CN112175060B - 一组用于抑制补体的蝎毒多肽及其突变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组用于抑制补体的蝎毒多肽及其突变体，所述的蝎毒多肽是Sj3H多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的Sj3H多肽的突变体为：在所述的Sj3H多肽的氨基酸序列中存在如下任一或任意组合的突变：K30A、H31A、C32A、P33A、Q34G、G35I/A、C36A、F37A、V38A、G39A/K/S/D。本发明还涉及所述的Sj3H多肽及其突变体的制药应用。

Description

一组用于抑制补体的蝎毒多肽及其突变体

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一组用于抑制补体的蝎毒多肽及其突变体。

背景技术

1、补体激活的分子网络及补体相关疾病

补体是存在于人和动物血清和组织液中一组不耐热、经活化后具有酶活性、可介导免疫和炎症反应的蛋白质[1]。补体不仅是机体固有免疫防御的重要组成部分，也是固有免疫和适应性免疫的桥梁[2]。补体活化过程及其活化所形成的产物可介导细胞溶破、调理吞噬、炎症反应、清除免疫复合物等一系列重要的生物学效应[3-4]。补体系统是高度复杂的生物反应系统。生理情况下，血浆中补体成分多以无活性的酶前体形式存在，但在受到某些内源性或外源性物质激活后，通过不同途径的级联酶促反应激活补体系统。这些途径分为经典途径(Classical pathway，CP)[5]、旁路途经(Alternative pathway，AP)[6]、凝集素途径(Lectin pathway，LP)[7]，以及近年发现的备解素途径(Properdin pathway，PP)[8]、蛋白酶解途径(proteolytic pathway，PIP)[9]。补体包括50多种可溶性蛋白和膜结合蛋白，其中补体固有成分C1r、C1s、MASP(MASP1、MASP2、MASP3)、C2、B因子、D因子，补体调节蛋白I因子同属于丝氨酸蛋白酶(serine proteases，SP)[10]，所以补体必先通过一系列的丝氨酸蛋白酶的酶促级联反应激活后才能发挥生物学效应。

正常生理状态下，机体内补体系统各成分含量相对稳定，适时、适度地被激活从而发挥生物学功能，此过程受到一系列调节机制严格控制，以防止补体成分过度消耗和对自身组织造成损伤。某些病理状态下，补体异常涉及某些疾病的发生，例如遗传型补体成分缺陷导致的感染性疾病、免疫性疾病[11-12]；补体异常活化相关的溶血性疾病[13]、肾脏疾病[14]和缺血-再灌注损伤[15]等。因此，随着补体的生理病理功能的基础研究的突破，针对补体药物的研发进入活跃期[16]，但由于补体包含50多种蛋白，调节机制复杂，其药物的研发亦具有较大的挑战。

2、基于补体的治疗药物

补体系统新功能的发现，补体与免疫-炎症反应存在密切联系，新的补体相关疾病的不断发现，都表明目前国内外关于补体的研究在不断深入，补体成为免疫调节和抗炎的重要靶点[17]。基于补体的治疗主要涉及抑制或阻断补体的异常激活，目前围绕控制补体系统的激活，阻断性抗体抑制补体活化或中和相应补体片段活性，补体受体拮抗剂阻断相应受体活化，补体阻断性多肽抑制某些补体成分的功能等方面进行研究。补体疾病相关的药物主要有单克隆抗体和多肽类药物两大类[18]。目前已有20多种靶向补体级联的不同阶段的候选药物正在临床试验中，还有不同的补充药物在临床前开发中[19]。抗C5抗体Eculizumab是全球首个上市的补体系统药物，通过抑制C5激活产生C5a从而阻断形成膜攻击复合体的形成，适应症从最初的PNH扩展到aHUS。但由于部分患者的C5存在多态性，因此Eculizumab无法完全响应。以C1-INH为代表的的多肽药物Cinryze、Berinert、Cetor和Ruconest均已获上市批准，用于HAE的治疗，也可治疗其他补体相关疾病如心肌梗死、移植排斥、I型糖尿病，并可减轻创伤和肾移植后血栓炎症，但这类药物是广谱酯酶抑制剂，特异性不高，可同时阻断C1r/s、MASP等[20]。临床上广泛使用的糖皮质激素、环磷酰胺、甲氨蝶呤等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药并非专一的补体抑制剂，选择性差，难以口服，长期使用会降低机体的防御机能，导致抗感染能力下降，易继发感染和使潜在病灶扩散，产生多种并发症和副作用[21]。补体系统成分多样、结构复杂，给药物开发带来了诸多难题，并且补体涉及的疾病广泛、患者个体差异较大、在开发补体系统药物时也需要考虑特定的适应症和患病人群。而大量天然产物如多糖类、黄酮类、甾体类、苷类、萜类化合物，蛇毒、牡蛎糖原、链霉菌属、日本血吸虫、蜱虫等亦可抑制补体CP、AP、LP途径的激活，因此天然产物也将是补体系统药物研发的新方向之一[22]。

3、蝎天然活性物质及其药用价值

蝎的主要活性成分为蝎毒，蝎毒储存在蝎尾节的毒液囊内，毒液囊通过导管与尾刺通道连接。蝎毒由蛋白质和非蛋白质两类成分组成。非蛋白质成分主要有脂类、游离氨基酸及其他有机酸、微量元素Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、P等。蛋白质类组分是蝎毒中的主要活性成分，大部分由酶与活性多肽(也叫蝎毒素)组成。酶包括磷脂酶A2、乙酰胆碱酯酶、透明质酸酶、磷酸单脂酶及5`核苷酸酶等，其含量较少；而活性多肽包括蛋白酶抑制剂、舒缓激肽增效肽、组胺释放因子、抗菌肽、抗原虫肽、防御样肽、神经毒素、细胞毒素等。随着生物技术的不断发展和进步，新的技术如转录组、蛋白质组、基因组、质谱等先后应用到蝎毒液蝎毒素多肽组分的分离、鉴定研究中，越来越多的蝎毒素多肽和类型被发现。经过大量体内体外实验，已经证实一些分离的蝎活性多肽具有相当大的治疗效果，例如抗微生物活性、抗肿瘤、镇痛活性、抗癫痫、抗血管疾病等，不少蝎活性多肽作为替补和补充药物被广泛使用[23]。有研究表明动物中药蝎及其提取物对机体免疫具有很好的调节作用，在调节巨噬细胞、淋巴细胞、NK细胞、体液免疫、肿瘤方面具有一定的药用价值[24]。但是，蝎抗补体活性物质的研究，未见报道。

本实验室前期建立了蝎活性多肽资源库，发现蝎活性多肽中含有丰富的丝氨酸蛋白酶抑制剂资源，包括BmKPI、BmKTT-1、BmKTT-2、BmKTT-3等[25-27]，而补体系统中有8种补体固有成分和1种补体调节蛋白属于丝氨酸蛋白酶，根据这两点，我们提出猜想：蝎活性多肽丝氨酸蛋白酶抑制剂具有潜在的抗补体活性。

参考文献:

[1]Complement First of two parts[J].The New England journal ofmedicine,2001,344(14):1058-1066.DOI:10.1056/NEJM200104053441406

[2]Complement and autoimmunity[J].Biomedicine&pharmacotherapy＝Biomédecine&pharmacothérapie,2003,57(7):269-273.

[3]Complement First of two parts[J].The New England journal ofmedicine,2001,344(14):1058-1066.DOI:10.1056/NEJM200104053441406

[4]Frank MM.The role of complement in inflammation and phagocytosis[J].Immunology today,1991,12(9):322-326.DOI:10.1016/0167-5699(91)90009-I

[5]Tao XY,Zheng SJ.Activated complement classical pathway in a murinemodel of oxygen-induced retinopathy[J].International journal ofophthalmology,2015,8(1):17-22.DOI:10.3980/j.issn.2222-3959.2015.01.03

[6]Camous L,Roumenina L,Bigot S,et al.Complement alternative pathwayacts as a positive feedback amplification of neutrophil activation[J].Blood,2011,117(4):1340-1349.DOI:10.1182/blood-2010-05-283564

[7]Petersen SV,Thiel S,Jensen L,et al.An assay for the mannan-bindinglectin pathway of complement activation[J].Journal of immunological methods,2001,257(1-2):107-116.

[8]Morrison DC.Activation of the classical and properdin pathways ofcomplement by bacterial lipopolysaccharides(LPS)[J].Journal of immunology(Baltimore,Md.:1950),1977,118(1):362-368.

[9]Thiel S,Vorup-Jensen T,Stover CM,et al.A second serine proteaseassociated with mannan-binding lectin that activates complement[J].Nature,1997,386(6624):506-510.DOI:10.1038/386506a0

[10]Sim RB.Proteases of the complement system[J].Biochemical Societytransactions,2004,32(Pt1):21-27.DOI:10.1042/

[11]Sjoholm AG，Jonsson G，Braconier JH，et al.Complement deficiency anddisease:an update[J].Mol Immunol，2006，43(1-2):78-85.

[12]Das N，Biswas B，Khera R.Membrane-bound complement regulatoryproteins as biomarkers and potential therapeutic targets for SL.E[J].Adv ExpMed Biol，2013，73(735):55-81.

[13]Brodsky RA.Complement in hemolytic anemia[J].Hematology Am SocHematol Educ Program，2015，2015(1):385-391.

[14][21]McCaughan JA,O’Rourke DM,Courtney AE.The complement cascadein kidney disease:from sideline to center stage[J].Am J Kidney Dis,2013,62(3):604-614.

[15]de Vries B,

J,Leclercq WK,et al.Complement factor C5a mediatesrenal ischemia-reperfusion injury independent from neutrophils[J].Journal ofimmunology(Baltimore,Md.:1950),2003,170(7):3883-3889.

[16]Ricklin,D.Complement-targetedtherapeutics[J].Naturebiotechnology,2007,25(11):1265-1275.DOI:10.1038/nbt1342

[17]Arbore G.A novel"complement-metabolism-inflammasome axis"as a keyregulator of immune cell effector function[J].European journal of immunology,2016,46(7):1563-1573.DOI:10.1002/eji.201546131

[18]de Cordoba SR,Tortajada A,Harris CL.Complement dysregulation anddisease:from genes and proteins to diagnostics and drugs[J].Immunobiology,2012,217(11):1034-1046.DOI:10.1016/j.imbio.2012.07.021

[19]Ricklin D,Mastellos DC,Reis ES.The renaissance of complementtherapeutics[J].Nature reviews.Nephrology,2018,14(1):26-47.DOI:10.1038/nrneph.2017.156

[20]Ricklin D.New milestones ahead in complement-targeted therapy[J].Seminars in immunology,2016,28(3):208-222.DOI:10.1016/j.smim.2016.06.001

[21]Progress in the clinical application of immunosuppressive drugsin renal transplantation[J].Current opinion in nephrology and hypertension,2001,10(6):763-770.

[22]Morgan BP.Complement therapeutics；history and current progress[J].Molecular immunology,2003,40(2-4):159-170.

[23]Goudet C,Chi CW.An overview of toxins and genes from the venom ofthe Asian scorpion Buthus martensi Karsch[J].Toxicon:official journal of theInternational Society on Toxinology,2002,40(9):1239-1258.

[24]Wong KL,Wong RN,Zhang L,et al.Bioactive proteins and peptidesisolated from Chinese medicines with pharmaceutical potential[J].Chinesemedicine,2014,9():19.DOI:10.1186/1749-8546-9-19

[25]Chen,Z.,et al.,Cloning and characterization of a novel Kunitz-type inhibitor from scorpion with unique cysteine framework.Toxicon,2013.72:p.5-10.

[26]Ding,L.,et al.,A new Kunitz-type plasmin inhibitor from scorpionvenom.Toxicon,2015.106:p.7-13.

[27]Chen,Z.；Hu,Y.；Yang,et al.,Hg1,Novel Peptide Inhibitor Specificfor Kv1.3 Channels from First Scorpion Kunitz-type Potassium Channel ToxinFamily。

发明内容

本发明首先涉及一组用于抑制补体的来源于蝎毒的Sj3H多肽及其突变体，所述的Sj3H多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1：MG QMTCRISGEV FTWCGTTCPL TCENFRNPPK HCPQGCFVGC MCRRGLVRHRNGRCVRPPRC YY

所述的Sj3H多肽的突变体为：在所述的Sj3H多肽的氨基酸序列中存在如下任一或任意组合的突变：K30A、H31A、C32A、P33A、Q34G、G35I/A、C36A、F37A、V38A、G39A/K/S/D(序列SEQ ID NO.1中的头两位氨基酸MG为标签序列，第三个氨基酸Q为编号1)。

优选的，所述的Sj3H多肽的突变体为：在所述的Sj3H多肽的氨基酸序列中存在如下任一突变：G39A/K/S/D。

本发明还涉及所述的Sj3H多肽及其突变体在制备抗补体药物中的应用，优选的，所述的补体是C1q、C4因子。

包含所述的Sj3H多肽或其突变体的药物或制剂，

所述的药物是靶向补体的药物，优选的，所述的补体是C1q、C4因子；

所述的药物或制剂包括：治疗有效量的所述的Sj3H多肽或其突变体、必要的药用辅料。

本发明还涉及所述的Sj3H多肽或其突变体在制备治疗或预防心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的药物中的应用，优选的，所述的药物为，经静脉注射给药的药物。

本发明还涉及编码所述Sj3H多肽及Sj3H多肽突变体的核苷酸。

优选的，编码所述Sj3H多肽的核苷酸如SEQ ID NO.2所示；

SEQ ID NO.2：

ATGGGCCAGATGACCTGCCGCATTAGCGGCGAAGTGTTTACCTGGTGCGGCACCACCTGCCCGCTGACCTGCGAAAACTTTCGCAACCCGCCGAAACATTGCCCGCAGGGCTGCTTTGTGGGCTGCATGTGCCGCCGCGGCCTGGTGCGCCATCGCAACGGCCGCTGCGTGCGCCCGCCGCGCTGCTATTAT

本发明还涉及编码所述Sj3H多肽及Sj3H多肽突变体的核苷酸的如下应用：

(1)制备抗补体药物中的应用，优选的，所述的补体是C1q、C4因子；

(2)制备治疗或预防心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的药物中的应用，优选的，所述的药物为，经静脉注射给药的药物。

附图说明

图1、pET-28a(+)质粒图谱。

图2、多肽Sj3H的HPLC纯化。

图3、Sj3H的抗补体浓度依赖性。

图4、Sj3H对C1q、C2、C3、C4、C5有不同程度的抑制作用。

图5、Sj3H作用对C1q、C2、C3、C4、C5补体缺失样品溶血实验结果。

图6、不同浓度Sj3H结合多个靶点。

图7、多肽Sj3H 4μg对靶点结合能力。

图8、多肽Sj3H与C1q、C4的CO-IP图谱。

图9、Sj3H及其突变体的经典途径抗补体溶血抑制率。

图10、Sj3HG39位点分子设计后的经典途径抗补体溶血抑制率。

图11、MI/RI小鼠心肌梗死Evans Blue/TTC染色，11A图为小鼠心肌梗死1小时后再灌注3小时心脏组织被Evans Blue/TTC染色，白色为坏死区、红色为缺血区、蓝色为非危险区；11B图为多肽对心肌坏死区面积的影响。

具体实施方式

实验材料与方法

实验材料

1、原核表达体系中的表达载体pET-28a(+)由本实验室提供，质粒图谱如图1所示。实验选择的酶切位点分别是Nco I、Xhol I。

2、感受态细胞为大肠杆菌菌株E.coli/Trans5α和Transetta(DE3)购于北京全式金生物技术有限公司。

3、高纯度质粒小提试剂盒，北京康为世纪科技有限公司。

4、快速DNA产物纯化试剂盒，北京康为世纪科技有限公司。

5、BCA蛋白定量检测试剂盒，碧云天生物科技有限公司。

6、2×SpecificTM Taq Master Mix，上海近岸蛋白质科技有限公司。

7、限制性内切酶Nco I、限制性内切酶Xho I、T4 DNA Ligase、DL2000 DNA Maker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，

宝生物工程有限公司。

8、还原型谷胱甘肽(L-GSH Reduced)、氧化型谷胱甘肽(L-GSH Oxidized)，

合肥新恩源生物技术有限公司。

9、卡那霉素，文翰科技有限公司。

10、实验血清：健康自愿捐献。

11、Alsever液保存无菌绵羊全血，浙江玉环市南方试剂有限公司。

12、兔抗羊血清，上海笃玛生物科技

13、变性液

使用前加入100mM还原型谷胱甘肽。

复性液：200mM乙酸铵，0.5M精氨酸，0.2mM氧化型谷胱甘肽，用HCl将pH值调节至远离蛋白等电点±1。

14、RP-HPLC溶液：

溶液A-80％(V/V)甲醇：500mL色谱纯甲醇溶液中加入高压灭菌超纯水，充分混匀。

溶液B-0.1％(V/V)三氟乙酸(TFA)500mL高压灭菌超纯水中加入500μL色谱纯TFA。

溶液C-80％(V/V)甲醇：500mL色谱纯甲醇溶液中加入高压灭菌超纯水，充分混匀。

溶液D-90％(V/V)乙腈+0.1％(V/V)TFA：500mL色谱纯乙腈溶液中加入高压灭菌超纯水55.6mL和色谱纯TFA 556μL，充分混匀。

15、5×巴比妥缓冲液(pH7.4)

明胶巴比妥缓冲液(GVB)：准确称取0.1g明胶，加适量超纯水在微波炉中煮沸溶解，加20mL上述5×巴比妥缓冲液，加超纯水定容至100mL。

16、雄性C57BL/6小鼠(25g左右)，由本校动物实验中心提供。

17、4-0带线缝合针、6-0带线缝合针，宁波市成和显微器械厂。

18、手术剪、蚊式止血钳、眼科弯镊、持针器、组织剪、动脉夹，上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂。

19、纸胶带、50mL离心管的瓶盖、6孔板、刀片、玻璃匀浆器

20、异氟烷，Evans Blue，TTC，4％多聚甲醛，CK试剂盒(南京建成生物工程研究所)

21、抗补体C1q、C3、C4抗血清；缺失补体成分C2、C5、C7、C8人血清；人补体成分C1、C1q、C2、C3、C3b、C4、C4b、C5、C6；6×His鼠单抗，鼠抗人C1q、C3/C3b单抗，兔抗人C4多抗，ProteinTech公司等。protein G购自碧云天科技公司。

实施例一、多肽SJ3H的制备

一、表达载体pET-28a(+)质粒的制备

1、将本实验室保存的含有pET-28a(+)质粒的DH5α菌种接种到含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基中，37℃震荡过夜孵育至OD600为0.8，转速为200rpm。使用康为世纪的高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。

2、取2mL过夜培养菌液到EP管中，12000rpm离心3分钟，弃去上清。

3、向菌沉淀中加入250μL Buffer P1(预先加入RNase A)，置于涡旋振荡器震荡至菌体充分悬浮。

4、向离心管中加入250μL Buffer P2，温和上下颠倒4～6次，使菌体破裂，菌悬液变得清亮粘稠，此步骤用时不超过5分钟。

5、向离心管中加入350μL Buffer N3，立即温和上下颠倒4～6次，出现白色絮状沉淀，12000rpm离心15分钟。

6、用移液枪将上清转移至吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，12000rpm离心2分钟，弃去收集管中的废液。

7、向吸附柱中加入750μL buffer PW(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心2分钟，弃去收集管中的废液，再12000rpm离心3分钟。将吸附柱置于室温中晾至无水乙醇挥发干净。

8、吸附柱置于干净EP管中，加入40μL Buffer EB，室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，弃掉吸附柱，收集质粒溶液，-20℃冰箱保存。

二、overlap PCR

根据overlap PCR原理，分成三轮PCR反应，以此获得SJ3H的完整DNA序列，

SJ3H的完整DNA序列如SEQ ID NO.2所示，

ATGGGCCAGATGACCTGCCGCATTAGCGGCGAAGTGTTTACCTGGTGCGGCACCACCTGCCCGCTGACCTGCGAAAACTTTCGCAACCCGCCGAAACATTGCCCGCAGGGCTGCTTTGTGGGCTGCATGTGCCGCCGCGGCCTGGTGCGCCATCGCAACGGCCGCTGCGTGCGCCCGCCGCGCTGCTATTAT

为了克隆表达的需要，加工修饰后的基因长度为209bp，具体序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列如下：

CTGCCATGGGCCAGATGACCTGCCGCATTAGCGGCGAAGTGTTTACCTGGTGCGGCACCACCTGCCCGCTGACCTGCGAAAACTTTCGCAACCCGCCGAAACATTGCCCGCAGGGCTGCTTTGTGGGCTGCATGTGCCGCCGCGGCCTGGTGCGCCATCGCAACGGCCGCTGCGTGCGCCCGCCGCGCTGCTATTATTGACTCGAGCAC

overlap PCR第一轮上下游引物为FP1、RP1；第二轮上下游引物为FP2、RP2；第三轮上下游引物为FP3、RP3。

Sj3H-FP3，SEQ ID NO.4：

CTGCCATGGGCCAGATGACCTGCCGCATTAGCGGCGAAGT

Sj3H-FP2，SEQ ID NO.5：

CATTAGCGGCGAAGTGTTTACCTGGTGCGGCACCACCTGCCCGCT

Sj3H-FP1，SEQ ID NO.6：

CACCACCTGCCCGCTGACCTGCGAAAACTTTCGCAACCCGCCGAA

Sj3H-RP1，SEQ ID NO.7：

GCGGCACATGCAGCCCACAAAGCAGCCCTGCGGGCAATGTTTCGGCGGGT

Sj3H-RP2，SEQ ID NO.8：

ACGCAGCGGCCGTTGCGATGGCGCACCAGGCCGCGGCGGCACATG

Sj3H-RP3，SEQ ID NO.9：

GTGCTCGAGTCAATAATAGCAGCGCGGCGGGCGCACGCAGCGGCCGTTG

反应体系及条件如下：

第一轮PCR：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环18次，最后72℃延伸10分钟。

第二轮PCR：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环28次，最后72℃延伸10分钟。

第三轮PCR：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环28次，最后72℃延伸10分钟。

三、目的DNA的PCR产物纯化

将完成PCR扩增的SJ3H DNA产物按照康为世纪的快速DNA产物纯化试剂盒进行纯化。

1、SJ3H的PCR产物加入6倍体积(150μL)的Buffer PB，充分混匀后装入吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

2、向吸附柱中加入750μL Buffer PW(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心3分钟，弃掉收集管中废液，再12000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温中晾至无水乙醇挥发干净。

3、吸附柱置于干净EP管中，加入40μL Buffer EB,室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，弃掉吸附柱，收集SJ3H DNA溶液，-20℃冰箱保存。

四、目的DNA和pET-28a(+)质粒的酶切

分别将纯化后的SJ3H DNA片段和pET-28a(+)质粒用限制性内切酶Nco I和Xhol I进行双酶切。双酶切体系如下：

置于恒温水浴箱中37℃水浴16小时。

五、目的DNA和pET-28a(+)质粒酶切产物的纯化

将完成双酶切的SJ3H DNA片段和pET-28a(+)质粒按照康为世纪的快速DNA产物纯化试剂盒进行纯化。

1、SJ3H的酶切产物加入6倍体积(240μL)的Buffer PB，pET-28a(+)质粒的酶切产物加入3倍体积(120μL)的Buffer PB，充分混匀后装入吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

2、向吸附柱中加入750μL Buffer PW(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心3分钟，弃掉收集管中废液，再12000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温中晾至无水乙醇挥发干净。

3、吸附柱置于干净EP管中，加入40μL Buffer EB,室温静置2分钟，12000rpm离心3分钟，弃掉吸附柱，收集SJ3H和pET-28a(+)质粒的酶切产物溶液，-20℃冰箱保存。

六、纯化后的酶切目的DNA和pET-28a(+)质粒的连接

用T4连接酶将纯化后的酶切SJ3H片段和pET-28a(+)质粒进行连接，体系如下：

置于22℃水浴1小时。

七、连接产物的转化

1、将10μL的连接产物缓缓加入冰浴上融化的感受态细胞E.coli/Trans5α中，冰浴30分钟。

2、将冰浴后的感受态细胞置于42℃热水中热激90秒，迅速将EP管在冰上冷却5分钟，该过程不要摇动EP管。

3、吸取500μL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基于EP管，混匀后置于恒温摇床37℃培养45分钟，转速180rpm，使细胞复苏。

4、将复苏后的细胞于3700rpm离心3分钟，用移液枪吸取420μL上清弃去，用剩余上清将细胞重悬。

5、将重悬后的细胞接种于含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基，用灭菌玻璃涂布棒涂抹均匀，将平板正置于37℃培养箱直至细胞液被吸收，倒置平板，37℃过夜孵育12～16小时。

6、从LB固体培养基平板上挑选10个单克隆菌落，接种于500μL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃培养8小时，转速200rpm。

八、阳性克隆子的筛选与鉴定

1、以培养好的单克隆菌液为模板，上下游引物为FP3、RP3，进行菌落PCR，实验设置阴性对照和阳性对照，分别为无菌双蒸水和SJ3H纯化后的PCR产物。反应体系和条件如下：

PCR反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环28次，最后72℃延伸10分钟。

2、对菌落PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，无菌双蒸水和SJ3H纯化后的PCR产物分别是阴性对照和阳性对照。将阳性结果的单克隆菌液送公司测序。

九、重组质粒SJ3H-pET-28a(+)的制备和蛋白表达

1、吸取测序成功的阳性单克隆菌液10μL于10mL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃过夜培养至适合浓度，一般OD600为0.6-1.0之间优化，转速为200rpm。

2、使用康为世纪的高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。将重组质粒SJ3H-pET-28a(+)溶液保存于-20℃冰箱。吸取2μL重组质粒SJ3H-pET-28a(+)溶液缓缓加入冰浴上融化的感受态细胞E.coli/Transetta(DE3)中。将培养好的重组质粒SJ3H-pET-28a(+)表达菌液保存于-20℃冰箱。

3、取10μL重组质粒SJ3H-pET-28a(+)表达菌液接种到100mL含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基，置于恒温摇床37℃过夜培养10小时，转速为180rpm。吸取50mL过夜表达菌液到1L含卡那霉素(30μg/mL)的无菌LB液体培养基，置于恒温摇床37℃，220rpm扩增培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mM)进行诱导，继续37℃，220rpm培养4小时。

4、将诱导完成的菌液用高速冷冻离心机以6000rpm的速度在4℃环境下离心6分钟，弃去上清。收集菌沉淀，用25mL预冷的PBS溶液充分重悬。重悬后的菌液置于冰上进行超声破壁，超声条件设置：200W，工作3秒/次，间歇5秒/次，共20分钟。破壁后的菌液在4℃、12000rpm离心20分钟后，弃上清，沉淀即为包涵体。将包涵体用预冷的PBST(1％Triton)充分重悬，冰浴20分钟，再4℃、5000g离心15分钟，弃上清，此步骤重复一次，可使包涵体沉淀的纯度较高。

5、包涵体变性：量取5mL变性液，加入0.15g还原型谷胱甘肽，混匀后加入包涵体沉淀中，充分重悬，于室温中静置2小时。

6、包涵体复性：提前配置500mL复性液，将pH值调至7.0,7.5，8.0，8.5.9.0.9.5.10.0(优化pH位8.0)，置于4℃冰箱冷藏。包涵体变性完成后于12000rpm离心20分钟。称量0.6g氧化型谷胱甘肽加入预冷的复性液中，置于磁力搅拌器上，边搅拌边缓慢滴加变性液上清。滴加过程中观察是否产生白色絮状沉淀，若有沉淀产生则停止滴加，直至沉淀消失继续滴加。完成后将复性液置于16℃恒温箱中复性过夜。

十、多肽SJ3H的纯化、冻干保存

1、过夜后的复性液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除不溶解的沉淀。

2、使用超滤管(截留分子量为3kDa)将离心后的复性液于4℃、4000g离心45分钟，直至复性液浓缩为15mL。

3、用EP管将浓缩的复性液按1mL/管进行分装，按1mL复性液加10μL 10％TFA(TFA终浓度为0.1％)，4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，再4℃、12000rpm离心5分钟，上清用RP-HPLC分离纯化。

4、过HPLC的上样体积为<5mL，流速4mL/分钟。RP-HPLC的流动相：

溶液B为0.1％TFA，

溶液D为0.1％的TFA+90％的乙腈，

固定相C18反相柱。RP-HPLC的洗脱梯度为：60分钟的线性梯度，初始时：B为95％、D为5％，结束时：B为5％、D为95％；测量波长选择230nm，HPLC谱图如图2所示。

5、将RP-HPLC纯化收集的溶液，-80℃冰箱中冰冻16小时，再经真空冻干机冻干。冻干后的干粉按峰面积用适量超纯水重新溶解，按500μL/管分装于冻存管，剩余的用于SDS-PAGE、BCA定量。分装后的蛋白再次冻干，-80℃冰箱中保存。然后是多肽SJ3H的BCA定量：

测序结果显示，多肽Sj3H的蛋白质序列与设计的DNA模板完全一致，如SEQ IDNO.1所示：MGQMTCRISGEVFTWCGTTCPLTCENFRNPPKHCPQGCFVGCMCRRGLVRHRNGRCVRPPRCYY

该多肽Sj3H是我们从中国西南地区的云南省保山县蝎种詹氏琵蝎(Scorpiopsjendeki)毒腺中发现的一种新的毒素多肽SjAPI-2修饰改造而得：在SjAPI-2成熟肽的N端，增加两个氨基酸M、G。

实施例二、CP途径补体溶血实验检测(补体效价的测定)

一、补体效价的测定

本实验利用兔抗羊血清作为溶血素将绵羊红细胞致敏，致敏绵羊红细胞在Ca2+、Mg2+的条件下能激活补体经典途径，从而使绵羊红细胞发生溶血，溶血程度与补体含量成正比例关系。

采集10名健康志愿者的血清(normal human serum，NHS)作为补体，混匀后分装，-80℃冰箱保存。

500μL绵羊红细胞悬液与1mL冰GVB缓冲液混匀后于4℃、1000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤三次。吸取红细胞沉淀20μL加入980μL冰GVB缓冲液制成2％绵羊红细胞。

制备致敏绵羊红细胞(EA)制备：兔抗羊血清作为溶血素用GVB缓冲液稀释为1：1000，与等体积的2％绵羊红细胞(SRBC)在37℃水浴30min，则SRBC致敏完成。

将补体(NHS)用GVB按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640倍比稀释，按下表加入各成分，置于37℃水浴30min后，4℃、5000rpm离心10min，取每管上清200ul于96孔板，405nm处测吸光度。超纯水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。

补体效价测定所加各成分体积(μl)

以补体稀释倍数为X轴，各稀释倍数的补体造成的溶血率为Y轴，作图。选择相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。结果显示，在NHS稀释度为1:20时，溶血率接近100％，体系基本达到全溶血。

二、多肽经典途径抗补体活性测定

取临界浓度的NHS与10μM多肽SJ3H等体积混匀，37℃水浴10分钟，按下表加入EA、GVB，37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟,取每管上清200μL于96孔板，405nm处测吸光度。以多肽作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。实验同时设置补体组、全溶组、GVB组。

经典途径抗补体溶血实验所加各成分的体积(μL)

多肽的补体抑制率＝(A405补体组－A405多肽组)/(A405补体组－A405 GVB组)×100％

三、多肽浓度依赖和补体浓度依赖测定

如前所述，取1:20NHS、1:30NHS、1:40NHS与10μM多肽等体积混匀，37℃水浴10分钟，加入EA、GVB，37℃水浴30分钟后，4℃、5000rpm离心10分钟，取每管上清200μL于96孔板，405nm处测吸光度。

以多肽作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图(图3)。实验同时设置补体组、全溶组、GVB组。

在NHS稀释度为1:20时，溶血率接近100％，体系基本达到全溶血，为确保体系能够全溶血和提高多肽筛选时方法的灵敏度，我们选择1:20NHS。

取临界浓度的NHS(1:20)与0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、15μM、20μM多肽SJ3H等体积混匀，37℃水浴10分钟，加入EA、GVB，37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟,取每管上清200μL于96孔板，405nm处测吸光度。以多肽作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图如下。实验同时设置补体组、全溶组、GVB组。

实施例三、抗补体活性多肽的作用靶点分析

(1)、补体缺失实验

a、抗补体抗血清制备缺失补体

不同浓度的抗补体抗血清(GVB稀释)与临界浓度NHS(1:20)等体积孵育37℃，15min。4℃离心6000rpm，15min。取上清做补体滴定。补体稀释倍数做X轴，溶血率做Y轴，确定临界抗血清浓度。将确定的临界抗血清浓度的抗补体抗血清与临界稀释浓度的补体等体积混合，37℃水浴15min后，6000rpm离心15min，上清为缺失补体，分装保存于-80℃。

表2、制备缺失补体所加各成分的体积(μl)

b、多肽作用靶点的测定

补体与临界浓度的多肽混匀，37℃水浴10min，加入缺失补体，EA，37℃水浴30min。4℃，5000rpm离心10min。200μl上清在405nm处测吸光度。设置多肽组，全溶组，补体组，缺失血清组，缺失对照组。

表3、补体作用靶点鉴定中所加各成分的体积(μl)

若多肽作用部位位于这一缺失成分，反应体系不溶血，反之，则溶血。

20μM Sj3H结合1:20NHS后回补缺失C1q、C2、C3、C4、C5、C7、C8血清，若多肽作用部位位于这一缺失成分，反应体系不溶血，反之，体系溶血。GVB缓冲液作为阴性对照。

结果表明，Sj3H对C1q、C2、C3、C4、C5有不同程度的抑制作用，作用越强，与阴性对照组的差异越明显(图4和图5)。为接下来的靶点确认提供了依据。

(2)间接ELISA检测多肽与补体分子结合

采用抗人C1q、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9抗体包被ELISA板孔12h，洗板后用含有2％BSA的PBS在37℃封闭2h。再次洗板后加入1:20NHS 37℃孵育1h，洗板后加入4ug多肽Sj3H(待测多肽含有His标签)37℃孵育1h，洗涤之后加入HRP标记的抗His单克隆抗体37℃孵育1h，洗涤去除未结合的酶标抗体，加入底物TMB，酶催化产生显色反应，结果同样说明补体成分C1q、C3、C3b、C4、C4b、C5是多肽Sj3H的潜在作用靶点，这些之前的补体缺失实验结果一致(图6和图7)。

(3)CO-IP检测多肽Sj3H与补体分子结合

根据之前的补体缺失实验和ELISA检测实验结果，C1、C3、C4的效果较为明显，接下来，我们对Sj3H多肽与补体C1q、C3、C4的结合效果，进行进一步的CO-IP验证。Western blot显示：C1q、C4可以通过结合Sj3H被His单克隆抗体沉淀，而单独的C1q、C4并不能被沉淀，说明C1q、C4与Sj3H具有特异性结合(图8)。综上，Sj3H是个多靶点抗补体活性多肽，可直接作用于补体成分C1q、C4。

实施例四、研究抗补体活性多肽的构效关系及突变体分子设计及验证

生物信息学分析和预测抗补体多肽的三维结构和活性位点，根据预测的活性位点P5、P4、P3、P2、P1、P1`、P2`、P3`、P4`和P5`，对应的氨基酸序列为K30-H31-C32-P33-Q34-G35-C36-F37-V38-G39(由于Sj3H多肽前两个氨基酸为标签序列，编号依据多肽原始序列)，做丙氨酸扫描以此初探其构效关系，主要将活性位点上的氨基酸突变为丙氨酸(Ala)。我们制备了Sj3HF37A、Sj3HV38A、Sj3HQ34G、Sj3HG35I、Sj3HC36A、Sj3HG35A、Sj3HC32A、Sj3HK30A、Sj3HP33A、Sj3HH31A、Sj3HG39A 11种突变体，并检测其经典途径抗补体活性。从溶血抑制率的结果可以看出，Sj3H的突变体仍有抗补体活性，且Sj3HG39A的抗补体活性强于野生型Sj3H。

基于Sj3HG39A的抗补体活性强于野生型Sj3H，我们进行进一步分子设计，获得Sj3HG39K、Sj3HG39S、Sj3HG39D，经经典途径补体溶血实验检测，我们发现Sj3HG39A、Sj3HG39K、Sj3HG39S、Sj3HG39D抗补体活性均大于野生型Sj3H(图9和图10)。

实施例五、多肽Sj3H对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)是指缺血后的心肌恢复血液供应造成的心肌损伤和功能改变，常发生于心梗后恢复血液供应、体外循环下心脏手术、心脏骤停后心肺复苏和心脏移植等。目前认为主要损伤机制有氧化应激反应、钙超载、中性粒细胞活化、补体激活等。越来越多证据表明，补体系统激活在心肌缺血再灌注损伤过程中起着重要作用，可能是介导中性粒细胞聚集和内皮细胞损伤的关键因素。抑制补体过度活化可能是减轻心肌损伤发生的有效策略。

一、C57BL/6小鼠心肌缺血再灌注模型的建立

鼠胸前区提前一天脱毛，使用1.5％～2％异氟烷呼吸麻醉，胶带固定小鼠。心脏正上方位置剪开小鼠皮肤，用4-0带针缝合线将小鼠皮肤提前做荷包缝合，使用眼科镊钝性分离胸大肌和胸小肌，使用蚊式止血钳戳破第四肋间隙，挤出心脏，从左心耳下缘3mm处找到左冠状动脉前降支穿针打活结，一端约留8mm线头，将心脏迅速推回胸腔。关闭胸腔，挤出空气，荷包缝合打结。红霉素眼膏消毒伤口，移至电热毯待苏醒。实验中以结扎后1～2分钟心电图II导联ST段明显抬高为模型成功指标。缺血1小时后拉开活结，再灌注3小时。假手术组小鼠只穿过冠状动脉不结扎，其余步骤相同。

实验分为三组：

(1)假手术组(SO)，只穿针不结扎，结扎前尾静脉注射生理盐水；

(2)I/RI组，结扎冠状动脉前降支，结扎前尾静脉注射生理盐水；

(3)多肽组，结扎冠状动脉前降支，结扎前尾静脉注射生理盐水稀释的多肽。

二、Evans Blue/TTC染色

再灌注结束后，再次对小鼠进行气麻，剪断膈肌和两侧肋骨，将胸骨上翻并固定，暴露出整个心脏，分离心包膜，使用6-0带针缝合线将左冠状动脉前降支再次结扎，分离并夹闭主动脉(注意保护主动脉，避免破裂)，逆向注射0.1～0.2mL 0.5％Evans Blue(生理盐水稀释)，保留观察1分钟。注射成功后剪取心脏，冲洗并挤出心脏积血，放在瓶盖上滴水覆盖，移至-20℃冰箱冻存30分钟。垂直于心脏长轴切1mm厚的心脏切片，置于6孔板中，加2mL0.5％TTC溶液(PBS稀释)，加瓶盖避光37℃震荡孵育30分钟。用移液枪弃去TTC溶液，加蒸馏水移液枪吹打清洗，重复三次直至清亮干净，吸尽废液后加4％多聚甲醛固定30分钟，拍照记录，显微镜成像软件Phmias计算梗死面积。

心梗面积百分比：每一切面的MI％＝梗死区面积/总心脏面积。

三、血清CK活性检测

再灌注结束后，用1mL注射器自心脏取血，去掉针头缓缓注入无抗凝剂真空采血管中，待血液凝固后2000g离心15分钟，分离血清装入新的无菌EP管中。用CK试剂盒按说明检测CK活性。

1、混合试剂的配置：按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五＝8:2:5:10:5的比例进行配置，现用现配，用前需预温5分钟。

2、按下表进行操作：

血清CK活性检测加样体积和顺序

混匀，45℃水浴15分钟，酶标仪660nm处测各孔吸光度。

3、血清计算公式

CK活力(U/mL)＝标准曲线计算所得CK酶活力(U/mL)×样品测试前稀释倍数

＝[7.4491×(测定OD值-对照OD值)-0.0716]×样品测试前稀释倍数

结果显示，我们构建的小鼠心机缺血动物模型，完成建模后，立即对小鼠进行了心电图检测，发现建模成功的小鼠心电图II导联ST段明显抬高，证明建模成功。Evans Blue/TTC能将小鼠心肌的非危险区染成蓝色，存活区染成红色，梗死区因缺乏脱氢酶不会被染色而呈现白色，多肽组的白色区域小于I/RI组，蓝色和红色也比I/RI鲜明(图11)。计算梗死面积占整个心室面积比，结果显示I/RI组心肌梗死面积明显高于假手术组(P<0.0001)。与I/RI小组比较，多肽Sj3H组心肌梗死面积明显缩小(图11)。提示多肽Sj3H能减小心肌梗死范围，对再灌注心肌有保护作用。

最后需要说明的是，上述实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北医药学院

<120> 一组用于抑制补体的蝎毒多肽及其突变体

<160> CP120020681C

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Gln Met Thr Cys Arg Ile Ser Gly Glu Val Phe Thr Trp Cys

1 5 10 15

Gly Thr Thr Cys Pro Leu Thr Cys Glu Asn Phe Arg Asn Pro Pro Lys

20 25 30

His Cys Pro Gln Gly Cys Phe Val Gly Cys Met Cys Arg Arg Gly Leu

35 40 45

Val Arg His Arg Asn Gly Arg Cys Val Arg Pro Pro Arg Cys Tyr Tyr

50 55 60

<210> 2

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggccaga tgacctgccg cattagcggc gaagtgttta cctggtgcgg caccacctgc 60

ccgctgacct gcgaaaactt tcgcaacccg ccgaaacatt gcccgcaggg ctgctttgtg 120

ggctgcatgt gccgccgcgg cctggtgcgc catcgcaacg gccgctgcgt gcgcccgccg 180

cgctgctatt at 192

<210> 3

<211> 209

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgccatggg ccagatgacc tgccgcatta gcggcgaagt gtttacctgg tgcggcacca 60

cctgcccgct gacctgcgaa aactttcgca acccgccgaa acattgcccg cagggctgct 120

ttgtgggctg catgtgccgc cgcggcctgg tgcgccatcg caacggccgc tgcgtgcgcc 180

cgccgcgctg ctattattga ctcgagcac 209

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgccatggg ccagatgacc tgccgcatta gcggcgaagt 40

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cattagcggc gaagtgttta cctggtgcgg caccacctgc ccgct 45

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccacctgc ccgctgacct gcgaaaactt tcgcaacccg ccgaa 45

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcggcacatg cagcccacaa agcagccctg cgggcaatgt ttcggcgggt 50

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgcagcggc cgttgcgatg gcgcaccagg ccgcggcggc acatg 45

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtgctcgagt caataatagc agcgcggcgg gcgcacgcag cggccgttg 49

Claims (9)

1.一组用于抑制补体的来源于蝎毒的Sj3H多肽突变体，所述的Sj3H多肽的突变体为：在如SEQ ID NO.1所示的Sj3H多肽的氨基酸序列中存在如下突变：G39K。

2.权利要求1所述的Sj3H多肽突变体在制备抗补体药物中的应用，所述的药物是用于治疗或预防心肌缺血再灌注损伤的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的补体是C1q、C4因子。

4.包含权利要求1所述Sj3H多肽突变体的药物或制剂。

5.根据权利要求4所述的药物或制剂，其特征在于，所述的药物或制剂包括：治疗有效量的所述Sj3H多肽突变体，必要的药用辅料。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为经静脉注射给药的药物。

7.编码权利要求1所述Sj3H多肽突变体的多核苷酸。

8.权利要求7所述的多核苷酸在制备抗补体药物中的应用，所述的药物是用于治疗或预防心肌缺血再灌注损伤的药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的补体是C1q、C4因子。

Images