CN108314720B - Sj12多肽及其在制备抗凝血药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于日本血吸虫的Sj12多肽，所述多肽对外源性凝血系统和凝血共同途径均无影响，但是能够干扰内源性凝血系统，使凝血时间延长超过正常检测范围10秒以上，起到了抑制血液凝固的作用，其凝血活性优于现有技术中的抗凝多肽，具有重要的抗凝、抗血栓药物开发应用价值。

Description

Sj12多肽及其在制备抗凝血药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药医疗领域，具体涉及来源于日本血吸虫的Sj12多肽，及其在制备抗凝血药物中的应用。

背景技术

血液能够在人体内正常循环流动，除了心脏正常工作之外，还需要血液流经之处始终保持畅通状态。为了维持血液在血管系统的无障碍运行，血管内皮必须完好无损；机体的凝血、抗凝和纤溶系统必须处于平衡状态，这些对机体发挥正常生理功能起着重要作用。当机体的凝血、抗凝或是纤溶系统功能异常时，凝血与抗凝血的平衡被打破，随之而来的便是出血或是血栓形成的发生。长期少量的出血机体可出现贫血症状；急性大量出血机体可出现休克症状，引发多器官功能衰竭，甚至是造成死亡。血栓形成可引起相应组织和器官缺血、缺氧、坏死(动脉血栓)以及淤血、水肿(静脉血栓)，这将严重的威胁着人们的生命健康。动脉血栓形成是造成90％以上的心肌梗死，80％脑卒中的主要原因，动脉栓塞性心脑血管疾病是导致人类死亡首要因素。静脉血栓栓塞(VTE),包括深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)，是继心梗和中风后位列第3位的心血管相关性疾病的死亡原因。全球每年确诊VTE患者约数百万人，在美国，据不完全统计每年发生VTE超过90万例，其中约30万例死于肺栓塞。死于肺栓塞的人数是每年死于肺癌、交通意外和AIDS总人数的5倍还要多，政府每年要花费5.8-7.8亿美元治疗这种疾病。在欧洲，每年发生112万例VTE，PTE54.3万例，是VTE相关死亡猝死的主要原因之一，约占院内死亡的5％-10％^[5]。在我国，1997年-2008年，24个地区60多家三甲医院针对PTE的统计数据显示，住院患者PE的发生率逐年上升，至2008年约为0.1％。另外，2006年-2010年28个省自治区205家医院针对特定人群，包括重症监护病房(ICU)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌、老年内科住院患者以及妇产科大手术患者，进行了VTE的流行病学调查，结果显示其发病率分别为27％，9.7％，11.5％，9.7％。由此可见，在中国人群中，VTE的发病率甚至与欧美相当，该病在中国乃至亚洲被严重低估。因此，血液凝固异常导致栓塞性疾病，是危害人类健康的主要杀手。

德国的Rudolf L.K.Virchow 1856年提出了血栓形成三因素(Virchow三因素)即血液流速、血液成分以及血管损伤，指出这些因素彼此相互作用，导致了血管内血栓的形成，至今仍然是血栓形成机制的经典理论。据此，临床上治疗血栓栓塞性疾病药物，分为三类：即抗血小板药、抗凝血药和纤维蛋白溶解药。

2015年，澳大利亚学者SL Ranasinghe等人在日本血吸虫cDNA中发现了第一个抗凝多肽SjKI-1，但是其抗凝效果不尽如人意。

发明内容

本发明中，通过对血吸虫蛋白数据库的筛选，通过结构生物学和生物信息学的方式，获取血吸虫蛋白序列；采用基因工程技术将日本血吸虫多肽Sj12克隆、表达、纯化，并基于APTT、PT和TT筛选平台，系统的评价了日本血吸虫多肽Sj12资源的抗凝潜能，为新型抗凝血药物制备提供了新的抗凝多肽资源。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种多肽Sj12，所述多肽包含SEO ID NO.1所示氨基酸序列。

本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码多肽Sj12。进一步的，所述核酸分子包含SEO ID NO.2所示核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，所述载体包含编码多肽Sj12的核酸分子。

本发明提供了一种非人细胞，所述细胞包含所述多肽Sj12、和/或编码多肽Sj12的核酸分子。

本发明提供了一组引物，所述引物组包含3对引物，分别为：

SEO ID NO.3所示的Sj12-FP1和SEO ID NO.4所示的Sj12-RP1；

SEO ID NO.5所示的Sj12-FP2和SEO ID NO.6所示的Sj12-RP2；

SEO ID NO.7所示的Sj12-FP3和SEO ID NO.8所示的Sj12-RP3。

进一步的，本发明还提供了上述引物在扩增多肽Sj12的编码核酸分子中的用途。

本发明提供了一种多肽Sj12，和/或编码多肽Sj12的核酸分子在制备抗凝血、抗血栓制剂中的用途。所述制剂可选自试剂盒、药物或药物组合物，优选为药物或药物组合物。

本发明的有益效果是：

本发明提供一种全新序列的重组血吸虫多肽Sj12，其能够干扰内源性凝血系统，使凝血时间延长超过正常检测范围10秒以上，起到了抑制血液凝固的作用，活性优于现有技术SjKI-1，具有重要的抗凝血、抗血栓药物开发应用价值。

附图说明

图1.原核表达体系pET-28a(+)质粒图谱。

图2.高效液相色谱仪检测峰图：X轴，HPLC设置的程序运行时间；Y轴，吸光值；波长设置为270nm。

图3.MOLDI-TOF-MS质谱检测图：X轴，物质的质荷比(m/z)值；Y轴，离子流的相对强度；箭头指示的是重组血吸虫蛋白的分子量。

图4.活化部分凝血酶时间(APTT)检测结果：X轴，重组血吸虫蛋白的终浓度，分别为0μg/ml，1.04μg/ml，2.08μg/ml，4.17μg/ml，8.33μg/ml，16.67μg/ml，33.33μg/ml；Y轴，APTT检测时间。

图5.凝血酶原时间(PT)检测结果：X轴，重组血吸虫蛋白的终浓度，分别为0μg/ml，1.04μg/ml，2.08μg/ml，4.17μg/ml，8.33μg/ml，16.67μg/ml，33.33μg/ml；Y轴，PT检测时间。

图6.血浆凝血酶时间(TT)检测结果：X轴，重组血吸虫蛋白的终浓度，分别为0μg/ml，1.04μg/ml，2.08μg/ml，4.17μg/ml，8.33μg/ml，16.67μg/ml，33.33μg/ml；Y轴，TT检测时间。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。

实施例1：表达载体pET-28a(+)质粒的制备

1、菌种扩大培养

将本实验室保存的含有pET-28a(+)质粒的Trans 5α菌种(购于北京全式金生物技术有限公司)1μl加入10ml的LB培养基(含30μg/ml卡那霉素)中混匀，置于恒温摇床，37℃，<180rpm，培养11-12小时，OD600＝0.8。

2、表达载体pET-28a(+)质粒的提取

(1)取1-2ml过夜培养的菌液加入1.5ml Eppendorf离心管中，8000rpm离心5分钟，尽量弃去上清，收集菌体沉淀。

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1(注意查看是否已RNaseA)，充分混匀。

(3)向离心管中加入250μl Buffer P2，轻柔地上下颠倒混匀6-8次，充分混匀。注意观察，此时溶液应变得清亮粘稠。

(4)向离心管中加入250μl Buffer N3，立即轻柔地上下颠倒混匀6-8次，充分混匀。注意观察，此时溶液中会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心15分钟。

(5)将离心管中离心后的上清液倒入到已装有吸附柱的收集管中，注意尽量避免将白色絮状沉淀倒入。12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装回。

(6)向吸附柱中加入750μl Buffer PW(注意查看是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，12000rpm再次离心3分钟，倒掉收集管中残留的废液，将吸附柱置于室温直至彻底晾干。注意观察无水乙醇是否挥发完全。

(7)将彻底晾干的吸附柱置于一个新的1.5ml Eppendorf离心管中，将50μlBuffer EB加入吸附柱底部膜中央，室温静置5分钟，12000rpm离心3分钟，丢弃吸附柱，-20℃保存收集后的质粒溶液。

实施例2：日本血吸虫多肽载体的构建

1、Sj12PCR引物设计

(1)通过结构生物学和生物信息学相结合的方式，从日本血吸虫基因库中确定出一个新的日本血吸虫基因，命名为Sj12，其编码的多肽氨基酸序列如下：

ARLRTSDDCLRPMKKGYGLRQRTRYYYDLNMNSCLEFTYKGRGGSRNRFHSREDCEKVCLPEAINNNTN(SEQ ID NO.1)

(2)通过序列反向翻译网站获取Sj12的cDNA序列，如下：

GCGCGCCTGCGCACCAGCGATGATTGCCTGCGCCCGATGAAAAAAGGCTATGGCCTGCGCCAGCGCACCCGCTATTATTATGATCTGAACATGAACAGCTGCCTGGAATTTACCTATAAAGGCCGCGGCGGCAGCCGCAACCGCTTTCATAGCCGCGAAGATTGCGAAAAAGTGTGCCTGCCGGAAGCGATTAACAACAACACCAAC(SEQ ID NO.2)

(3)使用引物设计软件，进行引物设计，如下：

Sj12-FP1：AGCGCACCCGCTATTATTATGATCTGAACATGAACAGCTGCCTGGAATTT(SEQ IDNO.3)

Sj12-RP1：AAGCGGTTGCGGCTGCCGCCGCGGCCTTTATAGGTAAATTCCAGGCAGCT(SEQ IDNO.4)

Sj12-FP2：CCTGCGCCCGATGAAAAAAGGCTATGGCCTGCGCCAGCGCACCCGCTATT(SEQ IDNO.5)

Sj12-RP2：GCAGGCACACTTTTTCGCAATCTTCGCGGCTATGAAAGCGGTTGCGGCTG(SEQ IDNO.6)

Sj12-FP3：CTGCATATGGCGCGCCTGCGCACCAGCGATGATTGCCTGCGCCCGATGAA(SEQ IDNO.7)

Sj12-RP3：GTGCTCGAGTCAGTTGGTGTTGTTGTTAATCGCTTCCGGCAGGCACACTT TTT(SEQID NO.8)

双下划线表示NdeⅠ酶切位点的核酸序列单下划线表示XhoⅠ酶切位点的核酸序列。

2、Sj12DNA片段的获取

将所设计的6条引物用overlap PCR方法通过3轮PCR扩增出完整的基因序列：第1轮PCR用引物FP1和RP1进行PCR扩增；第2轮PCR用第1轮PCR扩增后的产物以及引物FP2和RP2进行扩增；第3轮PCR用第2轮PCR扩增后的产物以及引物FP3和RP3进行扩增。具体反应体系如下表所示：

PCR反应条件：第一轮重复②－④18个循环，第二轮和第三轮重复②－④28个循环。

步骤	温度(℃)	时间
			①预变性	95	5分钟
②变性	95	30秒
			③退火	55	30秒
④延伸	72	30秒
			⑤延伸	72	10分钟

3、Sj12DNA片段的纯化

(1)向DNA反应液中加入150μl(6倍体积)的Buffer PB，充分混匀后倒入已装有吸附柱的收集管中，室温静置2分钟，12000rpm离心2分钟。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装回。

(2)向吸附柱中加入750μl Buffer PW(注意查看是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装回，12000rpm再次离心3分钟，倒掉收集管中残留的废液，将吸附柱置于室温直至彻底晾干。注意观察无水乙醇是否挥发完全。

(3)将彻底晾干的吸附柱置于一个新的1.5ml Eppendorf离心管中，将50μlBuffer EB加入吸附柱底部膜中央，室温静置5分钟，12000rpm离心3分钟，丢弃吸附柱，-20℃保存收集后的DNA溶液。

通过琼脂糖凝胶电泳凝胶技术，检测目的DNA片段的大小，所有的目的DNA片段大小都在200bp左右，与已知Sj12实际的DNA片段大小基本一致。

4、限制性内切酶消化pET-28a质粒和纯化后的Sj12DNA片段

将纯化后的Sj12DNA片段和pET-28a质粒，使用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ分别进行双酶切消化。反应体系分别如下表，将反应液置于37℃恒温水浴箱中水浴过夜(12-16小时)。

5、消化后的pET-28a质粒和Sj12DNA片段的纯化

(1)向酶切后的DNA片段反应液中加入150μl(6倍体积)的Buffer PB；向酶切后的pET-28a质粒反应液中加入120μl(3倍体积)的Buffer PB。将其充分混匀后分别倒入已装有吸附柱的收集管中，做好标记后室温静置2分钟，12000rpm离心2分钟。倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装回。

(2)向吸附柱中分别加入750μlBuffer PW(注意查看是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装回，12000rpm再次离心3分钟，倒掉收集管中残留的废液，将吸附柱置于室温直至彻底晾干。注意观察无水乙醇是否挥发完全。

(3)将彻底晾干的吸附柱分别置于一个新的1.5ml Eppendorf离心管中，将50μlBuffer EB分别加入各自吸附柱底部膜中央，室温静置5分钟，12000rpm离心3分钟，丢弃吸附柱，-20℃保存收集后的酶切消化后的pET-28a质粒和Sj12DNA片段溶液。

6、消化后的pET-28a质粒和Sj12DNA片段的连接

将纯化后的限制性内切酶酶切消化后的pET-28a质粒和Sj12DNA片段溶液按照如下表体系加入，将混合后的溶液22℃水浴1小时。

组分	体积(μl)
		酶切纯化后的DNA片段	6
酶切纯化后的pET-28a质粒	2
		T4连接酶	1
Buffer(10×)	1
		总体积	10

7、pET-28a－Sj12DNA片段连接产物的转化

(1)将10μl pET-28a－Sj12DNA片段连接产物缓慢的加入到刚刚融化的100μlTrans 5α感受态细胞中，冰浴30分钟。

(2)将冰浴后的溶液置于42℃恒温水浴箱中热激90秒，然后再冰浴5分钟。注意操作要轻柔，避免振荡。

(3)加500μl不含抗生素的LB液体培养基于装有溶液的Eppendorf管中，37℃，<150rmp，恒温摇床培养45分钟。

(4)将培养后的菌液3800rmp，离心5分钟，使用移液枪吸弃去上清400μl，然后充分混匀。

(5)混匀后的菌液使用涂布棒均匀的涂布在含有卡那霉素(30μg/ml)的LB平板上，37℃，培养箱培养16小时。

(6)挑取5个单菌落，放入装有0.5ml LB液体培养基(含卡那霉素30μg/ml)的Eppendorf离心管中做好标记，37℃，220rmp，恒温摇床培养8小时。

8、阳性重组子的鉴定

(1)从标记好的Eppendorf管中各取1μl培养后的菌液作为PCR的模板。同时设置阴性和阳性对照。阴性对照为：1μl灭菌超纯水，阳性对照为：1μl纯化后的Sj12DNA片段。按前述反应条件进行PCR检测。反应体系如下表：

组分	体积(μl)
		菌液/ddH<sub>2</sub>O/DNA片段	1
FP3	1
		RP3	1
ddH<sub>2</sub>O	9.5
		Taq Master Mix	12.5
总体积	25

2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小，从中挑选出阳性克隆子送生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。待分析完测序结果后，将插入片段的目的核酸序列与已知血吸虫蛋白的编码序列完全一致的阳性克隆子菌种进行扩大培养，提取质粒并保存菌种。

实施例3：日本血吸虫多肽的表达和纯化

1、重组质粒pET-28a－Sj12的制备

(1)将测序成功的阳性克隆子接种至10ml的液体LB培养基(含卡那霉素30μg/ml)中，37℃，<180rpm，恒温摇床培养11-12小时，OD₆₀₀＝0.8。

(2)使用高纯度质粒小题提试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，提取质粒。具体步骤参照1.2.1.2表达载体pET-28a(+)质粒的制备。将提取完成后的质粒-20℃冰箱保存。

2、Sj12蛋白的诱导表达

(1)将提取的测序正确的2μl重组质粒pET-28a－Sj12缓慢的加入到刚刚融化的100μl E.coli Transetta(DE3)感受态细胞中，进行转化。

(2)挑取单个阳性菌落，置于装有0.5ml LB液体培养基(含卡那霉素30μg/ml)的Eppendorf离心管中做好标记，37℃，220rpm培养8小时，得到表达菌液，加入500μl 30％甘油充分混匀冻存与-20℃冰箱。

(3)取pET-28a－Sj12表达菌液10μl接种至100ml LB液体培养基(含卡那霉素30μg/ml)中，37℃，160rpm，恒温摇床培养11-12小时。

(4)将上述表达菌液50ml接种至1000ml L B液体培养基(含卡那霉素30μg/ml)中，37℃，200rpm，恒温摇床培养2小时(菌液OD600＝0.8)加入0.1mM IPTG诱导，37℃，200rpm，恒温摇床继续培养4小时。

3、Sj12蛋白的纯化

包涵体的制备：

(1)将诱导结束后的菌液6000rmp，4℃低温离心6分钟。去上清，留沉淀。

(2)按1L菌液加入25ml冰PBS，充分悬浮后使用超声细胞粉碎机冰上破壁。设置：200HZ，工作3秒/次，间歇8秒/次，(共20分钟)。将破壁后的菌液12000rpm，4℃，离心20分钟，弃上清，留沉淀。沉淀即为包含杂质的Sj12蛋白包涵体。注意高速离心机需提前预冷到4℃。

包涵体的洗涤：

用适量预冷后的PBST溶液充分重悬包涵体沉淀，冰浴20分钟，5000g，4℃，离心15分钟，弃上清，留沉淀。重复操作一次。此时得到的沉淀即为纯度较高的包涵体沉淀。

包涵体的变性：

将所得包涵体沉淀加入适量含有0.03g/ml还原型谷胱甘肽的变性缓冲液充分重悬，然后室温静置2小时。变性缓冲液加入的比例为1:5，即1L菌液所得的包涵体沉淀加入5ml变性缓冲液。变性缓冲液使用时加入的0.03g/ml还原型谷胱甘肽需现配现用。

包涵体的复性：

(1)复性缓冲液按照1:100的体积比配制，即5ml的变性缓冲液需要配制500ml的复性缓冲液。然后根据蛋白的等电点调节使用HCl将复性缓冲液的pH调整至8.0。置于4℃冰箱，冰浴备用。

(2)将变性后的包涵体溶液12000rpm，4℃低温离心20分钟。

(3)将冰浴后含有0.06g氧化型谷胱甘肽的复性缓冲液置于磁力搅拌器上,适当调整磁力搅拌器的转数。收集离心后的变性包涵体溶液上清，将其逐滴滴加入剧烈搅拌的复性液中(滴加过程若有白色絮状沉淀则停止滴加，待其消失后继续滴加)。操作完成后，将其置于16℃恒温摇床静置过夜，至少16小时。

复性Sj12蛋白的纯化：

(1)将复性后的Sj12蛋白溶液12000rmp，4℃低温离心20min，去沉淀，留上清。离心机需提前预冷至4℃。

(2)离心后的Sj12蛋白复性液使用超滤管(3KD)3500g，4℃低温继续离心50分钟，进行反复的脱盐和浓缩，直至复性液浓缩至<5ml，用去离子水洗涤1～2次，再次脱盐。

(3)浓缩后的Sj12蛋白复性液，使用1.5ml Eppendorf离心管分装，每管分装1ml。

(4)1ml浓缩后的Sj12蛋白复性液加10％TFA10ul(TFA终浓度为0.1％)，12000rpm，4℃低温离心15分钟，将上清重新移入新的1.5ml Eppendorf离心管中。用RP-HPLC分离纯化目的蛋白。RP-HPLC使用的是C18反相柱。纯化的条件为：HPLC的上样体积为≤5ml，流速4ml/min。RP-HPLC的流动相：溶液B为0.1％TFA，D溶液为0.1％的TFA+90％的乙腈，RP-HPLC的洗脱梯度为：60min的线性梯度，初始时：B为95％、D为5％，结束时：B为5％、D为95％；测量波长选择230nm。

(5)手动收集从RP-HPLC中洗脱下来的Sj12蛋白洗脱峰，冻存于-80℃冰箱。

5、Sj12蛋白纯化液的冻干、分装

(1)RP-HPLC纯化获得的蛋白液，在-80℃冰箱中预冻至少8小时后，使用真空冻干机冻干。冻干后的干粉用适量灭菌后的超纯水重新溶解，按500μl每管分装至2ml的冻存管中，做好标记。留取100μl用于BCA定量和质谱检测。

(2)分装完成后的Sj12蛋白溶液，再次放入-80℃冰箱预冻至少4小时后，经真空冻干机再次冻干。标注每管的蛋白质量后，-80℃冰箱保存。

将构建完成的pET-28a质粒转化入E.coli Transetta(DE3)表达菌种进行菌种扩大培养，获得蛋白包涵体。包涵体经洗涤后通过变性、稀释复性、超滤浓缩和高效液相色法(HPLC)，得到重组日本血吸虫蛋白Sj12分离纯化后的蛋白液。高效液相色谱仪分离结果如图2所示。高效液相色谱仪，出现明显的Sj12单峰，将其出峰时间下所流出的蛋白液全部收集，用冷冻冻干机将收集的纯化蛋白液冻成干粉。

实施例4：Sj12蛋白纯化液的BCA定量

1、实验步骤：BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)

(1)BSA标准品(初始浓度5mg/ml)的配制如下：

(2)BCA工作液的配制：每个孔加200μl BCA工作液，根据检测样品的数量，按试剂A：试剂B＝50：1的体积比配制适量的BCA工作液，充分混匀。

(3)在96孔板中按一定顺序依次加入25μl待检的蛋白液和稀释到一定浓度的BCA标准品，然后再向这些孔中分别加入200μl BCA工作液。

(4)将加完样品的96孔板置于恒温摇床中，37℃，110rmp，孵育30分钟。

(5)将孵育后的96孔板置于酶标仪上，设置酶标仪的检测波长为570nm，进行检测。

(6)将检测结果导入Excel软件中，绘制标准曲线，计算检测蛋白浓度。

2、实验结果

取出10μg的蛋白粉剂送至中国科学院化学研究所进行质谱检测，进一步鉴定蛋白是否重组成功。质谱鉴定结果见图3。中国科学院化学研究所提供的质谱检测结果显示重组的Sj12的分子量分别为10345.1Da；经ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)网站预测的Sj12理论分子量是10347.53Da。Sj12质谱检测结果实际检测值和理论值一致。

实施例5：活化部分凝血酶时间(APTT)检测

血浆中的凝血因子Ⅻ(FⅫ)可通过接触阴离子表面而被激活，有活性的FⅫ(FⅫa)继而激活凝血因子Ⅺ(FⅪ)使之成为有活性的FⅪ(FⅪa)，接下来FⅪa激活凝血因子Ⅸ(FⅨ)，有活性的FⅨ(FⅨa)在磷脂(PL)、钙离子(Ca²⁺)和有活性的凝血因子Ⅷ(FⅧa)的参与下激活凝血因子Ⅹ(FⅩ),内源性凝血途径从而被启动。APTT检测实验正是按照内源性凝血途径的激活原理而设计，APTT检测试剂提供了激活内源性凝血系统所需要，但是正常血浆中所不具备的鞣花酸、磷脂和高浓度的钙离子(Ca²⁺)。将APTT检测试剂加入待检血浆中内源性凝血系统会立即启动，最终导致纤维蛋白多聚体的形成，达到检测目的。Sj12蛋白的APTT检测结果如图4所示。

1、实验步骤：部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒，美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司

(1)按50μl/上样杯，在上样杯中依次加入不同浓度的重组Sj12、阴性对照和阳性对照。阴性对照为PBS磷酸缓冲液，阳性对照为肝素钠水溶液。

(2)取100μl 1:9枸橼酸钠抗凝，离心后的正常人血浆按100μl/上样杯，依次加入到已装有不同浓度的重组Sj12、阴性对照和阳性对照的上样杯中。

(3)在各上样杯中分别加入磁珠1粒。

(4)打开半自动血凝仪，使其预热至37℃(温度显示灯熄灭即可使用)。使用半自动血凝仪上的功能键选择APPT检测项目。

(5)将APTT检测试剂(恢复至室温)按照100μl/上样杯，加入上述其中一个上样杯中，并放在血凝仪预热孔位上孵育5分钟。孵育完成后，将样品杯放入检测孔内，加入100μlCaCl₂溶液后立即启动检测键进行检测。待样品检测完成后，如前所述，进行下一个样品的孵育、加入试剂以及检测。每个样品重复检测3次。

2、实验结果

通过APTT检测发现，重组血吸虫蛋白Sj12能够延长APTT检测时间(图4)，并且在浓度为33.33μg/ml时Sj12延长时间分别为阴性对照的2.78倍。也就是说Sj12对内源性凝血系统有抑制作用，具有抗凝功能。

实施例6：血浆凝血酶原时间(PT)检测

血浆中的凝血因子Ⅶ(FⅦ)在组织损伤后与释放入血的组织因子(Ⅲ)结合成复合物，在PL和Ca²⁺的参与下而被激活，继而直接激活凝血因子Ⅹ(FⅩ)使之成为有活性的FⅩ(FⅩa)，外源性凝血途径从而被启动。PT检测试剂则提供了激活外源性凝血系统所需要，但是正常血浆中所不具备的(PL)和高浓度的Ca²⁺。将PT检测试剂加入待检血浆中外源性凝血系统会立即启动，最终导致纤维蛋白多聚体的形成，达到检测目的。Sj12蛋白的PT检测结果，如图5所示。

1、实验步骤：凝血酶原时间(PT)试剂盒，美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司

(1)按50μl/上样杯，在上样杯中依次加入不同浓度的重组Sj12、阴性对照和阳性对照。阴性对照为PBS磷酸缓冲液，阳性对照为肝素钠水溶液。

(2)取100μl 1:9枸橼酸钠抗凝，离心后的正常人血浆按100μl/上样杯，依次加入到已装有不同浓度的重组Sj12、阴性对照和阳性对照的上样杯中。

(3)在各上样杯中分别加入磁珠1粒。

(4)打开半自动血凝仪，使其预热至37℃(温度显示灯熄灭即可使用)。使用半自动血凝仪上的功能键选择PT检测项目。

(5)将上述其中一个样品杯放在血凝仪预热孔位上孵育3分钟。孵育完成后，将样品杯放入检测孔内，加入200μl复溶后的PT检测试剂(血凝仪上孵育30分钟)后立即启动检测键进行检测。待样品检测完成后，如前所述，进行下一个样品的孵育、加入试剂以及检测。每个样品重复检测3次。

2、实验结果

PT检测结果表明Sj12未能使PT检测时间延长，即PT检测时间都在正常参考值范围12-16秒内。换而言之，Sj12对外源性凝血系统无抑制作用，不能阻止由外源性凝血系统启动引起的血液凝固。

实施例7：血浆凝血酶时间(TT)检测

内、外源性凝血途径都通过激活FⅩ，从而使凝血酶原(Ⅱ)转变成凝血酶(Ⅱa)，凝血酶能使纤维蛋白原转化成可溶性纤维蛋白单体，在有活性的凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)和高浓度的Ca²⁺的参与下可溶性纤维蛋白单体形成牢固的不可溶纤维蛋白多聚体，这就是凝血的共同途径。TT检测试剂直接提供凝血酶，使血浆中的纤维蛋白原直接转化成纤维蛋白，检测其所用时间。Sj12蛋白的TT检测结果，如图6所示。

1、实验步骤：凝血酶时间(TT)试剂盒，美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司

(1)按50μl/上样杯，在上样杯中依次加入不同浓度的重组Sj12、阴性对照和阳性对照。阴性对照为PBS磷酸缓冲液，阳性对照为肝素钠水溶液。

(2)取100μl 1:9枸橼酸钠抗凝，离心后的正常人血浆按200μl/上样杯，依次加入到已装有不同浓度的重组Sj12、阴性对照和阳性对照的上样杯中。

(3)在各上样杯中分别加入磁珠1粒。

(4)打开半自动血凝仪，使其预热至37℃(温度显示灯熄灭即可使用)。使用半自动血凝仪上的功能键选择TT检测项目。

将上述其中一个样品杯放在血凝仪预热孔位上孵育3分钟。孵育完成后，将样品杯放入检测孔内，加入100μl复溶后的TT检测试剂(血凝仪上孵育30分钟)后立即启动检测键进行检测。待样品检测完成后，如前所述，进行下一个样品的孵育、加入试剂以及检测。每个样品重复检测3次。

2、实验结果

Sj12蛋白的TT检测结果表明，TT检测时间都在正常参考值范围11-18秒内，证明Sj12不影响凝血系统的共同途径，不能阻止凝血酶激活纤维蛋白原引起的血液凝固。

综上，本发明提供一种全新序列的重组血吸虫蛋白/多肽Sj12，其能够干扰内源性凝血系统，使凝血时间延长超过正常检测范围10秒以上，起到了抑制血液凝固的作用，活性优于现有技术SjKI-1，具有重要的药物开发应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北医药学院

<120> Sj12多肽及其在制备抗凝血药物中的应用

<130> CP11802087C

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 69

<212> PRT

<213> Sj12

<400> 1

Ala Arg Leu Arg Thr Ser Asp Asp Cys Leu Arg Pro Met Lys Lys Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Leu Arg Gln Arg Thr Arg Tyr Tyr Tyr Asp Leu Asn Met Asn

20 25 30

Ser Cys Leu Glu Phe Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Gly Ser Arg Asn Arg

35 40 45

Phe His Ser Arg Glu Asp Cys Glu Lys Val Cys Leu Pro Glu Ala Ile

50 55 60

Asn Asn Asn Thr Asn

65

<210> 2

<211> 207

<212> DNA

<213> Sj12的cDNA

<400> 2

gcgcgcctgc gcaccagcga tgattgcctg cgcccgatga aaaaaggcta tggcctgcgc 60

cagcgcaccc gctattatta tgatctgaac atgaacagct gcctggaatt tacctataaa 120

ggccgcggcg gcagccgcaa ccgctttcat agccgcgaag attgcgaaaa agtgtgcctg 180

ccggaagcga ttaacaacaa caccaac 207

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Sj12-FP1

<400> 3

agcgcacccg ctattattat gatctgaaca tgaacagctg cctggaattt 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Sj12-RP1

<400> 4

aagcggttgc ggctgccgcc gcggccttta taggtaaatt ccaggcagct 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Sj12-FP2

<400> 5

cctgcgcccg atgaaaaaag gctatggcct gcgccagcgc acccgctatt 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Sj12-RP2

<400> 6

gcaggcacac tttttcgcaa tcttcgcggc tatgaaagcg gttgcggctg 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> Sj12-FP3

<400> 7

ctgcatatgg cgcgcctgcg caccagcgat gattgcctgc gcccgatgaa 50

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> Sj12-RP3

<400> 8

gtgctcgagt cagttggtgt tgttgttaat cgcttccggc aggcacactt ttt 53

Claims (1)

1.多肽Sj12在制备抗凝血、抗血栓制剂中的用途，所述多肽Sj12的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，其特征在于，所述制剂仅延长活化部分凝血酶时间，而不影响血浆凝血酶原时间且不阻止凝血酶激活纤维蛋白原引起的血液凝固。

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