CN110218754A - 一种抗氧化肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗氧化肽的制备方法，属于生物技术领域，包括以下步骤：1)将西番莲果肉与水水磨后加入复合蛋白酶与酶解助剂酶解，灭酶得酶解液；2)将酶解液固液分离，取液相超滤，小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物；3)以水复溶浓缩提取物，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到西番莲抗氧化肽粗品；4)西番莲抗氧化肽粗品经二次纯化即得抗氧化肽纯品。有益效果为：本制备方法可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗，抗氧化肽纯品中西番莲抗氧化肽的纯度较高，其对DPPH自由基和羟自由基的清除率可达90％以上，具有较高的经济价值。

Description

一种抗氧化肽的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗氧化肽的制备方法。
背景技术
西番莲(Passiflora caerulea L.)，为多年生常绿攀缘木质藤本植物，是一种芳香可口的水果，有“果汁之王”的美誉。又名百香果、受难果、巴西果、藤桃、热情果、转心莲、西洋鞠，转枝莲、洋酸茄花、时计草。西番莲茎圆柱形并微有棱角，无毛；叶纸质，基部心形，掌状5深裂，中间裂片卵状长圆形，两侧裂片略小，无毛、全缘；聚伞花序退化仅存1花，与卷须对生，花大，淡绿色；浆果卵圆球形至近圆球形，熟时橙黄色或黄色；种子多数，倒心形，长约5mm。花期5～7月。
据专家分析测试，西番莲果内含有丰富的蛋白质、脂肪、还原糖、多种维生素和磷、钙、铁、钾等多达165种化合物以及人体必需的17种氨基酸，营养价值很高，其中维生素含量1345(1·U/100G)，是抗癌的有效成份，菸酸含量1.7mm/100g，对于防止心血管疾病有积极的作用。西番莲果实成熟后气味芬芳，如切开则香气四溢、沁人肺腑，且果内有大量果瓤和果汁，食之甜酸可口，生津止渴，提神醒脑，特别适宜加工成果汁、果露、果酱、果冻等风味独特、营养丰富、滋补健身、有助消化的产品。西双版纳生产的西番莲果汁饮料已畅销国内外。西番莲的种子含油量高达21.7～25.25％，油质可与葵花油相媲美，是优质的食用油。西番莲的根、茎、叶均可入药，有消炎止痛、活血强身、降脂、降压的疗效。此外，西番莲果皮还是很好的饲料。然而有些西番莲果因品种原因往往较为酸涩，不宜使用，将其开发并提取营养物质或活性物质是对该类品种西番莲果的更深层次的加工，可大大提升西番莲果的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗氧化肽的制备方法，本制备方法可通过作用于蛋白酶活性中心缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗，抗氧化肽纯品中西番莲抗氧化肽的纯度较高，其对DPPH自由基和羟自由基的清除率可达90％以上，具有较高的经济价值。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种抗氧化肽的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将西番莲果肉与水混合，水磨磨细后加入复合蛋白酶与酶解助剂酶解，灭酶得酶解液；西番莲果肉与水混合并磨细后有助于剥离开果肉中富含的纤维素，使蛋白质暴露出来，然后以复合蛋白酶与酶解助剂进行酶解蛋白质，复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，酶解助剂有利于激活蛋白酶的活性中性，活化蛋白酶，提高酶解效率；
2)将步骤1)中的酶解液中的固液分离，取液相超滤，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物；将酶解液固液分离可祛除酶解液中的纤维素、木质素等杂质，超滤后即可得到分子量小于2kDa的富含抗氧化肽的滤液，便于后续分离纯化的进行；
3)以水复溶步骤2)的浓缩提取物，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到西番莲抗氧化肽粗品；肽浓缩提取物粗品复溶后以凝胶层析柱分离纯化可大大提高粗品中西番莲抗氧化肽的含量，凝胶层析柱分离纯化也可避免氧化肽的流逝，提高终产物中有效抗氧化肽成分的纯度和含量；
4)西番莲抗氧化肽粗品经二次纯化即得抗氧化肽纯品。先后经复合酶酶解、超滤、凝胶层析柱分离纯化与二次纯化等数个步骤提取纯化西番莲抗氧化肽，可显著提高西番莲抗氧化肽的提取效率与终产物得率，复合酶酶解与酶解助剂辅助酶解可在保持高效酶解的同时大大缩短酶解时间，降低酶解周期，经多次纯化后，抗氧化肽纯品中西番莲抗氧化肽的纯度可大于99％，其有效成分的有效得率可超过60％，经济价值较为显著；抗氧化肽纯品的主要氨基酸组成为甘氨酸和丙氨酸，对DPPH、·OH和·O2-具有较好的清除效果，同时可以显著降低血清和肝脏中总胆固醇、甘油三酯的浓度，促进NIH/3T3细胞生长，对NIH/3T3细胞胶原蛋白的分泌有显著的促进作用，还具有一定的抗氧化损伤能力、降低血糖、改善糖耐量的功效。
优选地，所述步骤1)中，所述复合酶是重量比为1:0.3～1.5的丝氨酸蛋白酶Carsberg和胰蛋白酶YDB-CF的混合酶；复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，提高酶解效率，降低酶解时间。
优选地，所述步骤1)中，所述酶解助剂是含有0.1～1wt％戊二醇和0.8wt‰t-亮氨酸叔丁酯的水溶液；酶解体系中加入含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂，二者可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗，提升经济效益。
优选地，所述步骤1)中，所述复合酶的添加量是西番莲果肉重量的3～11％；所述酶解助剂的添加量是复合酶添加量的1/5～1重量倍。
优选地，所述步骤1)中，所述酶解温度为48～52℃，所述酶解时间为25～60min；一方面，复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，提高酶解效率，降低酶解时间；另一方面，酶解体系中加入含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂，二者可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗。
优选地，所述步骤3)中，所述凝胶层析柱的洗脱溶剂为超纯水，所述洗脱溶剂的流速为1mL/min。
优选地，所述步骤4)中，所述二次纯化包括以下步骤：
a)西番莲抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤制得抗氧化肽粗品溶液；
b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和磁化水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液；
c)抗氧化肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗氧化肽精纯溶液；
d)抗氧化肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗氧化肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到西番莲抗氧化肽成品。
进一步优选地，二次纯化步骤的磁化水中含有10～25ppm的乙酸；在溶解与透析抗氧化肽的磁化水中添加微量的乙酸有助于提高磁化水的活性，从而将西番莲抗氧化肽粗品中的抗氧化肽和小分子蛋白质以及小肽更加充分的溶解，避免抗氧化肽在溶解和透析过程中发生散失，从而减损终产物中抗氧化肽的纯度与得率；此外，使用磁化水而不选用普通用水也可避免普通用水中的杂质对抗氧化肽造成降解和/或沉淀，增强抗氧化肽的溶解与析出，提高终产物中抗氧化肽的纯度与得率。
进一步优选地，所述步骤b)的过程为：抗氧化肽粗品溶液装入到半透膜，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.2～3.5；然后将含抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝4.6～5.0。
进一步优选地，所述步骤b)中，所述缓冲液与抗氧化肽粗品溶液的体积比为6～8:1；所述磁化水与抗氧化肽溶液的体积比为20～40:1。
进一步优选地，所述步骤b)中，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH值为3.4。
进一步优选地，所述步骤b)中，所述半透膜为纤维素酯膜或再生纤维素膜，截留分子量为1500道尔顿。
进一步优选地，所述步骤c)的反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min。
进一步优选地，所述通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐。
进一步优选地，所述减压浓缩过程中浓缩条件为不超过35℃，真空度为0.08Mpa以上。
进一步优选地，所述干燥采用减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50～-10℃保持2～4h，使真空度恒定在0.01～1.00Mbar，升温干燥12～36h。
本发明的有益效果为：
1)含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗，提升经济效益；
2)经多次纯化后，抗氧化肽纯品中西番莲抗氧化肽的纯度可大于99％，其有效成分的有效得率可超过60％，经济价值较为显著；
3)在溶解与透析抗氧化肽的磁化水中添加微量的乙酸有助于提高磁化水的活性，从而将西番莲抗氧化肽粗品中的抗氧化肽和小分子蛋白质以及小肽更加充分的溶解，避免抗氧化肽在溶解和透析过程中发生散失，从而减损终产物中抗氧化肽的纯度与得率；
4)使用磁化水而不选用普通用水也可避免普通用水中的杂质对抗氧化肽造成降解和/或沉淀，增强抗氧化肽的溶解与析出，提高终产物中抗氧化肽的纯度与得率。
本发明采用了上述技术方案提供一种抗氧化肽的制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为本发明实施例1纯化后抗氧化肽检测谱图；
图2为本发明实施例2纯化后抗氧化肽检测谱图；
图3为本发明的抗氧化肽对DPPH自由基的清除率示意图；
图4为本发明的抗氧化肽对羟自由基的清除率示意图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
本实施例提供一种抗氧化肽的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将西番莲果肉与水混合，水磨磨细后加入复合蛋白酶与酶解助剂酶解，灭酶得酶解液；西番莲果肉与水混合并磨细后有助于剥离开果肉中富含的纤维素，使蛋白质暴露出来，然后以复合蛋白酶与酶解助剂进行酶解蛋白质，复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，酶解助剂有利于激活蛋白酶的活性中性，活化蛋白酶，提高酶解效率；
2)将步骤1)中的酶解液中的固液分离，取液相超滤，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物；将酶解液固液分离可祛除酶解液中的纤维素、木质素等杂质，超滤后即可得到分子量小于2kDa的富含抗氧化肽的滤液，便于后续分离纯化的进行；
3)以水复溶步骤2)的浓缩提取物，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到西番莲抗氧化肽粗品；肽浓缩提取物粗品复溶后以凝胶层析柱分离纯化可大大提高粗品中西番莲抗氧化肽的含量，凝胶层析柱分离纯化也可避免氧化肽的流逝，提高终产物中有效抗氧化肽成分的纯度和含量；
4)西番莲抗氧化肽粗品经二次纯化即得抗氧化肽纯品。先后经复合酶酶解、超滤、凝胶层析柱分离纯化与二次纯化等数个步骤提取纯化西番莲抗氧化肽，可显著提高西番莲抗氧化肽的提取效率与终产物得率，复合酶酶解与酶解助剂辅助酶解可在保持高效酶解的同时大大缩短酶解时间，降低酶解周期，经多次纯化后，抗氧化肽纯品中西番莲抗氧化肽的纯度可大于99％，其有效成分的有效得率可超过60％，经济价值较为显著；抗氧化肽纯品的主要氨基酸组成为甘氨酸和丙氨酸，对DPPH、·OH和·O2-具有较好的清除效果，同时可以显著降低血清和肝脏中总胆固醇、甘油三酯的浓度，促进NIH/3T3细胞生长，对NIH/3T3细胞胶原蛋白的分泌有显著的促进作用，还具有一定的抗氧化损伤能力、降低血糖、改善糖耐量的功效。
所述步骤1)中，所述复合酶是重量比为1:0.5的丝氨酸蛋白酶Carsberg和胰蛋白酶YDB-CF的混合酶；复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，提高酶解效率，降低酶解时间。
所述步骤1)中，所述酶解助剂是含有0.2wt％戊二醇和0.8wt‰t-亮氨酸叔丁酯的水溶液；酶解体系中加入含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂，二者可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗，提升经济效益。
所述步骤1)中，复合酶的添加量是西番莲果肉重量的4％；酶解助剂的添加量是复合酶添加量的1/4重量倍。
所述步骤1)中，所述酶解温度为48℃，所述酶解时间为45min；一方面，复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，提高酶解效率，降低酶解时间；另一方面，酶解体系中加入含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂，二者可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗。
所述步骤3)中，所述凝胶层析柱的洗脱溶剂为超纯水，所述洗脱溶剂的流速为1mL/min。
所述步骤4)中，所述二次纯化包括以下步骤：
a)西番莲抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤制得抗氧化肽粗品溶液；
b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和磁化水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液；
c)抗氧化肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗氧化肽精纯溶液；
d)抗氧化肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗氧化肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到西番莲抗氧化肽成品。
所述二次纯化步骤的磁化水中含有10ppm的乙酸；在溶解与透析抗氧化肽的磁化水中添加微量的乙酸有助于提高磁化水的活性，从而将西番莲抗氧化肽粗品中的抗氧化肽和小分子蛋白质以及小肽更加充分的溶解，避免抗氧化肽在溶解和透析过程中发生散失，从而减损终产物中抗氧化肽的纯度与得率；此外，使用磁化水而不选用普通用水也可避免普通用水中的杂质对抗氧化肽造成降解和/或沉淀，增强抗氧化肽的溶解与析出，提高终产物中抗氧化肽的纯度与得率。
所述二次纯化的步骤b)的过程为：抗氧化肽粗品溶液装入到半透膜，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.2；然后将含抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝4.6。
所述二次纯化的步骤b)中，所述缓冲液与抗氧化肽粗品溶液的体积比为6:1；所述磁化水与抗氧化肽溶液的体积比为20:1。
所述二次纯化的步骤b)中，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH值为3.4。
所述二次纯化的步骤b)中，所述半透膜为纤维素酯膜或再生纤维素膜，截留分子量为1500道尔顿。
所述二次纯化的步骤c)的反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为15mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min。
所述二次纯化的步骤d)通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐。
所述二次纯化的步骤d)的减压浓缩过程中浓缩条件为35℃，真空度为0.08Mpa。
所述二次纯化的步骤d)的干燥采用减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50℃保持2h，使真空度恒定在0.01Mbar，升温干燥12h。
实施例2：
一种抗氧化肽的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将西番莲果肉与水混合，水磨磨细后加入复合蛋白酶与酶解助剂酶解，灭酶得酶解液；西番莲果肉与水混合并磨细后有助于剥离开果肉中富含的纤维素，使蛋白质暴露出来，然后以复合蛋白酶与酶解助剂进行酶解蛋白质，复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，酶解助剂有利于激活蛋白酶的活性中性，活化蛋白酶，提高酶解效率；
2)将步骤1)中的酶解液中的固液分离，取液相超滤，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物；将酶解液固液分离可祛除酶解液中的纤维素、木质素等杂质，超滤后即可得到分子量小于2kDa的富含抗氧化肽的滤液，便于后续分离纯化的进行；
3)以水复溶步骤2)的浓缩提取物，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到西番莲抗氧化肽粗品；肽浓缩提取物粗品复溶后以凝胶层析柱分离纯化可大大提高粗品中西番莲抗氧化肽的含量，凝胶层析柱分离纯化也可避免氧化肽的流逝，提高终产物中有效抗氧化肽成分的纯度和含量；
4)西番莲抗氧化肽粗品经二次纯化即得抗氧化肽纯品。先后经复合酶酶解、超滤、凝胶层析柱分离纯化与二次纯化等数个步骤提取纯化西番莲抗氧化肽，可显著提高西番莲抗氧化肽的提取效率与终产物得率，复合酶酶解与酶解助剂辅助酶解可在保持高效酶解的同时大大缩短酶解时间，降低酶解周期，经多次纯化后，抗氧化肽纯品中西番莲抗氧化肽的纯度可大于99％，其有效成分的有效得率可超过60％，经济价值较为显著；抗氧化肽纯品的主要氨基酸组成为甘氨酸和丙氨酸，对DPPH、·OH和·O2-具有较好的清除效果，同时可以显著降低血清和肝脏中总胆固醇、甘油三酯的浓度，促进NIH/3T3细胞生长，对NIH/3T3细胞胶原蛋白的分泌有显著的促进作用，还具有一定的抗氧化损伤能力、降低血糖、改善糖耐量的功效。
所述步骤1)中，所述复合酶是重量比为1:1的丝氨酸蛋白酶Carsberg和胰蛋白酶YDB-CF的混合酶；复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，提高酶解效率，降低酶解时间。
所述步骤1)中，所述酶解助剂是含有0.64wt％戊二醇和0.8wt‰t-亮氨酸叔丁酯的水溶液；酶解体系中加入含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂，二者可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗，提升经济效益。
所述步骤1)中，所述复合酶的添加量是西番莲果肉重量的5％；酶解助剂的添加量是复合酶添加量的1/5重量倍。
所述步骤1)中，所述酶解温度为52℃，所述酶解时间为25min；一方面，复合蛋白酶中的多种蛋白酶具有相互增益的作用，其联合使用的酶解效率和酶解速度远远大于单一多种蛋白酶分别酶解之和，提高酶解效率，降低酶解时间；另一方面，酶解体系中加入含有特殊配比戊二醇与t-亮氨酸叔丁酯的酶解助剂，二者可以作用并活化丝氨酸蛋白酶的巯基活性中心，可大大降低丝氨酸蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，提高反应效率，加快酶解反应的进行，可缩短50～80％的酶解时间，显著降低酶解成本与能量消耗。
所述步骤3)中，所述凝胶层析柱的洗脱溶剂为超纯水，所述洗脱溶剂的流速为1mL/min。
所述步骤4)中，所述二次纯化包括以下步骤：
a)西番莲抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤制得抗氧化肽粗品溶液；
b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和磁化水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液；
c)抗氧化肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗氧化肽精纯溶液；
d)抗氧化肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗氧化肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到西番莲抗氧化肽成品。
所述二次纯化的磁化水中含有15ppm的乙酸；在溶解与透析抗氧化肽的磁化水中添加微量的乙酸有助于提高磁化水的活性，从而将西番莲抗氧化肽粗品中的抗氧化肽和小分子蛋白质以及小肽更加充分的溶解，避免抗氧化肽在溶解和透析过程中发生散失，从而减损终产物中抗氧化肽的纯度与得率；此外，使用磁化水而不选用普通用水也可避免普通用水中的杂质对抗氧化肽造成降解和/或沉淀，增强抗氧化肽的溶解与析出，提高终产物中抗氧化肽的纯度与得率。
所述二次纯化的步骤b)的过程为：抗氧化肽粗品溶液装入到半透膜，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.4；然后将含抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝4.8。
所述二次纯化的步骤b)中，所述缓冲液与抗氧化肽粗品溶液的体积比为8:1；所述磁化水与抗氧化肽溶液的体积比为35:1。
所述二次纯化的步骤b)中，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH值为3.4。
所述二次纯化的步骤b)中，所述半透膜为纤维素酯膜或再生纤维素膜，截留分子量为1500道尔顿。
所述二次纯化的步骤c)的反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为15mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至3.2；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min。
所述二次纯化的步骤d)的通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐。
所述二次纯化的步骤d)的减压浓缩过程中浓缩条件为30℃，真空度为0.1Mpa。
所述二次纯化的步骤d)的干燥采用减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-20℃保持4h，使真空度恒定在0.5Mbar，升温干燥24h。
实施例3：
实施例3与实施例2基本相同，不同之处在于实施例3中，酶解过程中未添加酶解助剂。
实施例4：
实施例4与实施例2基本相同，不同之处在于实施例4中，酶解助剂是仅含有0.64wt％戊二醇的水溶液。
实施例5：
实施例5与实施例2基本相同，不同之处在于实施例5中，酶解助剂是仅含有0.8wt‰t-亮氨酸叔丁酯的水溶液。
实施例6：
实施例6与实施例2基本相同，不同之处在于实施例6二次纯化中的磁化水不含有乙酸。
实施例7：
实施例7与实施例2基本相同，不同之处在于实施例7二次纯化的步骤b)中，西番莲抗氧化肽粗品通过蒸馏水溶解。
实施例8：
实施例8与实施例2基本相同，不同之处在于实施例8二次纯化的步骤b)为：b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和蒸馏水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液。
实验例：
A)测定实施例1与实施例2纯化后抗氧化肽的样品检测谱图，分别如图1和图2所示。
B)DPPH自由基清除率测定：分别配制浓度为5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL的抗氧化肽溶液各2.0mL，分别加入2.0mL0.04mg/mLDPPH溶液(无水乙醇作为溶剂)，充分混匀后室温下避光反应30min，在波长517nm处测定其吸光度A1，同时测定无水乙醇(2.0mL)与DPPH(2.0mL)混合液的吸光度AC，无水乙醇(2.0mL)和样品液(2.0mL)混合液的吸光度A2，在其他条件不变下，以VC替换活性物质作为阳性对照。则DPPH自由基清除率计算公式为：
分别测定实施例1-7中抗氧化肽的DPPH自由基清除率，统计结果如图3所示。
C)羟自由基清除率测定：取1mL的FeSO4溶液(10mmol/L)于试管中，加入1mL的水杨酸-乙醇溶液(10mmol/L)，摇匀后加入1mL浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL的活性物质溶液，最后加入8.8mmol/LH2O2溶液1mL启动反应，37℃，水浴1h，冷却至室温，在波长510nm测吸光度。在其他条件不变下，以VC替换活性物质作为阳性对照，则羟自由基清除率计算公式为：
式中：B1为蒸馏水代替活性物质做空白；B2为样品液；BC为蒸馏水代替H2O2的活性物质本底溶液。
分别测定实施例1-7中抗氧化肽的羟自由基清除率，统计结果如图4所示
由图1和图2可知，本发明方法中的优选实施例1和实施例2中的抗氧化肽经过多次纯化后其纯度较高，因此它们对DPPH自由基与羟自由基的清除能力较强。
由图3和图4可知，本发明优选实施例1和2中的抗氧化肽对DPPH自由基和羟自由基均具有较为明显的清除作用，同时其自由基清除率均呈现剂量依赖性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将西番莲果肉与水混合，水磨磨细后加入复合蛋白酶与酶解助剂酶解，灭酶得酶解液；
2)将步骤1)中的酶解液中的固液分离，取液相超滤，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物；
3)以水复溶步骤2)的浓缩提取物，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到西番莲抗氧化肽粗品；
4)西番莲抗氧化肽粗品经二次纯化即得抗氧化肽纯品；
其中，所述复合酶是重量比为1:0.3～1.5的丝氨酸蛋白酶Carsberg和胰蛋白酶YDB-CF的混合酶；
所述酶解助剂是含有0.1～1wt％戊二醇和0.8wt‰t-亮氨酸叔丁酯的水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述复合酶的添加量是西番莲果肉重量的3～11％；所述酶解助剂的添加量是复合酶添加量的1/5～1重量倍。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述酶解温度为48～52℃，所述酶解时间为25～60min。
4.根据权利要求1或2所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述凝胶层析柱的洗脱溶剂为超纯水，所述洗脱溶剂的流速为1mL/min。。
5.根据权利要求1所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述二次纯化包括以下步骤：
a)西番莲抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤制得抗氧化肽粗品溶液；
b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和磁化水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液；
c)抗氧化肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗氧化肽精纯溶液；
d)抗氧化肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗氧化肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到西番莲抗氧化肽成品。
6.根据权利要求5所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述二次纯化步骤的磁化水中含有10～25ppm的乙酸。
7.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤b)的过程为：抗氧化肽粗品溶液装入到半透膜，置于缓冲液中，于室温下搅拌渗滤至缓冲液pH＝3.2～3.5；然后将含抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗滤至半透膜内溶液pH＝4.6～5.0。
8.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤c)的反相色谱法中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为5mM～50.0mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节pH值至2.0～3.5；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min。。
9.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤d)的通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐。
10.根据权利要求5或6所述的一种抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述步骤d)的干燥采用减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50～-10℃保持2～4h，使真空度恒定在0.01～1.00Mbar，升温干燥12～36h。
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