CN105985432B - 一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成；或者含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的，具有抗凝血活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有抗血栓作用，而且出血风险小，可作为制备治疗和预防血栓性疾病的药物应用。

Description

一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其在制备治疗和预防血栓性疾病中的应用。

技术背景

血栓栓塞性疾病是危害人类健康的常见病，也是当前社会致死致残的主要原因之一。传统的抗栓药物如肝素、低分子量肝素、华法林、血小板聚集抑制剂(如阿司匹林)、水蛭素等在临床应用中均具有较好的抗栓药效，但他们却还存在一定的不足，其中，最常见、最严重的并发症(副作用)是引起出血，因此，发明出血副作用小的抗栓新药具有非常重要的价值。

近年来的研究表明：凝血过程中的凝血因子十一(coagulation factor XI，FXI)及血浆激肽释放酶(plasma kallikrein，PK)是出血风险小的抗栓防治新靶点[Bane CEJr，Gailani D.Factor XI as a target for antithrombotic therapy.Drug DiscovToday.2014，19(9)：1454-8；Renné T，Gruber A.Plasma kallikrein：novel functionsfor an old protease.Thromb Haemost.2012，107(6)：1012-3]，FXIa或FXI、血浆激肽释放酶(PK)抑制剂可能开发为出血副作用小的抗栓药物。

Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类含有Kunitz结构域的多肽或蛋白类抑制剂，是目前研究最多的丝氨酸蛋白酶抑制剂之一[罗玉娇，李滨，舒衡平，蒋立平.Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的研究进展.中国生化药物杂志.2012，33(3)：316-9]。Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有复杂多样的功能，如具有抗炎、抗菌或抗虫等作用，目前已有牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)等Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂作为药物进入临床应用。

生物体内分布有大量的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前在Genbank中登记的含有Kunitz型结构域的蛋白/多肽已超过1万多条。我们从美洲钩虫(Necator americanus)中获得了一种含有Kunitz型结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Necatorin，Necatorin及其经氨基酸残基替换、缺失或添加而形成的突变体具有较强的抗凝作用，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。Necatorin及其突变体对FXIa、或PK有很强的抑制作用。动物实验表明：Necatorin及其突变体能抑制血栓 形成，而且出血副作用小。因此，Necatorin及其突变体是一种具有出血副作用小的抗凝多肽，可应用于制备预防和治疗血栓性疾病药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抗凝活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂可应用于制备药物以治疗和预防血栓性疾病，并且具有出血副作用小的优点。

本发明提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂含有由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽，或者含有由SEQ IDNO.1所示氨基酸序列组成的多肽经过一个或多个氨基酸残基的替代、缺失或添加而形成的，且能明显延长APTT，而对PT基本无影响。

本发明提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。该抑制剂含有由SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4、或SEQ ID NO.5、或SEQ ID NO.6、或SEQID NO.7、或SEQ ID NO.8、或SEQ ID NO.9、或SEQ ID NO.10、或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成的多肽，这些多肽能明显延长APTT，而对PT基本无影响。

本发明提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其对FXIa或PK有很强的抑制作用。其中，由SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的多肽对激活的凝血因子十一(FXIa)及血浆激肽释放酶(PK)两者均有较强的抑制作用，由SEQ IDNO.4、或SEQ ID NO.5、或SEQ IDNO.6、或SEQ ID NO.7、或SEQ ID NO.8、或SEQID NO.9、或SEQ ID NO.10、或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成的多肽较SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽对FXIa抑制作用有增强或无明显变化，但抑制PK的能力明显减弱，即抑制FXIa的特异性明显增强了。

本发明的一个应用在于应用提供的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂制备治疗和预防血栓性疾病药物。包含本发明的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有明显的抑制血栓形成作用，而且对出血时间无明显影响，可用于作为或发展成为出血副作用小的抗血栓约物。

本发明的其它方面由于本文技术内容的公开，对本领域专业技术人员是易于理解并实施的。例如，包含本发明所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂与其它抗栓药物联合用药可减少出血副作用，包含本发明所述的多肽药物组合物在临床中的应用，包含本发明的多肽药物与白蛋白等偶联或融合以提高药物半衰期，包含本发明的抗凝多肽在作为抗凝制剂中的应用。

本发明提供的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的优点是：该种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂不但能够制备作为有效治疗和预防血栓性疾病药物应用，而且出血副作用小，对于解决目前临床抗栓药物治疗出现的出血副作用具有重大价值。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中，图1显示的是Necatorin对APTT及PT的影响，X轴数值为Necatorin浓度(nM)，Y轴数值为凝血时间(秒，sec)，Necatorin延长APT T的活性与其浓度呈依赖关系；图2显示的是Necatorin的核苷酸序列及其编码氨基酸序列，上方序列为核苷酸序列，下方为氨基酸残基(简写)序列，“*”示终止，下划线部分序列为预测的信号肽序列。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。凡是依照本发明公开内容所做出的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的获得与制备

在Genbank中登记的美洲钩虫基因组测序数据中，一种预测为具有Kunitz型结构域的多肽/蛋白(GenBank：ETN84717.1)由62个氨基酸残基组成，但其仅含有4个半胱氨酸残基(cys)，提示该Kunitz型结构域还不不完整。多种已知的美洲钩虫Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂信号肽具有较保守序列“MK/RFLLFLL”，因此我们利用已知的美洲钩虫Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(GenBank：ETN75126.1及GenBank：ETN82803.1)的cDNA序列设计上游引物5’-ATGAAATTTCTGCTATTTCTT-3’，根据前述GenBank：ETN84717.1序列的相应cDNA序列(GenBank：KI657882.1)设计下游引物5’-CTACAGTTTATGTTTGCGGTTTA-3’，以美洲钩虫成虫cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，获得了具有完整成熟肽的编码基因，编码基因及其编码序列见图2。编码成熟肽序列见SEQ ID NO.1所示序列，由69个氨基酸残基组成，具有典型Kunitz型结构域所具备的6个半胱氨酸残基(cys)。

用BlastP程序进行检索，在GenBank中与SEQ ID NO.1所示序列氨基酸序列一 致性大于或等于66％的序列有2条，其中具有最大序列相似性的序列为前述GenBank：ETN84717.1所述序列，两者的羧基端的50个氨基酸残基序列一致，但氨基端序列有明显差异，且前者成熟肽由69个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸残基(cys)；后者登记的完整序列由62个氨基酸残基组成，仅含有4个半胱氨酸残基(cys)；与SEQ ID NO.1所示序列具有其次序列相似性的序列为GenBank：ETN84721.1所述序列，两者氨基酸序列一致性(Identities)为68％(38/56)。因此，我们命名我们获得的多肽为Necatorin。目前尚无任何有关SEQ ID NO.1序列的生物活性(功能)研究。

用PCR法对SEQ ID NO.1编码序列进行突变，结果获得了突变体AP-1(SEQ ID NO.2所示氨基酸序列)、AP-2(SEQ ID NO.3所示氨基酸序列)、AP-3(SEQ ID NO.4所示氨基酸序列)、AP-4(SEQ ID NO.5所示氨基酸序列)、AP-5(SEQ ID NO.6所示氨基酸序列)、AP-6(SEQID NO.7所示氨基酸序列)、AP-8(SEQ ID NO.9所示氨基酸序列)、AP-9(SEQ ID NO.10所示氨基酸序列)及AP-10(SEQ ID NO.11所示氨基酸序列)编码序列。

Necatorin及其突变体编码基因经克隆、酶切连接入表达质粒pET32a，成功构建的表达质粒pET32a/Necatorin(或其突变体编码序列)转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达、离心分离细菌、超声破碎、Ni-NTA亲和层析获得了纯化的含Necatorin或其突变体的融合蛋白，再用牛肠激酶切割融合蛋白，经Ni-NTA亲和层析分离融合伴侣Trx和目的多肽，获得重组目的多肽。

实施例2：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗凝活性

本实施例中，用活化部分凝血活酶时间(APTT)及凝血酶原时间(PT)法检测本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗凝活性。本实施例所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(抗凝多肽)是通过在大肠杆菌中重组表达、分离纯化获得(见实施例1)。

活化部分凝血活酶时间(APTT)测定(白陶土)：于塑料试管中取10μl一定浓度的抗凝多肽(空白对照用浓度为0.9％的生理盐水)与0.1ml正常人血浆(枸橼酸钠抗凝)混匀后，加入APTT(上海太阳生物技术有限公司产品)试剂0.1ml，37℃水浴5min，其间轻轻振摇，再加入25mmol/L CaCl2溶液0.1ml混匀，置于37℃水浴，摇匀计时，观察凝固时间，即为APTT值。每个浓度均重复3次，取平均值。通过计算该重组多肽延长凝血时间的倍数值分析其延长APTT的能力，计算公式为：延长APTT倍数＝(测定的各浓度APTT值-空白对照组APTT值)/空白对照组APTT值。

凝血酶原时间(PT)测定：于塑料试管中取10μl一定浓度的抗凝多肽(空白对照用生理盐水)与0.1ml正常人血浆(枸橼酸钠抗凝)混匀后，37℃温浴5min后，加入预温PT试剂(上海太阳生物技术有限公司产品)0.2ml，混匀，开始计时，血液凝固时间即为PT值。

结果表明：Necatorin及其突变体均能明显延长APTT(表1)，但均基本不影响PT。在50nM及100nM浓度(终浓度)下，重组Necatorin(SEQ ID NO.1所示序列)分别能延长0.43倍及1.01倍APTT。保留有3对完整Cys结构的截断突变体AP-1(SEQ ID NO.2所示序列)及AP-2(SEQ ID NO.3所示序列)具有与Necatorin相似的延长APTT活性；突变体AP-3～AP-10(SEQID NO.4～SEQ ID NO.11所示序列)延长APTT活性均有显著增强(P＜0.05)，如100nM的AP-3及AP-4分别能延长1.66及1.42倍APTT。但即使在1000nmol的浓度下，Necatorin及其突变体均不明显延长PT。

不同浓度的Necatorin对APTT、PT的影响可见图1。Necatorin延长APTT的能力与其浓度呈依赖关系，但其基本不能延长PT。

表1 本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对APTT的影响

实施例3：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对凝血因子的抑制作用

本实施例所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(重组抗凝多肽)是通过在大肠杆菌中重组表达、分离纯化获得(见实施例1)。用发色底物法检测各重组多肽对凝血因子的作用。

在酶标板每孔200μl反应体系中进行。100μL人凝血因子XIa(FXIa)、或人FXIIa(终浓发为1nM，Haematologic lechnologies lnc产品)、或人血浆激肽释放酶(plasmakallikrein，PK)(终浓度为lnM，Merck产品)分别与20μL不同浓度重组多肽(对照组用PBS)混匀。在25℃孵育15分钟后，加入80μL发色底物(FXIa及FXIIa发色底物用S2366，终浓度均为0.4mM；PK发色底物用S2302，终浓度为0.8mM。发色底物均为 Chromogenix产品)，3分钟后测OD₄₀₅值，根据OD₄₀₅值变化计算抑制情况，重复测3孔。抑制率计算公式为：抑制率＝(对照组OD₄₀₅值-加入重组多肽的OD₄₀₅值)/对照组OD₄₀₅值×100％。

结果表明：Necatorin及其突变体对PK、或FXIa有较强的抑制作用(表2和表3)。Necatorin、AP-1(SEQ ID NO.2所示序列)及AP-2(SEQ ID NO.3所示序列)对PK及FXIa两者均有很强的抑制作用，如10nM浓度的Necatorin可抑制83％的PK活性及63％的FXIa活性。突变体AP-3～AP-10(SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.11所示序列)抑制FXIa的活性较野生型序列(SEQ ID NO.1所示序列)有所增强或无明显变化，但他们抑制PK活性均有不同程度减弱，如100nM的Necatorin能抑制约97％的PK活性，但100nM的AP-3(SEQ ID NO.4所示序列)仅能抑制约40％的PK活性。部分突变体抑制PK活性降低了，意味着其抑制FXIa的特异性增强了。

表2 本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对PK的抑制作用

表3 本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对FXIa的抑制作用

实施例4：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠尾出血时间(BT)的影响

取昆明小鼠，体重18～22g，雌雄各半，随机分组(每组8只)。小鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠0.2ml/100g麻醉，麻醉后于尾静脉注射给药，分别给予各重组多肽高(5mg·kg^-1)、低(50μg·kg^-1)2个剂量组、肝素钠(1650U/kg，天津生物化学制药有限公司)组 和生理盐水组。给药10min后，于鼠尾术端1mm处用外科手术刀横向切断鼠尾，立即将鼠尾放于试管内37℃恒温的生理盐水中，开始计时，观察出血情况并记录出血时间(BT)。出血时间最长观察10分钟，超过10分钟仍出血的按10分钟计算。

结果表明：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对出血时间(BT)无明显影响(表4)，表明本发明所提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠的正常止血功能无明显影响，作为药物应用时，出血副作用小。

表4 本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠出血时间的影响(n＝8)

实施例5：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响

取雄性SD大鼠，体重300～350g，随机分组，每组8只，包括生理盐水对照组，阳性对照组(100U·kg^-1肝素钠，天津生物化学制药有限公司)，重组多肽(Necatorin、AP-3、AP-4及AP-5)低(50μg·kg^-1)、中(200μg·kg^-1)和高剂量组(800μg·kg^-1)。大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠1.5ml/kg体重，仰位固定，分离气管插管。手术分离出右颈总动脉及左颈外静脉，在一内径1.5mm、长22cm、充满50U·mL的肝素生理盐水的硅化聚乙烯管内， 内置一根长5cm的4号手术缝合线，将聚乙烯管的一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静脉。尾静脉给药，给药后5min，打开动脉夹，血液由右颈总动脉流经聚乙烯管返回左颈外静脉。开放血流20min后中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量为血栓湿重。血栓形成抑制率＝(生理盐水对照组血栓湿重-给药组血栓湿重)/生理盐水对照组血栓湿重×100％。

结果见表5，与生理盐水对照组比较，本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂能显著抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成(p＜0.01)，如Necatorin低剂量组(50μg·kg^-1)血栓湿重为(10.5±2.1)mg，血栓形成抑制率为78.7％。

表5 本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响(n＝8)

与生理盐水对照组比较，^*p＜0.01

实施例6：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠颈总动脉血栓形成的影响

取雄性SD大鼠(体重300-350g)随机分组(8只/组)，包括假手术组，模型组，肝素钠组(1650U·kg^-1)，重组多肽(Necatorin、AP-3、AP-4及AP-5)低(50μg·kg^-1)、中(200μg·kg^-1)及高剂量组(800μg·kg^-1)。大鼠用以2％戊巴比妥钠溶液1.5ml/kg剂量腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，于颈部正中切口，小心剥离左侧颈总动脉1.5cm，穿过2根2号缝合线将其游离，用塑料纸将血管与周围组织隔开，以保护血管周围正常组织。尾静脉给药后，将准备好浸润有40μl 10％FeCl₃溶液的滤纸片(0.8cm×2.0cm)将血管 包裹10min，从而诱导动脉血栓形成。20min后，结扎滤纸条两端血管，精确剪下滤纸条包裹的血管段，用滤纸吸干血管内余血，称重。血栓湿重＝(含血栓的血管重量-取出血栓后的血管重量)。假手术组用生理盐水代替FeCl3浸泡的滤纸条。

结果见表6，与模型组比较，本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂能显著抑制大鼠颈总动脉血栓形成，如Necatorin低剂量组(50μg·kg^-1)血栓湿重为(4.140.8)mg，较模型组血栓湿重(7.5±0.7)mg显著降低。

表6本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠颈总动脉血栓形成的影响(n＝8)

与生理盐水对照组比较，^*p＜0.01

实施例7：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠静脉血栓形成的影响

取雄性SD大鼠(体重300-350g)随机分组(8只/组)，包括生理盐水对照组，重组多肽(Necatorin、AP-3、AP-4及AP-5)低(50μg·kg^-1)、中(200μg·kg^-1)及高剂量组(800μg·kg^-1)。大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液1.5ml/kg剂量麻醉，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下方置一丝线备结扎血管用，自尾静脉注射不同浓度受试药物，5min后结扎下腔静脉造成淤血，然后关闭腹腔，4h后再次打开腹腔，于结扎下方2.0em处夹闭血管，纵行剖开检查有无血栓形成，以正常对照组为基准计算各组血栓形成比率，即血栓形成比率为给有血栓形成的大鼠数/每组实验大鼠数。抑制率＝[(每组实验大鼠只数-每组有血栓形成的大鼠只数)/每组实验大鼠只数-(生理盐水组实验大鼠只数-生理盐水组有血栓形成的大 鼠只数)/生理盐水组实验大鼠只数)]。

结果表明(表7)本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂能显著抑制大鼠的静脉血栓形成，如在Necatorin低剂量组(50μg·kg^-1)，10只实验大鼠中有2只大鼠有静脉血栓形成，相对于生理盐水组的100％大鼠能形成血栓，血栓形成抑制率为80％。

表7 本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠下腔静脉血栓形成的影响(n＝10)

与生理盐水对照组比较，^*p＜0.01

以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。

工业实用性

本发明提供的具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是凝血因子XIa(FXIa)，或血浆激肽释放酶(PK)的抑制剂，该类抑制剂不但能够制备作为有效预防和治疗血栓性疾病药物应用，而且出血副作用小，对于解决目前临床抗凝抗栓治疗出现的出血并发症具有重大意义。

Claims (3)

1.一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂为：由SEQ ID NO.1，或SEQ ID NO.2，或SEQ ID NO.3，或SEQ ID NO.4，或SEQ ID NO.5，或SEQ ID NO.6，或SEQID NO.7，或SEQ ID NO.8，或SEQ ID NO.9，或SEQ ID NO.10，或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列组成的多肽。

2.如权利要求1所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备治疗和预防血栓性疾病药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂作为活性成份直接或与药学上可接受的载体制成制剂。

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