CN106212851B - 一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白及其制备方法。该荞麦浓缩蛋白纯度达65‐85％，总多酚质量含量为<0.45％，均显著低于一般碱溶酸沉法制备的荞麦蛋白，并具有低胰蛋白酶抑制剂，色泽纯白，溶解性、消化性良好的优良性状。其制备方法为：以苦荞皮层粉为原料，采用盐溶液进行提取；离心后取上清液，经过大孔树脂吸附；再通过超滤渗滤技术或透析，冷冻干燥后即可获得低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白。本发明工艺流程简单可行、无毒无害，切实践行环境友好和可持续发展的新时代生产要求，所发明的蛋白产品可应用于特殊人群专用食品、营养保健品等多个领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白及其制备方法，特别是涉及一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白及其制备方法，属于荞麦谷物深加工技术领域。
背景技术
荞麦蛋白具有相当高的生物价，相当于脱脂奶粉的92.3％，鸡蛋的81.4％，且蛋白质质量优于大米、小麦和玉米。此外，荞麦蛋白含有19种氨基酸，8种为人体必需氨基酸，组成合理、比例适当，其中赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸含量较高，是一种营养均衡的蛋白质，可以很好的为人体所利用。因此，补充荞麦蛋白可以有效改善“赖氨酸缺乏症”，它与其它谷物混食，可以充分发挥食物的互补作用，弥补营养素的不足，从而提高食物的营养价值。荞麦蛋白的组成不同于小麦，主要是由80％的盐溶性球蛋白和水溶性清蛋白组成，近似于豆类植物蛋白。近年来很多研究报道苦荞麦是制作Gluten‐free食物的良好原材料，并且由于荞麦中醇溶蛋白含量也是极少的，因此不具有致病性，成为腹腔疾病患者可以信赖和推崇的安全食品。
随着人们生活水平的提高，平衡膳食、采用食疗以达到保健功效已成为世界关注的焦点，近年来荞麦蛋白作为一种有机绿色保健食品而得到重视。然而，传统方法提取的荞麦蛋白当中存在大量的苦味物质多酚以及抗消化的蛋白酶抑制剂，大大降低了其风味和吸收利用价值。相关报道指出，苦荞麦中芦丁含量高达1.08‐6.6％，产生的苦涩味使得其在食品加工中的利用率下降。另一方面，有研究发现荞麦中的胰蛋白酶抑制剂分子量大约为7.7‐9.2kDa，且对胰蛋白酶有较强的抑制作用，因此导致荞麦蛋白在肠道的消化性降低。一般方法提取的荞麦蛋白富含胰蛋白酶抑制剂，因此常被成为抗消化蛋白。粮食作物的加工与利用一直是我国食品研究的热点问题，以新的技术手段降低谷物蛋白的不良风味并提高其消化性对谷物深加工有重要意义，而国内外关于低多酚或低胰蛋白酶抑制剂的荞麦蛋白的研究甚少。
另一方面，传统的蛋白提取工艺消耗大量的酸碱溶液，造成的环境污染不可忽视。而偏酸或偏碱的条件更会影响部分蛋白质的结构和性质，未能使荞麦的天然成分得以充分保留。因此，采用温和友好的加工技术对蛋白进行提取与制备是未来谷物蛋白产业发展的趋势。
中国发明专利申请2015104932349公开了一种提取银杏叶黄酮的方法，该方法包括如下步骤：(1)将银杏叶粉碎后进行索式提取，得到粗提物浸膏；(2)将步骤(1)所得的银杏叶粗提物浸膏放于离子液体与盐溶液形成的双水相溶液A中，然后微波进行处理得到吸附完成的双水相溶液；(3)取步骤(2)上层清液，通过B‐R缓冲液控制在pH3‐6，用大孔吸附树脂常温静态进行吸附24h，(4)用蒸馏水冲洗大孔树脂，然后收集冲洗液，回收离子液体利用；并用乙醇溶液对大孔吸附树脂进行洗脱，最后得银杏黄酮产物。大大减少了银杏黄酮的损失，也节约了溶剂使用的成本，整个流程中并不使用有毒有害有严重气味的有机溶剂以及其它会造成严重污染的原料，绿色环保。大孔树脂提取黄酮的做法很常用，该发明利用大孔树脂是为了富集黄酮，富集黄酮的工艺重心在于洗脱液，采用乙醇溶液洗脱；该发明为了形成双水相采用盐提法，主要是磷酸钾或钠溶液，该过程是富集黄酮于溶液中的过程；该发明的方法是单纯的静态吸附过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白，该蛋白较彻底地分离了荞麦中的多酚物质，呈现纯白的色泽，具有低蛋白酶抑制剂，高溶解性、消化性等特点，因此可提供较高的营养价值和应用价值，并且可改善荞麦蛋白的风味，促进荞麦蛋白在食品配料中的利用与发展。
本发明的另一目的在于提供一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，该方法工艺简单，条件温和，不需采用酸碱处理，环境友好，并实现对荞麦谷物的精深加工，是一种注重营养、健康、安全以及资源利用的技术，可推动谷物蛋白的工业化发展。
众所周知，杂粮营养价值高，但粗糙生涩的口感却难以下咽，因此对谷物精深加工十分有必要。荞麦的淀粉含量与禾谷类粮食含量相当，蛋白附着于淀粉表面并与淀粉紧密结合，传统的荞麦蛋白提取方法常采用碱溶酸沉手法使蛋白溶解并与淀粉分离，但与此同时碱溶液的处理会促进荞麦中的多酚与蛋白结合，从而使蛋白带苦涩味，溶解性和消化性都相对较低，大大降低了其加工利用价值。
本发明发现，荞麦中的蛋白以盐溶性球蛋白为主，通过低盐温和的反应条件，并结合大孔树脂的高效吸附，可以彻底降低其中结合态多酚的含量，再通过超滤渗滤技术脱离荞麦蛋白中剩余的游离酚，最终实现低酚荞麦浓缩蛋白的提取。目前，利用盐提结合大孔树脂法制备低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的技术尚未报道。
本发明则针对荞麦高多酚及高盐溶性蛋白含量的特点，创新性地将盐提结合大孔树脂吸附技术应用于荞麦蛋白的制备当中，并结合采用超滤渗滤手段，分离多酚与浓缩蛋白的过程同时进行，大大增强了脱除多酚的效果，实现多酚与蛋白的高效分离。终产品多酚含量显著低于碱溶酸沉法，且蛋白纯度相对较高。相比其它分离方法，盐提法具有无毒、无害，环保、无污染，非热加工、不破坏提取物的性质，并且操作过程简单可控等优点。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白：以苦荞皮层粉为原料，采用盐溶液进行提取；离心后取上清液，经过大孔树脂吸附；再通过超滤渗滤技术或透析，冷冻干燥得到；蛋白质纯度达65‐85％，总多酚质量含量<0.45％，缺乏<10kDa的胰蛋白酶抑制剂组分，体外消化的氮释放量达60‐80％。
游离酚质量含量<0.11％，结合酚质量含量<0.34％。
所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法：以苦荞皮层粉为原料，采用盐溶液进行提取；离心后取上清液，经过大孔树脂吸附；再通过超滤渗滤技术或透析，冷冻干燥，得低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白；所述的盐溶液为含0.07‐0.35mol/L的NaCl以及0.03‐0.15mol/L的NaHCO3混合溶液。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述的原料苦荞皮层粉选取来源于四川大凉山高寒地区的野生黑苦荞，是苦荞粒脱壳研磨得到的表层粉状物，其蛋白质量含量在8‐20％，总多酚质量含量在2‐5％。
优选地，所述苦荞皮层粉与盐溶液的质量体积比1:10‐1:20混合，质量单位为kg，体积单位为L。
优选地，所述的盐溶液提取时间为2‐12h，盐溶液提取过程的磁力搅拌速率为200‐500r/min，温度控制在20‐30℃。
优选地，所述离心后取上清液的离心速率为5000‐10,000r/min，时间为15‐30min。
优选地，所述的大孔树脂类型是XAD16N或XAD16HP，吸附过程采用动态吸附或静态吸附；其中，动态吸附过程吸附流速控制在每小时1‐4倍柱体积，收集样液；静态吸附采用1‐10g树脂处理100‐200mL上样液，置于20‐25℃恒温摇床吸附60‐90min，达到吸附平衡后，采用200‐250目筛网滤出样液。
优选地，所述的超滤渗滤过程，采用聚砜膜，膜孔径为5‐50kDa，流速为300‐1,000mL/min，渗滤体积为上样体积的2‐6倍；透析过程采用8‐10kDa的透析袋，透析24‐48h，期间更换透析用蒸馏水3‐6次。
本发明蛋白质纯度达到65‐85％，总酚质量含量为<0.45％，游离酚质量含量为<0.11％，结合酚质量含量为<0.34％。该低酚荞麦浓缩蛋白产品呈纯白色粉末状，低胰蛋白酶抑制剂，具有良好的溶解性以及消化性。
上述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白，根据大孔树脂吸附多酚的原理，通过除杂的方法，把多酚与蛋白分离，既保留了优质的蛋白质组分，又最大程度地脱除产生苦涩味的多酚和抗消化的低蛋白酶抑制剂，为谷物蛋白的分离纯化以及在食品配料中的应用提供了参考。
相对于现有技术本发明的有益效果在于：
1、本发明在利用盐提结合大孔树脂技术制备蛋白的机理主要是利用球蛋白的盐溶性和大孔树脂对多酚的高效吸附作用而实现的。荞麦中丰富的多酚易与其蛋白发生疏水键‐氢键多点键合而难以分离，经试验探索，高温或碱性条件会促使更多的多酚与蛋白的结合。因此，采用条件温和的盐提方法，不仅能有效提取盐溶性球蛋白，而且能避免多酚与蛋白质的紧密结合。并通过大孔树脂对结合态多酚和游离态多酚的高效吸附，结合超滤渗滤技术更彻底排除剩余的游离多酚，使得大分子的荞麦球蛋白截留下来。此外，大孔树脂对胰蛋白酶抑制剂也产生吸附作用，可赋予产品蛋白低胰蛋白酶抑制剂的特性。不同于单纯的提取方法，该法获得的荞麦浓缩蛋白多酚含量显著低于传统的碱溶酸沉法，溶解性和消化性更高。
2、本发明涉及一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其操作过程和设备简单，安全无毒，制备过程对环境友好，能够有效提高荞麦蛋白的附加值，以此推进荞麦生产和深加工，开发新型功能性食品配料，形成新的经济增长点。
3、本发明制备的荞麦浓缩蛋白，低多酚，低胰蛋白酶抑制剂，风味色泽均较优，溶解性、消化性良好，营养价值丰富，实用价值高，可用于研制具有特殊功能(如补充氨基酸、Gluten‐free等食品)的专用蛋白及相关制品。
4、本发明利用大孔树脂降低荞麦蛋白中的多酚含量以及除去胰蛋白酶抑制剂则尚未有报道，本发明把大孔树脂应用在荞麦蛋白的分离纯化上，目的是去除多酚，现有技术2015104932349利用大孔树脂是富集黄酮，目的上有本质区别，并且实验工艺也有差异，富集黄酮的工艺重心在于洗脱液，采用乙醇洗脱，而本发明的重心在于滤出液，是水相体系；
5、本发明应用大孔树脂不仅仅做到降低多酚含量的效果，还除去了胰蛋白酶抑制剂，这是荞麦蛋白研究的突破；
6、本发明采用盐提法是为了得到盐溶性球蛋白，因此选择蛋白溶出率较高的NaCl和NaCO3盐溶液，并且经过大量实验摸索，通过工艺参数的调整使得该过程是减弱多酚溶出的一个过程；现有技术2015104932349是为了形成双水相采用盐提法，主要是磷酸钾或钠溶液，该过程是富集黄酮于溶液中的过程，目的恰恰与本发明相反，盐提的原理与盐溶液的选择均不一样；
7、本发明树脂吸附工艺条件可采用动态吸附，即可以实现连续化工艺制备蛋白，这与单纯的静态吸附过程不一样。
附图说明
图1为实施例1以及对比例1、2荞麦浓缩蛋白SDS‐PAGE电泳图谱；
图2为实施例1以及对比例2荞麦浓缩蛋白体外消化过程的可溶性氮释放量测定；
图3为实施例2低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的多酚HPLC图谱；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。
以下各实施例中，蛋白质纯度、多酚质量含量及多酚回收率、可溶性氮释放量的测定方法如下：
采用杜马斯定氮法测定样品中蛋白含量(×5.83)。
多酚质量含量测定方法：适量样品溶于0.1mol/L NaOH碱液中，10,000r/min离心15min，取上清液，分为均等的两份：一份于紫外波长328nm处检测，测定总酚吸光度A1；另一份加入等体积的10％质量分数的三氯乙酸(TCA)，沉淀蛋白质，再经过10,000r/min离心15min，之后上清液于328nm处测定游离多酚吸光度A2；并以芦丁标品为参照品做标准曲线。结合酚质量含量＝总酚质量含量‐游离酚质量含量。多酚回收率计算如下：
蛋白消化过程中释放的可溶性氮释放量的测定采用TCA‐NSI法。取3mL不同消化时间的样品溶液加入3mL 10％TCA，静置30min后离心(5000g，20min)，弃去上清液，沉淀部分再次用10％TCA洗涤、离心，弃去上清液即得TCA不溶组分，然后测定其中的氮含量。可溶性氮释放量计算公式如下：
氮释放量(％)＝[(N0‐Nt)/Ntot]×100
其中，Nt为消化t分钟时的TCA不溶性氮(mg)，
N0为消化0分钟蛋白样品中的TCA不溶性氮(mg)，
Ntot为蛋白样品中的总氮量(mg)。
实施例1
40g苦荞皮层粉与含0.033mol/L NaHCO3和0.086mol/LNaCl的盐溶液以料液比1:10(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，于室温25℃搅拌(300r/min)12h，之后8,000r/min离心30min。预活化XAD16HP大孔树脂50g，湿法装柱，采用动态吸附，流速控制在每小时1倍柱体积，收集样液。最后在4℃下透析48h、冷冻干燥，即得低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白。
该实施例的多酚回收率为0.32％，该蛋白样品呈纯白色粉末状，可快速溶解于pH7.0的蒸馏水中。
对比例1
称取40g苦荞皮层粉以质量体积比1:20充分分散于蒸馏中，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0，磁力搅拌(300r/min)90min，样液经过8,500r/min离心20min后取上清液，用2mol/LHCl溶液调节pH值至蛋白等电点4.6，再次离心20min。随后收集沉淀物，二次水洗沉淀物后加入7倍体积蒸馏水，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0将沉淀复溶，蛋白复溶液经透析、冷冻干燥后得到碱溶酸沉荞麦浓缩蛋白。
该对比例的方法是普遍使用的蛋白质提取方法碱溶酸沉法，蛋白的多酚回收率为8.57％，蛋白质纯度与多酚质量含量如表1所示，实施例1总酚含量0.20％，相比之下，显著低于对比例1的3.65％，这是由于制备方法的差异而导致的，充分说明盐提结合大孔树脂吸附可以有效制备低酚荞麦浓缩蛋白。该蛋白样品呈淡褐色粉末状，缓慢溶解于pH7.0的蒸馏水中。
表1实施例1以及对比例1荞麦浓缩蛋白的蛋白质及多酚含量
对比例2
40g苦荞皮层粉与含0.033mol/L NaHCO3的0.086mol/L NaCl盐溶液以质量体积比1:10混合，室温25℃下搅拌(300r/min)过夜，样液以8,000r/min离心30min，取上清液透析48h，经过冷冻干燥后即得盐提荞麦浓缩蛋白。
该对比例的蛋白质纯度为66.49％，总酚质量含量为2.67％，其中结合酚质量含量为2.06％，游离酚质量含量为0.6％，多酚回收率7.99％。该蛋白样品色泽呈现暗白色，快速溶解于pH7.0的蒸馏水中。
对原料、实施例1以及对比例1、2的荞麦浓缩蛋白进行SDS‐PAGE分析，凝胶电泳采用Laemmli系统，在不连续缓冲系统上进行SDS‐PAGE电泳分析，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。取适量样品，添加电泳缓冲液配置成4mg/mL溶液，沸水煮3min，上样量为2.5μL；测定结果如附图1所示，荞麦蛋白主要由2S，8S和13S组成，实施例1的蛋白主要以分子量较大的球蛋白为主，相对于对比例1、2，该蛋白缺乏10.0kDa以下的胰蛋白酶抑制剂组分，这是由于大孔树脂对分子量较低的胰蛋白酶抑制剂有吸附作用，胰蛋白酶抑制剂被很好地除去，这使得蛋白更易于被人体消化利用。
对实施例1与对比例2的蛋白样品进行体外模拟消化实验，用6mol/L HCl调pH至2.0，加入100mg/mL胃蛋白酶0.2mL并于37℃恒温摇床酶解1h，调节pH至7.0终止反应。胃蛋白酶消化结束后，用2mol/L氢氧化钠溶液调节体系的pH值为7.0，加入100mg/mL胰蛋白酶0.2mL和脱氧胆酸钠(体系最终浓度为8.6mmol/L)，于37℃条件下恒温摇床酶解2h。期间在不同消化时间取样待测可溶性氮释放量。结果如图2所示，在胃蛋白酶消化阶段实施例1与对比例2的蛋白消化均比较缓慢，且消化进程基本一致；然而，在胰蛋白酶消化阶段，实施例1蛋白消化速率显著高于对比例2(图中斜率可反应速率)，消化结束后，实施例1的氮释放量为72.88％，远高于对比例2的56.15％，说明消化性较高，这可能是通过大孔树脂吸附，样品有效除去了胰蛋白酶抑制剂，因而消化性大大提高。
实施例2
20g苦荞皮层粉与含0.033mol/L NaHCO3和0.086mol/L NaCl的盐溶液以料液比1:10(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，于室温20℃搅拌(300r/min)3h，之后8,000r/min离心30min。取上清液于1000mL锥形瓶，加入已活化的XAD16N大孔树脂50g，并置于25℃恒温摇床，转速200rpm，静态吸附90min。最后在4℃下透析48h、冷冻干燥，即得低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦蛋白。
该实施例的蛋白质回收率为65.29％，总酚质量含量为0.43％，多酚回收率0.52％。该蛋白样品呈纯白色粉末状，可快速溶解于pH7.0的蒸馏水中。
样品采用70％甲醇超声水浴提取，并经过0.45μm滤膜后，C18高效液相色谱检测，色谱图见附图3。图中的1表示芦丁对应的吸光强度，2表示槲皮素对应的吸光强度。由该色谱可知，低酚荞麦浓缩蛋白的芦丁和槲皮素的响应值相当低，其中芦丁的质量含量为0.06％(是原料苦荞皮层粉芦丁含量的1/33.5)，槲皮素的质量为含量0.11％(是碱溶酸沉法蛋白的1/4)，说明该方法有效降低了芦丁含量，实现了低酚蛋白的制备。
实施例3
40g苦荞皮层粉与含0.033mol/L NaHCO3和0.086mol/L NaCl的盐溶液以料液比1:10(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，于室温25℃搅拌(300r/min)6h，之后8,000r/min离心30min。取上清液于1000mL锥形瓶，加入已活化的XAD16N大孔树脂50g，并置于25℃恒温摇床，转速200rpm，静态吸附90min。其后采用10kDa聚砜膜超滤渗滤，流速600r/min，渗滤体积为上样液体积的4倍，收集浓缩液，冷冻干燥后即得低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦蛋白。
该实施例的蛋白质回收率为65.16％，总酚质量含量为0.42％，多酚回收率0.53％。该蛋白样品呈纯白色粉末状，可快速溶解于pH7.0的蒸馏水中。
实施例仅仅为进一步说明本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征在于：以苦荞皮层粉为原料，采用盐溶液进行提取；离心后取上清液，经过大孔树脂吸附；再通过超滤渗滤技术或透析，冷冻干燥，得低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白；所述的盐溶液为含0.07-0.35mol/L的NaCl以及0.03-0.15mol/L的NaHCO3混合溶液；低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的蛋白质纯度在65-85％范围内，总多酚质量含量<0.45％，缺乏<10kDa的胰蛋白酶抑制剂组分，体外消化的氮释放量在60-80％范围内。
2.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的原料苦荞皮层粉选取来源于四川大凉山高寒地区的野生黑苦荞，是苦荞粒脱壳研磨得到的表层粉状物，其蛋白质量含量在8-20％，总多酚质量含量在2-5％。
3.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述苦荞皮层粉与盐溶液以质量体积比1:10-1:20混合，质量单位为kg，体积单位为L。
4.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的盐溶液提取时间为2-12h，盐溶液提取过程的磁力搅拌速率为200-500r/min，温度控制在20-30℃。
5.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述离心后取上清液的离心速率为5000-10,000r/min，时间为15-30min。
6.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的大孔树脂类型是XAD16N或XAD16HP，吸附过程采用动态吸附或静态吸附；其中，动态吸附过程吸附流速控制在每小时1-4倍柱体积，收集样液；静态吸附采用1-10g树脂处理100-200mL上样液，置于20-25℃恒温摇床吸附60-90min，达到吸附平衡后，采用200-250目筛网滤出样液。
7.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的超滤渗滤过程，采用聚砜膜，膜孔径为5-50kDa，流速为300-1,000mL/min，渗滤体积为上样体积的2-6倍。
8.根据权利要求1所述低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述透析过程采用8-10kDa的透析袋，透析24-48h，期间更换透析用蒸馏水3-6次。
9.根据权利要求1所述的低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征在于是，低酚低胰蛋白酶抑制剂荞麦浓缩蛋白的游离酚质量含量<0.11％，结合酚质量含量<0.34％。
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