JP6334061B2 - 腫瘍血管遮断剤であるポリペプチド、遺伝子、発現ベクター、腫瘍血管遮断剤の組成物、及び腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドの調製方法 - Google Patents
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Description
検討より明らかなように、該領域が遊離状態にある場合、凝固活性がないが、細胞膜にアンカーされて血液中に暴露されると、完全長因子と類似する血液凝固活性が発生するため、この配列は短縮型組織因子(tTF)と呼ばれる。この特徴に鑑み、腫瘍標的機能のある分子でtTFを特異的に腫瘍組織にアンカーすると、腫瘍血管に血栓を特異性的に形成し、腫瘍部位への血液供給および代謝産物排出のための経路を遮断し、腫瘍を治療する目的を達成できる。
第1の側面において、本発明は配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドを提供する。
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREGGGGSAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT(配列番号1)。
前記活性ドメインは219個のアミノ酸からなり、配列が以下のとおりである。
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE(配列番号2)。
GGGGS(配列番号3)。
前記連結ドメインの配列は、発現した融合タンパク質の活性ドメインと標的ドメインの機能を完全に維持することを保証できる。
AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT(配列番号4)。
前記標的ドメインの配列は腫瘍部位での弱酸性環境において立体配座変化が発生し、α−ヘリックス構造を形成し、細胞膜を貫通し、これにより、腫瘍血管の内皮細胞膜に位置決めされる。
当業者にとって、コドンの縮重性によって、本発明に係る前記腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は唯一ではなく、前記腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドをコーディングして発現できるヌクレオチド配列は全て本発明の腫瘍血管遮断剤遺伝子であると理解すべきである。
それにもかかわらず、本発明は特に、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する腫瘍血管遮断剤遺伝子を提供する。
TCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAACCCAAACCCGTCAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTCACACCTTACCTGGAGACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAAGGTGGTGGTGGTTCTGCTGAACAGAACCCGATCTACTGGGCTCGTTACGCTGACTGGCTGTTCACCACCCCGCTGCTGCTGCTGGACCTGGCTCTGCTGGTTGACGCTGACGAAGGTACC(配列番号5)。
当業者にとって、コドンの縮重性によって、本発明に係る前記腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は唯一ではなく、前記腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドをコーディングして発現できるヌクレオチド配列は全て本発明の腫瘍血管遮断剤遺伝子であると理解すべきである。従って、前記腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドをコーディングして発現する発現ベクターは全て本発明の意図する保護範囲に含まれるものとする。
それにもかかわらず、本発明は特に上記配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
それにもかかわらず、本発明は特に一般的に使用されるpET30aベクタープラスミドであるベクタープラスミドを提供する。従って、本発明の発現ベクターとしては、pET30aベクタープラスミドで構築される発現ベクターが好ましく使用される。
本発明において、前記腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドは、具体的に、対応した遺伝子配列を設計して融合タンパク質の発現プラスミドを構築し、例えばBL21大腸菌に移し、IPTGにより誘導発現して精製し、腫瘍標的性及び血液凝固活性を有する腫瘍血管遮断剤を得る。
(1)前記腫瘍血管遮断剤は主要な部分が自体の組織因子の細胞外ドメインに由来するため、免疫原性が小さく、免疫系の除去を良く回避できる。
(2)前記腫瘍血管遮断剤は、酸に応答した腫瘍標的ペプチドをうまく利用して組織因子を腫瘍血管の内皮細胞に位置決めするものであり、他のリガンド−受容体による組織因子の位置決め方法に比べて、組織因子の天然構造により近く、血液凝固活性がより良好となる。
(3)本発明は、標的分子を変えることで、他の出血性疾患に適用できるため、応用の将来性が期待できる。
特に断らない限り、下記実施例の実験方法は常法であり、使用される実験材料は、一般的な生化学的試薬メーカーから入手されるものである。
まず、NCBIウェブサイトで組織因子の細胞外の219個のアミノ酸配列(配列番号2に示される)の遺伝子配列を調べて、次に、腫瘍標的ペプチド(配列番号3に示される)及び連結部でのアミノ酸配列について翻訳して遺伝子配列を取得し、配列番号5に示されるような融合タンパク質の遺伝子配列を得る。全遺伝子合成方式によって、融合タンパク質の遺伝子を合成し、且つ両端のそれぞれにNde IとXho Iの酵素切断部位を設計した。最後に、融合タンパク質の遺伝子を上記酵素切断部位によって、pET30aベクターに連結して、融合タンパク質の発現ベクターを得る。
(1)融合タンパク質の発現
上記融合タンパク質の発現ベクターをBL21大腸菌に形質転換し、先ず5μLの菌液を5mLのLB液体培地に接種し、37℃、200×rpmで、16h振盪培養した。培養した菌液を500mLのLB液体培地に接種し、37℃、200×rpmで、OD=0.6〜0.8になるまで培養し、IPTG(0.5mM)により4h誘導発現した。
上記IPTGにより誘導発現した菌液を遠心分離し(6000×rpm、5min)、上澄みを捨て、細菌を収集した。沈殿を25mLの10mM Tris−HCl(pH=8.0)溶液で吹き散らし、超音波で破砕し、12000×rpmで10min遠心分離し、上澄みを除去した後、25mLの10mM Tris−HCl(pH=8.0)溶液で超音波によって遠心して得た沈殿を再懸濁させ、10min静置した。上記操作を1回繰り返し、沈殿を得た。少量の10mM Tris−HCl(pH=8.0)溶液を加えて沈殿を再懸濁させた後、更に8M尿素を含有する10mM Tris−HCl(pH=8.0)溶液8mLを加えてタンパク質を溶解し、12000×rpmで10min遠心分離して、上澄みを収集した。
SDS−PAGE電気泳動によって融合タンパク質を同定した結果を図1(B)に示す。明瞭で純粋なバンドが形成されることが見られ、大きさが30KDa以上であり、予想と一致している。
本発明の実施例2で調製した腫瘍血管遮断剤を、833μg/kg体重又は20μg/匹マウスの量で尾静脈からヌードマウス乳癌腫瘍モデルに注入し、12時間後、治療効果を観察し、生理食塩水を注射するものを対照群とする。結果は図2に示される。
生理食塩水を注射した担癌マウス(A)に比べて、本発明の腫瘍血管遮断剤は、腫瘍部位で目視により見られる深紅色(D)を引き起こした。解剖したところ、対照群では、腫瘍(B)は正常な肉紅色であるのに対して、腫瘍血管遮断剤(E)を注射した腫瘍では、血栓に起因する明らかな暗赤色が見られた。腫瘍の病理学的切片では、対照群(C)に比べて、腫瘍血管遮断剤注射群(F)は、腫瘍血管に明らかな血栓(矢印で示される)が形成されていることが分かった。
本発明に対するあらゆる改良、本発明の製品における各原料の均等置換及び補助成分の添加、具体的な形態の選択等は、全て本発明の保護範囲と開示範囲に属することを、当業者は了承すべきである。
Claims (7)
- アミノ端からカルボキシル端へ、短縮型組織因子、連結ドメイン、及び、腫瘍標的分子pHLIPを有するポリペプチドであって、
前記短縮型組織因子は配列番号2に示されるアミノ酸配列を有し、
前記連結ドメインは配列番号3に示される1つのみのアミノ酸配列を有し、
前記腫瘍標的分子pHLIPは配列番号4に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする腫瘍血管遮断剤であるポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を有することを特徴とする腫瘍血管遮断剤遺伝子。
- 配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項2に記載の腫瘍血管遮断剤遺伝子。
- 請求項2または3に記載の腫瘍血管遮断剤遺伝子において、ポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする腫瘍血管遮断剤の発現ベクター。
- pET30aベクタープラスミドで構築されることを特徴とする請求項4に記載の腫瘍血管遮断剤の発現ベクター。
- 請求項1に記載の腫瘍血管遮断剤であるポリペプチド、請求項2もしくは3に記載の腫瘍血管遮断剤遺伝子、又は、請求項4もしくは5に記載の腫瘍血管遮断剤の発現ベクターを有することを特徴とする腫瘍血管遮断剤の組成物。
- 請求項1に記載の腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドの調製方法であって、
請求項4または5に記載の腫瘍血管遮断剤の発現ベクターを発現系に移し、誘導発現して腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドを得ることを特徴とする腫瘍血管遮断剤であるポリペプチドの調製方法。
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