CN104994869B

CN104994869B - 止血组合物

Info

Publication number: CN104994869B
Application number: CN201480008682.9A
Authority: CN
Inventors: 费尔南德斯-阿尔瓦胡安·雷蒙·罗德里格斯; 莫雷诺杰西·穆拉特
Original assignee: Thrombotargets Europe SL
Current assignee: Thrombotargets Europe SL
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: AU2014209886A1; EP2759305A1; ES2626806T3; US20160000863A1; EP2948169A1; MX2015009348A; AU2014209886B2; EP2948169B1; CN104994869A; JP2016506920A; WO2014114719A1; BR112015017546A2; JP6404833B2

Abstract

本发明提供一种组合物，所述组合物包含脂化的组织因子和凝血酶的组合，其中包含的凝血酶的量为每克组合物1‑30IU，包含的脂化的组织因子的量为每克组合物5‑150ng。本发明还提供药学或兽医学组合物和止血组合物。本发明的组合物可用于治疗出血。

Description

止血组合物

本发明涉及止血组合物领域。

发明背景

在损伤后，被触发来止住出血的一系列生理机制被称为止血。止血是非常复杂的过程，其涉及多种分子以及细胞类型。为了便于研究，止血可被再分为四个重叠的步骤：ⅰ)血管收缩，ⅱ)伤口区域中的最初血小板栓的形成，ⅲ)纤维蛋白抗性凝块的形成(凝固级联)，和ⅳ)凝块溶解步骤或纤维蛋白溶解，伤口愈合过程从该步骤开始。

通过在血浆中处于可溶的以及无活性形式的因子VII(FVII)与它的被称为组织因子(下文也称作“TF”)的特异性受体的相互作用来启动凝固级联。在天然形式下，TF主要位于血管周围多种细胞类型的表面。因此，在正常情况下，当发生损伤或者伤口时，它特异性地与血浆分子接触。血管破裂之后，通过TF与FVII的相连启动凝固级联，触发多种凝血因子之间随后的相互作用。最终结果是形成凝血酶(FIIa)，凝血酶随后将血浆中丰度很高的纤维蛋白原(FI)转化为纤维蛋白纤维。这些纤维蛋白纤维是不可溶的，并且形成网，其与血小板一起导致被称为纤维蛋白凝块的形成。

为了在大量出血的情况下快速止血，各种各样的方法已经使用了几个世纪，例如直接按压、纱布包扎、缝合线以及止血带。这些技术被称为“非主动”止血手段，当与不同类型的敷料共同使用时，能够帮助止血过程。现在，最常用的敷料基于生物相容的以及可吸收材料，例如胶原纤维、明胶或者氧化的纤维素纤维。

为了试图提高外科止血效果，在过去几十年中，在研发含有“主动”组分的新产品方面作了巨大的努力，在传统技术之外，所述产品可以有助于改善止血。在这一点上，市场上已提供了药物(“主动止血手段”)，其含有血浆浓缩物中的整套凝血因子或者基于高纯度的分离因子。

其中，凝血因子VII(FVII)、凝血因子VIII(FVIII)、凝血因子IX(FIX)和凝血因子XI(FXI)已经在市场上销售了。它们应当通过静脉内途径使用以克服引起某些疾病(如血友病)各种血浆缺陷。然而，只有凝血酶(也被称为激活因子II(FIIa))或者含有它的组合物被用作局部止血剂，在手术中被施用于皮肤损伤或出血伤口。实际上，从50年代起，FIIa已被广泛用于多种外科应用中。在很多公开的申请中，FIIa与海绵型、纱布或凝胶(如胶原凝胶或明胶)的支持物相联。

FIIa在凝血级联的最后步骤起作用，直接作用于纤维蛋白原(FI)，促进快速的凝块形成。因此，它的功效不需要其余凝血因子的激活。然而，为了保证它的功效，必须以高浓度将FIIa施用于出血表面。这是因为，存在很多降低它们活性浓度的因素，例如：i)它的浓度由于血液流动被稀释，ii)由于与它的天然抑制剂抗凝血酶III的相互作用，使其快速失活，iii)由于它在血栓形成中被固定，存在额外的失活，和iv)通过纱布或外科方法中的冲洗将其机械去除。这些因素(i)-(iv)迫使治疗性FIIa浓度的使用要高于生理凝块形成所需的浓度。在建议使用肝素的某些外科操作中，建议的FIIa浓度是增加的。

除了它的用途，由于FIIa被如此大量的使用，许多它的副反应已被公开。其中：(a)作为促炎症分子，这样的浓度可能引起非生理性炎症过程；(b)由于此种凝血酶在很多情况下是从非人类的动物血浆中获得的，因而存在免疫原性风险，和(c)从人源血浆中获得的FIIa具有含有外来物质的风险。除(a)-(c)之外，且与使用浓度无关，凝血酶本身不能有效地引发适当的血液凝集蔓延，这是快速止血的要求。

因此，鉴于以上，需要具有合适止血特征的其他止血组合物。

发明概述

本发明的发明人发现，向凝血酶中增加脂化的组织因子(TF)，凝血酶的止血效果大幅度提高，以这种方式，获得预期效果所需的凝血酶的量就可以降低。

具体而言，当制备含有脂化的组织因子和凝血酶的组合的组合物时，发现凝血酶的止血效果协同增加，按此种方式，当脂化的TF以每克组合物5-150ng浓度存在于组合物中时，可能使用少量的凝血酶(每克组合物1～30IU)。

如下文表2总结的，例如，使用含有1IU凝血酶/克组合物的本发明的一种组合物时，当脂化的TF以5、15或150ng/克组合物的浓度并入时，凝血时间减少约至少5倍。当含有3UI或30UI凝血酶/克组合物的组合物与5、15和150ng/克组合物浓度的脂化的TF一起时，也观察到了凝血时间的明显减少。

因此，这些实验数据允许得到以下结论，当凝血酶与脂化的TF组合时，观察到了启动纤维蛋白网络形成所需时间的大大减少。这表示，与凝血酶一起施用脂化的TF，获得了十分强的止血效果。这种在一定浓度下凝血酶与TF的组合产生的协同效果也在体内研究中观察到(图1)。

因此，第一方面，本发明提供含有脂化的组织因子与凝血酶的组合的组合物，其中，含有的凝血酶的量为每克组合物1-30IU，含有的脂化的组织因子的量为每克组合物5-150ng。

除了以上所述，含有低浓度凝血酶的本发明组合物提供的止血效果与施用300UI凝血酶/mL提供的止血效果基本相同。

如以上所述，施用本发明的组合物，使用少量的凝血酶，止住出血需要的时间大大减少。

对于内部创伤的情况，这具有特别的关联性，在内部创伤的情况中，凝血酶或其它止血产品压迫不足以有效止住出血，患者有很高的死亡风险。使用本发明的组合物，凝血发生的更快，这表示对于内部创伤的情况有重大的优势，其中止住出血的时间对患者的存活是关键的。

此外，通过使用少量的凝血酶，本发明的组合物避免了本领域公开的与施用大量凝血酶有关的问题，例如炎症和免疫原性副作用等。

本发明第一方面的组合物可以包括其它组分，例如纤维蛋白溶解抑制剂、CaCl₂等，只要所述其它组分对凝血酶和脂化的组织因子的组合的止血活性没有负面影响。

鉴于本发明第一方面的组合物的性质，它可以以药学或兽医学组合物的形式被使用。

因此，第二方面，本发明提供药学或兽医学组合物，所述组合物含有治疗有效量的本发明第一方面的组合物，以及其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。

鉴于本发明第一方面组合物的优良的止血性质(下面表2)，本发明第一方面的组合物和第二方面的药学或兽医学组合物可以与合适的载体材料一起来配制止血组合物

因此，第三方面，本发明提供止血组合物，所述组合物含有本发明第一方面所述的组合物或者本发明第二方面所述的药学或兽医学组合物，和载体材料。

第四方面，本发明提供本发明第一方面组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物作为止血剂的用途。

如以上所讨论的，鉴于本发明的组合物的止血效果，其可用于治疗出血。

因此，第五方面，本发明提供作为药物的本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物。该方面可制定为治疗疾病的方法，所述方法包括向需要的个体施用治疗有效量的本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物，和其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。

第六方面，本发明提供用于治疗出血的本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物。

本方面可选地被制定为本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物在制造用于治疗出血的药物中的用途。本方面可选地被制定为治疗出血的方法，该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物，和其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。

又一方面，本发明提供本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物作为伤口愈合剂的用途。

最后，本发明的组合物可提供为试剂盒。

因此，第八方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的组合物或本发明第二方面所述的药学组合物和施用器，所述施用器允许同时施用凝血酶和脂化的组织因子。

附图简要说明

图1表示肝脏中单独切口的几种处理的凝血时间。每个柱对应三至六次独立实验中得到的止血时间(以秒为单位)的平均值，X轴描述每个测试物。结果的统计学显著性通过Newman-Keuls多重比较检验进行了确认，给出以下p值：柱6与柱5和柱3的p值<0.05。

发明详细描述

如上文所述，第一方面，本发明提供含有凝血酶和脂化的组织因子的组合物。

在一个实施方案中，本发明第一方面的组合物是固体形式、半固体形式或液体形式。

本发明中，术语“固体形式”应被理解为包括粉末和固体泡沫。

本发明中，术语“半固体形式”应被理解为包括药膏、糊剂、乳霜、软的或硬的凝胶、悬浮液、乳剂和栓剂。

本发明中，术语“液体形式”应被理解为包括液体泡沫、溶液和洗液。

在一个实施方案中，本发明第一个方面的组合物包含浓度为每克组合物10-30IU的凝血酶。

在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含浓度为每克组合物1IU、每克组合物3IU或每克组合物30IU的凝血酶。

在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含浓度为每克组合物5-15ng的脂化的组织因子。

在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含浓度为每克组合物150ng的脂化的组织因子。

在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物选自：

-每克组合物1IU凝血酶和每克组合物5ng脂化的TF；

-每克组合物1IU凝血酶和每克组合物15ng脂化的TF；

-每克组合物1IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF；

-每克组合物3IU凝血酶和每克组合物5ng脂化的TF；

-每克组合物3IU凝血酶和每克组合物15ng脂化的TF；

-每克组合物3IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF；

-每克组合物30IU凝血酶和每克组合物5ng脂化的TF；

-每克组合物30IU凝血酶和每克组合物15ng脂化的TF；和

-每克组合物30IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF。

在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物选自：

-每克组合物1IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF；

-每克组合物3IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF；和

-每克组合物30IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF；

在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含每克组合物20IU凝血酶和每克组合物8ng脂化的TF。

在本发明中，术语“组织因子(TF)”应被理解为完整的膜糖蛋白，其广泛分布于动物界中。TF存在于多种细胞类型中，主要是在内皮下组织，对于启动凝血级联的外源途径是必须的，该凝血级联导致产生FIIa并形成稳定的纤维蛋白凝块。可用在本发明中的示例性TF蛋白包括人TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 148,2012年11月,登录号P13726)，小鼠TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 103,2012年11月，登录号P20352)，牛TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 89,2012年11月，登录号P30931)，兔TF(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 90,2012年11月，登录号P24055)以及不同动物的TF蛋白。

SwissProt登录号P13726的人TF蛋白有定义明确的结构域结构，包括：(1)信号肽或有32个氨基酸前导序列的区域，前导序列从未成熟状态经翻译后加工为成熟状态；(2)含219个氨基酸的N-糖基化的亲水性胞外结构域；(3)23个氨基酸的高度疏水片段，该片段形成跨膜结构域；和(4)21个氨基酸羧基端，该区域为蛋白胞质片段。

在具体实施方案中，TF对应于成熟TF。

本文使用的术语“成熟TF”指的是氨基酸序列缺少信号肽的TF蛋白。在一个实施方案中，所述成熟TF蛋白为SEQ ID NO:1的成熟人TF。

在一个实施方案中，TF是糖基化的。

本文使用的术语“糖基化的”包括任何程度的糖基化。由于天然的TF含有一些糖基化位点，如下面详细解释的，表述“组织因子”也包含显示不同糖基化程度的那些蛋白质形式，所述形式通过在可以发生N-糖基化反应的宿主中表达TF来获得。

此外，术语“组织因子”也包括在天然FT序列中一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代所产生的那些变体。可以用于评估给定的多肽是否是TF功能性变体的适合的功能实验是基于TF变体特异性结合FVIIa的能力或基于体外测定血浆或全血中凝结时间的那些实验，通过严重出血的动物模型的体内实验，或通过致死性出血的动物模型的体内实验。现有技术已经公开了实施这些实验的方法。

根据本发明的此类变体包括与以上提到的天然TF分子至少60％、70％、80％、90％、95％或96％相同的氨基酸序列。本领域已知，两种蛋白之间的“同一性”通过将一种蛋白的氨基酸序列和它的保守氨基酸取代与第二种蛋白的序列进行比较来确定。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种蛋白之间的同一性程度。两个氨基酸序列之间的同一性优选地通过利用BLASTP算法确定。

TF可以是完全糖基化、部分糖基化或非糖基化的。

本申请中“完全糖基化的”指全部可能的糖基化位点已被糖基化。

本申请中“部分糖基化的”指的是三个N-糖基化位点中至少一个是无功能的，该位点不能被糖基化。

本申请中“非糖基化的”指的是没有一个N-糖基化位点是功能性的，或可选地，TF多肽在体外通过非糖基化的方法(即，无细胞表达系统)表达，或在失去糖基化代谢途径的载体(即，大肠杆菌)中表达。

在一个实施方案中，TF为部分糖基化或非糖基化的。在这一实施方案中，TF被修饰，使得N-糖基化位点中至少一个是无功能的，该位点不能被糖基化。

所有成熟的TF蛋白包括三个可能的N-连接糖基化位点，所述位点具有Asn-Xaa-Ser/Thr的共有序列。以人成熟TF为例，这三个糖基化位点位于Asn11(序列Asn11-Leu12-Thr13)、Asn124(序列Asn124-Val125-Thr126)以及Asn137(序列Asn137-Asn138-Thr139)，所述位置相对于SEQ ID NO:1而言。

在一个实施方案中，人成熟TF蛋白中可以被修饰而变为无功能的N-糖基化位点是对应于上文序列SEQ ID NO:1的成熟人TF的第11-13位NLT、第124-126位NVT以及第137-139位NNT的N-糖基化位点。

在另一个实施方案中，TF携带一个或多个将Asn残基替换为非N-糖基化受体的取代。在一个更优选实施方案中，TF变体包括对应于成熟人TF的第11、124或137位的位置处的Asn残基的一个或多个Asn至Ala突变。优选地，成熟人TF在SEQ ID NO:1的第124位携带Asn至Ala的突变。

糖基化将根据用于产生TF的表达系统变化。例如，组织因子蛋白可包括一种或多种植物特异多糖、酵母特异多糖、昆虫特异多糖或动物特异多糖。

当TF在酵母中产生时，糖基化通常涉及约10个甘露糖残基的内部核心(该内部核心通过两个GlcNAc残基与天冬酰胺相连)以及50-100个甘露糖残基的分支外链。因此，N-连接的糖基化可能向TF添加多达300个甘露糖残基，使分子量增加约60kDa。此外，一些甘露糖残基可能与不同的O-连接糖基化位点(多于25)相连。因此，包含于本发明组合物中的TF分子具有一个或多个N-糖基化位点中N-连接的糖基化的可变的程度和组成。

在另一个实施方案中，TF蛋白是融合蛋白，所述融合蛋白包括含有TF蛋白的第一部分以及含有另一肽或蛋白的第二部分。

所述第二部分可以与所述TF蛋白片段第一部分的N端结合，或可选地，所述第二部分可以与所述TF蛋白片段的C端区域结合。第一以及第二组分可以直接结合或通过在所述第一以及第二区域之间的连接多肽结合。

在另一个实施方案中，所述第二部分是标签。标签可以与TF蛋白第一部分的C端或N端结构域结合。在本发明中，术语“标签”应被理解为与所述TF蛋白C端或N端结构域结合的任意肽或氨基酸序列，该序列可以用于融合蛋白的分离或纯化。因此，所述标签能够结合一个或多个配体，例如亲和基质的一个或多个配体(例如高亲和力的色谱分析载体或珠子)。所述标签的实例为组氨酸标签(His标签或HT)，例如含6个组氨酸残基的标签(His6或H6)，该标签能以高亲和力结合镍柱(Ni²⁺)或钴柱(Co²⁺)。用于分离或纯化融合蛋白的标签的其它示例性、非限制性的实例包括：Arg标签、FLAG标签、Strep标签、可被抗体识别的表位，例如c-myc标签(被抗c-myc抗体识别)、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S转移酶标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi标签等，氨基酸序列，例如Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO:2)、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO:3)、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ IDNO:4)；β-半乳糖苷酶等。

之前已公开，用于重组TF的分离或纯化的His标签具有理想的特征，其能在使大多数蛋白变性并破坏大多数蛋白-蛋白相互作用的条件下与它的配体结合。因此，在破坏目的蛋白参与的蛋白-蛋白相互作用之后，它可以被用于移除标记有H6的目的蛋白。

因此，在一个实施方案中，标签为His标签。在另一个实施方案中，His标签与TF蛋白第一部分的C端结构域结合。在另一个实施方案中，His标签与TF蛋白第一部分的N端结构域结合。

在另一个实施方案中，融合蛋白的第一部分包括成熟的TF蛋白，优选地，包括成熟人TF蛋白。在另一个实施方案中，第一部分为人成熟TF。

在另一实施方案中，融合蛋白具有第一部分和第二部分，第一部分包括至少一个N-糖基化位点无功能的成熟人组织因子蛋白，第二部分包括His标签。在优选的实施方案中，组织因子为包括SEQ ID NO:5的人TF的融合蛋白，其(a)缺少信号序列，(b)在糖基化位点有N124A突变，和(c)在C端有六个组氨酸的标签。

所述融合蛋白可以通过常规手段获得，例如，通过在合适的酵母细胞中对编码所述融合蛋白的核苷酸序列的基因表达。如果需要，可以使用最终的标签进行融合蛋白的分离或纯化。

本文使用的术语“脂化的组织因子(TF)”指的是TF完全或部分插入脂质囊泡或细胞膜的任意TF来源。“脂化的TF”来源的示例性、非限制性的实例为：1)含有脂化的TF的组织提取物(其分离可以从一些组织来实施，例如脑、胎盘以及肺组织，从来自不同动物的组织来实施，例如羊、牛、兔、狗以及人等)；2)纯化的以及(再)脂化的TF蛋白质组分，即，TF纯化后加入脂质组分(磷脂)；和3)含脂化的TF的细胞提取物，其中脂质部分来自宿主细胞，并且TF为重组表达的。

作为示例性、非限制性的实例，纯化的以及(再)脂化的TF可以通过根据MimmsL.T.et al.,”Phospholipid vesicle formation and transmembrane proteinincorporation using octyl glucoside”,Biochemistry,1981,vol.20(4),p.833-840描述的方案来制备。在所述方案中，利用非离子型洗涤剂(例如N-辛基-β-D-半乳吡喃糖苷)，将非脂化的TF并入磷脂囊泡内。可被用于根据本发明的脂化的TF的磷脂可以有任意来源(动物、植物或合成的)。几乎任何磷脂都可以用于制备本文所述的脂化TF。可用于制备脂化TF的磷脂的示例性、非限制性的实例包括磷脂酰胆碱、磷酯酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺等。TF蛋白质组分：磷脂的比例(摩尔、重量或体积)可在大范围内变化，例如约1:50000～约1:3000。在具体实施方案中，脂化的TF是脂化的人TF，由分离自人组织或重组细胞的TF的蛋白质组分组成，并且以合适的TF蛋白质组分：磷脂的比例插入到脂膜。为达到最佳的TF活性，脂质组分(优选磷脂酰胆碱以及磷酯酰丝氨酸)的优选的摩尔比在本领域是已知的。

关于制备含脂化TF的细胞提取物，其中脂质部分来自宿主细胞且TF为重组表达的，由于TF分子包含很大的疏水结构域，可以合理地假定在任意可用的真核表达系统中克隆rTF基因将导致表达或重组TF(rTF)与宿主细胞的脂膜相联。在这种相联中，可能的是，宿主膜组分可以模拟或向rTF分子提供与TF正常相联的哺乳动物细胞中存在的相似或相同的支架。因此，这些膜组分的纯化将产生脂化的rTF的可用来源。由于它的化学构成，这些分离的脂膜组分主要以不同尺寸的囊泡的形式存在。除了rTF，那些囊泡也包括具体的蛋白或脂质，这取决于宿主细胞来源。因此，来自酵母、细菌、不同来源的细胞(例如昆虫、哺乳动物、植物、鱼、藻类)的脂膜会含有此类宿主细胞的蛋白质以及脂质特征。

TF包括锚定于脂膜的疏水区域(跨膜结构域)，其亲水性区域(即，所述TF蛋白的氨基端区域以及羧基端区域)朝向膜的质膜外侧。

在本发明中，术语“脂膜”应被理解为形成细胞边界(即细胞膜或质膜)或胞内细胞器边界的数个分子(脂质和蛋白质)厚的有组织的层。通常，膜包括两层定向的脂质层，蛋白可以嵌入其中。脂双层是细胞膜的基本结构，通常在水性环境下由两亲分子(例如磷脂、脂肪酸等)形成，每一分子的定向亲水基团位于层的外侧，疏水基团朝向层的内部。优选地，TF锚定于脂质微泡。

本发明中，“脂质微泡”应被理解为小的以及闭合的室，其基本上由脂单层或脂双层组成。本发明中携带TF的微泡的尺寸可以在相对大的范围内变化，通常，所述尺寸等于或低于10μm，典型地等于或小于0.5μm。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源微泡的尺寸的范围为10-0.01μm。微泡由真核细胞的脂膜或其片段形成。在一个实施方案中，微泡可以富集带负电的磷脂，优选磷脂酰丝氨酸。用于富集这种磷脂酰丝氨酸的微泡的方法公开于例如WO2011/131658中。简要地，所述富集磷脂的携带TF的微泡可以通过下列方法制备，该方法包括：a)在允许表达TF蛋白或其具有促凝活性片段的条件下，将表达TF蛋白的重组真核细胞培养物进行发酵；b)将来自步骤a)的发酵的细胞培养物离心以得到发酵产物；c)将步骤b)产生的发酵产物进行均质化以得到发酵匀浆；和d)将步骤c)产生的发酵匀浆分离以得到沉淀以及澄清的酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物含有具有促凝活性的携带TF的来源微泡；e)收集所述澄清的酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物含有具有促凝活性的携带TF的酵母来源微泡；和，任选地，f)如果需要，通过尺寸分离方法将所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源微泡进行分离或纯化；和g)在带负电荷的磷脂(即，磷酯酰丝氨酸)中富集获得的微泡，所述富集通过将组分磷酯酰丝氨酸以及含有TF的脂质微泡孵育来实现。作为所述孵育之前的步骤，可以通过将脂质在缓冲溶液中重悬随后超声处理，将磷酯酰丝氨酸制备为多层囊泡。

产生TF的方法取决于使用的真核细胞。通常，用表达载体转化真核细胞，所述表达载体含有编码TF蛋白的核苷酸序列，其与细胞内的功能性启动子可操作地相连，所述细胞可以来自：真菌、酵母、植物或动物(例如鱼、爬行动物、哺乳动物、昆虫等)。可以使用cDNA文库作为模板以及合适的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)将编码TF蛋白的cDNA进行扩增。实施例1公开了编码成熟hTF蛋白的cDNA的扩增，所述成熟hTF蛋白在3’端含有18个额外的核苷酸(编码六个组氨酸)。

在另一个实施方案中，TF蛋白可遵循完善的色谱纯化的方法从上面的步骤a)到d)纯化。一旦纯化，可以在体外以最佳磷脂浓度将TF蛋白脂化。

在另一个实施方案中，可以从动物组织提取物中获得脂化的TF，例如脑、胎盘和肺组织，组织可来自不同动物，如羊、牛、兔、狗和人等。优选地，脂化的TF来自人。更优选地，脂化的TF是人重组体。

在本发明中，术语“凝血酶(FIIa)”应被理解为关键的丝氨酸蛋白酶，其在止血中发挥关键作用。FIIa激活参与凝血级联反应的多种凝血因子，包括纤维蛋白原(FI)、因子V(FV)、因子VIII(FVIII)、因子XI(FXI)以及因子XIII(FXIII)。FIIa也激活血小板以及血管内皮细胞。凝血酶前体是凝血素酶原(FII)，其由肝脏分泌至血液中。在凝血级联过程中，FII以不同的速率转变为FIIa，首先通过激活的FX(FXa)，并且在级联的最后步骤通过凝血素复合物(FXa:FVa)。FII从人源或牛源血浆分离后产生商业的FIIa。分离之后，FII在体外被转化为FIIa。所有目前市售的FS都含有人源或牛源的FIIa。此外，高度纯化的重组人FIIa也是可获得的。这种重组人FIIa来自于纯化后的人FII，所述人FII来自重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，随后通过体外方法加工为FIIa。

本发明可以使用的示例性FII蛋白包括人FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version182，2012年11月，登录号P00734.)、牛FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 153，2012年11月，登录号P00735)、鼠FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 141，2012年11月，登录号P19221)、猪FII(UniProtKB/Swiss-Prot.Version 37，2012年11月.登录号B3STX9)，以及不同动物的FII蛋白。优选地，凝血酶为人源或牛源，但是更优选人凝血酶，且甚至更优选重组人凝血酶。

本领域公知的是，凝血酶的浓度以单位/mL表示。表示凝血酶的量的单位可以是“NIH”单位或国际单位。如何将一个系统中表述的单位换算为另一种在本领域也是公知的：

1IOWA单位＝0.83NIH单位

1IU＝1NIH单位

1NIH单位＝0.324±0.073mg

1NIH单位＝1USP单位

在一个实施方案中，本发明的任何组合物是液体形式。在这一实施方案中，可以通过制备单独的凝血酶溶液和脂化的TF溶液获得组合物，两种溶液的浓度使得将两种溶液混合后，得到的组合物具有上文提到的规定浓度的凝血酶和TF。可选地，可以通过制备凝血酶或脂化的TF溶液并且另一组分以粉末的形式加入获得组合物，只要得到的液体组合物中每一组分的终浓度为上文提到的浓度。可以使用任何生理上可接受的溶剂。溶剂的示例性、非限制性实例包括水、盐水缓冲液、磷酸盐缓冲液或体液，如血液或滑液。

在另一个实施方案中，本发明的任何组合物是粉末形式。在该实施方案中，可以通过从液体组合物(可根据以上公开内容获得)出发获得组合物，该液体组合物已具有规定浓度的凝血酶和脂化的TF，然后可以将其进行公知的制粉技术，只要此种技术不对凝血酶或TF的稳定性产生不利影响。制粉技术的示例性、非限制性的实例基于干燥技术，例如，冻干法或喷雾干燥法。

可选地，可以通过从粉末形式的凝血酶和脂化的TF出发获得粉末组合物。在该实施方案中，技术人员可以容易地确定需要的每一组分的量，从而获得每一组分具有规定浓度的组合物。

在另一实施方案中，本发明的任何组合物是固体泡沫形式。这些固体泡沫可以通过喷雾干燥技术从液体组合物(可根据上文的公开内容获得)获得。

在另一个实施方案中，本发明的任何组合物是半固体形式。为了获得这种形式，需要合适的赋形剂和载体。下文提供了对获得此种半固体组合物有用的赋形剂和载体。

在本发明第一方面的实施方案中，组合物还包括交联剂。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，组合物还包括CaCl₂。

在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。

在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括交联剂和CaCl₂。

在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

优选地，所述交联剂为FXIII或激活的FXIIIa。

优选地，所述纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶、凝血酸和氨基乙酸。

如上文所述，本发明另一方面提供药学或兽医学组合物，所述组合物包括治疗有效量的本发明第一方面的组合物，以及合适的药学或兽医可接受的赋形剂和/或载体。

本文使用的表述“治疗有效量”指当施用该量的组合物时，足以阻止被治疗疾病的一种或多种症状的发展或将其减轻至一定程度。施用根据本发明的组合物的具体剂量当然由围绕事件的具体情况决定，包括施用的化合物、给药途径、被治疗的具体状态以及相似的考虑。

制备此类药学或兽医学组合物的方法在本领域是已知的。

本发明的药学或兽医学组合物应局部施用于出血部位，可直接施用或者通过载体材料施用，例如纱布。局部施用的实例包括，但不限于，外部、皮肤、鼻内、囊内、阴道内、颊、直肠、眼、内窥镜局部应用以及滴注法。

本发明第二方面的药学或兽医学组合物可采取以下形式：软的或硬的凝胶、液体、洗液、乳霜、药膏、糊剂、走珠剂型、喷雾、气溶胶、泡沫、施用垫剂型以及成膜剂型。

对于局部给药，合适的药学赋形剂或载体包括，但不限于，保湿剂、润肤剂、乳化剂、湿润剂、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、介质或其混合物。使用的赋形剂或载体对皮肤有亲和性，耐受性好、稳定，并且用量足够提供理想的均一性，易于施用。

当本发明的药学或兽医学组合物是局部使用时，它可配制为多种形式，包括，但不限于，溶液、洗液、凝胶、药膏、糊剂、乳霜、软的或硬的凝胶、液体、泡沫、走珠剂型、喷雾、气溶胶、施用垫剂型以及成膜剂型。可以根据本领域已知的方法制备这些局部药学组合物。合适的药学赋形剂和/或载体以及它们的量可由本领域技术人员根据制备的剂型的种类容易地确定。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的一个实施方案中，组合物包括交联剂。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的另一个实施方案中，组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的另一实施方案中，组合物还包括CaCl₂。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，组合物还包括交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂和CaCl₂。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，组合物还包括交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

优选地，所述交联剂为FXIII。

本发明的组合物可用作经历手术的患者通过常规外科技术(如缝合线、绷带和烧灼)控制出血时的止血辅助物，以及标准外科技术(例如缝合线和绷带)中的辅助物以防止渗漏。

在又一方面，本发明提供止血组合物和载体材料，所述组合物包括本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物。

在本发明中，在组合物、效果和用途中涉及的术语“止血剂”应被理解为促进凝血的物质，即，能止住出血。它也可被称为“抗出血药物”和“促凝剂”。

术语“载体材料”应被理解为允许在其上沉积、运输和在期望的部位释放本发明组合物的合适的材料基质，所述期望的部位例如本发明组合物发挥治疗效果的部位。所述载体材料可以是固体载体。固体载体的示例性、非限制性的实例包括敷料、创可贴、敷布、膏药等。液体载体的示例性、非限制性的实例包括凝胶、喷雾、漱口水等。组合物组分与固体材料之间的相互作用可以是物理或化学相互作用。

在一个实施方案中，载体材料是由胶原、明胶或氧化再生纤维素制成的固体载体。

在另一个实施方案中，载体材料是用于分散粉末的装置。

在一个实施方案中，第一方面的组合物以液体形式施用于载体材料，即，用本发明的组合物浸润载体。

在本发明第三方面的止血组合物的另一个实施方案中，止血组合物包括交联剂。

在本发明第三方面的止血组合物的另一个实施方案中，止血组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂。

在本发明第三方面的止血组合物的另一实施方案中，止血组合物还包括CaCl₂。

在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。

在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂和CaCl₂。

在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

优选地，所述交联剂为FXIII。

由于以上详细指出的性质，本发明的组合物可用作伤口愈合剂。

表述“伤口愈合”涉及复杂过程，在此过程中，皮肤(或一些其它器官)在任何种类以及任何位置的损伤伤口愈合之后进行自我修复。它可以是正常的以及受损的伤口愈合。后者特别发现于疾病的情况中，例如糖尿病、血管炎、动脉闭塞性疾病、慢性静脉和/或感染性溃疡以及不良愈合的胃部溃疡。受损的伤口愈合也发现于神经损伤情况中，例如截瘫、麻风病、神经病变等，以及需要护理的患者的褥疮坏疽。如果手术(特别是肠)以及皮肤和其它器官的移植后发生不牢固的缝合线和受损的愈合，受损伤口愈合也会发生。

受损的伤口愈合也发现于骨折、烧伤和使用类固醇治疗的情况中。

本文使用的术语“伤口”包括任何组织的损伤，包括，例如，伤口愈合延迟或困难以及慢性伤口。伤口的实例可以包括开放性和闭合性伤口。术语“伤口”也可以包括，例如，不同方式导致的并具有不同的特征的皮肤或皮下组织的损伤(如，长期卧床导致的褥疮和外伤引发的伤口)。伤口可以根据伤口的深度分类至四个等级中的一级：ⅰ)等级Ⅰ：伤口限于上皮；ⅱ)等级Ⅱ：伤口延伸至真皮；ⅲ)等级Ⅲ：伤口延伸至皮下组织；和ⅳ)等级Ⅳ：伤口(或全层伤口)，其中骨头被暴露出来(如，骨压力点，如大转子或骶骨)。

术语“慢性伤口”一般指还未愈合的伤口。慢性伤口包括静脉溃疡、静脉淤积性溃疡、动脉溃疡、压迫溃疡、糖尿病溃疡、糖尿病足部溃疡、血管炎溃疡、褥疮性溃疡、烧伤溃疡、外伤诱导的溃疡、感染性溃疡、混合式溃疡和坏疽性脓皮病。

本发明的组合物还可以用于出血的治疗。优选地，本发明的组合物局部施用。此类出血可以是由于凝血病、受伤、伤口或血小板疾病等。

如下所示，本发明组合物作为抗出血剂起作用，因此可被用于治疗或改正出血性疾病，特别是与出血性素质相关的那些出血性疾病。

术语“出血性素质”指引起止血障碍的过程，其结果导致出血综合征的发生，出血综合征可偶尔发生广泛以及大量出血。

术语“凝血病”指凝血因子疾病。该种疾病可能是由于特定的凝血因子缺乏或不足，其结果导致发生出血综合征，或者该种疾病可能是由于凝血因子病症。凝血病通常可以为先天性凝血病或获得性凝血病。作为先天性凝血病的示例性、非限制性的实例，可被提到的凝血因子的缺乏选自凝血因子V(FV)、凝血因子VII(FVII)、凝血因子VIII(FVIII)(其不足或缺乏引起血友病A)、凝血因子IX(FIX)(其不足或缺乏引起血友病B)、凝血因子X(FX)、凝血因子XI(FXI)(其不足或缺乏引起血友病C)、凝血因子XII(FXII)、凝血因子XIII(FXIII)和它们的组合。获得性凝血病可能有不同的病因。示例性实例包括在严重肝衰竭、抗凝血治疗(如肝素、低分子量的肝素、华法令、香豆素衍生物、双香豆素等)时的凝血因子合成缺乏。可选择的机制基于凝血因子的过量消耗，使得它们不足以在出血病变时形成凝块。由于消耗发生在多种疾病中，例如损害微循环内皮、激活血小板和凝血因子，伴随形成多个微血栓的重症脓毒症中、在通过TF的血液入侵，例如胎盘释放、死胎停留中、破碎组织的多处创伤中、毒蛇咬伤中等，该机制发生在弥漫性血管内凝集综合征或凝血病。在血管炎中，顶骨和内皮损伤释放凝血激活因子。凝血因子的消耗通过许多微血栓纤维蛋白溶解被加剧，溶解是由于作为抗血小板药物以及抗凝血剂的胞浆素的作用。

术语“血小板疾病”指血小板数量上及功能活性上的疾病，其结果为出血综合征的产生。所述血小板疾病可以是先天性的或者获得性的。在一个具体实施方案中，血小板疾病是先天性的血小板疾病。先天性血小板疾病的示例性、非限制的实例包括Glanzmann病、Bernard Soulier病、Bolin-Jamieson综合征、Wiskott-Aldrich综合征、Paris-Trousseau-Jacobsen综合征、X染色体血小板减少症、灰色血小板综合征、Sebastian综合征和范可尼贫血。在另一具体实施方案中，血小板疾病是获得性血小板疾病。获得性血小板疾病的示例性、非限制性的实例包括骨髓增殖性疾病，例如血小板增多症、红血球增多症、慢性粒细胞性白血病等；在骨髓化生中存在功能性血小板疾病，伴随出血时间增加、玻璃珠滞留缺陷症、血小板聚集缺陷症、异常释放、以及血小板因子Ⅲ缺陷。功能性血小板缺陷症发现于坏血病的蛋白异常血症、先天性心脏病以及肝硬化中。

在本发明第七方面的一个实施方案中，提供以上所述的组合物在局部治疗出血的用途，通过将其施用于损伤部位来实现。

本文使用的术语“个体”包括动物物种中的任何成员，包括人类；作为示例性、非限制性的实例，所述个体可以是哺乳动物，如灵长类、驯养动物、啮齿类动物等。所述个体优选任何年龄和种族的男性或女性。在一个具体实施方案中，所述个体为无止血病症史的人，如没有凝血病或血小板疾病的个体。在另一个具体实施方案中，所述个体为有止血病症史的人，如有出血性素质的个体，例如凝血病(如先天性或获得性的凝血病)或血小板疾病(如先天性或获得性血小板疾病)。

由于TF是公知的促血管生成分子，本发明的组合物也可用于与血管生成缺陷有关的疾病的治疗中。

本文使用的术语“与血管生成缺陷有关的疾病”涉及可通过激活血管形成被治愈的疾病。表述“血管生成”涉及任何种类以及在任何部位的血管生成。促进血管生成可能在许多临床疾病状态中是有用的。例如，在缺血性疾病、心肌梗塞过程中或之后，或者冠状动脉搭桥手术之后，本发明的组合物可用于促进心肌组织侧支血管的生成。可以使用本发明组合物治疗的其它疾病或状态包括引起周围或者中枢神经系统病变的血管疾病和/或缺血性疾病。此类状态/疾病可以包括脑血管急性事件，如由凝块闭塞或动脉瘤破裂引起的，或者引起神经元死亡或周围功能损伤(例如运动或感知功能或言语功能损伤)的系统或者局部缺血，缺血性心肌病或者周围动脉疾病(如慢性肢体缺血性跛行(骨骼肌))、静息疼痛/缺血性溃疡、坏疽。此外，促进血管生成对于替换损伤的(如老化的)血管是足够的。例如，它们可以存在于脑部或心脏，以便能够预防或治疗中风或梗塞。预防也可针对presbyphrenia。此外，它涉及动脉硬化、克罗恩病和溃疡性结肠炎、糖尿病视网膜病和腿部深度静脉血栓症/腿部溃疡的治疗及预防复发的血管生成。

最后，又一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一或第二方面的组合物以及施用器。

试剂盒可以采取(a)两部分的形式，在这种方式下，每一部分含有形成组合的每一组分，即，试剂盒的一部分含有凝血酶，另一部分含有脂化的组织因子；或者选择性地，采取(b)一部分的形式，在这种方式中，凝血酶和脂化的TF并为单一部分。

因此，在一个实施方案中，试剂盒包括：a)包含凝血酶的第一部分；b)包含脂化的组织因子的第二部分；和c)同时施用试剂盒中包含的全部组分的施用器。

在另一实施方案中，试剂盒包括：a)包含凝血酶和脂化的组织因子的第一部分；和b)同时施用试剂盒包含的所有组分的施用器。

试剂盒中包含的凝血酶和脂化的组织因子可以是任何合适的形式，例如溶液、悬浮液或粉末，只要它们的浓度为1-30IU/g组合物和5-150ng/g组合物，以及适当的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。

此外，试剂盒可以包括在上文提到的任何应用中的使用说明书。

在一个实施方案中，试剂盒还包括交联剂。

在另一个实施方案中，试剂盒还包括纤维蛋白溶解抑制剂。

在另一个实施方案中，试剂盒还包括CaCl₂。

在又一实施方案中，试剂盒还包括交联剂和纤维蛋白溶解抑制剂。

在又一实施方案中，试剂盒包括交联剂和CaCl₂。

在又一实施方案中，试剂盒包括纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

在又一实施方案中，试剂盒包括交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl₂。

优选地，所述交联剂为FXIII。

交联剂、纤维蛋白溶解抑制剂和/或CaCl₂可包含于上文指出的凝血酶和脂化的组织因子中的任一部分，或者可选地，每一种可为另外的单独的部分或可共享试剂盒的同一部分。

任何其它的组分可包括在试剂盒中，只要它对其中包含的组合物的止血剂特征没有负面影响。这样的额外组分可以包含于上文提到的凝血酶和脂化的组织因子中的任一部分。可选地，试剂盒中的“额外组分”中的每一种可为另外的单独的部分。

允许同时施用包含于试剂盒中所有组分的施用器的示例性、非限制性实例为有管的注射器、喷雾施用器、衬垫或当是粉末形式时用于分散组分的装置等。

粉末分散装置的一个实例公开于WO2010/07033中。

在整个说明书和权利要求中，术语“包括(comprise)”以及它的变形词并不意图排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，术语“包括(comprise)”涵盖“由…组成(consist of)”的情况。通过查阅说明书，本发明另外的目的、优势和特征对于本领域那些技术人员将是显而易见的，或通过实施本发明可以获知的。下面的实施例和附图以举例说明的方式提供，并且它们并不意图限制本发明。此外，本发明涵盖本文描述的具体的以及优选的实施方案的所有可能的组合。

实施例

实施例1：基于在酵母中表达全长TF his标签修饰蛋白产生重组组织因子(下文也称为“TT-173”)。

本文使用了WO2008080989的实施例1描述的酵母游离型载体pTT-10301，用于在GPD启动子控制下，克隆编码成熟hTF蛋白的SEQ ID NO:6的cDNA(SEQ ID NO:1的33-295位氨基酸)，所述成熟hTF蛋白在3’末端有His标签，并且含有Asn124Ala的突变，该突变使得在天然hTF序列(SEQ ID NO:5)中一个可能的N-糖基化位点失活，所述载体包含URA3基因、氨苄青霉素抗性基因、酵母2μ复制起点、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子以及磷酸甘油酸激酶的酵母转录终止信号。

SEQ ID NO:6按如下方式获得。利用序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物序列扩增TF的人cDNA序列(Genbank登录号BC011029,SEQ ID NO:11)。利用序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，通过定点突变进一步修饰得到的扩增DNA序列。为了该目的，使用Quick Change定点突变试剂盒(Stratagene)，依照Stratagene手册中描述的方法。用这种后者的突变，产生了包含TF蛋白序列124位氨基酸残基Asn到Ala的点突变的TF序列。

转化之后，收集可以在不含尿嘧啶的培养基中生长的酵母菌株，并测试它们表达hTF的能力，基本上如WO2008080989中所描述，通过Western印迹分析酵母提取物。简要地，包含含有TF编码基因的修饰形式(SEQ ID NO:6)的游离型表达质粒的酵母在发酵罐中生长，并通过离心收集得到的细胞。将收集的细胞在合适的裂解缓冲液(20mM磷酸盐、50mMNaCl,pH 7.4)中重悬，并通过将其三次经过1000bars压力的均质器进行高压裂解以获得发酵裂解液(发酵匀浆)。通过将容器浸入冰浴中，细胞悬液维持冷却。在这之后，通过离心的方法将发酵裂解液中最重的物质除去，从而获得澄清的酵母提取物(CYE)上清。用裂解缓冲液稀释从均质化步骤获得的CYE，直至总蛋白浓度达到5-6mg/mL的浓度，并分别通过0.45μm、0.2μm和0.1μm的连续过滤器将其过滤，从而降低无膜宿主细胞衍生蛋白(HCP)的量，并获得更均质的rTF囊泡材料。

0.1μm的微滤滞留物中的囊泡的直径小于0.2μm。为了去除痕量的DNA，然后用10U/mL的核酸内切酶Benzonase(Merck)和终浓度1mM的氯化镁处理0.1μm的微滤滞留物，并在转速约20rpm的玻璃容器中，4℃孵育12h，并用于进一步富集步骤。

为了根据囊泡的尺寸进一步分离不同的囊泡亚群以及移除不想要的残余细胞材料，将滤过的澄清的酵母提取物施加于Sephacryl尺寸排阻色谱柱。分离后，将对应于富含rTF的囊泡的组分2-22合并并且过滤除菌。在这之后，向无菌产物中加入终浓度为0.1mg/mL的磷酯酰丝氨酸(PS)，在室温将混合物维持2h以允许PS并入囊泡。作为在先步骤，根据通过超声制备磷脂囊泡(SUV)的Morrissey实验室方法，可以通过在缓冲溶液中将脂质重悬，然后超声处理将PS制备为多层囊泡。简要地：(1)在玻璃试管(13x 100mm管是合适的尺寸)中分散2.6μmole的总磷脂(PL)；(2)在通风橱中，在温和的氮气或氩气流下干燥PL混合物。干燥时，在高度真空条件下抽真空额外60分钟。(这是为了移除任何残留的氯仿)；(3)向脱水后的PL加入2.6mL室温HBS溶液，并用封口膜封闭试管端部。室温静置1hr；(4)强力涡旋试管以完全重悬PL。得到的应当是乳白色的均匀的悬浮液；(5)用室温水填充水浴超声仪。使用环架和试管夹在水浴中悬浮含有PL悬浮液的试管。试管内的液体水平应与试管外的水平相当。超声直至悬浮液在外观上从乳白色变为几近澄清(即，只有非常轻微的模糊)。每10min检查一次；整个超声时间通常需要10-30min(确保不要让水浴过热，并且在水浴完全冷却前不要排水)；和(6)在4℃保存终产物。得到的是HBS中总共含有1mM磷脂的小单层囊泡(SUV)的悬浮液。

孵育2h后，将含有富含PS囊泡的无菌产物分成小份并冻干。冻干的材料对应于下面试验中使用的rTF，并且由锚定在高度富含PS的脂质囊泡上的SEQ ID NO:5的蛋白组成。

实施例2：在全血中向凝血酶加入TF的效果

对于这些实验，使用来自三个健康个体的柠檬酸钠处理的血液样品。在开始实验之前，准备凝血酶和脂化的组织因子。为了这一目的，在1mL磷酸盐缓冲液(20mM磷酸盐,50mM NaCl,pH 7.4)中重悬一瓶含有1000NIH单位的冻干的牛凝血酶(Ref.T4648 SIGMA)。平行地，也在1mL磷酸盐缓冲液中复原含有1μg脂化的TF的冻干的TT-173。从这两种储液中，制备含有下面所述的工作溶液：

i)单个测试物：凝血酶(1000、300、30、3和1IU/mL和)或脂化的TF(150、15和5ng/mL)，和

ii)凝血酶(IU)+脂化的TF(ng)的组合，组合按下述比例配比(每毫升)：1+5、1+15、1+150、3+5、3+15、3+150、30+5、30+15和30+150。

发现对于制备的每一溶液，不管是单个测试物还是组合，1mL的重量为1克。因此，以上所述的凝血酶、脂化的TF或不同的凝血酶+脂化的TF比例的浓度也可表述为每克溶液(对于单独的凝血酶或脂化的TF的情况)或每克组合物(对于凝血酶+脂化的TF组合的情况)。

一旦准备好，将20μL上述溶液分别置于血栓弹性描记器(TEG)的样品杯中，之后加入20μL氯化钙。然后，将300μL血液转移至TEG杯内，并通过TEG监测凝血时间参数(下文也称为“CT参数”)。最后，记录每一测试物(凝血酶、脂化的TF或组合)浓度的CT时间。结果总结在表1-2中：

表1：单独使用凝血酶时的CT

凝血酶的量	CT(秒)
		1IU/克凝血酶	735±21.2
3IU/克凝血酶	506±38.2
		30IU/克凝血酶	127.5±40.3
300IU/克凝血酶	84.7±20.1

表2：使用凝血酶+脂化的TF组合物时的CT

正如所预期的，向血液中加入浓度为1、3、30IU单位/克组合的外源凝血酶以剂量依赖形式显著降低了CT值(参见表1)。

下一步是确定测试浓度的FIIa(1、3和30U/mL)与脂化的TF组合的施加效果。出人意料的是，向FIIa中添加少量的脂化的TF(5ng/mL)，引起CT时间显著降低。如表2所示，5ng脂化的TF与1、3或30IU的凝血酶的组合引发的CT时间与单独使用300U/mL凝血酶时获得的CT时间相似。

在相似的实验中，使用商业的脂化的rTF(American Diagnostica ref.4500L)代替TT-173，对这些结果进行了确认。在这些研究中，仅测试了单一浓度的脂化的rTF。结果如表3所示：

表3

从这些结果可以总结出，每克组合物含有1-30IU凝血酶和5-150ng脂化的TF的组合物产生了协同的凝血效果。

实施例3：脂化的rTF与凝血酶组合的体内效果

为了证明脂化的rTF与凝血酶以一定浓度比例的组合可以引起明显的协同效果，在标准的猪肝脏模型中实施下面的研究。

为了这一目的，将在合适的装置中饲养的重30-40Kg的猪，按照动物研究的标准UE的规定进行麻醉，麻醉是通过肌肉内注射盐酸甲苯噻嗪(1.1mg/Kg)和盐酸氯胺酮(15mg/Kg)的组合实现，并且在整个研究中通过吸入异氟烷和氧气维持猪。将猪按背卧式放置。将皮肤刮毛，并为无菌手术作准备。对于肝脏损伤，穿过皮肤切开上中线剖腹手术切口。暴露肝脏，将直径8mm的尖端探针插入左叶2cm。之后立即在伤口施用止血剂测试物，用精密计时表记录止血需要的时间跨度。之后，在距离3cm处切开相似的切口，并测试新测试物的止血效果。测试的测试物为：

1.浸于1mL盐水中的5cm²的商业胶原垫(Curaspon)

2.浸于含有80ng脂化的rTF(TT-173)的磷酸盐缓冲液中的5cm²的商业胶原垫(Curaspon)

3.浸于含有8ng脂化的rTF(TT-173)的磷酸盐缓冲液中的5cm²的商业胶原垫(Curaspon)

4.浸于含有200IU凝血酶(SIGMA)的磷酸盐缓冲液中的5cm²的商业胶原垫(Curaspon)

5.浸于含有20IU凝血酶(SIGMA)的磷酸盐缓冲液中的5cm²的商业胶原垫(Curaspon)

6.浸于含有20IU凝血酶(SIGMA)和8ng rTF(TT173)的磷酸盐缓冲液中的5cm²的商业胶原垫(Curaspon)

发现对于制备的每一溶液，不管是单独的测试物还是组合，1mL的重量为1克。因此，上文所述的：凝血酶、脂化的TF或不同的凝血酶+脂化的TF比例的浓度也可以表述为每克溶液(对于单独的凝血酶或脂化的TF的情况)或每克组合物(对于凝血酶+脂化的TF组合的情况)。

每一测试物测试三至六次。对于每一测试物观察到的止血时间的平均值显示于图1中。在研究结束时，通过静脉内注射喷妥撒使动物安乐死。

如图所示，用浸于盐水的商业胶原垫处理伤口，产生的止血时间为约260秒(柱1)。然而，当用分别浸于单独的两种剂量(80或8ng/mL的rTF)的rTF(柱2和3)或单独的两种剂量(200或20IU/mL)的凝血酶(柱4和5)的商业胶原垫处理伤口时，凝血时间明显降低，且具有剂量依赖性。因此，用80ng rTF/mL处理，使凝血时间从260秒降至50秒(比较柱1与2)。正如所预期的，rTF浓度降低10倍导致凝集时间由50秒增加至170秒(比较柱2与3)。类似地，与使用200IU/mL凝血酶(80秒，柱4)相比，当凝血酶的剂量减少10倍(230秒，柱5)时，观察到的止血效果大幅度降低。

非常值得注意的是，最低剂量的rTF(8ng/mL)与最低剂量的凝血酶(20IU/mL)的组合产生协同效果，引起与施用相似浓度的单独的rTF(从170至90秒，比较柱3和柱6)或单独的凝血酶(从240至90秒，比较柱5和柱6)相比，凝血时间大幅减少。这些结果确认了，在体内，含有一定浓度比例的凝血酶和脂化的rTF的组合物产生协同的止血效果。本申请引用的参考文献

WO2008/080989；

WO2010/07033；

WO2011/131658；和

Mimms LT,Zampighi G,Nozaki Y,Tanford C,Reynolds JA.Phospholipidvesicle formation and transmembrane protein incorporation using octylglucoside.Biochemistry.1981Feb 17；20(4):833-40。

Claims

1.组合物，其包含脂化的组织因子和凝血酶的组合，其中所包含的凝血酶的量为每克组合物1-30IU，所包含的脂化的组织因子的量为每克组合物5-150ng。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所包含的脂化的组织因子为每克组合物5-15ng。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述脂化的组织因子的至少一个N-糖基化位点是无功能的。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述脂化的组织因子与His标签部分融合而形成融合蛋白。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述脂化的组织因子为至少一个N-糖基化位点为无功能的成熟人组织因子蛋白。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO：5组成。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述脂化的组织因子锚定于脂质微泡中。

8.药学组合物，其含有治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的组合物，和其它合适的药学可接受的赋形剂和/或载体。

9.止血组合物，其含有如权利要求1-7中任一项所述的组合物或者如权利要求8所述的药学组合物，以及载体材料。

10.如权利要求1-7中任一项所述的组合物、或者如权利要求8所述的药学组合物、或者如权利要求9所述的止血组合物在制备用于治疗出血的药物中的用途。

11.试剂盒，其包括如权利要求1-7中任一项所述的组合物、或者如权利要求8所述的药学组合物、或者如权利要求9所述的止血组合物，以及施用器，所述施用器允许同时施用形成所述组合的所有组分。