CN112206310B - 一组用于抑制补体的寄生绦虫多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组用于抑制补体的寄生绦虫多肽，所述的多肽为EG2434多肽和EM3696多肽，EG2434的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，EM3696蛋白序列如SEQ ID NO.3所示，本发明还涉及所述的EG2434多肽和/或EM3696多肽在制备抗补体药物中的应用。

Description

一组用于抑制补体的寄生绦虫多肽

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一组用于抑制补体的寄生绦虫多肽。

背景技术

补体系统是机体固有免疫防御的重要组成部分，包括一系列不耐热、经活化后具有酶活性的补体蛋白，以及其对应补体受体和调节蛋白质(1)，同时也是机体固有免疫和适应性免疫的桥梁(2)。补体活化过程及其活化所形成的产物可介导细胞溶破、调理吞噬、炎症反应、清除免疫复合物等一系列重要的生物学效应。补体系统是高度复杂的生物反应系统。生理情况下，血浆中补体成分多以无活性的酶前体形式存在，但在受到某些内源性或外源性物质激活后，通过不同途径的级联酶促反应激活补体系统。这些途径分为经典途径(3)、旁路途经(4)、凝集素途径(5)，以及近年发现的备解素途径(6)、蛋白酶解途径(7)。

补体包括50多种可溶性蛋白和膜结合蛋白，统称为补体系统，可分为三类组分。补体固有成分，指参与补体激活级联反应的补体成分，包括经典途径的C1q、C1r、C1s、C4、C2，凝集素途径的甘露糖结合凝集素(MBL)、纤维胶原素和MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASPs)，旁路途经的B因子(fB)、D因子(fD)，共同途径的C3、C5～C9。补体调节蛋白，该类蛋白可通过调节补体激活过程中的关键酶从而控制补体的活化程度，包括C1抑制剂(C1-INH)、I因子(fI)、C4结合蛋白(C4bp)、蛋白S(PS)、补体1型受体(CR1，CD35)、补体2型受体(CR2，CD21)、衰变加速因子(DAF)、膜辅因子(MCP)、H因子(fI)、备解素(fP)等。补体受体，表达于不同细胞膜表面，与补体激活过程中生成的活性片段相结合，介导多种免疫效应。已发现的补体受体有CR1、CR2、CR3、CR4、CR5及C3aR、C4aR、C5aR、C1qR、C3eR、fH受体等。

补体系统是体内最复杂的一个有限蛋白酶解性质的级联反应系统，有严格的反应顺序，受分级调控机制严格控制。每种补体分子和每个活化阶段的反应程度都受到各种调节分子的严格控制，借此维持体内补体水平稳定，达到既能有效清除病原微生物等抗原性异物，又能防止补体过度消耗和对自身组织造成损伤。

补体系统适度激活是维持自身稳定的重要保证之一。正常情况下，机体内补体系统各成分含量相对稳定，适时、适度地被激活从而发挥生物学功能，其原因就在于体内存在相应的控制和调节补体激活的机制。

补体系统与其他有限蛋白酶解级联反应系统如凝血系统(8)、纤溶系统(9)和激肽系统(10)存在密切联系，某些调节蛋白可参与几个系统的调节，所以当一个系统失控时会累及其他系统。

某些情况下，补体过度消耗或激活被认为是免疫介导性和炎症性疾病的主要致病因素，不仅可使大量补体无益消耗，导致机体抗感染能力下降，而且会使机体发生剧烈炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，从而造成正常组织细胞损伤。

临床上广泛使用的糖皮质激素、环磷酰胺、甲氨蝶呤等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药并非专一的补体抑制剂，选择性差，难以口服，长期使用会降低机体的防御机能，导致抗感染能力下降，易继发感染和使潜在病灶扩散，产生多种并发症和副作用(11)。补体系统成分多样、结构复杂，且补体涉及的疾病广泛、患者个体差异较大、在开发补体系统药物时也需要考虑特定的适应症和患病人群，给药物开发带来了诸多难题。

生物活性肽主要是指对生物机体的生命活动有益且具有生理作用的肽类化合物，它来源非常广泛，可以来源于动植物、微生物等生物体内，也可以通过人工化学合成或者生物工程方法获得。在上个世纪，小分子和多肽天然产物作为先导药物进入临床试验，在在蛋白质设计和工程中受到越来越多的关注，在药物研究中的应用越来越广泛。生物活性肽被认为是新一代的生物活性调节因子，可以增强对各种疾病和失调的治疗。它们在氨基酸组成、化学结构和生物功能上有很大的差异。这些多肽影响许多生物过程，从而产生行为、神经、激素、营养、胃肠作用，具有抗菌活性、抗血栓形成、凝血因子XIa抑制活性、降压以及抗肿瘤活性等(12-20)。现今，国内外对生物活性肽的研究日益活跃，许多生物活性肽已作为诊断试剂、药物、疫苗等广泛应用于实践中。然而迄今为止，很少关于抗补体功能的报道(21-24)。

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发明内容

本发明首先涉及寄生绦虫活性多肽中的两个同源的Kunitz多肽在制备抗补体药物中的应用，所述的两个同源的Kunitz多肽为EG2434多肽和EM3696多肽，

EG2434来源于细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)，有63个氨基酸组成，属于Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，含一个Kunitz结构域，含有6个Cys并形成3对分子内二硫键；

EG2434的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示

SEQ ID NO.1：

KISYINRCNLPISSGRCRGYFLRYGYDSETDECRRFVYGGCRGNRNNFFTYKECMKRCYLRFK

EM3696来源于多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)，是细粒棘球绦虫多肽EG2434的同源序列，也有63个氨基酸组成，属于Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，含一个Kunitz结构域，含有6个Cys并形成3对分子内二硫键。

EM3696蛋白序列如SEQ ID NO.3所示：

SEQ ID NO.3：

KMSYINRCNLPISSGRCRGYFLRYGYDSKTDECRRFVYGGCRGNRNNFFTYKECMKRCYLRFK。

本发明还涉及编码所述EG2434多肽和EM3696多肽的核苷酸序列，

优选的，

EG2434的核酸序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

CTGCATATGAAAATTAGCTATATTAACCGCTGCAACCTGCCGATTAGCAGCGGCCGCTGCCGCGGCTATTTTCTGCGCTATGGCTATGATAGCGAAACCGATGAATGCCGCCGCTTTGTGTATGGCGGCTGCCGCGGCAACCGCAACAACTTTTTTACCTATAAAGAATGCATGAAACGCTGCTATCTGCGCTTTAAATGACTCGAGCAC

EM3696的密码子优化的核酸序列如SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.4：

CTGCATATGAAAATGAGCTATATTAACCGCTGCAACCTGCCGATTAGCAGCGGCCGCTGCCGCGGCTATTTTCTGCGCTATGGCTATGATAGCAAAACCGATGAATGCCGCCGCTTTGTGTATGGCGGCTGCCGCGGCAACCGCAACAACTTTTTTACCTATAAAGAATGCATGAAACGCTGCTATCTGCGCTTTAAATGACTCGAGCAC。

本发明还涉及所述的EG2434多肽和/或EM3696多肽在制备抗补体药物中的应用。

本发明还涉及包含所述的EG2434多肽和/或EM3696多肽的药物或制剂，所述的药物是靶向补体的药物；

所述的药物或制剂包括：治疗有效量的所述的EG2434多肽和/或EM3696多肽、必要的药用辅料。

本发明还涉及所述的EG2434多肽和/或EM3696多肽在制备治疗或预防心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的药物中的应用，优选的，所述的药物为，经静脉注射给药的药物。

附图说明

图1、天然多肽EG2434的表达纯化。

图2、天然多肽EM3696的表达纯化。

图3、天然多肽EG2434和EM3696的SDS-PAGE

图4、经典途径不同稀释度的人血清效价。

图5、多肽的抗补体浓度依赖。

图6、多肽对不同浓度补体抑制率。

图7、MI/RI小鼠心肌梗死Evans Blue/TTC染色，7A图为小鼠心肌梗死1小时后再灌注3小时心脏组织被Evans Blue/TTC染色，白色为坏死区、红色为缺血区、蓝色为非危险区；7B图为多肽对心肌坏死区面积的影响。

图8、多肽对血清CK的影响。

具体实施方式

实验材料与方法

实验材料

1、原核表达体系中的表达载体pET-28a(+)由本实验室提供，实验选择的酶切位点分别是NdeI、XhoI。

2、感受态细胞为大肠杆菌菌株E.coli/Trans5α和Transetta(DE3)购于北京全式金生物技术有限公司。

3、高纯度质粒小提试剂盒，北京康为世纪科技有限公司。

4、快速DNA产物纯化试剂盒，北京康为世纪科技有限公司。

5、BCA蛋白定量检测试剂盒，碧云天生物科技有限公司。

6、2×SpecificTM Taq Master Mix，上海近岸蛋白质科技有限公司。

7、限制性内切酶NdeI、限制性内切酶XhoI、T4 DNA Ligase、DL2000 DNA Maker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，

宝生物工程有限公司。

8、还原型谷胱甘肽(L-GSH Reduced)、氧化型谷胱甘肽(L-GSH Oxidized)，

合肥新恩源生物技术有限公司。

9、卡那霉素，文翰科技有限公司。

10、实验血清：健康自愿捐献。

11、Alsever液保存无菌绵羊全血，浙江玉环市南方试剂有限公司。

12、兔抗羊血清，上海笃玛生物科技

13、变性液：

使用前加入100mM还原型谷胱甘肽。

复性液：200mM乙酸铵，0.5M精氨酸，0.2mM氧化型谷胱甘肽，用HCl将pH值调节至远离蛋白等电点±1。

14、RP-HPLC溶液：

溶液A-80％(V/V)甲醇：500mL色谱纯甲醇溶液中加入高压灭菌超纯水，充分混匀。

溶液B-0.1％(V/V)三氟乙酸(TFA)500mL高压灭菌超纯水中加入500μL色谱纯TFA。

溶液C-80％(V/V)甲醇：500mL色谱纯甲醇溶液中加入高压灭菌超纯水，充分混匀。

溶液D-90％(V/V)乙腈+0.1％(V/V)TFA：500mL色谱纯乙腈溶液中加入高压灭菌超纯水55.6mL和色谱纯TFA 556μL，充分混匀。

15、5×巴比妥缓冲液(pH7.4)

明胶巴比妥缓冲液(GVB)：准确称取0.1g明胶，加适量超纯水在微波炉中煮沸溶解，加20mL上述5×巴比妥缓冲液，加超纯水定容至100mL。

16、雄性C57BL/6小鼠(25g左右)，由本校动物实验中心提供。

17、4-0带线缝合针、6-0带线缝合针，宁波市成和显微器械厂。

18、手术剪、蚊式止血钳、眼科弯镊、持针器、组织剪、动脉夹，上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂。

19、纸胶带、50mL离心管的瓶盖、6孔板、刀片、玻璃匀浆器

20、异氟烷，Evans Blue，TTC，4％多聚甲醛，CK试剂盒(南京建成生物工程研究所)

21、抗补体C1q、C3、C4抗血清；缺失补体成分C2、C5、C7、C8人血清；人补体成分C1、C1q、C2、C3、C3b、C4、C4b、C5、C6；6×His鼠单抗，鼠抗人C1q、C3/C3b单抗，兔抗人C4多抗，ProteinTech公司等。protein G购自碧云天科技公司。

实施例一、肽EG2434和EM3696的制备

一、表达载体pET-28a(+)质粒的制备

1、将本实验室保存的含有pET-28a(+)质粒的DH5α菌种接种到含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基中，37℃震荡过夜孵育至OD600为0.8，转速为200rpm。使用康为世纪的高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。

2、取2mL过夜培养菌液到EP管中，12000rpm离心3分钟，弃去上清。

3、向菌沉淀中加入250μL Buffer P1(预先加入RNase A)，置于涡旋振荡器震荡至菌体充分悬浮。

4、向离心管中加入250μL Buffer P2，温和上下颠倒4～6次，使菌体破裂，菌悬液变得清亮粘稠，此步骤用时不超过5分钟。

5、向离心管中加入350μL Buffer N3，立即温和上下颠倒4～6次，出现白色絮状沉淀，12000rpm离心15分钟。

6、用移液枪将上清转移至吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，12000rpm离心2分钟，弃去收集管中的废液。

7、向吸附柱中加入750μL buffer PW(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心2分钟，弃去收集管中的废液，再12000rpm离心3分钟。将吸附柱置于室温中晾至无水乙醇挥发干净。

8、吸附柱置于干净EP管中，加入40μL Buffer EB，室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，弃掉吸附柱，收集质粒溶液，-20℃冰箱保存。

二、引物设计

根据overlap PCR原理，设计PCR反应引物。

EG2434的引物设计：

EG2434-FP3：

CTGCATATGAAAATTAGCTATATTAACCGCTGCAACCTGCCGATTAGCAG

EG2434-FP2：

CCTGCCGATTAGCAGCGGCCGCTGCCGCGGCTATTTTCTGCGCTA

EG2434-FP1：

CTATTTTCTGCGCTATGGCTATGATAGCGAAACCGATGAATGCCGCCGCTTTGTG

EG2434-RP1：

GTTGTTGCGGTTGCCGCGGCAGCCGCCATACACAAAGCGGCGGCA

EG2434-RP2：

GCGTTTCATGCATTCTTTATAGGTAAAAAAGTTGTTGCGGTTGCC

EG2434-RP3

GTGCTCGAGTCATTTAAAGCGCAGATAGCAGCGTTTCATGCATTC

EM3696的引物设计：

EM3696-FP3：

CTGCATATGAAAATGAGCTATATTAACCGCTGCAACCTGCCGATTAGCAG

EM3696-FP2：

CCTGCCGATTAGCAGCGGCCGCTGCCGCGGCTATTTTCTGCGCTA

EM3696-FP1：

CTATTTTCTGCGCTATGGCTATGATAGCAAAACCGATGAATGCCG

EM3696-RP1：

TTGCCGCGGCAGCCGCCATACACAAAGCGGCGGCATTCATCGGTT

EM3696-RP2：

CATTCTTTATAGGTAAAAAAGTTGTTGCGGTTGCCGCGGCAGCCG

EM3696-RP3：

GTGCTCGAGTCATTTAAAGCGCAGATAGCAGCGTTTCATGCATTCTTTATAGGTA

三、overlap PCR

根据overlap PCR原理，分成三轮PCR反应，以此获得EG2434和EM3696的完整DNA序列，第一轮上下游引物为FP1、RP1；第二轮上下游引物为FP2、RP2；第三轮上下游引物为FP3、RP3。反应体系及条件如下：

第一轮PCR：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环18次，最后72℃延伸10分钟。

第二轮PCR：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环28次，最后72℃延伸10分钟。

第三轮PCR：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环28次，最后72℃延伸10分钟。

四、目的DNA的PCR产物纯化

将完成PCR扩增的EG2434和EM3696 DNA产物按照康为世纪的快速DNA产物纯化试剂盒进行纯化。

1、EG2434和EM3696的PCR产物加入6倍体积(150μL)的Buffer PB，充分混匀后装入吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

2、向吸附柱中加入750μL Buffer PW(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心3分钟，弃掉收集管中废液，再12000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温中晾至无水乙醇挥发干净。

3、吸附柱置于干净EP管中，加入40μL Buffer EB,室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，弃掉吸附柱，收集EG2434和EM3696 DNA溶液，-20℃冰箱保存。

五、目的DNA和pET-28a(+)质粒的酶切

分别将纯化后的EG2434和EM3696 DNA片段和pET-28a(+)质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切。双酶切体系如下：

置于恒温水浴箱中37℃水浴16小时。

六、目的DNA和pET-28a(+)质粒酶切产物的纯化

将完成双酶切的EG2434和EM3696 DNA片段和pET-28a(+)质粒按照康为世纪的快速DNA产物纯化试剂盒进行纯化。

1、EG2434和EM3696的酶切产物加入6倍体积(240μL)的Buffer PB，pET-28a(+)质粒的酶切产物加入3倍体积(120μL)的Buffer PB，充分混匀后装入吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

2、向吸附柱中加入750μL Buffer PW(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心3分钟，弃掉收集管中废液，再12000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温中晾至无水乙醇挥发干净。

3、吸附柱置于干净EP管中，加入40μL Buffer EB,室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，弃掉吸附柱，收集EG2434和EM3696和pET-28a(+)质粒的酶切产物溶液，-20℃冰箱保存。

七、纯化后的酶切目的DNA和pET-28a(+)质粒的连接

用T4连接酶将纯化后的酶切EG2434和EM3696片段和pET-28a(+)质粒进行连接，体系如下：

置于22℃水浴1小时。

八、连接产物的转化

1、将10μL的连接产物缓缓加入冰浴上融化的感受态细胞E.coli/Trans5α中，冰浴30分钟。

2、将冰浴后的感受态细胞置于42℃热水中热激90秒，迅速将EP管在冰上冷却5分钟，该过程不要摇动EP管。

3、吸取500μL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基于EP管，混匀后置于恒温摇床37℃培养45分钟，转速180rpm，使细胞复苏。

4、将复苏后的细胞于3700rpm离心3分钟，用移液枪吸取420μL上清弃去，用剩余上清将细胞重悬。

5、将重悬后的细胞接种于含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基，用灭菌玻璃涂布棒涂抹均匀，将平板正置于37℃培养箱直至细胞液被吸收，倒置平板，37℃过夜孵育12～16小时。

6、从LB固体培养基平板上挑选10个单克隆菌落，接种于500μL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃培养8小时，转速200rpm。

九、阳性克隆子的筛选与鉴定

1、以培养好的单克隆菌液为模板，上下游引物为FP3、RP3，进行菌落PCR，实验设置阴性对照和阳性对照，分别为无菌双蒸水和EG2434和EM3696纯化后的PCR产物。反应体系和条件如下：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环28次，最后72℃延伸10分钟。

2、对菌落PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，无菌双蒸水和EG2434和EM3696纯化后的PCR产物分别是阴性对照和阳性对照。将阳性结果的单克隆菌液送公司测序。

十、重组质粒EG2434-pET-28a(+)和EM3696-pET-28a(+)的制备

1、吸取测序成功的阳性单克隆菌液10μL于10mL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃过夜培养至OD600为0.8，转速为200rpm。

2、使用康为世纪的高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。步骤同前，将重组质粒EG2434-pET-28a(+)和EM3696-pET-28a(+)溶液保存于-20℃冰箱。

十一、重组质粒EG2434-pET-28a(+)和EM3696-pET-28a(+)的转化

1、吸取2μL重组质粒EG2434-pET-28a(+)和EM3696-pET-28a(+)溶液缓缓加入冰浴上融化的感受态细胞E.coli/Transetta(DE3)中。

2、转化步骤同1.2.1.7，将培养好的重组质粒EG2434-pET-28a(+)和EM3696-pET-28a(+)表达菌液保存于-20℃冰箱。

十二、多肽EG2434和EM3696的包涵体表达

1、取10μL重组质粒EG2434-pET-28a(+)和EM3696-pET-28a(+)表达菌液接种到100mL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基，置于恒温摇床37℃过夜培养10小时，转速为180rpm。

2、吸取50mL过夜表达菌液到1L含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基，置于恒温摇床37℃，220rpm扩增培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mM)进行诱导，继续37℃，220rpm培养4小时。

3、将诱导完成的菌液用高速冷冻离心机以6000rpm的速度在4℃环境下离心6分钟，弃去上清。收集菌沉淀，用25mL预冷的PBS溶液充分重悬。重悬后的菌液置于冰上进行超声破壁，超声条件设置：200W，工作3秒/次，间歇5秒/次，共20分钟。破壁后的菌液在4℃、12000rpm离心20分钟后，弃上清，沉淀即为包涵体。

4、将包涵体用预冷的PBST(1％Triton)充分重悬，冰浴20分钟，再4℃、5000g离心15分钟，弃上清，此步骤重复一次，可使包涵体沉淀的纯度较高。

5、包涵体变性：量取5mL变性液，加入0.15g还原型谷胱甘肽，混匀后加入包涵体沉淀中，充分重悬，于室温中静置2小时。

6、包涵体复性：提前配置500mL复性液，将pH值调至8.0，置于4℃冰箱冷藏。包涵体变性完成后于12000rpm离心20分钟。称量0.6g氧化型谷胱甘肽加入预冷的复性液中，置于磁力搅拌器上，边搅拌边缓慢滴加变性液上清。滴加过程中观察是否产生白色絮状沉淀，若有沉淀产生则停止滴加，直至沉淀消失继续滴加。完成后将复性液置于16℃恒温箱中复性过夜。

十三、多肽EG2434和EM3696的包涵体纯化

1、过夜后的复性液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除不溶解的沉淀。

2、使用超滤管(截留分子量为3kDa)将离心后的复性液于4℃、4000g离心45分钟，直至复性液浓缩为15mL。

3、用EP管将浓缩的复性液按1mL/管进行分装，按1mL复性液加10μL 10％TFA(TFA终浓度为0.1％)，4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，再4℃、12000rpm离心5分钟，上清用RP-HPLC分离纯化。

4、过HPLC的上样体积为<5mL，流速4mL/分钟。RP-HPLC的流动相：溶液B为0.1％TFA，D溶液为0.1％的TFA+90％的乙腈，固定相C18反相柱。RP-HPLC的洗脱梯度为：60分钟的线性梯度，初始时：B为95％、D为5％，结束时：B为5％、D为95％；测量波长选择230nm。

结果显示，C18烷反相柱RP-HPLC纯化后，获得较纯的蛋白(图1和图2)，

十四、多肽EG2434和EM3696的冻干

将RP-HPLC纯化收集的溶液，-80℃冰箱中冰冻16小时，再经真空冻干机冻干。冻干后的干粉按峰面积用适量超纯水重新溶解，按500μL/管分装于冻存管，剩余的用于SDS-PAGE(图3)、BCA定量。分装后的蛋白再次冻干，-80℃冰箱中保存。

十五、多肽EG2434和EM3696的BCA定量

1、标准品配制：

2、BCA工作液配制：按试剂A：试剂B＝50:1配制适量的工作液。

3、依次向96孔板中加入25μL待测多肽EG2434和EM3696溶液和不同浓度(0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9、1.2mg/mL)的BSA标准品，再依次向每孔中加入200μL工作液，充分混匀后置于恒温摇床中37℃、100rpm孵育30分钟。

4、孵育结束后立即用酶标仪检测在570nm处各孔的吸光度，将检测结果导出在Excel表格，各浓度标准品吸光值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制散点图，显示标准曲线和公式，将多肽EG2434和EM3696的吸光值带入公式中，计算多肽EG2434和EM3696的浓度，单位为mg/mL。

实施例二、天然活性多肽的抗补体功能筛选

本实验利用兔抗羊血清作为溶血素将绵羊红细胞致敏，致敏绵羊红细胞在Ca2+、Mg2+的条件下能激活补体经典途径，从而使绵羊红细胞发生溶血，溶血程度与补体含量成正比例关系。

一、补体效价的测定

采集10名健康志愿者的血清(NHS)作为补体，混匀后分装，-80℃冰箱保存。

500μL绵羊红细胞悬液与1mL冰GVB缓冲液混匀后于4℃、1000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤三次。吸取红细胞沉淀20μL加入980μL冰GVB缓冲液制成2％绵羊红细胞。

致敏绵羊红细胞(EA)的制备：兔抗羊血清作为溶血素用GVB缓冲液稀释为1:1000，与等体积的2％绵羊红细胞(SRBC)在37℃水浴30分钟，则SRBC致敏完成。

将补体(NHS)用GVB按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640倍比稀释，按下表加入各成分，置于37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟，取每管上清200μL于96孔板中，405nm处测吸光度。超纯水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。

补体效价测定所加各成分体积(μL)

以补体稀释倍数为X轴，各稀释倍数的补体造成的溶血率为Y轴，作图(图4)。选择能使致敏绵羊红细胞接近全溶的最低补体浓度作为确保体系所需的临界补体浓度。

二、多肽经典途径抗补体活性测定

取临界浓度的NHS与10μM多肽等体积混匀，37℃水浴10分钟，按下表加入EA、GVB，37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟,取每管上清200μL于96孔板，405nm处测吸光度。以多肽作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。实验同时设置补体组、全溶组、GVB组。

经典途径抗补体溶血实验所加各成分的体积(μL)

多肽的补体抑制率＝(A405补体组－A405多肽组)/(A405补体组－A405 GVB组)×100％

三、多肽浓度依赖和补体浓度依赖测定

取临界浓度的NHS与0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、15μM、20μM多肽等体积混匀，37℃水浴10分钟，加入EA、GVB，37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟,取每管上清200μL于96孔板，405nm处测吸光度。以多肽作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图(图5)。实验同时设置补体组、全溶组、GVB组。

取1:20NHS、1:30NHS、1:40NHS与10μM多肽等体积混匀，37℃水浴10分钟，加入EA、GVB，37℃水浴30分钟后，4℃、5000rpm离心10分钟，取每管上清200μL于96孔板，405nm处测吸光度。以多肽作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图(图6)。实验同时设置补体组、全溶组、GVB组。

实施例三、多肽EG2434和EM3696对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)是指缺血后的心肌恢复血液供应造成的心肌损伤和功能改变，常发生于心梗后恢复血液供应、体外循环下心脏手术、心脏骤停后心肺复苏和心脏移植等。目前认为主要损伤机制有氧化应激反应、钙超载、中性粒细胞活化、补体激活等(21)。越来越多证据表明，补体系统激活在心肌缺血再灌注损伤过程中起着重要作用(22,23)，可能是介导中性粒细胞聚集和内皮细胞损伤的关键因素(24)。抑制补体过度活化可能是减轻心肌损伤发生的有效策略。因此，我们建立了小鼠心肌缺血再灌注模型评估抗补体天然多肽EG2434和EM3696在体内的抗补体效果(多肽TSM1为对照)。

相关设备：

呼吸气麻机、37℃恒温摇床、-20℃冰箱、酶标仪、XTL-165系列体视显微镜、显微镜成像软件Phmias

一、C57BL/6小鼠心肌缺血再灌注模型的建立

鼠胸前区提前一天脱毛，使用1.5％～2％异氟烷呼吸麻醉，胶带固定小鼠。心脏正上方位置剪开小鼠皮肤，用4-0带针缝合线将小鼠皮肤提前做荷包缝合，使用眼科镊钝性分离胸大肌和胸小肌，使用蚊式止血钳戳破第四肋间隙，挤出心脏，从左心耳下缘3mm处找到左冠状动脉前降支穿针打活结，一端约留8mm线头，将心脏迅速推回胸腔。关闭胸腔，挤出空气，荷包缝合打结。红霉素眼膏消毒伤口，移至电热毯待苏醒。实验中以结扎后1～2分钟心电图II导联ST段明显抬高为模型成功指标。缺血1小时后拉开活结，再灌注3小时。假手术组小鼠只穿过冠状动脉不结扎，其余步骤相同。

实验分为三组：

(1)假手术组(SO)，只穿针不结扎，结扎前尾静脉注射生理盐水；

(2)I/RI组，结扎冠状动脉前降支，结扎前尾静脉注射生理盐水；

(3)多肽组，结扎冠状动脉前降支，结扎前尾静脉注射生理盐水稀释的多肽。

二、Evans Blue/TTC染色

再灌注结束后，再次对小鼠进行气麻，剪断膈肌和两侧肋骨，将胸骨上翻并固定，暴露出整个心脏，分离心包膜，使用6-0带针缝合线将左冠状动脉前降支再次结扎，分离并夹闭主动脉(注意保护主动脉，避免破裂)，逆向注射0.1～0.2mL 0.5％Evans Blue(生理盐水稀释)，保留观察1分钟。注射成功后剪取心脏，冲洗并挤出心脏积血，放在瓶盖上滴水覆盖，移至-20℃冰箱冻存30分钟。垂直于心脏长轴切1mm厚的心脏切片，置于6孔板中，加2mL0.5％TTC溶液(PBS稀释)，加瓶盖避光37℃震荡孵育30分钟。用移液枪弃去TTC溶液，加蒸馏水移液枪吹打清洗，重复三次直至清亮干净，吸尽废液后加4％多聚甲醛固定30分钟，拍照记录，显微镜成像软件Phmias计算梗死面积。

心梗面积百分比：每一切面的MI％＝梗死区面积/总心脏面积。

Evans Blue/TTC能将小鼠心肌的非危险区染成蓝色，存活区染成红色，梗死区因缺乏脱氢酶不会被染色而呈现白色，多肽组的白色区域小于I/RI组，蓝色和红色也比I/RI鲜明(图7)。计算梗死面积占整个心室面积比，结果显示I/RI组心肌梗死面积明显高于假手术组(P<0.0001)。与I/RI小组比较，多肽EG2434和EM3696组心肌梗死面积明显缩小(图7)。提示多肽EG2434和EM3696能减小心肌梗死范围，对再灌注心肌有保护作用。

三、血清CK活性检测

再灌注结束后，用1mL注射器自心脏取血，去掉针头缓缓注入无抗凝剂真空采血管中，待血液凝固后2000g离心15分钟，分离血清装入新的无菌EP管中。用CK试剂盒按说明检测CK活性。

1、混合试剂的配置：按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五＝8:2:5:10:5的比例进行配置，现用现配，用前需预温5分钟。

2、按下表进行操作：

血清CK活性检测加样体积和顺序

混匀，45℃水浴15分钟，酶标仪660nm处测各孔吸光度。

3、血清计算公式

CK活力(U/mL)＝标准曲线计算所得CK酶活力(U/mL)×样品测试前稀释倍数

＝[7.4491×(测定OD值-对照OD值)-0.0716]×样品测试前稀释倍数

由图8可见，I/RI组与SO组相比，血清CK活性明显上升，提示I/RI组心肌损伤严重；多肽组EG2434和EM3696的血清CK活性相对于I/RI组有显著性降低，结果提示多肽EG2434和EM3696能显著减少受损心肌细胞数量，从而导致释放入血的CK明显减少。

最后需要说明的是，上述实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北医药学院

<120> 一组用于抑制补体的寄生绦虫多肽

<160> CP120020682C

<210> 1

<211> 63

<212> PRT

<213> Echinococcus granulosus

<400> 1

Lys Ile Ser Tyr Ile Asn Arg Cys Asn Leu Pro Ile Ser Ser Gly Arg

1 5 10 15

Cys Arg Gly Tyr Phe Leu Arg Tyr Gly Tyr Asp Ser Glu Thr Asp Glu

20 25 30

Cys Arg Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Arg Asn Asn Phe

35 40 45

Phe Thr Tyr Lys Glu Cys Met Lys Arg Cys Tyr Leu Arg Phe Lys

50 55 60

<210> 2

<211> 210

<212> DNA

<213> Echinococcus granulosus

<400> 2

ctgcatatga aaattagcta tattaaccgc tgcaacctgc cgattagcag cggccgctgc 60

cgcggctatt ttctgcgcta tggctatgat agcgaaaccg atgaatgccg ccgctttgtg 120

tatggcggct gccgcggcaa ccgcaacaac ttttttacct ataaagaatg catgaaacgc 180

tgctatctgc gctttaaatg actcgagcac 210

<210> 3

<211> 63

<212> PRT

<213> Echinococcus multilocularis

<400> 3

Lys Met Ser Tyr Ile Asn Arg Cys Asn Leu Pro Ile Ser Ser Gly Arg

1 5 10 15

Cys Arg Gly Tyr Phe Leu Arg Tyr Gly Tyr Asp Ser Lys Thr Asp Glu

20 25 30

Cys Arg Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Arg Asn Asn Phe

35 40 45

Phe Thr Tyr Lys Glu Cys Met Lys Arg Cys Tyr Leu Arg Phe Lys

50 55 60

<210> 4

<211> 210

<212> DNA

<213> Echinococcus multilocularis

<400> 4

ctgcatatga aaatgagcta tattaaccgc tgcaacctgc cgattagcag cggccgctgc 60

cgcggctatt ttctgcgcta tggctatgat agcaaaaccg atgaatgccg ccgctttgtg 120

tatggcggct gccgcggcaa ccgcaacaac ttttttacct ataaagaatg catgaaacgc 180

tgctatctgc gctttaaatg actcgagcac 210

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgcatatga aaattagcta tattaaccgc tgcaacctgc cgattagcag 50

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctgccgatt agcagcggcc gctgccgcgg ctattttctg cgcta 45

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctattttctg cgctatggct atgatagcga aaccgatgaa tgccgccgct ttgtg 55

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gttgttgcgg ttgccgcggc agccgccata cacaaagcgg cggca 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgtttcatg cattctttat aggtaaaaaa gttgttgcgg ttgcc 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgctcgagt catttaaagc gcagatagca gcgtttcatg cattc 45

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgcatatga aaatgagcta tattaaccgc tgcaacctgc cgattagcag 50

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctgccgatt agcagcggcc gctgccgcgg ctattttctg cgcta 45

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctattttctg cgctatggct atgatagcaa aaccgatgaa tgccg 45

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttgccgcggc agccgccata cacaaagcgg cggcattcat cggtt 45

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cattctttat aggtaaaaaa gttgttgcgg ttgccgcggc agccg 45

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtgctcgagt catttaaagc gcagatagca gcgtttcatg cattctttat aggta 55

Claims (2)

1.寄生绦虫活性多肽中的一组同源的Kunitz多肽在制备治疗或预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述的一组同源的Kunitz多肽为EG2434多肽和EM3696多肽，其特征在于，

EG2434的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示；

EM3696蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为经静脉注射给药的药物。

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