CN105497868B - 一种林蛙油水溶性蛋白口服液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种林蛙油水溶性蛋白口服液及其制备方法。配方为每1000mL口服液含有林蛙油水溶性蛋白100~50g，矫味剂12.5~5g，防腐剂1~2g。制备方法为林蛙油水溶性蛋白加入到纯化水中，180~220 r/min搅拌至溶解，控制温度10~30℃，再分别加入矫味剂、防腐剂于180~220 r/min转速下搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。本发明所提供的林蛙油口服液在乙醇氧化损伤模型鼠体内具有显著的抗氧化作用，可降低丙二醛（MDA）和蛋白质羰基（PC）含量，升高超氧化物歧化酶（SOD）活力及谷胱甘肽（GSH）含量，最佳有效剂量为10 mL/(kg.d),人体推荐剂量为77 mL/d。
Description
技术领域
本发明属于保健品领域，具体为一种林蛙油水溶性蛋白口服液及其制备方法，该林蛙油口服液具有抗氧化的保健功效。
背景技术
对机体而言，活性氧自由基是一把“双刃剑”，其在生理浓度时广泛参与细胞的信号转导和生命过程，过量时又能引起线粒体氧化应激，从而导致衰老及相关疾病的发生。如何保持细胞内的氧化与抗氧化平衡（氧化还原平衡），既不过度氧化损伤，也不过度抗氧化而影响正常的信号转导，这对健康极为重要。大量研究已证实，人体本身就具有清除多余自由基的能力，这主要靠内源性自由基清除系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原性谷胱甘肽等一些抗氧剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对机体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则在细胞外就可起到防御作用。因此，外源性补充抗氧化剂对于维持正常生理功能及相关疾病的辅助治疗具有积极作用。
基于化学合成的人工抗氧化剂存在毒性大、体内蓄积、不宜长期服用等缺点，相比之下，源于天然产物的抗氧化剂毒性轻微、效果显著、更易耐受，已成为抗氧化市场的主流产品。
林蛙油（Oviductus rana）是我国名贵的中药材，富含高达 50% 以上的蛋白质，还含有丰富的糖类、脂肪、磷脂、维生素、脂肪酸、矿物质及激素等营养成分。《中药大词典》记载：林蛙油具有独特的“补肾益精、润肺养阴”之功效，用于治疗“病后、产后虚弱、肺痨、咳嗽、吐血、盗汗”等症；《中国药物学》记载：蛤蟆油是“润肺、生津、补虚的身体增强剂，是身体衰弱的滋补佳品”。我国林蛙资源丰富，现有技术中已有林蛙油食品制作或林蛙油酶水解肽入药的技术，但对于我国林蛙油资源仍然存在广阔的开发空间，有着巨大的开发价值和市场前景。对于林蛙油如何有效利用，如何开发其各种成分的最佳用途，探索出最佳服用剂量，成为林蛙油产品研究的关键问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种林蛙油水溶性蛋白口服液及其制备方法，以林蛙油水溶性蛋白为活性成分，降低脂溶性成分所引起的不良反应，利于机体吸收，增强保健功能。本发明的目的是由以下技术方案实现的：
一种林蛙油水溶性蛋白口服液，每1000mL所述口服液含有以下重量的各组分：林蛙油水溶性蛋白100~50g，矫味剂12.5~5g，防腐剂1~2g。
进一步的，所述林蛙油水溶性蛋白的制备包括：1）林蛙油水溶性总蛋白的提取和2）林蛙油水溶性蛋白的纯化；所述步骤1）林蛙油水溶性总蛋白的提取的具体步骤为：取林蛙油，加入 pH 6.0 ~ 7.0 的5~10倍量水溶液中搅拌提取3~5 h，压滤，残渣重复提取，合并多次提取液，进行第一次离心处理，取上清液，经中空纤维柱膜过滤，滤液用65~70%硫酸铵沉淀6~12 h，对沉淀进行第二次离心处理，将沉淀置0~10℃蒸馏水透析，至透析液没有沉淀产生，对透析液进行第三次离心处理，得含有林蛙油水溶性总蛋白的上清液。
进一步的，所述步骤2）林蛙油水溶性蛋白的纯化的具体步骤为：将步骤1）中所得含有林蛙油水溶性总蛋白的上清液中加入Amberlite CG50树脂，于20~25℃搅拌吸附2~5h，倾去上层液体，所述树脂用蒸馏水洗涤后上柱，用0.2-0.4 mol/L磷酸氢二钾-0.1-0.3mol/L氯化钾混合液洗脱，流速8 mL/10 min，洗脱液用蒸馏水透析去离子后真空冷冻干燥，得纯化后的林蛙油水溶性蛋白。
进一步的，所述矫味剂为蔗糖、木糖醇、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甘草糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷其中一种或几种的混合物。
进一步的，所述矫味剂为木糖醇或木糖醇与蔗糖、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甘草糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷中其中一种或几种混合物。
进一步的，所述矫味剂为甘草糖浆或甘草糖浆与木糖醇、蔗糖、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷中其中一种或几种混合物。
进一步的，所述防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯中一种或两种复配。
一种林蛙油水溶性蛋白口服液的制备方法，每1000mL所述口服液含有以下重量的各组分：林蛙油水溶性蛋白100~50g，矫味剂12.5~5g，防腐剂1~2g；
具体制备步骤为：按上述组分的重量，取林蛙油水溶性蛋白加入到纯化水中，180~220 r/min 搅拌至溶解，控制温度10~30℃，再分别加入矫味剂、防腐剂于180~220 r/min转速下搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液在制备抗氧化保健食品中的应用。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液的使用方法，所述口服液的服用剂量为体重120kg成人7mL/d。
本发明的有益效果：
1）本发明提供的林蛙油口服液以抗氧化活性最强的水溶性蛋白为活性成分，不仅可提高保健功效，同时能降低脂溶性成分所引起的不良反应。
2）简化口服液配方，除林蛙油水溶性蛋白外，仅加入矫味剂和防腐剂，有效避免多种活性成分配伍所引起的不良相互作用，更有利于单一组分功效的发挥。
3）同时，由于活性成分水溶性良好，有利于口服液稳定性的提高，便于制剂加工、储存、运输，具有产业化开发价值。
4）在乙醇诱导氧化损伤模型小鼠体内，本发明提供的林蛙油水溶性蛋白口服液能显著降低脂质氧化产物丙二醛（MDA）和蛋白质羰基（PC）的含量；升高抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）含量，显示较为理想的抗氧化作用。
具体实施方式
实施例1
一种林蛙油水溶性蛋白口服液，每1000mL所述口服液含有以下重量的各组分：林蛙油水溶性蛋白100~50g，矫味剂12.5~5g，防腐剂1~2g。
其中的林蛙油可购买市售产品
林蛙油水溶性蛋白的制备包括：1）林蛙油水溶性总蛋白的提取和2）林蛙油水溶性蛋白的纯化；步骤1）林蛙油水溶性总蛋白的提取的具体步骤为：取干燥的林蛙油，加入 pH6.0 ~ 7.0 的5~10倍量（重量比）水溶液中搅拌提取3~5 h（优选3h），压滤，残渣重复提取(2次)，合并多次提取液，进行第一次离心处理，4500 r/min离心5~10 min，取上清液，经中空纤维柱膜过滤，滤液用65~70%（优选65%）硫酸铵沉淀6~12 h（优选6h），沉淀进行第二次离心处理，4500 r/min离心5~10 min，将沉淀置0~10℃（优选4℃）蒸馏水透析，用1% BaCl2检验透析液，至透析液没有沉淀产生，将透析液进行第三次离心处理，4500 r/min离心5 min，得含有林蛙油水溶性总蛋白的上清液。
步骤2）林蛙油水溶性蛋白的纯化的具体步骤为：将步骤1）中所得含有林蛙油水溶性总蛋白的上清液中加入过处理的Amberlite CG50树脂（上清液与树脂质量的质量比值为：1：10~1:15），于20~25℃搅拌吸附2~5 h，倾去上层液体，所述树脂用蒸馏水洗涤3次后上柱，用0.2~0.4 mol/L磷酸氢二钾-0.1~0.3 mol/L氯化钾混合液洗脱，流速8 mL/10 min，洗脱液用蒸馏水透析去离子后真空冷冻干燥，得纯化后的林蛙油水溶性蛋白。考马斯亮蓝法测定林蛙油水溶性蛋白质含量为95~97℅；凝胶层析法测定其分子量为20 KDa~13 KDa。树脂处理方法为：取干Amoerlite CG50树脂，水漂洗后加5倍体积l mol/LNaOH搅拌2h，水洗至中性。加5倍体积l mol/L HC1处理2h，水洗至中性，再用pH 4.5 0.1mol/L醋酸缓冲液平衡过夜。
矫味剂为蔗糖、木糖醇、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甘草糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷其中一种或几种的混合物。
矫味剂的一种优选方案为木糖醇或木糖醇与蔗糖、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甘草糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷中其中一种或几种混合物。木糖醇不但甜度高，且不参与人体能量代谢，适合糖尿病患者食用，而且与本发明中的林蛙油水溶性蛋白结合可以有效掩盖其特有的腥味。三氯蔗糖的甜度约是蔗糖的600倍，以木糖醇混合少量三氯蔗糖做为矫味剂可以完全遮盖林蛙油水溶性蛋白的腥味，口感更佳。推荐添加量重量比为林蛙油水溶性蛋白：木糖醇：三氯蔗糖=100~50:10~4.5:2.5~0.5。
矫味剂的另一种优选方案为甘草糖浆或甘草糖浆与木糖醇、蔗糖、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷中其中一种或几种混合物。甘草糖浆中富含的甘草次酸是一种植物源抗氧化剂，可与林蛙油水溶性蛋白发挥协同作用，其口感先甜后甘，可弥补木糖醇单一的甜味，木糖醇和甘草糖浆复配使口服液口感更佳，其中优选的添加重量比为林蛙油水溶性蛋白：木糖醇：甘草糖浆 = 100~50:7~3.5:6~2
防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯中一种或两种复配。防腐剂优选山梨酸钾、尼泊金乙酯或山梨酸钾和尼泊金乙酯复配，山梨酸钾微酸，除起到防腐作用外，还可以起到矫味作用，使口服液酸甜可口，与尼泊金乙酯复配可减少其用量，发挥协同作用，优选的添加量重量比为林蛙油水溶性蛋白：山梨酸钾 =30~25:1；林蛙油水溶性蛋白：尼泊金乙酯 = 55~45:1；林蛙油水溶性蛋白：山梨酸钾：尼泊金乙酯 = 90~110:1:1。
林蛙油水溶性蛋白口服液的制备方法，具体制备步骤为：按上述组分的重量，取林蛙油水溶性蛋白加入到纯化水中，180~220 r/min 搅拌至溶解，控制温度10~30℃，再分别加入矫味剂、防腐剂于180~220 r/min转速下搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
林蛙油水溶性蛋白口服液可应用于在制备抗氧化保健食品中。
本发明林蛙油水溶性蛋白口服液在乙醇诱导氧化损伤模型鼠体内抗氧化的最佳剂量为10 mL/(kg.d)，换算为人体推荐剂量为77 mL/d。
实施例2
在实施例1的基础上进一步改进。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液的各组分重量份数比为：林蛙油水溶性蛋白 50 g,木糖醇 12.5 g, 山梨酸钾 2 g, 纯化水 1000 mL。
实施例3
在实施例1的基础上进一步改进。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液的各组分重量份数比为：
林蛙油水溶性蛋白 50 g, 木糖醇8 g 三氯蔗糖 1.5 g, 尼泊金乙酯 1 g, 纯化水 1000 mL。
实施例4
在实施例1的基础上进一步改进。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液的各组分重量份数比为：
林蛙油水溶性蛋白 50 g, 甘草糖浆 7.5 g, 山梨酸钾 2 g, 纯化水 1000 mL。
实施例5
在实施例1的基础上进一步改进。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液的各组分重量份数比为：
林蛙油水溶性蛋白 50 g, 甘草糖浆 5 g, 樱桃糖浆 2.5g, 山梨酸钾 0.5 g,尼泊金乙酯 0.5 g, 纯化水 1000 mL。
实施例6
在实施例1的基础上进一步改进。
所述林蛙油水溶性蛋白口服液的各组分重量份数比为：
林蛙油水溶性蛋白 50 g, 木糖醇2.5 g, 甘草糖浆2.5 g, 樱桃糖浆1 g, 山梨酸钾2 g, 纯化水 1000 mL。
实施例7
在实施例1的基础上进一步改进。
林蛙油水溶性蛋白 50 g，木糖醇2.5 g，甘草糖浆2.5 g，樱桃糖浆1 g，桂皮糖浆0.5 g，甜菊苷0.5 g，山梨酸钾1 g，尼泊金乙酯（或尼泊金甲酯）1g， 纯化水 1000 mL。
本发明林蛙油水溶性蛋白口服液在乙醇诱导氧化损伤模型小鼠体内的抗氧化实验及结果：
雄性昆明小鼠 60 只，随机分成 6 组，每组 10 只，即空白对照组、 模型对照组、阳性对照组、0.3、3.3、10.0 mL/(kg.d)林蛙油口服液受试组。空白对照组和模型对照组灌胃给予生理盐水，阳性对照组灌胃给予200 mg/(kg.d) 维生素C（VC），其他剂量组每日给予林蛙油口服液，连续喂养30天。最后一天，除空白组外，其他受试组按照 12 mL/kg 一次性灌胃给予50℅乙醇造成氧化损伤模型。造模6小时后，用氯仿麻醉所有实验动物，取血1 ml用于丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定。断颈处死所有实验动物，迅速取出肝脏，用于谷胱甘肽（GSH）和蛋白质羰基（PC）的测定。
实验结果如表1所示，结果表明，模型对照组与空白组对照组相比，小鼠血清中抗氧化酶SOD的活性下降（P ＜ 0.01），抗氧化物质GSH含量下降（P ＜ 0.01），脂质氧化产物MDA和PC的含量升高（P ＜ 0.01），说明乙醇诱导氧化损伤模型造模成功。
三个受试组与模型对照组相比，SOD活力和GSH含量随林蛙油口服液剂量的提高而升高，MDA含量与PC含量随林蛙油口服液剂量的提高而降低。其中，中剂量组（3.3 mL/(kg.d)）和高剂量组（10.0 mL/(kg.d)）的MDA、SOD、GSH、PC与模型对照组相比具有极显著性差异（P ＜ 0.01）；低剂量组（0.3 mL/(kg.d)）的MDA、GSH和PC含量与模型对照组相比有极显著差异（P ＜ 0.01），SOD有显著差异（P ＜ 0.05）。与阳性药对照组VC相比，高剂量林蛙油口服液（10.0 mL/(kg.d)）各方面抗氧化能力均优于VC。
因此，中、高剂量（3.3 mL/(kg.d)、10.0 mL/(kg.d)）的林蛙油口服液在提高抗氧化酶SOD活力，提高抗氧化物质GSH含量，降低脂质氧化产物MDA和PC含量方面，显示出显著的抗氧化能力，其中10.0 mL/(kg.d) 高剂量组同时优于阳性对照组。
Claims (6)
1.一种林蛙油水溶性蛋白口服液，其特征在于：每1000mL所述口服液含有以下重量的各组分：林蛙油水溶性蛋白100~50g，矫味剂12.5~5g，防腐剂1~2g；所述林蛙油水溶性蛋白的制备包括：1）林蛙油水溶性总蛋白的提取和2）林蛙油水溶性蛋白的纯化；所述1）林蛙油水溶性总蛋白的提取的具体步骤为：取林蛙油，加入 pH 6.0 ~ 7.0 的5~10倍量水溶液中搅拌提取3~5 h，压滤，残渣重复提取，合并提取液，进行第一次离心处理，取上清液，经中空纤维柱膜过滤，滤液用65%~70%硫酸铵沉淀6~12 h，进行第二次离心处理，将沉淀置0~10℃蒸馏水透析，至透析液没有沉淀产生，进行第三次离心处理，得含有林蛙油水溶性总蛋白的上清液；所述2）林蛙油水溶性蛋白的纯化的具体步骤为：将1）中所得含有林蛙油水溶性总蛋白的上清液中加入Amberlite CG50树脂，于20~25℃搅拌吸附2~5 h，倾去上层液体，所述树脂用蒸馏水洗涤后上柱，用0.2-0.4 mol/L磷酸氢二钾-0.1-0.3 mol/L氯化钾混合液洗脱，流速8 mL/10 min，洗脱液用蒸馏水透析去离子后真空冷冻干燥，得纯化后的林蛙油水溶性蛋白；按上述组分的重量，取林蛙油水溶性蛋白加入到纯化水中，180~220 r/min 搅拌至溶解，控制温度10~30℃，再分别加入矫味剂、防腐剂于180~220 r/min转速下搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
2.根据权利要求1所述的林蛙油水溶性蛋白口服液，其特征在于：所述矫味剂为蔗糖、木糖醇、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甘草糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷其中一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的林蛙油水溶性蛋白口服液，其特征在于：所述矫味剂为木糖醇或木糖醇与蔗糖、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、甘草糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷中其中一种或几种混合物。
4.根据权利要求1所述的林蛙油水溶性蛋白口服液，其特征在于：所述矫味剂为甘草糖浆或甘草糖浆与木糖醇、蔗糖、三氯蔗糖、橙皮糖浆、枸橼糖浆、樱桃糖浆、桂皮糖浆、甜菊苷中其中一种或几种混合物。
5.根据权利要求1所述的林蛙油水溶性蛋白口服液，其特征在于：所述防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯中一种或两种。
6.权利要求1所述林蛙油水溶性蛋白口服液在制备抗氧化保健食品中的应用。
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