CN102892781B - 具有止血活性的荷有组织因子的富含磷脂的囊泡及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过使衍生自真核细胞的微囊泡与负电荷磷脂例如磷脂酰丝氨酸接触，用于改善在真核细胞中表达的TF的促凝性质的方法。本发明还涉及使用所述方法获得的微囊泡以及其作为促凝血剂、用于伤口愈合和用于促进血管生成的用途。

Description

具有止血活性的荷有组织因子的富含磷脂的囊泡及其用途

发明领域

一般来说，本发明涉及使用基于组织因子的促凝血剂治疗受试者中的出血和伤口愈合。更具体而言，本发明涉及包含以微囊泡形式的真核细胞衍生膜和组织因子蛋白质和负电荷磷脂（NCP）的荷有组织因子的微囊泡（荷有TF的微囊泡），以及其作为促凝血剂用于治疗受试者中的出血以及促进血管生成和细胞迁移的应用。本发明进一步涉及用于产生所述荷有TF的微囊泡的方法。

发明背景

止血是生物借助于其响应出血且涉及两个过程的参与的机制，所述两个过程在损伤后立即变得有功能且长时间段保持活性。其中第一个称为初次止血并且特征在于血管性损害部位血管收缩的出现和血小板聚集体形成。第二个称为二次止血，是其中由于不同凝血级联蛋白水解酶作用形成纤维蛋白凝块的时期。

都称为凝血因子的几种辅因子和蛋白水解酶参与血液凝固过程的第二个时期，并且它由几个时期组成，所述时期以来自由于凝血酶作用的纤维蛋白原水解的纤维蛋白形成结束。凝血酶先前通过脱辅基酶凝血酶原的蛋白酶解水解形成。这种蛋白酶解通过活化凝血因子X（FXa）执行，其与活化血小板的表面结合，并且仅在其辅因子活化凝血因子V（FVa）和钙离子的存在下，并且能够水解凝血酶原。凝血因子X（FX）活化可以以两个分开途径――内源性途径和外源性途径出现。

内源性途径由在其中水解每种酶原的一系列反应组成，获得其活性蛋白酶形式。在每个步骤中，新近形成的蛋白水解酶将催化随后酶原的作用，以相继获得活性形式。

在血液凝固外源性途径中，在损害部位处的外膜细胞上表达的组织因子（TF）与循环凝血因子VII/活化凝血因子VII（FVII/FVIIa）结合，以形成TF::FVIIa复合物，并且在钙的存在下，充当底物，从而使得FX活化发生。外源性途径目前认为是血液凝固中的最相关途径，并且公认在通过血管损害产生的出血事件中，由于涉及TF与其配体FVII/FVIIa的相互作用的外源性途径活化而触发凝血。

已广泛公认TF是负责凝血由其起始的快速性的主要元件，并且它是FX活化所需的，这依次开始凝血酶原水解。

已报道了来自多个组织的TF的纯化，例如：人脑，牛脑；人胎盘；绵羊脑；和肺。广泛公认虽然在物种之间的TF蛋白质的结构中存在差异，但如通过体外凝血测定法测量的，不存在功能差异。

广泛公认为了显示生物学活性，TF必须在体外与磷脂结合。已显示例如通过使用磷脂酶去除TF的磷脂组分导致其在体外生物学活性的丧失。

WO2008080989描述包含酵母膜和组织因子蛋白质的荷有组织因子的酵母衍生的微囊泡，及其作为促凝血剂在治疗受试者中的出血中的用途。

WO2006004675描述组织因子在植物细胞中的表达，得自表达TF的植物的粗提取物和包含得自植物细胞的重组TF的人工囊泡。

EP 19359021描述组织因子在昆虫细胞中的表达以及含有在昆虫细胞中表达的重组TF的再脂质化的TF。

然而，本领域存在关于基于TF的另外的促凝剂制备物的需要。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括

（i）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体，

（ii）从步骤（i）的细胞中回收荷有TF的微囊泡，和

（iii）在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的囊泡与负电荷磷脂接触。

在第二个方面，本发明涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括

（i）提供得自真核细胞的脂质微囊泡，

（ii）在足以将所述TF蛋白质或其变体掺入所述微囊泡内的条件下，使具有促凝活性的TF蛋白质或其变体与如（i）中定义的脂质微囊泡接触，和

（iii）在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的囊泡与负电荷磷脂接触，

其中步骤（ii）和（iii）可以以任何次序执行。

在另一个方面，本发明涉及使用本发明的方法获得的荷有TF的微囊泡。

在另外一个方面，本发明涉及包含本发明的荷有TF的微囊泡和药学可接受的媒介物的药物组合物。

在另一个方面，本发明涉及包含下述的药物组合物，

（i）通过包括下述步骤的方法获得的微囊泡

a）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其功能等价变体，和

b）从步骤（a）的细胞中回收荷有TF的微囊泡，

（ii）至少凝血促进剂，和

（iii）药学有效的媒介物。

在另一个方面，本发明涉及用于用作药物的本发明的荷有TF的微囊泡或本发明的药物组合物。

在另一个方面，本发明涉及用于在治疗出血中使用、用于促进伤口愈合或用于治疗血管生成相关疾病的本发明的荷有TF的微囊泡或本发明的药物组合物。

在另一个方面，本发明涉及本发明的荷有TF的微囊泡用于测定样品中的凝血酶原时间的用途。

在另一个方面，本发明涉及用于测定抗凝治疗因子的试剂盒，其包含本发明的微囊泡。

附图简述

图1通过TT-173提取物的rTF表达。来自四次独立切向流过滤的纯化TT-173（MFR 0.1）的提取物的蛋白质印迹分析。使印迹与人纯化的小鼠抗体（BD Biosciences Pharmingen）反应。以kDa表示的分子量标记显示于该图的左侧。

图2.在与PS一起温育后TT-173的促凝活性。A.-为了测试PS对TT-173生物活性的作用，将PS（0.1mM）加入TT-173（1mL）中，并且在实验过程中将混合溶液维持在R/T。在该图表示的不同时间点，将混合物的一个等分试样（10μl）加入含有130μl正常贫血小板血浆的加温比色杯中。立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计（Stago）测定凝血时间（以秒表示）。实验在300秒后停止（来自5个供体的合并血浆）。B.-如A中所述获得的结果也表示为单位/mL。1个单位定义为在标准凝血测量测定法（130μl血浆、20μl氯化钙（100mM）和10μl产物）中在30秒内使正常合并血浆凝固所需的TT-173量。

图3.在与不同浓度的PS一起温育后，TT-173或脂质化rTF的促凝活性。为了测试PS对TT-173或再脂质化的rTF生物活性的作用，将PS（以该图中指示的浓度）加入TT-173（1mL）或再脂质化的rTF中。两种混合溶液都在R/T维持2小时。在这个时间后，将每种混合物的一个等分试样（10μL）加入含有130μl正常贫血小板血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计（Stago）测定凝血时间（以秒表示）。实验在300秒后停止（来自5个供体的合并血浆）。获得的结果表示为单位/mL。

图4.当嵌入合适的磷脂囊泡内时，rTF的促凝活性。根据由Mimms等人（Biochemistry 20，833.1981）描述的标准化方法，将商业纯化的rTF再脂质化到含有磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸（PC/PS）的囊泡内。简言之，使100ng rTF（American Diagnostica Inc.Stanford，CT，USA）与下述一起温育：以所示PC:PS比例（100:0、95:5、90:10、80:20、70:30）（2.6mM终浓度）的PC/PS（Sigma Aldrich Inc，SaintLouis，MO，USA），和去污剂（N-辛基-β-D-吡喃半乳糖苷（galactopiranoside），40mM终浓度）。将混合物匀浆化，并且广泛透析（在48小时过程中，伴随几次缓冲液更换）。通过这个程序，缓慢去除去污剂，并且自发产生含有rTF的脂质微团。在这个再脂质化程序后，就其促凝活性（蓝色条）测试含rTF微团。平行地，将不同的含rTF微团与以0.1mM终浓度的PS一起温育2小时。在这个时间后，还就促凝活性测试含有额外PS的微团。凝血测量分析如下执行：将具有PC/PS囊泡量的再脂质化的rTF的等分试样（10μl）加入含有130μl正常贫血小板血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计（Diagnostica Stago，Inc.NJ，USA）测定凝血时间（以秒表示）。

图5.PS添加对不同含rTF囊泡的作用。在4℃制备来自下述任一的两个等分试样（各2mL）：i）以80:20的PC:PS浓度比的再脂质化的rTF，ii）以70:30的PC:PS浓度比的再脂质化的rTF，或iii）从表达TF的重组酵母中分离的TT-173囊泡。将以0.1mM浓度的PS加入每种含rTF囊泡的等分试样之一中，并且在R/T温育2小时。在这个时间过程中，另一个等分试样维持在4℃。在那之后，如图例1中所述就促凝活性测试来自每种含rTF囊泡的两个等分试样。

图6.在与PS和不同浓度的TT-100一起温育后，再脂质化的rTF的促凝活性。将与PS（0.1mM）和不同浓度的TT-100（0、0.03、0.1、0.3和0.36mg/ml）一起温育2小时的再脂质化的rTF（0.3μg/m1）的等分试样（10μl）加入含有130μl正常贫血小板血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计测定凝血时间（以秒表示）。

图7.FVIIa的酰胺分解（Amidolytic）活性。为了定量TF:FVIIa催化复合物的酶促活性，使用底物S-2238执行标准生色测定法。通过在底物S-2238和所得到的加工产物对硝基苯胺（pNA）之间在吸光度（光密度）中的差异测量TF:FVIIa活性。pNA形成的速率与酶促活性成比例，并且它方便地用光度计进行测定。在这个实验中，通过其与FVIIa相互作用和在S-2238的存在下产生可检测pNA的能力，测试含或不含PS的不同浓度的TT-173。

图8.在全血中的TT-173凝固活性和PS的作用。测试含或不含PS（0.1mM）的TT 173使健康血浆和全血样品凝血的能力。A）将TT 173和与PS（终浓度0.1mM）一起温育2小时的TT 173的等分试样（10μl）加入含有130μl正常贫血小板血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计测定凝血时间（以秒表示）。（来自5个供体的血浆库）。B）将含有该图中表示的rTF量的TT-173或TT-173+PS（0.1mM）的等分试样（200μl）加入从健康供体中最近提取的血液的等分试样（800μl）中。借助于记时计测量从血液提取开始直到出现稳定和良好固化的凝块的凝血时间。N=3。

图9.TT-173的作用的假定机制。

图10.在缺乏凝血因子VIII、IX或XI的血浆中的TT-173凝固活性。（A）将TT 173或TT 173+PS（0.1mM）的等分试样（10μl）加入含有130μl正常贫血小板血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计测定凝血时间（以秒表示）。（来自5个供体的血浆库）。（B）将如A中所述的相似等分试样（10μl）加入含有130μl因子VIII、因子IX或因子XI耗尽血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计测定凝血时间（以秒表示）。（N=3）。

图11.在缺乏凝血因子V或VII的血浆中的TT-173凝固活性。（A）将TT 173或TT 173+PS（0.1mM）的等分试样（10μl）加入含有130μl因子V或因子VII耗尽血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计测定凝血时间（以秒表示）。（N=3）。

图12.在华法林处理的血浆中的TT-173凝固活性。（A）将TT 173或TT 173+PS（0.1mM）的等分试样（10μl）加入含有130μl因子V或因子VII耗尽血浆的加温比色杯中。之后立即加入20μl氯化钙（100mM），并且借助于凝血计测定凝血时间（以秒表示）。（N=3）。

图13.TT-173的重构在促凝活性中的作用。当通过用可透析去污剂处理分裂含和不含PS添加的TT-173囊泡，并且随后在体外通过透析重构时，丧失约50%的最初活性（小图A）。然而，当使用再脂质化的rTF囊泡完成相似实验时，在透析前和后未观察到可观差异（小图B）。

图14.PS添加对不同含rTF囊泡的作用。在4℃制备来自下述任一的两个等分试样（各2mL）：i）以80:20的PC:PS浓度比的再脂质化的rTF，ii）以70:30的PC:PS浓度比的再脂质化的rTF，iii）从表达TF的重组酵母中分离的TT-173囊泡，或iiii）从由表达的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中分离的TT-173囊泡。将以0.1mM浓度的PS加入每种含rTF囊泡的等分试样之一中，并且在R/T温育2小时。在这个时间过程中，另一个等分试样维持在4℃。在那之后，如图例1中所述就促凝活性测试来自每种含rTF囊泡的两个等分试样。

图15.PS的添加对TT-173囊泡提供稳定性。在这个研究中使用来自三批独立的TT-173的四个等分试样，各10mL。来自每个批次的两个等分试样与PS（0.1mM）一起在R/T温育两小时，并且将等分试样的剩余部分维持在4℃。在这个时间后，根据图1的图例中所述的程序，来自十二个TT-173样品的各10μL用于测定凝固活性（时间0）。之后立即将一半等分试样（3个TT-173–PS和3个TT-173+PS，其各自对应于三个批次之一）在稳定性实验的剩余部分过程中维持在4℃，并且将剩余部分（3个TT-173–PS和3个TT-173+PS）维持在20℃。在该图中的指示时间，来自每个等分试样的10μL用于测定维持在4℃（A）或20℃（B）的等分试样的凝固活性。结果与标准差一起标绘。还显示了在4℃（C）和20℃（D）的不同分批中的最低限度稳定性平均值。

图16.FVII、FVIIa、FX和FXa的添加扩增TT-173的促凝作用。将不同浓度的FVII（20nM和60nM）、FVIIa（20nM和60nM）、FX（1000nM和3000nM）和FXa（1000nM）加入TT-173+PS 0.1（mM）中。在以TF在血浆中45ng/ml的终浓度的标准凝血测量测定法中，就凝固活性检查TT-173+PS 0.1（mM）/FVII、TT-173+PS 0.1（mM）/FVIIa、TT-173+PS 0.1（mM）/FX和TT-173+PS 0.1（mM）/FXa混合物的等分试样。如所示的，FVII、FVIIa和FX的添加使凝血时间减少约2秒，并且FXa的添加使凝血时间减少约7秒。

发明详述

本发明人已发现在不存在去污剂的情况下，对衍生自酵母细胞且已含有PS的荷有TF的微囊泡添加额外的磷脂酰丝氨酸（PS），令人惊讶地导致所述囊泡的促凝活性改善以及所述囊泡的稳定性增加。增加的促凝性质可以例如在本发明的实施例2和3中所示的实验中观察到，在其中明确显示对包含TF的酵母衍生的微囊泡添加磷脂酰丝氨酸导致就未与磷脂接触的囊泡而言，囊泡显示增加的促凝性质（减少的凝血时间）（参见例如图2和表2）。不希望受任何理论束缚，认为PS与荷有TF的微囊泡相互作用，导致囊泡召募涉及凝血酶原酶和X酶复合物形成的血浆因子的能力增加，这依次导致增加的凝血酶产生。囊泡的稳定性增加例如显示于本发明的实施例4中，在其中显示用PS预处理的囊泡显示在20℃和4℃都增加的稳定性。

发明的第一种方法

在第一个方面，本发明涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法（下文本发明的第一种方法），其包括

（i）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体，

（ii）从步骤（i）的细胞中回收荷有TF的微囊泡，和

（iii）在足以将所述磷脂掺入所述微囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的微囊泡与负电荷磷脂（NCP）接触。

如本文使用的，术语“荷有TF的微囊泡”指任何脂质微囊泡，其含有整合在所述脂质微囊泡中的TF且衍生自真核细胞。脂质微囊泡指小且闭合的区室，其基本上由脂质单或双层组成。本发明的荷有TF的微囊泡的尺寸可以在相对宽的范围内改变，通常，所述尺寸等于或低于10μm，一般等于或低于0.5μm。在特定实施方案中，本发明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡的尺寸范围为10-0.01μm。

微囊泡通过来自真核细胞的脂质膜或其片段形成。一般而言，膜指厚度形成细胞的边界（即细胞或质膜）或细胞内细胞器的边界的少数分子（脂质和蛋白质）组构层。一般地，膜由蛋白质可以嵌入其中的两个定向脂质层（即脂质双层）组成。其为细胞膜的基本结构的脂质双层通常由水环境中的两性分子（例如磷脂、脂肪酸等）形成，每个分子由在层外的亲水基团和层内部的疏水基团定向。

在第一个步骤中，本发明的第一种方法包括在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体。

“真核细胞”在本发明中指含有在膜内封闭的复杂结构如核的任何细胞。可以在本发明的第一种方法中使用的真核细胞例子是真菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞、鱼细胞、爬行动物细胞、昆虫细胞等）。

如本文使用的，术语“酵母细胞”包括任何产子囊酵母（内孢霉目）、担子菌酵母、和属于不完全真菌（芽生菌）的酵母。因为酵母的分类在未来可能改变，所以为了本发明的目的，酵母应如由Skinner，F.等人（Biology和Activities of Yeast，Soc.App.Bacteriol.Symp.SeriesNo.9）描述中所述定义。合适的酵母菌株包括但不限于，圆酵母的任何物种、面包酵母、啤酒酵母、酵母属物种例如酿酒酵母（S.cerevisiae）、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属物种例如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）、假丝酵母属物种、汉逊酵母属物种例如多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）、和克鲁维酵母属物种例如乳酸克鲁维酵母（Klyuveromyces lactis）以及来自上述酵母物种的不同菌株，例如酿酒酵母T73菌株。还可以使用这些物种和菌株中的任何的混合物。

如本文使用的，术语“植物细胞”包括来自植物的细胞，包括但不限于藻类、单子叶植物、双子叶植物和具体地谷类（例如玉蜀黍、稻、燕麦等）、豆科（例如大豆等）、十字花科（例如拟南芥、油菜等）或茄科（例如马铃薯、番茄、烟草等）。植物细胞包括悬浮培养物、胚芽、分生组织（merstematic）区、愈伤组织、叶、根、枝、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。因为本领域技术人员应当理解植物细胞可以是植物的部分或全植物，从而称为“植物宿主系统”。“植物宿主系统”或分离的植物细胞可以处于不同成熟阶段。植物宿主系统还指此类植物、种子、自交或杂交后代的任何克隆、无论是有性还是无性生成的繁殖体、和这些中的任何的后代例如插条或种子。

如本文使用的，术语“动物细胞”包括来自动物的任何细胞。动物细胞包括哺乳动物细胞、鱼细胞、爬行动物细胞、昆虫细胞等。动物细胞可以衍生自动物的任何组织（原代培养细胞）或可以是永生化细胞。永生化细胞可以得自肿瘤组织或使用本领域技术人员已知的技术永生化，例如由病毒感染（例如EP1212420）或正常细胞与永生化细胞系的融合。

昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞、SF21细胞、SF+细胞、Hi-Five细胞、或昆虫幼虫细胞。

可以由其获得细胞的哺乳动物包括大鼠、小鼠、猴、人等。适合于本发明的哺乳动物细胞包括上皮细胞系、骨肉瘤细胞系、成神经细胞瘤细胞系、上皮癌细胞、神经胶质细胞、肝细胞系、CHO（中国仓鼠卵巢）细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、293细胞或PER.C6细胞、人ECC NTERA-2细胞、mESC系的D3细胞、人胚胎干细胞例如HS293和BGV01、SHEF1、SHEF2和HS181、NIH3T3细胞、293T细胞、REH细胞和MCF-7细胞和hMSC细胞。

如本文使用的，术语“组织因子”或“TF”也称为“促凝血酶原激酶”、“血小板组织因子”、“CD 142”或“凝血因子III”，指广泛分布在动物界中的整合膜糖蛋白，其在内皮下组织、血小板和白细胞中出现，并且是来自酶原凝血酶原的凝血酶形成起始所需的。用于在本发明中使用的合适TF多肽包括任何动物物种包括人的天然或野生型（wt）TF。可以在本发明中使用的示例性TF蛋白质包括人TF（UniProtKB登记号P13726）、小鼠TF（UniProtKB登记号P20352）、大鼠TF（UniProtKB登记号P42533）、猪TF（NCBI Prot登记号NP 998950）、牛TF（NCBI Prot登记号AAB20755）、犬TF（NCBI Prot登记号BAD98568）、豚鼠TF（NCBI Prot登记号AAF36523）和不同生物体的TF蛋白质。

因为天然TF含有几个糖基化位点，所以可以通过在能够执行N糖基化反应的宿主中表达TF获得显示不同程度糖基化的TF变体。成熟TF含有位于Asn11（序列Asn11-Leu12-Thr13）、Asn124（序列Asn124-Val125-Thr126）和Asn137（序列Asn137-Asn138-Thr139）上具有共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的三个潜在N联糖基化。因此，用于在本发明中使用的TF分子包括在一个或多个N糖基化位点中具有可变程度的N联糖基化的TF变体。在酵母中，糖基化一般涉及经由两个GlcNAc残基与天冬酰胺连接的约十个甘露糖残基的内核，和50-100个甘露糖残基的分支外部链。因此，N联糖基化可以潜在地将多达300个甘露糖残基加入TF中，分子量中约60kDa的增加。此外，几个甘露糖残基可以附着至多个（超过25个）O联糖基化位点也是可能的。在特定实施方案中，本发明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡包含糖基化的TF蛋白质。如本文使用的，术语“糖基化的”包括任何程度的糖基化。

术语“具有促凝活性的TF的变体”指显示与TF基本上相同的生物学活性，且起因于一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或置换的化合物。可以用于评估给定多肽是否是TF的功能等价变体的合适功能测定法是基于TF变体特异性结合FVIIa的能力的测定的那些测定法，或基于在血浆或全血中的凝血时间的体外测定，通过在严重出血动物模型中的体内测定法或通过在致命性出血动物模型中的体内测定法。用于执行这些测定法的程序已在现有技术中描述，并且在本发明的实施例中（节段“方法”）以及申请WO2008080989中概括。

根据本发明的变体包括与上文提及的天然TF分子至少60%、70%、80%、90%、95%或96%相似或相同的氨基酸序列。如本领域已知的，通过比较一种蛋白质的氨基酸序列及其保守氨基酸置换与第二种蛋白质的序列来测定在两种蛋白质之间的“相似性”。在两种蛋白质之间的同一性程度使用对于本领域技术人员广泛已知的计算机算法和方法进行测定。在两个氨基酸序列之间的同一性优选通过使用BLASTP算法[BLASTManual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894，Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410（1990）]进行测定。

TF蛋白质具有定义明确的结构域结构，其包含（1）当蛋白质从未成熟加工为成熟形式时，被翻译后加工的具有32氨基酸引导序列的信号肽或区域；（2）包含约219个末端氨基酸的N糖基化亲水细胞外结构域；（3）约23个氨基酸的片段，主要是疏水性的，其被认为形成跨膜结构域氨基酸；和（4）21-氨基酸羧基末端，其被认为是形成蛋白质细胞质片段的部分的氨基酸。hTF蛋白质的结构域结构允许例如蛋白质或其功能片段的细胞外结构域的产生。

在特定实施方案中，具有促凝活性的TF的片段包含成熟的TF蛋白质。如本文使用的术语“成熟TF”指其氨基酸序列缺乏信号肽的TF蛋白质。在优选实施方案中，所述成熟TF蛋白质包含人成熟TF蛋白质。进一步地，在特定实施方案中，所述人成熟TF蛋白质具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。

具有促凝活性的TF蛋白质的片段可以是糖基化的，部分糖基化的或非糖基化的。因此，在特定实施方案中，本发明的荷有TF的脂质微囊泡包含具有促凝活性的TF蛋白质的非糖基化片段，而在另一个特定实施方案中，本发明的所述荷有TF的酵母衍生的微囊泡包含具有促凝活性的TF蛋白质的糖基化片段。如上所述，术语“糖基化的”包括任何程度的糖基化。在优选实施方案中，具有促凝活性的TF或其功能变体含有至少一个无功能的N糖基化位点。

在优选实施方案中，一个或多个N糖基化位点是对应于在成熟人TF中的位置11-13上的N糖基化位点NLT、在位置124-126上的NVT、或在位置137-139上的NNT的那些。在一个更优选的实施方案中，TF携带Asn残基成为并非N糖基化受体的残基的一个或多个置换。在一个更加优选的实施方案中，TF变体包含对应于在成熟人TF中的位置11、124或137的位置中的Asn残基中的一个或多个Asn-至-Ala突变。

糖基化将取决于用于产生荷有TF的脂质囊泡的表达系统而改变。因此，本发明提供了重组哺乳动物组织因子蛋白质，其包括至少一种植物特异性聚糖、酵母特异性聚糖或动物特异性聚糖。

此外，如在TF蛋白质的情况下，在执行本发明中使用的具有促凝活性的TF蛋白质的片段可以是融合蛋白的成员，所述融合蛋白含有与包含另一种肽或蛋白质的第二个区域结合，包含其具有促凝活性的所述TF蛋白质片段的第一个区域。所述第二个区域可以与所述TF蛋白质片段的氨基末端区域结合，或备选地，所述第二个区域可以与所述TF蛋白质片段的羧基末端区域结合。第一个和第二个区域可以直接结合或通过在所述第一个和第二个区域之间的接头多肽结合。

在特定实施方案中，所述融合蛋白包含具有促凝活性的TF蛋白质的片段和与所述TF蛋白质片段的C末端或N末端结构域结合的标签。所述标签一般是可以在所述融合蛋白的分离或纯化中使用的肽或氨基酸序列。适合于产生这种融合蛋白的标签的举例说明性、非限制性例子包括先前与融合蛋白结合提及的那些，在所述融合蛋白中第一个区域是TF蛋白质。在特定实施方案中，所述标签是与具有促凝活性的所述TF蛋白质或其片段的C末端结构域结合的His-标签。在另一个实施方案中，所述标签是与具有促凝活性的所述TF蛋白质或其片段的N末端结构域结合的His-标签。在特定实施方案中，融合蛋白包含成熟TF蛋白质，优选人成熟TF蛋白质。这种融合蛋白还具有促凝活性，其促凝活性可以如先前提及的进行测定，例如通过实施例2中提及的凝血测定法中的任何一种进行测定。

此外，可以提供形成融合蛋白的部分的TF蛋白质，所述融合蛋白含有与第二个区域连接的包含TF蛋白质的第一个区域，所述第二个区域包含另一种肽或蛋白质。所述第二个区域可以与所述TF蛋白质的氨基末端区域结合，或备选地，所述第二个区域可以与所述TF蛋白质的羧基末端区域结合。第一个和第二个区域可以彼此直接结合，或可以通过在所述第一个和第二个区域之间的接头多肽结合

在特定实施方案中，所述融合蛋白包含TF蛋白质和与所述TF蛋白质的C末端或N末端结构域结合的标签，通常为肽标签。所述标签一般是可以在所述融合蛋白的分离或纯化中使用的肽或氨基酸序列。因此，所述标签能够与一种或多种配体结合，例如亲和基质例如具有高亲和力的色谱载体或珠的一种或多种配体。所述标签的例子是组氨酸标签（His-标签或HT），例如包含6个组氨酸残基的标签（His6或H6），其可以以高亲和力与镍（Ni2+）或钴（Co2+）柱结合。如实施例1（图4）中所示的，His-标签具有希望特征，它可以在对于大多数蛋白质变性且破坏大多数蛋白质-蛋白质相互作用的条件下结合其配体。因此，在诱饵已参与其中的蛋白质-蛋白质相互作用破坏后，它可以用于去除由H6加上标签的引诱蛋白。

对于分离或纯化融合蛋白有用的标签的另外举例说明性、非限制性例子包括Arg-标签、FLAG-标签、Strep-标签，能够由抗体识别的表位例如c-myc-标签（由c-myc抗体识别）、SBP-标签、S-标签，钙调蛋白结合肽，纤维素结合结构域，壳多糖结合结构域，谷胱甘肽S-转移酶-标签，麦芽糖结合蛋白，NusA、TrxA、DsbA、Avi-标签等（TerpeK.、Appl.Microbiol.Biotechnol.（2003），60:523-525），氨基酸序列例如Ala-His-Gly-His-Arg-Pro（SEQ ID NO:2）；Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser（SEQ IDNO:3）；Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys（SEQ ID NO:4）；β-半乳糖苷酶等。

在特定实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白质的C末端结构域结合的His-标签。在另一个实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白质的N末端结构域结合的His-标签。

在特定实施方案中，融合蛋白包含具有促凝活性的缺乏信号肽或其变体的人TF，其具有在糖基化位点上的N124A突变和在C末端上的六组氨酸标签，并且由（SEQ ID NO：5）给出。

所述融合蛋白可以通过常规方式获得，例如借助于在合适酵母细胞中基因表达编码所述融合蛋白的核苷酸序列。需要时，最后标签可以用于所述融合蛋白的分离或纯化。

在另一个特定实施方案中，本发明的第一种方法的第一个步骤涉及在真核细胞中表达具有促凝活性的TF的片段。

根据本发明，具有促凝活性的所述TF蛋白质或其片段的部分整合在所述脂质膜中。通常，所述部分包含所述蛋白质或片段的亲脂区域（即TF的中心结构域），而其亲水区域（即所述TF蛋白质的氨基末端区域和羧基末端区域）面对膜的外质或内质侧面。关于TF蛋白质的亲脂和亲水区域的信息可以得自WO2008080989。在特定实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的N末端结构域面对所述膜的外质侧面，而在另一个特定实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的N末端结构域面对所述膜的内质侧面。

TF或其变体的表达方法取决于使用的真核细胞。一般地，用表达载体转化真核细胞，所述表达载体包含与在可以在本发明中使用的任何细胞中的功能启动子可操作地连接的，编码具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的核苷酸序列：真菌、酵母、植物或动物（鱼、爬行动物、哺乳动物、昆虫等）细胞。

编码具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的cDNA可以通过聚合酶链反应（PCR）进行扩增，使用cDNA文库作为模板和合适引物。实施例1公开了在3'末端具有18个额外核苷酸（编码六组氨酸）的成熟hTF蛋白质的cDNA扩增。

如本文使用的，“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。如本文使用的，术语“酵母表达载体”指在酵母中由载体携带的DNA表达构建体，例如核酸区段、质粒、粘粒、噬菌体、能够合成由其各自重组基因（即具有促凝活性的TF蛋白质或其片段）编码的主题蛋白质的病毒或病毒颗粒。可替代地，使用非定向或同源重组，核酸区段还可以用于制备转基因酵母细胞，其中基因或目的基因稳定整合到酵母基因组内。通常，酵母表达载体包含与在酵母细胞中起作用的启动子（即酵母功能启动子）可操作地连接的，编码具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。用于与本发明一起使用的载体是例如在酵母细胞中能够自主复制和/或表达它们与之连接的核酸的载体。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。此外，本发明预期包括此类其他形式的表达载体，其发挥等价功能并且随后关于这点变得本领域已知的。所述酵母表达载体可以是酵母附加型表达载体或酵母整合型表达载体，并且它们可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。

因此，在一个实施方案中，所述酵母表达载体是酵母附加型表达载体。如本文使用的术语“酵母附加型表达载体”指在酵母细胞质中作为染色体外DNA分子维持的表达载体。在特定实施方案中，除了与酵母功能启动子可操作地连接的，编码具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的核苷酸序列外，所述酵母附加型表达载体进一步包含：（i）酵母选择基因；（ii）酵母复制起点；（iii）细菌选择基因；和（iv）酵母转录终止信号。有利地，所述酵母附加型表达载体进一步包含在酵母功能启动子的控制下用于克隆所选基因（具有促凝活性的TF蛋白质或其片段）的独特限制位点，且随后为酵母转录终止信号。

实际上任何酵母功能启动子、酵母选择基因、酵母复制起点、细菌选择基因、酵母转录终止信号和用于克隆的限制位点，可以用于制造所述酵母附加型表达载体；然而，在特定实施方案中，3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子（pGPD）用作酵母功能启动子；在另一个特定实施方案中，URA3基因（URA3）用作酵母选择基因；在另一个特定实施方案中，酵母2微米（2μ）复制起点用作酵母复制起点；在另一个特定实施方案中，氨苄青霉素抗性基因（Amp）用作细菌选择基因；并且在另一个特定实施方案中，磷酸甘油酸酯激酶（PGKt）的转录终止信号用作特异性酵母转录终止信号。因此，在特定实施方案中（实施例1-2），酵母附加型表达载体包含（i）URA3基因；（ii）用于在大肠杆菌（E.coli）中选择且繁殖载体的Amp基因；（iii）酵母2μ复制起点；（iv）pGPD；（v）PGKt的特异性酵母转录终止信号；和（vi）独特的BamHI限制位点，其允许在pGPD的控制下克隆所选基因，且随后为PGKt序列。在其他实施方案中，所述酵母表达载体是酵母整合型表达载体。如本文使用的术语“酵母整合型表达载体”指能够整合到酵母基因组内的载体。在特定实施方案中，所述酵母整合型表达载体包含：（i）细菌选择基因；和（ii）插入酵母选择基因中的表达盒，所述表达盒进一步包含酵母功能启动子、酵母转录终止信号和用于克隆所选基因（具有促凝活性的TF蛋白质或其片段）的独特限制位点。

实际上任何细菌选择基因、插入酵母选择基因中的表达盒、酵母功能启动子、酵母转录终止信号和用于克隆所选基因的独特限制位点可以用于制造所述酵母整合型表达载体；然而，在特定实施方案中，氨苄青霉素抗性基因（Amp）用作细菌选择基因；在另一个特定实施方案中，插入URA3基因的中心区域中的表达盒pGPD-BamHI-PGKt用作含有酵母功能启动子（pGDP）、酵母转录终止信号（PGKt）和用于在URA3基因的中心区域中克隆所选基因的独特限制位点（BamHI）的表达盒。

事实上对用所述酵母表达载体转化敏感的任何酵母细胞都可以用于本发明中，所述酵母表达载体包含与酵母功能启动子可操作地连接的，编码具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的核苷酸序列。用所述酵母表达载体的酵母细胞转化可以通过本领域技术人员已知的常规方法执行（Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A LaboratoryManual）。

在优选实施方案中，所述酵母是非絮凝酵母（即当它们在发酵过程中分散时，不会絮凝（聚集）的酵母细胞）。有利地，所述酵母细胞是GRAS酵母细胞。可以在本发明的过程中使用的酵母细胞的举例说明性、非限制性例子是所谓的液剂酵母（liquor yeast）物种（用于制备液剂的酵母），其通过代谢酿造材料液体来产生酒精、碳酸气、面包酵母等。具体地，优选酵母选自酿酒酵母。此类液剂酵母的例子包括啤酒酵母细胞、葡萄酒酵母细胞和清酒酵母细胞。在本发明的优选实施方案中，酵母细胞是葡萄酒酵母细胞例如酿酒酵母T73 ura3-（实施例1）。

如本文使用的，术语“植物表达载体”指在植物中由载体携带的DNA表达构建体，例如核酸区段、质粒、粘粒、噬菌体、能够合成由其各自重组基因（即具有促凝活性的TF蛋白质或其片段）编码的主题蛋白质的病毒或病毒颗粒。可替代地，使用非定向或同源重组，核酸区段还可以用于制备转基因植物细胞，其中基因或目的基因稳定整合到植物基因组内。通常，植物表达载体包含与在植物细胞中起作用的启动子（即植物功能启动子）可操作地连接的，编码具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。可以在本发明中使用的植物功能启动子可以选自玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、豌豆小亚基RuBP羧化酶、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、碧冬茄查尔酮异构酶、豆富含甘氨酸蛋白质1、马铃薯patatin、凝集素、CaMV 35S和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。植物宿主系统的转化可以通过使用常规方法来执行。关于植物的遗传转移的综述可以在通过Marta Izquierdo，Ed.Pirámide（1999）的名称为"Ingeniería genética and transferencia génica"的教科书，特别是第9章"Transferencia génica a plantas"，第283-316页中可见。

用于与本发明一起使用的载体是例如在酵母细胞中能够自主复制和/或表达它们与之连接的核酸的载体。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。此外，本发明预期包括此类其他形式的表达载体，其发挥等价功能并且随后关于这点变得本领域已知的。所述酵母表达载体可以是植物附加型表达载体或植物整合型表达载体，并且它们可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。实际上任何植物功能启动子、植物选择基因、植物复制起点、细菌选择基因、植物转录终止信号和用于克隆的限制位点，可以用于制造所述植物附加型表达载体。

已开发了大量特定植物生产系统。这些包括在油体上表达蛋白质（Rooijen等人（1995）Plant Physiology 109：1353-61；Liu等人（1997）Molecular Breeding 3:463-70）、通过根分泌（rhizosecretion）（Borisjuk等人（1999）Nature Biotechnology 17:466-69）、在种子中（Hood等人（1997）Molecular Breeding 3:291-306；Hood等人（1999）InChemicals via Higher Plant Bioengineering（编辑Shahidi等人）Plenum Publishing Corp.第127-148页；Kusnadi等人（1997）Biotechnology and Bioengineering 56:473-84；Kusnadi等人（1998）Biotechnology and Bioengineering 60:44-52；Kusnadi等人（1998）Biotechnology Progress 14：149-55；Witcher等人（1998）MolecularBreeding 4:301-12）、作为在病毒表面上的表位（Verch等人（1998）J.Immunological Methods 220:69-75；Brennan等人（1999）J.Virology73:930-38；Brennan等人（1999）Microbiology 145:211-20）、和通过在马铃薯块茎中稳定表达蛋白质（Arakawa等人（1997）TransgenicResearch 6:403-13；Arakawa等人（1998）Nature Biotechnology16:292-97；Tacket等人（1998）Nature Medicine 4:607-09）。重组蛋白质还可以靶向种子、叶绿体或被分泌，以鉴定给出最高水平的蛋白质聚集的位置。这些各自可以适合于在合适的植物宿主中表达组织因子或片段。

用于在植物中表达蛋白质的另外一般方法已得到报道。参见给予Bascomb，N.等人的PCT/US02/23624；和给予Hall，G.等人的PCT/US02/17927。这些可以容易地适合于在例如拟南芥属（Arabadopsis）以及多种其他植物中表达组织因子蛋白质或片段。

用于在单子叶植物和双子叶植物中表达异源蛋白质的进一步方法已得到报道。这些包括导致目的蛋白质的稳定和组成性表达的方法：1）土壤杆菌属介导的基因转移；2）直接DNA摄取包括用于将DNA直接摄取到原生质体内的方法；3）通过植物细胞的短暂电休克诱导的DNA摄取，4）通过粒子轰击、通过使用微量吸管系统或通过DNA与萌发的花粉的直接温育将DNA注射到植物细胞或组织内；和5）使用植物病毒作为基因载体。这些方法之一或组合可以用于制备表达组织因子或其功能片段的植物。

借助于改造的土壤杆菌属菌株的基因转移已变成用于大多数双子叶植物和用于一些单子叶植物的常规。参见例如，Fraley等人（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803。用于与本发明一起使用的进一步载体包括公开于例如美国专利号5,591,616和EPA 0604662A1中的那些“超二元的（super-binary）”。还参见Hood等人（1984）Biotechnol.2:702-709；Hood等人（1986）J.Bacteriol.168：1283-1290；Komari等人（1986）J.Bacteriol.166:88-94；Jin等人（1987）J.Bacteriol.169:4417-4425；Komari T.（1989）Plant Science 60:223-229；ATCC登记号37394）。

如本文使用的，术语“动物表达载体”指在动物中由载体携带的DNA表达构建体，例如核酸区段、质粒、粘粒、噬菌体、能够合成由其各自重组基因（即具有促凝活性的TF蛋白质或其片段）编码的主题蛋白质的病毒或病毒颗粒。可替代地，使用非定向或同源重组，核酸区段还可以用于制备转基因动物细胞，其中基因或目的基因稳定整合到动物基因组内。通常，动物表达载体包含与在动物细胞中起作用的启动子（即动物功能启动子）可操作地连接的，编码具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。

在特定实施方案中，动物细胞是昆虫细胞。昆虫转染系统的例子包括在本发明中使用的昆虫特异性病毒例如重组杆状病毒（参见实施例），及其他例如在美国专利US6130074A中所述的那些。

在其中TF或其变体待在其中表达的细胞是酵母的那些实施方案中，使用用于处理酵母和酵母遗传学的标准技术处理酵母。参见例如，Bacila等人，编辑（1978，Biochemistry and Genetics of Yeast，Academic Press，New York）；以及Rose和Harrison.（1987，The Yeasts（2.sup.nd ed.）Academic Press，London）。将外源DNA引入酵母宿主内的方法是本领域众所周知的。存在用于酵母转化的广泛多样的方法。原生质球转化由Hinnen等人（1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1919-1933）；Beggs（1978，Nature 275（5676）：104-109）；和Stinchcomb等人（EPO公开号45,573；通过引用合并入本文）教导。电穿孔由Becker和Gaurante（1991，Methods Enzymol.194：182-187）教导，乙酸锂由Gietz等人（2002，Methods Enzymol.350:87-96）和Mount等人（1996，Methods Mol.Biol.53：139-145）教导。关于非酵母属酵母的转化系统的综述，参见Wang等人（Crit.Rev Biotechnol.2001；21（3）：177-218）。关于酵母基因工程的一般程序，参见Barr等人（1989，Yeast genetic engineering，Butterworths，Boston）。

一旦用选择的TF表达载体转化真核细胞，下一个步骤就由培养重组真核细胞的培养物组成，所述重组真核细胞在允许表达具有促凝活性的TF蛋白质或其片段表达的条件下表达具有促凝剂的TF蛋白质或其片段。在特定实施方案中，所述真核细胞在适当的培养基中进行培养，其中所述真核细胞可以表达所需异源产物（具有促凝活性的TF蛋白质或其片段）。用于培养酵母、植物、昆虫、鱼、哺乳动物或其他真核细胞的合适培养基是本领域技术人员众所周知的，并且将根据待培养的真核细胞类型进行选择。可以使用用于制备发酵或培养产物的任何材料，只要它适合于由采用的真核细胞引起的发酵或生长，并且可以随意使用已知材料。当需要时可以向其中加入合适营养素等。

发酵或细胞培养条件与已知条件基本上没有不同，并且可以通过本领域技术人员选定。应调节的生长条件是气体组成（氧等）、温度、pH等。文件US5618676、US5854018、US5856123和US5919651描述足以使用酵母启动子表达重组蛋白质的方法和反应。在特定实施方案中，酵母细胞的发酵随后为在发酵过程自始至终控制主要参数的进化，并且它在氧压力（PO₂）达到定态时停止。

在第二个步骤中，本发明的第一种方法包括从细胞中回收荷有TF的微囊泡，所述细胞已在步骤（i）中获得。

如本文使用的术语“回收”指使荷有TF的微囊泡与完整或裂解细胞分离以及与其他细胞组分例如DNA、蛋白质等分离，且从而获得部分或完全纯化的荷有TF的微囊泡制备物的动作。在优选实施方案中，回收的馏分的纯度是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%和100%。

回收要求在不存在去污剂的情况下的细胞裂解，或当使用去污剂时，使用低于临界微团浓度（CMC）的所述去污剂浓度。在细胞得自完整生物体如转基因植物或转基因动物的情况下，回收可以包括使用机械或酶促方法将组织还原至细胞悬液的步骤。

在从细胞培养中回收荷有TF的微囊泡的情况下，可以通过常规方法例如通过离心使来自细胞培养的细胞悬液或细胞形成团块，并且在对所述产物实施匀浆化之前重悬浮于合适裂解缓冲液中。

植物和真菌细胞具有纤维素和壳多糖壁。因此，在匀浆化之前，可能需要额外步骤细胞，以便去除细胞壁。这个步骤可以使用机械（例如通过使用研钵和研棒、弗氏压碎器、搅拌器等）或酶促方法（例如使用纤维素酶、壳多糖酶等）在药学可接受的溶液或裂解缓冲液（水、磷酸盐缓冲盐水（PBS）等）的存在下执行。

此外，在匀浆化之前，碎片可以通过过滤或轻轻离心回收，一般为约l,000×g小于约30分钟，优选在约5–约20分钟之间。

用于从在本发明的第一种方法的第一个步骤中获得的细胞中回收荷有TF的微囊泡的方法可以取决于使用的真核细胞而改变，并且包括但不限于离心、凝胶过滤色谱、切向流过滤或其组合。

在优选实施方案中，细胞通过机械方法裂解，并且核、未破碎的细胞和碎片通过低速离心去除，提供核后上清液（PNS）。因此，在优选实施方案中，脂质微囊泡制备物是核后上清液。

在酵母细胞用作宿主细胞用于制备荷有TF的微囊泡的特定情况下，酵母细胞可以通过常规方法例如在匀浆器中的高压匀浆化，以提供发酵匀浆物。随后通过常规方法例如通过离心对发酵匀浆物实施分离，以提供含有具有促凝活性的所述荷有TF的酵母衍生微囊泡（即本发明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡）的细胞团块和澄清的酵母提取液（CYE），其可以分开控制。

具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的存在可以通过常规方法进行测定，例如通过蛋白质印迹分析通过使用特异性抗TF蛋白质单克隆抗体（mAb）。进一步地，CYE的促凝活性可以通过任何常规测定法进行测定，例如通过实施例4中提及的凝血测定法中的任何，例如一般通过在血浆或非抗凝全血中的体外凝血测定法等。

可以应用通过用标记的抗TF mAb的免疫电子显微镜检查进一步检查CYE样品，以便鉴定TF在酵母或其他真核生物衍生的微囊泡中的存在。包含具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的所述微囊泡也具有促凝活性，并且对应于本发明的荷有TF的真核生物衍生的微囊泡。

任选地，需要时，具有促凝活性的所述荷有TF的真核细胞衍生的微囊泡（例如酵母衍生的微囊泡）可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行浓缩，分离或纯化。作为举例说明，在C或N末端上含有肽标签（例如His-标签等）的蛋白质的亲和色谱纯化是用于获得大量蛋白质的高度纯化制备物的良好的标准化方法。作为任何色谱方法，任何方法可以容易地按比例扩大。可以执行备选的纯化程序例如免疫亲和色谱，尽管它要求特异性抗TF单或多克隆抗体的良好标准化原液的可用性，尤其是用于扩大生产。

因此，分离和纯化方法将尤其取决于具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的性质，即它是具有标签还是具有能够由抗体识别的表位（例如c-myc-标签（由c-myc抗体识别））等的融合蛋白，所述标签用于与亲和基质例如具有高亲和力的色谱载体或珠的一种或多种配体结合（例如His-标签等）。

在优选实施方案中，根据先前公开的过程，本发明的加上组氨酸标签的荷有TF的酵母衍生的微囊泡得自澄清的酵母提取液（CYE）。一般地，在装载到合适的亲和柱（例如HiTrap-亲和柱）前，将CYE过滤（例如通过经由切向流过滤的0.2μm孔径滤器）；随后，在施加样品后，回收流通物（未结合的材料），并且对柱实施几次洗涤，并且在末次洗涤后，通过向柱中加入合适的缓冲液（例如含有咪唑的缓冲液）洗脱荷有（TF-His-标签蛋白质）的酵母衍生的微囊泡，并且收集且透析洗脱馏分，以提供分离或纯化的荷有（TF-his-标签蛋白质）的酵母衍生的脂质微囊泡。

此外，在另一个实施方案中，本发明的荷有TF的微囊泡可以通过引发设备纯化。引发是来自General ElectricHealthcare的自动化液相色谱系统，其可以用于开发使用尺寸排阻色谱柱的标准纯化方案，其可以容易地扩大用于大量生产。在另一个实施方案中，可以使用切向流过滤或高效切向流过滤（HPTFF）。

在特定实施方案中，使用切向流过滤的一个或多个步骤和/或尺寸排阻色谱的一个或多个步骤的组合回收荷有TF的微囊泡。

在特定实施方案中，使用切向流过滤的一个步骤随后为一次尺寸排阻色谱且随后为另一次切向流过滤，回收荷有TF的酵母微囊泡。在优选实施方案中，第一次切向流过滤的孔径大于第二个（和后续）切向流过滤的孔径。在一个更优选的实施方案中，第一次切向流过滤的孔径是0.5-0.1μm，并且来自第二次切向流过滤的孔径是从0.2μm开始。

在第三个步骤中，本发明的第一种方法包括在足以将所述磷脂掺入所述微囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的微囊泡与负电荷磷脂（NCP）接触。

如本文使用的术语“磷脂”指含有一个或多个磷酸基的脂质。磷脂在性质中是两亲的；即，每个分子由亲水（亲水性（water-loving））部分和疏水（憎水性）部分组成。此处，术语“磷脂”包括此类化合物的药学可接受的盐和酯衍生物。

当磷脂携带甘油主链和其中脂质含有鞘氨醇的鞘脂时，它们可以根据在磷酸甘油酯（或甘油磷酸酯）中的醇类型进行分类。两个类别都存在于生物膜中。磷酸甘油酯是在自然界中发现的最丰富类别的磷脂，并且包括但不限于磷脂酰胆碱（卵磷脂）、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂。在每类磷酸甘油酯内的结构多样性是由于链长的变异性和脂肪酸酯基团的饱和度。

鞘磷脂是主要含鞘氨醇磷脂。它的一般结构由通过酰胺键附着至鞘氨醇的脂肪酸组成。

术语“负电荷磷脂”或“NCP”指在生理学pH水平，即超过约pH 7.3-7.5的范围，携带净负电荷的磷脂。可以在本发明中使用的负电荷磷脂的例子包括磷脂酰丝氨酸（PS）、二棕榈酰和二硬脂酰磷脂酸（DPPA）、DSPA）、二棕榈酰和二硬脂酰磷脂酰丝氨酸（DPPS、DSPS）、二棕榈酰、二硬脂酰磷脂酰甘油（DPPG、DSPG）、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘脂（神经酰胺-1-磷酸；糖基化（glycosilated）磷脂酰乙醇胺；硫苷脂（羟基化（hidroxilated）或未羟基化的）；神经节苷脂）、磷脂酰肌醇磷酸和磷脂酸。

在优选实施方案中，负电荷磷脂是磷脂酰丝氨酸（PS），其是通过在磷脂酸分子中的磷酸基和在丝氨酸中的羟基之间的酯化反应形成且具有下式中所示结构的磷脂

其中R是脂肪酸。如本文使用的，术语“脂肪酸”指从约C12到C22不同链长的长链脂肪族酸（链烷酸），含有零个、一个或超过一个不饱和。优选地，脂肪酸选自硬脂酸（18:0或十八烷酸）、油酸（18：1顺式-9或（9Z）-十八碳-9-烯酸）、棕榈酸（16:0或十六烷酸）、亚油酸（18:2（ω-6）或顺式，顺式-9,12-十八碳二烯酸）、花生四烯酸（20:4（ω-6）或全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸）、二十二碳六烯酸（22:6（n-3或（4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z）-二十二-4,7,10,13,16,19-六烯酸）。

用于在本发明中使用的负电荷磷脂可以是纯化或分离的或基本上纯的。当化合物与天然伴随其的组分分离时，它是“基本上纯的”。一般地，当化合物是样品中按重量计至少60%、更一般75%或超过90%的总材料时，它是基本上纯的。基本上纯的磷脂可以例如通过从天然来源中提取或通过化学合成来获得。因此，例如化学合成的磷脂一般基本上不含它天然结合的组分。纯度可以使用任何合适的方法例如柱色谱、凝胶电泳、HPLC等进行测量。然而，负电荷磷脂无需在本发明中使用之前纯化，前提是磷脂不与实质上干扰其效用的组分结合。技术人员应当理解负电荷磷脂的天然来源或部分纯化的来源可以用于本发明中，并且负电荷磷脂组分可以构成小百分比（例如10-20%，但优选至少30%、40%、50%或更多）的得自此类来源的总材料。

使本发明的第一种方法的第二个步骤（ii）中获得的微囊泡与负电荷磷脂接触的过程在足以将负电荷磷脂掺入脂质微囊泡内的条件下进行。可以在温育步骤过程中最佳化的变量包括温度、pH、适当的缓冲液、湿度、组分浓度、溶液、洗涤步骤等；这些变量可以根据需要进行调整，以获得最佳的微囊泡/磷脂比。

如前所述，在本发明的第一种方法的步骤（i）中获得的囊泡制备物由膜脂质以及蛋白质组成，所述蛋白质包括在宿主细胞中表达的组织因子或其变体，以及在宿主中内源性出现的膜结合蛋白质。然而，为了定量微囊泡得率的目的，将微囊泡浓度表示为微克蛋白质/体积单位一般是更方便的。使用标准蛋白质定量技术，例如Bradford测定法、BCA测定法、Biuret测定法等，可以测定在微囊泡样品中的蛋白质浓度。

一旦已测定微囊泡中的蛋白质浓度，就可以使用任何合适的磷脂与微囊泡比执行接触步骤。技术人员应当理解在接触步骤中磷脂与囊泡的比可以根据需要加以改变，以便实现显示最佳性质的囊泡制备物。优选地，通过将使用的特定负电荷磷脂与增加浓度的在步骤（ii）中获得的微囊泡混合，并且测定所得到的囊泡的凝血时间直至测定两种组分的最佳浓度时，使用“饱和曲线测定法”可以计算负电荷磷脂的适当终浓度。虽然这个浓度比通常对应于导致基本上无游离负电荷磷脂（即不掺入微囊泡）的浓度比，但本发明还考虑导致过量的未掺入磷脂可以通过常规方法去除的两种组分的比。本领域技术人员还应当理解负电荷磷脂将以不同比率包括在步骤（ii）中获得的微囊泡的脂质双层中，取决于负电荷磷脂的性质和在步骤（ii）中获得的微囊泡（即酵母衍生的微囊泡、昆虫衍生的微囊泡等）的性质。

在优选实施方案中，使用约0,1-1000μg/ml、1-100μg/ml、10-90μg/ml、20-80μg/ml、30-70μg/ml、40-60μg/ml、45-55μg/ml或μg/ml的蛋白质浓度执行接触步骤。在接触步骤中的磷脂浓度优选是0,001mM-1mM、0,005mM-0,5mM、0,1mM-0,4mM、0,2mM-0,3mM。

在优选实施方案中，使用约Xμg蛋白质与约0,005-1μmol磷脂的蛋白质/磷脂比执行接触步骤，其中X是约5、10、30、40、50、60、70、80、90或100。在一个更加优选的实施方案中，对于具有50或小于50μg蛋白质的囊泡制备物使用0,05μmol磷脂，或对于具有至少50μg蛋白质的囊泡制备物使用1μmol磷脂执行接触步骤。

虽然接触步骤通常在足以将大多数磷脂掺入囊泡内而不留下任何大量磷脂过量的条件下执行，但在可以执行其中从步骤（ii）中获得的富含磷脂的微囊泡制备物中去除过量的负电荷磷脂的另外步骤的情况下，可能不一定如此。用于去除过量的不同方法是本领域技术人员已知的，例如另外的洗涤步骤、层分离、离心、色谱等。

过量磷脂可以通过许多方法从富含磷脂的微囊泡中去除，导致具有与脂质双层结合且插入通过脂质双层的组织因子的稳定的荷有TF的微囊泡组合物。去污剂去除的合适方法包括透析、切向流渗滤、横向流空心纤维过滤、用疏水色谱树脂处理和简单稀释。

本发明的第二种方法

在第二个方面，本发明涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡、或本发明的第二种微囊泡的方法，其包括步骤

（i）提供得自真核细胞的脂质微囊泡，

（ii）在足以将所述TF蛋白质或其变体掺入所述微囊泡内的条件下，使具有促凝活性的TF蛋白质或其变体与如（i）中定义的脂质微囊泡接触，和

（iii）在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的囊泡与负电荷磷脂接触，

其中步骤（ii）和（iii）可以以任何次序执行。

术语“TF”、“具有促凝活性的TF变体”和“负电荷磷脂”已在本发明的第一种方法的上下文中描述，并且可同样应用于本发明的第二种方法。

在本发明的第二种方法的第一个步骤中，提供得自真核细胞的脂质微囊泡。在本发明的第二种方法中使用的脂质微囊泡可以是衍生自如本发明的第一种方法中所述的任何类型的真核细胞的微囊泡，使用在本发明的第一种方法中所述的方法，并且包括但不限于从酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、鱼细胞和植物细胞中分离的囊泡。如在本发明的第一种方法的上下文中描述的，脂质微囊泡一般在不存在去污剂的情况下或在其中这些以低于临界微团浓度的浓度发现的去污剂的存在下获得。

在第二个步骤中，在足以将所述TF蛋白质或其变体掺入所述微囊泡内的条件下，使脂质微囊泡与具有促凝活性的TF蛋白质或其变体接触。如上所述获得的微囊泡随后与TF蛋白质接触，所述TF蛋白质可以得自组织提取物或作为（部分）纯化的重组蛋白质提供。提取物的制备和TF的纯化可以由几种组织例如大脑、胎盘和肺组织执行，并且由不同动物例如绵羊、牛、兔、犬和人执行。提取物的制备和TF蛋白质的纯化可以如US5622931中所述执行，但不限于其。使用的TF可以是重组TF（rTF），其可以得自任何细胞表达系统，优选得自真核细胞。在执行本发明中使用的rTF可以进一步是融合蛋白的部分，如先前描述的。用于异源表达可以在本发明的第二种方法中使用的蛋白质的真核细胞和方法先前已得到描述。

本发明的第二种方法可以进一步包括去除来自步骤（ii）的TF过量的步骤。用于去除来自步骤（ii）的TF过量的方法基本上与在本发明的第一种方法的上下文中提及的那些相同，并且包括凝胶过滤色谱、差异离心、密度梯度离心等。

在第三个步骤中，本发明的第二种方法包括在足以将磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的囊泡与负电荷磷脂接触。

可以在本发明中使用的负电荷磷脂以及足以将磷脂掺入所述囊泡内的条件已在本发明的第一种方法中详细描述。在优选实施方案中，使用的负电荷磷脂是磷脂酰丝氨酸。

表达“足以将磷脂掺入囊泡中的条件”在本文中应理解为允许磷脂自由移动且整合到微囊泡中的任何条件。虽然未具体限制，但该条件通常涉及约4C-90C、10C-80C、15C-70C、20C-60C、25C-50C、30C-40C的温度或室温，2-12、3-11、4-10、5-9、6-8或7的pH和生理学盐浓度。

在优选实施方案中，使用具有约0,1-1000μg/ml、1-100μg/ml、10-90μg/ml、20-80μg/ml、30-70μg/ml、40-60μg/ml、45-55μg/ml或μg/ml的蛋白质浓度的囊泡制备物执行接触步骤。在接触步骤中的磷脂浓度优选是0,001mM-1mM、0,005mM-0,5mM、0,1mM-0,4mM、0,2mM-0,3mM。

在优选实施方案中，使用约X与约0,005-1μmol磷脂的蛋白质/磷脂比执行接触步骤，其中X是约5、10、30、40、50、60、70、80、90或100μg蛋白质。在一个更加优选的实施方案中，对于具有50或小于50μg蛋白质的囊泡制备物使用0,05μmol磷脂，或对于具有至少50μg蛋白质的囊泡制备物使用1μmol磷脂执行接触步骤。

本发明的第二种方法可以进一步包括去除来自步骤（iii）的PS过量的步骤。用于去除来自步骤（iii）的PS过量的方法基本上与在本发明的第一种方法的上下文中提及的那些相同，并且包括凝胶过滤色谱、差异离心、密度梯度离心等。

本发明的第二种方法还可以以倒序执行步骤（ii）和（iii）来进行，即通过首先使囊泡与负电荷磷脂接触，随后使第一个步骤中获得的囊泡与TF接触。因此，在另一个方面，本发明包括其中在用于将磷脂掺入所述囊泡内的合适条件下，使脂质微囊泡与负电荷磷脂接触的第一个步骤，和其中在足以将重组TF掺入微囊泡内的条件下，使在第一个步骤中获得的囊泡与具有促凝活性的重组TF或其变体接触的第二个步骤。

足以执行第一个和第二个步骤的条件基本上如上所述。

本发明的微囊泡

本发明的第一种和第二种方法导致荷有TF的微囊泡，与未与负电荷磷脂接触的微囊泡相比较，其显示改善的促凝性质和增加的稳定性。因此，在另一个方面，本发明涉及已使用本发明的第一种或第二种方法制备的微囊泡。

术语“微囊泡”已在上文详细描述并且基本上指基本上包含脂质单层或脂质双层的闭合区室。微囊泡可以显示在宽范围内改变的直径。通常，所述尺寸等于或低于10μm，一般等于或低于0.5μm。在特定实施方案中，本发明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡的尺寸范围为10-0.01μm。因为根据本发明的方法获得的微囊泡衍生自真核生物，所以它们的蛋白质和脂质组成将反映它衍生于其中的生物体的膜的那种。

在微囊泡衍生自酵母细胞的特定情况下，它们通常含有酵母特异性磷脂例如麦角固醇和心磷脂。

当微囊泡衍生自植物细胞时，这些含有植物细胞膜特异性脂质例如植物甾醇、甾烷醇、甾烷醇酯、生育酚、d-α生育酚、d，I-α生育酚、生育三烯酚、植物甾醇或三萜包含β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾醇、谷甾醇、脱氢胆甾醇、多孔甾醇、穿贝海绵甾醇或菜子甾醇。

当微囊泡衍生自动物细胞时，这些含有动物细胞膜特异性脂质例如胆固醇或一般的哺乳动物膜脂质组成。

当微囊泡衍生自昆虫细胞时，这些含有昆虫细胞膜特异性脂质或一般的昆虫膜脂质组成，例如大量二酰甘油（Insect Lipids：Chemistry，Biochemistry，and Biology Book by David W.Stanley-Samuelson，Dennis R.Nelson；University of Nebraska Press，1993）。

尽管优选本发明的微囊泡不含其他粒性物质，但在微囊泡的大范围纯度内观察到促凝效应。因此，本发明的微囊泡可以在这样的制备物中提供，就非微囊泡粒性物质而言，所述制备物包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%微囊泡。

本发明的冻干组合物

如本领域技术人员应认识到的，本发明的微囊泡组合物中的任何可以冻干用于贮存，并且借助于剧烈搅动例如用水性介质（例如无菌水、磷酸盐缓冲液或水性盐水溶液）重构。

术语“冻干”、“冷冻干燥”或其语法等价变体指一般用于保存易腐材料或使得材料对于转运更方便的脱水过程，其通过使材料冷冻且随后减少周围压力且加入足够的热以允许材料中的冷冻水从固相直接升华到气体而发挥作用。

可以使用的不同冻干和冷冻程序是本领域技术人员已知的。冻干可以使用标准设备例如旋转蒸发器、歧管冷冻干燥器和盘式冷冻干燥器执行。在特定实施方案中，本发明的药物组合物可以在干冰上冷冻，随后使用以-40℃开始且以室温结束的循环经过48小时时期冻干。所得到的试剂可以伴随0.1M Tris，pH 7.5，150mM海藻糖的添加重构至工作浓度，以获得含有以大约10-250μg/ml的本发明的第一种或第二种囊泡的溶液。

为了预防由于冻干的脂质和/或囊泡粘着或融合，包括预防此类融合或粘着出现的冷冻保护剂可以是有用的。术语“冷冻保护剂”指保护实施脱水-再水合、冻融或冻干-再水合的脂质颗粒不受囊泡融合和/或囊泡内容物渗漏的试剂，并且包括但不限于山梨糖醇、甘露醇、氯化钠、葡萄糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和聚（乙二醇）（PEG），例如PEG 400。这些及其他添加剂在文献中描述，例如U.S.Pharmacopeia，USP XXII，NF XVII，The United StatesPharmacopeia，The National Formulary，United States PharmacopeialConvention Inc.，12601Twinbrook Parkway，Rockville，Md.20852，其公开内容在此通过引用整体合并入本文。冻干制备物一般具有更大贮存期限的优点。

本发明的第一种药物组合物

在另一个方面，本发明涉及本发明的药物组合物，其包含以溶液/悬液或冻干形式的根据本发明的第一种和第二种方法获得的囊泡和药学活性的媒介物。所述药物组合物随后以适合于其施用于受试者的药物施用形式进行配制。

本发明的药物组合物包含本发明的微囊泡，其包含具有促凝活性的人TF蛋白质或其任何变体，并且已在上文详细描述，包括成熟的人TF、截短的人TF、TF的糖基化变体、加上标签的TF和携带上述修饰中的超过一个的变体，例如携带在C末端上的六组氨酸标签和N124A突变的成熟TF。

如本文使用的，术语“药学可接受的媒介物”指适合于将在本发明的方法中有用的治疗组合物递送至体内或离体部位的任何物质，而不引起不希望有的不利效应，例如毒性、刺激、变态反应或具有适当的出现风险的其他问题或并发症。实际上，不会不利地影响本发明的第一种或第二种微囊泡的任何媒介物可以用于本发明的所述组合物中。在一个实施方案中，所述媒介物是基本上液体的介质，例如通过操作本发明过程获得的围绕本发明荷有TF的微囊泡的介质。因此，在特定实施方案中，本发明的第一种组合物包含在本发明的过程操作中获得的澄清的真核生物提取液，其中已加入负电荷磷脂。

关于载体和赋形剂以及适合于施用本发明的所述产物的所述施用形式的信息可以在植物药学论文中发现。一般而言的药物的不同药物施用形式及其制备过程的综述可以在通过C.Fauli i Trillo的名称为"Tratado de Farmacia Galenica"，第1版，1993，Luzan 5，S.A.ofEdiciones的书本中找到。

在特定实施方案中，根据本发明的第一种和第二种方法获得的微囊泡可以配制在一起。

在特定实施方案中，包含本发明的荷有TF的微囊泡的药物组合物可以与凝血促进剂配制在一起。

在本发明中，“凝血促进剂”可以视为促进血液通过其形成凝块的过程的任何试剂。

作为凝血促进剂有用的试剂是吸附性化学制品例如zeolin；凝血酶；凝固级联的组分例如凝血因子II、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII等；辅因子例如钙、维生素K；等。在优选实施方案中，使用的凝血促进剂选自因子VII（作为前体或活性形式）、因子X（作为前体或活性形式）及其组合。

尽管优选本发明的药物组合物包含纯化的微囊泡，但组合物包含基本上纯化的微囊泡也是可能的。微囊泡可以通过上文提及的任何方法进行纯化，以便获得就非微囊泡粒性物质而言，包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%微囊泡的制备物。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的荷有TF的微囊泡。所述量可以在大范围内改变，取决于剂量、施用途径等。一般地，本发明的药物组合物可以包含在约10μg本发明的活性微囊泡/ml和300μg本发明的活性微囊泡/ml之间，并且优选在20μg活性蛋白质/ml和200μg活性蛋白质/ml之间，并且更加优选在约50μg本发明的活性微囊泡/ml和100μg本发明的活性微囊泡/ml之间。

待施用于受试者的剂量可以在非常宽的范围内改变，例如在约1.0pg本发明的活性微囊泡/ml和1.0mg本发明的活性微囊泡/ml之间，优选在0.05μg本发明的活性微囊泡/ml和100μg本发明的活性微囊泡/ml之间，并且更加优选在约0.1μg本发明的活性微囊泡/ml和50μg本发明的活性微囊泡/ml之间。待施用的本发明的第一种或第二种微囊泡剂量将取决于几个因素，在其中包括使用的具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的特征，例如其活性和生物学半衰期、在制剂中具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的浓度，受试者或患者的临床病状，待治疗的出血病症等。为此，本文提及的剂量必须仅视为本领域技术人员的指导，并且这个人可以根据先前提及的变量调整剂量。然而，本发明的药物组合物可以每天施用一次或多次用于预防或治疗目的。

其中荷有TF的微囊泡是冻干的，它们可以在施用于动物之前重悬浮于溶剂中用于再装配。当冻干递送时，一旦组合物暴露于动物体内的亲水环境，微囊泡就自发再形成。

本发明的第二种药物组合物

本发明的作者已观察到得自真核细胞的包含TF的微囊泡的促凝活性可以通过将囊泡与凝血促进剂组合得到协同增强。

因此，在另一个方面，本发明涉及包含下述的药物组合物

（i）通过包括下述步骤的方法获得的微囊泡

a）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体，和

b）从步骤（i）的细胞中回收荷有TF的微囊泡，

（ii）至少一种促进凝血的试剂，和

（iii）药学有效的媒介物。

术语“微囊泡”、“TF”、“TF的功能等价变体”、“真核细胞”、“促进凝血的试剂”和“药学有效的媒介物”已在上文详细描述，并且基本上以与关于本发明的第二种药物组合物相同的方式使用。

本发明的第二种药物组合物的第一种组分是通过包括下述步骤的方法获得的微囊泡

a）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其功能等价变体，和

b）从步骤（i）的细胞中回收荷有TF的微囊泡。

在优选实施方案中，真核细胞是酵母细胞，在这种情况下微囊泡酵母膜衍生自在本发明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡生产中使用的酵母细胞，且包含通常形成酵母膜的部分的脂质和一般嵌入酵母膜中的蛋白质。一般地，膜由蛋白质可以嵌入其中的两个定向脂质层（即脂质双层）组成。其为细胞膜的基本结构的脂质双层通常由水环境中的两性分子（例如磷脂、脂肪酸等）形成，每个分子由在层外的亲水基团和层内部的疏水基团定向。微囊泡衍生自酵母细胞膜或其片段，例如酵母细胞质膜或其片段。在另一个特定实施方案中，所述酵母衍生的微囊泡衍生自细胞内酵母细胞细胞器膜或其片段，例如核、高尔基体、内质网等。

一般而言，所述酵母衍生的微囊泡将由在其生产中使用的酵母细胞进展（例如在对酵母发酵产物实施如实施例1中公开的过程中所示的匀浆化处理后）。实际上，任何酵母细胞都可以用于产生所述酵母衍生的微囊泡，有利地非絮凝酵母细胞，且优选由联邦药物管理局（FDA）分类为对于人消费“公认安全的”（或GRAS）酵母细胞的酵母细胞，因为所述GRAS批准的物质不需要由FDA的上市前批准，因为它们对于动物包括人类是基本上无害（inocuous）的。可以在用于产生本发明的荷有TF的酵母衍生微囊泡的过程中使用的酵母细胞的举例说明性、非限制性例子是所谓的液剂酵母物种，其通过代谢酿造材料液体来产生酒精、碳酸气、面包酵母等。具体地，优选酵母细胞包括来自酵母属物种等的酵母细胞，例如酿酒酵母菌株T73ura3-、酿酒酵母菌株T73的衍生物、在葡萄酒生产中广泛使用的菌株（实施例1）或毕赤酵母属物种。

用于产生TF或其功能等价变体以及用于从真核细胞中回收微囊泡的适当方法已在本发明的第一种方法的上下文中详细说明，且可同样应用于用于获得形成本发明的第二种药物组合物的部分的微囊泡的方法。

术语“TF”基本上如上所述，并且包括来自任何物种的天然TF以及其功能等价变体，并且其已在上文详细描述，包括成熟的人TF、截短的人TF、TF的糖基化变体、加上标签的TF和携带上述修饰中的超过一个的变体，例如携带在C末端上的六组氨酸标签和N124A突变的成熟TF。在优选实施方案中，TF是成熟TF蛋白质。在一个更加优选的实施方案中，TF是人成熟TF蛋白质。在另一个优选实施方案中，TF是携带N124A突变和/或携带在C末端上的六组氨酸标签的成熟的人TF。

所述药物组合物随后以适合于其施用于受试者的药物施用形式进行配制。

实际上，不会不利地影响本发明的第一种或第二种微囊泡的任何媒介物可以用于本发明的所述组合物中。在一个实施方案中，所述媒介物是基本上液体的介质，例如通过操作本发明过程获得的围绕本发明荷有TF的微囊泡的介质。因此，在特定实施方案中，本发明的第一种组合物包含在本发明的过程操作中获得的澄清的真核生物提取液，其中已加入负电荷磷脂。

关于载体和赋形剂以及适合于施用本发明的所述产物的所述施用形式的信息可以在植物药学论文中发现。一般而言的药物的不同药物施用形式及其制备过程的综述可以在通过C.Faulíi Trillo的名称为"Tratado de Farmacia Galénica"（"Galenic Pharmacy Treatise"），第1版，1993，Luzán 5，S.A.of Ediciones的书本中找到。

尽管优选本发明的药物组合物包含纯化的微囊泡，但组合物包含基本上纯化的微囊泡也是可能的。微囊泡可以通过上文提及的任何方法进行纯化，以便获得就非微囊泡粒性物质而言，包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%微囊泡的制备物。

本发明的第二种药物组合物包含治疗有效量的荷有TF的微囊泡。所述量可以在大范围内改变，取决于剂量、施用途径等。一般地，本发明的药物组合物可以包含在约10μg本发明的活性微囊泡/ml和300μg本发明的活性微囊泡/ml之间，并且优选在20μg活性蛋白质/ml和200μg活性蛋白质/ml之间，并且更加优选在约50μg本发明的活性微囊泡/ml和100μg本发明的活性微囊泡/ml之间。

待施用于受试者的剂量可以在非常宽的范围内改变，例如在约1.0pg本发明的活性微囊泡/ml和1.0mg本发明的活性微囊泡/ml之间，优选在0.05μg本发明的活性微囊泡/ml和100μg本发明的活性微囊泡/ml之间，并且更加优选在约0.1μg本发明的活性微囊泡/ml和50μg本发明的活性微囊泡/ml之间。待施用的本发明的第一种或第二种微囊泡剂量将取决于几个因素，在其中包括使用的具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的特征，例如其活性和生物学半衰期、在制剂中具有促凝活性的TF蛋白质或其片段的浓度，受试者或患者的临床病状，待治疗的出血病症等。为此，本文提及的剂量必须仅视为本领域技术人员的指导，并且这个人可以根据先前提及的变量调整剂量。然而，本发明的药物组合物可以每天施用一次或多次用于预防或治疗目的。

本发明的第二种药物组合物可以以其中一种或多种组分已冻干的冻干形式提供。技术人员应当理解组合物以不同形式提供，例如：

-冻干的微囊泡和在悬液中的凝血促进剂，

-在悬液中的微囊泡和冻干的凝血促进剂，

-冻干的微囊泡和冻干的凝血促进剂。

其中微囊泡和凝血促进剂都以冻干形式提供，两种组合可以组合的单一制备物中，或可以在分开容器中提供。其中荷有TF的微囊泡是冻干的，它们可以在施用于动物之前重悬浮于溶剂中用于再装配。当冻干递送时，一旦组合物暴露于动物体内的亲水环境，微囊泡就自发再形成。类似地，其中凝血促进剂是冻干的，它可以在施用于动物之前重悬浮于溶剂中用于再装配。当冻干递送时，当暴露于动物体内的亲水环境时，重构凝血促进剂。

本发明的治疗用途

血液凝固相关用途

不同测定法已显示包含已用负电荷磷脂处理的荷有TF的微囊泡的本发明的微囊泡具有增强的促凝活性和增加的稳定性。实施例2显示体外测定法，其证实本发明的微囊泡在健康和患者病状中引起纤维蛋白凝块形成和血液凝固，包括来自健康患者的血浆和血液，缺乏FVIII、FIX或FXI的血浆（在血浆中的凝血测定法）；来自显示获得性血小板缺乏的患者的血液（在血小板减少的血液中的凝血测定法）、在抗FVII抗体的存在下缺乏FXI的血浆（在血浆中的凝血测定法），以及来自血友病、von Willebrand和华法林化（warfarinized）患者的血液。这些结果明确显示本发明的荷有TF的酵母衍生的微囊泡是用于局部治疗受试者中的出血的促凝血剂或止血剂。

因此，在另一个方面，本发明的微囊泡和本发明的药物组合物可以在治疗受试者中的出血中用作药物，即作为促凝血剂，或作为止血剂，特别是作为用于局部应用的止血剂。因此，在另一个方面，本发明涉及用于用作药物的本发明的第一种或第二种微囊泡。在进一步方面，本发明涉及用于治疗受试者中的出血的方法，其包括给所述受试者施用本发明的微囊泡或组合物，涉及本发明的微囊泡或组合物用于制造用于治疗受试者中的出血的药物的用途，以及用于在出血治疗中使用的本发明的微囊泡或组合物。

本发明的微囊泡可以直接局部用于治疗受试者中的出血，即无需与药学可接受的媒介物组合，因为这些微囊泡对于受试者是基本上无害的。然而，一般优选本发明的微囊泡以适合于其施用的药物施用形式进行配制，优选其用于出血的局部（局限性）治疗的局部施用。

随后，本发明的微囊泡可以以药物施用形式，优选适合于其局部施用的药物施用形式进行配制，为此将掺入适合于制备所需药物施用形式的药学可接受的载体和赋形剂。关于载体和赋形剂以及适合于施用本发明的所述产物的所述施用形式的信息可以在植物药学论文中发现。一般而言的药物的不同药物施用形式及其制备过程的综述可以在通过C.Faulíi Trillo的名称为"Tratado de Farmacia Galénica"（"Galenic Pharmacy Treatise"），第1版，1993，Luzán 5，S.A.ofEdiciones的书本中找到。

尽管可以使用本发明的微囊泡的不同药物施用形式，但局部施用所述产物在实践中是最有利的；因此，本发明的所述第一种或第二种微囊泡将以适合于其局部施用的药物形式进行配制。所述药物形式的举例说明性、非限制性例子包括气溶胶、溶液、悬液、乳状液、凝胶、药膏、乳膏、敷料、贴剂、软膏、漱口水等。为此，本发明的第一种和第二种药物组合物将包括对于制备用于局部施用的本发明微囊泡的药物施用形式所需的药学可接受的媒介物、载体和/或赋形剂。

因此，在特定实施方案中，本发明的药物组合物是用于局部施用本发明的微囊泡的药物组合物，其包含所述产物和适合于局部施用本发明的所述微囊泡的药学可接受的媒介物、载体或赋形剂。

适合于局部施用本发明的所述第一种或第二种微囊泡的药学可接受的媒介物、载体或赋形剂的举例说明性、非限制性例子是可以在植物药学论文中发现。

本发明的微囊泡及其组合和本发明的药物组合物及其组合可以连同在出血素质的预防和/或治疗中有用的另外药物（例如凝血因子、人血浆等）一起使用，以提供联合治疗。所述另外药物可以是相同药物组合物的部分，或备选地，它们可以以分开组合物的形式提供，用于其就本发明的药物组合物的施用而言的同时或相继（在时间上顺次）施用。

本发明的药物组合物还可以置于载体上。因此，在另一个方面，本发明涉及包含本发明的药物组合物或其组合和载体的产品。如本文使用的，术语“载体”指合适材料的基底，其允许本发明的药物组合物在其上沉积，其转运及其在所需部位的释放，例如在其中本发明的药物组合物发挥其疗效的部位中。所述载体可以是固体载体或非固体载体，例如液体载体或气体载体。固体载体的举例说明性、非限制性例子包括敷料、创可贴、敷布、石膏等。液体载体的举例说明性、非限制性例子包括凝胶、喷雾剂、漱口水等。气体载体的举例说明性、非限制性例子包括空气、推进剂等。通过常规方法例如通过将本发明的微囊泡和载体混合，可以获得包含本发明的微囊泡或本发明的药物组合物的这种产品。在本发明的微囊泡和载体之间的相互作用可以是物理或化学相互作用，取决于囊泡组分的性质、本发明的组合物或药物组合物和使用的载体。

在其他方面，本发明涉及用于治疗受试者中的出血特别是用于局部治疗健康受试者或具有出血素质的受试者中的出血的本发明的微囊泡或本发明的药物组合物或其组合。

如本文使用的，术语“局部治疗”指治疗直接在需要它的部位处的应用，例如在皮肤的不连续切断面（切口等）和在由于开放性伤口、手术等的静脉和动脉出血中的血管组织（破裂血管等），以及在皮肤粘膜和微血管出血中。

根据本发明和如实施例2中所示，本发明的微囊泡可以充当促凝血剂或止血剂，并且因而，所述产品可以用于治疗或校正出血病症，特别是与出血素质相关的那些出血病症。

术语“出血素质”指引起出血病症并且因此引起出血综合征的出现的过程，其可以偶然伴随延长和过量流血出现。出血素质可以通过先天性或获得性凝血病和/或通过先天性和获得性血小板病症引起。

术语“凝血病”指凝血因子病症。这种病症可以是由于特异性凝血因子缺乏或缺少，其后果将是出血综合征的出现，或由于凝血因子病症。凝血病一般可以是先天性凝血病或获得性凝血病。

作为先天性凝血病的举例说明性、非限制性例子，可以提及选自下述的凝血因子缺乏：其缺少或缺乏引起血友病A的凝血因子V（FV）、凝血因子VII（FVII）、凝血因子VIII（FVIII），其缺少或缺乏引起血友病B的凝血因子IX（FIX），其缺少或缺乏引起血友病C的凝血因子X（FX）、凝血因子XI（FXI），凝血因子XII（FXII）、凝血因子XIII（FXIII）及其组合。

获得性凝血病可以具有不同起源。举例说明性例子包括在严重肝衰竭中的凝血因子合成缺乏、抗凝疗法（例如肝素、低分子量肝素、华法林、香豆素衍生物、双香豆素等）。备选机制基于凝血因子的过度消耗，从而使得它们无法在流血损害中形成凝块。这种机制在弥漫性血管内凝血综合征或凝血病中出现，由于在多种病中出现的消耗，例如在伴随多重微血栓形成的损害微循环内皮活化血小板和凝血因子的严重败血症中；在通过TF例如胎盘释放的血液侵入中；在死胎的保留中；在具有组织破碎的多次创伤中；在毒蛇咬伤中等。在血管炎中，顶骨和内皮损害释放凝血激活物。由于纤溶酶的作用伴随PDF（其是抗血小板的且是抗凝血药）释放，凝血因子的消耗通过众多微血栓的纤维蛋白裂解而恶化。

术语“血小板病症”指在血小板数目和功能能力中的病症，其结果是出血综合征的出现。所述血小板病症可以是先天性或获得性的。

在特定实施方案中，所述血小板病症是先天性血小板病症。先天性血小板病症的举例说明性、非限制性例子包括葛氏（Glanzmann's）病、伯-索二氏（Bernard Soulier）病、Bolin-Jamieson综合征、维-奥二氏（Wiskott-Aldrich）综合征、Paris-Trousseau-Jacobsen综合征、X染色体血小板减少症、灰色血小板综合征、Sebastian综合征和范科尼贫血。

在另一个特定实施方案中，所述血小板病症是获得性血小板病症。获得性血小板病症的举例说明性、非限制性例子包括骨髓增殖性病症例如血小板增多症、红细胞增多症、慢性髓性白血病等；存在在髓样化生中的功能血小板病症，具有增加的流血时间、玻璃球保留缺陷、血小板聚集缺陷、异常释放和血小板因子III缺陷。功能血小板缺陷已在坏血病中的异常蛋白血症以及先天性心脏病和肝硬化中发现。

术语“获得性凝血病”和“获得性血小板病症”指病症的起源，其可以是医源性或其他疾病继发性的。

如本文使用的，术语“受试者”包括动物物种的任何成员，包括人物种；作为举例说明性、非限制性例子，所述受试者可以是哺乳动物，例如灵长类动物、驯养动物、啮齿类动物等，所述受试者优选是具有任何年龄和种族的男人或女人。在特定实施方案中，所述受试者是不具有止血病症史的人类，例如没有凝血病或血小板病症的个体。在另一个特定实施方案中，所述受试者是具有止血病症史的人类，例如具有出血素质的个体，例如凝血病例如先天性或获得性凝血病、或血小板病症例如先天性或获得性血小板病症。

因此，在特定实施方案中，本发明涉及在制造用于局部治疗不具有止血病症史的人类中的出血的药物中的本发明的微囊泡或本发明的药物组合物。在另一个特定实施方案中，本发明涉及本发明的微囊泡或本发明的药物组合物在制造用于局部治疗具有出血素质的人类中的出血的药物中的用途。

伤口愈合相关用途

除了在血液凝固中的作用外，TF促进伤口修复和愈合（Nakagawa等人（1998）Seminars in Thromb.and Hemostasis 24:207-210；Philippart等人（2003）The Internatl.J.of Oral and MaxillofacialImplants 3:411-416）。

因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的微囊泡或本发明的药物组合物在制造用于治疗伤口愈合的药物中的用途。备选地，本发明涉及用于在制造用于治疗伤口愈合的药物中使用的本发明的微囊泡或本发明的药物组合物。备选地，本发明涉及用于治疗患者中的伤口愈合的方法，其包括给所述受试者施用本发明的微囊泡或本发明的药物组合物。

表达“伤口愈合”涉及任何种类和在任何部位的伤口愈合。它可以是正常和受损的伤口愈合。后者特别在疾病的情况下发现，例如糖尿病、血管炎、动脉阻塞性疾病、慢性静脉和/或受感染溃疡以及愈合不良性胃溃疡。受损的伤口愈合也在神经支配缺损的情况下和需要护理的个人的褥疮性坏疽中发现，所述神经支配缺损例如截瘫、麻风病、神经病等。如果特别是分别在小肠手术和皮肤及其他器官移植后出现弱缝线和受损的愈合，那么也将给出受损的伤口愈合。受损的伤口愈合也在骨折、烧伤和使用类固醇治疗的情况下发现。

在本发明中，“伤口愈合”或“伤口修复”指其中皮肤（或一些其他器官）在损伤后修复其自身的复杂过程。如本文使用的，术语“伤口”包括对于任何组织的损伤，包括例如延迟或难以愈合伤口和慢性伤口。伤口的例子可以包括开放性和闭合性伤口。术语“伤口”还可以包括例如以不同方式起始（例如来自长期卧床休息的压疮和由创伤诱发的伤口）且具有不同特征的对于皮肤和皮下组织的损伤。取决于伤口的深度，伤口可以分类成四个级别之一：i）局限于上皮的I级伤口；ii）延伸到真皮内的II级伤口；iii）延伸到皮下组织内的III级伤口；和iv）其中骨暴露（例如骨压点例如大转子或骶骨）的IV级（或全层伤口）伤口。

术语“慢性伤口”一般指仍未愈合的伤口。例如在三个月内未愈合的伤口视为慢性的。慢性伤口包括静脉溃疡、静脉瘀血性溃疡、动脉溃疡、压力性溃疡、糖尿病性溃疡、糖尿病足溃疡、血管炎溃疡、褥疮溃疡、烧伤溃疡、创伤诱发的溃疡、感染性溃疡、混合性溃疡和坏疽性脓皮病。慢性伤口可以是包含起因于完全或部分动脉阻塞的溃疡形成的动脉溃疡。慢性伤口可以是包含起因于静脉瓣的功能失常和相关血管疾病的溃疡形成的静脉或静脉瘀血性溃疡。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于下述AHCPR压力性溃疡阶段中的一个或多个：1期、2期、3期和/或期。

如本文使用的，慢性伤口可以指例如特征至少部分在于下述中的一个或多个的伤口：（1）伤口炎症的慢性自身延续状态，（2）缺乏和缺陷的伤口细胞外基质，（3）弱应答的（衰老）伤口细胞尤其是成纤维细胞，限制细胞外基质产生，和/或（4）部分由于缺乏必需的细胞外基质配合和缺乏用于迁移的支架的再上皮化失败。慢性伤口还可以特征在于1）延长的炎症和蛋白水解活性，导致溃疡性损害，包括例如糖尿病性、压力性（褥疮）、静脉和动脉溃疡；2）在受累区域中基质的进行性沉积，3）更长的修复时间，4）更少的伤口收缩，5）更慢的再上皮化，和6）增厚的肉芽组织。

示例性慢性伤口可以包括“压力性溃疡”。基于AHCPR（卫生保健政策与研究处，美国卫生和公众服务部（Agency for Health CarePolicy and Research，U.S.Department of Health and HumanServices））指导，示例性压力性溃疡可以分类成4个阶段。I期压力性溃疡是与身体上的邻近或相对区域相比较，完整皮肤可观察到的压力相关改变，其指示物可以包括下述中的一种或多种中的变化：皮肤温度（温暖或凉爽）、组织坚实度（紧致或软湿感（boggy feel））和/或感觉（疼痛、发痒）。溃疡作为在轻微着色的皮肤中限定区域的持续性发红出现，而在深色皮肤色调中，溃疡可以伴随持续红色、蓝色或紫色色泽出现。1期溃疡可以包括完整皮肤的不发白红斑和皮肤溃疡的先驱损害。在具有深色皮肤的个体中，皮肤的变色、温暖、水肿、硬结或硬化也可以是1期溃疡的指示物。2期溃疡可以特征在于涉及表皮、真皮或两者的部分厚度皮肤丧失。溃疡是浅表的并且在临床上作为擦伤、水泡或浅凹陷呈现。3期溃疡可以特征在于涉及对于皮下组织的损害或坏死的全层皮肤丧失，其可以延伸下至但未通过下面的筋膜。溃疡在临床上作为含或不含邻近组织潜挖的深凹陷呈现。4期溃疡可以特征在于全层皮肤丧失，伴随广泛破坏，组织坏死或对于肌肉、骨或支持结构（例如腱、关节囊）的损伤。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于下述AHCPR压力性溃疡阶段中的一个或多个：1期、2期、3期和/或4期。

示例性慢性伤口还可以包括“褥疮溃疡”。示例性褥疮溃疡可以由于经过骨突的延长和未减轻的压力而出现，这导致缺血。伤口趋于在不能使其自身改变位置以卸下重量的患者中出现，例如瘫痪、失去知觉或严重残废的个人。如由美国卫生和公众服务部定义的，主要预防措施包括高危患者的鉴定；频繁评估；和防病措施例如预定的改变位置、适当的卸压垫层、防潮衬层和足够的营养状况。治疗选项可以包括例如卸压、手术和酶促清创、潮湿伤口护理和细菌接种量的控制。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于褥疮溃疡或溃疡形成，其起因于经过骨突的延长、未减轻的压力，这导致缺血。

慢性伤口还可以包括“动脉溃疡”。慢性动脉溃疡一般理解为伴随动脉硬化和高血压性心血管疾病的溃疡形成。它们是疼痛的、边界清晰的，并且通常在外侧下肢和足趾上发现。动脉溃疡可以特征在于完全或部分动脉阻塞，其可以导致组织坏死和/或溃疡形成。动脉溃疡的体征可以包括例如肢体的无脉；疼痛的溃疡形成；通常良好局限的小的穿透性溃疡；冷或寒冷皮肤；延迟的毛细管返回时间（在足趾末端上的短暂挤压且释放，正常颜色应在约3秒或更少时间内返回足趾）；萎缩外观皮肤（例如有光泽的、薄的、干燥的）；以及手指和脚毛发的丧失。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于由于完全或部分动脉阻塞的动脉溃疡或溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“静脉溃疡”。示例性静脉溃疡是影响下肢的最常见类型的溃疡且可以特征在于静脉瓣的功能失常。正常静脉具有阻止血液回流的瓣。当这些瓣变得不完全时，静脉血的回流引起静脉性充血。来自红血细胞的血红蛋白逃逸且渗透到血管外间隙内，引起通常显著的呈褐色变色。已显示在静脉溃疡周围的皮肤的经皮氧压减少，暗示存在堵塞区域的正常血管供应的力。淋巴引流和流动也在这些溃疡中起作用。静脉溃疡可以在内踝附近出现，并且通常与水肿和硬结下肢组合出现；它可以是浅的，不太疼痛的并且可以伴随来自受累部位的渗出液排放存在。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于由于静脉瓣的功能失常和相关血管疾病的静脉溃疡或溃疡形成。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于由于完全或部分动脉阻塞的动脉溃疡或溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“静脉瘀血性溃疡”。瘀血性溃疡是与静脉功能不全相关的损害，更通常在内踝上存在，通常伴随指压性水肿、静脉曲张、斑驳着色、红斑和不可触及的瘀点和紫癜。淤滞性皮炎和溃疡一般是瘙痒的而不是疼痛的。示例性静脉瘀血性溃疡可以特征在于下肢的慢性被动性静脉性充血，导致局部缺氧。这些伤口的发病机理的一种可能机制包括氧跨越厚血管周纤维蛋白袖套（cuffs）扩散到组织内的妨碍。另一种机制是渗透到血管周组织内的大分子诱陷维持皮肤完整性所需的生长因子。另外，大量白血细胞的流动由于静脉性充血而减慢，堵塞毛细管，变得活化且损害血管内皮以诱发溃疡形成。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于由于静脉瓣的功能失常和相关血管疾病的静脉溃疡或溃疡形成。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于由于下肢的慢性被动性静脉性充血和/或所得到的局部缺氧的静脉瘀血性溃疡或溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“糖尿病性溃疡”。由于神经病学和血管并发症，糖尿病患者易于溃疡形成，包括足溃疡形成。外周神经病可以引起足和/或腿中的感觉改变或完全丧失。具有晚期神经病的糖尿病患者丧失关于敏锐-迟钝区分的所有能力。对于足的任何切口或创伤可以在具有神经病的患者中完全未注意地进行数天或数周。事实上，当溃疡已存在相当一段时间时，具有神经病的患者注意到溃疡“刚刚出现”，这并不罕见。对于具有神经病的患者，严格葡萄糖控制已显示减慢疾病的进展。夏科氏（Charcot）足畸形还可以由于感觉减退而出现。当太多的压力置于足的区域上时，在其足中具有“正常”感觉的人具有自动感觉的能力。一旦经鉴定，我们的身体就本能地转变位置以减轻这种压力。具有晚期神经病的患者丧失感觉持续压力损伤的这种能力，因此，可以出现组织缺血和坏死，导致例如足底溃疡形成。另外，如果未注意到且未加处理，那么在足的骨中的微小骨折可以导致损形、慢性肿胀和另外的骨突。微血管疾病是糖尿病的显著并发症之一，其也可以导致溃疡形成。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于由于糖尿病的神经病学和血管并发症的糖尿病足溃疡和/或溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“创伤性溃疡”。创伤性溃疡的形成可以由于对于身体的创伤性损伤而出现。这些损伤包括例如对于动脉、静脉或淋巴系统的妥协；对于骨骼的骨体系结构的变化；组织层-表皮、真皮、皮下软组织、肌肉或骨的丧失；对于身体部分或器官的损害和身体部分或器官的丧失。在特定实施方式中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于与对于身体的创伤性损伤相关的溃疡。

示例性慢性伤口可以包括“烧伤溃疡”，包括1度烧伤（即皮肤的浅表、变红区域）；2度烧伤（起泡的损伤部位，其可以在水泡液已去除后自发愈合）；3度烧伤（通过整个皮肤的烧伤且通常需要手术干预用于伤口愈合）；烫伤（可以由于滚烫的热水、猪油或放射器流体而出现）；热（可以由于火焰而出现，通常为深度烧伤）；化学（可以来自酸和碱，通常为深度烧伤）；电（在房子周围的低电压或在工作时的高电压）；爆炸焰（通常为浅表损伤）；和接触烧伤（通常为深度的并且可以由于消音器尾管、热熨斗和炉子而出现）。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于与对于身体的烧伤损伤相关的溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括“血管炎溃疡”。血管炎溃疡还可以在下肢上出现，并且是疼痛的、边界清晰的损害，其可以具有相关的可触及的紫癜和出血性大疱。胶原疾病、败血病和多种血液学病症（例如血小板减少症、异常蛋白血症）可以是这种严重的急性病状的原因。示例性慢性伤口可以包括坏疽性脓皮病。坏疽性脓皮病作为小腿的单个或多个、非常触痛的溃疡出现。深红色至紫色、潜挖的边界围绕化脓性中心缺陷。活组织检查一般未能揭示血管炎。在一半患者中，它与全身性疾病例如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎或白血病相关。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征在于与坏疽性脓皮病相关的溃疡形成。示例性慢性伤口可以包括感染性溃疡。感染性溃疡跟着具有多种生物体的直接接种发生且可以与显著区域性腺病相关。分枝杆菌感染、炭疽、白喉、芽生菌病、孢子丝菌病、野兔病和猫抓伤发烧是例子。初期梅毒的生殖器溃疡一般是无触痛的，具有清洁的坚固基底。软下疳和腹股沟肉芽肿的那些趋于溃烂、化脓和更过度的损害。在特定实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中所述慢性伤口的特征与感染有关的溃疡形成。如本文使用的，术语“裂开性伤口”指已破裂或切开的伤口，通常为手术伤口。在特定实施方案中，提供了治疗不以期望速率愈合的伤口的方法，其中所述伤口的特征在于裂开。

可以使用的合适载体先前已得到描述。包含本发明的第一种或第二种微囊泡及其组合的药物还可以包含用于伤口愈合的其他化合物。

血管生成相关用途

除了其在血液凝固中的作用外，TF还在血管生成中起作用。当发现由于无法发展血管，其中TF已遗传敲除的小鼠无法发育超过胚胎第9-10天时，发现这点（Carmeliet等人，1996，Nature 383:73-75；Bugge等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：6258-6263；Toomey等人，1996，Blood 88：1583-1587）。进一步的研究已证实凝血蛋白酶的活化可以导致蛋白酶活化受体的活化，导致血管内皮生长因子的增加产生，其刺激血管生成（Richard等人，2002，Oncogene 20：1556-1562；Milia等人，2002，Circ.Res.91:346-352）。此外，TF在肿瘤细胞上的过表达促进肿瘤生长、血管化和转移（Mueller等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11832-11836）。

因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的第一种或第二种微囊泡或其组合、本发明的第一种或第二种组合物或其组合、或本发明的第一种或第二种药物组合物或其组合在制造用于治疗与缺陷性血管生成相关的疾病的药物中的用途。

血管生成是通过其通过由现有血管发展形成新血管或淋巴管的过程。如本文使用的，术语“与缺陷性血管生成相关的疾病”指其中可以通过活化血管形成治愈的疾病。表达“血管形成”涉及任何种类和在任何部位的血管形成。血管形成的促进在许多临床病状中可以是有用的。例如，本发明的促血管形成的荷有TF的微囊泡可以用于促进在心肌组织中在缺血性疾病过程中或后、心肌梗塞或在冠状动脉旁路手术后的侧枝血管系统的血管生成。可以通过提供本发明的荷有TF的微囊泡治疗的其他疾病或病状包括引起外周或中枢神经系统的病理学的血管疾病和/或缺血性疾病。此类病状/疾病可以包括例如通过凝块堵塞或通过微动脉瘤破裂引起的脑血管意外，或引起神经元死亡或外周功能缺损的一般/局限性缺血，例如运动或感觉功能或说话障碍、缺血性心肌病、或外周动脉疾病例如慢性肢体缺血跛行（骨骼肌）、静止痛/缺血性溃疡形成/坏疽。此外，血管形成的促进对于替代受损例如旧血管是足够的。它们可以例如存在于脑或心脏中，从而使得中风或梗塞可以得到预防或治疗。还可以获得针对老年精神病态（presbyphrenia）的警惕。此外，它涉及用于治疗动脉硬化、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、糖尿病视网膜病变和腿/溃疡小腿的深部静脉血栓的血管形成的血管形成以及复发的预防。

患有与缺陷性血管生成有关的疾病的患者可以用本发明的微囊泡或本发明的药物组合物或其与抗血管生成疗法、抗癌疗法或已知治疗该疾病或病状的其他疗法的组合进行治疗。

如本文使用的，“疗法”包括但不限于已知药物。可通过本发明的方法治疗的癌症包括所有实体瘤和转移癌，包括但不限于选自下述的那些：膀胱、乳腺、肝、骨、肾、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、肺、脑和皮肤癌。本发明包括但不限于用单独的、与化学疗法组合的、或与通过本领域已知的方法的放射疗法组合的，本发明的第一种或第二种微囊泡或其组合的癌症治疗（参见美国专利6,596,712）。

本发明的试剂盒

在另一个方面，本发明涉及包含本发明的微囊泡的试剂盒以及所述微囊泡用于测定样品中的抗凝疗法因素的用途。

如本文使用的，术语“试剂盒”在提及物品的组合中使用，其促进过程、方法、测定法、样品的分析或处理。这些试剂盒提供用于执行本发明中所述方法所需的材料。

如本文使用的，术语“抗凝疗法因素”指在决定患者是否需要抗凝疗法中有用的参数。抗凝疗法因素包括但不限于凝血酶原时间（PT）、国际标准化比（INR）、修饰的ATF（MATF）、校正的ATF（CATF）、凝血酶原比（PR）和纤维蛋白原转化率（FTR）。

如本文使用的术语“凝血酶原时间”、“PT”或其语法等价物意指用于血液凝固时间的测试，其可用于监控处于过量血液凝固（血栓形成）危险中的个体的治疗。凝血酶原时间指从组织因子-钙加入样品到其中纤维蛋白原至纤维蛋白的转换开始的点计算的时间段。凝血酶原时间一般通过接触正常人血浆的不同稀释物（优选在0.15M NaCl中的1:2、1:4、1：10、1:20和1:40稀释）进行测定，以分别获得具有减少的因子活性（50、25、10、5和2.5%的样品。将本发明的第一种或第二种囊泡加入样品中，并且光学测量样品凝结花费的时间。

如本文使用的，凝血酶原比（PR）指血液凝固的另一种测量，其通过将患者血浆的PT除以来自正常个体的血浆库的PT进行计算。

本发明的试剂盒和用途可以用于凝血实验室中。这种测试的变体具有许多用途（White等人，Hemostasis and Thrombosis，BasicPrinciples and Clinical Practice，Coleman等人，编辑，J.B.LippencottCo.，Philadelphia，第1048-1060页，1987）。一种用途是评估外源性凝血途径中的缺乏（因子VII、X、V和凝血酶原）。第二种用途是监控经历用于病症例如复发性静脉血栓形成和癌症的长期经口抗凝疗法的患者（Hirsh，J.，Seminars in Thrombosis and Hemostasis，12：1-11，1986）。第三种用途是估计肝功能障碍。

抗凝疗法的治疗范围基于流血和血栓并发症的避免。当通过PT测试监控经口抗凝疗法以及对于多种其他病状时，凝血酶原时间延长2倍对于长期疗法是最希望的（O'Reilly，Hemostasis and Thrombosis，Basic Principles and Clinical Practice，Coleman等人，编辑，J.B.Lippencott Co.，Philadelphia，第1367-1372页，1987）。这种延长因子定义为凝血酶原比（PR），并且通过将患者血浆的PT除以来自正常个体的血浆库的PT进行计算。更高的PR指示更灵敏的PT试剂。用于监控抗凝疗法的更灵敏试剂的利益是更低剂量的抗凝药物的使用。这些更低剂量仍提供针对血栓疾病的足够保护，同时使流血并发症降到最低。

此外，试剂盒可以包含允许维持试剂在测定限制内的包装。用于制备此类包装的合适材料包括玻璃、塑料（聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等）、瓶子、小瓶、纸、小袋等。本发明的试剂盒可以另外含有关于在本发明的方法中使用一种或多种试剂的说明书。所述说明书可以以印刷材料或以电子载体的形式发现，所述电子载体可以存储指令，从而使得它们可以通过受试者阅读，例如电子存储介质（磁盘、胶带等）、光学介质（CD-ROM、DVD）等。介质可以另外或备选地含有提供所述指令的因特网站。

本发明通过下述实施例详细描述，所述实施例仅视为本发明的范围的举例说明而不是限制。

实施例

方法

血浆中的凝血测定法

借助于两步凝血测定法在4通道凝血计（Start 4，DiagnosticaStago）中测量血浆中的自发促凝活性（未刺激的）。简言之，将50μl贫血小板血浆加入已调和的（tempered）比色杯中，并且加入50μl样品（TF，或蒸馏水作为对照）。这种混合物在37℃静置温育60秒，并且立即加入50μl 25mM氯化钙，并且在凝血计中以秒测定凝血时间，通过凝块的形成验证。通过离心获得贫血小板血浆，并且通过Coulter测定血小板数目。

通过使用借助于免疫亲和技术耗尽的商业血浆（Dade BehringMarburg GmbH），研究TF对分别对应于血友病A、B或C的凝血因子缺乏性血浆（FVIII、FIX或FXI）的促凝作用。在每种情况下，所述凝血因子的最终含量小于1%。

在用顺次离心过程耗尽血小板的血浆中研究血小板减少样病状中的促凝剂作用。

在全血中的凝血测定法

借助于凝血方法测定在非抗凝全血中的促凝活性。将以0.2ml终体积的待研究的不同试剂（mTF）加入0.8ml非抗凝的全血中，并且用计时器测量从提取开始直到出现稳定和固化的血块的凝血时间。借助于其血液凝固时间的缩短或延长来估计不同试剂的作用。

全血样品得自患者或健康志愿者。

实施例1

基于在酵母中表达全长TF his-标签修饰的蛋白质的促凝剂产物 的产生（TT-173）。

在WO2008080989中描述且包含URA3基因、氨苄青霉素抗性基因、酵母2μ复制起点、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GPD）启动子和磷酸甘油酸酯激酶的酵母转录终止信号的酵母附加型载体，用于在GPD启动子的控制下克隆编码成熟hTF蛋白质（SEQ ID NO：1的aa 33-295）的cDNA，其具有在3'末端上的18个额外核苷酸（编码六组氨酸）和灭活天然hTF序列（SEQ ID NO：6）中的潜在N糖基化位点之一的Asn124Ala突变。

在酵母菌株T73ura3-转化后，收集在无尿嘧啶培养基中生长的菌株，并且基本上如WO2008080989中所述，通过酵母提取物的蛋白质印迹分析就其表达hTF的能力进行测试。

为了估计在工业化前水平标定酵母提取物生产的可能性，通过使细胞在30℃在250-300rpm的搅拌速度、pH 4.5和气流6L/m下生长，执行在2升生物反应器（Biostat B-2L.BRAUN）中的发酵。培养基是CSM-URA:0.78g/L；YNB：6.7g/L；蔗糖：20g/L。当培养物达到OD 8.0时，停止发酵。

通过以3,000rpm（1,200xg）离心10分钟收集起因于发酵的产物，并且重悬浮于200ml裂解缓冲液（20mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、50mM NaCl）中。通过高压（1,000巴（10⁸Pa）)(匀浆器NIRO SOAVIS.Panda 2K）使酵母匀浆化，并且将匀浆物以13,000rpm（13,000xg）在4℃离心30分钟。弃去团块，并且收集命名为澄清的酵母提取液（CYE）的上清液。

使用在孔径尺寸上具有逐步减少的滤器（0.45μm、0.2μm和0.1μm膜（Sartorius，聚砜），通过在Crossflow Filtration System（Sartorius sartoflow Slice 200Benchtop）中的切向流过滤的相继步骤分馏含有rTF的这种CYE。

在相继过滤步骤后得自四个独立CYE的不同渗余物和渗透物的促凝活性在表1上表示。在四个MFR 0.1馏分各自中TF的存在显示于图1中。

	活性秒
		CYE	23,5
MFR 0.45	23,6
		MFP 0.45	24,0
MFR 0.2	24,3
		MFP 0.2	24,9
MFR 0.1	18,1
		MFP 0.1	>300

表1.在切向流过滤后来自四个独立CYE的微孔过滤渗余物（MFR）和微孔过滤渗透物（MFP）的促凝活性平均值。凝血测定法程序在方法中定义。

以这种方式，基本上如WO2008080989中所述，如使用不同的体外和体内测定法测定的，获得具有促凝性质的纯化的酵母囊泡制备物（在下文中称为TT-173）。这个结果指出用于纯化TT-173产物的切向流过滤程序的使用允许回收生物学活性的hTF，其与酵母衍生的膜微囊泡结合。

实施例2

通过加入PS增强TT-173生物活性

2.1磷脂酰丝氨酸（PS）对TT-173生物活性的作用

将PS（0.1mM）加入TT-173中，并且将混合物温育高达4小时。在不同时间点时，从其中加入PS的时间开始（时间0），在标准凝血测量测定法中就凝固活性检查TT-173/PS混合物的等分试样。图2中本结果明确显示PS的添加使凝血时间减少约10秒（小图A），其对应于六倍的比活性增量（小图B），并且这种扩增是时间依赖性的，在PS添加后1–2小时达到最大限度。

PS单独对凝血时间可忽略不计的作用（未显示），和在其加入TT-173后的第一个小时过程中观察到的加强作用中的增加，暗示在TT-173和PS之间出现一些相互作用，并且这种相互作用对于加速凝血时间是重要的。

这种效应对于负电荷磷脂是特异性的，因为以相似浓度（0.1mM）的不带电或正电荷磷脂添加不诱导TT-173的凝固活性中可检测的增量。特别地，磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、鞘磷脂（SM）或磷脂酰胆碱（PC）无一诱导凝固活性中可检测的增量。

随后测试PS/TT-173相互作用是否局限于酵母衍生的结构或它是否可以在人工制备的囊泡中再现。为了测试这点，将PS以不同浓度（范围为0.05-1mM）加入具有TT-173或体外再脂质化的rTF的等价凝固活性的等分试样中。在混合物在R/T温育2小时后，就其凝固活性测试来自两种含rTF产物的样品。结果显示于图3中。如以前观察到的，PS对于TT-173的添加使活性明确增加约六倍。这种效应在范围为0.05-0.5mM PS的浓度观察到。在更高浓度（1mM）时，PS产生明确的抑制凝固作用。令人惊讶的是，在使用的任何PS浓度时，PS对于再脂质化的rTF的添加不导致促凝活性中的可观增加。再次，测试的PS的更高浓度（1mM）产生明确的抑制效应。如果以高浓度的PS囊泡与可溶性凝血因子有效相互作用，隔离其并且因此限制其与含rTF囊泡的相互作用，那么可以解释通过更高浓度的PS对TT-173或再脂质化的rTF样品的这种抑制效应。

通过测试由于将增加的PS浓度加入已经预先存在的具有不同PC与PS比的含rTF微团对凝固活性的作用进一步证实这点。充分确定磷脂恢复完全rTF活性的最佳浓度，并且它对应于从80:20到70:30的磷脂酰胆碱（PC）与磷脂酰丝氨酸（PS）比。图4（黑色条）显示其中rTF用单独的PC（100:0的PC:PS浓度），或与PC有关的增加浓度的PS比（分别为95:5、90：10和80:20的PC:PS浓度）再脂质化的一般凝固实验。结果明确显示增加量的PS添加导致减少的凝血时间。然而，当额外PS加入预先存在的微团中时，在测试的任何PC:PS比时，不发挥凝固活性中的任何增量（图4，灰色条）。

为了提供观察到的效应局限于真核生物衍生的结构，并且不能在通过再脂质化人工制备的囊泡中再现的进一步证据，将PS以浓度0.1mM加入具有在酵母细胞中产生的TT-173囊泡或以80:20和70:30PC:PS比的体外再脂质化的rTF的等价凝固活性的等分试样中。在不同囊泡与PS一起在R/T温育2小时后，就其凝固活性测试来自不同含rTF产物的样品。结果显示于图5中。如观察到的，PS对于来自酵母起源的TT-173的添加明确减少凝固时间，而如期望的，在用于再脂质化的任何PC:PS比例时，PS对于再脂质化的rTF的添加不导致促凝活性中的可观增加。

为了测试PS的添加是否仅在与酵母衍生的囊泡结合时才是有效的，使用遵循与TT-173相同的生产程序得自非重组酵母的，再脂质化的rTF和TT-100囊泡（得自用不含TF蛋白质序列的质粒转化的重组酵母的微囊泡）完成实验。将再脂质化的rTF的等分试样与不同浓度的TT-100囊泡混合，其先前与PS（0.1mM）一起温育2小时。在30分钟后，测定每种等分试样的凝固活性。结果（图6）明确显示不依赖于使用的TT-100量，混合物TT-100/PS对再脂质化的rTF不具有可检测的作用。

这个结果证实PS对凝固活性的作用依赖于其与酵母衍生的囊泡的结合，并且这些囊泡必须含有rTF。

考虑到上述结果，在TT-173中通过PS诱导的加强凝固作用（参见图2、3和5）可以得到解释，如果：i）PS促进在rTF和FVII之间的相互作用，诱导用于相互作用的更合适支架；ii）加入的PS在囊泡中诱导结构效应，生成更适合于凝血酶原酶复合物形成的富含PS的区域，如活化血小板中一样；或iii）两种效应的组合。

为了测试PS对rTF:FVII相互作用的可能作用，使用确定为定量TF:FVII复合物的酶促活性的标准酰胺分解测定法。对于这个实验，将含或不含PS添加的三个浓度的TT-173与两个不同浓度的纯化的商业FVIIa一起温育。在FVIIa加入TT-173后，通过复合物酶促转化特异性生色底物S-2288的能力检测TF/FVIIa活性。如图5中所示，在测试的三个TT-173浓度时，并且在使用的两个FVIIa浓度50nM（未显示）或500nM（图7）时，在含或不含PS的TT-173之间在酰胺分解活性中不存在可观差异。这些结果明确证实PS对于TT-173的添加不对起始rTF-FVII相互作用发挥显著作用。

然而，当在正常血浆（图8，小图A）或正常全血（图8，小图B）中就促凝活性测试相同TT-173样品时，当PS与TT-173结合时，观察到在凝固活性中高度显著的增量。

因此，PS对TT-173活性的刺激作用应可归于对凝血级联下游而不是起始TF:FVII相互作用的作用。我们的解释是PS修饰TT-173囊泡表面，提供类似于在活化血小板中观察到的那种的PS依赖性支架。

2.2TT-173和TT-173PS的作用机制

在正常止血过程中，达到活化阶段所需的时间（达到活化FV、FVIII和血小板所需的凝血酶浓度需要的时间）是大约4分钟。这是允许在TF和FVII分子之间的相互作用所需的时间，两者都以相对低的浓度存在于血浆或损害细胞的膜中。分子碰撞和所得到的在TF和FVII之间的相互作用导致FX转化成FXa，其依次产生凝血酶。

因此，例如通过将TT-173加入血浆或血液中增加掺入合适膜内的TF浓度，将增加TF和FVII之间的相互作用发生的机会。这导致FXa的更快速和更高产生，并且因此活化血小板、FVIII和FV所需的凝血酶量的更快速产生。

在TT-173中，TF插入同样荷有PS的不连续小块的膜区室内。因此，TT-173对于血浆或血液的添加不仅提供以更高浓度的凝血级联起始剂，还提供合适的表面，其提供用于形成活性凝血酶原酶复合物的合适的含PS生理学支架。图9概括了提出的TT-173作用机制。

在正常血液凝固过程中，凝血的活化花费大约四分钟。这是在与血管邻近的损伤组织中相对低浓度的TF蛋白质，和在血流中循环的稀少量FVIIa的结果。

其中FXa生产增加的这种模型解释，当含或不含PS的TT-173加入正常血浆中时，观察到的凝固时间中的急剧减少（图10，左）。此外，通过凝血酶原酶复合物的形成，该模型解释当FVIII或FIX（在血友病A和B中缺乏）不存在或以极低浓度时，观察到正常凝血时间（图10，右）。在凝血因子缺乏的情况下，PS对于TT-173的添加明确减少凝固时间。这种效应在其中FVII或FV浓度小于1%的血浆中更显而易见（图11）。

如该模型预测的，作为华法林处理的效应，具有FVII和FX的获得性缺乏的血浆的凝血时间，也通过TT-173的添加标准化（图10）。

2.3酵母膜在TT-173活性中的作用

酵母囊泡组分单独显示出有限的促凝活性，但其中全部应是维持微粒的完整性必需的。当通过用可透析去污剂处理分裂含和不含PS添加的TT-173囊泡，并且随后在体外通过透析重构时，丧失约50%的最初活性（图13，小图A）。然而，当使用再脂质化的rTF囊泡完成相似实验时，在透析前和后未观察到可观差异（图13，小图B）。

这个结果指出凝固活性不仅在于rTF、酵母蛋白质和酵母脂质的相对量，还在于所有这些组分的空间排列/定向。当囊泡在体外自发产生时，TT-173的所有膜组分随机掺入新近形成的膜内，并且不获得仅可以在可以提供真核活细胞的背景中获得复杂构象。

实施例3

基于在昆虫细胞中表达全长TF蛋白质的促凝剂产物的产生

3.1重组杆状病毒的构建

如下执行全长成熟的人组织因子（TF）的重组杆状病毒（rBV）的构建：

编码成熟的人TF蛋白质（aa 33-295）的cDNA通过聚合酶链反应（PCR）作为816-bp片段扩增。对于这个PCR反应，含有TF编码基因的质粒pTT-103用作模板，并且分别在TF基因的5'或3'末端退火的寡核苷酸A 5'-CCGCTCGAGCGGTTATGAAACATTCAGTGGGGAGTTCTC-3'（SEQ ID NO：7）和B5'-CCGCTCGAGCGGTTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTC-3'（SEQID NO：8）用作引物。将获得的DNA片段用NcoI和HindIII消化，并且插入用相同限制性酶消化的杆状病毒转移载体pFastBacl-mAV-MCS内。对所得到的质粒pFB-TF实施核苷酸测序，以评估插入的TF序列的正确性，并且通过使用Bac-to-Bac系统且通过遵循制造商的说明书（Invitrogen），它随后用于产生相应rBV。对于活性含TF囊泡的产生和纯化，用表达TF的rBV以5PFU/细胞的复度（multiplicity）侵染昆虫高活性细胞。在侵染后72小时收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，重悬浮于裂解缓冲液（50nMTris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl）中。其后，借助于杜恩斯匀浆器破坏细胞提取物。遵循先前在实施例2中描述的方案，就凝固活性测试细胞提取物的等分试样。表2显示由提取物引发的凝固活性。

表2：对照囊泡、重组TF、体外脂质化的rTF和TT-172（携带wt-TF的昆虫细胞衍生的微囊泡）的凝血时间和TF蛋白质浓度。

3.2磷脂酰丝氨酸（PS）对携带wt-TF）的TT-173昆虫细胞衍生的微囊泡生物活性的作用

为了提供在本专利中观察到且请求保护的效应局限于真核生物衍生的结构，并且不能在通过再脂质化人工制备的囊泡中再现的进一步证据，将PS以浓度0.1mM加入具有在酵母细胞中产生的TT-173囊泡、在昆虫细胞中产生的TT-172囊泡或以80:20和70:30 PC:PS比的体外再脂质化的rTF的等价凝固活性的等分试样中。在不同囊泡与PS一起在R/T温育2小时后，就其凝固活性测试来自不同含rTF产物的样品。结果显示于图14中。如观察到的，PS对于来自昆虫细胞起源的TT-170的添加导致类似于用酵母细胞获得的那种的凝固时间中的减少，明确减少凝固时间。然而，如期望的，在用于再脂质化的任何PC:PS比例时，PS对于再脂质化的rTF的添加不导致促凝活性中的可观增加。

实施例4

PS添加的另一个出乎意料的效应是其超过TT-173囊泡稳定性的发生。为了测试这个效应，如实施例2中所述，将与或不与PS一起温育的三个独立TT-173批次的等分试样维持在两个不同温度（4℃和20℃）延长时间段。在不同时间点时，就凝固活性分析来自每种样品的等分试样。这个实验的结果显示于图15中。如上所示，PS对于TT-173样品的添加在时间0时使凝血时间加速高达10秒，并且出乎意料地，含有PS的样品的稳定性与不含PS的样品相比较是延长的。这种稳定性效应在20℃尤其是显而易见的，而不含额外PS的TT-173样品在5小时后丧失超过50%活性，在其中添加PS的样品保持稳定至少4天。

随后在20℃和4℃测定含或不含PS添加的TF-173的不同分批的最低限度稳定性的平均值。

平均最低限度稳定性显示于图15中（小图C和D）。

实施例5

通过促凝血剂增强TT-173的促凝效应。

将不同浓度的FVII（20nM和60nM）、FVIIa（20nM和60nM）、FX（1000nM和3000nM）和FXa（1000nM）加入TT-173中。在不同时间点时，从其中加入PS的时间开始（时间0），在标准凝血测量测定法中就凝固活性检查TT-173/FVII和TT-173/FX混合物的等分试样。呈现在图16中的结果明确显示FVII、FVIIa和FX的添加使凝血时间减少约2秒，并且FXa的添加使凝血时间减少约7秒。

Claims (18)

1.一种用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括

(i)在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体，其中具有促凝活性的其变体对应于具有选自如下的至少一种修饰的组织因子蛋白：

(a)与所述TF蛋白质的C末端或N末端结构域结合的标签；

(b)缺乏信号肽而形成成熟TF蛋白；

(c)对应于在成熟人TF中的位置11-13上的残基NLT的N糖基化位点的修饰，该修饰使得所述位点无功能；

(d)对应于在成熟人TF中的位置124-126上的残基NVT的N糖基化位点的修饰，该修饰使得所述位点无功能；

(e)对应于在成熟人TF中的位置137-139上的残基NNT的N糖基化位点的修饰，该修饰使得所述位点无功能；

(ii)在不存在去污剂的情况下裂解步骤(i)的TF表达细胞，或当使用去污剂时，使用低于临界微团浓度的所述去污剂浓度，

(iii)从步骤(ii)的细胞中回收荷有TF的微囊泡，和

(iv)在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，在不存在去污剂的情况下，使步骤(iii)中获得的囊泡与负电荷磷脂接触，

其中所述微囊泡通过来自真核细胞的脂质膜形成。

2.根据权利要求1的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。

3.根据权利要求1的方法，其中所述接触步骤(iv)在当所述微囊泡的蛋白质含量低于50微克时，使用0.05μmol负电荷磷脂和当所述微囊泡的蛋白质含量高于50微克时，使用0.1μmol负电荷磷脂执行。

4.根据权利要求1的方法，其中所述负电荷磷脂选自含鞘氨醇磷脂或含甘油磷脂。

5.根据权利要求4的方法，其中所述含甘油磷脂是磷脂酰丝氨酸。

6.根据权利要求1的方法，其中具有促凝活性的所述TF或其变体是糖基化的。

7.根据权利要求1的方法，其中所述TF是人成熟TF蛋白质。

8.根据权利要求7的方法，其中所述TF携带N124A突变和在C末端上的六组氨酸标签。

9.一种荷有TF的微囊泡，其使用权利要求1的方法获得。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求9的荷有TF的微囊泡和药学可接受的媒介物。

11.根据权利要求10的药物组合物，其进一步包含至少凝血促进剂。

12.根据权利要求10或11的药物组合物，其中所述组合物是冻干的。

13.根据权利要求9的荷有TF的微囊泡或根据权利要求10或11的药物组合物在制备药物中的用途。

14.根据权利要求9的荷有TF的微囊泡或根据权利要求10或11的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗出血、用于促进伤口愈合或用于治疗血管生成相关疾病。

15.根据权利要求14的用途，其中所述出血在选自健康受试者和具有出血素质的受试者的受试者中进行治疗，其中所述出血素质选自凝血病、血小板病症及其组合。

16.根据权利要求14或15的用途，其中所述荷有TF的微囊泡或药物组合物是局部施用的。

17.如权利要求9中定义的荷有TF的微囊泡在制备药物中的用途，所述药物用于测定样品中的凝血酶原时间。

18.用于测定凝血酶原时间的试剂盒，其包括根据权利要求9定义的微囊泡。