CN118005776A - 一种埃及血吸虫Kunitz多肽变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种埃及血吸虫Kunitz多肽变体及其应用，所述的Kunitz多肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用为抗内源性凝血，优选为，通过抗凝血因子FXIa而抗内源性凝血。
Description
技术领域
本申请属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种埃及血吸虫Kunitz多肽变体及其应用。
背景技术
血栓栓塞性疾病是一类重要的心血管疾病，包括动脉栓塞性疾病，静脉栓塞性疾病和微血管栓塞性疾病，严重威胁人类健康[1]。抗凝药物可以调节凝血因子活性，维持凝血稳态，是预防和治疗血栓栓塞性疾病的重要手段[2,3]。从肝素和华法林，到低分子肝素，再到现在新型抗凝药物如比伐卢定、达比加群、利伐沙班，抗凝药物的发展已有80多年的历史。但是，由于人体凝血稳态复杂性，目前临床上使用的抗凝药物依然存在肠胃出血、肝损伤和肾损伤等不足，因此，新的抗凝药物资源发现和鉴定具有重要意义[4,5]。
近年，研究发现凝血因子FXI是治疗血栓栓塞性疾病的新靶点[6,7]。Wang X等发现FXI缺陷型小鼠抵抗FeCl3诱导的血管闭塞，其保护作用可与高剂量的肝素(1000U/kg)相当，显示出良好的抗血栓作用。目前，已发现的FXI抑制剂包括单克隆抗体、反义寡核苷酸药物和小分子多肽/蛋白抑制剂(PN2KPI)，虽然这些现有的FXI抑制剂在动物体内显示抗血栓且出血风险低，但在人体内的抗血栓效果和副作用有待进一步研究[8,9]。因此，靶向FXI的抗凝活性物质是新一代抗凝药物研发的靶点。
基于此，提出本发明
[参考文献]
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发明内容
本发明首先涉及一种埃及血吸虫Kunitz多肽变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及编码所述Kunitz多肽变体的编码核酸片段。
本发明还涉及所述的Kunitz多肽变体或其编码核酸片段的如下用途：
(1)制备抗凝血因子FXI的制剂，优选的，所述凝血因子FXI为凝血因子FXIa；
(2)制备抗内源性凝血的药物；
(3)制备抗消化酶的制剂。
本发明还涉及包括所述Kunitz多肽变体或其编码核酸片段的药物或药物组合物，所述的药物为抗凝血药物，优选的，所述的药物为抗凝血因子FXIa的药物。
所述的药物组合物中包括，治疗有效量的所述Kunitz多肽变体或其编码核酸片段，以及必要的药用辅料。
本申请的有益效果在于，
(1)通过对埃及血吸虫来源的Kunitz型高抗凝活性多肽Shp4的构效关系研究，结合突变体凝血因子抑制实验，发现一个突变体多肽Shp4I16A，其增强了对凝血因子FXIa的抑制作用，减弱了对凝血因子FXa的抑制作用，在维持高抗凝活性的同时，提高了对凝血因子XIa的选择性。
(2)高选择性抑制凝血因子XIa多肽Shp4I16A的发现，为血栓栓塞性疾病抗凝药物的研发提供了新的先导分子，为深入研究埃及血吸虫抗凝活性物质提供了新思路。
附图说明
图1、抗凝药物的发展史。
图2、Shp4蛋白的空间结构，以及潜在活性区域G15～K22位点丙氨酸扫描示意图。
图3、Shp4突变体蛋白的HPLC图，6个蛋白均为单峰，出峰时间约为20min；X轴为HPLC设置的程序运行时间，Y轴表示为吸光度值，波长为230nm。A、B、C、D、E、F分别为突变体Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 R18A、Shp4 L20A、Shp4 I21A、Shp4 K22A蛋白的HPLC纯化图。
图4、多肽Shp4及突变体对内源性凝血途径的影响，X轴为多肽Shp4及6个突变体Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 R18A、Shp4 L20A、Shp4 I21A、Shp4 K22A，Y轴为APTT时间。此图表示当多肽终浓度为5μg/mL，多肽Shp4及突变体延长APTT时间的差异(Control组为PBS)。
图5、多肽Shp4及突变体的抗消化酶活性评价，图A为350nM多肽Shp4及突变体与Trypsin孵育后，Trypsin的残余活性；X轴为多肽Shp4及突变体的浓度；Y轴为Trypsin的残余活性。图B为40nM多肽Shp4及突变体与Chymotrypsin孵育后，Chymotrypsin的残余活性；X轴为多肽Shp4及突变体的浓度；Y轴为Chymotrypsin的残余活性(Control组为PBS)。
图6、多肽Shp4及突变体对四个凝血因子的抑制活性评价，X轴为多肽Shp4、Shp4G15A、Shp4I16A、Shp4 R18A、Shp4 L20A、Shp4 I21A、Shp4 K22A的终浓度，Y轴分别为Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin的残余活性。图A、B、C、D为多肽Shp4及六个突变体浓度分别为80nM、80nM、40nM、625nM时，7个多肽与Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin共同孵育后，Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin的残余活性(Control组为PBS)。
图7、突变体多肽Shp4 I16A对三个凝血途径的影响，图A、B、C分别表示多肽Shp4I16A对APTT、PT和TT功能检测结果，X轴为不同浓度的多肽Shp4 I16A，Y轴分别为APTT时间、PT时间和TT时间。
图8、突变体多肽Shp4 I16A的抗消化酶活性评价，X轴为不同浓度的多肽Shp4I16A，Y轴分别为Trypsin、Chymotrypsin和Elastase的残余活性。图A、B、C分别代表不同浓度的多肽Shp4 I16A对Trypsin、Chymotrypsin和Elastase的抑制作用。
图9、变体多肽Shp4 I16A对凝血因子的抑制活性评价，X轴为不同浓度的多肽Shp4I16A，Y轴为凝血因子的残余酶活性。图A、B、C、D、E、F分别代表多肽Shp4 I16A与Kallikrein、FXIIa、FXIa、FXa、FIIa和Plasmin孵育后，酶的残余活性变化。
具体实施方式
实施例1、埃及血吸虫Kunitz多肽类似物表达载体的构建
多肽Shp4是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，成熟肽含有61个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：
FRKGSSVCLLDYDEGICRALIKRFYYDRVNKTCEVFYYGGCLGNRNNFLSKQECEQKCNGT.
其中，包含6个半胱氨酸，并以C8-C58、C17-C54和C33-C41的配对方式形成3对二硫键。多肽Shp4分子主要特征是由有两个反相平行的β折叠、β-转角、N端和C端的α-螺旋组成，其空间结构和BPTI空间结构非常相似，使整个分子呈现梨形。一般Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性残基位于Loop环上，此环与酶的活性位点高度互补。于是，我们对Shp4的潜在活性区域G15～K22位点的氨基酸进行丙氨酸扫描(图2)，设计出多肽突变体，观察这些位点的改变对多肽Shp4抗凝功能的影响。
1、突变体重组质粒由金斯瑞生物技术有限公司合成，重组质粒(载体为pET-28a)在12000rpm条件下离心2分钟，按照说明书将质粒干粉配制为溶液，取2μL质粒加入感受态细胞E.coli Transetta(DE3)，于冰上冰浴30分钟。
2、将含有感受态的EP管于42℃水浴锅中热激90秒，再次冰上冰浴5分钟。
3、向EP管中加入500μL无抗性液体LB，置于37℃摇床180rpm培养45分钟。
4、将复苏后的菌液3700rpm离心5分钟，弃去450μL上清，使用余下的上清使菌沉淀重悬。
5、将菌液涂布于含卡那霉素(30μg/mL)的LB平板中，平板倒置于37℃恒温培养箱培养14小时。
6、从平板上挑取3个单克隆菌落接种于500μL含卡那霉素(30μg/mL)的液体LB，37℃恒温摇床200rpm培养10小时，加入250μL 75％的甘油，做好标记后，于-20℃冰箱保存。
实施例2、埃及血吸虫Kunitz多肽类似物的包涵体蛋白表达
1、取100μL表达菌液(E.coli Transetta(DE3)接种至100mL含卡那霉素(30μg/mL)的液体LB中，置于37℃的恒温摇床，180rpm培养10-12小时。
2、取50mL过夜培养的菌液接种至1L含卡那霉素(30μg/mL)的液体LB培养基中，于37℃恒温摇床210rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为1mM)进行诱导，37℃，210rpm继续培养4小时。
3、将诱导后的菌液利用高速冷冻离心机4℃，6000rpm离心6分钟，收集菌沉淀。25mL冰PBS使菌沉淀充分重悬，使用超声细胞粉碎机冰上破壁，条件：80W，工作3秒/次，间歇8秒/次，共20分钟。收集破壁后的液体在4℃，12000rpm的条件下离心20分钟，收集的沉淀即为包涵体。
4、用10mL预冷的PBST重悬沉淀，在冰上冰浴20分钟后，4℃，5000g离心15分钟，弃去上清，再次重复洗涤一次，可得到较高纯度的包涵体。
5、包涵体变性：称取0.15g的还原型谷胱甘肽加入5mL的变性液中，用变性液将包涵体重悬，置于室温变性2小时。
6、包涵体复性：配制500mL的复性液，将PH调离等电点±1，置于4℃冰箱备用。将变性完成的包涵体于20℃，12000rpm离心20分钟，取上清备用。将复性液置于磁力搅拌器上，加入0.06g的氧化型谷胱甘肽，边搅拌边缓慢滴加变性液上清，复性过程中出现沉淀则停止滴加，待沉淀消失后继续滴加。完成后将复性液于16℃过夜复性16小时。
实施例3、埃及血吸虫Kunitz家族多肽的包涵体蛋白纯化
1、将实施例2中复性后的蛋白液4℃，12000rpm离心20分钟，使用超滤管(截留分子量3KD)将复性液上清于此条件下离心40分钟，反复去盐浓缩至体积＜5mL。
2、将浓缩后的复性液按1mL/管分装至1.5mL的EP管中，每1mL复性液中加入10μL10％ TFA，4℃，12000rpm离心20分钟，将上清移至新的EP管中，再次离心5分钟后，用于RP-HPLC的纯化。
3、过HPLC的上机体积＜5mL，流速为4mL/分钟。RP-HPLC使用的是C18反向柱，其流动相：溶液B为0.1％体积比的TFA，溶液D为90％体积比的乙腈+0.1％体积比的TFA(色谱用超纯水配置)。洗脱梯度：60分钟的线性洗脱梯度，初始时：B为95％，D为5％，结束时：B为5％，D为95％；检测波长为230nm，收集蛋白主峰集份。
4、收集纯化后的蛋白液，于-80℃冰箱保存。
我们利用野生型多肽Shp4的包涵体蛋白表达方式，成功制备了Shp4的6个突变体蛋白Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 R18A、Shp4 L20A、Shp4 I21A、Shp4 K22A。突变体蛋白的HPLC图显示：6个蛋白均为单峰，出峰时间约为20min(图3)。
将蛋白液于-80℃冰箱预冻8小时，使用真空冷冻冻干机冻成干粉，灭菌超纯水溶解后按500μL/管分装，蛋白再次冻干后于-20℃冰箱保存。
实施例4、突变体多肽的APTT(内源性凝血)功能检测
1、打开美德太平洋TS1000凝血仪，预热试剂，选择APTT检测项目。
2、在预热孔放入检测杯，依次加入50μL不同浓度多肽、100μL健康人血浆、100μLAPTT试剂和一粒磁珠，37℃孵育5分钟。
3、将检测杯放入测试孔，加入100μL CaCl2溶液，立即检测，记录血浆凝固时间。
4、阴性对照组(PBS)的检测，同时按照上述步骤完成。
5、将数据导入Excel表格，绘制多肽的浓度依赖曲线图。
对野生型多肽Shp4及6个突变体蛋白进行APTT功能检测，比较延长APTT时间的差异。
(1)PBS为对照组，APTT时间为35.3±0.95秒。
(2)当多肽终浓度为5μg/mL时，Shp4的APTT时间为1067.3±46.97秒，Shp4 G15A的APTT时间为171.6±7.63秒，Shp4 I16A的APTT时间为448.3±12.58秒，Shp4 R18A的APTT时间为37.0±0.81秒，Shp4 L20A的APTT时间为413.0±16.52秒，Shp4 I21的APTT时间为239.3±16.77秒，Shp4 K22A的APTT时间为365±15秒(图4)。
突变体多肽的抗凝效果与野生型Shp4相比有不同程度的下降，说明G15-K22确实是多肽Shp4的功能区域。
这些结果表明突变体多肽Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 L20A、Shp4 I21A、Shp4K22A依旧可以延长APTT时间，而Shp4 R18A不能延长的APTT时间，提示：R18位点是多肽Shp4 发挥抗凝功能的关键位点，而G15、I16、L20、I21、K22是多肽Shp4发挥抗凝功能的辅助位点。
实施例5、多肽的PT、TT功能检测
(一)多肽的PT(外源性凝血)功能检测
1、打开美德太平洋TS1000凝血仪，预热试剂，选择PT检测项目。
2、在预热孔放入检测杯，依次加入50μL不同浓度多肽、100μL健康人血浆和一粒磁珠，37℃孵育3分钟。
3、将检测杯放入检测孔，加入200μL PT溶液后立即检测，记录血浆凝固时间。
4、阴性对照组(PBS)的检测，同时按照上述步骤完成。
5、将数据导入Excel表格，绘制多肽的浓度依赖曲线图。
(二)多肽的TT(纤溶系统)功能检测
1、打开美德太平洋TS1000凝血仪，预热试剂，选择TT检测项目。
2、在预热孔放入检测杯，依次加入50μL不同浓度多肽、100μL健康人血浆和一粒磁珠，37℃孵育3分钟。
3、将检测杯放入检测孔，加入100μL TT溶液后立即检测，记录血浆凝固时间。
4、阴性对照组(PBS)的检测，同时按照上述步骤完成。
5、将数据导入Excel表格，绘制多肽的浓度依赖曲线图。
突变体多肽Shp4 I16A的抗凝功能检测结果：当多肽浓度达到10μg/mL时，多肽 Shp4 I16A呈剂量依赖性延长APTT时间，对PT时间有极弱的剂量依赖的延长作用，对TT时间 没有影响(图7)。
实施例6、埃及血吸虫抗凝多肽的消化酶抑制活性检测
1、将多肽使用消化酶缓冲液倍比稀释成6个浓度梯度待用。
2、在96孔板排孔中各加入50μL 1.6μM Trypsin酶(胰蛋白酶)和50μL不同浓度的的多肽溶液，阴性对照为凝血因子缓冲液。
3、另一排中加入适量浓度为800μM的发光底物(B3133)，将96孔板置于37℃摇床，100rpm孵育30分钟。
4、将96孔板置于酶标仪上，向各孔[E]-[I]混合物孔中加入100μL Trypsin发光底物。
5、在405nm波长立即检测，每个1分钟检测1次，共检测6次。
6、计算抑制百分率，绘制浓度抑制曲线。
7、同样参照此方法检测α-Chymotrypsin蛋白酶(胰凝乳蛋白酶)抑制活性和Elastase蛋白酶(弹性蛋白酶)抑制活性影响，并绘制相应曲线。
检测多肽Shp4及突变体的抗消化酶活性，比较多肽对Trypsin和Chymotrypsin的抑制效果。结果显示，
1、多肽Shp4及突变体对Trypsin的抑制结果：当多肽浓度为350nM时，
多肽Shp4、Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 L20A和Shp4 K22A对Trypsin的抑制率可达到100％，
多肽Shp4 I21A对Trypsin的抑制率为58％，
而多肽Shp4 R18A对Trypsin无抑制作用(图5)。
2、多肽Shp4及突变体对Chymotrypsin的抑制结果：当多肽浓度为40nM时，
多肽Shp4、Shp4 G15A、Shp4 I16A对Chymotrypsin的抑制率能达到95％以上，
多肽Shp4 L20A、Shp4 I21A和Shp4 K22A对Chymotrypsin的抑制率分别为65.2％、79.1％、34.4％，
而多肽Shp4 R18A对Chymotrypsin无抑制作用(图5)。
这些结果表明多肽Shp4对Trypsin和Chymotrypsin均具有较好的抑制作用，而突变体多肽对Trypsin和Chymotrypsin的抑制活性有不同程度的下降，其中P1位点突变体Shp4 R18A降低的程度最为明显，这说明R18位点也是多肽Shp4发挥抗消化酶功能的关键位点。
进一步的定量实验显示，多肽Shp4 I16A对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均有抑制作 用，IC50分别为160.69±15.62nM和26.41±1.39nM，而对弹性蛋白酶无抑制作用(图8)。突变体多肽Shp4 I16A对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制效果与多肽Shp4相当。
实施例7、Kallikrein、FXIIa、FXIa、FXa、FIIa和Plasmin的抑制活性检测
(一)Kallikrein、FXIIa、FXIa、FXa和FIIa的抑制活性检测
1、向96孔板孔内依次加入25μL酶和25μL不同浓度的多肽，阴性对照为缓冲液。
2、另一排孔中加入适量的发光底物。
3、将96孔板放入37℃恒温摇床，100rpm孵育20分钟，置于酶标仪上。
4、使用排枪吸取50μL发光底物加入[E]-[I]混合孔，在405nm处立即检测，每隔1分钟检测1次，共检测7次。
5、将结果导入Excel中，绘制抑制曲线并计算IC50。
结果显示，
1、对于Kallikrein的抑制率，当多肽浓度为80nM时，
Shp4、Shp4 G15A、Shp4 L20A和Shp4 K22A对Kallikrein的抑制率可达95％以上，
Shp4I16A和Shp4 I21A对Kallikrein的抑制率分别为76.5％、62％，
而多肽Shp4 R18A对Kallikrein无抑制作用(图6)。
2、对FXIa的抑制结果：当多肽浓度为80nM时，
Shp4、Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 L20A和Shp4 K22A对FXIa的抑制率可达95％以上，Shp4 I21A对FXIa的抑制率为83.9％，而Shp4 R18A对FXIa无抑制作用(图6)。
3、多肽对FXa的抑制结果：当多肽浓度为40nM时，
多肽Shp4、Shp4 G15A、Shp4 L20A、Shp4 I21A和Shp4 K22A对FXa的抑制率可达93％以上，多肽Shp4 I16A对FXa的抑制率为66.8％，
而多肽Shp4 R18A对FXa无抑制作用(图6)。
这些结果表明：Shp4 G15A、Shp4 I16A、Shp4 L20A、Shp4 I21A、Shp4 K22A抑制Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin活性有不同程度的下降，而多肽Shp4 R18A完全失去对这四种凝血因子的抑制活性，说明R18位点是多肽Shp4发挥抗凝功能的关键位点，此部分结果与之前APTT功能检测实验结果一致；另外，Shp4 I16A对Kallikrein、FXa和Plasmin抑制活性下降较多，而对FXIa的抑制活性保持不变，说明I16是抗凝多肽Shp4改造的潜在位点。
(二)plasmin的抑制活性检测
1、向96孔板孔内依次加入50μL酶和50μL不同浓度的多肽，阴性对照为凝血因子缓冲液。
2、另一排孔中加入适量的纤溶酶发光底物。
3、将96孔板放入37℃恒温摇床，100rpm孵育20分钟，置于酶标仪上。
4、使用排枪吸取100μL发光底物加入[E]-[I]混合孔，在405nm处立即检测。
5、将96孔板在此条件下再次孵育3分钟，立即检测，如此反复检测6次。
6、将结果导入Excel中，绘制抑制曲线并计算IC50。
多肽对Plasmin的抑制结果：当多肽浓度为625nM时，
多肽Shp4、Shp4 L20A和Shp4 K22A对Plasmin的抑制可达82％以上，
多肽Shp4 G15A、Shp4 I16A和Shp4 I21A对Plasmin的抑制可达46％以上，
而Shp4 R18A对Plasmin无抑制作用(图6)。
进一步的定量实验显示了突变体多肽Shp4 I16A对六个凝血因子抑制活性的剂量依赖性(图9)。从图中可以看出，当多肽浓度为2500nM时，Shp4 I16A对Kallikrein、FXIa和 FXa和Plasmin的抑制率分别为100％、100％、100％、和87.7％，而对FXIIa和FIIa无抑制作 用。突变体多肽Shp4 I16A呈剂量依赖性抑制Kallikrein、FXIa和FXa的活性，IC50分别9.01±0.39nM、3.58±0.27nM、4.17±1.05nM。
综上实施例4-7可见，比较突变体多肽Shp4 I16A和野生型多肽Shp4对内源性凝血途径的影响，我们发现：多肽Shp4 I16A呈线性延长APTT时间，虽然其抗凝效果减弱了，但是却提高了对内源性凝血途径的选择性。
比较多肽Shp4 I16A和野生型多肽Shp4对外源性凝血途径的影响，我们发现80μg/mL Shp4 I16A的PT时间仅为108.6秒，而相同浓度的Shp4使血浆在较长的时间内不会出现纤维蛋白和凝固现象；两者对外源性凝血途径的影响有了较大的差异，这表明多肽Shp4 I16A显著降低了对外源性凝血途径的影响。
比较突变体多肽Shp4 I16A和野生型多肽Shp4对凝血因子的抑制作用，发现：Shp4I16A的凝血因子抑制靶点与野生型Shp4相同，都能抑制Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin的活性。
当多肽浓度为2.5μM时，Shp4对Plasmin的抑制率为100％，而Shp4 I16A对Plasmin的抑制率为87.7％；
Shp4对Kallikrein、FXIa、FXa的IC50分别为1.01±0.11nM、6.44±1.42nM、1.30±0.24nM，
Shp4 I16A对Kallikrein、FXIa和FXa的IC50分别9.01±0.39nM、3.58±0.27nM、4.17±1.05nM；
综上，与野生型多肽Shp4的凝血因子抑制活性相比，多肽Shp4 I16A降低对凝血因子Kallikrein、FXa和Plasmin的抑制作用，而增加了对凝血因子FXIa的抑制作用(表1)。
表1：多肽Shp4 I16A和野生型多肽Shp4对凝血抑制因子活性比较
| FXIa | FXa | Kallikrein | Plasmin | XIIa | IIa | |
| Shp4 | 6.44±1.42nM | 1.30±0.24nM | 1.01±0.11nM | 8.09±0.74nM | 无 | 无 |
| Shp4 I16A | 3.58±0.27nM | 4.17±1.05nM | 9.01±0.39nM | 明显减弱 | 无 | 无 |
| XIa选择性 | - | 提高1.78倍 | 提高4.96倍 | 明显提高 | - | - |
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质内容，不用于限定本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种埃及血吸虫Kunitz多肽变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述Kunitz多肽变体的编码核酸片段。
3.权利要求1所述的Kunitz多肽变体或权利要求2所述的编码核酸片段的如下用途：
(1)制备抗凝血因子FXI的制剂，优选的，所述凝血因子FXI为凝血因子FXIa；
(2)制备抗内源性凝血的药物；
(3)制备抗消化酶的制剂。
4.包含权利要求1所述Kunitz多肽变体或权利要求2所述的编码核酸片段的药物或药物组合物，所述的药物为抗凝血药物，优选的，所述的药物为抗凝血因子FXIa的药物。
5.根据权利要求4所述的药物或药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中包括，治疗有效量的所述Kunitz多肽变体或其编码核酸片段，以及必要的药用辅料。
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