KR101884954B1 - 지혈 작용을 가진 조직인자를 함유하는 인지질이 풍부한 소포 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포스파티딜세린과 같은 음이온 인지질과 진핵 세포로부터 유래되는 마이크로소포를 접촉시키는 것에 의해 진핵 세포에서 발현되는 Tissue Factor의 응혈촉진 활성을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상처 치유 및 혈관혈성으 촉진하기 위한 응혈촉진제로서의 용도뿐만 아니라 상기 방법을 사용하는 마이크로소포에 관한 것이다.

Description

지혈 작용을 가진 조직인자를 함유하는 인지질이 풍부한 소포 및 그의 용도{PHOSPHOLIPID-ENRICHED VESICLES BEARING TISSUE FACTOR HAVING HAEMOSTATIC ACTIVITIES AND USES THEREOF}

본 발명은 전반적으로 대상(subject)에게 조직인자에 기반한 응혈촉진성제를 사용하는 출혈 및 상처 치유의 치료에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 마이크로소포 형태로 진핵 세포-유래 멤브레인 및 조직인자 단백질을 포함하는 조직인자-함유 마이크로소포(TF-bearing microvesicle) 그리고 음이온 인지질(NCP) 뿐만 아니라 대상에서의 출혈을 치료하기에 뿐만 아니라 혈관형성 및 세포 이동을 촉진하기에 유용한 응혈촉진제로서의 그것의 응용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 언급한 TF-함유 마이크로소포의 생산을 위한 공정에 관한 것이다.

지혈은 출혈에 대한 생명체가 반응하는 메카니즘이며 병변 후에 즉각적으로 가동되고 긴 시간 동안 활성을 유지하는 두 개의 프로세스가 참여한다. 그들 중 첫 번째는 1차 지혈로 알려져 있고 혈관 병소 부위에서 혈관수축 및 혈소판 응집 형성의 발생으로 특징지어진다. 두 번째 프로세스는 2차 지혈로 알려져 있으며, 다른 응고 폭포반응(coagulation cascade) 프로테아제의 작용에 의해 피브린 혈전(fibrin clot)이 형성되는 단계이다.

여러 개의 보조인자와 프로테아제가 혈액 응고 프로세스의 두 번째 단계에 참여하며, 응고 인자로서 언급된 모든 것, 그리고 트롬빈의 작용에 의해 피브리노겐 가수분해로부터 피브린 형성으로 끝나는 수개의 단계로 이루어진다. 트롬빈은 아포효소, 프로트롬빈의 단백질 가수분해(proteolytic hydrolysis)에 의해 미리 형성된다. 이 단백질 가수분해(proteolysis)는 활성화된 혈소판의 표면에 결합된 활성화된 응고 인자 X(FXa)에 의해, 오직 그것의 보조인자, 활성화된 응고 인자 V(FVa), 및 칼슘 이온의 존재하에 수행되며, 프로트롬빈을 가수분해할 수 있다. 응고 인자 X(FX) 활성화는 두 개의 분리된 경로, 내인성 경로와 외인성 경로에서 일어날 수 있다.

내인성 경로는 각각의 전구효소가 가수분해되고, 그것의 활성 효소 형태를 생성하는 일련의 반응으로 구성된다. 각 단계에서 최근 형성된 프로테아제가 활성형을 연이어 생성하기 위해 그 다음의 전구효소의 활성화를 촉진할 것이다.

혈액 응고 외인성 경로에서, 병변 부위에서 외막세포에 노출된 조직인자(TF)가 TF::FVIIa 착체를 형성하기 위해, 그리고 칼슘의 존재하에 FX 활성화가 일어나도록 기질로서 작용하기 위해 순환 응고 인자 VII/활성화된 응고 인자 VII(FVII/FVIIa)에 결합한다. 외인성 경로는 혈액 응고에서 가장 관련있는 경로로 현재 고려되며, 혈관 병변에 의해 생성된 출혈의 경우에 수락되며, 응고가 리간드 FVII/FVIIa와 TF의 상호작용을 수반하는 내인성 경로 활성화에 의해 촉발된다.

TF는 응고의 개시와 함께 신속함을 담보하는 주요소로 넓게 인식되어 있으며, FX 활성화를 위해, 순차적으로 프로트롬빈 가수분해를 시작하기 위해 요구된다.

TF의 정제는 인간의 뇌, 소의 뇌; 인간의 태반; 양의 뇌; 및 폐와 같은 다양한 조직으로부터 보고되고 있다. 종들 사이에 TF 단백질의 구조에서 차이가 있지만 인 비트로 응고 분석(assay)에 의해 측정되는 것처럼 기능적 차이가 없다고 광범위하게 받아들여져 있다.

생물학적 활성을 나타내기 위해, TF는 인 비트로에서 인지질과 결부되어야만 하는 것으로 널리 받아들여져 있다. TF의 인지질 성분의 제거는, 예로 포스포리파아제의 사용에 의해, 인 비트로에서 생물학적 활성을 상실하게 하는 것을 보여주고 있다.

WO2008080989호는 이스트 멤브레인 및 조직인자 단백질을 포함하는 마이크로소포에서 유래된 조직인자-함유 이스트 및 대상의 출혈 치료에서 응혈촉진제로서의 용도를 개시한다.

WO2006004675호는 식물 세포에서 조직인자, TF를 발현하는 식물로부터 얻어진 조 추출물 및 식물 세포로부터 얻어진 재조합 TF를 포함하는 인공 소포 발현을 개시한다.

EP19359021호는 곤충 세포에서 발현된 재조합 TF를 함유하는 재지질화된(relipidated) TF 뿐만 아니라 곤충 세포에서의 조직인자의 발현을 개시한다.

그렇지만, TF에 기반한 추가 응혈촉진 제제(prepartion)에 대한 요구가 있다.

본 발명의 목적은 전반적으로 대상에게 조직인자에 기반한 응혈촉진성제를 사용하는 출혈 및 상처 치유의 치료를 제공하는 것이다.

제1측면에 따르면, 본 발명은

(i) 진핵 세포에서 TF 및 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 발현하는 단계,

(ii) 단계 (i)의 세포로부터 TF-함유 마이크로소포를 회수하는 단계 및

(iii) 단계 (ii)에서 얻어진 소포를 음이온 인지질과 상기 소포 내로 상기 인지질의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함하는 응혈촉진 활성(procoagulant activity)을 가지는 TF-함유 마이크로소포의 제조 방법에 관한 것이다.

제2측면에 따르면, 본 발명은 응혈촉진 활성을 가지는 TF-함유 마이크로소포의 제조를 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:

(i) 진핵 세포로부터 얻어진 지질 마이크로소포를 제공하는 단계,

(ii) TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 상기 (i)에서 규정된 지질 마이크로소포와 상기 마이크로소포 내로 상기 TF 단백질 또는 그것의 변종의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계 및

(iii) 단계 (ii)에서 얻어진 소포를 음이온 인지질과 상기 소포 내로 상기 인지질의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함하고,

여기서 상기 단계 (ii)와 단계 (iii)은 순서에 상관없이 실시될 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법으로 얻어진 TF-함유 마이크로소포에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 TF-함유 마이크로소포 및 약학적으로 허용되는 부형제(vehicle)를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은

(i) a) 진핵 세포에서 TF 및 응혈촉진 활성을 가지는 기능적으로 동등한 그것의 변종을 발현하는 단계 및

b) 단계 (a)의 세포로부터 TF-함유 마이크로소포를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 마이크로소포,

(ii) 최소 하나의 응고 프로모터 및

(iii) 약학적으로 유효한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 본 발명의 TF-함유 마이크로소포 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상처 치유 촉진 또는 혈관형성 관련 질환의 치료를 위해서, 출혈 치료에서의 사용을 위한 본 발명의 TF-함유 마이크로소포 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 샘플에서 프로트롬빈 시간의 결정을 위한 본 발명의 TF-함유 마이크로소포의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 마이크로소포를 포함하는 항응혈 치료 인자의 결정을 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명은 마이크로소포 형태로 진핵 세포-유래 멤브레인 및 조직인자 단백질을 포함하는 조직인자-함유 마이크로소포(TF-bearing microvesicle) 그리고 음이온 인지질(NCP) 뿐만 아니라 대상에서의 출혈을 치료하기에 뿐만 아니라 혈관형성 및 세포 이동을 촉진하기에 유용한 응혈촉진제로서의 그것의 응용을 제공한다. 본 발명은 또한 언급한 TF-함유 마이크로소포의 생산을 위한 공정을 제공한다.

도 1은 TT-173 추출물에 의한 rTF의 발현이다. 4개의 독립된 접선흐름여과(tangential flow filtrations)로부터 정제된 TT-173(MFR 0.1)으로부터의 추출물의 웨스턴-블롯(Western blot) 분석이다. 블롯은 인간의 정제된 마우스 항체(BD Biosciences Pharmingen)와 반응시켰다. 분자량 마커는 kDa로 도면의 왼편에 나타내었다.
도 2는 PS와 함께 배양한 후의 TT-173의 응혈촉진 활성을 나타낸다. A는 TT-173 생체활성에서 PS의 효과를 테스트하기 위해, PS(0.1mM)를 TF-173(1mL)에 첨가하고 혼합된 용액을 실험 동안 R/T에서 유지시켰다. 다른 시간 지점을 도면에 나타내었으며, 혼합물 앨리쿼트(aliquots)(10μL)를 정상(normal) 혈소판-결핍 혈장 130μL를 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 염화칼슘 (100mM) 20μl를 즉시 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터(coagulometer)(Stago)를 사용하여 결정했다. 실험을 300초(5 도너로부터 합동혈장) 후에 중지했다. B. A에서 얻어진 결과들은 또한 Units/mL로서 나타내었다. 1 Unit은 표준 코어귤로미터 분석(혈장 130μL, 염화칼슘(100mM) 20μL 및 생성물 10μL)에서 30초 동안 정상의 결핍된 혈장을 응고시키기 위하여 요구되는 TT-173의 양으로 규정된다.
도 3은 다른 농도의 PS로 배양 후의 TT-173 또는 지질화된 rTF의 응혈촉진 활성을 나타낸다. TT-173 또는 재지질화된 rTF 생체활성에서의 PS의 효과를 테스트하기 위해, PS(도면에서 표시된 농도에서)를 TT-173(1mL) 또는 재지질화된 rTF에 첨가했다. 두 개의 혼합된 용액을 2시간 동안 R/T에서 유지시켰다. 그 후에, 각각의 혼합물 앨리쿼트(10μL)를 130μL 정상 혈소판-결핍 혈장을 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그리고 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터(coagulometer)(Stago)를 사용하여 결정했다. 실험을 300초(5 도너로부터 합동혈장) 후에 중지했다. 얻어진 결과들은 또한 Units/mL로서 나타내었다.
도 4는 적합한 인지질 소포 내로 넣을 때(embedded) rTF의 응혈촉진 활성을 나타낸 것이다. 상업적으로 정제된 rTF를 Mimms et al.(Biochemistry 20, 833. 1981)에 기재된 표준 방법에 따라 포스파티딜 클로린/포스파티딜 세린(PC/PS)를 함유하는 소포 내로 재지질화시켰다. 간략히, rTF(American Diagnostica Inc. Stanford, CT, USA) 100ng을 표시된 PC:PS 비율(100:0, 95:5, 90:10, 80:20, 70:30)(최종 농도 2.6mM)에서 PC/PS(Sigma Aldrich Inc, Saint Louis, MO, USA)와 세제(detergent)(N-옥틸-β-D-갈락토피라노사이드, 최종 농도 40mM)로 배양하였다.
혼합물을 균질화한 후, 광범위하게 투석했다(여러 번 완충액을 바꾸면서 48시간 동안). 이 절차로, 세제가 천천히 제거되고 rTF를 함유하는 지질 마이셀이 자연스럽게 생성된다. 이 재지질화 절차 후에, rTF-함유 마이셀을 응혈촉진 활성(블루 바(Blue bars))에 대해 테스트했다. 병행하여, 다른 rTF-함유 마이셀을 최종 농도 0.1mM에서 PS와 함께 2시간 동안 배양하였다. 이후에, 추가의 PS를 함유하는 마이셀을 또한 응혈촉진 활성에 대해 테스트했다. 코어귤로미터 분석을 다음과 같이 실시했다: PC/PS 소포 앨리쿼트와 함께 재지질화된 rTF 앨리쿼트(10μL)를 정상 혈소판-결핍 혈장 130μL를 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그리고나서 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터(Diagnostica Stago, Inc. NJ, USA)를 사용하여 결정했다.
도 5는 상이한 rTF-함유 소포에 대한 PS 첨가의 효과를 나타낸 것이다. i) 80:20의 PC:PS 농도비에서 재지질화된 rTF, ii) 70:30의 PC:PS 농도비에서 재지될화된 rTF 또는 iii) TF를 발현하는 재조합 이스트로부터 분리된 TT-173 소포로부터 두 개의 앨리쿼트(각각 2mL)를 4℃에서 준비했다. 0.1mM 농도의 PS를 TF-함유 소포 각각의 앨리쿼트 중 하나에 첨가했다. 그리고 2시간 동안 R/T에서 배양하였다. 이 시간동안, 다른 앨리쿼트를 4℃에서 유지시켰다. 그런 후, 각각의 rTF-함유 소포로터 두 개의 앨리쿼트를 도면 범례 1에 표시된 대로 응혈촉진 활성에 대해 테스트했다.
도 6은 PS와 다른 농도의 TT-100으로 배양한 후의 재지질화된 rTF의 응혈촉진 활성을 나타낸 것이다. 재지질화된 rTF(0.3μg/ml) 앨리쿼트(10μL)를 PS(0.1mM)로 2시간 동안 배양하고, 다른 농도의 TT-100(0, 0.03, 0.12, 0.3 및 0.36mg/ml)을 정상 혈소판-결핍 혈장 130μL를 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그리고나서 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터를 사용하여 결정했다.
도 7은 FVIIa의 아미드 분해 활성(amidolytic activity)을 나타낸 것이다. TF:FVIIa 촉매 착물의 효소 활성을 수량화하기 위하여, 표준 크로마토제닉 분석(chromatogenic assay)을 기질 S-2238을 사용하여 실시했다. TF:FVIIa 활성을 기질 S-2238과 공정의 결과물인 p-니트로아닐라(pNA) 사이의 흡수도(광학 밀도) 차이에 의해 측정했다. pNA 형성의 속도는 효소 활성에 비례하고 포토미터에 의해 통상적으로 결정된다. 이 실험에서, PS를 함유하거나 또는 함유하지 않는 다른 농도의 TT-173를 FVIIa와 상호 작용하는 능력에 대해 그리고 S-2238의 존재하에 감지할 수 있는 pNA를 생산하는 능력에 대해 테스트했다.
도 8은 전혈(whole blood)의 TT-173의 응고 활성 및 PS의 효과를 나타낸다. PS(0.1mM)를 함유하였거나 또는 함유하지 않은 TT-173가 건강한 혈장 및 전혈 샘플을 응고시키는 능력을 테스트했다. A) TT-173 및 PS(최종 농도 0.1mM)로 2시간 동안 배양한 TT-173 앨리쿼트(10μL)를 정상(normal) 혈소판-결핍 혈장 130μL을 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그런 후 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터를 사용하여 결정했다.(5 도너로부터 합동 혈장). B) TT-173 앨리쿼트(200μL) 및 도면에 나타낸 rTF를 일정량 함유하는 TT-173+PS(0.1mM)를 건강한 도너로부터 최근에 추출한 혈액 앨리쿼트(800μL)에 첨가했다. 응고 시간을 안정하고 잘 굳은 혈전이 나타날 때까지 혈액 추출 초기부터 크로노미터로 측정했다. N=3.
도 9는 TT-173의 가설 작용 메카니즘을 나타낸 것이다.
도 10은 응고 인자 VIII, IX 또는 XI 결핍 혈장에서의 TT-173 응고 활성을 나타낸 것이다. (A) TT-173 또는 TT-173+PS(0.1mM) 앨리쿼트(10μL)를 정상 혈소판-결핍 혈장 130μL을 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그런 후 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터를 사용하여 결정했다. (5 도너로부터 합동 혈장). (B) A에 기재된 것과 유사한 앨리쿼트(10μL)를 인자-VIII, 인자 IX 또는 인자 XI가 제거된(depleted) 혈장 130μL를 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그런 후 바로 염화 칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터를 사용하여 결정했다. (N=3).
도 11은 응고 인자 V 또는 VII 결핍 혈장에서의 TT-173 응고 활성을 나타낸 것이다. TT-173 또는 TT-173+PS(0.1mM) 앨리쿼트(10μL)를 인자 V 또는 인자 VII가 제거된 혈장 130μL을 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그런 후 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터를 사용하여 결정했다. (N=3).
도 12는 와파린-처리 혈장에서의 TT-173 응고 활성을 나타낸 것이다. TT-173 또는 TT-173+PS(0.1mM) 앨리쿼트(10μL)를 인자 V 또는 인자 VII가 제거된 혈장 130μL을 함유하는 데워진 큐벳에 첨가했다. 그런 후 바로, 염화칼슘(100mM) 20μL를 첨가하고, 응고 시간(초단위로)을 코어귤로미터를 사용하여 결정했다. (N=3).
도 13은 응혈촉진 활성에 있어서의 TT-173의 복원(reconstitution) 효과를 나타낸 것이다. PS가 첨가된 TT-173 소포 및 PS가 첨가되지 않은 TT-173 소포가 투석가능한 세제로 처리하여 떨어져 나간 후, 투석에 의해 인 비트로에서 복원되었을 때, 대략 초기 활성의 50%가 상실되었다(패널 A). 그렇지만, 유사한 실험이 재지질화된 rTF 소포를 사용하여 실시되었을 때, 투석 전후에 주목할 만한 차이가 전혀 관찰되지 않았다(패널 B).
도 14는 다른 rTF-함유 소포에 대한 PS 첨가의 효과를 나타낸 것이다. i) 80:20의 PC:PS 농도비에서 재지질화된 rTF, ii) 70:30의 PC:PS 농도비에서 재지될화된 rTF, iii) TF를 발현하는 재조합 이스트로부터 분리된 TT-173 소포 또는 iiii) 발현하는 재조합 바큘로바이러스로 감염시킨 곤충 세포로부터 분리된 TT-173 소포들로부터 두 개의 앨리쿼트(각각 2mL)를 4℃에서 준비했다. 0.1mM 농도의 PS를 TF-함유 소포 각각의 앨리쿼트 중 하나에 첨가했다. 그리고 2시간 동안 R/T에서 배양하였다. 이 시간 동안, 다른 앨리쿼트를 4℃에서 유지시켰다. 그런 후, 각각의 rTF-함유 소포로부터 두 개의 앨리쿼트를 도면 범례 1에 표시된 대로 응혈촉진 활성에 대해 테스트했다.
도 15는 PS의 첨가가 TT-173 소포에 안정성을 제공하는 것을 나타낸 것이다. 3개의 독립된 TT-173 덩어리(lots)로부터 각각 10mL의 4개의 앨리쿼트를 이 연구에서 사용하였다. 각 덩어리로부터 두 개의 앨리쿼트를 두 시간 동안 R/T에서 PS(0.1mM)로 배양했다. 그리고 나머지 앨리쿼트를 4℃에서 유지했다. 이 시간 후에, 열두 개 TT-173 샘플 각각으로부터 10μL를 응고 활성(시간 0)을 결정하기 위해 도면 1의 범례에 제시된 절차에 따라서 사용했다. 그런 후 바로, 앨리쿼트(TT-173-PS 3, TT-173+PS 3 그들 각각은 세 개의 덩어리 중 하나와 상응함)의 반을 남은 안정성 시험동안 4℃에서 유지했다. 그리고 나머지(TT-173-PS 3, TT-173+PS 3)를 20℃에서 유지했다. 도면에서 표시된 시간에서, 각각의 앨리쿼트 10μL를 4℃에서 유지한 앨리쿼트(A)나 20℃에서 유지한 앨리쿼트(B)에서 응고 활성을 결정하기 위해 사용했다. 결과를 표준편차와 함께 도시했다. 4℃(C) 및 20℃(D)에서 다른 배치(batch)들 사이의 최소 안정성 평균이 또한 나타나 있다.
도 16은 FVII, FVIIa, FX 및 FXa의 첨가가 TT-173의 응혈촉진 효과를 증폭한다는 것을 나타낸다. 다른 농도의 FVII(20nM 및 60nM), FVIIa(20nM 및 60nM), FX(1000nM 및 3000nM) 및 FXa(1000nM)를 TT-173+PS(0.1mM)에 첨가했다. TT-173+PS(0.1mM)/FVII, TT-173+PS(0.1mM)/FVIIa, TT-173+PS(0.1mM)/FX 및 TT-173+PS(0.1mM)/FXa 혼합물의 앨리쿼트를 45ng/ml의 혈장 내 TF의 최종 농도로 표준 응고 분석에서 응고 활성에 대해 체크했다. 도시된 것처럼, FVII, FVIIa 및 FX의 첨가는 대략 2초의 응고 시간을 줄이며 FXa의 첨가는 대략 7초의 응고 시간을 줄였다.

본 발명자들은 이스트 세포로부터 유래되고 이미 PS를 함유하는 TF-함유 마이크로소포에 대해 세제가 없는 초과 포스파티딜세린(PS)의 첨가가 놀랍게도 언급된 소포의 안정성을 향상시킬 뿐만 아니라 소포의 응혈촉진 성질도 개선시킨다는 것을 발견하였다. 향상된 응혈촉진 성질이 예를 들면, 본 발명의 실시예 2 및 3에 나타낸 실험에서 관찰될 수 있으며, TF를 포함하는 이스트-유래 마이크로소포에 대해 포스파티딜세린의 첨가는 인지질과 접촉한 적이 없는 소포에 대해 향상된 응혈촉진 성질(줄어든 응고 시간)을 보이는 소포를 얻게 하는 것이 명확하게 나타난다(도 2 및 표 2 참조). 어떠한 이론에 얽매이는 걸 바라지 않으면서, 차례로 트롬빈의 증가된 생성을 이끄는 프로트롬비나아제 및 X아제 착체 둘 다의 형성을 가져오는 리크루트 혈장 인자에 대해 향상된 소포의 능력을 나타내는 TF-함유 마이크로소포와 PS가 상호작용한다는 것이 믿어진다. 소포의 향상된 안정성이 예를 들어, 본 발명의 실시예 4에서 나타나며, PS로 미리 처리된 소포가 20℃ 및 4℃에서 증가된 안정성을 나타내는 것이 나타난다.

본 발명의 제1 방법

첫 번째 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 응혈 촉진 활성을 가지는 TF-함유 마이크로소포의 제조를 위한 방법(이하 본 발명의 제1 방법)에 관한 것이다:

(i) 진핵 세포에서 TF 및 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 발현하는 단계,

(ii) 단계 (i)의 세포로부터 TF-함유 마이크로소포를 회수하는 단계 및

(iii) 단계 (ii)에서 얻어진 소포를 음이온 인지질(NCP)과 적합한 조건하에서 상기 소포 내로 상기 인지질을 병합시키기 위하여 접촉시키는 단계.

용어 "TF-함유 마이크로소포"는 진핵 세포로부터 유래되고 지질 마이크로소포 내에 통합된 TF를 함유하는 지질 마이크로소포를 의미한다. 지질 마이크로소포는 작고 폐쇄된 구획(compartment)을 의미하며, 실질적으로 단일층 또는 이중층 지질로 구성된다. 본 발명의 TF-함유 소포의 크기는 상대적으로 넓은 범위에서 다양화할 수 있으며, 크기는 10μm와 같거나 적으며, 보통 0.5μm와 같거나 적다. 특정 구현예에서, 본 발명의 마이크로소포 유래 TF-함유 이스트의 크기는 10μm 내지 0.01μm 범위이다.

마이크로소포는 진핵 세포로부터 지질 멤브레인 또는 그 단편에 의해 형성된다. 멤브레인은 보통 세포(세포 또는 혈장 멤브레인)의 경계 또는 세포 내 세포기관의 경계를 형성하는 수개의 분자(지질 및 단백질) 두께의 조직화된 층을 말한다. 일반적으로 멤브레인은 단백질이 내장될 수 있는 두 개의 배향된(oriented) 지질 층(즉, 지질 이중층)으로 구성된다. 세포의 멤브레인의 기본 구조인 지질 이중층은 대개 수성 환경에서 양친매성 분자(인지질, 지방산 등)에 의해 형성되며, 각 분자들은 층의 외측은 친수성 그룹으로 배향되고 층의 내부는 소수성 그룹으로 배향된다.

본 발명의 제1 발명의 첫 번째 단계는 진핵 세포에서 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그들의 변종의 발현을 포함한다.

진핵 세포는 본 발명에서 세포핵과 같이 멤브레인 내에 봉입된 착체 구조를 함유하는 세포로서 언급된다. 본 발명의 제1 방법에서 사용될 수 있는 진핵 세포의 예는 균류 세포(fungi cells), 이스트 세포(yeast cells), 식물 세포 및 동물 세포(포유류 세포, 어류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포 등)이다.

용어 "이스트 세포"는 자낭포자형성효모(Endomycetales), 담자포자형성효모, 및 불완전균류(병원성효모(Blastomycetes))에 속하는 이스트를 포함한다. 이스트의 분류가 장래에 바뀔 수 있기 때문에, 본 발명의 목적을 위해, 이스트는 Skinner, F. et al(Biology and Activities of Yeast, Soc. App. Bacterial. Symp. Series No.9)에 기재되고 설명된 대로 규정한다. 적합한 이스트 균주(strain)은 제한없이 토룰라(Torula), 빵 효모, 맥주 효모, S.세레비시아(S.cerevisiae)와 같은 사카로미세스 종(Saccharomyces species), 스키조사카로미세스 종(Schizosaccaromyces species), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 피치아 종(Pichia species), 칸디다 종(Candida species), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 한세눌라 종(Hansenula species), 및 클뤼베로미세스 랙티스(Klyuveromyces lactis)와 같은 클뤼베로미세스 종(Klyuveromyces species) 뿐만 아니라 S.세레비시아(S.cerevisiae) T73 스트레인과 같은 위에 언급된 이스트 종과는 다른 균주를 포함한다. 또한 이들 종 및 균주의 혼합물도 사용될 수 있다.

용어 "식물 세포"는 조류(algae), 외떡잎식물(monocot), 쌍떡잎식물(dicot), 그리고 특히 곡류(예, 옥수수, 쌀, 귀리 등), 콩류(예, 대두 등), 십자화과 식물(예, 애기장대, 유채 등) 또는 가지과(예. 감자, 토마토, 담배 등)를 포함하는 식물로부터 나온 세포를 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 식물 세포는 현탁배양, 배아(embryos), 머스테마틱 영역(merstematic regions), 캘러스 조직(callus tissue), 잎(leaves), 뿌리(root), 애순(shoots), 배우체(gametophytes), 포자체(sporophytes), 꽃가루(pollen), 씨(seeds) 및 소포자(microspore)를 포함한다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 "식물 호스트 시스템(Plant host system)"으로 언급하는 것이 식물 세포가 식물의 부분 또는 식물 전체가 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. "식물 호스트 시스템" 또는 분리된 식물 세포는 다양한 성숙의 스테이지에 있을 수 있다. 식물 호스트 시스템은 또한 식물, 씨, 순종 또는 잡종 자손(selfed or hybrid progeny), 유성적으로 또는 무성적으로 생산되는 번식체(propagule whether generated sexually or asexually), 및 꺾꽂이용으로 자른 나뭇가지 (cuttings) 또는 씨와 같은 이들의 자손(descendants)의 클론을 의미한다.

용어 "동물 세포"는 동물로부터 나온 세포를 포함한다. 동물 세포는 포유류 세포, 어류 세포, 파충류 세포, 곤충 세포 등을 포함한다. 동물 세포는 동물(일차 배양 세포)의 조직으로부터 유래될 수 있거나 또는 세포를 불멸화할 수 있다. 불멸화된 세포는 종량 조직으로부터 얻어질 수 있거나 또는 바이러스로 감염시키거나(예. EP1212420) 불멸화된 세포계(cell line)로 정상 세포를 융합시키는 것과 같이 통상의 기술자에 의해 공지된 기술을 사용하여 불멸화될 수 있다.

곤충 세포는 Sf9 세포, SF21 세포, SF+ 세포, 하이-파이브 세포, 또는 곤충 애벌레 세포를 포함하며 이에 제한되지 않는다.

세포로부터 얻어질 수 있는 포유동물은 래트(rats), 쥐, 원숭이, 인간 등을 포함한다. 본 발명에 적합한 포유류의 세포는 상피 세포계, 골육종 세포계, 신경아세포종의 세포계, 상피암, 교질 세포, 간 세포계, CHO(Chinese Hamster Ovary) 중국햄스터난소 세포, COS 세포, BHK 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, 293 세포 또는 PER.C6 세포, 인간 EDD NTERA-2 세포, mESC계의 D3 세포, HS293, BGV01, SHEF1, SHEF2 및 HS181과 같은 인간배아줄기 세포, NIH3T3 세포, 293T 세포, REH 세포, MCF-7 세포 및 hMSC 세포를 포함한다.

"트롬보플라스틴", "혈소판 조직 인자", "CD142" 또는 "응고 인자 III"으로 또한 알려져 있는 용어 "조직 인자" 또는 "TF"는 동물계에 널리 분포된 내재막 당단백(integral membrane glycoprotein)을 의미하며, 내피하조직, 혈소판 및 백혈구에서 나타나며 지모겐 프로트롬빈으로부터 트롬빈 형성 초기에 필요하다. 본 발명에서의 사용을 위해 적합한 TF 폴리펩타이드는 인간을 포함하는 동물 종의 네이티브(native) 또는 야생형(wt) TF를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 TF 단백질은 인간 TF(UniProtKB 수탁 번호 P13726), 마우스 TF(UniProtKB 수탁 번호 P20352), 래트 TF(UniProtKB 수탁 번호 P42533), 돼지 TF(NCBI Prot 수탁 번호 NP_998950), 소 TF(NCBI Prot 수탁 번호 AAB20755), 개 TF(NCBI Prot 수탁 번호 BAD98568), 기니피그 TF(NCBI Prot 수탁번호 AAF36523) 및 다른 기관의 TF 단백질을 포함한다.

네이티브 TF가 여러 개의 당화(glycosylation) 사이트를 함유하기 때문에, 다른 당화 정도를 나타내는 TF 변종이 N-당화 반응을 수행할 수 있는 호스트 내에서 TF 발현에 의해 얻어질 수 있다. 성숙한 TF는 Asn11(서열 Asn11-Leu12-Thr13)에 위치한 공통서열 Asn-Xaa-Ser/Thr, Asn124(서열 Asn124-Val125-Thr26) 및 Asn127(서열 Asn137-Asn138-Thr139)을 가지는 세 개의 잠재적 N-연결당화과정(N-linked glycosylation)을 함유한다. 따라서, 본 발명에서의 사용을 위한 TF 분자는 하나 이상의 N-당화 사이트에서 다양한 정도의 N-연결당화과정을 가지는 TF 변종을 포함한다. 이스트에서, 당화는 일반적으로 두 개의 GlcNAc 잔기를 통해 아스파라긴에 연결되는 약 열 개의 만노오스 잔기(mannose residues)의 내부 코어, 그리고 50-100 만노오스 잔기를 갖는 분지된 외부 사슬을 수반한다. 따라서 N-연결당화과정은 잠재적으로 TF에 무려 300 만노오스 잔기를 첨가할 수 있고, 분자량이 약 60kDa 증가할 수 있다. 게다가, 여러 개의 만노오스 잔기가 다양한(25 이상) O-연결당화과정 사이트에 부착되는 것이 가능하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 마이크로소포 유래 TF-함유 이스트는 당화된 TF 단백질을 포함한다. 용어 "당화된"은 모든 당화의 정도를 포함한다.

용어 "응혈촉진 활성을 가지는 TF 변종"은 실질적으로 TF로서 동일한 생물학적 활성을 나타내고 삽입, 제거 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환으로부터 얻어지는 화합물을 의미한다. 주어진 폴리펩타이드가 기능적으로 동등한 TF 변종인지를 분석하기 위해 사용될 수 있는 적합한 기능성 분석은, 심각한(severe) 출혈 동물 모델에서 인비보 분석에 의하거나 또는 치명적인(lethal) 출혈 동물 모델에서 인비보 분석에 의해, 특히 FVIIa에 결합된 TF 변종의 능력의 결정에 기초한 분석이거나, 또는 혈장 또는 전혈에서 인비트로 응고 시간의 결정에 기초한 분석이다. 이들 분석을 수행하기 위한 절차는 선행기술에 개시되어 있으며 WO2008080989 출원 뿐만 아니라 본 발명의 실시예(섹션 "방법")에 요약되어 있다.

본 발명에 따른 변종은 위에 언급된 네이티브 TF 분자에 대해 최소 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 96% 유사 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 공지된 바와 같이 두 개 단백질 사이의 "유사도(similarity)"는 아미노산 서열 및 두 번째 단백질에 대한 보존된 첫 번째 단백질의 아미노산 치환체를 비교하여 결정된다. 두 개의 단백질 사이의 동일성(identity) 정도는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 사용하여 결정된다. 두 개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게 BLASTP 알고리즘[BLAST매뉴얼, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)]을 사용하여 결정된다.

TF 단백질은 (1) 신호 펩티드 또는 영역 단백질이 미성숙형에서 성숙형으로 변형되는 번역후변형(post-transslationally processed) 32 아미노산 리더 서열; (2) 약 219 말단 아미노산을 포함하는 N-당화된 세포외 도메인; (3) 주로 소수성이고, 트랜스멤브레인 도메인 아미노산을 형성하는 것으로 생각되는 약 23 아미노산의 단편(fragment); 및 (4) 단백질 세포질 단편의 부분을 형성하는 아미노산으로 생각되는 21-아미노산 카복실 말단을 포함하는 명확한(well-defined) 도메인 구조를 가진다. hTF 단백질의 도메인 구조는 예를 들어, 단백질 또는 그것의 기능성 단편의 세포외 도메인의 생성을 하게 한다.

특정 구현예에서, 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단편은 성숙한 TF 단백질을 포함한다. 용어 "성숙한 TF"는 신호 펩티드를 결여한 아미노산 서열인 TF 단백질을 의미한다. 또한, 특정 구현예에서, 인간 성숙 TF 단백질은 SEQ ID NO:1에서 나타낸 아미노산 서열을 가진다.

응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질의 단편은 당화, 부분적으로 당화 또는 비당화될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 TF-함유 지질 마이크로소포는 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질의 비당화 단편을 포함하고, 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 마이크로소포 유래 TF-함유 이스트는 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질의 당화 단편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 기능성 변종은 최소한 하나의 기능성 N-당화 사이트를 함유한다.

바람직한 구현예에서, N-당화 사이트 또는 사이트들은 성숙한 인간의 N-당화 사이트 위치 11-13에서 NLT, 위치 124-126에서 NVT 또는 위치 137-139에서 NNT에 상응하는 것들이다. 더 바람직한 구현예에서, TF는 하나 이상의 Asn 잔기의 N-당화를 위한 수용체가 아닌 잔기로의 치환을 수반한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, TF 변종은 성숙한 인간 TF의 위치 11, 124 또는 137에 상응하는 위치에서 Asn 잔기에 하나 이상의 Asn-to-Ala 돌연변이를 포함한다.

당화는 TF 함유 지질 소포의 생성을 위해 사용되는 발현 시스템에 따라서 달라질 것이다. 따라서, 본 발명은 최소한 하나의 식물-특이적 글리칸, 이스트-특이적 글리칸 또는 동물-특이적 글리칸을 포함하는 재조합 포유류의 조직 인자 단백질을 제공한다.

또한, TF 단백질의 경우에서와 같이, 본 발명의 실시에서 사용되는 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질의 단편은 융합 단백질의 멤버가 될 수 있으며, 이때 융합단백질은 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질 단편을 포함하는 첫 번째 영역을 함유하고, 다른 펩티드 또는 단백질을 포함하는 두 번째 영역에 결합된다. 두 번째 영역은 TF 단백질 단편의 아미노-말단 영역에 결합될 수 있거나 또는 대안적으로 두 번째 영역은 TF 단백질 단편의 카복실-말단 영역에 결합될 수 있다. 첫 번째 또는 두 번째 영역 둘다는 직접 결합될 수 있거나 또는 첫 번째와 두 번째 영역 사이에 링커 폴리펩티드를 통해 결합될 수 있다.

특정 구현예에서, 융합 단백질은 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질의 단편 및 TF 단백질 단편의 C-말단 또는 N-말단 도메인에 결합되는 태그를 포함한다. 태그는 일반적으로 융합 단백질의 분리 또는 정제에서 사용될 수 있는 펩티드 또는 아미노산 서열이다. 이 융합 단백질의 생성을 위해 적합한 태그의 구체적이면서 제한적이지 않은 예는 첫 번째 영역이 TF 단백질인 융합 단백질과 연결되는 앞에서 언급된 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 태그는 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질 또는 그것의 단편의 C-말단 도메인에 결합된 His-태그이다. 다른 구현예에서, 태그는 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편의 N-말단 도메인에 결합된 His-태그이다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 성숙한 TF 단백질, 바람직하게 인간의 성숙한 TF 단백질을 포함한다. 이 융합 단백질은 또한 응혈촉진 활성을 가지며, 그것의 응혈촉진 활성은 앞에서 언급된 대로, 예를 들어 실시예 2에서 언급되는 응고 분석에 의해 분석될 수 있다.

또한, TF 단백질은 융합 단백질을 형성하는 부분을 제공할 수 있고, TF 단백질을 포함하는 첫 번째 영역을 함유하는 융합 단백질은 다른 펩티드 또는 단백질을 포함하는 두 번째 영역에 연결된다. 두 번째 영역은 TF 단백질의 아미노-말단 영역에 결합될 수 있거나 또는 대안적으로 두 번째 영역은 TF 단백질의 카복실-말단 영역에 결합될 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 영역은 서로 직접 결합될 수 있거나 또는 첫 번째 및 두 번째 영역 사이에 링커 폴리펩티드를 통해서 결합될 수 있다.

특정 구현예에서, 융합 단백질은 TF 단백질 및 TF 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 결합되는 태그, 대체로 펩티드 태그를 포함한다. 태그는 일반적으로 융합단백질의 분리 또는 정제를 위해 사용될 수 있는 펩티드 또는 아미노산 서열이다. 따라서 태그는 하나 이상의 리간드, 예를 들어 고친화성을 가지는 크로마토그래피 지지체 또는 비드와 같은 친화성 매트릭스인 하나 이상의 리간드를 결합할 수 있다. 태그의 예는 고친화성을 가지는 니켈 컬럼(Ni2+) 또는 코발트(Co2+)에 결합될 수 있는 6 히스티딘 잔기(His6 또는 H6)를 포함하는 태그와 같은 히스티딘 태그(His-태그 또는 HT)이다. 실시예 1(도 4)에 나타낸 His-태그는 바람직한 형태를 가지며, 대분분의 단백질이 변성되고 대부분의 단백질-단백질 상호작용에 지장을 주는 조건 하에서 그것의 리간드를 결합할 수 있다. 따라서 참여한 미끼로 단백질-단백질 상호작용의 붕괴를 수반하는 H6로 태그된 미끼 단백질(bait protein)을 제거하기 위해 사용될 수 있다.

구체적이고 비제한적인 융합 단백질을 분리 또는 정제하기에 유용한 태그의 추가적인 예는 Arg-태그, FLAG-태그, Strep-태그, 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프, SBP-태그, S-태그, 칼모듈린 결합 펩티드, 셀룰로오스 결합 도메인, 키틴 결합 도메인, 글루타티온 S-전이효소-태그, 말토오스 결합 단백질, NusA, TrsA, DsbA, Avi-태그 등과 같은 c-myc-태그(항-c-myc 항체에 의해 인식되는)(Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO:2); Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO:3); Gly-Met-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO:4); β-갈락토시다아제 등의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 태그는 TF-단백질의 C-말단 도메인에 결합되는 His-태그이다. 다른 구현예에서, 태그는 TF 단백질의 N-말단 도메인에 결합되는 His-태그이다.

특정 구현예에서, 융합 단백질은 신호 펩티드를 결여한 인간 TF 또는 당화 사이트에서 N124A 돌연변이 및 C 말단에 헥사히스티딘 태그를 가지고 (SEQ ID NO:5)에 의해 주어지는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 포함한다.

융합 단백질은 종래의 수단, 예를 들면 적합한 이스트 세포에서 융합 단백질에 대해 엔코딩하는 뉴클레오펩티드 서열의 유전자 발현 수단에 의해 얻어질 수 있다. 최종적인 태그가, 만약 요구된다면 융합 단백질의 분리 또는 정제를 위해 사용될 수 있다.

다른 특정 구현예에서, 본 발명의 제1 방법의 첫 번째 단계는 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단편의 진핵 세포에서의 발현을 수반한다.

본 발명에 따르면, TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편의 부분(portion)이 지질 멤브레인에 통합된다. 보통, 언급된 부분은 상기 단백질 또는 단편의 친유성 영역(즉, TF의 중앙 도메인)을 포함하고, 반면 그것의 친수성 영역(즉, 아미노-말단 영역 및 상기 TF 단백질의 카복실-말단 영역)은 멤브레인의 외형질 또는 내형질면과 마주한다. TF 단백질의 친유성 및 친수성 영역에 관한 정보는 WO2008080989로부터 얻을 수 있다. 특정 구현예에서, 응혈촉진 활성을 가지는 TF 단백질의 N-말단 도메인 또는 그의 단편의 N-말단 도메인은 언급한 멤브레인의 외형질면과 마주하는 반면, 다른 특정 구현예에서 TF 단백질의 N-말단 도메인 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그의 단편의 N-말단 도메인은 언급한 멤브레인의 내형질면과 마주한다.

TF 또는 그것의 변종의 발현 방법은 시용되는 진핵 세포에 의존한다. 일반적으로 진핵 세포는 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 변형되고, 작동적으로 본 발명에서 사용될 수 있는 균류, 이스트, 식물 또는 동물(어류, 파충류, 포유류, 곤충 등) 세포와 같은 세포의 어딘 가에서 기능성 프로모터에 연결된다.

TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편을 코딩하는 cDNA는 템플레이트 및 적합한 프라이머로서 cDNA 라이브러리를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭될 수 있다. 실시예 1은 3' 말단에서 18 엑스트라 뉴클레오티드(6개의 히스티딘을 코딩하는)로 성숙한 hTF 단백질을 코딩하는 cDNA의 증폭을 개시한다.

여기서 사용된 "벡터"는 핵산 분자가 연결되는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 용어 "이스트 발현 벡터"는 DNA 발현 구조체, 예를 들어 이스트에서 벡터에 의해 수행되는 그들 각각의 재조합 유전자(즉, TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편)에 의해 엔코드되는 대상 단백질(subject proteins)을 합성할 수 있는 핵산 절편(segment), 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 바이러스 입자를 의미한다. 대안적으로, 핵산 절편은 무방향성 재조합(non-directional recombination) 또는 상동 재조합(homologus recombination)을 사용하여 형질전환 이스트 세포를 생산(create)하기 위해 사용될 수 있는데, 형질전환 이스트 세포에서 관심 유전자 또는 유전자들이 안정하게 이스트 게놈으로 통합된다. 보통, 이스트 발현 벡터는 작동적으로 이스트 세포(즉, 이스트-기능성 프로모터)에서 기능성인 프로모터에 연결되는 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용을 위한 벡터는 예를 들어, 핵산의 자동 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터이고, 이스트 세포 내에서 핵산에 벡터가 연결된다. 본 명세서에서, 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드는 가장 공통적으로 사용되는 벡터의 형태로서 상호교환적으로 사용된다. 게다가, 본 발명은 동등한 기능을 주며 여기에서 연이어 선행기술에서 알려진 발현 벡터의 다른 형태를 포함한다. 이스트 발현 벡터는 이스트 에피솜 발현 벡터 또는 이스터 통합 발현 벡터일 수 있으며, 이 분야의 통상의 기술자에게 알려진 종래 기술에 의해 얻어질 수 있다.

따라서 일 구현예에서, 이스트 발현 벡터는 이스트 에피솜 발현 벡터이다. 용어 "이스트 에피솜 발현 벡터"는 이스트 세포질 내에서 염색체 외(extra-chromosomal)의 DNA 분자로서 유지되는 발현 벡터를 의미한다. 특정 구현예에서, 이스트 에피솜 발현 벡터는 응혈촉진 활성을 가지고 작동적으로 이스트-기능성 프로모터에 연결되는 TF 단백질 또는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 더해 하기를 더 포함한다: (i) 이스트 선택 유전자(a yeast selection gene); (ii) 이스트 복제 기원(a yeast replicaiton origin); (iii) 박테리아 선택 유전자(a bacterial selection gene); (iv) 이스트 전사 종결 신호(a yeast transcription termination signal)를 포함한다. 유리하게, 이스트 에피솜 발현 벡터는 이스트 전사 종결 신호 후에 이어서 이스트-기능성 프로모터 제어하에 선택된 유전자(TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편)를 클로닝하기 위한 고유의 제한부위를 더 포함한다.

사실상 이스트-기능성 프로모터, 이스트 선택 유전자, 이스트 복제 기원, 박테리아 선택 유전자, 이스트 전자 종결 신호, 및 클로닝하기 위한 제한부위는 어느 것이나 언급된 이스트 에피솜 발현 벡터의 제조에서 사용될 수 있다; 그럼에도 불구하고 특정 구현예에서, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화효소 프로모터(pGDP)가 이스트-기능성 프로모터로서 사용된다; 다른 특정 구현예에서, 이스트 2 미크론(2μ) 복제 기원이 이스트 복제 기원으로서 사용된다; 다른 특정 구현예에서, 암피실린 저항성 유전자(Amp)가 박테리아 선택 유전자로서 사용된다; 그리고 다른 특정 구현예에서, 포스포글리세레이트 키나제(PGKt)의 전사 종결 신호가 특정 이스트 전사 종결 신호로서 사용된다. 따라서 특정 구현예(실시예 1-2)에서, 이스트 에피솜 발현 벡터는 (i) URA3 유전자; (ii) 이콜라이(E. coli)에서 벡터를 선택하고 전파하기 위한 Amp 유전자; (iii) 이스트 2μ 복제 기원; (iv) pGDP; (v) PGKt의 특정 이스트 전사 종결 신호; 및 (vi) PGKt 서열에 이이서 pGDP의 제어 하에 선택된 유전자를 클로닝하게 하는 고유한 BamHI 제한부위를 포함한다. 다른 구현예에서, 이스트 발현 벡터는 이스트 통합 발현 벡터이다. 용어 "이스트 통합 발현 벡터"는 이스트 게놈으로 통합될 수 있는 벡터를 의미한다. 특정 구현예에서, 이스트 통합 발현 벡터는 (i) 박테리아 선택 유전자; 및 (ii) 이스트 선택 유전자 내에 삽입된 발현 카세트를 포함하고, 언급된 발현 카세트는 이스트-기능성 프로모터, 이스트 전사 종결 신호 및 선택된 유전자(TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편)를 클로닝하기 위한 고유한 제한 부위를 더 포함한다.

사실상 박테리아 선택 유전자, 이스트 선택 유전자 내에 삽입된 발현 카세트, 이스트-기능성 프로모터, 이스트 전사 종결 신호, 및 선택된 유전자를 클로닝하기 위한 고유의 제한 부위는 어느 것이나 이스트 통합 발현 벡터의 제조에서 사용될 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 구현예에서 암피실린 저항성 유전자(Amp)는 박테리아 선택 유전자로서 사용된다; 다른 특정 구현예에서; URA3 유전자의 중앙 영역에 삽입되는 발현 카세트 pGPD-BamHI-PGKt가 이스트-기능성 프로모터(pGDP), 이스트 전사 종결 신호(PGKt), 및 URAe 유전자의 중앙 영역에서 선택된 유전자를 클로닝하기 위한 고유한 제한부위(BamHI)를 함유하는 발현 카세트로서 사용된다.

사실상 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이스트 발현 벡터로 변형될 수 있게 하고, 작동적으로 이스트-기능성 프로모터에 연결되는 어떠한 이스트 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다. 언급된 이스트 발현 벡터로 이스트 세포를 변형시키는 것이 이 분야의 통상의 기술자에게 알려진 종래의 수단(Sambrook et al., 2001, Molecular cloning: A Laboratory Manual)에 의해 수행될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 이스트는 비응집 이스트(즉, 발효 과정에서 분산되고 응집(모이는)되지 않는 이스트 세포)이다. 유리하게, 이스트 세포는 GRAS 이스트 세포이다. 본 발명의 공정에서 사용될 수 있는 설명적이고, 비제한적인 이스트 세포의 예는 소위 알코올, 탄산가스를 생산하는 리쿠어 이스트 종(liquor yeast species, 술을 만들기 위해 사용되는 이스트), 빵효모, 및 양조 재료 액체 대사작용에 의한 유사한 것이다. 특별히, 바람직한 예는 S.세레비시에로부터 선택된다. 리쿠어 이스트의 예에는 맥주 이스트 세포, 와인 이스트 세포, 및 사케 이스트 세포가 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 이스트 세포는 S.세리비시에 T73 ura3-(실시예 1)와 같은 와인 이스트 세포이다.

용어 "식물 발현 벡터"는 DNA 발현 구조체, 예를 들어 식물에서 벡터에 의해 수행되는 그들 각각의 재조합 유전자(즉, TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 절편)에 의해 엔코드되는 대상 단백질을 합성할 수 있는 핵산 절편, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 바이러스 입자를 의미한다. 대안적으로, 핵산 절편은 무방향성 재조합(non-directional recombination) 또는 상동 재조합(homologus recombination)을 사용하여 형질전환 식물 세포를 생산(create)하기 위해 사용될 수 있는데, 형질전환 식물 세포에서 관심 유전자 또는 유전자들이 안정하게 식물 게놈으로 통합된다. 보통, 식물 발현 벡터는 작동적으로 식물 세포(즉, 식물-기능성 프로모터)에서 기능성인 프로모터에 연결되는 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 식물 기능성 프로모터는 옥수수 수크로스 합성효소 1, 옥수수 알코올 탈수소화효소 1, 옥수수 광수확 복합체, 옥수수 열충격 단백질, 피아 소단위체(small subunit) RuBP 카복실화효소, Ti 플라스미드 만노핀 합성효소, Ti 플라스미드 노팔린 합성효소, 페튜니아 챨콘 이성질화효소, 콩 글리신 풍부 단백질 1, 감토 파타틴, 레시틴, CaMV 35S, 및 S-E9 소단위체 RuBP 카복실화효소 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 식물 호스트 시스템의 형질전환은 종래의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 식물에 대한 유전적 전달의 연구보고를 마르타 이즈퀴에르도(Marta Izquierdo)의 표제 "Ingenieria genetica and transferencia genica"인 교재(Ed. Piramide(1999)), 특히 9장, 283-316페이지의 "Transferencia genica a plantas"에서 볼 수 있다.

본 발명에서의 사용을 위한 벡터는 예를 들어 핵산의 자동 복제 및/또는 발현을 가능하게 하는 벡터이고, 이스트 세포 내에서 벡터가 핵산에 연결된다. 본 명세서에서, 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드는 가장 공통적으로 사용되는 벡터의 형태로서 상호교환적으로 사용된다. 게다가, 본 발명은 동등한 기능을 주며 여기에서 연이어 선행기술에서 알려진 발현 벡터의 다른 형태를 포함한다. 이스트 발현 벡터는 이스트 에피솜 발현 벡터 또는 이스터 통합 발현 벡터일 수 있으며, 이 분야의 통상의 기술자에게 알려진 종래 기술에 의해 얻어질 수 있다. 실질적으로 식물-기능성 프로모터, 식물 선택 유전자, 식물 복제 기원, 박테리아 선택 유전자, 식물 전사 종결 신호, 및 클로닝을 위한 제한부위의 어느 것이나 식물 에피솜 발현 벡터의 제조에서 사용될 수 있다.

다수의 특정 식물 생산 시스템이 개발되어 왔다. 이들은 리조세크레션(rhizosecretion)을 통해(Borisjuk et al., (1999) Nature Biotechnology 17:466-69), 씨에서(Hood et al., (1997) Molecular Breeding 3:291-306); Hood et al.,(1999) In Chemicals via Higher Plant Bioengineering(ed. Shahidi et al.) Plenum Publishing Corp. pp. 127-148; Kusnadi et al., (1997) Biotechnology and Bioengineering 56:47384; Kunsai et al., (1998) Biotechnology and Progress 14:49-55; Witcher et al., (1998) Molecular Breeding 4:301-12), 바이러스 표면 상에서 에피토프로서(Verch et al., (1998) J. Immunological Methods 220:69-75; Brennan et al., (1999) J. Virology 73:930-38; Brennan et al., (1999) Microbiology 145:211-20), 그리고 감자 덩이줄기에서 단백질의 안정한 발현에 의해(Arakawa et al., (1997) Transgenic Research 6:403-13; Arakawa et al., (1998) Nature Biotechnology 16: 292-97; Tacket et al., (1998) Nature Medicine 4: 607-09) 유체(oil body)상의 단백질 발현(Rooijen et al., (1995) Plant Physiology 109:1353-61; Liu et al., (1997) Molecular Breeding 3:463-70)을 포함한다. 재조합 단백질은 또한 씨, 엽록소에 대해 표적이 될 수 있거나 또는 단백질 축적의 가장 높은 레벨을 주는 위치를 확인하기 위해 감추어질 수 있다. 이들 각각은 적합한 식물 호스트에서 조직 인자 또는 단편을 발현하기 위해 맞추어질 수 있다.

식물에서 단백질을 발현하기 위한 추가의 일반적인 방법이 보고되어 있다. Bascomb, N.et al.의 PCT/US02/23624; 및 Hall, G.et al.의 PCT/US02/17927을 참조하라. 이들은 예를 들어 다른 식물들의 다양성뿐만 아니라 아라바도프시스(Arabadopsis)에서 조직 인자 단백질 또는 단편을 발현하기 위해 손쉽게 고쳐질 수 있다.

이종성(heterologous) 단백질을 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물에서 발현하기 위한 추가의 방법이 보고되어 있다. 이들은 관심 단백질의 안정하고 구성적인 발현을 야기하는 접근을 포함한다: 1) 아그로박테륨-매개성(Agrobacterium-mediated) 유전자 전이; 2) 원형질 속으로 직접적 DNA 흡수(uptake)를 위한 방법을 포함하는 직접적 DNA 흡수; 3) 식물 세포의 짧은 전기 충격(shock)에 의해 유도되는 DNA 흡수; 4) 입자 충격(bombardment), 마이크로피펫 시스템 사용 또는 발아화분(germinating pollen)으로 직접 DNA 배양에 의해 식물 세포 또는 조직 속으로 DNA 주입; 및 5) 유전자 벡터로서 식물 바이러스의 사용. 이들 방법들의 하나 또는 조합이 조직 인자 및 그것의 기능성 단편을 발현하는 식물을 생산(create)하기 위해 사용될 수 있다.

재조합(engineered) 아그로박테륨 균주에 의한 유전자 전이가 대부분의 쌍자엽 식물 및 일부 단자엽 식물을 위한 경로가 되어 왔다. 예로 Fraley et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803을 보라. 또한 본 발명에서의 사용을 위한 벡터는 예를 들어 U.S. Pat. No. 5,591,616 및 EPA 0604662A1에 개시된 "수퍼-바이너리(super-binary)"를 포함한다. 또한 Hood et al.(1984) Biotechnol. 2:702-709; Hood et al.(1986) J. Bacteriol. 168:1283-1290; Komari et al. (1986) J. Bacteriol. 166:88-94; Jin et al. (1987) J. Bacteriol. 169-4417-4425; Komari T. (1989) Plant Science 60:223-229; ATCC Accession No. 37394).

용어 " 동물 발현 벡터"는 DNA 발현 구조체, 예를 들어 동물 세포에서 벡터에 의해 수행되는 그들 각각의 재조합 유전자(즉, TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편)에 의해 엔코드되는 대상 단백질(subject proteins)을 합성할 수 있는 핵산 절편(segment), 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 바이러스 입자를 의미한다. 대안적으로, 핵산 절편은 무방향성 재조합(non-directional recombination) 또는 상동 재조합(homologus recombination)을 사용하여 형질전환 동물 세포를 생산(create)하기 위해 사용될 수 있는데, 형질전환 동물 세포에서 관심 유전자 또는 유전자들이 안정하게 이스트 게놈으로 통합된다. 보통, 동물 발현 벡터는 작동적으로 동물 세포(즉, 동물-기능성 프로모터)에서 기능성인 프로모터에 연결되는 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 동물 세포는 곤충 세포이다. 곤충 트랜스펙션 시스템의 예에 본 발명(실시예 참조)에서 사용된 재조합 바큘로바이러스(Baculovirus)와 같은 곤충 특이적 바이러스와 US 특허 US6130074A에서 기재된 것들과 같은 다른 것이 포함된다.

구현예에서 발현하게 되는 TF 또는 그것의 변종 세포는 이스트이고, 이스트는 이스트 및 이스트 유전학의 처리(manipulation)를 위한 표준 기술을 사용하여 다루어진다. 예를 들어, Bacila et al., eds. (1978, Biochemistry and Genetics of Yeast, Academic Press, New York); 및 Rose and Harrison(1987, The Yeasts (2.sub.nd ed.) Academic Press, London)을 보라. 이스트 호스트 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법은 선행기술에 잘 알려져 있다. 이스트의 변형을 위한 방법이 매우 다양하게 있다. 스페로플라스트 변형이 Hinnen et al(1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1919-1933); Beggs(1978, Nature 275(5676):104-109); 및 Stinchcomb et al., (EPO Publication No. 45,573; 여기서 참조로 병합함)에 의해 교시된다. 전기천공법이 Becker 및 Gaurante,(1991, Methods Enzymol. 194:182-187)에 의해 교시되고, 리튬 아세테이트가 Gietz et al. (2002, Methods Enzymol. 350:87-96) 및 Mount et al. (1996, Methods Mol. Biol. 53:139-145)에 의해 교시된다. 비-사카로미세스 이스트의 변형 시스템의 연구보고에 대해 Wang et al.(Crit. Rev Biotechnol. 2001; 21(3):177-218)을 보라. 이스트 유전공학의 일반적 절차에 대해 Barr et al.(1989, Yeast genetic engineering, Butterworths, Boston)을 보라.

일단 진핵 세포가 선택 TF-발현 벡터로 변형되면, 다음 단계는 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 단편을 발현하는 재조합 진핵 세포의 배양조직(culture)을 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 단편을 발현할 수 있게 하는 조건에서 성장시키는 것이다. 특정 구현예에서, 진핵 세포는 적합 배지에서 자라며, 언급된 진핵 세포는 원하는 이종성 산물(TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 단편)을 발현할 수 있다. 이스트, 식물, 곤충, 어류, 포유류 또는 다른 진핵 세포를 성장시키기 위한 적합한 배양조직 배지는 이 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며 배양되어야 하는 진핵 세포의 타입에 따라 선택될 수 있다. 발효를 만들거나 산물을 성장시키기 위한 어떠한 재료가 채용된 진핵 세포에 의해 야기되는 발효 또는 성장에 적합한 만큼 길게 사용될 수 있고, 알려진 소재가 자유롭게 사용될 수 있다. 적합한 영양제 등이 필요하다면 거기에 첨가될 수 있다.

발효 또는 세포 배양 조건은 기본적으로 공지된 조건과 다르지 않으며 이 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수정될 수 있다. 조절되어야 하는 성장 조건은 가스 조성물(산소, 등), 온도, pH, 등이다. 이스트 프로모터를 사용하는 재조합 단백질의 발현을 위한 방법 및 반응 조건이 문서 US5618676, US5854018, US5856123 및US5919651에 개시되었다. 특정 구현예에서 이스트 세포의 발효가 발효 공정을 통해 주요 파라미터의 발전을 조절하는 것에 의해 이어지고 산소 압력(PO₂)이 정지상태에 도달할 때 멈춘다.

두 번째 단계에서, 본 발명의 제1 방법은 단계 (i)에서 얻어지는 세포로부터 TF-함유 마이크로소포의 회수를 포함한다.

용어 "회수"는 DNA, 단백질 등과 같은 다른 세포 성분뿐만 아니라 온전한(intact) 또는 용해된(lysed) 세포로부터 TF-함유 마이크로소포를 분리하고, 따라서 부분적으로 또는 전체적으로 정제된 TF-함유 마이크로소포 물질(preparation)을 얻는 행위를 의미한다. 특정 구현예에서 회수된 부분의 순도는 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%, 및 100%이다.

회수는 세제의 결여하에, 또는 세제가 사용되는 경우에는 임계 교질입자 농도(CMC) 아래의 세제 농도를 사용하는 세포의 용해를 요구한다. 얻어지는 세포가 형질전환 세포 또는 형질전환 동물 같은 전체 기관을 형성하는 경우에, 회수는 기계적 또는 효소적 방법을 사용하는 세포 현탁액으로 조직을 줄이는 단계를 포함할 수 있다.

세포 배양조직으로부터 나온 세포 부유액(cell suspension) 또는 세포는 TF-함유 마이크로소포가 세포 부유액으로부터 회수되는 경우에, 원심분리법과 같은 종래 방법에 의해 펠렛으로 될 수 있고, 그리고 상기 생성물을 균질화하기에 앞서 적합한 용해 버퍼에서 재현탁될 수 있다.

식물 및 균류 세포는 셀룰로오스 및 키틴 벽을 가진다. 따라서 균질화에 앞서 추가 단계 세포가 세포 벽을 제거하기 위해 요구될 수 있다. 이 단계는 기계적(예, 절구와 절구공이, 프렌치프레스, 블렌더 및 유사한 것) 또는 효소적(예, 셀룰라아제, 퀴티나아제(quitinase) 등을 사용하는) 방법을 사용하여 약학적으로 수용가능한 용액 o 분해 버퍼(물, 인산-완충 식염수(PBS) 등)의 존재하에 수행될 수 있다.

게다가, 균질화에 앞서, 잔류물(debris)이 여과 또는 가벼운 원심분리, 일반적으로 약 30분보다 적은 시간, 바람직하게 약 5 내지 약 20분 사이의 시간 동안 약 1,000.times.g으로 제거될 수 있다.

본 발명의 제1 방법의 첫 번째 단계에서 얻어진 세포부터 나온 TF-함유 마이크로소포를 회수하기 위한 방법은 사용된 진핵 세포에 따라 달라질 수 있으며 제한없이, 원심분리, 겔여과 크로마토그래피, 접선흐름여과(tangential flow filtration) 또는 그들의 조합을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 세포는 기계적 수단에 의해 용해되고 핵, 손상되지 않은 세포 및 잔류물이 핵을 제거한 상청액(post-nuclear supernatant)을 제공하여 저-스피드 원심분리에 의해 제거된다.

이스트 세포가 TF-함유 마이크로소포의 제조용 물질(preparation)을 위한 호스트 세포로서 사용되는 특정한 경우에, 이스트 세포는 발효 균질액을 만드는 호모게나이저에서의 고압과 같은 종래의 방법에 의해 균질화될 수 있다. 발효 균질액은 그런 후, 개별적으로 수집될 수 있는 응혈촉진 활성을 가지는 TF-함유 이스트(즉, 본 발명의 마이크로소포 유래 TF-함유 이스트) 유래된 마이크로소포를 함유하는 펠렛 및 정화된 이스트 추출물(CYE)을 만들기 위해, 원심분리와 같은 종래의 방법에 의해 분리된다.

TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편의 존재는 특정 항-TF 단백질 모노클로날 항체(mAb)를 사용하여 웨스턴-블롯 분석과 같은 공지의 방법에 의해 결정될 수 있다. 또한, CYE의 응혈촉진 활성은 실시예 4에서 언급되는 응고 분석 중의 어느 것과 같은 공지의 분석(assay), 예를 들어 일반적으로 혈장 또는 항응혈제로 처리되지 않은 전혈(non-anticoagulated whole blood) 등에서 인비트로 응고 분석에 의해 결정될 수 있다.

표지된 항-TF mAb로 면역전자현미경에 의한 CYE 샘플의 추가 조사가 이스트- 또는 다른 진핵- 유래 마이크로소포에서 TF의 존재를 확인하기 위해 적용될 수 있다. 언급한 마이크로소포는 응혈촉진 활성을 갖는 TF 단백질 또는 단편을 포함하고, 또한 응혈 촉진 활성을 가지며 본 발명의 TF-함유 진핵 유래 마이크로소포에 상응한다.

선택적으로, 요구된다면, 응혈촉진 활성을 가지는 TF-함유 진핵 세포 유래 마이크로소포(이스트 유래 마이크로소포)가 이 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 종래의 방법에 의해 농축될 수 있고, 분리 또는 정제될 수 있다. 설명으로, 펩티드 태그(예, His-tag 등)를 함유하는 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제가 C-말단이나 또는 N-말단에서 고도로 정제된 다수의 단백질 제조용 물질을 얻기 위해 잘 표준화된 방법이 사용된다. 크로마토그래피 방법으로서, 언급된 방법은 쉽게 증가(scaled-up)시킬 수 있다. 특히 증가된 생산을 위해 특정 항-TF 모노 또는 폴리클로날 항체의 잘 표준화된 스톡(stock)의 이용가능성이 요구된다 하더라도, 면역친화성 크로마토그래피와 같은 대안적인 정제 절차가 수행될 수 있다.

따라서 분리 및 정제 방법은 다른 것들 사이에서 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 단편, 즉 만약 그것이 고친화성 크로마토그래피 지지체 또는 비드와 같은 친화성 매트릭스의 하나 이상의 리간드에 결합하기 위한 태그(예. His-tag 등), 또는 c-myc-태그(항-c-myc 항체) 등과 같은 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 가지는 융합 단백질이라면, 그 본성에 의존할 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 히스티딘-태그된 TF-함유 이스트 유래 마이크로소포가 앞서 개시된 공정에 따라서 정제된 이스트 추출물(CYE)로부터 얻어진다. 일반적으로, CYE는 적합한 친화성 컬럼(예, HiTrap- 친화성 컬럼)에 로드되기 전에 여과(예, 0.2μm 포어사이즈 필터를 통해 접선흐름여과에 의해)된다; 그리고 나서, 샘플을 적용한 후에, 흐름을 통해 회수된다(결합되지 않은 물질), 그리고 컬럼은 수회 세정되고, 마지막 세정 후, (TF-His-태그 단백질)-함유 이스트 유래 마이크로소포가 컬럼에 적합한 버퍼(예, 이미다졸 함유 버퍼)를 첨가하여 용리되고 그리고 용리 부분이 분리된 또는 정제된 (TF-His-태그 단백질)-함유 이스트 유래 지질 마이크로소포를 만들기 위해 수집되고 투석된다.

또한, 다른 구현예에서, 본 발명의 TF-함유 마이크로소포가

프라임 장비에 의해 정제될 수 있다.

프라임은 대량 생산을 위해 쉽게 증가될 수 있는 사이즈 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 표준 정제 프로토콜의 전개에 대해 사용될 수 있는 제너럴 일렉트릭 헬스케어의 자동화된 액체 크로마토그래피 시스템이다. 또 다른 실시예에서, 접선흐름여과 또는 고-성능 접선흐름여과(HPTFF)가 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, TF-함유 마이크로소포는 접선흐름여과의 하나 이상의 단계 또는 사이즈 배제 크로마토그래피의 하나 이상의 단계의 조합을 사용하여 회수된다.

특정 구현예에서, TF-함유 이스트 마이크로소포는 접선흐름여과의 하나 이상의 단계에 의해 회수되고, 하나의 사이즈 배제 크로마토그래피가 이어지며, 또 다른 접선 흐름 여과가 이어진다. 특정 구현예에서, 첫 번째 접선흐름여과의 포어 사이즈는 두 번째(및 이어지는) 접선여과흐름의 포어 사이즈보다 더 크다. 더 바람직한 구현예에서, 첫 번째 접선여과흐름의 포어 사이즈는 0.5μm 내지 0.1μm이고 두 번째 접선여과흐름의 포어 사이즈는 0.2μm부터이다.

세 번째 단계에서, 본 발명의 제1 방법은 단계 (ii)에서 얻어진 마이크로소포를 마이크로소포 내로 인지질을 병합하기에 적합한 조건 하에서 음이온 인지질과 접촉하는 단계를 포함한다.

용어 "인지질"은 하나 이상의 인산 그룹을 함유하는 지질을 의미한다. 인지질은 자연에서 양친매성이다; 즉, 각 분자는 친수성(water-loving) 부분과 소수성(water-hating) 부분으로 구성된다. 여기서, 용어 "인지질"은 그 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르 유도체를 포함한다.

인지질은 그들이 글리세롤 주쇄 및 지질이 스핑고신을 함유하는 스핑고리피드를 수반할(carry) 때 포스포글리세라이드(또는 글리세로포스포리피드)내 알코올의 타입에 따라서 분류될 수 있다. 양 클래스는 생물학적 멤브레인 내에 존재한다. 포스포글리세라이드는 자연에서 발견되는 인지질의 가장 풍부한 클래스이고, 제한없이, 포스파티딜클로린(레시틴), 포스파티딜레탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤 및 카르디올리핀이 포함된다. 포스포글리세라이드의 각 타입 내에서의 구조적 다양성은 지방산 에스테르 그룹의 사슬 길이 및 포화도의 다양성에 기인한다.

스핑고미엘린은 주요 스핑고신-함유 인지질이다. 그것의 일반적인 구조는 아미드 결합에 의해 스핑고신에 부착되는 지방산으로 구성된다.

용어 "음이온 인지질" 또는 "NCP"는 생리학적 pH 레벨, 즉 약 pH 7.3 내지 7.5의 범위 이상에서 총 음이온을 가지고 있는 인지질을 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 음이온 인지질의 예는 포스파티딜세린(PS), 디팔미토일 및 디스테로일 포스파티딘산(DPPA, DSPA), 디팔미토일 및 디스테로일 포스파티딜세린(DPPS, DSPS), 디팔미토일, 디스테로일 포스파티딜글리세롤(DPPG, DSPG), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜리노시톨, 카르디오리핀, 스핑고리피드(세라마이드-1-포스페이트; 글리코실화된 포스파티딜 에타놀아민; 술파티드(수산화된 또는 되지 않은); 간글리오사이드, 포스파티딜리노시톨포스페이트 및 포스파티딘산이 포함된다.

바람직한 구현예에서, 음이온 인지질은 포스파티딜세린(PS)이고, 이것은 포스파티딘산 분자의 포스페이트 그룹과 세린의 수산기 사이의 에스테르화에 의해 형성되는 인지질이며, 하기 구조로 도시되는 구조를 가지며, 식에서 R은 지방산이다.

용어 "지방산"은 불포화를 하나도 가지지 않거나 하나 이상을 함유하는 약 C₁₂ 내지 C₂₂의, 다양한 사슬 길이를 가지는 긴 사슬 지방족 산(알칸산)을 의미한다. 바람직하게, 지방산은 스테아르산(18:0 또는 옥타데칸산), 올레산(18:1 시스-9 또는 (9Z)-옥타덱-9-노익 산), 팔미트산(16:0 또는 헥사데칸산), 리놀레산(18:2 (ω-6) 또는 시스, 시스-9,12-옥타데카디에노산), 아라키돈산(20:4 (ω-6) 또는 all-시스-5,8,11,14-에이코사테트라노에산(eicosatetraenoic acid), 도코소헥산산(docosohexanoic acid)(22:6 (n-3 또는 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥산산)으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명에서의 사용을 위한 음이온 인지질은 실질적으로 순수하게 정제 또는 분리될 수 있다. 화합물은 화합물이 자연적으로 그것을 동반하는 성분으로부터 떨어질 때 "실질적으로 순수"하다. 일반적으로, 화합물은 그것이 샘플 내 전체 재료의 중량에 대해서 최소한 60%, 더 일반적으로 75% 또는 90% 이상일 때 실질적으로 순수하다. 실질적으로 순수한 인지질은 예를 들면 자연적 원료로부터 추출에 의해 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 따라서 예를 들면, 화학적으로 합성되는 인지질은 일반적으로 그것의 자연적으로 연결된 성분으로부터 실질적으로 유리될 것이다. 순도는 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동, HPLC 등과 같은 어떠한 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 그렇지만, 본 발명에서 사용에 앞서 정제되는 것이, 인지질이 실질적으로 그것의 유용성으로 간섭하는 성분과 연결되지 않게 제공되는 것이 음이온 인지질에 대해 필수가 아니다. 당업자는 음이온 인지질의 자연 원료 또는 부분적으로 정제된 원료가 본 발명에서 사용될 수 있는 것을 인지할 것이다. 그리고 음이온 인지질 성분이 그러한 원료로부터 얻어지는 전체 재료의 작은 퍼센테이지(예를 들면 10-20%, 그러나 바람직하게 최소한 30%, 40%, 50% 또는 이상)를 구성할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

음이온 인지질로 본 발명의 제1 방법의 두 번째 단계 (ii)에서 얻어진 마이크로소포를 접촉하는 공정은 지질 마이크로소포 내에서 음이온 인지질의 병합을 위해 적합한 조건하에서 만들어진다. 배양 단계 동안 최적화될 수 있는 변수들은 온도, pH, 적합한 버퍼, 습도, 성분 농도, 용액, 세정 단계 등이 포함된다; 이들 변수들은 최적 마이크로소포/인지질 비를 얻기 위해 필요한 대로 조정될 수 있다.

앞에서 언급된 대로, 본 발명의 제1 방법의 단계 (i)에서 얻어진 소포 제제는 호스트에서 내생적으로 나타나는 멤브레인-연결된 단백질 뿐만 아니라 호스트 세포에서 발현되는 조직 인자 또는 그것의 변종을 포함하는 단백질뿐만 아니라 멤브레인 지질을 구성한다. 그렇지만, 마이크로소포 수득률을 수량화하기 위해, 부피 단위당 단백질의 마이크로그램으로 마이크로 소포 농도를 표현하는 것이 일반적으로 더 편리하다. 마이크로소포 샘플에서 단백질 농도가 브래드포드 분석(Bradford assay), 비씨에이 분석(BCA assay), 비우레트 분석(Biuret assay) 등과 같은 표준 단백질 수량화 기술을 사용하여 결정될 수 있다.

일단 마이크로소포에서 단백질 농도가 결정되면, 접촉 단계가 적합한 마이크로소포에 대한 인지질의 비를 사용하여 수행될 수 있다. 당업자는 접촉 단계에서 소포에 대한 인지질의 비가 최상의 성질을 보여주는 소포 제조용 물질을 획득하기 위한 요구에 따라서 다양화될 수 있는 것을 인지할 것이다. 바람직하게, 음이온 인지질의 적합한 종결 농도는 "포화 곡선 분석"을 사용하여 사용된 특정 음이온 인지질을 혼합하고 단계 (ii)에서 얻어진 마이크로소포의 농도를 증가시키고 그리고 양 성분의 최적 농도가 결정될 때까지 얻어지는 소포의 응고 시간을 결정하는 것에 의해 계산될 것이다. 대개 이 농도 비가 실질적으로 유리 음이온 인지질이 없게(즉 마이크로소포에 병합되지 않은) 하는 농도 비에 상응하지만, 본 발명은 또한 종래의 방법에 의해 제거될 수도 있는 병합되지 않은 인지질의 초과로 이어지는 양 성분의 비를 고려한다. 이 기술분야의 통상의 기술자는 또한 음이온 인지질이 음이온 인지질의 본성 및 단계 (ii)에서 얻어진 마이크로소포(즉, 이스트 유래 마이크로소포, 곤충 유래 마이크로소포 등)의 본성에 의존하는 다른 비율에서 단계 (ii)에서 얻어진 마이크로소포의 지질 이중층 내에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

바람직한 구현예에서, 약 0.1μg/ml 내지 1000μg/ml, 1μg/ml 내지 100μg/ml, 10-90μg/ml, 20-80μg/ml, 30-70μg/ml, 40-60μg/ml, 45-55μg/ml 또는 μg/ml의 단백질 농도를 사용하여 접촉 단계가 수행된다. 접촉 단계에서 인지질 농도는 바람직하게 0.001mM-1mN, 0.005-0.5mM, 0.1mM-0.4mM, 0.2mM-0.3mM이다.

바람직한 구현예에서, 접촉 단계는 0.005-1μmol의 인지질에 대해 약 Xμg의 단백질의 단백질/인지질 비를 사용하여 수행되며, 여기서 X는 약 5, 10, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100이다. 아직 더 바람직한 구현예에서, 접촉 단계는 50μg 또는 50μg보다 적은 단백질을 가지는 소포 제제에 대해 0.05μmol의 인지질을, 또는 최소한 50μg의 단백질은 가지는 소포 제제에 대해 1μmol의 인지질을 사용하여 수행된다.

접촉 단계가 대개 실질적인 인지질의 초과에 이르게 하지 않으면서 소포 내로 대부분의 인지질을 병합하기 위한 적합한 조건하에서 수행되는 반면, 이것은 추가 단계가 초과의 음이온 인지질이 단계 (ii)에서 얻어진 인지질-풍부 마이크로소포의 제제로부터 제거되게 수행될 수 있는 경우에 그렇게 필요하지 않을 수 있다. 추가 세정 단계, 층 분리, 원심분리, 크로마토그래피 등과 같은 잉여를 제거하기 위한 다른 방법이 이 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

잉여 인지질은 지질 이중층과 같이 연결되고 지질 이중층을 통해 삽입되는 조직 인자를 가지는 안정한 TF-함유 마이크로소포 조성물을 야기하는 다수의 방법에 의해 인지질-풍부 마이크로소포로부터 제거될 수 있다. 세제를 제거하는 적합한 방법은 투석, 접선흐름여과, 교차환류 중공섬유 여과, 소수성 크로마토그래피 수지로의 처리 및 단순한 희석이 포함된다.

본 발명의 제2 방법

두 번째 측면에서, 본 발명은 응혈촉진 활성을 가지는 TF-함유 마이크로소포, 또는 본 발명의 제2 마이크로소포의 제조를 위한 방법에 관한 것으로,

(i) 진핵 세포로부터 얻어진 지질 마이크로소포를 제공하는 단계,

(ii) TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 단계 (i)에서 정해진 지질 마이크로소포와 상기 마이크로소포 내로 상기 TF 단백질 또는 그것의 변종의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계,

(iii) 단계 (ii)에서 얻어진 소포를 음이온 인지질과 상기 소포 내로 상기 인지질의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함하며,

여기서 단계 (ii) 및 단계 (iii)은 순서에 무관하게 수행될 수 있다.

용어 "TF", 응혈촉진 활성을 가지는 TF 변종" 및 "음이온 인지질"은 본 발명의 제1 방법의 콘텍스트에서 자세히 설명되어 있으며 본 발명의 제2 방법에서 동등하게 적용가능하다.

본 발명의 제2 방법의 첫 번째 단계에서, 진핵 세포로부터 얻어진 지질 마이크로소포가 제공된다. 본 발명의 두 번째 단계에서 사용된 지질 마이크로소포는 본 발명의 제1 방법에서 설명된 방법을 사용하여 본 발명의 제1 방법에서 설명된 대로 진핵 세포의 어떠한 타입으로부터 유래되는 마이크로소포일 수 있으며 그리고 제한없이 이스트 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 어류 세포 및 식물 세포로부터 분리된 소포가 포함된다. 본 발명의 제1 방법의 콘텍스트에서 설명된 대로, 지질 마이크로소포는 일반적으로 세제의 결여하에 또는 세제의 존재하에 얻어지며 세제는 임계 교질입자 농도보다 낮은 농도에서 발견된다.

두 번째 단계에서, 지질 마이크로소포를 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종과 상기 마이크로소포 내로 TF 단백질 또는 그것의 변종의 병합을 위한 적합한 조건 하에서 접촉시킨다. 위에서 설명된 대로 얻어진 마이크로소포는 그런 후 조직 추출물로부터 얻어질 수 있거나 또는 (부분적으로) 정제된 재조합 단백질로서 제공될 수 있는 TF 단백질과 접촉된다. 추출물의 제제 및 TF의 정제가 곡류, 태반 및 폐 조직과 같은 여러 조직으로부터, 그리고 양, 소, 토끼, 개,및 인간과 같은 상이한 동물로부터 수행될 수 있다. 추출물의 제제 및 TF 단백질의 정제가 제한없이 US5622931에서 설명된 대로 수행될 수 있다. 사용된 TF는 어떠한 세포 발현 시스템, 바람직하게 진핵 세포로부터 얻어질 수 있는 재조합 TF(rTF)가 될 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용된 rTF는 앞에서 언급된 대로 또한 융합 단백질의 부분이 될 수 있다. 본 발명의 제2 방법에서 사용될 수 있는 진핵 세포 및 단백질의 이종성 발현을 위한 방법은 앞에서 설명되어 있다.

본 발명의 제2 방법은 단계 (ii)로부터 TF 잉여를 제거하기 위한 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (ii)로부터 잉여 TF를 제거하기 위한 방법은 기본적으로 본 발명의 제1 방법의 콘텍스트에서 언급된 것과 동일하며, 겔여과 크로마토그래피, 분별 원심분리, 밀도 구배 원심분리 및 그와 유사한 것이 포함된다.

세 번째 단계에서, 본 발명의 제2 방법은 단계 (ii)에서 얻어진 소포를 음이온 인지질과 상기 소포 내로 인지질의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다.

상기 소포 내로 인지질을 병합하기 위한 적합한 조건뿐만 아니라 본 발명에서 사용될 수 있는 음이온 인지질은 본 발명의 제1 방법에서 상세히 설명되어 있다. 바람직한 구현예에서, 사용된 음이온 인지질은 포스파티딜세린이다.

표현 "소포 내로 인지질의 병합을 위한 적합한 조건"은 자유롭게 인지질이 이동할 수 있고 마이크로소포 내로 병합될 수 있게 하는 어떠한 조건으로 이해되어야 한다. 특별하게 제한되지 않지만, 조건은 대개 온도 약 4C 내지 90C, 10C 내지 80C, 15C 내지 70C, 20C 내지 60C, 25C 내지 50C, 30C 내지 40C 또는 실온, pH 2-12, 3-11, 4-10, 5-9, 6-8 또는 7 및 생리적 염 농도를 수반한다.

바람직한 구현예에서, 약 0.1μg/ml 내지 1000μg/ml, 1μg/ml 내지 100μg/ml, 10-90μg/ml, 20-80μg/ml, 30-70μg/ml, 40-60μg/ml, 45-55μg/ml 또는 μg/ml의 단백질 농도를 가지는 소포 제제를 사용하여 접촉 단계가 수행된다. 접촉 단계에서 인지질 농도는 바람직하게 0.001mM-1mN, 0.005-0.5mM, 0.1mM-0.4mM, 0.2mM-0.3mM이다.

바람직한 구현예에서, 접촉 단계는 0.005-1μmol의 인지질에 대해 약 X의 단백질/인지질 비를 사용하여 수행되며, 여기서 X는 약 5, 10, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100μg의 단백질이다. 아직 더 바람직한 구현예에서, 접촉 단계는 50μg 또는 50μg보다 적은 단백질을 가지는 소포 제제에 대해 0.05μmol의 인지질을, 또는 최소한 50μg의 단백질은 가지는 소포 제제에 대해 1μmol의 인지질을 사용하여 수행된다.

본 발명의 제2 방법은 단계 (iii)으로부터 PS 잉여를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (iii)으로부터 PS 잉여를 제거하는 방법은 기본적으로 본 발명의 첫 번째 콘텍스트에서 언급한 것들과 동일하고 겔여과 크로마토그래피, 분별 원심분리, 밀도 구배 원심분리 및 그와 유사한 것이 포함된다.

본 발명의 제2 방법은 또한 단계 (ii) 및 단계 (iii)이 역순으로 수행될 수 있다. 즉 음이온 인지질로 소포를 먼저 접촉시키고 이어서 TF로 첫 번째 단계에서 얻어진 소포를 접촉시키는 순으로 수행될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서 본 발명은 지질 마이크로소포가 음이온 인지질과 상기 소포 내로 인지질의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉되는 첫 번째 단계 및 첫 번째 단계에서 얻어진 소포를 재조합 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종으로 상기 마이크로소포 내로 재조합 TF의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 두 번째 단계를 포함한다.

첫 번째 단계 및 두 번째 단계를 수행하기 위한 적합한 조건은 기본적으로 위에서 설명된 바와 같다.

본 발명의 마이크로소포

본 발명의 제1 방법 및 제2 방법 모두는 음이온 인지질과 접촉되지 않은 마이크로소포에 비해 개선된 응혈촉진 성능 및 증가된 안정성을 나타내는 TF-함유 마이크로소포를 얻게 한다. 따라서, 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 제1 방법 또는 제2 방법을 사용하여 준비되는 마이크로소포에 관한 것이다.

용어 "마이크로소포"는 위에서 상세히 설명되어 있으며 근본적으로 지질 단일층 또는 지질 이중층을 포함하는 폐쇄된 구획을 근본적으로 의미한다. 마이크로소포는 넓은 범위에서 다양한 직경을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 언급된 크기는 10μm와 동등 또는 더 작고, 일반적으로 0.5μm와 동동 또는 더 작다. 특정 구현예에서, 본 발명의 TF-함유 이스트 유래 마이크로소포의 크기는 10μm 내지 0.01μm 범위이다. 본 발명의 방법에 따라 얻어진 마이크로소포가 진핵 세포로부터 유래되기 때문에, 그들의 단백질 및 지질 구성은 그것이 유래하는 것의 기관의 멤브레인의 구성을 반영할 것이다.

마이크로소포가 이스트 세포로부터 유래하는 특정 경우에, 그들은 대개 에르고스테롤 및 카르디오리핀과 같은 이스트-특이적 인지질을 함유한다.

마이크로소포가 식물 세포로부터 유래하면, 이들은 파이토스테롤, 스타놀, 스타놀에스테르, 토코페롤, d-알파토코페롤, d,I-알파토코페롤, 토코트리에놀, 베타 -시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 스티그마스타놀, 베타 -시토스타놀, 시토스타놀, 데스모스테롤, 칼리나스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤 또는 브라시카스테롤을 포함하는 파이토스테롤 또는 트리테르펜과 같은 식물 세포 멤브레인-특이적 지질을 함유한다.

마이크로소포가 동물 세포로부터 유래하면, 이들은 콜레스테롤 또는 전형적인 동물 멤브레인 지질 구성과 같은 동물 세포-특이적 지질을 함유한다.

마이크로소포가 곤충 세포로부터 유래하면, 고함량의 디아실글리세롤과 같은 곤충 세포-특이적 지질 또는 전형적인 곤충 멤브레인 지질 구성을 함유한다(Insect Lipids: Chemistry, Biochemistry, and Biology Book by David W. Stanley-Samuelson, Dennis R. Nelson; University of Nebraska Press, 1993).

본 발명의 마이크로소포가 다른 입자성 물질로부터 유리되어 있는 것이 바람직하다 하더라도, 응혈촉진 효과는 넓은 범위의 마이크로소포의 순도 내에서 관찰된다. 따라서 본 발명의 마이크로소포는 비-마이크로소포 입자성 물질에 대해 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80% 또는 최소한 90% 마이크로소포를 포함하는 제제로 제공될 수 있다.

본 발명의 동결건조된 조성물

당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 마이크로소포의 조성물은 저장 동안 동결건조되고, 예를 들어 수성 배지(살균수, 인산완충용액, 또는 수성 식염수 용액)를 사용한 강력한 교반과 함께 복원(reconstitute)될 수 있다.

용어 "동결건조(lyophilization)", "냉동건조(freeze-drying)" 또는 문법적으로 동등한 그것의 변형은 일반적으로 부패가능한 물질을 보존하기 위해 또는 수송에 있어 더 편리한 물질을 만들기 위해 사용되는 탈수화 과정으로, 물질을 얼리고 난 후 주변 압력을 줄이고 충분한 열을 가해서 물질 내에서 얼어있는 물이 고체 상태에서 기체 상태로 직접 승화하게 하는 작업이다.

사용될 수 있는 다른 동결건조 및 냉동 과정이 당업자에게 알려져 있다. 동결건조는 회전식 증발기, 매니폴드 냉동-건조기 및 트레이 냉동-건조기와 같은 표준 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 드라이아이스 상에서 얼려질 수 있고, 그런 후 48시간 기간 이상 -40℃에서 시작하고 실온에서 종결되는 사이클을 사용하여 동결건조될 수 있다. 얻어지는 시약(reagent)이 0.1M 트리스(Tris), pH 7.5, 150mM 트레할로오스 첨가 농도를 작업하여 본 발명의 제1 또는 제2 소포를 함유하는 용액이 거의 10-250μg/ml에서 수득되도록 복원될 수 있다.

동결건조의 결과로서 지질 및/또는 소포의 교착 또는 융합을 방지하기 위해, 발생으로부터 융합 또는 교착을 방지하는 항냉동제(cryoprotectant)를 포함하는 것이 유용하다. 용어 "항냉동제"는 탈수화-재수화, 냉동-해동 또는 동결건조-재수화에 처해지는 지질 입자를 소포 융합 및/또는 소포 내용물의 유출로부터 보호하기 위한 제제이며, 제한없이 소르비톨, 만니톨, 염화나트륨, 글루코오스, 트레할로오스, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리(에틸렌글리콜)(PEG), 예를 들어 PEG 400이 포함된다. 이들 및 다른 첨가제는 문헌에 기재되어 있다. 예로, U.S. Pharmacopeia, USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc.(12601 Twinbrook Parkway, Rockville, Md. 20852)가 있으며, 그들 전체를 참조로서 여기에 통합한다. 일반적으로 동결건조된 제제는 더 큰 반감기를 가지는 잇점을 가진다.

본 발명의 제1 약학적 조성물

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 방법 및 제2 방법에 따라서 용액/현탁액으로든 또는 동결건조된 형태로든 얻어진 소포 및 약학적 활성 부형제(vehicle)를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다. 언급한 약학적 조성물은 그것의 투여를 위해 적합한 약학적 투여 형태로 제형화된다.

본 발명의 약학적 조성물은 인간 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 포함하는 본 발명의 마이크로소포를 포함하며 이는 앞에 상세히 언급되어 있으며, 성숙한 인간 TF, 끝을 자른(truncated) 인간 TF, TF의 당화 변종, 태그된 TF 및 C 말단에 헥사히스티딘 태그 및 N124A 돌연변이를 수반하는 성숙한 TF와 같은 앞의 변형(modification) 중 하나 이상을 수반하는 변종을 포함한다.

용어 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 본 발명의 방법에서 유용한 치료학적 조성물을 독성, 흥분, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 발생가능한 위험이 있는 합병증과 같은 원치않는 역효과를 일으키지 않으면서 적합한 인비보 또는 엑스비보 사이트에 전달하기 위한 적합한 물질을 의미한다. 사실상, 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 본 발명의 제1 또는 제2 마이크로소포에 담체가 전혀 부정적으로 영향을 주지 않는다. 구현예에서, 언급한 부형제는 실질적으로 본 발명의 공정 수행에 의해 얻어지는 본 발명의 TF-함유 마이크로소포를 둘러싸는 배지와 같은 액체 배지이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 제1 조성물은 본 발명의 공정 수행에 의해 얻어지는 정제된 진핵 추출물을 포함하며, 여기서 음이온 인지질이 첨가된다.

본 발명의 생성물의 투여를 위한 적합한 투여 형태뿐만 아니라 담체(carrier) 및 첨가제(excipients)에 대한 정보는 생약학처치법에서 찾을 수 있다. 일반적으로 약물의 상이한 약학적 투여 형태의 연구검토는 표제 "Tratado de Farmacia Galenica"(C. Fauli Trillo, 제1판, 1993, Luzan 5, S.A. of Ediciones)인 책에서 찾을 수 있다.

특정 구현예에서 본 발명의 제1 및 제2 방법에 따라 얻어진 마이크로소포가 함께 제형화될 수 있다.

특정 구현예에서 본 발명의 TF-함유 마이크로소포를 포함하는 약학적 조성물이 응고 프로모터와 함께 제형화될 수 있다.

본 발명에서 "응고 프로모터"는 혈액을 혈전으로 형성시키는 과정을 촉진하는 제제로서 간주될 수 있다.

응고 프로모터로서 유용한 제제는 제올린; 트롬빈; 응고 인자 II, III, VIII, IX, X, XI, XII, XIII와 같은 응고 케스케이드 성분; 칼슘, 비타민 K와 같은 보조인자; 및 유사한 것과 같은 흡착성 화학약품이다. 바람직한 구현예에서, 사용된 응고 프로모터는 인자 VII(전구체 또는 활성형), 인자 X(전구체 또는 활성형) 및 그들의 조합으로부터 선택된다.

본 발명의 약학적 조성물이 정제된 마이크로소포를 포함하는 것이 선호된다 하더라도, 조성물은 실질적으로 정제된 마이크로소포를 포함하는 것이 역시 가능하다. 마이크로소포는 비-마이크로소포 입자성 물질에 대해 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80% 또는 최소한 90%의 마이크로소포를 포함하는 제제를 수득하기 위해 앞에 언급된 방법 중 어느 하나에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양의 TF-함유 마이크로소포를 포함한다. 상기 양은 복용량, 투여 루트 및 그와 유사한 것에 의존하면서 넓은 범위 내에서 다양할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 활성 마이크로소포 약 10μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 300μg/ml, 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 20μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 200μg/ml, 더 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 50μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 100μg/ml을 포함할 수 있다.

대상에게 투여되는 복용량(dose)은 예를 들어, 본 발명의 활성 마이크로소포 약 1.0pg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 1.0mg/ml, 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 0.05μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 100μg/ml, 더 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 0.1μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 50μg/ml의 매우 넓은 범위 내에서 다양할 수 있다. 투여되는 본 발명의 제1 또는 제2 마이크로소포 복용량은 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종의 특징들, 예를 들어 그것의 활성 및 생물학적 반감기, 제형 내에서의 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종의 농도, 대상 또는 환자의 임상학적 조건, 치료되어야 하는 출혈 장애 등을 포함하는 사용된 여러 인자들에 의존할 것이다. 이러한 이유 때문에 언급된 복용량은 당업자에게 오직 안내로만 간주되어야 하고, 당업자는 앞에 언급된 변수들에 따라서 복용량을 조정하여야만 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 약학적 조성물은 예방적 또는 치료적 목적을 위해 하루에 한 번 이상 투여될 수 있다.

TF-함유 마이크로소포가 동결건조되고, 그것은 동물에 투여하기에 앞서 재조립(reassembly)을 위해 용매에 재현탁될 수 있다. 동결건조된 것이 전달되면, 동물의 체내에서 일단 조성물이 친수성 환경에 노출되면 마이크로소포는 자연스럽게 재형성(reform)된다.

본 발명의 제2 약학적 조성물

본 발명의 발명자들은 진핵 세포로부터 얻어진 TF를 포함하는 마이크로소포의 응혈촉진 활성이 응고 프로모터와 소포를 조합하는 것에 의한 상승작용에 의해 향상될 수 있다는 것을 관찰했다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 약학적 조성물에 관한 것이고, 상기 약학적 조성물은,

(i) a) 진핵 세포에서 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 발현하는 단계 및

b) 단계 (i)의 세포로부터 TF-함유 마이크로소포를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 마이크로소포,

(ii) 최소 하나의 응혈을 촉진하는 제제 및

(iii) 약학적으로 유효한 부형제를 포함한다.

용어 "마이크로소포", "TF", "기능적으로 동등한 TF의 변종", "진핵 세포", "응혈을 촉진하는 제제" 및 "약학적으로 유효한 부형제"는 위에 구체적으로 설명되었고 본 발명의 제 2 약학적 조성물의 측면에서 동일한 방법으로 핵심적으로 사용되었다.

본 발명의 제 2 약학적 조성물의 제 1 구성성분은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 마이크로소포이다:

a) 진핵 세포에서 TF 또는 응혈촉진 활성을 가지는 기능적으로 동등한 그것의 변종을 발현하는 단계 및

b) 단계 (ⅰ)의 세포로부터 TF-함유 마이크로소포를 회수하는 단계.

바람직한 실시예에서, 진핵 세포는 이스트 세포이고, 이 경우에 마이크로소포 이스트 멤브레인이 본 발명의 마이크로소포에서 유래된 TF-함유 이스트의 생성에 사용되고, 그 마이크로소포 이스트 멤브레인은 일반적으로 이스트 멤브레인의 부분을 형성하는 지질 및 일반적으로 이스트 멤브레인에 내장되는 것으로 발견되는 단백질을 포함한다. 일반적으로 멤브레인은 단백질이 내장될 수 있는 두 개의 배향된 지질층(즉, 지질 이중층)으로 구성된다. 세포의 멤브레인의 기본 구조인 지질 이중층은 일반적으로 수성 환경에서 양친매성 분자(예, 인지질, 지방산 등)에 의해 형성되고, 각각의 분자는 층의 외부 상의 친수성 그룹 및 층의 내부로의 소수성 그룹으로 배향된다. 마이크로소포는 예를 들어, 이스트 세포 혈장 멤브레인 또는 그것의 단편과 같은 이스트 세포 멤브레인 또는 그것의 단편으로부터 유래한다. 또 다른 특정 실시예에서, 언급된 마이크로소포에서 유래된 이스트는 핵, 골지(Golgi) 장치, 소포체(Endoplasmic reticulum) 등과 같은 세포내 이스트 세포 세포기관(organelles) 멤브레인, 또는 그 단편으로부터 유래한다.

언급된 마이크로소포에서 유래된 이스트는 그것의 생성에 사용된 이스트 세포로부터 일반적으로 진행할 것이다(예, 실시예 1에 개시된 공정에 도시된 바와 같이 이스트 발효 산물을 균질화 처리한 이후). 사실상 임의의 이스트 세포가 상기 마이크로소포에서 유래된 이스트, 유리하게 비-응집성 이스트 세포, 및 바람직하게 인간의 소비를 위해 FDA에 의해 "일반적으로 안전하다고 간주되는(또는 GRAS; Generally Regarded as Safe)" 이스트 세포로서 분류되는 이스트 세포를 생산하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 GRAS 승인된 물질은 인간을 포함하는 동물에게 실질적으로 무해하기 때문에 FDA에 의한 시장 출하전(pre-market) 승인을 요구하지 않는다. 본 발명의 마이크로소포에서 유래된 TF-함유 이스트를 생산하기 위한 공정에 사용될 수 있는 이스트 세포의 설명적인, 비제한적인 예는 양조 물질 액체를 대사작용시키는 것에 의해 알코올, 탄산 가스, 베이커 이스트, 및 그와 유사한 것을 생산하는 소위 리큐어(liquor) 이스트 종이다. 구체적으로, 바람직한 이스트 세포는 S. 세레비시아 균주 T73 ura3-, S. 세레비시아 T73 균주의 유도체, 와인 생산에 광범위하게 사용되는 균주(실시예 1) 또는 피치아 sp.와 같은 사카로미세스 sp. 등으로부터의 이스트 세포를 포함한다.

진핵 세포로부터 마이크로소포를 회수하는 것은 물론 TF 또는 기능적으로 동등한 그것의 변종을 생산하기 위한 적합한 방법이 본 발명의 제 1 방법의 문맥에서 구체적으로 설명되고 본 발명의 제 2 약학적 조성물의 부분을 형성하는 마이크로소포를 얻기 위한 방법에 동일하게 적용가능하다.

용어 "TF"는 위에서 핵심적으로 설명된 바와 같이 기능적으로 동등한 그것의 변종은 물론 임의의 종으로부터의 천연 TF를 포함하고, 위에서 구체적으로 설명된 바와 같이, 성숙한 인간 TF, 끝을 자른 인간 TF, TF의 당화 변종, 태그된 TF 및 C 말단에 헥사히스티딘 태그 및 N124A 돌연변이를 수반하는 성숙한 TF와 같은 위의 변형 중 하나 이상을 수반하는 변종을 포함한다. 바람직한 실시예에서, TF는 성숙한 TF 단백질이다. 더 바람직한 실시예에서, TF는 인간의 성숙한 TF 단백질이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, TF는 C 말단에 헥사히스티딘 태그를 수반 및/또는 N124A 돌연변이를 수반하는 성숙한 인간의 TF이다.

그런 후에 언급된 약학적 조성물은 대상에게 투여하기에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화된다.

사실상, 본 발명의 제 1 또는 제 2 마이크로소포에 역으로 영향을 미치지 않는 임의의 부형제가 언급된 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 언급된 부형제는 실질적으로 본 발명의 공정 수행에 의해 얻어지는 본 발명의 TF-함유 마이크로소포를 둘러싸는 배지와 같은 액체 배지이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 제1 조성물은 본 발명의 공정 수행에 의해 얻어지는 정제된 진핵 추출물을 포함하며, 여기서 음이온 인지질이 첨가된다.

본 발명의 생성물의 투여를 위한 적합한 투여 형태뿐만 아니라 담체 및 첨가제에 대한 정보는 생약학처치법에서 찾을 수 있다. 일반적으로 약물의 상이한 약학적 투여 형태, 및 그들의 제조 공정의 연구검토는 C. Fauli i Trillo에 의한 제1판, 1993, Luzan 5, S.A. of Ediciones인 "Tratado de Farmacia Galenica"("Galenic Pharmacy Treatise")로 명명된 책에서 찾을 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 정제된 마이크로소포를 포함하는 것이 바람직함에도, 그 조성물이 실질적으로 정제된 마이크로소포를 포함하는 것 역시 가능하다. 마이크로소포는 비-마이크로소포 입자성 물질에 대해 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80% 또는 최소한 90% 마이크로소포를 포함하는 제제를 수득하도록 위에 언급된 방법 중 어느 하나에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 제 2 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 TF-함유 마이크로소포를 포함한다. 상기 양은 복용량, 투여 루트 및 그와 유사한 것에 의존하면서 넓은 범위 내에서 다양할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 활성 마이크로소포 약 10μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 300μg/ml, 바람직하게는 본 발명의 활성 단백질 20μg/ml 내지 본 발명의 활성 단백질 200μg/ml, 더 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 약 50μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 100μg/ml을 포함할 수 있다.

대상에게 투여되는 복용량(dose)은 예를 들어, 본 발명의 활성 마이크로소포 약 1.0pg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 1.0mg/ml, 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 0.05μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 100μg/ml, 더 바람직하게는 본 발명의 활성 마이크로소포 약 0.1μg/ml 내지 본 발명의 활성 마이크로소포 50μg/ml의 매우 넓은 범위 내에서 다양할 수 있다. 투여되는 본 발명의 제1 또는 제2 마이크로소포 복용량은 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종의 특징들, 예를 들어 그것의 활성 및 생물학적 반감기, 제형 내에서의 TF 단백질 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종의 농도, 대상 또는 환자의 임상학적 조건, 치료되어야 하는 출혈 장애 등을 포함하는 사용된 여러 인자들에 의존할 것이다. 이러한 이유 때문에 언급된 복용량은 당업자에게 오직 안내로만 간주되어야 하고, 당업자는 앞에 언급된 변수들에 따라서 복용량을 조정하여야만 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 약학적 조성물은 예방적 또는 치료적 목적을 위해 하루에 한 번 이상 투여될 수 있다.

본 발명의 제 2 약학적 조성물은 동결건조된 형태로 제공될 수 있고, 여기서 하나 이상의 구성성분이 동결건조된다. 당업자는 그 조성물이:

- 동결건조된 마이크로소포 및 현탁액인 응고 프로모터,

- 현탁액인 마이크로소포 및 동결건조된 응고 프로모터,

- 동결건조된 마이크로소포 및 동결건조된 응고 프로모터와 같은 다른 형태로 제공된다는 것을 인지할 것이다.

여기서 마이크로소포 및 응고 프로모터 모두는 동결건조된 형태로 제공되고, 두 구성성분 모두는 단일 제제로 결합될 수 있고 또는 별개의 컨테이너에 제공될 수 있다. 여기서 TF-함유 마이크로소포가 동결건조되고, 그들은 동물에 대한 투여 전에 재조립을 위해 용매에 재현탁될 수 있다. 동결건조된 것이 전달될 때, 동물의 체내에서 일단 조성물이 친수성 환경에 노출되면 마이크로소포는 자연스럽게 재형성된다. 유사하게, 응고 프로모터가 동결건조되고, 동물에 대한 투여 전에 재결합을 위해 용매에 재현탁될 수 있다. 동결건조된 것이 전달될 때, 응고 프로모터는 동물의 체내에서 친수성 환경에 노출될 때 복원된다.

본 발명의 치료적 용도

혈액 응고(clotting)-관련된 용도

다른 분석은 음이온 인지질로 처리되는 TF-함유 마이크로소포를 포함하는 본 발명의 마이크로소포가 향상된 응혈촉진 활성 및 증가된 안정성을 가진다는 것을 나타낸다. 실시예 2는 본 발명의 마이크로소포가 건강한 환자로부터의 혈장 및 혈액을 포함하는 건강한 조건과 환자 조건 모두에서 피브린 혈전 형성 및 혈액 응고를 야기한다는 것을 나타내는 인 비트로 분석을 보여주고, 여기서 혈장 및 혈액은 혈우병 환자, 빌러브란트씨 병 환자 및 와파린 처치된 환자로부터의 혈액은 물론, FVIII, FIX 또는 FXI가 결핍된 혈장(혈장에서의 응고 분석); 후천성 혈소판 결핍을 나타내는 환자로부터의 혈액(혈소판감소성 혈액에서의 응고 분석), 항-FVII 항체의 존재 하에서 FXI가 결핍된 혈장(혈장에서의 응고분석)이다. 이들 결과는 본 발명의 마이크로소포로부터 유래된 TF-함유 이스트가 대상에서의 출혈의 국소 치료에 유용한 응고촉진제 또는 지혈제라는 것을 분명히 보여준다.

따라서 또 다른 측면에서, 본 발명의 마이크로소포 및 본 발명의 약학적 조성물은 대상에서의 출혈의 치료에서, 약제, 즉, 응고촉진제로서 또는 지혈제로서, 특히, 국소 적용을 위한 지혈제로서 사용될 수 있다. 그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 약제로서의 사용을 위한 본 발명의 제 1 또는 제 2 마이크로소포에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 출혈의 치료에서의 사용을 위한 본 발명의 마이크로소포 또는 조성물은 물론 대상에서의 출혈의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 마이크로소포 또는 조성물의 사용을 위해 언급된 대상에 대한 본 발명의 마이크로소포 또는 조성물의 투여를 포함하는 대상에서의 출혈의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 마이크로소포는 이들 마이크로소포가 실질적으로 대상에게 무해하기 때문에, 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하지 않고, 즉, 대상에서 출혈의 치료를 위해 국소적으로 직접 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 마이크로소포가 투여, 바람직하게 출혈의 국소(국부)적 치료를 위한 국소적 투여에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화되는 것이 일반적으로 바람직하다.

그런 후에, 본 발명의 마이크로소포는 약학적 투여 형태, 바람직하게 국소 투여에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화될 수 있고, 요구되는 약학적 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 첨가제가 병합될 것이다. 본 발명의 생성물의 투여를 위한 적합한 투여 형태뿐만 아니라 담체 및 첨가제에 대한 정보는 생약학처치법에서 찾을 수 있다. 일반적으로 약물의 상이한 약학적 투여 형태의 연구검토, 및 그들의 제조 공정의 연구검토는 C. Fauli i Trillo에 의한, 제1판, 1993, Luzan 5, S.A. of Ediciones인 "Tratado de Farmacia Galenica"("Galentic Pharmacy Treatise")로 명명된 책에서 찾을 수 있다.

본 발명의 마이크로소포의 다른 약학적 투여 형태가 사용될 수 있음에도, 상기 생성물을 국소적으로 투여하는 것이 실시에서 가장 유리하고; 그러므로 언급된 본 발명의 제 1 또는 제 2 마이크로소포는 국소적 투여에 적합한 약학적 형태로 제형화될 것이다. 언급된 약학적 형태의 설명적인, 비-제한적인 예는 에어로졸, 용액, 현탁액, 에멀전, 겔, 살베(salve), 크림, 드레싱, 패치, 연고, 구강세정제 등을 포함한다. 끝으로 본 발명의 제 1 및 제 2 약학적 조성물은 국소적 투여를 위한 본 발명의 마이크로소포의 약학적 투여 형태를 제조하기 위해 요구되는 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 첨가제를 포함할 것이다.

그러므로, 특정 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 언급된 생성물 및 본 발명의 언급된 마이크로소포의 국소적 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 첨가제를 포함하는 본 발명의 마이크로소포의 국소적 투여를 위한 약학적 조성물이다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 마이크로소포의 국소 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 첨가제의 설명적인, 비-제한적인 예는 생약학처치법에서 찾을 수 있다.

본 발명의 마이크로소포 및 그것의 조합 및 본 발명의 약학적 조성물 또는 그것의 조합은 병용 요법을 제공하도록 출혈 소질(예, 응고 인자, 인간 혈장 등)의 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 추가적인 약물과 함께 사용될 수 있다. 언급된 추가적인 약물은 동일한 약학적 조성물의 일부일 수 있고, 또는 대안적으로 그들은 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 대한 동시 또는 연속(시간에서 순차적인) 투여를 위해 별개의 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 지지체 상에 위치될 수 있다. 그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물 또는 그것의 조합 및 지지체를 포함하는 생성물에 관한 것이다. 여기에 사용된 용어 "지지체"는 요구되는 위치, 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물이 치료적 효과를 나타내는 위치에서 본 발명의 약학적 조성물을 증착시키는 것, 그것의 전달 및 그것의 릴리스를 허용하는 적합한 물질의 기판을 말한다. 언급된 지지체는 솔리드 지지체 또는 예를 들어, 액상 지지체 또는 가스 지지체와 같은 논-솔리드 지지체일 수 있다. 솔리드 지지체의 설명적인, 비-제한적인 예는 드레싱, 밴드-에이드, 컴프레스, 플라스터 등을 포함한다. 액상 지지체의 설명적인, 비-제한적인 실시예는 겔, 스프레이, 구강세정제 등을 포함한다. 가스 지지체의 설명적인, 비-제한적인 예는 에어, 압축가스(propellants) 등을 포함한다. 본 발명의 마이크로소포를 포함하는 이러한 생성물 또는 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 방법에 의해 예를 들어, 본 발명의 마이크로소포 및 지지체를 혼합하는 것에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 마이크로소포 및 지지체 사이의 상호작용은 본 발명의 소포, 조성물 또는 약학적 조성물의 구성성분의 성질에 따라서 그리고 사용되는 지지체에 따라서 물리적 또는 화학적 상호작용일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상에서 출혈의 치료를 위한, 특히, 건강한 대상에서 또는 출혈 소질을 갖는 대상에서 출혈의 국소 치료를 위한 본 발명의 마이크로소포 또는 본 발명의 약학적 조성물 또는 그들의 조합에 관한 것이다.

여기에 사용된 용어 "국소적 치료"는 요구되는 곳에서 예를 들어, 피부의 불연속적인 절개(컷(cut) 등)와 관 조직의 불연속적인 절개(파열된 혈관 등)에서, 개방성 상처, 수술 등으로 인한 정맥 및 동맥에서의 출혈에서 그리고 점막피부 출혈과 미세혈관 출혈에서 직접적인 치료의 적용을 말한다.

본 발명에 따라서 그리고 실시예 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 마이크로소포는 응고촉진제 또는 지혈제로서 작용할 수 있고 결과적으로, 언급된 생성물은 출혈성 장애, 특히 출혈 소질과 연관된 이들 출혈성 장애를 치료하거나 바로잡도록 사용될 수 있다.

용어 "출혈 소질"은 지혈성 장애를 야기하는 프로세스를 말하고, 결과적으로, 종종 확장되고 계속적인 출혈이 발생할 수 있는 출혈성 증후군을 발생시킨다. 출혈 소질은 선천적 또는 후천적 응고장애에 의해 또는 선천적 및 후천적 혈소판 장애에 의해 야기될 수 있다.

용어 "응고장애"는 응고 인자 장애를 말한다. 이 장애는 특정 응고 인자 결핍 또는 부족으로 인한 것일 수 있고, 그 결과는 응고 인자 장애로 인한 출혈성 증후군의 발생일 것이다. 응고장애는 일반적으로 선천성 응고장애 또는 후천성 응고장애일 수 있다.

선천성 응고장애의 설명적인, 비-제한적인 예와 같이, 응고 인자 V(FV), 응고 인자 VII(FVII), 부족 또는 결핍이 혈우병 A를 야기하는 응고 인자 VIII(FVIII)로부터 선택된 응고 인자의 결핍, 부족 및 결핍이 혈우병 B를 야기하는 응고 인자 IX(FIX), 응고 인자 X(FX), 부족 또는 결핍이 혈우병 C를 야기하는 응고 인자 XI(FXI), 응고 인자 XII(FXII), 응고 인자 XIII(FXIII) 및 그들의 조합이 언급될 수 있다.

후천성 응고장애는 다른 기원을 가질 수 있다. 설명적인 예는 심각한 간부전, 항응고제 치료(헤파린, 낮은 분자 중량 헤파린, 와파린, 쿠마린 유도체, 디쿠마린 등)에서의 응고 인자 합성 결핍을 포함한다. 대안적인 메카니즘은 응고 인자가 출혈 병변에서 혈전을 형성하는 것이 이용가능하지 않는 바와 같이 응고 인자의 지나친 소비에 기반한다. 이 메카니즘은 복합 마이크로트롬비(microthrombi)의 형성으로 혈소판과 응고 인자를 활성화시키는 미소순환 내피를 손상시키는 심각한 폐혈증에서와 같은 복합성 질병에서; 태반 릴리스와 같은 TF에 의한 혈액 침습에서; 죽은 태아의 리텐션에서; 조직의 충돌로 인한 복합적인 트라우마에서; 독사 물림 등에서 발생하는 소비로 인한 파종성 혈관내 응고 증후군 또는 응고장애에서 발생한다. 혈관염에서, 체벽 손상과 내피 손상은 응고 활성제를 방출한다. 응고 인자의 소비는 항혈소판제 및 항응고제인 PDF 방출과의 플라스민의 작용으로 인한 많은 마이크로트롬비의 피브린의 용해(lysis)에 의해 악화된다.

용어 "혈소판 장애"는 혈소판의 수와 기능적 능력 모두에서의 장애를 말하고, 그것의 결과는 출혈성 증후군의 발생이다. 언급된 혈소판 장애는 선천적이거나 후천적일 수 있다.

특정 실시예에서, 언급된 혈소판 장애는 선천적 혈소판 장애이다. 선천적 혈소판 장애의 설명적, 비-제한적인 예는 글란즈만(Glanzmann's) 질병, 베르나르 술리에 질병, 볼린-제이미슨 증후군, 위스코트-알드리치 증후군, 패리스-트루소-자콥슨(Paris-Trousseau-Jacobsen) 증후군, X 염체체 혈소판 감소증, 그레이 혈소판 증후군, 세바스티안 증후군 및 판코니 빈혈을 포함한다.

또 다른 특정 실시예에서, 언급된 혈소판 장애는 후천성 혈소판 장애이다. 후천성 혈소판 장애의 설명적인, 비-제한적인 예는 혈소판혈병, 적혈구증가증, 골수성 백혈병 등과 같은 골수증식성 장애를 포함한다; 증가된 출혈 시간, 글래스 비드 리텐션 결함, 혈소판 응집 결함, 비정상적인 릴리스, 및 혈소판 인자 III 결함을 갖는 골수성 화생에서의 기능적인 혈소판 장애가 있다. 기능적인 혈소판 결함은 괴혈병에서의 이상단백혈증에서 그리고 선천성 심장 질환 및 간경변에서 발견된다.

용어 "후선성 응고장애" 및 "후천성 혈소판 장애"는 다른 질병에 대한 의료원성 또는 이차성일 수 있는 장애의 기원을 말한다.

여기에 사용된 용어 "대상"은 인간 종을 포함하는 동물 종의 임의의 멤버를 포함한다; 설명적인, 비-제한적인 예시의 방식에 의해, 언급된 대상은 영장동물, 가축, 설치류 등과 같은 포유류일 수 있다; 언급된 대상은 바람직하게 임의의 나이 및 인종의 남성 또는 여성이다. 특정 실시예에서, 언급된 대상은 어떠한 응고장애 또는 혈소판 장애도 갖지 않는 개인과 같이, 어떠한 지혈 장애의 히스토리도 갖지 않는 인간이다. 또 다른 특정 실시예에서, 언급된 대상은 예를 들어, 선천성 응고장애 또는 후천성 응고장애와 같은 응고장애, 또는 선천성 혈소판 장애 또는 후천성 혈소판 장애와 같은 혈소판 장애와 같은 출혈 소질을 갖는 개인과 같이, 지혈 장애의 히스토리를 갖는 인간이다.

그러므로, 특정 실시예에서, 본 발명은 어떠한 지혈 장애의 히스토리도 갖지 않는 인간에서의 출혈의 국소 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 마이크로소포 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 특정 실시예에서, 본 발명은 출혈 소질을 갖는 인간에서 출혈의 국소 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 마이크로소포 또는 본 발명의 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

상처 치료-관련된 용도

혈액 응고에서의 역할에 더해서, TF는 상처 회복 및 치료를 촉진한다(Nakagawa, et al. (1998) Seminars in Thromb. and Hemostasis 24:207-210; Philippart, et al.(2003) The Internatl.J. of Oral and Maxillofacial Implants 3:411-416).

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 상처 치료의 처리를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 마이크로소포 또는 본 발명의 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 상처 치료의 처리를 위한 약제의 제조에서의 사용을 위한 본 발명의 마이크로소포 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 본 발명의 마이크로소포 또는 본 발명의 약학적 조성물의 언급된 대상에의 투여를 포함하는 환자의 상처 치료의 처리를 위한 방법에 관한 것이다.

표현 "상처 치료"는 임의의 지점에서 임의의 종류의 상처 치료에 관한 것이다. 그것은 정상적일 수 있고 상처 치료를 악화시킬 수 있다. 후자는 특히 좋지않게 치료중인 위궤양은 물론 당뇨병(diabetes mellitus), 혈관염, 동맥 폐색 질환, 만성 정맥 및/또는 감염된 궤양과 같은, 질병의 경우에 발견된다. 손상된 상처 치료는 또한 대마비(paraplegia), 나병, 신경병증(neuropathy) 등과 같은 신경 손상, 및 치료의 필요에 따라서 사람의 욕창성 괴저(decubital gangrene)의 경우에 발견된다. 손상된 상처 치료는 또한 수술 특히, 장의 수술 및 피부 및 다른 기관 각각의 이식 후에 약화된 봉합과 손상된 치료가 발생한다면 이루어질 것이다. 손상된 상처 치료는 또한 골절, 화상, 스테로이드를 사용하는 치료의 경우에 발견된다.

본 발명에서 "상처 치료" 또는 "상처 회복"은 피부(또는 일부 다른 기관)가 부상 후에 회복하는 복잡한 프로세스를 말한다. 여기서 사용된 "상처"는 예를 들어, 지연되거나 또는 치료하기 어려운 상처, 및 만성 상처를 포함하는 임의의 조직에 대한 부상을 포함한다. 상처의 예는 개방성 및 폐쇄성 상처 모두를 포함할 수 있다. 용어 "상처"는 또한 예를 들어, 다른 방식으로 시작된 피부 및 피하 조직에 대한 부상(예, 연장된 와식 요양(extended bed rest)으로부터의 욕창 및 트라우마에 의해 유도된 상처) 및 변화하는 특성을 갖는 피부 및 피하 조직에 대한 부상을 포함할 수 있다. 상처는 상처의 깊이에 따라서 네 개의 등급 중 하나로 분류될 수 있다: i) 등급 Ⅰ 상처는 상피로 한정된다; ⅱ) 등급 Ⅱ 피부로 확장하는 상처; ⅲ) 등급 Ⅲ 피하 조직으로 확장하는 상처; 및 ⅳ) 등급 Ⅳ 뼈가 노출되는 상처(또는 전-두께(full-thickness) 상처)(예, 더 큰 전자(trochanter) 또는 천골(sacrum)과 같은 뼈가 드러나는 압력 포인트).

용어 "만성 상처"는 일반적으로 치료되지 않는 상처를 말한다. 예를 들어, 3개월 내에 치료되지 않는 상처는 만성으로 간주된다. 만성 상처는 정맥 궤양, 울혈성 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양, 당뇨병성 궤양, 당뇨병성 족부(foot) 궤양, 혈관염성 궤양, 욕창 궤양, 화상 궤양, 트라우마-유도성 궤양, 전염성 궤양, 혼합된 궤양, 및 괴저성 농피증을 포함한다. 만성 상처는 완전한 또는 부분적인 동맥 장애로부터 초래하는 궤양화를 포함하는 동맥 궤양일 수 있다. 만성 상처는 정맥판 및 연관된 관의 질환의 오기능으로부터 초래하는 궤양화를 포함하는 정맥 궤양 또는 정맥 울혈성 궤양일 수 있다. 특정 실시예에서 만성 상처를 치료하는 방법은 만성 상처가 다음의 압박 궤양화의 AHCPR 스테이지: 스테이지 1, 스테이지 2, 스테이지 3, 및/또는 스테이지 중 하나 이상에 의해 특징화되는 곳에 제공된다.

여기서 사용되는 바와 같은, 만성 상처는 예를 들어 (1) 상처 염증의 만성적 자체-영구화 상태(self-perpetuaiting state), (2) 결핍된 그리고 결함이 있는 상처 세포외 매트릭스, (3) 세포외 매트릭스에 제한되는, 반응이 열악한(노쇠) 상처 세포 특히 섬유아세포, 및/또는 (4) 필요한 세포외 매트릭스오케스트레이션(matrixorchestarion)의 부족 및 이동을 위한 스캐폴드의 부족에 기인한 부분에서의 재-상피화의 실패 중 하나 또는 그 이상에 의해 최소한 부분적으로 특징지어지는 상처를 의미한다. 상처는 또한 1) 예를 들어, 당뇨, 압박(욕창), 정맥 및 동맥 궤양을 포함한 궤양화 병소로 유도하는 장기적 염증 및 단백질가수분해 작용, 2) 감염된 부위의 매트릭스의 점진적 증착, 3) 길어진 회복 시간, 4) 감소된 상처 수축, 5) 느려진 재-상피화 및 6) 육아(granulation) 조직의 두께 증가에 의해 특징지어질 수 있다.

전형적인 만성적 상처는 "압박성 궤양(pressure ulcers)"을 들 수 있다. 전형적 압박성 궤양으로는 AHCPR(Agency for Health Care Policy and Research, U.S. Department of Health and Human Services) 가이드 라인을 근거로 한 4 스테이지로 분류될 수 있다. 스테이지 1 압박성 궤양은 온전한 피부의 관측가능한 압력 관련 변화이며, 신체의 인접 또는 대응 병소와 비교한 그것의 인디케이터로는 다음의 하나 또는 그 이상의 변화를 들 수 있다. 피부 온도(온기 또는 냉기), 조직 일관성(단단한 또는 패인 느낌) 및/또는 감각(고통, 가려움)을 들 수 있다. 궤양은 가볍게 착색된 피부의 적색이 지속되는 한정된 영역으로 나타날 수 있으며, 이에 따라, 어두운 톤의 피부에서는, 궤양은 적색, 청색, 또는 자주색 색조가 지속되는 것으로 보인다. 스테이지 1 궤양화는 온전한 피부의 비창백 홍반(nonblanchable erythema) 및 피부 궤양화의 전조(heralding) 병소를 들 수 있다. 피부가 어두운 개인에서는, 피부의 변색, 온기(warmth), 부종(edema), 경결(induration) 또는 경도(hardness)가 스테이지 1의 인디케이터가 될 수 있다. 스테이지 2의 궤양화는 상피, 진피, 또는 이들 모두를 포함하는 피부의 부분적 두께 손실에 의해 특징지워 질 수 있다. 궤양은 표면상에서 찰과상, 물집 또는 얕은 크레이터(crater)로서 임상적으로 나타난다. 스테이지 3의 궤양화는 하부(underlying) 근막(fascia)을 통하지 않지만 하부 근막으로 연장될 수 있는 피하 조직의 손상 또는 괴사를 포함한 피부 전체 두께 손실에 의해 특징지어진다. 궤양은 인접한 조직을 악화시키거나 또는 그렇지 않은 깊은 크레이터로서 임상적으로 나타난다. 스테이지 4 궤양화는 근육, 뼈, 또는 지지 구조(예컨대, 힘줄, 관절 주머니)에 대한 넓은 파괴, 조직 괴사, 또는 손상(damage)을 동반한 피부 전체 두께의 손실에 의해 특징지어진다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 압박성 궤양화의 다음 AHCPR 스테이지, 스테이지 1, 스테이지 2, 스테이지 3 및/또는 스테이지 4의 하나 또는 그 이상에 의해 특징지어지는 상처 치료 방법을 제공한다.

또한 전형적인 만성 상처로는 "욕창(decubitus ulcers)"을 들 수 있다. 전형적인 욕창은 허혈(ischemia)로 유도하는 뼈 돌기(bony prominence)에 대한 오랜 구제할 수 없는 압박의 결과로서 야기될 수 있다. 이러한 상처는 마비되고, 의식이 없거나 또는 극심하게 약화된 사람과 같이 오프-로드(off-load) 체중에 대해 스스로 재위치를 잡을 수 없는 환자에게 발생하는 경향이 있다. 미보건복지부(U.S Department of Health and Human Services)에 의해 규정된 바와 같이, 주요한 예방적 판단은 고위험 환자를 확인하는 것을 들 수 있는데, 빈번한 평가, 및 스케쥴을 가진 리포지셔닝, 적절하게 압박을 해제하는 베딩(bedding), 수분 장애, 및 적절한 영양 상태와 같은 예방적 판단을 들 수 있다. 처치 옵션으로는 예를 들어, 압박 해제, 수술 및 효소성 오염 삼출물 제거(enzymatic debridement), 수분 상처 케어, 및 박테리아 로드(bacterial load)의 제어를 들 수 있다. 특정 구현예에서, 상처는 허혈을 야기하는 뼈 돌기에 대한 오래도록 구제할 수 없는 압박으로 야기되는 욕창 또는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처를 치료하는 방법이 제공될 수 있다.

또한 만성 상처로는 "동맥성 궤양(arterial ulcers)"을 들 수 있다. 만성 동맥성 궤양은 일반적으로 동맥경화 및 고혈압 심혈관 질환을 수반하는 궤양화인 것으로 이해된다. 그들은 고통스럽고, 날카롭게 가장자리가 있으며(marginated), 종종 하부 측 사지 및 발가락에서 발견된다. 동맥성 궤양은 완전 또는 부분적 동맥 폐색에 의해 특징지어지는데, 이것은 조직 괴사 및/또는 궤양화로 유도할 수 있다. 동맥성 궤양의 증상으로는 예를 들어, 사지에 무맥박, 고통을 수반한 궤양화, 통상적으로 국한성인 작은 반점 궤양, 차거나 또는 싸늘한 피부, 지연된 모세관 회복 시간 (발가락의 끝을 간단하게 밀고, 릴리스하고, 정상적인 색이 약 3초 또는 그 이하에서 회복됨), 위축이 보이는 피부(예를 들어, 빛나는(shiny), 마른(thin), 건조한(dry)) 및 디지털(digital) 및 페달 헤어(pedal hair)의 손실을 들 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 완전 또는 부분적 동맥 폐색으로 인한 동맥성 궤양 또는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처를 치료하는 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처로는 "정맥성 궤양(venous ulcers)"을 들 수 있다. 전형적인 정맥성 궤양은 하부 사지에 영향을 미치는 궤양의 가장 통상적인 타입이며, 정맥판(venous valve)의 기능 저하에 의해 특징지어질 수 있다. 정상 정맥(normal vein)은 혈액의 역류를 방지하는 판을 구비한다. 이들 판이 무능력해질 때, 정맥 혈액의 역류가 컨제스천(congestion)을 야기한다. 적혈구로부터 헤모글로빈이 빠져나와서 혈관 밖 공간으로 누출되어, 갈색을 띈 변색이 통상적으로 주목되도록 한다. 정맥성 궤양을 에워싸는 피부의 경피성(transcutaneous) 산소 압력이 감소되어, 부위(area)의 정상적 맥관질(vascularity)을 패색시키는 힘이 있는 것으로 보인다. 또한 림프순환(lymphatic drainage) 및 플로우는 이들 궤양에서 역할을 한다. 정맥성 궤양은 안쪽 복사뼈 근처에 나타나며 통상적으로 부종 및 하부 사지의 경화를 동반하여 일어나며, 얕지만, 고통을 주지 않을 수도 있고, 감염된 부위로부터 위핑 방출(weeping discharge)이 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 정맥판의 기능이상 및 관련된 맥관 질환으로 인해, 정맥성 궤양 또는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 완전하거나 또는 부분적인 정맥 패색으로 인한 정맥성 궤양 또는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처 치료 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처로 "정맥성 울혈 궤양(venous stasis ulcers)"을 들 수 있다. 울혈 궤양은 정맥의 기능부전과 관련된 병소이며, 더 통상적으로 안쪽 복사뼈에 걸쳐 부종, 정맥류종창(varicosities), 반점 색소, 홍반, 및 뚜렷하지 않은(nonpalpable) 점상 출혈(petechiae) 및 자반병(purpura)을 나타낸다. 체성(statis) 피부염 및 궤양은 일반적으로 고통스럽기 보다는 가려움증을 일으킨다. 전형적인 정맥 울혈 궤양은 하부 사지의 만성적 패시브 정맥 컨제스천에 의해 특징지어지며, 국소적 저산소증을 가져온다. 이들 상처의 발병의 가능한 메카니즘으로는 두꺼운 혈관 주위의 피브린 커프(fibrin cuffs)를 가로질러 조직으로 산소가 확산되는 장애를 들 수 있다. 다른 메카니즘은 혈관주위의 조직으로 누출되는 거대분자가 피부 온전성을 유지하는데 필요한 성장 요소를 위험하게 하는 메카니즘이다. 부가적으로 큰 백혈구는 정맥 컨제스천으로 인해 천천히 움직여서, 모세관을 폐색시키고, 활성이 시작되고, 그리고 맥관 내피가 손상되어 궤양이 형성되게 한다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 정맥판의 기능저하 및 관련 맥관 질환으로 인한 정맥성 궤양 및 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 하부 사지의 만성적 패시브 정맥 컨제스천 및/또는 결과된 국소적 저산소증으로 인한 정맥 울혈 궤양 또는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처를 치료하는 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처로는 "당뇨성 궤양(diabetic ulcers)"을 들 수 있다. 당뇨 환자는 신경 및 맥관 합병증으로 인해 발 궤양화를 포함하는 궤양화를 겪기 쉽다. 말초신경장애는 팔 및/또는 다리에서 감각의 완전한 상실 또는 변경을 야기할 수 있다. 신경장애가 진행된 환자는 예리함-둔함 식별(통각, sharp-dull discrimination)에 대한 모든 능력을 손실한다. 발에 대한 소정의 컷(cuts) 또는 트라우마는 신경장애를 갖는 환자에게는 수일 또는 수주 동안 완전히 눈에 띄지 않고 지나갈 수 있다. 신경장애를 겪는 환자가 사실상 궤양이 상당한 시간 동안 존재했을 때 궤양이 나타나자마자 바로 주목하는 것은 드물지 않다. 신경장애가 있는 환자에 있어서, 글루코스의 철저한 제어는 질환의 진행을 늦추는 것으로 알려져 있다. 또한 샤르코 발(charcot foot) 기형은 감각이 저하된 결과에 따라 발생할 수 있다. 그들의 발에서 정상적인 느낌을 가진 사람은 매우 높은 압력이 팔의 어떤 영역에 놓일 때 자동적으로 감지하는 능력을 갖는다. 확인이 될 때, 우리의 몸은 위치를 이 스트레스를 없애도록 본능적으로 쉬프트한다. 신경장애가 진행된 환자는 가해지는 압력을 겪는 것을 감지하는 능력이 손상되어, 그 결과, 조직 허혈 및 괴사가 발생되어, 예를 들어 발바닥 궤양화를 유발한다. 추가적으로, 발 뼈의 마이크로 골절이 감지되지 않고 치료되지 않는다면, 미관손상, 만성적 부종(swelling) 및 추가 뼈 돌기를 가져올 수 있다. 미세혈관 질환은 또한 궤양화를 유도할 수 당뇨병에 대한 중요한 합병증 중 하나이다. 특정 구현예에서, 만성 상처는 당뇨병의 신경장애 및 맥관 모두의 합병증으로 인해 당뇨 발 궤양 및/또는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처 치료 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처는 "트라우마성 궤양(traumatic ulcers)"을 들 수 있다. 트라우마성 궤양의 형성은 몸에 대한 트라우마성 부상의 결과로서 발생될 수 있다. 이들 부상은 예를 들어, 동맥, 정맥 또는 림프 시스템에 대한 타협(compromises); 골격의 골 구조의 변화; 조직 층-상피, 피부, 피하 연조직, 근육 또는 뼈의 손실; 몸의 부분 또는 기관에 대한 손상 및 몸의 부분 또는 기관의 손실이 포함한다. 특정 구현예에서, 만성 상처는 몸에 대한 트라우마성 부상과 관련된 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처 치료 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처로 "화상 궤양(brun ulcers)"을 들 수 있는데, 이것은 제 1도 화상(예컨대, 피부 표면의 붉은 부분); 제2도 화상(수포 유체가 제거된 후에 자발적으로 치유될 수 있는 수포 부상 부위); 제3도 화상(전체 피부에 대한 화상이고 통상적으로 상처 치유를 위한 수술적 개재(intervention)를 필요로 함); 스켈딩(scalding)(델 정도의 고온수, 그리스 또는 라디에이터 유체로부터 발생할 수 있음); 열적 화상(불꽃으로부터 발생, 통상적으로 깊은 화상); 화학적 화상(산 및 알칼리부터 발생, 통상적으로 깊은 화상); 전기적 화상(가정 주변에서는 낮은 전압 또는 작업장에서는 높은 전압 중 하나); 폭발 플래시(통상적으로 표면적인 부상); 및 접촉 화상(통상적으로 깊으며 머플러 테일 파이프, 고온 철 빛 스토브로부터 발생)을 들 수 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처는 몸에 상해를 가하는 화상에 관련된 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처를 치료하는 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처로 "맥관성 궤양(vasculitic ulcers)"을 들 수 있다. 또한 맥관성 궤양은 하부 사지상에 발생되며 날카롭게 가장가리가 있는 병소이며, 뚜렷한 자반병(purpuras) 및 출혈성 수포와 관련될 수 있다. 콜라겐 질환, 폐혈증, 및 다양한 혈액학적 질환(혈소판감소증, 이상단백혈)은 매우 심한 급성 조건의 원인이 될 수 있다.

전형적인 만성 상처로는 "괴저농피증(pyoderma gangrenosum)"을 들 수 있다. 괴저농피증은 단일 또는 복합적으로, 다리 아래쪽의 매우 연한 궤양을 발생시킨다. 깊은 적색에서 자주색의, 약화된 경계가 화농성 중앙 결함부를 에워싼다. 생체 조직 검사로는 일반적으로 맥관염을 검출하는 데는 실패한다. 절반의 환자에게서, 이것은 궤양성 대장염, 국부적 회장염(ileitis) 또는 백혈병과 같은 전신 질환과 관련된다. 만성 상처가 괴저농피증과 관련된 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처 치료 방법이 제공된다.

전형적인 만성 상처로는 "감염성 궤양(infectious ulcers)을 들 수 있다. 감영성 궤양은 다양한 기관에 직접 접종으로 잇따르고 중요한 국소 선병증으로 연결될 수 있다. 마이코박테리아 감염, 탄저병, 디프테리아, 블라스토마이오시스(blastomyosis), 스포로트리쿰증, 야토병, 및 묘소열이 예이다. 제1기 매독의 생식기 궤양은 일반적으로 깨끗하고 단단한 베이스가 있으며 부드럽지 않다. 연성 하감 및 서혜부 육아종은 해지고, 지저분하고 더 과장된 병소(extravagant lesion)가 되는 경향이 있다. 특정 구현예에서, 만성 상처가 감염으로 연결되는 궤양화에 의해 특징지어지는 만성 상처의 치료 방법이 제공된다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "열개성 상처(dehiscent wound)"는 대개 파열 또는 벌어진 수술 상처를 의미한다. 특정 구현예에서, 상처가 봉합의 터져 벌어짐(dehiscence)에 의해 특징지어지고 예상된 비율로 치유되지 않는 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

혈관형성-관련된 용도

혈액 응고에서 그것의 역할에 더해, TF는 혈관형성에서 역할을 한다. 이는 TF가 유전적으로 녹아웃된 쥐에서 혈관 생성의 실패에 기인하여 배아기(embryonic day) 9-10일을 넘어 생성하는 것이 불가능하다는 것을 알았을 때 발견되었다(Carmeliet, et al., 1996, Nature 383:73-75; Bygge et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93:6258-6263; Toomey, et al., 1996, Blood 88: 1583-1587). 또한 응고 프로테아제의 활성화가 혈관형성을 자극하는 혈관내피 성장 인자의 증가된 생성을 유도하는 프로테아제 활성화된 리셉터의 활성화를 이끌 수 있다는 것이 또한 연구에서 입증되어 있다(Richard, et al., 2002, Oncogene 20: 1556-1562; Milia, et al., 2002, Cird. Res. 91:346-352). 또한, 종양 세포에서 TF의 과발현(over-expression)은 종양 성장, 혈관신생 및 전이를 촉진한다(Mueller, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89: 11832-11836).

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 결핍된 혈관형성에 관련되는 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 제1 또는 제2 마이크로소포 또는 그들의 조합의 용도, 본 발명의 제1 또는 제2 조성물의 또는 그들의 조합의 용도, 또는 본 발명의 제1 또는 제2 약학적 조성물 또는 그들의 조합의 용도에 관한 것이다.

혈관형성은 새로운 혈관 또는 림프관을 미리-존재하는 혈관으로부터 생성시켜 형성하는 것에 의한 공정이다. 용어 "결핍된 혈관형성에 관련된 질병"은 여기서 사용된 대로, 혈관 형성 활성화에 의해 치료될 수 있는 질병을 의미한다. 표현 "혈관 형성"은 어떠한 종류 및 어떠한 부위의 혈관 형성을 의미한다. 혈관 형성의 촉진은 많은 임상적 조건에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 혈관형성 촉진 TF-함유 마아크로소포는 허혈성 질병 심근경색 중 또는 그 다음에, 또는 관상동맥 바이패스 수술 다음에 심근 조직에서 병립맥관구조의 혈관형성을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 TF-함유 마이크로소포의 공급에 의해 치료될 수 있는 다른 질병 또는 조건은 말초 또는 중앙 신경계의 병적 측면을 일으키는 맥관 질병 및/또는 허혈성 질병을 포함한다. 그러한 조건/질병은 예를 들어 혈전 폐색(clot occulusion) 또는 동맥류 파열에 의해 야기되는 뇌혈관 장애, 또는 신경세포사 또는 운동 기능 또는 감각 기능에서와 같은 말초 기능성 손상 또는 언어능력 손상을 일으키는 전신성/국부성 허혈, 허혈성 심근증, 또는 만성 사지허혈 파행(limb ischemia claudication)(골격성 근육)과 같은 말초 동맥 질병, 나머지 고통/허혈성궤양/괴저를 포함할 수 있다. 게다가, 혈관 형성의 촉진은 손상된, 예를 들어 오래된, 혈관을 대체하기 위해 적합하다. 그들은 뇌졸증 또는 경색이 방지 또는 치료될 수 있도록, 예를 들어, 뇌 또는 심장에 존재할 수 있다. 노인성 치매에 대해 또한 예방을 가져올 수 있다. 또한, 그것은 재발의 방지뿐만 아니라 동맥경화증, 크론병 및 궤양성 대장염, 당뇨성 망막증 및 다리/궤양 하퇴(cruris)의 심부정맥혈전을 치료하기 위한 혈관 혈성에 관한 것이다.

여기서 사용된 바와 같이, 용어 "프로트롬빈 시간", "PT" 또는 그것의 문법적 동등어는 과도한 혈액 응고(트롬보시스)의 위험에 있는 개인의 치료를 모니터하기 위해 사용할 수 있는 혈액 응고 시간에 대한 테스트를 의미한다. 프로트롬빈 시간은 샘플에 대해 조직 인자 - 칼슘의 첨가로부터 피브리노겐의 피브린으로 전환이 시작되는 지점까지 계산된 시간의 간격을 의미한다. 프로트롬빈 시간은 일반적으로 감소된 인자 활성(각각 50, 25, 10, 5 및 2.5%)을 가지는 샘플을 수득하도록 정상 인간 혈장(바람직하게 0.15M NaCl에서 1:2, 1:4, 1:10, 1:20 및 1:40 희석액)의 다른 희석액을 접촉시켜 결정된다. 본 발명의 제1 또는 제2 소포는 샘플에 첨가되고 샘플의 응고에 걸리는 시간이 광학적으로 측정된다.

여기서 사용된, 프로트롬빈 비(prothrombin ratio, PR)는 환자 혈장의 PT를 정상적인 개인으로부터 나온 혈장 풀의 PT로 나누어 계산되는 또 다른 혈액 응고의 측정을 의미한다.

본 발명의 키트 또는 용도는 응고 실험실에서 사용될 수 있다. 이 테스트의 변형은 많은 용도를 가진다(White, et al., Hemostastis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman et al., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, pp. 1048-1060, 1987). 하나의 용도는 응고의 외인성 경로에서의 결핍을 평가하는 것이다(인자 VII, X, V, 및 프로트롬빈). 제2 용도는 재발하는 정맥 트롬보시스 및 암과 같은 장애에 대한 긴 기간 구강 항응고성 치료를 받는 환자를 모니터하는 것이다(Hirsh, J., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 12:1-11, 1986). 세 번째 용도는 간 기능장애를 평가하는 것이다.

항응고성 치료의 치료학적 범위는 출혈의 방지 및 혈전성 합병증(thrombolic complications)에 근거한다. 구강 항응고성 치료를 모니터할 때, PT 테스트에 의해 다른 조건의 다양화에 대해서뿐만 아니라, 2의 인자에 의한 프로트롬빈 시간의 연장이 긴 기간 치료에 대해 가장 바람직하다(O'Reilly, Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman, et al., eds., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, pp. 1367-1372, 1987). 이 연장 인자는 프로트로빈 비(PR)로서 규정되고 환자 혈장의 PT를 정상적인 개인으로부터 나온 혈장 풀의 PT로 나누어 계산된다. 더 높은 PR은 더 예민한 PT 시약을 나타낸다. 항응고성 치료를 모니터하기 위한 더 예민한 시약의 잇점은 항응고성 약물의 더 낮은 복용량의 사용이다. 이들 더 낮은 복용량은 출혈 합병증을 최소화하면서 혈전색전성 질병에 대해 적합한 보호를 더 제공한다.

키트는 또한 정해진 한계 내에서 시약을 유지할 수 있게 하는 팩키징을 포함할 수 있다. 그러한 팩키징을 준비하기 위한 적합한 물질은 글래스, 플라스틱(폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 및 그와 유사한 것), 바틀, 바이알, 종이, 샤세 및 그와 유사한 것이 포함된다. 본 발명의 키트는 추가적으로 본 발명의 방법에서 시약 또는 시약들을 사용하기 위한 지시(instructions)를 포함할 수 있다. 언급된 지시는 인쇄된 재료의 형태 또는 전자적 저장 미디어(마그네틱 디스크, 테이프 및 그와 유사한 것), 광학 미디어(CD-ROM, DVD) 및 그와 유사한 것과 같은 대상에 의해 읽혀질 수 있는 지시를 저장할 수 있는 전자적 지원의 형태로 발견될 수 있다. 미디어는 추가적으로 또는 대안적으로 언급된 지시를 제공하는 인터넷 웹사이트를 포함할 수 있다.

본 발명이 거의 설명적이지만 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 간주되는 하기하는 실시예에 의해 상세히 설명된다.

실시예 1

이스트( TT -173) 내에서 전장( full - length ) TF his -태그 변형된 단백질의 발현에 기초한 응혈촉진 산물의 생산

WO2008080989에 개시되고 URA3 유전자를 포함하는 이스트 에피솜 벡터, 암피실린 저항성 유전자, 이스트 2μ 복제 기원, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화효소(GPD) 프로모터 및 포스포글리세레이트 키나제의 이스트 전사 종결 신호를 성숙한 hTF 단백질(SEQ ID NO:1의 aa 33-295)을 코딩하는 cDNA GPD 프로모터 제어하에 3' 말단에서 18 엑스트라 뉴클레오티드(여섯 개의 히스티딘을 코팅) 및 본래의 hTF 서열(SEQ ID NO:6)에서 잠재적 N-당화 사이트의 하나를 불활성화하는 Asn124Ala 돌연변이와 함께 클론하기 위해 사용했다.

이스트 균주 T73 ura3-의 변형 후에, 우라실-프리 배지에서 자랄 수 있는 균주를 수집하고 기본적으로 WO2008080989에 개시된 대로 이스트 추출물의 웨스턴-블롯 분석에 의해 그것들의 hTF를 발현하는 능력을 테스트했다.

이스트 추출물의 생산의 예비-산업적 레벨에서의 규모화 가능성을 평가하기 위해, 2 리터 바이오리액터(Biostat B-2L. BRAUN)에서 250-300 rpm의 교반 속도로 30℃에서, pH 4.5 그리고 공기 흐름 6L/m 하에 세포가 자라게 하여 발효를 실시했다. 배양배지는 CSM-URA:0.78g/L; YNB:6.7g/L; 수크로스:20g/L였다. 발효는 배양조직이 OD 8.0에 이르렀을 때 멈추었다.

발효로부터 얻어진 산물을 3,000rpm(1,200xg)에서 10분 동안 원심분리에 의해 수집하고 용해 버퍼(lysis buffer, 20mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4), 50mM NaCl)) 200ml에서 재현탁했다. 이스트를 고압(1,000 bar(10⁸ Pa))에서 균질화했다(균질화기 NIRO SOAVIS. Panda 2K). 그리고 호모제네이트를 30분 동안 4℃에서 13,000rpm에서 원심분리했다. 펠렛을 버리고 정제된 이스트 추출물(CYE)로 명명되는 상청액을 수집했다.

이 rTF를 함유하는 CYE는 포어 사이즈에서 점차적인 감소가 있는 필터(0.45μm, 0.2μm 및 0.1μm 멤브레인(Sartorius, 폴리설폰))를 사용하는 교차흐름 여과 시스템(Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop)에서 접선흐름여과의 연속된 단계에 의해 분별되었다.

연속적 단계의 여과 후에 4개의 독립된 CYE로부터 얻어진 다른 농축액 및 투과액의 응혈촉진 활성을 표 1에 나타낸다. 4개의 MFR 0.1 부분의 각각에서의 TF의 존재를 도 1에 나타낸다.

이렇게 하여, WO2008080989에 개시된 것과 근본적으로 다른 인비트로 및 인비보 분석을 사용하여 결정된 응혈촉진 성능을 가지는 정제된 이스트 소포 제제(이하 TT-173으로 언급된다)를 얻었다. 이러한 결과는 TT-173 산물을 정제하기 위해 사용된 접선흐름여과 절차의 사용이 이스트-유래 멤브레인 마이크로소포에 연결되는 생물학적으로 활성인 hTF의 회수를 가능하게 한 것을 나타낸다.

실시예 2

PS 의 첨가에 의한 TT -173 생물활성의 향상

2.1 TT -173 생물활성에서의 포르파티딜세린(PS)의 효과

PS(0.1mM)를 TT-173에 추가하고 4h 이상 혼합물을 배양했다. 시작할 때 PS를 첨가했으며(time 0), 다른 시간 지점들에서, TT-173/PS 혼합물의 앨리쿼트를 표준 코어귤로미터 분석에서 응고 활성에 대해 체크했다.

도 2에 나타낸 결과는 명백하게 PS의 첨가가 대략 10s의 응고 시간을 줄이는 것을 보여주고(패널 A), 이것은 여섯 배의 특이적 활성의 증가에 상응한다(패널 B). 그리고 이 증폭은 시간-의존적이고, PS 첨가 후에 최대 1h 내지 2h 걸린다.

응고 시간에 있어 그 자체에 의한 PS의 무시할 만한 효과(도시하지 않음), 및 TT-173에 그것의 첨가 후에 첫 번째 시간 동안 관찰되는 진작(boosting) 효과에서의 증가는 TT-173과 PS 사이의 어떠한 상호작용이 생겼으며, 이 상호작용은 응고 시간을 가속하기 위해 중요했다는 것을 시사했다.

이 효과는 비슷한 농도(0.1mM)에서 중성 또는 양이온 인지질의 첨가가 TT-173의 응고 활성에 있어서 주목할 만한 증가를 이끌어내지 않기 때문에 음이온 인지질에 대해 특이적이다. 특히, 포스파티딜세핀(PS), 포스파티딜에탄올아민(PE), 스핑고미엘린(SM), 또는 포스파티딜클로린(PC)의 어느 것도 응고 활성에서 주목할 만한 증가를 이끌어내지 않았다.

그리고 나서 PS/TT-173 상호작용이 이스트-유래 구조에 제한된 것인지 또는 인공적으로-만들어진 소포에서 재현될 수 있는 것인지를 테스트했다. 이를 테스트하기 위해, PS를 다른 농도(0.05 내지 1mM의 범위)에서 TT-173나 인비트로에서 재지질화된 rTF의 동등한 응고 활성을 가지는 앨리쿼트에 첨가했다. R/T에서 2h 동안 혼합물의 배양 후에, 양 rTF-함유 산물로부터의 샘플을 그들의 응고 활성에 대해 테스트했다. 이 결과를 도 3에 나타낸다. 전에 관찰된 바와 같이, TT-173에 PS의 첨가는 명백히 거의 여섯 배의 활성을 증가시킨다. 이 효과는 PS의 0.05 내지 0.5mM의 농도 범위에서 관찰되었다. PS의 더 높은 농도(1mM)에서 명확한 저해적인 응고 효과가 생성된다. 놀랍게도, 재지질화된 rTF에 대한 PS의 첨가는 사용된 PS 농도의 어디에서도 응혈촉진 활성에서 인식할 만한 증가를 가져오지 않았다. 다시, 테스트된 PS의 더 높은 농도(1mM)는 명확한 저해 효과를 생성했다. 이 TT-173 샘플이나 재지질화된 rTF 샘플에서의 더 높은 PS 농도에 의한 이 저해 효과는 만약 PS소포가 고 농도에서 가용성 응고 인자와 효과적으로 상호작용하고, 그들을 격리하고, 그리고 따라서 그들의 rTF-함유 소포와의 상호작용을 제한한다면 설명될 수 있다.

이것은 또한 상이한 PS에 대한 PC 비율을 가지며 이미 미리-존재하는 rTF-함유 마이셀에 대한 PS 농도를 증가시키면서 첨가하는 것의 결과로서 응고 활성 효과를 테스트하는 것에 의하여 확인되었다. 전체 rTF 활성을 회복하기 위한 인지질의 최적 농도는 잘 확립되어 있고, 80:20 내지 70:30의 포스파티딜세린(PS)에 대한 포스파티딜클로린(PC) 비율에 상응한다. 도 4(검정 바)는 일반적인 응고 실험을 나타내며, 여기서 rTF는 PC만으로(100:0의 PC:PS 농도) 재지질화되었거나, 또는 PC에 대한 PS의 농도 비를 증가시키면서(각각 95:5, 90:10 및 80:20의 PC:PS 농도) 재지질화되었다. 결과는 명백하게 PS의 양을 증가시키면서 한 첨가가 감소되는 응고 시간을 가져온다는 것을 나타낸다. 그렇지만, 엑스트라 PS가 미리-존재하는 마이셀에 첨가되면, 어떠한 PC:PS 비에서 테스트되어도 응고 활성에서의 증가를 가져오지 않았다(도 4, 회색 막대).

관찰된 효과가 진핵 세포-유래 구조에 제한되고, 재지질화에 의해 인공적으로 만들어진 소포에서는 재현될 수 없다는 증거를 더 제공하기 위해, PS를 농도 0.1mM에서 이스트 세포에서 생산된 TT-173 소포나 인비트로 재지질화된 rTF와 동등한 응고 활성을 가지는 앨리쿼트에 80:20 및 70:30의 PC:PS 비에서 첨가했다. R/T에서 2h동안 PS로 다른 소포의 배양 후에, 다른 rTF-함유 산물의 샘플을 그들의 응고활성에 대해 테스트했다. 이 결과를 도 5에 나타낸다. 관찰된 대로, 이스트 기원으로부터의 TT-173에 대한 PS의 첨가는 명확하게 응고 시간을 줄였으며, 반면 예상대로, 재질화된 rTF에 대한 PS의 첨가는 재지질화를 위해 사용된 PC:PS 비율 어느 것에서도 응혈촉진 활성에 있어 주목할 만한 증가를 가져오지 않았다.

PS의 첨가가 오직 이스트 유래 소포에 연결되었을 때만 효과적이었는지를 테스트하기 위해, 재지질화된 rTF 및 TT-173과 동일한 생성 절차를 따르는 비-재조합 이스트로부터 얻어진 TT-100 소포(TF 단백질 서열이 없는 플라스미드로 변형된 재조합 이스트로부터 얻어진 마이크로소포)를 사용하여 실험하였다. 재지질화된 rTF의 앨리쿼트를 다른 농도들을 가지는 2시간 동안 PS(0.1mM)로 미리 배양한 TT-100 소포와 혼합했다. 30분 후에 각 앨리쿼트의 응고 활성을 결정했다. 결과(도 6)는 명확하게 사용된 TT-100의 양이 독립적으로 TT-100/PS의 혼합물이 재지질화된 rTF에 주목할 만한 효과를 주지 않는다는 것을 보여준다.

이 결과는 응고 활성에 있어 PS의 효과가 이스트-유래 소포와 그것의 결합에 의존하고, 이들 소포는 rTF를 함유해야만 한다는 것을 입증한다.

위 결과로부터, TT-173에서 PS에 의해 유도되는 응고 진작 효과(도 2, 3 및 5)는 만약 i) PS는 rTF와 FVII 사이의 상호작용을, 상호작용에 대해 더 적합한 스캐폴딩(scaffolding)을 유도하면서, 촉진한다; ii) 첨가된 PS가, 활성화된 혈소판에서처럼 프로트롬비나아제 착체 형성을 위해 더 적합한, PS에서 풍부해진 소포 발생 영역에 구조적 효과를 유도한다; 또는 iii) 양 효과의 조합이라면 설명될 수 있다.

rTF:FVII 상호작용에서 PS의 가능한 효과를 테스트하기 위해, TF:FVII 착체의 효소적 활성을 수량화하기 위해 규정된 표준 아미드 분해 분석(amidolytic assay)을 사용했다. 이 실험을 위해, PS를 첨가한 또는 첨가하지 않은 TT-173 세 개의 농도를 정제된 상업적 FVIIa의 두 개의 다른 농도로 배양했다. TT-173에 대한 FVIIa의 첨가 후에, TF/FVIIa 활성을 특정 염색체 기질 S-2288을 효소적으로 변형하는 착체의 능력에 의해 감지했다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 테스트된 TT-173의 세 개의 농도에서 그리고 사용된 FVIIa의 양 농도 50nM(도시하지 않음) 또는 500nM(도 7)에서 PS가 있는 또는 PS가 없는 TT-173 사이의 아미드 분해 활성에 있어 주목할 만한 차이가 없었다. 이들 결과는 TT-173에 대한 PS의 첨가가 최초 rTF/FVII 상호작용에 현저한 효과를 미치지 못한다는 것을 분명히 나타낸다.

그렇지만, 동일한 TT-173 샘플을 정상 혈장(도 8, 패널 A)이나 정상 전혈(도 8, 패널 B)에서 응혈촉진 활성에 대해 테스트했을 때, PS가 TT-173에 연결되었을 때 응고 활성에 있어 매우 상당한 증가가 관찰되었다.

따라서, TT-173에서의 PS의 자극적 효과는 초기 TF:FVII 상호작용보다 응고 폭포반응 다운스트림 상에서 효과에 기인할 것이다. 우리의 해석은 PS는 활성화된 혈소판에서 관찰되는 것과 유사한 PS-의존적 스캐폴드를 제공하면서 TT-173 소포 표면을 변형(modify)한다는 것이다.

2.2 TT -173 및 TT -173 PS 의 작용 메카니즘

정상 출혈 동안, 활성화 스테이지에 이르도록 요구되는 시간(FV, FVIII 및 혈소판을 활성화하기 위해 요구되는 트롬빈 농도에 도달하기 위해 요구되는 시간)은 대략 4분이다. 이것은 혈장에서나 손상된 세포의 멤브레인에서나 상대적으로 낮은 농도에서 둘 다 존재하는 TF와 FVII 분자 사이의 상호작용을 하게 하는데 요구되는 시간이다. 분자 충돌 및 TF와 FVII 분자 사이의 결과 상호작용은 FXa 내로 FX의 변형을 이끌고, 차례로 트롬빈을 생성한다.

따라서 혈장 또는 전혈에 TT-173을 첨가하는 것과 같은 적합한 멤브레인 내로 병합되는 TF의 농도의 증가는 TF와 FVII 사이의 상호작용이 일어날 기회를 증가시킬 것이다. 이는 더 빠르고 더 높은 FXa의 생성을 가져오고, 그에 따라서 혈소판, FVIII 및 FV의 활성화를 위해 요구되는 트롬빈 양을 더 빠르게 생산한다.

TT-173에서, TF는 또한 PS의 별개의 패치를 함유하는 멤브레인 구획 속으로 삽입된다. 따라서 혈장 또는 전혈에 대해 TT-173의 첨가는 더 높은 농도에서 응고 폭포반응의 개시자로서뿐만 아니라 활성 프로트롬비나아제 착체의 형성을 위한 적절한, PS-함유, 생리학적 스캐폴드를 제공하는 적합한 표면이다. 도 9는 TT-173의 제안된 작용 메카니즘을 요약한다.

정상적 혈액 응고 동안, 응고의 활성화는 거의 4분이 걸린다. 이것은 혈관에 인접한 손상된 조직에서 TF 단백질의 상대적으로 낮은 농도, 그리고 혈류에서 순환하는 FVIIa의 부족한 양의 결과이다.

FXa의 생성이 증가하는 이 모델은 PS를 가진 또는 가지지 않은 TT-173이 정상 혈장(도 10, 왼쪽)에 첨가될 때 관찰되는 응고 시간에 있어 드라마틱한 감소를 설명한다. 게다가, 프로트롬비나아제 착체의 형성을 통해, 이 모델은 FVIII 또는 FIX(혈우병 A 및 B에서 결핍)가 없거나 매우 낮은 농도(도 10, 오른쪽)일 때 관찰되는 정상 응고 시간을 설명한다. 응고 인자가 결핍된 경우에, TT-173에 대한 PS의 첨가는 명확하게 응고시간을 감소시킨다. 이 효과는 FVII 또는 FV의 농도가 1% 미만(도 11)인 혈장에서 더 분명하다.

이 모델이 예측하는 바와 같이, FVII 및 FV가 결핍된 혈장의 응고 시간은 또한, 와파린 처리의 효과로서, TT-173의 첨가에 의해 정상화된다.

2.3. TT -173 활성에 있어 이스트 멤브레인의 역할

이스트 소포 성분은 그 자체에 의해 제한된 응혈촉진 활성을 나타내지만, 그들 모두는 마이크로입자의 온전함 유지에 필수적일 것이다. 첨가된 PS를 가지는 또는 가지지 않는 TT-173 소포가 투석가능한 세제로의 처리에 의해 조각조각 파열되면, 투석에 의해 거의 초기 활성의 50%를 잃고 인비트로에서 복원되었다(도 13, 패널 A). 그렇지만, 비슷한 실험이 재지질화된 rTF 소포를 사용하여 했을 때, 주목할 만한 차이가 투석 전후에 전혀 관찰되지 않았다(도 13, 패널 B).

이 결과는 응고활성이 rTF, 이스트 단백질 및 이스트 지질의 상대적 양에 의해서 뿐만 아니라 이들 성분 모두의 공간적 배치/배향에 의해서도 야기된다는 것을 나타낸다. 소포가 자연스럽게 인비트로에서 생성되었을 때, TT-173의 모든 멤브레인 성분은 새로 형성된 멤브레인 내로 무작위로 병합되었으며, 오직 진핵 생세포가 제공할 수 있는 콘텍스트에서 얻어질 수 있는 착체 구조를 얻지 않았다.

실시예 3

곤충 세포에서 전장 TF 단백질의 발현에 기초한 응혈촉진 활성 산물의 생성

3.1. 재조합 바큘로바이러스의 구축

전장의 성숙한 인간 조직 인자(TF)을 발현하는 재조합 바큘로바이러스(rBV)의 구축을 아래와 같이 실행했다:

성숙한 인간 TF 단백질(aa 33-295)에 대해 코딩하는 cDNA를 816-bp 단편으로 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 이 PCR 반응을 위해, TF 코딩 유전자를 함유하는 플라스미드 pTT-103을 템플레이트로 사용했으며, TF 유전자의 5' 또는 3' 말단에서 각각 어닐링하는 올리고뉴클레오티드 A

(SEQ ID NO: 7) 및 B

(SEQ ID NO: 8)가 프라이머로서 사용되었다. 얻어진 DNA 단편이 NcoI 및 HindIII으로 소화되었고 동일한 제한 효소로 소화된 바큘로바이러스 전이 벡터 pFastBaci-mAV-MCS 내로 삽입되었다. 얻어지는 플라스미드, pFB-TF를 삽입된 TF 서열의 정확성을 평가하기 위해 뉴클레오티드 시퀀싱(sequencing)을 받게 했으며, 그리고 나서 Bac-to-Bac 시스템을 사용하여 그리고 제조자(Invitrogen)의 지시에 따라서 상응하는 rBV를 생산하기 위해 사용되었다. 활성 TF-함유 소포의 생산 및 정제를 위해, 곤충의 높은 다섯 개의 세포(insect high five cell)를 TF를 발현하는 rBV로 5 PFU/cell의 다중도에서 감염시켰다. 세포를 72시간 감염 후(post-infection)에서 수확하고, 인산-완충 식염수로 두 번 세정하고, 용해 버퍼(50nM Tris-HCL, pH 8.0, 500mM NaCl)에서 재현탁했다. 그런 후에, 세포 추출물을 도운스(dounce) 균질화기를 이용하여 분열시켰다. 세포 추출물의 앨리쿼트를 실시예 2에서 미리 언급된 프로토콜을 따라 응고 활성을 위해 테스트했다. 표 2는 추출물에 의해 유도되는 응고 활성을 나타낸다.

3.2. TT -173( wt - TF 를 수반하는 곤충 세포 유래 마이크로소포)의 생활성에서의 포스파티딜세린(PS)의 효과

이 특허에서 관찰되고 청구된 효과가 진핵-유래 구조에 제한되고, 재지질화에 의해 인공적으로-만들어진 소포에서는 재현될 수 없다는 증거를 더 제공하기 위해, PS를 이스트 세포에서 생산된 TT-173 소포, 곤충 세포에서 생산된 TT-172 소포 또는 80:20 및 70:30의 PC:PS 비에서 인비트로 재지질화된 rTF와 동등한 응고 활성을 가지는 앨리쿼트에 농도 0.1mM에서 첨가했다. R/T에서 2h 동안 PS로 다른 소포들을 배양한 후에, 다른 rTF-함유 산물들의 샘플을 그들의 응고 활성을 위해 테스트했다. 결과를 도 14에 나타낸다. 관찰된 대로, 곤충 세포 기원으로부터 나온 TT-170에 대한 PS의 첨가는 이스트 세포에서 얻어진 것과 유사하게 응고시간에 있어 감소를 가져왔으며, 명확하게 응고 시간을 감소시켰다. 그렇지만, 예상된 대로, 재지질화된 rTF에 대한 PS의 첨가는 재지질화를 위해 사용된 PC:PS 비율 어느 것에서도 응혈 촉진 활성에 있어서 주목할 만한 증가를 가져오지 않았다.

실시예 4

PS 첨가의 다른 예상하지 못한 효과는 TT-173 소포의 안정성을 넘는 그것의 발생 정도였다. 이 효과를 테스트하기 위해, 배양된 세 개의 독립된 TT-173 덩어리 또는 실시예 2에서 설명된 대로 PS 없는 것으로부터 나온 앨리쿼트를 두 개의 다른 온도(4℃ 및 20℃)에서 장기적 시간 기간 동안 유지시켰다. 다른 시간 지점에서, 각 샘플로부터 나온 앨리쿼트를 응고 활성을 위해 테스트했다. 이 실험의 결과를 도 15에 나타낸다. 앞에 나타낸 바와 같이, TT-173 샘플에 대한 PS의 첨가는 시간 0초에서 10초 이상 응고시간을 가속하고, 그리고 예상치않게 PS를 함유하는 샘플의 안정성을 PS가 없는 샘플과 비교해서 오래 계속되게 했다. 이 안정성 효과는 특히 20℃에서 분명했으며, 반면 엑스트라 PS가 없는 TT-173 샘플은 5h 후에 활성의 50% 이상을 잃었으며, PS가 첨가된 샘플은 최소한 4일 동안 안정하게 유지되었다.

첨가된 PS가 있는 또는 없는 TF-173의 다른 배치의 최소 안정성의 평균을 20℃ 및 4℃에서 결정했다.

최소 안정성 평균을 도 15에 나타낸다(패널 C 및 패널 D).

실시예 5

응혈촉진제에 의한 TT -173의 응혈촉진 효과의 향상

다른 농도의 FVII(20nM 및 60nM), FVIIa(20nM 및 60nM), FX(1000nM 및 3000nM) 및 FXa(1000nM)을 TT-173에 첨가했다. PS를 시간의 처음(time 0)에 첨가했으며, 다른 시간 지점에서, TT-173/FVII의 앨리쿼트 및 TT-173/FX 혼합물의 앨리쿼트를 표준 코어귤로미터 분석에서 응고 활성에 대해 체크했다. 도 16에 나타낸 결과는 명확하게 FVII, FVIIa 및 FX의 첨가가 거의 2s의 응고 시간을 줄이며 FXa의 첨가는 거의 7s의 응고 시간을 줄이는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Thrombotargets S.L. <120> PHOSPHOLIPID-ENRICHED MEMBRANES BEARING TISSUE FACTOR HAVING HAEMOSTATIC ACTIVITIES AND USES THEREOF <130> P5250PC00 <150> EP10382085 <151> 2010-04-19 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln 20 25 30 Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175 Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val 180 185 190 Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205 Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile 210 215 220 Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile 225 230 235 240 Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu 245 250 255 Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser 260 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope AHGHRP <400> 2 Ala His Gly His Arg Pro 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope PIHDHDHPHLVIHS <400> 3 Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope GMTCXXC <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 5 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human mature TF with N124A mutation and C terminal hexahistidine tag <400> 5 Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln 20 25 30 Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Ala Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175 Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val 180 185 190 Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205 Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile 210 215 220 Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile 225 230 235 240 Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu 245 250 255 Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser His His His His His His 260 265 <210> 6 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding human mature TF with N124A and C-terminal hexahistidine tag <400> 6 atgtcaggca ctacaaatac tgtggcagca tataatttaa cttggaaatc aactaatttc 60 aagacaattt tggagtggga acccaaaccc gtcaatcaag tctacactgt tcaaataagc 120 actaagtcag gagattggaa aagcaaatgc ttttacacaa cagacacaga gtgtgacctc 180 accgacgaga ttgtgaagga tgtgaagcag acgtacttgg cacgggtctt ctcctacccg 240 gcagggaatg tggagagcac cggttctgct ggggagcctc tgtatgagaa ctccccagag 300 ttcacacctt acctggagac aaacctcgga cagccaacaa ttcagagttt tgaacaggtg 360 ggaacaaaag tggcagtgac cgtagaagat gaacggactt tagtcagaag gaacaacact 420 ttcctaagcc tccgggatgt ttttggcaag gacttaattt atacacttta ttattggaaa 480 tcttcaagtt caggaaagaa aacagccaaa acaaacacta atgagttttt gattgatgtg 540 gataaaggag aaaactactg tttcagtgtt caagcagtga ttccctcccg aacagttaac 600 cggaagagta cagacagccc ggtagagtgt atgggccagg agaaagggga attcagagaa 660 atattctaca tcattggagc tgtggtattt gtggtcatca tccttgtcat catcctggct 720 atatctctac acaagtgtag aaaggcagga gtggggcaga gctggaagga gaactcccca 780 ctgaatgttt cacatcacca tcaccatcac tag 813 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide A <400> 7 ccgctcgagc ggttatgaaa cattcagtgg ggagttctc 39 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide B <400> 8 ccgctcgagc ggttattctc tgaattcccc tttctc 36

Claims (29)

1. 응혈촉진 활성을 가지는 Tissue Factor-함유 마이크로소포의 제조를 위한 방법으로서,
   (i) 진핵 세포에서 Tissue Factor 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종을 발현하는 단계,
   (ii) 활성제(detergent)가 없는 경우에는 상기 발현하는 Tissue Factor을 용해하거나 상기 활정제를 이용하는 경우에는 임계미셀농도(critical micellar concentration)보다 낮은 상기 활성제의 농도를 이용하는 단계.
   (iii) 단계 (ii)의 세포로부터 Tissue Factor-함유 마이크로소포를 회수하는 단계 및
   (iv) 단계 (iii)에서 얻어진 소포를 음이온 인지질과 상기 소포 내로 상기 인지질의 병합을 위한 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함하고,
   상기 마이크로소포는 상기 진핵 세포로부터 나온 지질 멤브레인, 또는 그것의 단편에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 진핵 세포는 이스트 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 접촉시키는 단계는 상기 마이크로소포의 단백질 함량이 50micrograms보다 적은 경우에는 음이온 인지질 0.05μmol을 사용하고, 상기 마이크로소포의 단백질 함량이 50micrograms보다 큰 경우에는 상기 음이온 인지질 0.1μmol을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 음이온 인지질은 스핑고신-함유 인지질 또는 글리세롤-함유 인지질의 그룹으로터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 글리세롤-함유 인지질은 포스파티딜세린인 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 Tissue Factor 또는 응혈촉진 활성을 가지는 그것의 변종은 당화된 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 Tissue Factor는 인간의 성숙한 Tissue Factor 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 Tissue Factor는 SEQ ID NO:5 에 대응하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항의 방법을 사용하여 얻어진 Tissue Factor-함유 마이크로소포.
10. 제9항에 따른 Tissue Factor-함유 마이크로소포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하고, 출혈의 치료 또는 상처 치유를 촉진하기 위한 약학적 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    최소한 응고 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 동결건조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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14. 제9항에 따른 Tissue Factor-함유 마이크로소포를 사용하여 샘플에서 프로트롬빈 시간의 결정을 위한 방법.
15. 제9항에 따른 마이크로소포를 포함하는 프로트롬빈 시간의 결정을 위한 키트.
16. 방법에 있어서,
    필요에 따라서 대상에서 제9항에 따른 Tissue Factor 함유 마이크로소포를 투여하는 것에 의해 출혈의 치료 또는 상처 치유를 촉진하기 위한 것이고,
    상기 방법은 인간 이외의 동물에만 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 출혈은 건강한 대상 및 출혈소질을 가진 대상의 그룹으로부터 선택되는 대상에서 치료되며, 상기 출혈소질은 선천성 응고장애, 후천성 응고장애, 혈소판 장애 및 그들의 조합의 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17항에 있어서,
    상기 Tissue Factor-함유 마이크로소포는 국소적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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