JP6903633B2 - 腫瘍抑制ペプチド - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、腫瘍治療の分野に属し、具体的に腫瘍の抑制、治療に用いるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列はエンドスタチンのＮ末端の第1番目のアミノ酸残基から45個アミノ酸以内の長さの断片である。
本発明は、腫瘍治療の分野に属し、具体的に腫瘍の抑制、治療に用いるポリペプチドに関し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列はエンドスタチンのＮ末端の第1番目のアミノ酸残基から45個アミノ酸以内の長さの断片である。
背景技術
エンドスタチンは、1997年O’Reillyらが培養したマウス内皮細胞腫瘍( EOMA) の上清から精製した内因性血管新生阻害剤で、20 kD分子量のタンパク質であり、XVIII型コラーゲンに由来する加水分解物である。実験により、エンドスタチンが血管内皮細胞及び腫瘍細胞に対して抑制効果を発揮することが表明された。組換えエンドスタチンの再生などが困難である要因によって、米国EntreMed会社は、組換えエンドスタチンの臨床研究を放棄して、現在、高いin vitro活性を有するエンドスタチンを大規模で製造することができない。
エンドスタチンは、1997年O’Reillyらが培養したマウス内皮細胞腫瘍( EOMA) の上清から精製した内因性血管新生阻害剤で、20 kD分子量のタンパク質であり、XVIII型コラーゲンに由来する加水分解物である。実験により、エンドスタチンが血管内皮細胞及び腫瘍細胞に対して抑制効果を発揮することが表明された。組換えエンドスタチンの再生などが困難である要因によって、米国EntreMed会社は、組換えエンドスタチンの臨床研究を放棄して、現在、高いin vitro活性を有するエンドスタチンを大規模で製造することができない。
エンドスタチン配列において、N末端から1、3、11番目の三つのヒスチジン及び第76番目のアスパラギン酸残基からなる亜鉛イオン結合部位として、エンドスタチンの亜鉛イオンとの結合が活性にとって重要である。報告によると、エンドスタチンのN末端由来のポリペプチドは血管内皮細胞及び腫瘍細胞を抑制する活性を有する（Cancer Res. 2005；65(9):3656-63，米国特許US7524811B2）。しかしながら、上記の試験は、ヒトエンドスタチン由来のN末端の1〜25番目のアミノ酸を含むポリペプチドがマウス動物モデルに接種したヒト由来腫瘍の増殖を顕著に抑制できないことを示し、エンドスタチンの誘導ペプチドの活性を向上する必要がある。
Cancer Res. 2005；65(9):3656-63
発明の開示
本発明は、エンドスタチンのN末端から45個アミノ酸残基以内の長さの断片であり、且つ少なくともN末端の1〜20番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、前記エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸残基及び18番目のアミノ酸残基はそれぞれ下記の群より選ばれる。
本発明は、エンドスタチンのN末端から45個アミノ酸残基以内の長さの断片であり、且つ少なくともN末端の1〜20番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、前記エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸残基及び18番目のアミノ酸残基はそれぞれ下記の群より選ばれる。
選択的に、前記エンドスタチンのN末端の17番目のアミノ酸はS、A、L、I又はTであり、及び/又は20番目のアミノ酸残基はS又はTであり、及び/又は21番目及び/又は22番目のアミノ酸残基を含む場合、21番目アミノ酸残基はG、A、L、I又はVであり、及び/又は22番目アミノ酸残基はG、A、L、I又はVである。
好ましくは、前記エンドスタチンのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 1で示されるとおりである。
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、2番目及び18番目のアミノ酸残基は前述のとおりである。
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、2番目及び18番目のアミノ酸残基は前述のとおりである。
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、2番目のアミノ酸残基はTであり、18番目のアミノ酸残基はN、G、K、M、F、S又はTであり、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述の通りである。
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ18番目のアミノ酸残基はNであり、2番目のアミノ酸残基はTであり、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述の通りである。
一つの実施形態において、前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、18番目のアミノ酸残基はSであり、2番目のアミノ酸残基はE、H、L、T、W又はVであり、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述の通りである。
一つの実施形態において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 4、5、6、7、27〜30、39又は41で示されるとおりである。
1つの実施形態において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:38からなり、ただし、2番目のアミノ酸残基はTであり、18番目のアミノ酸残基はN又はSであり、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述の通りである。
1つの実施形態において、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO: 4の1番目から39、38、37、36、34、33、32、31、29、28、27又は26番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及びSEQ ID NO: 39の1番目から39、38、37、36、35、34、33、32、31、29、28、27、26又は25番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる群より選ばれる。
1つの実施形態において、前記ポリペプチドのN末端の1番目のアミノ酸残基はヒスチジンであり、このヒスチジンはホルミル化、アセチル化、リジンプロピオニル化又はリジンブチリル化により修飾され、C末端の1番目のアミノ酸は、PEG、コレステロール又はアミド化により修飾されることができる。
1つの実施形態において、前記ポリペプチドは下記のアミノ酸配列からなる群より選ばれる。
HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD；
HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac- HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRG-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGADFQCFQ-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGADFQCFQQARAV-NH2；
HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD；
HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD -NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNASLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLTGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNASLTGGMRGIRGAD-NH2；及び
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGA-NH2；
ただし、Acはアセチル化修飾であり、NH2はアミド化修飾である。
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD；
HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac- HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRG-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGADFQCFQ-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGADFQCFQQARAV-NH2；
HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD；
HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD -NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNASLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLTGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNASLTGGMRGIRGAD-NH2；及び
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGA-NH2；
ただし、Acはアセチル化修飾であり、NH2はアミド化修飾である。
本発明は、更に下記の配列からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列を提供する。
（1）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;及び
（2）前記（1）のポリヌクレオチド配列の相補的な配列。
（1）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;及び
（2）前記（1）のポリヌクレオチド配列の相補的な配列。
1つの実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO：32、33、34、35、37及び40からなる群より選択される。
1つの実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO：32の1番目から117、114、111、108、102、99、96、93、87、84、81又は78番目の塩基からなるポリヌクレオチド配列からなる群より選ばれる。
1つの実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO：40の1番目から117、114、111、108、105、102、99、96、93、87、84、81、78又は75番目の塩基からなるポリヌクレオチド配列からなる群より選ばれる。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
また、本発明は、本発明のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物を提供する。
また、本発明は、本発明のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物を提供する。
また、本発明は、腫瘍の予防又は治療用薬剤の調製における本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用を提供する。
1つの実施形態において、前記腫瘍は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、及び骨肉腫からなる群より選ばれる。
また、本発明は、化学療法剤の治療効果を高めるための医薬の調製における本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用を提供する。
1つの実施形態において、前記化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンである。
また、本発明は、Fmoc固相合成法によりアミノ酸配列を合成することを含む、本発明のアミノ酸配列の調製方法を提供する。
具体的な実施形態
本発明のポリペプチドは、エンドスタチンのN末端から45個以内の長さのアミノ酸残基の断片であり、少なくともエンドスタチンのN末端1〜20番目のアミノ酸残基を含む。ただし、
（1）エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸に対応する残基は、A、R、N、D、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y又はVであり;及び
（2）エンドスタチンのN末端の18番目のアミノ酸に対応する残基は、A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y又はVである;
且つ、前記ポリペプチドは、突然変異のない対応するポリペプチドに比べて、同じ濃度条件下、HUVECに対する抑制率が少なくとも15％高く、好ましくは、少なくとも20％高い。又は前記ポリペプチドは、突然変異のない対応するポリペプチドに比べて、前者IC50濃度は後者IC50濃度の二分の一であり、好ましくは、前者IC50濃度は後者IC50濃度の五分の一であり、より好ましくは、前者IC50濃度は後者IC50濃度の十分の一である。
本発明のポリペプチドは、エンドスタチンのN末端から45個以内の長さのアミノ酸残基の断片であり、少なくともエンドスタチンのN末端1〜20番目のアミノ酸残基を含む。ただし、
（1）エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸に対応する残基は、A、R、N、D、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y又はVであり;及び
（2）エンドスタチンのN末端の18番目のアミノ酸に対応する残基は、A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、Y又はVである;
且つ、前記ポリペプチドは、突然変異のない対応するポリペプチドに比べて、同じ濃度条件下、HUVECに対する抑制率が少なくとも15％高く、好ましくは、少なくとも20％高い。又は前記ポリペプチドは、突然変異のない対応するポリペプチドに比べて、前者IC50濃度は後者IC50濃度の二分の一であり、好ましくは、前者IC50濃度は後者IC50濃度の五分の一であり、より好ましくは、前者IC50濃度は後者IC50濃度の十分の一である。
エンドスタチンは、好ましくはヒトエンドスタチンである。SEQ ID NO: 1は組換えヒトエンドスタチンの一例を示す。好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、少なくともSEQ ID NO：1で示されるエンドスタチンのN末端の1〜20番目アミノ酸残基を含み、2番目及び18番目のアミノ酸は本文に記載のとおりである。
好ましくは、前記ポリペプチドにおいて、エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸に対応する残基は、D、L、T、W又はYである。好ましくは、前記ポリペプチドにおいて、エンドスタチンのN末端の18番目のアミノ酸に対応する残基は、N、E、K、M、S、T又はVである。より好ましくは、前記ポリペプチドにおいて、エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸に対応する残基は、D、T、W又はYである。より好ましくは、前記ポリペプチドにおいて、エンドスタチンの18番目のアミノ酸に対応する残基は、N、S又はVである。
ある実施形態において、前記ポリペプチドにおいて、エンドスタチンの2番目のアミノ酸及び18番目のアミノ酸に対応する残基は、それぞれ下記の組み合わせである：
又は、ある実施形態において、前記ポリペプチドにおいて、エンドスタチンの2番目のアミノ酸及び18番目のアミノ酸に対応する残基は、それぞれ下記の組み合わせである：
「断片」は、完全長配列の部分の連続した配列を指すことが理解される。例えば、本文のポリペプチドは、好ましくは、エンドスタチンのN末端の1番目のアミノ酸から20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45番目のアミノ酸残基からなり、且つ2番目及び18番目は本文に記載のアミノ酸残基の配列である。言い換えれば、本発明のポリペプチドは、エンドスタチンのN末端の1番目のアミノ酸残基からの20〜45個アミノ酸残基の長さである。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、N末端の1番目のアミノ酸残基からの25〜40個アミノ酸残基の長さである。
ある実施形態において、前記断片は、2番目及び18番目が本文に記載のアミノ酸残基である以外に、選択的に、17、20、21及び22番目のいずれか１つ、二つ、三つ又は全ての四つは以下の残基である。
17番目のアミノ酸残基：S、A、L、I、V又はT；
20番目のアミノ酸残基：S又はT；
21番目のアミノ酸残基：G、A、L、I又はV；
22番目のアミノ酸残基：G、A、L、I又はV；
従って、ある実施形態において、エンドスタチンのN末端の45個アミノ酸残基以内の長さの断片である本発明のポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目及び18番目は本文に記載されるアミノ酸残基であり、且つ17、20〜22番目のいずれか１つ、二つ、三つ又は全ての四つは前述の残基である。更に、これらのポリペプチドは、25〜40個アミノ酸残基の長さである。
20番目のアミノ酸残基：S又はT；
21番目のアミノ酸残基：G、A、L、I又はV；
22番目のアミノ酸残基：G、A、L、I又はV；
従って、ある実施形態において、エンドスタチンのN末端の45個アミノ酸残基以内の長さの断片である本発明のポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目及び18番目は本文に記載されるアミノ酸残基であり、且つ17、20〜22番目のいずれか１つ、二つ、三つ又は全ての四つは前述の残基である。更に、これらのポリペプチドは、25〜40個アミノ酸残基の長さである。
ある実施形態において、エンドスタチンのN末端の45個アミノ酸残基以内の長さの断片である本発明のポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目のアミノ酸残基はTであり、18番目のアミノ酸残基はN、G、K、M、F、S又はT（より好ましくはN又はS）であり、選択的に、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述のとおりである。さらに好ましくは、これらのポリペプチドは、25〜40個アミノ酸残基の長さである。
ある実施形態において、エンドスタチンのN末端の45個アミノ酸残基以内の長さの断片である本発明のポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ18番目のアミノ酸残基はNであり、2番目のアミノ酸残基はTであり、選択的に、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述のようである。さらに好ましくは、これらのポリペプチドは、25〜40個アミノ酸残基の長さである。
ある実施形態において、エンドスタチンのN末端の45個アミノ酸残基以内の長さの断片である本発明のポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ、18番目のアミノ酸残基はSであり、2番目のアミノ酸残基はE、H、L、T、W又はVであり、選択的に、17、20、21及び22番目のアミノ酸は前述のとおりである。さらに好ましくは、これらのポリペプチドは、25〜40個アミノ酸残基の長さである。
本発明の好ましいポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 4、5、6、7、27〜30、39又は41で示されるとおりである。本発明のポリペプチドは、更にSEQ ID NO: 4の1番目から39、38、37、36、34、33、32、31、29、28、27又は26番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及びSEQ ID NO: 39の1番目から39、38、37、36、35、34、33、32、31、29、28、27、26又は25番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
本発明のポリペプチドのN末端の1番目のアミノ酸残基はヒスチジンであり、このヒスチジンは、ホルミル化、アセチル化、リジンプロピオニル化又はリジンブチリル化により修飾され、そのC末端の1番目のアミノ酸は、PEG、コレステロール又はアミド化により修飾されることができる。
好ましくは、本発明のポリペプチドのN末端の1番目のアミノ酸残基であるヒスチジンはアセチル化により修飾され、そのC末端の1番目のアミノ酸はアミド化により修飾される。
遺伝子クローニング操作において、通常に適切な制限酵素切断部位を設計する必要があり、これは発現しようとするアミノ酸配列の末端に１つ又は複数の無関係の残基を導入するが、配列の活性に影響しないべきであることが理解される。また、例えば、融合タンパク質の構築、組換えタンパク質の発現の促進、自動的に宿主細胞外に分泌する組換えタンパク質の獲得、又は組換えタンパク質の精製のために、通常にあるアミノ酸を、組換えタンパク質のN-末端、C-末端又はこのタンパク質の他の適合な領域に添加すべきであり、例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端延長などが含まれるが、これらに制限されない。本発明のアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端は、タンパク質タグとして1つ以上のポリペプチド断片をさらに含んでいてもよい。任意の適切なタグは全部本発明に用いることができる。例えば、前記タグは、FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly -His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE及びTy1であってもいい。これらのタグはタンパク質の精製に用いることができる。用いられるタグの例として、Poly-Arg、例えばRRRRR（SEQ ID NO:42）；Poly-His 2〜10個(通常6個)、例えばHHHHHH(SEQ ID NO: 43)；FLAG、即ちDYKDDDDK（SEQ ID NO:44）；Strep-TagII、即ちWSHPQFEK（SEQ ID NO:45）；及びC-myc、即ちWQKLISEEDL（SEQ ID NO:46）であってもいい。
よって、本発明は、更に、タグ配列を含むか、又は前記タグ配列及び上記断片からなるポリペプチドを含む。
本発明のアミノ酸配列は、化学合成の生成物であってもよく、組換え技術により、原核生物又は真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、糸状菌、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞）から生成される組換えポリペプチドであってもよい。組換え方法に用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよく、非グリコシル化されてもよい。
例えば、本発明のアミノ酸配列は、本分野で公知のポリペプチド化学合成法を用いて合成することができる。ポリペプチド化学合成法には、通常用いられる固相合成法である固相合成及び液相合成が含まれる。固相合成法には、Fmoc及びtBocの二つの通常の方法が含まれるが、これらに限定されない。一般的に、樹脂を不溶性固体担体として、通常にC末端（カルボキシル基末端）からN末端（アミノ基末端）へ、アミノ酸をペプチド鎖に接続させ、各アミノ酸の接続循環は、次の三つのステップからなる。つまり、1）脱保護：保護されたアミノ酸は、必ず一種の脱保護溶媒でアミノ保護基を除去する; 2）活性化：接続されるアミノ酸のカルボキシル基は活性化剤により活性化される;及び3）カップリング：活性化されたカルボキシル基は、前のアミノ酸における露出されたアミノ基と反応して、ペプチド結合を形成する。ペプチド鎖が所望の長さに達するまで繰り返して循環する。最後に、切断液を用いてペプチド鎖と固体担体との間のリンカーを切断して、所望のアミノ酸配列を得る。上記の化学合成を、プログラム制御の自動化ポリペプチド合成装置で行うことができ、これらの装置は、Protein Technologies会社のTribute2チャンネルポリペプチド合成装置、C S Bio会社のUV Online Monitorシステム、Aapptec会社のFocus XC３チャンネルポリペプチド合成装置などを含むが、これらに制限されない。
本発明は、更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、SEQ ID NO：30は、SEQ ID NO：1のコード配列を示す：SEQ ID NO：31は、SEQ ID NO：3のコード配列を示す；SEQ ID NO：32は、SEQ ID NO：4のコード配列を示す； SEQ ID NO：33はSEQ ID NO：5のコード配列を示す；SEQ ID NO：34はSEQ ID NO：6のコード配列を示す；SEQ ID NO：35は、SEQ ID NO：7のコード配列を示す；SEQ ID NO：36は、SEQ ID NO：8のコード配列を示す；SEQ ID NO：37は、SEQ ID NO：9のコード配列を示す、SEQ ID NO：40は、SEQ ID NO：39のコード配列を示す。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAの形態であってもよい。DNA形態には、cDNA、ゲノムDNA又は人工合成DNAが含まれる。DNAは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。DNAはコード鎖又は非コード鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード領域の配列は、上記DNA配列と同じであってもよく、その縮重変異体であってもよい。本文に用いられるように、「縮重変異体」とは、本発明において、本発明のアミノ酸配列をコードするが、SEQ ID NO：31などで示される配列と差異を有する核酸配列を指す。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであってもよく、追加のコード及び/又は非コード配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供し、より好ましくは均質に精製される。
本発明のヌクレオチド配列は、通常、PCR増幅法、組換え法、又は人工合成法により得ることができる。PCR増幅法において、本発明に開示された関連ヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に基づいてプライマーを設計し、市販cDNAライブラリー、又は当業者に公知の通常の方法によって製造されたcDNAライブラリーをテンプレートとして、増幅させて関連配列を得る。配列がより長い場合、一般的に2回以上のPCR増幅を行ってから、各回に増幅された断片を正しい順序でスプライシングする。
関連配列が得られたら、組換え方法により、関連配列を大量に得ることができる。これは、通常、ベクターにクローニングした後、細胞に入れ、次いで従来の方法によって増殖した宿主細胞から単離して、関連する配列を得る。
さらに、特に断片の長さが短い場合、人工合成方法により関連配列を合成することができる。一般に、長い断片は、複数の小さな断片を合成した後、ライゲーションすることによって得ることができる。
現在、本発明のアミノ酸配列をコードするDNA配列は、完全に化学合成によって得ることができる。次いで、DNA配列を、本技術分野で公知の様々な既存のDNA分子（又はベクター）及び細胞に導入することができる。
本発明は、更に本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクターを用いて遺伝子工程により得られる宿主細胞、及び組換え技術により本発明の前記ポリペプチドを得る方法に関する。好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。
従来の組換えDNA技術により、本発明のポリヌクレオチド配列を用いて、本発明のポリペプチドを発現又は産生することができる。一般的に、以下のステップを含む。
（1）本発明のポリヌクレオチド又は縮重変異体を用いて、或いはこのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを用いて、適当な宿主細胞に形質転換又は形質導入する。
（2）適切な培地で宿主細胞を培養する;
（3）培地又は細胞からタンパク質を単離、精製する。
（3）培地又は細胞からタンパク質を単離、精製する。
本発明のポリヌクレオチド配列を、組換え発現ベクターに挿入することができる。用語「組換え発現ベクター」は、技術分野で既知の細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスのような哺乳動物細胞のウイルス又は他のベクターを指す。宿主中で複製し安定であれば、いかなるプラスミド及びベクターを使用することができる。発現ベクターの重要な特徴は、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳制御エレメントを含むことである。発現ベクターは、更に翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。
当業者に周知の方法を用いて、本発明の核酸配列及び適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、DNA合成技術、in vivo組換え技術などが含まれる。前記核酸配列は、発現ベクター中の適切なプロモーターに作動可能に連結されて、mRNA合成を導くことができる。このようなプロモーターの代表例として、大腸菌lac又はtrpプロモーター；λファージのPLプロモーター；CMV最初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、トランス転写ウイルスのLTRsを含む真核生物プロモーター及び他の既知の制御可能な遺伝子が原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルス中で発現するプロモーターがある。
また、発現ベクターは、好ましくは、1つ以上のジヒドロ葉酸還元酵素、ネオマイシン耐性、及び緑色蛍光タンパク質（GFP）或いは大腸菌に対するテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のような選択性マーカー遺伝子を含んで、形質転換された宿主細胞の表現型形質の選択に提供される。
上記の適切なDNA配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターは、タンパク質を発現させるように、適切な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞；下等真核細胞、例えば酵母細胞;糸状菌細胞、又は高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞であってもよい。代表的な例として：大腸菌、ストレプトミセス；ネズミチフス菌の細菌細胞;真菌細胞、例えば酵母、糸状菌、植物細菌；昆虫細胞、例えばショウジョウバエS2細胞又はSf9細胞;又は動物細胞、例えばCHO、COS、293細胞、ボウズ（Bowes）黒色腫瘍細胞などがある。
本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞で発現する場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入すると、転写が増強される。エンハンサーはDNAのシスエレメントであり、通常約10〜300個の塩基対を有し、プロモーターに作用して遺伝子の転写を増強させる。
当業者は、どのように適切なベクター、プロモーター、エンハンサー、及び宿主細胞を選択するかをよく知っている。
組換えDNAの宿主細胞への形質転換は、当業者に周知の従来の技術を用いて行うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、DNAの取り込みが可能なコンピテントセルは指数増殖期後に回収でき、CaCl2法で処理し、採用する手順は、当該分野の公知である。他の方法は、MgCl2を使用することである。必要に応じて、形質転換はエレクトロポレーション法を採用することもできる。宿主が真核生物である場合、次のDNAトランスフェクション法、例えば、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどの通常の機械的方法、を選択することができる。
得られた形質転換体は、常法によって培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。培養に使用される培養培地は、用いられる宿主細胞によって、様々な通常の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで成長した後、適切な手段（例えば、温度シフト又は化学的誘導）により、選択されたプロモーターを誘導し、細胞を更にある期間培養する。
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内で、又は細胞膜で発現されるか、又は細胞外に分泌される。必要に応じて、その物理的、化学的及び他の特性を用いて、様々な分離方法によって組換えタンパク質を単離及び精製することができる。これらの方法は、当業者に周知である。このような方法の例として、通常の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析方法）、遠心分離、浸透による細菌破砕、超処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、及び他の様々な液体クロマトグラフィー技術及びこれらの方法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。先行技術には、様々な組換え技術によってポリペプチドを調製する方法がある。
また、本発明は、本発明のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、治療又は予防有効量の本発明のポリペプチドを含むことができる。 「有効量」は、ある成分の量が所望の反応を生じるのに十分であることを指す。具体的な有効量は、治療しようとする特定の状態、患者の体調（例えば、患者の体重、年齢、性別など）、治療持続時間、共投与療法（もしあれば）、及び使用される具体的な処方のような様々な要因により決められる。「有効量」は、この使用量により、本発明のポリペプチドの毒性又は負の効果が、得られる正の効果より小さいことも意味する。
薬学的に許容される担体は、一般的に安全で、非毒性であり、広い意味で充填剤、希釈剤、凝固剤、結合剤、滑沢剤、滑剤、安定剤、着色剤、湿潤剤、崩壊剤などの医薬組成物の調製に用いられる製薬業界における任意の公知のものを含むことができる。合成ペプチドの送達に適切な賦形剤を選択する場合、主要な考慮事項は医薬組成物の投与方式であり、当業者はこの技術を熟知している。
本発明の医薬組成物におけるポリペプチドの含有量は約0.01〜1000μMである。
既知の薬学的な手順によって上記の医薬組成物を調製することができる。例えば、「レミントンの薬学」（Remington’s Pharmaceutical Sciences）（第17版、アルフォノーゾ・R・ジェンナーロ（Alfonoso R. Gennaro）編集、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン、ペンシルベニア州（1985））の本に詳細な記載がある。
既知の薬学的な手順によって上記の医薬組成物を調製することができる。例えば、「レミントンの薬学」（Remington’s Pharmaceutical Sciences）（第17版、アルフォノーゾ・R・ジェンナーロ（Alfonoso R. Gennaro）編集、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン、ペンシルベニア州（1985））の本に詳細な記載がある。
本発明の医薬組成物は種々の適切な剤形であってもよく、錠剤、カプセル剤、注射剤等を含むが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は他の既知の化学療法薬物を含んでもよく、特に既知の腫瘍を治療又は予防する化学療法薬物を含んでもよく、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンを含むが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチド及び医薬組成物は、既知のエンドスタチンが治療又は予防できる種々の疾患の治療又は予防に用いられ、エンドスタチンが緩和又は軽減できる既知の種々の疾患の緩和又は軽減することができる。
例えば、本発明のポリペプチド及び医薬組成物は、必要とする対象に投与することにより、腫瘍の治療又は予防に用いられる。対象は哺乳動物、特にヒトである。
腫瘍には、血管腫及び固形腫瘍が含まれる。前記固形腫瘍は、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽腫、骨肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肝臓癌、結腸癌及び膵臓癌などを含むが、これらに限定されない。
また、本発明は、必要とする対象に本発明のポリペプチド又は医薬組成物を投与することを含む癌治療方法を提供する。
また、本発明は、必要とする対象に化学療法薬を投与する前、同時又は投与した後に、本発明のポリペプチド又は医薬組成物を投与することを含む、化学療法薬の有効性を高める方法を提供する。
また、本発明は、腫瘍を治療又は予防するための医薬の調製における、本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用を提供する。
また、本発明は、化学療法薬の有効性を増強するための医薬の調製における、本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用を提供する。
また、本発明は、医薬品として使用するためのポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、本発明の前述の各態様又は実施形態に記載されるとおりである。また、本発明は、上記の様々な腫瘍を治療又は予防する、又は化学療法薬の治療効果を増強するためのポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは本発明の前述の各態様又は実施形態に記載されるとおりである。
具体的な実施形態を結合して、本発明をさらに説明する。本発明の実施形態は、特に断らない限り、当業者に既知の化学、生化学、組換えDNA技術及び免疫学の通常の方法を用いる。これらの技術は文献で十分に説明されている。例えば、「ペプチド：化学及び生物学」、科学出版社、N.Sewald、H.D.Jakubke著、劉克良、何軍林ら翻訳；「基礎免疫学」（Fundamental Virology）、第二版、第I及びII卷(B.N.Fields及びD.M.Knipe編集)；「実験免疫学のハンドブック」（Handbook of Experimental Immunology）、第I〜IV巻（D.M.Weir及びC.C.Blackwell編集、Blackwell Scientific Publications）；T.E. Creighton，「タンパク質：構造と分子特性」（Proteins: Structures and Molecular properties）（W.H. Freeman and Company、1993）; A.L. Lehninger、「生物化学」（Biochemistry） (Worth Publishers, Inc.最新版)；Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル」（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）、第二版、1989;「酵素学方法」（Methods in Engymology）(S.Colowick及びN. Kaplan編集、Academic Press，Inc.)を参照する。また、本発明における「含む」は、「からなる」も含むことと理解される。本文に使用されるアミノ酸配列の番号、すなわち、「SEQ ID NO：1〜29、38、39及び41」は、アミノ酸配列自体を指し、N末端及びC末端の修飾を含まない。
実施例1：ポリペプチドの調製及び修飾
ポリペプチド合成標準Fmocプロトコールによって、0.25mM樹脂から開始して、以下の配列のようにカルボキシ末端からアミノ末端まで残基を伸びて合成し、最後にN末端修飾を加えることができる。ペプチド合成の完了後、切削液で切断し、G6砂コアガラス漏斗で樹脂を除去し、濾液を真空乾燥し、C末端ポリペプチドをさらにアミド化することができる。イオンフリー水でポリペプチド生成物を溶解し、AKTA explorer 100型中圧分取液体クロマトグラフィーC18カラムで精製し、主ピークを段階的に集めた。標的ピークの収集試料を、Agilent 1100 型逆相高速液体クロマトグラフィーPhenomenex C18分析カラムによって同定し、LCQ Advantage質量分析計で分子量を同定した。中圧分取液体クロマトグラフィーの精製により得られた収集液を凍結乾燥し、PBSに溶解してポリペプチド原液を調製し、0.20μMでろ過して菌を除去し、-80℃で冷凍保存した。HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1を参照する。
ポリペプチド合成標準Fmocプロトコールによって、0.25mM樹脂から開始して、以下の配列のようにカルボキシ末端からアミノ末端まで残基を伸びて合成し、最後にN末端修飾を加えることができる。ペプチド合成の完了後、切削液で切断し、G6砂コアガラス漏斗で樹脂を除去し、濾液を真空乾燥し、C末端ポリペプチドをさらにアミド化することができる。イオンフリー水でポリペプチド生成物を溶解し、AKTA explorer 100型中圧分取液体クロマトグラフィーC18カラムで精製し、主ピークを段階的に集めた。標的ピークの収集試料を、Agilent 1100 型逆相高速液体クロマトグラフィーPhenomenex C18分析カラムによって同定し、LCQ Advantage質量分析計で分子量を同定した。中圧分取液体クロマトグラフィーの精製により得られた収集液を凍結乾燥し、PBSに溶解してポリペプチド原液を調製し、0.20μMでろ過して菌を除去し、-80℃で冷凍保存した。HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1を参照する。
実施例2：ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単離及び培養
臍帯保存液の準備：150mlのPBS +3倍の作業濃度の二重抗体（ペニシリン/ストレプトマイシン）；完全培地の準備：80ml M199 + 20ml FBS + 1ml ECGS +1ml 100Xの二重抗体+1mlヘパリン溶液（0.5％W/V）+ 1ml 200mMのグルタミン;分離器の準備：1個の手術湾曲プレート、4〜5個の血管鉗子、2個の外科用ハサミ、直径約10cmのガラスペトリ皿；I型コラゲナーゼの調製：1％（W/V）とする。
臍帯保存液の準備：150mlのPBS +3倍の作業濃度の二重抗体（ペニシリン/ストレプトマイシン）；完全培地の準備：80ml M199 + 20ml FBS + 1ml ECGS +1ml 100Xの二重抗体+1mlヘパリン溶液（0.5％W/V）+ 1ml 200mMのグルタミン;分離器の準備：1個の手術湾曲プレート、4〜5個の血管鉗子、2個の外科用ハサミ、直径約10cmのガラスペトリ皿；I型コラゲナーゼの調製：1％（W/V）とする。
胎児臍帯の端部から20cmを取って、洗浄し、両端を結んで、150ml臍帯保存液に入れた。4℃冷蔵庫で保存して、6時間以内に消化させた。臍帯を検査して、損傷部分を除去し、臍帯静脈を充分に洗浄した後、10mlのコラゲナーゼ溶液に注入し、37℃インキュベーターに転移して、15分間消化させた。臍帯を取って、消化液を収集し、PBSで洗浄し、遠心分離した後、培養を再懸濁し、24時間後培地を交換し、壁に接着できない細胞を除去した。
実施例3：ポリペプチドのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）及び腫瘍細胞に対する抑制
MTTアッセイで細胞増殖に対する抑制を測定した。その原理は、生細胞のミトコンドリアにおけるコハク酸デヒドロゲナーゼが外因性MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を水不溶性青紫色のホルマザン（Formazan）結晶へ還元し、細胞中に沈着させるが、死んだ細胞はこの機能がないことである。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、細胞におけるホルマザンを溶解し、ELISAリーダーで波長490/570nmにおける吸光度を測定して、間接に生細胞の数を反映できる。所定数量の細胞範囲内で、形成されるMTT結晶の量は、細胞数に比例する。対数期のHUVEC細胞又は腫瘍細胞に対して、培養上清を捨て、PBSで1回洗浄し、1mlの0.25%トリプシン（4℃）を入れて、37℃で2分間消化し、培養上清を添加して中和し、細胞をピペッティングして懸濁液とした後、1000rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、5mlの培地に再懸濁させた。3×104/mlで48ウェルプレートに接種し、500μl/ウェルとした。5%CO2、37℃で２４時間培養した。培養した細胞の上清を捨て、ポリペプチド含有培地（培地は濃度17.39μmol/LのZn2+を含有する）を添加し、48時間培養続けた。慎重に各ウェルの上清を捨て、450μl/ウェルのPBSで1回柔らかく洗浄した。各ウェルに450μlのMTT培地を添加し、4時間培養を続けた。慎重に各ウェルの上清を捨て、450μl/ウェルでジメチルスルホキシドを加え、光線を避けて振盪器で低速振動を10分間行った。150μlの上清を96ウェルELISAプレートに移し、ELISAリーダーで、OD490nm、570nmで吸光度を測定した。
MTTアッセイで細胞増殖に対する抑制を測定した。その原理は、生細胞のミトコンドリアにおけるコハク酸デヒドロゲナーゼが外因性MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を水不溶性青紫色のホルマザン（Formazan）結晶へ還元し、細胞中に沈着させるが、死んだ細胞はこの機能がないことである。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、細胞におけるホルマザンを溶解し、ELISAリーダーで波長490/570nmにおける吸光度を測定して、間接に生細胞の数を反映できる。所定数量の細胞範囲内で、形成されるMTT結晶の量は、細胞数に比例する。対数期のHUVEC細胞又は腫瘍細胞に対して、培養上清を捨て、PBSで1回洗浄し、1mlの0.25%トリプシン（4℃）を入れて、37℃で2分間消化し、培養上清を添加して中和し、細胞をピペッティングして懸濁液とした後、1000rpmで3分間遠心分離した。上清を捨て、5mlの培地に再懸濁させた。3×104/mlで48ウェルプレートに接種し、500μl/ウェルとした。5%CO2、37℃で２４時間培養した。培養した細胞の上清を捨て、ポリペプチド含有培地（培地は濃度17.39μmol/LのZn2+を含有する）を添加し、48時間培養続けた。慎重に各ウェルの上清を捨て、450μl/ウェルのPBSで1回柔らかく洗浄した。各ウェルに450μlのMTT培地を添加し、4時間培養を続けた。慎重に各ウェルの上清を捨て、450μl/ウェルでジメチルスルホキシドを加え、光線を避けて振盪器で低速振動を10分間行った。150μlの上清を96ウェルELISAプレートに移し、ELISAリーダーで、OD490nm、570nmで吸光度を測定した。
実施例4：ポリペプチドのN末端修飾及びC末端修飾がその活性に及ぼす影響
実施例1に示す合成方法により、下記の表で示される配列がSEQ ID NO: 2であるポリペプチドを合成し、N末端及び/又はC末端修飾を有する又は有しない。ただし、Acはアセチル化修飾であり、NH2はアミド化修飾である。それに対して、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定を行った。
実施例1に示す合成方法により、下記の表で示される配列がSEQ ID NO: 2であるポリペプチドを合成し、N末端及び/又はC末端修飾を有する又は有しない。ただし、Acはアセチル化修飾であり、NH2はアミド化修飾である。それに対して、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定を行った。
組換えヒトエンドスタチン（endostatin，SEQ ID NO: 1）は、市場から購買できる（例えば、Genetexのカタログ番号GTX65524、BioVisionのカタログ番号4799-1000、上海博昇生物科技有限会社のカタログ番号E2296-05、武漢博士徳生物工程有限会の社カタログ番号 番号BP4153等）。市販の組換えヒトエンドスタチン薬物エンドスター（endostar，SEQ ID NO: 10）は、医療機関から購入した。
実施例3に示す方法により、ポリペプチド濃度1mg/ml、組換えヒトエンドスタチン濃度5mg/ml（ポリペプチド及びエンドスタチンは等モル濃度に近い）の試験条件下で、P1、P2、P3及びP4ポリペプチド、エンドスタチン、エンドスターが、HUVECに対する抑制の生物学的活性を測定し、測定結果は図2のとおりである。
実施例5：ポリペプチドの構造活性相関に関する研究
実施例1に示す合成方法により、配列が下記の表に示されたポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定を行った。実施例3に示す方法により、1mg/ml濃度条件下、ポリペプチドのHUVECに対する抑制の生物学活性の測定を行って、測定結果は図4のようである。
実施例1に示す合成方法により、配列が下記の表に示されたポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定を行った。実施例3に示す方法により、1mg/ml濃度条件下、ポリペプチドのHUVECに対する抑制の生物学活性の測定を行って、測定結果は図4のようである。
文献に（EMBO J. 1998年3月16日; 17（6）：1656〜1664）に記載されたエンドスタチン構造（PDBデータベース構造番号1BNL）を基礎として、INSIGHT IIIソフトウェアを用いて、前記ポリペプチドに対してホモロジーモデリングを行って、P2ポリペプチドの優勢な立体配座を得た。次いで、完全活性空間多配置（CASSCF）を用いて、P2ポリペプチドの最高被占分子軌道（HOMO）エネルギー及び最低空分子軌道（LUMO）エネルギーを計算した。これに基づいて、独創のアルゴリズム-ポリペプチドのアミノ酸2次元相乗効果反復空間ポテンシャル場アルゴリズム（2-D synergistic iterative algorithms in spacial point field，2-D SIASPF）により、P2ポリペプチドにおけるアミノ酸に対してペアワイズ組み合わせのシミュレーション反復置換を行って、置換によってポリペプチドZnイオン結合活性領域（1H、3H、11H）で引き起こす電子密度の平方偏差相加を計算し、アミノ酸組み合わせの生物活性に対する実測値に基づいて、P2の各アミノ酸の二つの部位間の生物活性の相乗関係について評価した結果、ポリペプチドの2番目及び18番目のアミノ酸の生物活性の相乗性に対して影響が最も高かった。
実施例6：ポリペプチドのアミノ酸置換がその活性に及ぼす影響
2番目及び18番目のアミノ酸のP2ペプチド組み合わせのペプチドライブラリーを構築した。AAPPTEC会社のApex396全自動High Throughputペプチドシンセサイザーを用いて、次の表に示した配列を有するポリペプチドを合成した。ただし、X1及びX3は任意の天然アミノ酸であり（以下の表を参照）、X2及びX4はSであり、X5及びX6は、Gである。
2番目及び18番目のアミノ酸のP2ペプチド組み合わせのペプチドライブラリーを構築した。AAPPTEC会社のApex396全自動High Throughputペプチドシンセサイザーを用いて、次の表に示した配列を有するポリペプチドを合成した。ただし、X1及びX3は任意の天然アミノ酸であり（以下の表を参照）、X2及びX4はSであり、X5及びX6は、Gである。
実施例3に示す方法により、1mg/ml濃度条件下、ポリペプチドのHUVECに対する抑制の生物学的活性を測定し、測定結果の次の表に示した。
表において，小文字a、b、c、d、e、f、g、h、i及びjはそれぞれ下記の意味を示す：
a：細胞活性0〜10％；b：細胞活性11〜20％；c：細胞活性21〜30％；d：細胞活性31〜40％；e：細胞活性41〜50％；f：細胞活性51〜60％；g：細胞活性61〜70％；h：細胞活性71〜80％；i：細胞活性81〜90％；j：細胞活性91〜100％。
a：細胞活性0〜10％；b：細胞活性11〜20％；c：細胞活性21〜30％；d：細胞活性31〜40％；e：細胞活性41〜50％；f：細胞活性51〜60％；g：細胞活性61〜70％；h：細胞活性71〜80％；i：細胞活性81〜90％；j：細胞活性91〜100％。
実施例7：ポリペプチドの腫瘍細胞及びHUVECのin vitro増殖に対する抑制
実施例1に示す合成方法により、配列が下記の表に示されたポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定を行った。
実施例1に示す合成方法により、配列が下記の表に示されたポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定を行った。
SEQ ID NO：1の配列のような組換えエンドスタチン（endostatin）、SEQ ID NO: 10の配列のような市販される薬物エンドスター（endostar）に対して、実施例3に示す方法により、HUVEC及び腫瘍細胞HepG2に対する抑制作用を測定し、測定結果は図5A、図5B及び下記の表を参照する。結果は、P2T2S18及びP2T2N18の生物活性がP2より顕著に高く、そのIC50濃度がP2より10倍低いことを示した。しかし、2番目のアミノ酸の単一の点突然変異を有するポリペプチドP2T2及び18番目のアミノ酸の単一の点突然変異を有するP2N18とP2S18の生物活性が、いずれもP2より低かった。従って、P2T2S18とP2T2N18の高生物活性は、2番目のアミノ酸と18番目のアミノ酸の共通の変異による予想外の相乗効果により生じ、通常の点突然変異スキャニング法により、本発明のP2T2S18とP2T2N18の高生物活性構造を得ることが困難であることが分かる。
実施例8：ポリペプチドのSPC-A-1腫瘍細胞のin vitro死亡に対する誘導
実施例3に示す方法により、ポリペプチドの濃度2.5mg/mlの条件下ポリペプチドのSPC-A-1肺癌細胞系に対する細胞死亡の誘導作用を測定し、光学顕微鏡下で24時間観察し撮影した。結果は図6に示すように、p2を培地に添加した後4時間から作用を発揮し、細胞が収縮し、24時間で細胞が基本的に死亡し、p2が細胞死を誘導する方式はアポトーシスと類似した。P2T2S18を培地に添加した後、2時間後から細胞に対して激烈に作用を発揮したが、細胞が収縮したのではなく、極度に膨張した。4時間後に膨張が更に加速化して、8時間後細胞は破裂し始め、24時間で細胞残屑のみが存在した。P2T2S18による細胞死亡は驚くことであり、現在このような細胞死亡がどのパータンであるかを確定できなく、報告されたこともない。しかしながら、このような細胞死亡パータンは、P2による細胞死亡とは著しく異なることは明らかである。実施例7の結果を組み合わせてみると、P2T2S18は生物活性がP2より顕著に高いばかりでなく、細胞死亡を引き起こす方式もP2とは明らかに異なる。
実施例3に示す方法により、ポリペプチドの濃度2.5mg/mlの条件下ポリペプチドのSPC-A-1肺癌細胞系に対する細胞死亡の誘導作用を測定し、光学顕微鏡下で24時間観察し撮影した。結果は図6に示すように、p2を培地に添加した後4時間から作用を発揮し、細胞が収縮し、24時間で細胞が基本的に死亡し、p2が細胞死を誘導する方式はアポトーシスと類似した。P2T2S18を培地に添加した後、2時間後から細胞に対して激烈に作用を発揮したが、細胞が収縮したのではなく、極度に膨張した。4時間後に膨張が更に加速化して、8時間後細胞は破裂し始め、24時間で細胞残屑のみが存在した。P2T2S18による細胞死亡は驚くことであり、現在このような細胞死亡がどのパータンであるかを確定できなく、報告されたこともない。しかしながら、このような細胞死亡パータンは、P2による細胞死亡とは著しく異なることは明らかである。実施例7の結果を組み合わせてみると、P2T2S18は生物活性がP2より顕著に高いばかりでなく、細胞死亡を引き起こす方式もP2とは明らかに異なる。
実施例9：ポリペプチドのHUVECのin vitro増殖に対する抑制
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1及び図7A〜7Jを参照する。
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1及び図7A〜7Jを参照する。
実施例3に示す方法により、ポリペプチドのHUVECに対する抑制活性を測定した。各ポリペプチドは等モル濃度条件下で測定し、P2T2S18ポリペプチドの300μM濃度は約1mg/mlに相当する。結果は図8と下記の表を参照し、P2T2S18のC末端が所定の範囲内で短縮又は延長した後依然として生物活性を有することが分かる。
実施例10：ポリペプチドの種々の腫瘍細胞のin vitro増殖に対する抑制
実施例3に示す方法により、ポリペプチド濃度1mg/ml条件下P2 (配列番号SEQ ID NO: 2)とP2T2S18 (配列番号SEQ ID NO: 6)ポリペプチドが、種々の腫瘍細胞SMMC7721、SPC-A-1、A549、LS174T、BEL7402、CK-MES-1、BxPC-3に対するin vitro抑制作用を測定し、測定結果は図9と下記の表に示した。従って、P2T2S18はP2より、種々の腫瘍に対する抑制活性が顕著に増加され、P2T2S18のIC50濃度はいずれもP2 IC50濃度の1/10より小さい。特に、LS174T結腸癌細胞に対して、P2は抑制活性を示されていなく、薬物濃度が1mg/mlである場合、細胞生存率が高く、95%であった。しかしながら、P2T2S18がこの細胞に対する抑制活性はかなり顕著であり、同じ濃度条件下ほぼ全ての腫瘍細胞を殺傷し、細胞生存率は1%のみであった。
実施例3に示す方法により、ポリペプチド濃度1mg/ml条件下P2 (配列番号SEQ ID NO: 2)とP2T2S18 (配列番号SEQ ID NO: 6)ポリペプチドが、種々の腫瘍細胞SMMC7721、SPC-A-1、A549、LS174T、BEL7402、CK-MES-1、BxPC-3に対するin vitro抑制作用を測定し、測定結果は図9と下記の表に示した。従って、P2T2S18はP2より、種々の腫瘍に対する抑制活性が顕著に増加され、P2T2S18のIC50濃度はいずれもP2 IC50濃度の1/10より小さい。特に、LS174T結腸癌細胞に対して、P2は抑制活性を示されていなく、薬物濃度が1mg/mlである場合、細胞生存率が高く、95%であった。しかしながら、P2T2S18がこの細胞に対する抑制活性はかなり顕著であり、同じ濃度条件下ほぼ全ての腫瘍細胞を殺傷し、細胞生存率は1%のみであった。
実施例11：ポリペプチドの腫瘍細胞及びHUVECのin vitro増殖に対する抑制
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1及び図3A〜3Fを参照する。実施例3に示す方法により、HUVECに対する抑制作用を測定し、測定結果は図10を参照する。
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1及び図3A〜3Fを参照する。実施例3に示す方法により、HUVECに対する抑制作用を測定し、測定結果は図10を参照する。
実施例12：in vivoにおける腫瘍モデルの確立
in vitro培養状態が良好である対数増殖期の腫瘍細胞を取って、ヌードマウス皮下に5×106腫瘍細胞を含有する100μlの細胞懸濁培養物を接種した。15日後、成長良好な固形腫瘍を取って、無菌条件下で約3mmの大きさの均一な断片を切断し、トロカールを使用して各ヌードマウスの右脇皮下にこの断片を接種した。接種10〜14日後、腫瘍の大きさに基づいて再グループ化し、腫瘍が大きすぎる又は小さすぎる動物をアウトし、各群の平均腫瘍体積が基本的に一致した。各群に試験プロトコルに従って試験薬物を投与した。腫瘍塊の長径（a）及び短径（b）を週に2回測定した。試験後に動物を屠殺し、解剖して腫瘍を取り、腫瘍の分量を量って、撮影した。腫瘍体積TV = 1/2×a×b2であり；腫瘍相対体積RTV= Vt/Voであり、Voはかごを分ける場合（投与1日前）測定した腫瘍体積であり、Vtは各測定時の腫瘍体積である。腫瘍抑制率（％）=（1-T/C）×100%であり、ただし、Tは治療群の平均腫瘍体積であり、Cは陰性対照群の平均腫瘍体積である。
in vitro培養状態が良好である対数増殖期の腫瘍細胞を取って、ヌードマウス皮下に5×106腫瘍細胞を含有する100μlの細胞懸濁培養物を接種した。15日後、成長良好な固形腫瘍を取って、無菌条件下で約3mmの大きさの均一な断片を切断し、トロカールを使用して各ヌードマウスの右脇皮下にこの断片を接種した。接種10〜14日後、腫瘍の大きさに基づいて再グループ化し、腫瘍が大きすぎる又は小さすぎる動物をアウトし、各群の平均腫瘍体積が基本的に一致した。各群に試験プロトコルに従って試験薬物を投与した。腫瘍塊の長径（a）及び短径（b）を週に2回測定した。試験後に動物を屠殺し、解剖して腫瘍を取り、腫瘍の分量を量って、撮影した。腫瘍体積TV = 1/2×a×b2であり；腫瘍相対体積RTV= Vt/Voであり、Voはかごを分ける場合（投与1日前）測定した腫瘍体積であり、Vtは各測定時の腫瘍体積である。腫瘍抑制率（％）=（1-T/C）×100%であり、ただし、Tは治療群の平均腫瘍体積であり、Cは陰性対照群の平均腫瘍体積である。
実施例13：ポリペプチドの腫瘍細胞のin vivo増殖に対する抑制
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1を参照する。
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1を参照する。
SEQ ID NO：1の配列のような組換えエンドスタチン（endostatin）、SEQ ID NO: 10の配列のような市販される薬物エンドスター（endostar）に対して、実施例10に示す方法により、ヒト肝臓癌BEL7404腫瘍モデルを確立し、試験は以下の6群を設置した。陰性対照群は9匹動物とする以外に、他の試験群は、6匹/群とした。ただし、ポリペプチドとエンドスタチンの製剤量は等モルに近接する。試験結果は図11A、図11B及び下記の表を参照する。
１）陰性対照群（生理食塩水、皮下注射sc、2回/日、21日間連続投与）
２）シクロホスファミドCTX（30mg/kg、腹腔内注射ip、1回/日、7日間連続投与）
３）P2群（15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
４）P2T2S18群（15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
５）エンドスタチン（50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
６）エンドスター（50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
２）シクロホスファミドCTX（30mg/kg、腹腔内注射ip、1回/日、7日間連続投与）
３）P2群（15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
４）P2T2S18群（15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
５）エンドスタチン（50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
６）エンドスター（50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与）
各試験群間RTVのt検定を行い、各p値は以下の表を参照する。P2は陰性対照群と比較して有意差（P = 0.015）がなく、腫瘍増殖を有意に抑制することができないことが分かる。P2T2S18は腫瘍の増殖を有意に抑制し、21日間投与した後腫瘍抑制率が76.7％に達した。ひいては、腫瘍に対するP2T2S18の抑制効果は化学療法剤CTXと近接し、両群間のRTVは有意差（P> 0.01）がない。注目すべきことは、試験において、P2T2S18試験群の動物は、毒性反応が現れなかったが、CTX群は典型的な化学療法の副作用が現れた。P2T2S18の腫瘍増殖の抑制作用は、P2（P＜0.001）、エンドスタチン (P＜0.001)及びエンドスター(P＜0.001)より、有意に良好である。
実施例14：ポリペプチドの併用化学療法薬の腫瘍細胞のin vivo増殖に対する抑制
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1を参照する。
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図1を参照する。
SEQ ID NO：1の配列のような組換えエンドスタチン（endostatin）、SEQ ID NO: 10の配列のような市販される薬物エンドスター（endostar）に対して、実施例10に示す方法により、ヒト肺癌A549腫瘍モデルを確立し、試験は以下の7群を設置し、6匹動物/群とした。ただし、ポリペプチドとエンドスタチンの製剤量は等モルである。
1）陰性対照群：生理食塩水、sc、2回/日、21日間連続投与;
2）低用量シスプラチン（DDP）群：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与）
3）P2 + DDP群：
DDP：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
P2：15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
4）P2T2S18 + DDP群：
DDP：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
P2T2S18：15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
5）組換えエンドスタチンSEQ ID NO: 1 + DDP群：
DDP：2mg /kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
エンドスタチン：50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
6）組換えエンドスタチンSEQ ID NO: 10 + DDP群：
DDP：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
エンドスター：50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
7）DDP高用量群：6mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与。
2）低用量シスプラチン（DDP）群：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与）
3）P2 + DDP群：
DDP：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
P2：15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
4）P2T2S18 + DDP群：
DDP：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
P2T2S18：15mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
5）組換えエンドスタチンSEQ ID NO: 1 + DDP群：
DDP：2mg /kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
エンドスタチン：50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
6）組換えエンドスタチンSEQ ID NO: 10 + DDP群：
DDP：2mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与、
エンドスター：50mg/kg/回、sc、2回/日、21日間連続投与;
7）DDP高用量群：6mg/kg/日、ip、1回/日、7日間連続投与。
試験結果は図12A、図12B及び下記の表を参照する。
各試験群間RTVのt検定を行い、各p値は以下の表を参照する。P2併用DDP（2mg/kg）はDDP（2mg/kg）の腫瘍抑制作用を有意に高めることができなく、二つの試験群RTVを比較したが、有意差（P=0.011）がなかった。P2併用DDP（2mg/kg）の腫瘍抑制作用はDDP（6mg/kg）より有意に弱い、二つの試験群RTVを比較したが、有意差（P＜0.001）があった。P2T2S18がDDP（2mg/kg）の腫瘍抑制作用を有意に高めることができる。P2T2S18併用DDP（2mg/kg）が腫瘍に対する抑制は、DDP（2mg/kg）より有意に高く、二つの試験群RTVを比較したが、有意差（P＜0.001）があった。ひいては、P2T2S18併用DDP（2mg/kg）の腫瘍に対する抑制は、DDP（6mg/kg）より有意に高く、P2T2S18併用DDP（2mg/kg）は、投与21日後に腫瘍抑制率が99.7%に達し、6匹試験動物において、2匹動物のみの腫瘍は残存し、他の4匹動物の腫瘍は消失した。しかしながら、DDP（6mg/kg）群は投与21日後に6匹の動物は全て腫瘍が残存した。P2T2S18併用DDP（2mg/kg）群のRTVはDDP（6mg/kg）群より小さく，有意差（P＜0.001）があった。つまり、P2T2S18併用DDP（2mg/kg）の治療効果はDDP（6mg/kg）より優れている。
P2T2S18併用DDP（2mg/kg）群の治療効果は、P2併用DDP（2mg/kg）群（（P <0.001）、エンドスタチン併用DDP（2mg/kg）群（（P <0.001）、エンドスター併用DDP（2mg/kg）群（P <0.001）より有意に良好であった。
特に、試験において、P2T2S18併用DDP（2mg/kg）試験群動物とDDP（2mg/kg）群は、明らかな毒性を示さなかったが、DDP（6mg/kg）群動物は、明らかな化学療法毒性反応を示した。
実施例15：ポリペプチドの腫瘍細胞及びHUVECのin vitro増殖に対する抑制
実施例1の方法により、下記の表のようなポリペプチドを合成し、実施例3に示す方法により、0.1mg/mlのポリペプチド濃度条件下、HUVECに対する抑制作用を測定し、測定結果は図13のようである。
実施例1の方法により、下記の表のようなポリペプチドを合成し、実施例3に示す方法により、0.1mg/mlのポリペプチド濃度条件下、HUVECに対する抑制作用を測定し、測定結果は図13のようである。
実施例16：ポリペプチドの腫瘍細胞及びHUVECのin vitro増殖に対する抑制
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図14A及び14Bを参照する。実施例3に示す方法により、HUVEC及び腫瘍細胞HepG2に対する抑制作用を測定し、測定結果は図15と16を参照する。結果は、P2T2S18及びP2T2S18-29の生物活性が類似し、いずれもP2より有意に高いことを示した。
実施例1に示す方法により、配列が下記の表のようなポリペプチドを合成し、HPLC純度同定及びMASS質量スペクトル分子量の同定は図14A及び14Bを参照する。実施例3に示す方法により、HUVEC及び腫瘍細胞HepG2に対する抑制作用を測定し、測定結果は図15と16を参照する。結果は、P2T2S18及びP2T2S18-29の生物活性が類似し、いずれもP2より有意に高いことを示した。
上記の具体的な実施形態は単なる例示であり、限定的なものではない。本出願の保護範囲は特許請求の範囲により限定される。当業者であれば、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術方案に様々な修正及び変更を加えることができ、これらの修正及び変更は依然として本発明の範囲に含まれることが理解される。
SEQ ID NO：2
ヒトエンドスタチンの断片
SEQ ID NO：3
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
45番目のThrはThr-NH 2 である
SEQ ID NO：4
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
40番目のValはVal-NH 2 である
SEQ ID NO：5
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
35番目のGlnはGln-NH 2 である
SEQ ID NO：6
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：7
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
25番目のGlyはGly-NH 2 である
SEQ ID NO：8
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
20番目のSerはSer-NH 2 である
SEQ ID NO：9
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：10
組換えヒトエンドスタチン薬物エンドスター
SEQ ID NO：11
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：12
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：13
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：14
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：15
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：16
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：17
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：18
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：19
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：20
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：21
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：22
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：23
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：24
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
17番目のSerはSer-NH 2 である
SEQ ID NO：25
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：26
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：27
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：28
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：29
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：31
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：32
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：33
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：34
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：35
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：36
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：37
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：38
合成
1番目のHisはAc-Hisである
2番目のXaaは任意のアミノ酸である
17番目のXaaはS、A、L、I、V又はTである
18番目のXaaは任意のアミノ酸である
20番目のXaaはS又はTである
21番目のXaaはG、A、L、I又はVである
22番目のXaaはG、A、L、I又はVである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：39
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
SEQ ID NO：40
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：41
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
29番目のAlaはAla-NH 2 である
SEQ ID NO：42
タグ
SEQ ID NO：43
タグ
SEQ ID NO：44
タグ
SEQ ID NO：45
タグ
SEQ ID NO：46
タグ
SEQ ID NO：47
合成
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：48
合成
1番目のHisはAc-Hisである
SEQ ID NO：49
合成
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：50
合成
1番目のHisはAc-Hisである
SEQ ID NO：51
合成
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：52
合成
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
ヒトエンドスタチンの断片
SEQ ID NO：3
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
45番目のThrはThr-NH 2 である
SEQ ID NO：4
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
40番目のValはVal-NH 2 である
SEQ ID NO：5
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
35番目のGlnはGln-NH 2 である
SEQ ID NO：6
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：7
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
25番目のGlyはGly-NH 2 である
SEQ ID NO：8
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
20番目のSerはSer-NH 2 である
SEQ ID NO：9
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：10
組換えヒトエンドスタチン薬物エンドスター
SEQ ID NO：11
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：12
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：13
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：14
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：15
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：16
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：17
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：18
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：19
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：20
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：21
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：22
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：23
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：24
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
17番目のSerはSer-NH 2 である
SEQ ID NO：25
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：26
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：27
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：28
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：29
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：31
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：32
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：33
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：34
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：35
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：36
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：37
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：38
合成
1番目のHisはAc-Hisである
2番目のXaaは任意のアミノ酸である
17番目のXaaはS、A、L、I、V又はTである
18番目のXaaは任意のアミノ酸である
20番目のXaaはS又はTである
21番目のXaaはG、A、L、I又はVである
22番目のXaaはG、A、L、I又はVである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：39
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
SEQ ID NO：40
ヒトエンドスタチン断片の突然変異のコード配列
SEQ ID NO：41
ヒトエンドスタチン断片の突然変異
1番目のHisはAc-Hisである
29番目のAlaはAla-NH 2 である
SEQ ID NO：42
タグ
SEQ ID NO：43
タグ
SEQ ID NO：44
タグ
SEQ ID NO：45
タグ
SEQ ID NO：46
タグ
SEQ ID NO：47
合成
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：48
合成
1番目のHisはAc-Hisである
SEQ ID NO：49
合成
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：50
合成
1番目のHisはAc-Hisである
SEQ ID NO：51
合成
30番目のAspはAsp-NH 2 である
SEQ ID NO：52
合成
1番目のHisはAc-Hisである
30番目のAspはAsp-NH 2 である
Claims (13)
- エンドスタチンのN末端から45個のアミノ酸残基以内の長さの断片であり、且つ少なくともN末端の1〜20番目のアミノ酸残基を含み、前記エンドスタチンのN末端の2番目のアミノ酸残基及び18番目のアミノ酸残基はそれぞれ下記の群より選ばれることを特徴とするポリペプチドであって、ここにおいて前記エンドスタチンのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 1で示されるとおりである、ポリペプチド。
- 前記エンドスタチンのN末端の17番目のアミノ酸はS、A、L、I、V又はTであり；及び/又は、20番目のアミノ酸残基はS又はTであり；及び/又は、21番目及び/又は22番目のアミノ酸残基を含むと、21番目のアミノ酸残基はG、A、L、I又はVであり、及び/又は、22番目のアミノ酸残基はG、A、L、I又はVである、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目及び18番目のアミノ酸残基は請求項１に記載のとおりある、請求項１または２に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目及び18番目のアミノ酸残基は請求項１に記載のとおりである、請求項３に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目のアミノ酸残基はTであり、18番目のアミノ酸残基はN、G、K、M、F、S又はTであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりであり；又は、
前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、且つ18番目のアミノ酸残基はNであり、2番目のアミノ酸残基はTであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりであり；又は、
前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜22番目のアミノ酸残基を含み、且つ18番目のアミノ酸残基はSであり、2番目のアミノ酸残基はE、H、L、T、W又はVであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりであり；又は、
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 4、5、6、7、27〜29、39又は41に示され、又は
前記ポリペプチドは、SEQ ID NO：38からなり、2番目のアミノ酸残基はTであり、18番目のアミノ酸残基はN又はSであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりであり；又は、
前記ポリペプチドは、SEQ ID NO: 4の1番目から39、38、37、36、34、33、32、31、29、28、27又は26番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、及びSEQ ID NO: 39の1番目から39、38、37、36、35、34、33、32、31、29、28、27、26又は25番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列から選ばれ；及び/又は
前記ポリペプチドのN末端の1番目のアミノ酸残基はヒスチジンであり、前記ヒスチジンはホルミル化、アセチル化、リジンプロピオニル化又はリジンブチリル化により修飾され、C末端の1番目のアミノ酸は、PEG、コレステロール又はアミド化により修飾される；
ことを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ2番目のアミノ酸残基はTであり、18番目のアミノ酸残基はN、G、K、M、F、S又はTであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりであり；又は、
前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ18番目のアミノ酸残基はNであり、2番目のアミノ酸残基はTであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりであり；又は、
前記ポリペプチドは、少なくともSEQ ID NO：38の1〜25番目のアミノ酸残基を含み、且つ18番目のアミノ酸残基はSであり、2番目のアミノ酸残基はE、H、L、T、W又はVであり、且つ17、20、21及び22番目のアミノ酸は請求項２に記載のとおりである、請求項５に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが下記から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD；
HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRG-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGADFQCFQ-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGADFQCFQQARAV-NH2；
HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD；
HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSNLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNASLSGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLTGGMRGIRGAD-NH2；
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNASLTGGMRGIRGAD-NH2；及び
Ac-HTHRDFQPVLHLVALNSSLSGGMRGIRGA-NH2；
ただし、Acはアセチル化修飾であり、NH2はアミド化修飾である。 - 下記から選ばれるポリヌクレオチド分子。
（１）請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び
（２）前記（１）に記載のポリヌクレオチド分子と相補的な配列を有するポリヌクレオチド分子。 - 前記ポリヌクレオチド分子が下記から選ばれることを特徴とする請求項８に記載のポリヌクレオチド分子。
（１）SEQ ID NO：32、33、34、35、37及び40；
（２）SEQ ID NO：32の1番目から117、114、111、108、102、99、96、93、87、84、81又は78番目の塩基からなるポリヌクレオチド分子；及び
（３）SEQ ID NO：40の1番目から117、114、111、108、105、102、99、96、93、87、84、81、78又は75番目の塩基からなるポリヌクレオチド分子。 - 請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター。
- 請求項１〜７のいずれか一項のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 腫瘍を治療又は予防するための医薬の調製における、又は化学療法薬の有効性を増強するための医薬の調製における請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
- （１）前記腫瘍は、腺癌、肺扁平上皮癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫及び骨肉腫からなる群より選ばれ；及び
（２）前記化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンである、
ことを特徴とする請求項１２に記載の使用。
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