CN116103270A - 基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法及其纤溶酶和应用 - Google Patents

基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法及其纤溶酶和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法及其纤溶酶和应用。本发明包含以下步骤：(1)在含星虫纤溶酶的原液中添加80～90％的硫酸铵，静置过夜沉淀；(2)Tris‑HCl缓冲液重悬上述沉淀，将重悬液流过经Tris‑HCl缓冲液平衡好的赖氨酸‑琼脂糖凝胶层析柱或精氨酸‑琼脂糖凝胶层析柱，再进行NaCl梯度洗脱，收集洗脱液；(3)用3kD超滤管对收集洗脱液进行浓缩及脱盐，得到高纯纤溶酶制品。本发明纯化步骤少、设备要求低、成本低、纯度高，且获得的纤溶酶具有很好的纤溶活性。

Description

基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法及其纤溶酶和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及星虫纤溶酶的亲和层析制备方法。
背景技术
现代社会，我国国民心脑血管疾病发生率有明显的持续上升迹象，这与现代人作息习惯、饮食方式的改变有关，同时伴随着人口老龄化和城市化的趋势，心脑血管疾病将会是全社会持续关注的热点。其中，血栓引起的心脑血管栓塞类疾病是严重危害中老年人的疾病之一，且研究显示血栓类疾病发病逐渐呈现年轻化趋势。血栓类疾病具有发病快、病程长、易复发、致残率和病死率高的特点，严重威胁患者的生命安全。血栓是指血液中的不溶性纤维蛋白、血细胞和血小板等有形成分聚集而成的血管表面小块或者内面脱落物，血栓在血液中流动的过程中造成血管部分或者全部堵塞会引发血栓栓塞。目前多项研究也已经证实血栓形成后会使血管发生阻塞或狭窄，进而造成心肌细胞缺氧、缺血或坏死。在心脑血管疾病中血栓栓塞性疾病是十分常见的一种，其临床病状表现常为肺梗死、心肌梗死、心力衰竭、脑栓塞、肾栓塞、脾栓塞等。血栓可以栓塞血管导致心脑血管疾病，心血管疾病引发的组织或器官缺血、缺氧、坏死又会形成血栓，如动脉粥样硬化可能导致静脉血栓且二者之间相互影响，最终形成恶性循环。
血栓产生的机理，主要是凝血蛋白和血细胞在不同的病原诱导下、彼此相互作用下产生的，根据发病机制、形成部位的差异，血栓形成的机理也不同。但是血栓形成的原因主要有三因素：血流状态变化、血液成分改变和血管内皮功能异常。血液流动状态异常时，即血流发生瘀滞或者湍流时，血液流速和方向发生改变使得血小板进入边流，增高了血小板同血管内皮接触的机率，血小板的激活导致异常黏附发生，这是造成血栓的主要原因，且血液瘀滞比湍流更容易产生血栓。当人体内血管发生破裂，内、外源凝血机制受到激活，血液便会立即在血管受损的地方凝固，通过产生纤维蛋白网以填充各种血细胞构成血栓来达到止血的目的，保证内皮的完整性是有效抑制血栓形成的途径。血管内皮细胞(Endothelial cells，ECs)受损将影响分泌内皮素(Endothelin，ET)，内皮素可以调控内皮细胞的收缩功能，内皮素紊乱将导致血管内皮持续收缩引发血液血流瘀滞进而促成血栓形成。血液成分改变即是凝血状态的改变其主要包括凝血系统和纤溶系统的抑制与激活，血管内皮损伤与血流状态变化导致或加剧了人体血管中凝血状态的改变，而人体凝血状态的改变导致产生血栓。根据血栓的病发部位还可以分为两大类，静脉血栓和动脉血栓。静脉血栓主要成分为红细胞和纤维蛋白，大部分以新鲜血栓的形式出现在静脉内。如深静脉血栓，肺栓塞等都属于静脉血栓。动脉血栓细分为心肌梗塞，外周动脉血栓和脑梗。动脉血栓主要成分由血小板和纤维蛋白组成，在血流较快的部位形成，如心脏瓣膜和动脉内。
目前用于血栓类疾病的治疗手段主要为外科手术和溶栓治疗，同时辅以保守疗法。保守疗法是指长期服用抗血栓药物。这类血栓治疗药物根据作用方式，分为抗血小板药物、抗凝血药物、溶栓药物和降血压药物。抗血小板药物通过阻碍血小板发生粘附、释放和聚集的过程从而预防血栓的形成以达到治疗的目的。抗凝血药物通过影响凝血系统中的凝血因子阻断凝血酶的生成，最终达到防止血栓生成的作用，以此来进行治疗。降血压药物主要作用是舒张血管。外科手术疗法的风险很大，手术部位的血管变薄，容易导致血管破裂出血的风险。目前最安全的最有效也最可靠的治疗方法是溶栓治疗。溶栓药物治疗方法包括导管接触性溶栓(Catheter-directed thrombolysis，CDT)和系统溶栓，药物通过导管接触性溶栓直接进入静脉中作用于血栓，也可由系统溶栓经外周静脉全身给药。当今用于临床治疗的药物有尿激酶，组织型纤溶酶原激活剂等，但目前临床上用于溶栓的药物都存在着半衰期短，靶向性低，容易引发内出血等问题，临床治疗中迫切需要一种可以长期服用且安全、有效的药物用于治疗血栓类疾病。
方格星虫属于方格星虫目、星虫科、方格星虫属，又被称光裸星虫、裸体方格星虫，沿海地区俗称沙虫、海人参。全球的星虫门类约有150种，在我国方格星虫主要分布在北海、福建、广东、广西等地区，广西北部湾资源最为丰富。方格星虫内富含必需氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质和维生素等，因其肉质鲜美、营养丰富被作为药膳食材。中医认为方格星虫性寒、味甘，具有滋阴补阳、活血祛瘀、强身健体的功效，可以治疗胸闷痰多、肺虚喘咳、脾虚肾亏、神经衰弱等症状。现代研究发现方格星虫的活性成分具有抗衰老、抗氧化、抗疲劳、提升记忆力的功效。方格星虫在闽南地区深受喜爱，是传统小吃土笋冻的主要材料，有悠久的食用历史，被闽南人称为“海洋虫草”、“动物海参”。方格星虫多个部位含有大量的纤溶酶活性，其中肠腔及肠腔液的纤溶活性最高，从其中能纯化出天然动物纤溶酶，对血栓栓块中的纤维蛋白具有很高的结合活性，不仅具有纤溶活性和激酶活力，还表达出体外降解血栓的能力，作为溶栓药物具有很大的研发前景。
此前方格星虫纤溶酶的纯化工艺需要经过脱盐柱、阴离子交换柱和分子筛等步骤，工艺成本大、消耗时间长且纯化效率低。因此，还有必要进一步改进方格星虫纤溶酶的纯化工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法及其纤溶酶和应用。本发明经过对方格星虫纤溶酶进行结晶分析，通过分子模拟对接实验发现纤溶酶氨基酸中存在赖氨酸和精氨酸结合活性位点，由此设计出方格星虫纤溶酶赖氨酸亲和纯化工艺路线和方格星虫纤溶酶精氨酸亲和纯化工艺路线，以期提高天然海洋动物纤溶酶纯化产率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法，星虫纤溶酶的粗提液用赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱或精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱进行亲和层析，上样流速为0.8～1.2mL/min；上样后先用pH 7.8～8.2的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液以1.8～2.2mL/min的流速清洗平衡4～6个柱体积，再用0.14～0.16M、0.24～0.26M、0.34～0.36M、0.44～0.46M、0.54～0.56M、0.64～0.66M的NaCl溶液以0.8～1.2mL/min的流速依次进行分段洗脱，各洗脱4～6个柱体积；收集0.14～0.16M的NaCl溶液洗脱主峰对应样品，用3K超滤管超滤浓缩及脱盐，得到纯化的纤溶酶。
优选地，所述星虫纤溶酶的粗提液的制备方法包括：在含人工或天然星虫纤溶酶的原液中加入饱和硫酸铵溶液，使溶液中硫酸铵的浓度达到80～90％，搅拌混匀后0～5℃放置至少12h；离心收集沉淀，用pH 7.3～7.5的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，得到星虫纤溶酶的粗提液。
优选地，所述含人工或天然星虫纤溶酶的原液为星虫的肠组织和/或肠腔液经匀浆处理得到。其中，所述天然星虫纤溶酶指的是星虫中所含有的天然的纤溶酶，所述人工的星虫纤溶酶指的是利用重组表达等人工合成手段获得的纤溶酶。
优选地，所述星虫为方格星虫。
优选地，所述赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱在上样前经过预处理，所述预处理方法包括：先用ddH2O以0.8～1.2mL/min的流速清洗8～12个柱体积，再用pH 7.8～8.2的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液以0.8～1.2mL/min的流速清洗4～6个柱体积。
优选地，所述精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱在上样前经过预处理，所述预处理方法包括：先用ddH2O以0.8～1.2mL/min的流速清洗8～12个柱体积，再用pH 7.8～8.2的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液以0.8～1.2mL/min的流速清洗4～6个柱体积。
优选地，所述星虫纤溶酶的粗提液过0.22μm滤膜过滤后再上样。
优选地，所述超滤浓缩及脱盐为在0～5℃、5500～6500rpm离心处理1～2h。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种根据上述的方法所制备的纤溶酶。
进一步地，所述纤溶酶可以为天然的纤溶酶或重组表达的纤溶酶。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种根据上述的方法所制备的纤溶酶在制备血栓治疗或预防药物中的应用。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±20％范围内。
本发明中，除有特别说明或在领域内有通用意义外，％均为质量百分比，比例均为质量比。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
(1)本发明经过对方格星虫纤溶酶进行结晶分析，通过分子模拟对接实验发现纤溶酶氨基酸中存在赖氨酸结合活性位点和精氨酸结合活性位点，由此设计出方格星虫纤溶酶的亲和纯化工艺路线。
(2)本发明制备过程简单，可以在大规模生产过程中有效降低能耗从而降低生产成本。
(3)本发明制备得到的纤溶酶蛋白在SDS-PAGE中为单一条带。
(4)本发明有效得到了一种方格星虫纤溶酶，具有很好的纤溶活性，具有作为抗血栓药物的的潜在研究价值。
附图说明
图1为方格星虫肠腔液硫酸铵沉淀后赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析梯度洗脱图。
图2为赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析电泳图(M.Marker；1.硫酸铵沉淀粗提液；2.赖氨酸-琼脂糖凝胶0.15M NaCl洗脱)。
图3为纤维蛋白平板检测赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析洗脱峰蛋白活力图(左上1.生理盐水；右上2.尿激酶；左下3.赖氨酸-琼脂糖凝胶0.15M NaCl洗脱；右下4.硫酸铵沉淀粗提液)。
图4为方格星虫肠腔液硫酸铵沉淀后精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析梯度洗脱图。
图5为精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析电泳图(M.Marker；1.硫酸铵沉淀粗提液；2.精氨酸-琼脂糖凝胶0.15M NaCl洗脱)。
图6为纤维蛋白平板检测精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析洗脱峰蛋白活力图(左上1.尿激酶；右上2.生理盐水；左下3.硫酸铵沉淀粗提液；右下4.精氨酸-琼脂糖凝胶0.15MNaCl洗脱)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析
1)纤溶酶粗提液的制备
将购买的新鲜方格星虫解剖取肠组织及其肠腔液，加入一定体积的0.02mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.4)，组织匀浆，于4℃，10000rpm冷冻离心0.5h，弃沉淀。测量上清体积与饱和硫酸铵溶液混合使溶液中硫酸铵的浓度达到90％，于4℃条件下放置12h后有大量蛋白析出，于4℃，10000rpm冷冻离心0.5h，收集沉淀。于少量0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)溶解，初步得到含有蛋白粗制品的纤溶酶粗提液。
2)赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析
将初步得到的含有蛋白粗制品的纤溶酶粗提液，通过0.22μm滤膜过滤待用。在5mL层析空柱中填装适量的赖氨酸-琼脂糖凝胶层析介质(索莱宝，S8911)制备赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱。
赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱预处理：1mL/min ddH2O清洗10个柱体积，1mL/min0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积，上样：纤溶酶粗提液样品需过0.22μm滤膜，上样流速为1mL/min；平衡：0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)2mL/min清洗五个柱体积；洗脱：分步洗脱：用1mL/min分别在0.15M、0.25M、0.35M、0.45M、0.55M、0.65M的NaCl进行洗脱，各洗脱5个柱体积，得到主峰的位置用5mL EP管收集。色谱图如图1，可以看出大部分杂质被平衡液洗脱下来(峰1)，目的蛋白出现在0.15M NaCl洗脱中(峰2)。之后随着NaCl浓度的上升，并未出现新的洗脱峰，表明目的蛋白主要在峰2中。因此，收集0.15M NaCl洗脱主峰。
超滤：将所得0.15M洗脱主峰蛋白样品倒入3K超滤管中，4℃、6000rpm、1.5h超滤浓缩及脱盐，收集样品，得高纯度纤溶酶制品。超滤管用ddH2O反复冲洗3～5次，滤膜浸入20％乙醇中。
3)纤溶酶纯度鉴定
采用SDS-PAGE电泳方法对分离得到的纤溶酶进行纯度鉴定电泳方法参照Laemmli方法进行，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％。
电泳试剂配制：
(1)1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液：称取Tris 93.55g加入400mL去离子水充分搅拌溶解，用1mol/L氢氧化钠调节至pH 8.8，后定容至500mL。
(2)1.0mol/L Tris-HCl(pH 6.8)缓冲液：称取Tris 30.275g，加入200mL去离子水，1mol/L盐酸调节至pH 6.8，最后定容至250mL。
(3)10％(w/v)SDS：称取SDS 12.5g，加入125mL去离子水充分搅拌溶解。
(4)10％(w/v)过硫酸铵(APS)：称取0.15g过硫酸铵加入1.5mL去离子水反复震荡溶解，避光保存，可于4℃条件下存放数月。
(5)5×上样缓冲液(5×Loading buffer)：吸取2.5mL的甘油和1.25mL的1M Tris(pH6.8)，加入25mg的溴酚蓝和0.5g的SDS将其充分混匀，溶解后定容至5mL，分装为1mL份，于室温保存。使用前将每小份中加入50μL的β-巯基乙醇，可在室温下保存1个月左右。
(6)10×SDS-PAGE电泳缓冲液(10×Tris-Glycine Buffer)：称取9.06g的Tris，56.4g的甘氨酸，3g的SDS，加入约250mL的去离子水使其溶解后定容至300mL，室温保存。
按照如下表1的材料与顺序配制5mL 12％ SDS-PAGE分离胶。
表1 12％分离胶配制配方
Figure BDA0004075878790000081
按照如下表2的材料与顺序配制2mL 5％ SDS-PAGE浓缩胶。
表2 5％浓缩胶配制配方
Figure BDA0004075878790000082
将5×Loading buffer同样品按照样品与上样缓冲液4：1体积混合后，离心数秒，沸水浴(95℃)5min。将10×电泳缓冲液加水稀释为1×，将玻璃板固定于电泳槽中，加1×电泳缓冲液至适当水位，拔出梳子后用电泳上样枪头上样25μL。分离胶时设置电压为65V，待色预染蛋白分子量标准跑出彩色条带时，说明蛋白已经进入至分离胶中，改用100V电压继续跑。跑到距离玻璃板底部0.5cm时停止电泳。
取下玻璃板，取出SDS-PAGE胶，切除周围没有目的蛋白的多余的胶，在胶的一角做标记。使用碧云天(Beyotime)快速银染试剂盒(Fast Silver Stain Kit)对SDS-PAGE胶进行银染后置于化学发光成像仪器内白光拍照。结果如图2，可以看出在硫酸沉淀粗提液有5条25-35kD的蛋白条带(1号孔)，在0.15M NaCl洗脱峰中只有2条25kD的蛋白条带，说明了我们建立的赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析条件能够实现纤溶酶的亲和层析，纯度可达91.2％。
4)纤溶酶活性鉴定
称取25mg人纤维蛋白原加入1.25mL生理盐水中，并放入培养箱内37℃，30min条件使其完全溶解。取100U的凝血酶(500U/mL)用1.05mL生理盐水稀释，并置于冰上待用；称量0.5g琼脂糖加到22.5mL 0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中，于100mL的三角烧瓶中混匀后经微波炉加热70s完全融化，冷却到50℃左右后，先加入人纤维蛋白原稀释液摇匀，后立即加入凝血酶稀释液，迅速摇匀，后均匀铺倒60mm培养皿上，凝固后用封口膜封好，置于4℃待用。在标准纤维蛋白平板上打出直径为3mm的小孔，每孔加入10μL待测样品溶液(分别为赖氨酸-琼脂糖凝胶的0.15M NaCl洗脱液，以及硫酸铵沉淀得到的纤溶酶粗提液)，加入10,000U/mL的尿激酶10μL作为阳性对照，生理盐水10μL作为阴性对照并将平板置于培养箱37℃孵育18h。结果如图3，可以看出阴性对照组生理盐水没有纤溶圈(孔1)，阳性对照组尿激酶出现较小纤溶圈(孔2)，赖氨酸-琼脂糖凝胶的0.15M NaCl洗脱液出现较大纤溶圈(孔3)，硫酸铵沉淀得到的纤溶酶粗提液出现最大纤溶圈(孔4)。孔3纤溶圈略小于孔4纤溶圈，说明了在赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析过程中纤溶酶含量的损失非常小，绝大部分的纤溶酶成功的被亲和纯化出来。纯化收率高达83％。
实施例2精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析
1)纤溶酶粗提液的制备
将购买的新鲜方格星虫解剖取肠组织及其肠腔液，加入一定体积的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，组织匀浆，于4℃，10000rpm冷冻离心0.5h，弃沉淀。测量上清体积与饱和硫酸铵溶液混合使溶液中硫酸铵的浓度达到90％，于4℃条件下放置12h后有大量蛋白析出，于4℃，10000rpm冷冻离心0.5h，收集沉淀。于少量20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)溶解，初步得到含有蛋白粗制品的纤溶酶粗提液。
2)精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析
将初步得到的含有蛋白粗制品的纤溶酶粗提液，通过0.22μm滤膜过滤待用。在5mL层析空柱中填装适量的精氨酸-琼脂糖凝胶层析介质(索莱宝，S4560)制备精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱。
精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱预处理：1mL/min去离子水清洗10个柱体积，1mL/min 20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗5个柱体积，上样：纤溶酶粗提液样品需过0.22μm滤膜，上样流速为1mL/min；平衡：20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)2mL/min清洗五个柱体积；洗脱：分部洗脱：用1mL/min分别在0.15M、0.25M、0.35M、0.45M、0.55M、0.65M的NaCl进行洗脱，各洗脱5个柱体积，得到主峰的位置用5mL EP管收集。色谱图如图4，可以看出部分杂质被平衡液洗脱下来(峰1)，目的蛋白出现在0.15M NaCl洗脱中(峰2)。之后随着NaCl浓度的上升，并未出现新的洗脱峰，表明目的蛋白主要在峰2中。因此，收集0.15M NaCl洗脱主峰。
超滤：将所得0.15M洗脱主峰蛋白样品倒入3K超滤管中，4℃、6000rpm、1.5h浓缩，收集样品，得高纯度纤溶酶制品。超滤管用去离子水反复冲洗3～5次，滤膜浸入20％乙醇中。
3)纤溶酶纯度鉴定
采用SDS-PAGE电泳方法对分离得到的纤溶酶进行纯度鉴定电泳方法参照Laemmli方法进行，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％。
电泳试剂配制：
(1)1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液：称取Tris 187.1g加入800mL去离子水充分搅拌溶解，用1mol/L氢氧化钠调节至pH 8.8，后定容至1L。
(2)1.0mol/L Tris-HCl(pH 6.8)缓冲液：称取Tris 60.55g，加入400mL去离子水，1mol/L盐酸调节至pH 6.8，最后定容至500mL。
(3)10％(w/v)SDS：称取SDS 20g，加入200mL去离子水充分搅拌溶解。
(4)10％(w/v)过硫酸铵(APS)：称取0.1g过硫酸铵加入1mL去离子水反复震荡溶解，避光保存，可于4℃条件下存放数月。
(5)5×上样缓冲液(5×Loading buffer)：吸取5mL的甘油和2.5mL的1M Tris(pH6.8)，加入50mg的溴酚蓝和1g的SDS将其充分混匀，溶解后定容至10mL，分装为1mL份，于室温保存。使用前将每小份中加入50μL的β-巯基乙醇，可在室温下保存1个月左右。
(6)10×SDS-PAGE电泳缓冲液(10×Tris-Glycine Buffer)：称取15.1g的Tris，94g的甘氨酸，5g的SDS，加入约400mL的去离子水使其溶解后定容至500mL，室温保存。
按照如下表3的材料与顺序配制5mL 12％ SDS-PAGE分离胶。
表3 12％分离胶配制配方
Figure BDA0004075878790000111
按照如下表4的材料与顺序配制2mL 5％ SDS-PAGE浓缩胶。
表4 5％浓缩胶配制配方
Figure BDA0004075878790000112
将5×Loading buffer同样品按照样品与上样缓冲液4：1体积混合后，离心数秒，沸水浴(95℃)5min。将10×电泳缓冲液加水稀释为1×，将玻璃板固定于电泳槽中，加1×电泳缓冲液至适当水位，拔出梳子后用电泳上样枪头上样25μL。分离胶时设置电压为60V，待色预染蛋白分子量标准跑出彩色条带时，说明蛋白已经进入至分离胶中，改用110V电压继续跑。跑到距离玻璃板底部0.5cm时停止电泳。
取下玻璃板，取出SDS-PAGE胶，切除周围没有目的蛋白的多余的胶，在胶的一角做标记。使用碧云天(Beyotime)快速银染试剂盒(Fast Silver Stain Kit)对SDS-PAGE胶进行银染后置于化学发光成像仪器内白光拍照。结果如图5，可以看出在硫酸沉淀粗提液中有5条25 -35kD的蛋白条带(1号孔)，在0.15M NaCl洗脱峰中只有1条25kD的蛋白条带，说明了我们建立的精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析条件能够实现纤溶酶的亲和层析，纯度可达99.5％。
4)纤溶酶活性鉴定
称取50mg人纤维蛋白原加入2.5mL生理盐水中，并放入培养箱内37℃，30min条件使其完全溶解。取200U的凝血酶(500U/mL)用2.1mL生理盐水稀释，并置于冰上待用；称量1g琼脂糖加到45mL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中，于100mL的三角烧瓶中混匀后经微波炉加热120s完全融化，冷却到50℃左右后，先加入人纤维蛋白原稀释液摇匀，后立即加入凝血酶稀释液，迅速摇匀，后均匀铺倒60mm培养皿上，凝固后用封口膜封好，置于4℃待用。在标准纤维蛋白平板上打出直径为3mm的小孔，每孔加入10μL待测样品溶液(分别为精氨酸-琼脂糖凝胶的0.15M NaCl洗脱液，以及硫酸铵沉淀得到的纤溶酶粗提液)，加入10,000U/mL的尿激酶10μL作为阳性对照，生理盐水10μL作为阴性对照并将平板置于培养箱37℃孵育18h。结果如图6，可以看出阴性对照组生理盐水没有纤溶圈(孔2)，阳性对照组尿激酶出现较小纤溶圈(孔1)，精氨酸-琼脂糖凝胶的0.15M NaCl洗脱液出现较大纤溶圈(孔4)，硫酸铵沉淀得到的纤溶酶粗提液出现最大纤溶圈(孔3)。孔4纤溶圈略小于孔3纤溶圈，说明了在精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析过程中纤溶酶含量的损失非常小，绝大部分的纤溶酶成功的被亲和纯化出来。纯化收率高达88％。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法，其特征在于：星虫纤溶酶的粗提液用赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱或精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱进行亲和层析，上样流速为0.8～1.2mL/min；上样后先用pH 7.8～8.2的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液以1.8～2.2mL/min的流速清洗平衡4～6个柱体积，再用0.14～0.16M、0.24～0.26M、0.34～0.36M、0.44～0.46M、0.54～0.56M、0.64～0.66M的NaCl溶液以0.8～1.2mL/min的流速依次进行分段洗脱，各洗脱4～6个柱体积；收集0.14～0.16M的NaCl溶液洗脱主峰对应样品，用3K超滤管超滤浓缩及脱盐，得到纯化的纤溶酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述星虫纤溶酶的粗提液的制备方法包括：在含人工或天然星虫纤溶酶的原液中加入饱和硫酸铵溶液，使溶液中硫酸铵的浓度达到80～90％，搅拌混匀后0～5℃放置至少12h；离心收集沉淀，用pH 7.3～7.5的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，得到星虫纤溶酶的粗提液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含人工或天然星虫纤溶酶的原液为星虫的肠组织和/或肠腔液经匀浆处理得到。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述星虫为方格星虫。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱或精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱在上样前经过预处理，所述预处理方法包括：先用ddH2O以0.8～1.2mL/min的流速清洗8～12个柱体积，再用pH 7.8～8.2的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液以0.8～1.2mL/min的流速清洗4～6个柱体积。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述星虫纤溶酶的粗提液过0.22μm滤膜过滤后再上样。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超滤浓缩及脱盐为在0～5℃、5500～6500rpm离心处理1～2h。
8.一种根据权利要求1至7中任一项所述的方法所制备的纤溶酶。
9.根据权利要求8所述的纤溶酶，其特征在于：所述纤溶酶为天然的纤溶酶或重组表达的纤溶酶。
10.一种根据权利要求1至7中任一项所述的方法所制备的纤溶酶在制备血栓治疗或预防药物中的应用。
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