CN112457388B - 一种抗凝血多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种抗凝血多肽及其应用，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗凝血为抗内源性凝血途径，所述的内源性凝血途径为：由凝血因子XⅠa(FXⅠa)参与或介导的凝血效应。本发明还涉及编码所述抗凝血多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及所述的抗凝血多肽的应用。

Description

一种抗凝血多肽及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种抗凝血多肽及其应用。

背景技术

据世界卫生组织统计全球每年有1500万人死于血栓栓塞性疾病。我国每年有1000万人发病，病死人数有100万，血栓栓塞性疾病具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点^[1]。常见的血栓性疾病包括急性冠状动脉综合征、缺血性中风、外周血管疾病，严重危害人类健康。血栓栓塞性疾病治疗分为抗凝治疗、溶栓治疗和手术取栓，其中抗凝治疗是治疗血栓栓塞性疾病的主流^[2]。临床常见抗凝药分为传统抗凝药和新型口服抗凝药，例如传统抗凝药如肝素^[3]和法华林等应用广泛，但治疗窗口狭隘，有出血或出血并发症等副作用^[4]。新型口服抗凝药(NOAC)包括直接凝血酶抑制药(达比加群)和Xa因子抑制药(阿哌沙班、利伐沙班、依度沙班)^[5]，与传统抗凝药物维生素K拮抗剂(VKA)如华法林相比，NOAC具有起效快、半衰期短、药物间相互作用少、无需监测药物抗凝强度等显著优点。但是临床上治疗过程中存在肝肾功能损伤^[6]，出血时缺乏有效解毒剂等缺陷^[7]，限制了临床应用。虽然目前抗血小板和溶栓药物的研究和应用有较大的发展，但出血和再栓等风险使得对抗栓药物的选择存在争议，因此，我国迫切需要研发抗栓效果好、出血风险低的药物。

近期研究表明：人凝血因子XI缺陷的临床病人，血栓风险较低，患出血性疾病的风险也较低，同时凝血因子XI敲除小鼠，止血功能可以维持正常，凝血因子XIa是研发抗凝药物研发的新靶点，抑制凝血因子XIa是抗凝药物研发的新方向。

血吸虫属于无脊椎扁形动物门吸虫刚裂体虫科，寄生于人体会导致血吸虫病。血吸虫尾蚴通过皮肤入侵宿主，在移行过程中由童虫发育为成虫。成虫可在血管中存活相当长的一段时间而不被破坏或排出体外^[8]，这种现象引起人们关注。雌雄成虫合抱在血管内逆行，会引起血流的改变；虫卵外渗可能会引起血管内的皮损伤^[9，10]。此外，成虫表面带有负电荷，可能激活血小板和凝血级联，导致宿主血液高凝。根据Virchow 理论^[11]的三要素：血流改变、内皮功能损伤和血液高凝，推测血吸虫是有效的凝血效应的活化剂，然而研究表明血吸虫患者血栓形成风险并未增加，这说明血吸虫存在抗宿主凝活机制。国内外均对血吸虫的抗凝机制进行了研究，并对血吸虫对抗宿主干扰机制做了分析。血吸虫抗凝物质有很多，包括sK1^[12]、 SmATPDase1、SmAP^[13]、SmSP2^[14]、Sm22.6和SmKI-1^[15]等。有研究表明血吸虫SmATPDase1可以降解 ADP，并阻碍血小板的聚集，抑制血液凝固，从而干扰一期止血。也有研究表明血吸虫可通过对二期止血的激活或二期止血的调控进行干扰，从而影响二期止血。例如，Stein和David发现在曼氏血吸虫被膜表达的抗原Sm22.6可抑制凝血酶活性，可干扰虫体周围纤维蛋白的凝固。Lanton等在埃及血吸虫虫体表面发现了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂SHW4-2，与抗凝血酶和神经胶质衍生序列高度相似，能与凝血酶结合并抑制其活性。血吸虫这些大分子抗凝物质抑制了宿主血液凝固，从而有利于虫体的寄生。

目前，日本血吸虫抗凝多肽研究较多。2015年，ShiwanthiL.Ranasinghe等通过对日本血吸虫基因组序列进行BLAST分析，鉴定了7个单域Kunitz蛋白，对重组多肽SjKI-1(Sjp_0020270)的功能进行了深入研究。发现SjKI-1可以抑制胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、中性粒细胞弹性酶、FXa和血浆激肽酶等。此外，7.5 μM SjKI-1延长2倍APTT时间。这些结果表明SjKI-1具有抗炎、抗凝血作用，它可能在延长寄生虫在哺乳动物宿主中的生存中发挥重要作用，但是未见埃及血吸虫Kunitz多肽研究的报道。

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发明内容

血液凝固一般可分为内源性凝血途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径由因子Ⅻ活化而启动，当血管受损，内膜下胶原纤维暴露时，可激活因子Ⅻ为因子Ⅻa，进而激活因子Ⅺ为因子Ⅺa，因子Ⅺa在Ca2+ 存在时激活因子Ⅸa，因子Ⅸa再与激活的因子Ⅷa、PF3、Ca2+形成复合物进一步激活因子X，上述过程参与凝血的因子均存在于血管内的血浆中，故取名为内源性凝血途径，临床上最常用的反映内源性凝血系统凝血活性的敏感筛选实验是活化部分凝血活酶时间(APTT)；外源性凝血途径由损伤组织暴露的因子Ⅲ与血液接触而启动，当组织损伤血管破裂时，暴露的因子Ⅲ与血浆中的Ca2+、Ⅶ共同形成复合物进而激活因子Ⅹ。因启动该过程的因子Ⅲ来自血管外的组织，故称为外源性凝血途径，临床上最常用的反映外源性凝血系统凝血活性的敏感筛选实验是凝血酶原时间(Prothrombin time，PT)。

本发明中，我们针对埃及血吸虫分子资源，利用生物信息学预测了6个埃及血吸虫Kunitz序列，通过包涵体表达制备了重组多肽shp1、shp2、shp4和shp5。对其进行APTT和PT功能检测，并筛选出抗凝活性较好的shp4。

本发明首先涉及一种抗凝血的多肽shp4，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗凝血为抗内源性凝血途径，所述的内源性凝血途径为：由凝血因子XⅠa(FXⅠa)参与或介导的凝血效应。

SEQ ID NO.2：

FRKGSSVCLLDYDEGICRALIKRFYYDRVNKTCEVFYYGGCLGNRNNFLSKQECEQKCNGT

本发明还涉及编码所述抗凝血的多肽shp4的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；

SEQ ID NO.1：

TTTCGCAAAGGCAGCAGCGTGTGCCTGCTGGATTATGATGAAGGCATTTGCCGCGCGCTGATTAA ACGCTTTTATTATGATCGCGTGAACAAAACCTGCGAAGTGTTTTATTATGGCGGCTGCCTGGGCAACC GCAACAACTTTCTGAGCAAACAGGAATGCGAACAGAAATGCAACGGCACCTGA；

本发明还涉及所述的多肽shp4或其编码序列在制备抗凝血药物或前药中的应用。

本发明的有益效果在于，从埃及血吸虫天然多肽中，筛选出具有抗凝活性的埃及血吸虫Kunitz型多肽，阐明其用机制并进一步进行抗血栓研究，寻找到新一类抗凝活性的天然物质shp系列多肽，为血栓栓塞性疾病药物研发提供新的先导分子。

附图说明

图1、6个埃及血吸虫Kunitz序列分析；

图2、4个埃及血吸虫Kunitz多肽RP-HPLC纯化；

图3、4个重组多肽SDS-PAGE鉴定；

图4、4个重组多肽的APTT抗凝时间；

图5、不同浓度shp4的APTT凝血时间；

图6、不同浓度shp4的PT凝血时间；

图7、不同浓度的shp4与FXIa和FXIIa活性的关系。

具体实施方式

实施例1、抗凝多肽的筛选

1、多肽的制备

利用生物信息学分析找到埃及血吸虫Kunitz序列，分析这些序列，挑选出结构完整的Kunitz序列，用 Signal P3.1服务器预测其信号肽切割位点，将目的序列命名为shp。以pET28a为表达载体，构建含有目的序列的重组质粒。

6个埃及血吸虫Kunitz序列分别命名为shp1、shp2、shp3、shp4、shp5和shp6。根据Kunitz多肽的保守序列及三维建模，序列中的6个半胱氨酸以CI～CVI、CIII～CV、CII～CIV的连接方式形成3对二硫键(图1)

其中，

shp4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(末尾的TGA是终止密码子)

SEQ ID NO.1：

TTTCGCAAAGGCAGCAGCGTGTGCCTGCTGGATTATGATGAAGGCATTTGCCGCGCGCTGATTAA ACGCTTTTATTATGATCGCGTGAACAAAACCTGCGAAGTGTTTTATTATGGCGGCTGCCTGGGCAACC GCAACAACTTTCTGAGCAAACAGGAATGCGAACAGAAATGCAACGGCACCTGA

shp4多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示

SEQ ID NO.2：

FRKGSSVCLLDYDEGICRALIKRFYYDRVNKTCEVFYYGGCLGNRNNFLSKQECEQKCNGT

将测序正确的质粒，转入大肠杆菌DE3得到表达菌，转化成功的菌液在含Kana的LB培养基中活化，扩大培养后加入IPTG(终浓度1mM)诱导，继续培养4h。

诱导好的菌液离心弃上清，沉淀用冰PBS重悬，超声破菌离心弃上清，沉淀用冰PBST洗涤两次；再次离心，沉淀用含有0.03g/mL还原型谷胱甘肽变性液重悬，室温变性2h。高速离心后上清在含0.12g/mL的氧化型谷胱甘肽复性液中16℃缓慢复性。将复性液用超滤管浓缩脱盐，用RP-HPLC分析纯化，纯化后的蛋白液用真空冷冻型冻干机冻干(冻干程序有必要说一下，制备)，并做BCA定量和分装。

以同样的方法制备shp1、shp2和shp5，蛋白变性复性并用RP-HPLC方法纯化过程的谱图见图2。制备的重组多肽shp1、shp2、shp4和shp5的SDS-PAGE分子量鉴定结果见图3。

2、多肽APTT和PT抗凝功能检测

APTT：将检测杯放置在凝血仪的预热位置，依次向杯加入50μl不同浓度重组多肽、100μl正常人血浆、100μl预热的APTT试剂和一粒磁珠，37℃孵育5min，将检测杯放置检测孔，加入100μl CaCl₂立即进行检测，计算磁珠在在检测杯内摆动的时间。

PT：将检测杯放置在凝血仪的预热位置，依次向杯加入50μl不同浓度重组多肽、100μl正常人血浆和一粒磁珠，37℃孵育3min，将检测杯放置检测孔，加入200μl PT试剂立即进行检测，计算磁珠在检测杯内摆动的时间。

APTT结果如图4所示，shp4多肽的抗凝时间最长最强，达到1800秒，远大于肝素组的抗凝效果。

进一步的，检测不同浓度的shp4在APTT和PT实验中的延长凝血时间，结果显示shp4对APTT凝血时间具有较好的浓度依赖性(图5)，而对PT凝血时间无延迟效果(图6)。

由此，可以排除shp4在外源途径中的抗凝作用，shp4抑制凝血方式为内源途径或共同途径。

实施例2、目标凝血因子活性检测

本实施例中，检测抗凝活性多肽shp4对凝血因子FXIa和XIIa抑制效果，利用底物发光法检测凝血因子在与多肽孵育后的残余活性，

1、凝血因子Xia(FXIa)检测

(1)用凝血因子缓冲液A(50mM Tris-C，100mM NaCl，2mM CaCl2，0.1％PEG8000，0.1％BAS， pH7.4)将实施例1制备的各条重组多肽稀释成10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、 0共七个浓度梯度，再用凝血因子缓冲液A将Ⅺa(Ⅺa购于HaematologicTechnologies Inc公司，货号：HCⅪ A-0160)与相应底物(Ⅺa的底物为S2366，购于Chromogenix公司，货号82109039)，分别稀释为1.5μg/mL 和1200μM。

(2)向96孔板孔内加入50μlⅪa和50μl不同浓度的多肽，再另一排加入120μl底物，将板放置摇床，37℃震荡孵育20min，将板放置酶标仪检测孔内，用排枪吸取100μl底物S2366加入酶肽混合孔，405nm 每隔1min检测1次，共检测7次。

重复三次实验，将数据绘制抑制曲线，计算IC50。

2、凝血因子XIIa(FXIIa)检测

方法与FXIa类似，仅酶与底物的工作浓度有区别。

结果如图7所示，随着shp4浓度的增加，FXIa的残余活性逐渐减弱，说明shp4对FXIa具有特异抑制作用。

至此，我们筛选出作用凝血因子XIa的新型抗凝多肽Shp4，其对内源性凝血途径具有选择性抑制作用，为深入研究埃及血吸虫抗凝功能奠定了基础，为天然抗凝药物提供新的先导分子。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北医药学院

<120> 一种抗凝血多肽及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttcgcaaag gcagcagcgt gtgcctgctg gattatgatg aaggcatttg ccgcgcgctg 60

attaaacgct tttattatga tcgcgtgaac aaaacctgcg aagtgtttta ttatggcggc 120

tgcctgggca accgcaacaa ctttctgagc aaacaggaat gcgaacagaa atgcaacggc 180

acctga 186

<210> 2

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Phe Arg Lys Gly Ser Ser Val Cys Leu Leu Asp Tyr Asp Glu Gly Ile

1 5 10 15

Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Tyr Tyr Asp Arg Val Asn Lys Thr

20 25 30

Cys Glu Val Phe Tyr Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe

35 40 45

Leu Ser Lys Gln Glu Cys Glu Gln Lys Cys Asn Gly Thr

50 55 60

Claims (3)

1.抗凝血多肽shp4在制备抗凝血药物或前药中的应用，

所述的抗凝血多肽shp4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的抗凝血为抗内源性凝血途径，

所述的内源性凝血途径为：由凝血因子XⅠa(FXⅠa)参与或介导的凝血效应。

2.编码抗凝血多肽shp4的编码基因在制备抗凝血药物或前药中的应用，

所述的抗凝血多肽shp4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的抗凝血为抗内源性凝血途径，

所述的内源性凝血途径为：由凝血因子XⅠa(FXⅠa)参与或介导的凝血效应。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

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