿海方格星虫(Sipunculus nudus)，具有与蚯蚓类似的“自溶”现象，且在生活水域环境变化时，体腔内会有大量蛋白粉末排出，鉴于此，我们推测中国福建沿海方格星虫体内具有纤溶酶类活性物质，并且其体内所含的纤溶酶可能具有较蚯蚓更多的优越性。原因在于：第一，与陆地相比，海洋环境更为复杂，物种也更为丰富，为了生存竞争，海洋生物进化出了高效的新陈代谢机制，来源于海洋生物体内的生物活性物质具有结构新颖、生物活性高等特点；第二，方格星虫长期作为福建特色小吃---土笋冻的主要原料，其特有的无毒无害，美味保健功能已被历史所证明，同时它所具有的的“自溶”现象，以及“腐蚀”手纹现象较为明显和确切，表明沙蚕体内具有的纤溶活性物质的活力很强；第三，中国福建沿海方格星虫，分布广泛，可以人工养殖，易存活且繁殖周期短，为纤溶活性成分的研究提供了丰富的原料资源。

本实验室经过不懈努力和研究，从海洋无脊椎动物海洋星虫的提取物中发现一种纤溶酶，其在抗血栓治疗和中风防治方面有很好的效果。该项研究成果，迄今尚未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天然方格星虫纤溶酶。

本发明所述的方格星虫纤溶酶，其部分氨基酸序列为SEQ ID NO:1-6所示： IleVal Gly Gly Gln Asp Ala Thr Arg、Ala Leu Thr Ala Ala His Cys、Val Leu Ala GlyAla His Val Ser Ala Gly Asp Gln Glu Gln Gln Ser Asp Val Ala、Leu Ser Gln TrpGln Lys Leu、Gly Asp Ser Gly Gly Pro、Val Ser Tyr Phe Arg。

本发明所述的方格星虫纤溶酶，比活力达2001.32U/mg，纯化倍数为6.16，回收率10.9％，相对分子质量为24925.00Da。

本发明所述的方格星虫纤溶酶，最适反应pH范围在6.6～9.0；在20℃～40℃下，酶活力保持相对稳定；属于丝氨酸蛋白酶家族。

本发明所述的方格星虫纤溶酶，其具有靶向降解纤维蛋白原的的功能，其降解先后顺序为α链>β链>γ链。

本发明的另一个目的在于提供方格星虫纤溶酶的制备方法。

本发明所述的制备方法，包括以下步骤：取方格星虫肠组织，加入一定体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆，取出于4℃，10000rpm冷冻离心 20min，添加硫酸铵使其终浓度达到90％，可见有大量蛋白析出，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，收集沉淀。收集的沉淀于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4) 溶解，0.22微米滤膜过滤。Sephadex G-25脱盐；洗脱得到蛋白用2ml/min分别在0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M的NaCl进行DEAE Sepharose Fast Flow层析；洗脱得到的蛋白Superdex75 10/300GL凝胶过滤层析，所得蛋白用1ml/min分别在0.25M、0.3M、0.32M、0.34M、0.36M、0.38M、0.40M、 0.45M、0.5M的NaCl进行MonoQ 5/50GL层析洗脱，脱盐与超滤浓。

具体的，本发明所述的方格星虫纤溶酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)硫酸铵沉淀

将新鲜的方格星虫，放在海水中饲养2-3天，排出内脏泥沙，根据活性部位检测的结果，取肠组织，加入一定体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆，取出于4℃，10000rpm冷冻离心20min，弃沉淀，测量上清体积与pH 7.4 的饱和硫酸铵混合使溶液中硫酸铵的浓度达到30％，搅拌，放置12h，可见有少量析出物，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，沉淀主要为细胞碎片及其他不溶物质，丢弃，收集上清，继续添加硫酸铵使其终浓度达到90％，可见有大量蛋白析出，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，收集沉淀，初步得到蛋白粗制品，

(2)Sephadex G-25脱盐

收集的沉淀于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)溶解，0.22微米滤膜过滤，Sephadex G-25脱盐柱预处理：5个柱体积去离子水5ml/min洗柱； 5个柱体积0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡；上样：上样体积不要大于柱体积20％；洗脱：5ml/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱1.5 个柱体积，5ml/管集；柱子的保存：5ml/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4) 两个柱体积清洗5ml/min去离子水两个柱体积清洗，5ml/min 20％两个柱体积清洗，

(3)DEAE Sepharose Fast Flow层析

DEAE柱预处理：2ml/min去离子水清洗10个柱体积，2ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积，上样：样品需过0.22微米滤膜，上样流速为1ml/min；平衡：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)2ml/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用2ml/min分别在0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、 0.35M、0.4M、0.45M、0.5M的NaCl进行洗脱,1ml/管收集，得到五个主峰，用纤维平板法检测收集蛋白的活性，

(4)Superdex75 10/300GL凝胶过滤层析

Superdex75预处理：0.8ml/min去离子水清洗10个柱体积，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)(含0.15M NaCl)清洗5个柱体积；上样：上一步收集的的活性组分，用3K超滤管4℃、6000rpm、30min,0.8ml/min上样，上样量不要超过柱体积的2％；洗脱：用0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)(含0.15 mol/L NaCl)0.8ml/min洗脱1.5个柱体积，1ml/管收集，

(5)MonoQ 5/50GL层析

MonoQ 5/50GL预处理：1ml/min去离子水清洗10个柱体积，1ml/min 0.02 mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积，上样：上样流速为1ml/min；平衡：0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)2ml/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用1ml/min分别在0.25M、0.3M、0.32M、0.34M、0.36M、0.38M、0.40M、 0.45M、0.5M的NaCl进行洗脱,1ml/管收集，得到1个主峰，用纤维平板法检测收集蛋白的活性，

(6)HisTrap-5mlDesalting脱盐与超滤浓缩

HisTrap5mlDesalting脱盐柱预处理：5个柱体积去离子水5ml/min洗柱；5 个柱体积0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡；上样：上样体积不要超过总体积的20％，洗脱：5ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱1.5 个柱体积，1ml/管收集；柱子的保存：5ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)两个柱体积清洗5ml/min去离子水两个柱体积清洗，5ml/min 20％两个柱体积清洗，

超滤：将所得脱盐样品倒入3K超滤管中，4℃、6000rpm、30min,收集样品，超滤管用去离子水反复冲洗3-5次，滤膜浸入20％乙醇中。

本发明的另一个目的在于提供一种药物组合物。

该药物组合物，以本发明所述的方格星虫纤溶酶为药物活性成分，与药学上可接受的载体所组成。

本发明所述的药物组合物，其特征在于，制备成任何可药用的剂型。

本发明所述的方格星虫纤溶酶在制备预防和\或治疗血栓的药物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：提取方格星虫纤溶酶肠腔液—硫酸铵沉淀—G-25脱盐—DEAE离子交换—S75分子筛分离—MonoQ离子交换—超滤脱盐，得到一种天然方格星虫纤溶酶的组分，采用高效液相色谱法测定其分子量大小为24925.00Da。如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7所示。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：将该酶置于不同的pH和不同温度下，测定其最适pH和最适反应温度。加入不同的抑制剂和金属离子，测定不同抑制剂和金属离子对该酶活性的影响。如图8、图9、图10、图11、图 12所示。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下步骤：采用加热平板法测定该酶的直接纤溶活力，并加入尿激酶作为阴性对照。如图13所示。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下步骤：采用小鼠全血凝块用于体外溶栓实验，加入尿激酶作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，计算血块的溶解率并观察不同时间段溶液中的细胞的释放量和细胞形态。如图14、15、16 所示。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下步骤：将该酶与纤维蛋白原进行孵育，取不同时间段样品进行SDS-PAGE电泳。如图17所示。

在本发明的一个优选实施方案中，还包括如下步骤：将该酶溶液腹腔注射入血栓模型小鼠中，并加入尿激酶作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，统计小鼠尾部血栓的长度变化。如图18、19所示。

本发明的有益效果是：所得纤溶酶具有良好的溶栓效果，并且具有靶向溶解纤维蛋白原的作用。

本发明所述方格星虫纤溶酶，其最适pH范围在6.6～9.0；在20℃～40℃下，酶活力保持相对稳定。PMSF与Fe3+对该酶的活性影响较大。加热纤维平板实验表明方格星虫纤溶酶具有直接溶解纤维蛋白的能力。质谱鉴定结果得到了SFE 的部分氨基酸序列。

方格星虫纤溶酶在体外溶栓实验中，作用小鼠全血凝血块4h后血块几乎完全使其溶解；溶解率达91％，溶解血块效果优于阳性对照尿激酶。并且具有靶向降解纤维蛋白原的的功能，其降解先后顺序为α链>β链>γ链。

本发明在在角叉菜胶致小鼠尾部血栓的实验中，较之阳性尿激酶有明显的溶栓作用。因此将会成为一种出血安全性更好的溶栓药物。

对本发明中出现的名词进行解释：

SFE:方格星虫纤溶酶

UK:尿激酶

Acrylamide：丙烯酰胺

SDS:十二烷基硫酸钠

TEMED：四甲基乙二胺

PMSF：苯甲基磺酰氟

EDTA:乙二胺四乙酸

附图说明

图1为方格星虫肠腔液硫酸沉淀后Sephadex G-25脱盐图。

图2为方格星虫肠腔液脱盐后DEAE Sepharose Fast Flow梯度洗脱图

图3为方格星虫肠腔液经DEAE Sepharose Fast Flow梯度洗脱后Superdex75 10/300GL层析图

图4为方格星虫肠腔液经Superdex75 10/300GL层析MonoQ 5/50GL梯度洗脱图

图5为纤维蛋白平板检测各洗脱峰蛋白活力图(1:尿激酶(100U)；2:DEAE 0.3MNaCl洗脱3:superdex-75洗脱；4：MonoQ 0.32M NaCl洗脱)

图6为Superdex-75和MonoQ层析电泳图(1:Marker；2:supdex-75层析；3：MonoQ0.32MNaCl洗脱；4：DEAE 0.35M NaCl洗脱)

图7为高效液相测定的方格星虫纤溶酶的分子量图

图8为pH对方格星虫纤溶酶的稳定性的影响图。

图9为温度对方格星虫纤溶酶酶活性的影响图。

图10为温度对方格星虫纤溶酶稳定性的影响图。

图11为抑制剂对方格星虫纤溶酶活性的影响图。

图12为金属离子对方格星虫纤溶酶火星的影响图。

图13为加热纤维平板法测定方格星虫纤溶酶直接纤溶活力图。(SFE:方格星虫纤溶酶；UK:尿激酶)。

图14为体外溶栓效果图(图中1、2、3分别表示SFE组、尿激酶组、生理盐水组)。

图15为4小时各组分小鼠全血血块的质量图.

图16为方格星虫体外血栓组不同时间段内溶液中细胞数量与形态图。

图17为纤维蛋白原降解产物分析图。(1为蛋白分子量Marker，2-9依次为0，1min，3min，5min，10min，30min，1h，2h，3h取样的电泳结果)。

图18为给药72h后角叉菜胶引发小鼠黑尾图(a:正常组；b:阴性对照组,注射生理盐水的量为8mL/kg；c:实验组，注射SFE剂量为6mg/kg(120U/25g)； d:阳性对照组，注射尿激酶的剂量为100U/25g)。

图19为给药72h后角叉菜胶引发小鼠黑尾长度统计图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1 硫酸铵沉淀

将新鲜的方格星虫，放在海水中饲养2-3天，排出内脏泥沙。根据活性部位检测的结果，取肠组织，加入一定体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆，取出于4℃，10000rpm冷冻离心20min，弃沉淀。测量上清体积与pH 7.4 的饱和硫酸铵混合使溶液中硫酸铵的浓度达到30％，搅拌，放置12h，可见有少量析出物。4℃，10000rpm，冷冻离心20min，沉淀主要为细胞碎片及其他不溶物质，丢弃，收集上清，继续添加硫酸铵使其终浓度达到90％，可见有大量蛋白析出，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，收集沉淀。初步得到蛋白粗制品。

实施例2 Sephadex G-25脱盐

收集的沉淀于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)溶解，0.22微米滤膜过滤。Sephadex G-25脱盐柱预处理：5个柱体积去离子水5ml/min洗柱；5个柱体积0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡；上样：上样体积不要大于柱体积20％；洗脱：5ml/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱1.5个柱体积，5ml/管集；柱子的保存：5ml/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)两个柱体积清洗5ml/min 去离子水两个柱体积清洗，5ml/min 20％两个柱体积清洗。

实施例3 DEAE Sepharose Fast Flow层析

DEAE柱预处理：2ml/min去离子水清洗10个柱体积，2ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积。上样：样品需过0.22微米滤膜，上样流速为1ml/min；平衡：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)2ml/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用2ml/min分别在0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、 0.4M、0.45M、0.5M的NaCl进行洗脱,1ml/管收集，得到五个主峰。用纤维平板法检测收集蛋白的活性。

实施例4 Superdex75 10/300GL凝胶过滤层析

Superdex75预处理：0.8ml/min去离子水清洗10个柱体积，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)(含0.15M NaCl)清洗5个柱体积；上样：上一步收集的的活性组分，用3K超滤管4℃、6000rpm、30min,0.8ml/min上样，上样量不要超过柱体积的 2％；洗脱：用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)(含0.15mol/L NaCl)0.8ml/min 洗脱1.5个柱体积，1ml/管收集。

实施例5 MonoQ 5/50GL层析

MonoQ 5/50GL预处理：1ml/min去离子水清洗10个柱体积，1ml/min 0.02 mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积。上样：上样流速为1ml/min；平衡： 0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)2ml/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用 1ml/min分别在0.25M、0.3M、0.32M、0.34M、0.36M、0.38M、0.40M、0.45M、 0.5M的NaCl进行洗脱,1ml/管收集，得到1个主峰。用纤维平板法检测收集蛋白的活性。

实施例6 HisTrap5mlDesalting脱盐与超滤浓缩

HisTrap5mlDesalting脱盐柱预处理：5个柱体积去离子水5ml/min洗柱；5 个柱体积0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡；上样：上样体积不要超过总体积的20％，洗脱：5ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱1.5个柱体积， 1ml/管收集；柱子的保存：5ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)两个柱体积清洗5ml/min去离子水两个柱体积清洗，5ml/min 20％两个柱体积清洗。

超滤：将所得脱盐样品倒入3K超滤管中，4℃、6000rpm、30min,收集样品。超滤管用去离子水反复冲洗3-5次，滤膜浸入20％乙醇中。

实施例7 酶纯度鉴定及分子量测定

采用SDS-PAGE电泳方法对分离得到的纤溶酶进行纯度鉴定。

电泳试剂配制：

1)30％丙烯酰胺(Acr)：称丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1～2月。

2)10％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠)：称取SDS 10g，加入100mL蒸馏水。

3)1.5mol/L pH 8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris 18.2g，加入50mL水，用1 mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100mL。

4)1.0mol/L pH 6.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50mL水，用1 mol/L盐酸调pH 6.8，最后用蒸馏水定容至100mL。

5)10％(w/v)过硫酸铵(AP)：1g过硫酸铵，10mL蒸馏水，可在密封的管内4℃存放数月。

6)5×上样缓冲液：量取下列试剂，置于10mL塑料离心管中，加入去离子水溶解后定容至5mL，分装为500μL/份，于室温保存。使用前将每小份中加入25μL 的β-巯基乙醇，可在室温下保存1个月左右。

7)考马斯亮蓝R-250染色液：称取0.5g考马斯亮蓝R-250，置于800mL烧杯中。加入125mL的异丙醇、50mL的冰醋酸和325mL的去离子水，搅拌均匀，倒入密封的瓶子中，室温保存。

8)脱色液：冰乙酸20mL，乙醇80mL，蒸馏水100mL，充分混匀后使用。

9)5×SDS电泳缓冲液：称Tris 3.02g，甘氨酸18.8g，SDS 1g，加入蒸馏水约80mL去离子水使其溶解后定容至200mL，室温保存。

SDS-PAGE电泳浓缩胶浓度为5％(pH 6.8)，分离胶浓度为12％(pH 8.8)，电极缓冲液为Tris-Gly(pH 8.3)。浓缩胶电流7mA，分离胶电流18mA。电泳时间为180min。结束后，切去浓缩胶，在胶的一角做标记。

1)配制12％分离胶10mL，按顺序和量取下列溶液在一个50mL的小烧杯中混匀：

2)配制5％的浓缩胶3mL，按顺序和量取下列溶液在一个50mL的小烧杯中匀：

样品与上样缓冲液4：1体积混合后，离心数秒，沸水浴加入3min，上样量每孔为50μL，以低分子量标准蛋白作为对照。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250 染色30～60min，然后用脱色液脱色，当脱色液的颜色与胶颜色一致时更换脱色液，一般要更换三次，直到背景透明。根据电泳结果判断酶的纯度。

实施例8 pH值对酶稳定性的影响

采用pH 2.2-pH 10.9的广泛缓冲液，配制方法如下：

配制0.2mol/L的甘氨酸200mL，测得其pH值为6.6，取出5mL装入试管中，然后用HCl调pH至5.7、3.6、3.0和2.2时，分别取出5mL缓冲液装入试管中。

配制0.2mol/L的Tris，测得其pH为10.9，然后用HCl调节pH为9.5、9.0、 8.5、8.0和7.4时，分别取出5mL缓冲液装入试管中。用纤维蛋白平板法测定酶活力的变化,37℃恒温培养箱放置12h。

实施例9 温度对酶稳定性的影响

将纤溶酶溶液分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保温2h后，在纤维蛋白平板测定酶活力的变化，37℃恒温培养箱放置12h。各个温度下酶浓度为5mg/mL。

实施例10 抑制剂对酶活力的影响

(1)β-巯基乙醇对PFE的抑制作用

取25μL的β-巯基乙醇与500μL的浓度为5mg/mL的SFE溶液中，混匀，取40μL加入纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

(2)EDTA对PFE的抑制作用

配制0.025mol/L的EDTA溶液50mL，由于溶解不充分加入0.3g的 NaOH。称取SFE2.5mg溶于EDTA溶液500μL，加入纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

(3)PMSF(苯甲基磺酰氟)对SFE的抑制作用

取100m M的PMSF 20ul加入到200ul的浓度为5mg/ml的SFE的溶液中，混匀，取40ul加入纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

(4)抑肽酶对SFE的抑制作用

取100ug/ml的抑肽酶20ul加入到200ul的浓度为5mg/ml的SFE的溶液中，混匀，取40ul加入到纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

实施例11 金属离子对酶活力的影响

(1)Ca²⁺对SFE的抑制作用研究

配制0.025mol/mL的CaCl2溶液50mL，称取PFE 2.5mg溶于500μL的 CaCl2溶液中，取40ul加入到纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

(2)Mg²⁺对SFE的抑制作用

配制0.025mol/mL的MgCl2溶液，取0.254g的MgCl2·6H2O溶于50mL蒸馏水中，称取PFE 2.5mg溶于500μL的MgCl2溶液中，取40ul加入到纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

(3)Fe²⁺对SFE的抑制作用

配制0.025mol/mL的FeSO4溶液50mL，称取PFE 2.5mg溶于500μL的 FeSO4溶液中,取40ul加入到纤维平板的小空中,37℃恒温培养12h。

(4)K⁺对SFE的抑制作用

配制0.025mol/mL的KCl溶液50Ml,称取SFE 2.5mg溶于500μL的KCl溶液中,取40ul加入到纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

(5)Fe³⁺对SFE的抑制作用

配制0.025mol/mL的FeCl3溶液50mL，称取PFE 2.5mg溶于500μL的FeCl3 溶液中，取40ul加入到纤维平板的小空中，37℃恒温培养12h。

实施例12 方格星虫纤溶酶的直接活力测定

加热平板的制作：将标准平板放入80℃烘箱中放置30min，冷凝后即成不含纤溶酶原活性的平板。加入100U的尿激酶(40ul)作为阳性对照，以验证平板中是否有残余的纤溶酶原。纯化好的蛋白(浓度为Xmg/mL)40μL放入加热平板上， 37℃保温18h后测量水解圈直径大小，以水解圈两直径乘积的对数代入标准曲线得SFE直接降解纤维蛋白的纤溶活力。

实施例13 方格星虫纤溶酶纤维蛋白原降解机理实验

牛纤维蛋白原α链的分子量为63.5kDa，β链的分子量为56kDa，γ链的分子量是47kDa。由SDS-PAGE电泳结果分析，α链在很短的时间内完全降解，β链在30min内完全降解，γ链是最后一个被水解的亚基，2h时仍未完全降解。图中，1为蛋白分子量Marker，2-9依次为0，1min，3min，5min，10min， 30min，1h，2h，3h取样的电泳结果。结果说明了，SFE可以用于溶栓治疗，或许也可以用于预防血栓的发生。

实施例14 体外溶栓实验

1)从小鼠的眼球取血5mL置于血清管中，4℃放置自然凝固，用滤纸吸干血块表面，分别称取50mg天然小鼠全血凝血块加入九个EP管中。

2)实验设阴性对照生理盐水组，阳性对照尿激酶组(2000U/mL)和实验SFE 组(2000U/mL)，每组做三个生物学重复。

3)在已加入血块的EP管中分别加入1mL对应的溶液，37℃恒温孵育，分别在1，2，3，4h后称量剩余的血块质量，计算血块的溶解率。

4)用移液器取SFE组在不同时间段的溶液滴于载玻片上，涂片，盖上载玻片，观察细胞的释放量和细胞形态。

实施例15 体内溶栓实验

采用角叉菜胶致小鼠尾部血栓模型。选用临床常用的尿激酶作为阳性对照，阴性对照为生理盐水组，实验组为SFE酶液。各受试组酶活力单位统一用尿激酶标准品纤溶活力标准曲线进行标定。

(1)雄性昆明种小鼠40只，体重25±2g，由福州大学吴氏动物中心提供。小鼠饲养环境为饲养温度20±2℃，湿度50～60％，光照12h。随机分为5组，即正常对照组(5只)、高剂量PFE给药组(5只)、低剂量SFE给药组(5只)、尿激酶阳性对照组(5只)和血栓模型组(5只)。

(2)麻醉剂：2％戊巴比妥钠(注射用生理盐水溶解)，按8mL/kg腹腔注射麻醉小鼠。

(3)2％角叉菜胶溶液的配制：称取1g角叉菜胶溶于50mL的生理盐水中，沸水浴至完全溶解，37℃恒温水浴备用。

(4)SFE溶液配制：实验用SFE的比活力为2001.32U/mg，取10mg SFE蛋白冻干粉溶于10mL生理盐水中，配制成1mg/mL的SFE溶液。

(5)尿激酶的配制：将一瓶10万单位的注射用尿激酶溶于50mL的生理盐水中，则得到2000U/mL的尿激酶。

除了正常对照组以外，其他各组均在小鼠腹部腹腔注射2％角叉菜胶溶液，注射剂量为200μL/10g。正常对照组的小鼠在其腹部腹腔注射生理盐水，注射剂量为200μL/10g注射生理盐水或角叉菜胶后，小鼠饲养于20±2℃条件下。48h 后，观察小鼠尾部出现淤血、变黑，挑选成型小鼠备用。

注射用尿激酶临床治疗急性脑血栓及外周动静脉栓塞每天2万～4万单位，一次给药，根据人与动物药量换算表(60kg/人)小鼠的用药量为人的9倍，计算可得25g小鼠的用药剂量范围为75～150U。实验阳性对照选择为注射尿激酶剂量100U/25g。

实施例16天然方格星虫纤溶酶序列的测定

该实验采用串联质谱法，由上海中科新生命生物科技有限公司使用QE质谱仪对样品进行测定，其试验方法为：

(1)供试品酶解：

供试品经过还原和烷基化处理后，加入胰酶(质量比1:50)，在37℃条件下酶解20小时。酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1％甲酸的乙腈水溶液中，-20℃保存待用。

(2)质谱分析：

A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱为95％的A液平衡后，样品由自动上样器至Trap柱。0.5H梯度。

(3)质谱数据采集：

多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集；每次扫描后采集20个碎片图谱(MS2scan)。

(4)数据分析：

质谱测试原始文件用Mascot2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 许瑞安

<120> 一种天然方格星虫纤溶酶的制备方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ile Val Gly Gly Gln Asp Ala Thr Arg

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Leu Thr Ala Ala His Cys

1 5

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Val Leu Ala Gly Ala His Val Ser Ala Gly Asp Gln Glu Gln Gln Ser

1 5 10 15

Asp Val Ala

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Leu Ser Gln Trp Gln Lys Leu

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gly Asp Ser Gly Gly Pro

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Val Ser Tyr Phe Arg

1 5

Claims (10)

1.一种方格星虫纤溶酶，其特征在于，其部分氨基酸序列为SEQ ID NO:1-6所示。

2.权利要求书1所述的方格星虫纤溶酶，其特征在于，由以下方法制备得到：取方格星虫肠组织，加入一定体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆，取出于4℃，10000rpm冷冻离心20min，添加硫酸铵使其终浓度达到90％，可见有大量蛋白析出，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，收集沉淀。收集的沉淀于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解，0.22微米滤膜过滤。Sephadex G-25脱盐；洗脱得到蛋白用2ml/min分别在0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M的NaCl进行DEAE Sepharose Fast Flow层析；洗脱得到的蛋白Superdex75 10/300GL凝胶过滤层析，所得蛋白用1ml/min分别在0.25M、0.3M、0.32M、0.34M、0.36M、0.38M、0.40M、0.45M、0.5M的NaCl进行MonoQ 5/50GL层析洗脱，脱盐与超滤浓。

3.权利要求书1所述的方格星虫纤溶酶，其特征在于，比活力达2001.32U/mg，纯化倍数为6.16，回收率10.9％，相对分子质量为24925.00Da。

4.权利要求书1所述的方格星虫纤溶酶，其特征在于，最适反应pH范围在6.6～9.0；在20℃～40℃下，酶活力保持相对稳定；属于丝氨酸蛋白酶家族。

5.权利要求书1所述的方格星虫纤溶酶，其特征在于，其具有靶向降解纤维蛋白原的的功能，其降解先后顺序为α链>β链>γ链。

6.权利要求书1所述的方格星虫纤溶酶在制备预防和\或治疗血栓的药物中的应用。

7.权利要求1所述的方格星虫纤溶酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取方格星虫肠组织，加入一定体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆，取出于4℃，10000rpm冷冻离心20min，添加硫酸铵使其终浓度达到90％，可见有大量蛋白析出，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，收集沉淀。收集的沉淀于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解，0.22微米滤膜过滤。Sephadex G-25脱盐；洗脱得到蛋白用2ml/min分别在0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M的NaCl进行DEAE Sepharose Fast Flow层析；洗脱得到的蛋白Superdex75 10/300GL凝胶过滤层析，所得蛋白用1ml/min分别在0.25M、0.3M、0.32M、0.34M、0.36M、0.38M、0.40M、0.45M、0.5M的NaCl进行MonoQ 5/50GL层析洗脱，脱盐与超滤浓。

8.权利要求1所述的方格星虫纤溶酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)硫酸铵沉淀

将新鲜的方格星虫，放在海水中饲养2-3天，排出内脏泥沙，根据活性部位检测的结果，取肠组织，加入一定体积的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，匀浆，取出于4℃，10000rpm冷冻离心20min，弃沉淀，测量上清体积与pH 7.4的饱和硫酸铵混合使溶液中硫酸铵的浓度达到30％，搅拌，放置12h，可见有少量析出物，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，沉淀主要为细胞碎片及其他不溶物质，丢弃，收集上清，继续添加硫酸铵使其终浓度达到90％，可见有大量蛋白析出，4℃，10000rpm，冷冻离心20min，收集沉淀，初步得到蛋白粗制品，

(2)Sephadex G-25脱盐

收集的沉淀于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)溶解，0.22微米滤膜过滤，Sephadex G-25脱盐柱预处理：5个柱体积去离子水5ml/min洗柱；5个柱体积0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡；上样：上样体积不要大于柱体积20％；洗脱：5ml/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱1.5个柱体积，5ml/管集；柱子的保存：5ml/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)两个柱体积清洗5ml/min去离子水两个柱体积清洗，5ml/min 20％两个柱体积清洗，

(3)DEAE Sepharose Fast Flow层析

DEAE柱预处理：2ml/min去离子水清洗10个柱体积，2ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积，上样：样品需过0.22微米滤膜，上样流速为1ml/min；平衡：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)2ml/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用2ml/min分别在0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M的NaCl进行洗脱,1ml/管收集，得到五个主峰，用纤维平板法检测收集蛋白的活性，

(4)Superdex75 10/300GL凝胶过滤层析

Superdex75预处理：0.8ml/min去离子水清洗10个柱体积，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)(含0.15M NaCl)清洗5个柱体积；上样：上一步收集的的活性组分，用3K超滤管4℃、6000rpm、30min,0.8ml/min上样，上样量不要超过柱体积的2％；洗脱：用0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)(含0.15mol/L NaCl)0.8ml/min洗脱1.5个柱体积，1ml/管收集，

(5)MonoQ 5/50GL层析

MonoQ 5/50GL预处理：1ml/min去离子水清洗10个柱体积，1ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积，上样：上样流速为1ml/min；平衡：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)2ml/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用1ml/min分别在0.25M、0.3M、0.32M、0.34M、0.36M、0.38M、0.40M、0.45M、0.5M的NaCl进行洗脱,1ml/管收集，得到1个主峰，用纤维平板法检测收集蛋白的活性，

(6)HisTrap5mlDesalting脱盐与超滤浓缩

HisTrap5mlDesalting脱盐柱预处理：5个柱体积去离子水5ml/min洗柱；5个柱体积0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡；上样：上样体积不要超过总体积的20％，洗脱：5ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)洗脱1.5个柱体积，1ml/管收集；柱子的保存：5ml/min 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)两个柱体积清洗5ml/min去离子水两个柱体积清洗，5ml/min 20％两个柱体积清洗，

超滤：将所得脱盐样品倒入3K超滤管中，4℃、6000rpm、30min,收集样品，超滤管用去离子水反复冲洗3-5次，滤膜浸入20％乙醇中。

9.一种药物组合物，其特征在于，以权利要求书1所述的方格星虫纤溶酶为活性成分，与药学上可接受的载体所组成。

10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，制备成任何可药用的剂型。