JP2023541650A - 止血管理を改善するシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、創傷ドレッシング材としてまたは創傷ドレッシング材においての使用に適するドレッシング材に、組織因子タンパク質を固定化し、組織因子を創傷に直接接触した状態にすることにより、止血管理を改善するための、安全でかつ有効なシステムに関する。本発明は、固定化された組織因子を用いて、血液凝固カスケートの最も重要な構成成分であるトロンビンが、非常に迅速に放出されるプロセスである、「トロンビンバースト」を作り出すことを目的とする。血管床中への組織因子タンパク質の全身性放出が全く起こらない。結合した組織因子タンパク質は、止血を最適化するために単独で使用でき、または別のヒトタンパク質もしくは成分と組み合わせて使用することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、望ましくない全身凝固（例えば、播種性血管内凝固）を防止しつつ、止血を促進するための、速効性でかつ安全なシステムに関する。より正確には、該システムは、ドレッシング材（dressing material）上に固定された、組織因子（TF）を含む１つ以上の止血剤を含んでなり、これにより、該システムは、損傷部位において局所的凝血塊（血餅）形成を開始することができると同時に、安全に使用することができる。

本発明は、固定化された組織因子を使用して局所的な「トロンビンバースト」を作り出すこと、いわゆるトロンビンが急速に放出される機序を利用する。

米国外傷外科学会（the American Association for the Surgery of Trauma；AAST）によれば、外傷は、１～４５歳の年齢のすべての人の死亡の主原因である。大域的には、損傷は、年間あたり５百万件以上の死亡の原因となっている。市民および軍人の両方において、外傷性事象後に起こる、防ぐことのできる死亡の大部分は、出血の結果として起こる（Bellamy R.F. Causes of death in conventional warfare, Mil Med. 1984; 149: 55-62）。

第III因子とも呼ばれる組織因子（TF）は、細胞外成分との相互作用に利用可能な細胞外ドメインを有する、膜貫通型糖タンパク質である。組織因子は、全血に曝されると血液凝固を開始させることが知られている。それは、第VII因子および活性化第VII因子に対する高親和性受容体として機能する。生成した複合体は、限定された特異的タンパク質分解によって凝固プロテアーゼカスケードの開始を担う触媒現象を提供する（Grover S.P. & Mackman N. Tissue Factor An Essential Mediator of Hemostasis and Trigger of Thrombosis, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018；38：709-725）。

凝固（血栓形成）は、血液が凝固して血栓を生成する過程であり、それは止血の重要な部分である。損傷した血管、いわゆる傷ついた血管からの血液損失の停止には、出血を止め、損傷した血管の修復を開始させるために、損傷した血管壁が血小板およびフィブリン含有凝血塊によって覆われることが必要である。凝固障害は、流血（出血）または閉塞性血栓形成（血栓症）のリスクの増加につながる可能性がある。

血液凝固を開始することができる２つの経路が存在するという一般的な科学的コンセンサスが存在する：それは、いわゆる外因性経路と内因性経路、またはしばしば接触経路と呼ばれる。

内因性経路は、それに関連する既知の出血原因論が存在せず、それゆえに、この経路は止血に付帯するものと考えられる。

外因性経路は、血管壁への損傷によって活性化され、その後、第III因子またはCD142とも呼ばれる組織因子が、内皮下組織内に存在する血管を取り囲む細胞によって構成的に発現される。活性化された内因性第VII因子は、組織因子に結合して、凝固プロテアーゼカスケードの重要な開始剤である、組織因子－FVIIa複合体を形成する。組織因子－FVIIa複合体は、カルシウム依存性方式で、負に帯電した膜表面上に集合して、第IX因子と第X因子をタンパク質分解によりそれぞれ第IXa因子と第Xa因子とに変換する。

第IXa因子および第Xa因子は、それぞれ、プロトロンビン（第II因子）からトロンビン（第IIa因子）への変換を誘導する、内因性因子Xaseおよびプロトロンビン複合体の酵素的成分である。活性化された内因性因子の結合活性は、トロンビン（FIIa）の爆発的バーストにつながる。トロンビンが生成されると、それはそれぞれFPAおよびFPBと呼ばれるフィブリノゲン放出性フィブリノペプチドＡおよびＢを開裂し、そして第XIII因子を活性化して架橋フィブリン凝血塊（血餅）を形成する。

止血は、1）血管狭窄、2）血小板栓による内皮欠陥の一時的閉塞、および3）血液凝固、すなわち止血の不可欠な部分であるフィブリン塊の形成、という３つの主要なステップを有する。

組織因子－ＶＩＩａ複合体の形成による凝固カスケードのトリガー（触発）は、適当な膜表面上で直接、または膜表面と接合して直接起こり、天然基質の第ＩＸ因子、第Ｘ因子、および第ＶＩＩ因子 に対する最大のタンパク質分解活性を発現させるだろうと推測される〔Ｗ． Ｒｕｆ， Ａ． Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ， Ｊ．Ｈ． Ｍｏｒｉｓｓｅｙ， ＆ Ｔ．Ｓ． Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ， “Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ” Ｊ， Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， ２６６， ２１５８－２１６６ （１９９１）； Ｍ．Ｍ． Ｆｉｏｒｅ Ｐ．Ｆ． Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ ＆ Ｊ．Ｈ． Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ “Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｅｎｈａｎｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ”， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， ２６９ （１）， １４３－１４９， （１９９４）〕。したがって、組織因子の細胞外ドメインと膜貫通ドメインは、血液凝固過程においてそれぞれ別々の役割を果たしている（Ｓａｕｌｉｕｓ Ｂｕｔｅｎａｓ、”Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ （Ｃａｉｒｏ）、２０１２：９６４８６２ （２０１２））。加えて、細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を欠いている組織因子タンパク質は、膜に結合することができないため、第ＶＩＩａ因子との複合体を形成しても、天然基質の第ＩＸ因子および第Ｘ因子をタンパク質分解することにおいて効率的でない（活性型でも全く効率的でない）ことを文献は教示している〔Ｗ． Ｒｕｆ， Ａ． Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ， Ｊ．Ｈ． Ｍｏｒｉｓｓｅｙ、およびＴ．Ｓ． Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ “Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ” Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， ２６６， ２１５８－２１６６， （１９９１） ； Ｍ．Ｍ． Ｆｉｏｒｅ， Ｐ．Ｆ． Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ ＆ Ｊ．Ｈ． Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ “Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ”， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， ２６９ （１）， １４３－１４９，（１９９４）〕。

例えば、Ｂｕｔｅｎａｓ〔Ｓａｕｌｉｕｓ Ｂｕｔｅｎａｓ、“Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ （Ｃａｉｒｏ）， ２０１２： ９６４８６２．（２０１２）〕により要約されているように、細胞外ドメインの特別な作用機序、構造－活性関係、組織因子の起源、翻訳後修飾、またはジスルフィド結合およびグリコシル化の役割の明確な科学的コンセンサスは存在しない。

凝血塊を形成しうるため、循環中の高濃度の止血促進化合物の存在が潜在的に致命的でありうることは、臨床プラクチスからよく知られている。このため、出血を抑えるための第VII因子または他の止血増強剤の全身投与は、脳をはじめとする幾つかの部位で望ましくなく且つ致命的な血液凝固を引き起こしうるので、他のオプションが利用可能でない場合にのみ、これらの治療法が用いられる（O'Connell K.A., Wood J.J., Wise R.P., Lozier J.N., Braun M.M., JAMA. 2006 Jan 18；295（3）：293-8）。

出血を抑えるための局所処置用ドレッシング材は、全身投与に代わる便利な代替物であり得る。このため、創傷を管理および保護し、潜在的に致命的な出血を止める必要性に応じて、止血制御、創傷治癒および治療のための多数の創傷ドレッシング材（創傷被覆材）が開発されている。

創傷ドレッシング材は、例えば、ラップ、ガーゼ、およびテープといった二次ドレッシング材およびカバードレッシング材に加えて、例えばシート、タンポンまたは縫合糸の形態で、例えば層状構造物または複合材料において、様々な形状、サイズおよび材料のものが入手可能である。

様々な創傷ドレッシング材の概説は、Ｗｉｌｌｉ ＰａｕｌおよびＣｈａｎｄｒａ Ｐ． Ｓｈａｒｍａ著、“Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ”（Ｓｍｉｔｈｅｒｓ、２０１５）に、そして生物学的材料の概説はＭａｇｎｕｓ Ａｇｒｅｎ著、“Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ － Ｖｏｌｕｍｅ ２： Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０１６）に見つけることができる。外傷および緊急手術における局所止血剤の使用並びに様々な製品および液剤の使用並びにいくつかの安全性問題に関する概説は、Ｃｈｉａｒａ他、ＢＭＣ Ｓｕｒｇｅｒｙ （２０１８） １８： ６８に見出すことができる。この参考文献は、止血剤が機能し得る、複雑性で多様な外傷および手術条件についても要約している。

即時的な創傷管理と長期の創傷管理の両方のために、多くの特殊なタイプの創傷ドレッシング材が開発されている。例えば、火傷、軽度から中程度の排液性創傷、壊死性創傷において、圧縮ラップの下で、褥瘡（床ずれ）および静脈性潰瘍で用いられる、親水コロイド（ハイドロコロイド）包帯が開発されている。ヒドロゲルは、ほとんどまたは全く余分な液分を持たない外傷、痛みを伴う創傷、壊死性創傷、褥瘡（床ずれ）、恵皮部、第２度以上の熱傷、および感染性創傷に用いられる。アルギン酸塩ドレッシング材は、中程度から重度の排液性外傷、ステージＩＩＩまたはＩＶの外傷および褥瘡を被覆するために用いられる。コラーゲンドレッシング材は、慢性または膠着状態の創傷、潰瘍、床ずれ、移植部位、手術創傷、第２度以上の熱傷、および表面積の大きい創傷のために使用することができる。これらのタイプの創傷ドレッシング材も全て、急性出血を停止し、創傷治癒を促進するのに受動的な様式で機能を果たす。最新の創傷ドレッシング材および技術の歴史的概観は、”Ｗｏｕｎｄ ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ － ａ ｒｅｖｉｅｗ”， Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｔａｉｐｅｉ） ２０１５ Ｄｅｃ．； ５（４）： ２２に見出すことができる。

最近、過剰なまたは無制御の出血の状況において使用される活性型ドレッシング材を提供することによって、緊急介入の有効性を向上させるために、様々なドレッシング材が開発されている。これらのドレッシング材は、トロンビン、フィブリンおよび／またはフィブリノゲンのような活性成分を含み、それらの成分はゼラチンまたは多糖ベースのドレッシング材、グリコール酸または乳酸ベースのドレッシング材、およびコラーゲンマトリックスをはじめとする、高分子ネットワークを形成することができるドレッシング材または基材と組み合わされている。そのような活性型ドレッシング材の例は、米国特許第6,762,336号明細書、米国特許第6,733,774号明細書およびPCT公開公報WO 2004/064878Alに開示されている。

トロンビン含有製品の例としては、Vascular Solutions/Mallinckrodt製の「D-Stat Dry」（商標）またはPfizer製のThrombi-Gel（商標）が挙げられる。ヒトフィブリノゲンおよびトロンビン含有創傷ドレッシング材の例としては、Nycomed/Tadeka製のTachoSil（商標）が挙げられる。

推奨される場合もあるが、これらのドレッシング材中のヒト止血性成分の存在は、ドレッシング材のコストを増加させ、特定の原材料の入手可能性の問題および病原体の伝染のリスクを高める。Di Minno他（2016）によるBlood Reviews 30: 35-48において、血液／血漿由来製品および組換え製品の病原体安全性が検討されている。

組織因子含有製品の例は、国際公開WO 2016/150449、WO 2006/047684およびWO 2012/142317公報に記載されている。

組織因子とドレッシング材との組み合わせは、能動的に止血を促進して出血を止めることが従来から詳細に記載されている。例えば、国際公開第WO 2016/150449Al号公報は、創傷とぴったり接触して出血を止めるようにドレッシング材中に含侵されている、特にHEK発現系からの種々の組換え可溶性ヒト組織因子（rshTF）分子を記載している。組織因子が血液の流れによって流出してしまうのを防ぐためのドレッシング材への組織因子の結合については何も言及されていない。

国際公開WO 2016/150449 Al公報の発明者は、溶解が容易でかつ出血性創傷に容易に投与することができる、凍結乾燥した組織因子組成物を有することの重要性を明示的に記載している。いずれも凍結乾燥した組織因子を確実に溶解し、創傷に適用することが容易である、様々な糖および他の成分を含むいくつかの組成物が記載されている。これは、足場またはドレッシング材に恒久的に固定化されそして共有結合された組織因子を使用することに反した教示である。

国際公開WO 2016/150449Al公報によって教示された製品は、潜在的に、使用が危険であり、ヒト損傷の治療のための当局によって承認されにくい、安全でない凝固生成物を生成する可能性がある。

国際公開WO 2016/150449Al（D1）引用文献は、rshTFを支持材に固定化せず、rshTFが放出されて支持材から流出するのを防止することを記載している。

前述したように、止血を増強するための様々な活性成分を有する、多数のドレッシング材が知られている。それらには、活性成分を含浸させたドレッシング材、例えばカオリンを含侵させたドレッシング材（Quick-Clot、Z-Medical社製）またはフィブリンもしくは止血を促進することができる他の成分を含侵させたドレッシング材が含まれる。

「含浸させる（impregnated)」という用語は、一般的に、ある物質中の細孔または間隙を飽和もしくは充填する方法、またはある物質の中の細孔または間隙を埋める方法として技術的に理解される。場合によっては、活性成分がどのようにドレッシング材に組み込まれているかを説明するために、レーシング（編合）またはコーティング（被覆）または乾燥という代替用語が使用される。

技術用語としては、コーティングは、通常、基板または足場と呼ばれる表面に適用される被覆である。コーティング方法は、単に問題の活性成分を保持している溶液によってドレッシング材を単に受動的に処理することであり、最終的に乾燥工程を伴うものである。

組織因子およびリン脂質系などの止血剤を含浸させた別の創傷ドレッシング材システムが、国際公開WO 2012/142317 Al公報に記載されており、その著者らは、急速に凝固するドレッシング材のための緊急ニーズを記載している。

Morris他による国際公開WO 2006/047684 A2公報は、ヒトまたは動物用の治療用組成物に使用される可溶性ナノスケール粒子に組み込まれた、天然または組換え型の短縮形（truncated）組織因子に関係する有効性に着目しており、安全性は記載されておらず、結果として得られるTFナノディスクにおいて最大活性を有する、リン脂質および足場タンパク質のためのいくつかの構築物を記載している。

国際公開WO 2006/047684A2公報は、担体またはドレッシング材に直接結合された組織因子を使用することを明確に教示している。この出願は、リン脂質タンパク質粒子構築物を使用して、血液凝固を増加させるための機能的システムを得ることを教示している。粒子内の表面に、粒子にまたは成分に直接組織因子を結合させることは全く記載されておらず、明らかに、粒子から血管床内への遊離形の組織因子の洗浄の安全性の問題は予想されていない。

特殊化されたタイプの創傷ドレッシング材の別の例が、国際出願WO 2013/007266公報に記載されており、そこでは、創傷ドレッシング材マトリックスが、創傷止血を増強するように制御された様式で、長期間にわたって遊離形トロンビンを徐放するように設計されていると記載されている。ここで、トロンビンは、エレクトロスプレー法によってポリウレタンフォーム材料の上部に散布される。

加えて、創傷ドレッシング材は、該ドレッシング材が比較的速く分解するかどうか、あるいは経時的に吸収されるかどうかによって、吸収性または非吸収性のいずれかに分類することができる。ポリウレタンは、非吸収性ドレッシング材の一例であり、一方、酸化セルロースまたはキトサンは、経時的吸収性である。

戦場の緊急治療室で使用するために選択される、２つの汎用製品は、キトサンベースのドレッシング材HemCon（HemCon Medical Technologies製、米国オレゴン州ポートランド）、およびゼオライト粒、ゼオライトビーズまたはカオリン被覆ガーゼQuikClot（商標）（Z-Medica社製、米国コネティカット州ウォリンフォード）製品に集中しており、それらは損傷静脈または表在部の切断によって引き起こされる比較的軽度の出血との関連で汎用される。

利用可能なドレッシング材のいずれも、固定化された組織因子をベースにしたものではない。

漏出性活性成分を有するドレッシング材についての安全性の懸念は、Polish Journal of Veterinary Sciences Vol.19、No.2 （2016）、337-343をはじめとして複数回記載されてきた。当該分野におけるこれらの懸念にもかかわらず、既知のドレッシング材において血流中への組織因子の漏出に関連する安全性リスクにほとんど焦点が当てられておらず、そのため、患者にとって有意なリスクを引き起こす、望ましくない血液凝固を助長している。

我々の知見によれば、いずれの従来技術も、使用の安全性を確保しながら、大量出血を停止させるためにドレッシング材に直接組織因子を永久結合させることから明らかに離れた教示であり、それを予測もしていない。

したがって、既知のドレッシング材（創傷ドレッシング材）による治療の望ましくない副作用のリスクを制限するために、公知のドレッシング材に関連する安全上の懸念に対処する、新たなドレッシング材の開発が必要とされている。

第一態様では、本発明は、望ましくない血液凝固を防止しながら迅速な止血を促進するための安全なシステムであって、該システムは組織因子またはその変異体（組織因子成分または少なくともその細胞外ドメインとも呼ばれる）と、該組織因子またはその変異体を保持するためのマトリックスなどのドレッシング材とを含み、該組織因子またはその変異体は、ドレッシング材と会合されており、これにより、ドレッシング材と組織因子またはその変異体との間の結合または相互作用が、血液凝固の開始が可能である環境のような生理学的環境に、該組織因子またはその変異体が曝されたとき、該組織因子またはその変異体がドレッシング材から解離するのを防止することができるシステムに関する。

従って、具体的には、組織因子（TF）またはその任意の変異体とドレッシング材料とを含んでなるシステムであって、該組織因子または任意の変異体が、該組織因子またはその変異体が生理的環境に曝されたときにドレッシング材から解離するのを防止するように該ドレッシング材に連結されているシステムが提供される。

本発明にかかるシステムは、全身性血液凝固などの望ましくない血液凝固を防止しながら迅速な止血を促進するのに適しており、したがって、重度の出血性外傷患者、例えば、軍事やテロ関連の戦闘、重度の事故、および他のタイプの傷害のような、様々な原因からの外傷被害者の治療のための、改善された治療剤を提供する。本発明にかかるシステムは、より具体的には、外因性因子を、内因性トロンビンバーストと止血を誘導する、出血を制御する外因性および内因性凝固因子と組み合わせることによって、血液凝固の増強と効率的な止血の開始を提供し、それによって、特に出血性外傷の状況において、効率的な止血の局所的制御を獲得するのに適切なアプローチを提供する。

さらに、本発明にかかるシステムは、組織因子などの外因性因子を使用するための安全な方法を提供する。ここで、外因性因子は、組織因子が血流中に放出されるリスクを克服しながら出血性外傷患者の治療中にドレッシング材に連結されるが、これは、他方でドレッシング材に適用された「遊離型」外因性組織因子を使用することを試みる場合であってもよく、従って大量出血している領域に区別なく混合された場合であってもよく、その場合、当該因子は血管床の中に入る可能性があり、血管床において全身的な凝血塊（血餅）形成の著しいリスクを容易に引き起こしうる。

従って、本発明の核心部は、止血を開始および促進し、かつ大量出血を停止させることであり、組織因子がドレッシング材にしっかりと連結されていることから、同時に、使用するのに安全であることである。該タンパク質は、永久的に固定化または結合されるが、止血を開始するために依然として活性な状態にある。

本発明の重要な態様は、血流、創腔または身体への活性化組織因子の漏出が少ないかまたは全くないため、有効性と安全性の両局面の特別な組み合わせである。

連結による永久的固定化による生物学的に活性な組織因子タンパク質の永久結合は、出血部位における効率的止血を得るため、および漏出した組織因子が血管系の他の場所で無制御な止血を開始するのを防止するための、きわめて重要でかつ新規な方法である。

この態様は、大量流血および出血に対して特に重要であり、ドレッシング材が損傷に対して機械的圧迫されていながらも、大量の血液が連続的に流れており、ドレッシング材の外に未結合の組織因子を容易に洗い出してしまう可能性がある状況において、特に重要である。組織因子の漏出は潜在的に始まり、血管系内で危険な血栓症を引き起こす可能性があり、これは許容できない安全性リスクである。

本発明のこの態様は、最終的なドレッシング材が、厳密な政府規制ガイドラインにより、例えばEMAまたはFDAにより、管理されるので、さらに重要である。これに準拠するために、有効性と安全性の両方を実証することとする。

組織因子は、止血を触媒するが、架橋フィブリンネットワーク（フィブリン網）の形成には携わらない。したがって、ドレッシング材と形成されたネットワークとは共有結合で連結されていない。この事実は、形成されたネットワークに含まれるタンパク質成分を利用する、大方の他のシステムとは対照的である。これは、ドレッシング材がより容易に除去または変更できるので有利である。

出血患者における実際の適用では、ドレッシング材を適用することにより機械的に安定なネットワークを迅速に形成することによって、所望の血液凝固が開始される。これは、粘着性で粘弾性特性を有する血液のゲル化および凝血塊の形成として認識される。その結果として止血、損傷した血管からの失血の終結、その後の修復をもたらす。

本発明にかかるシステムは、第VII因子またはその成分をさらに含むことができる。

本発明にかかるシステムは、さらに、補助活性化剤（co-active agent）、例えばキトサン、塩、ゼオライト、カオリン、トロンビン、フィブリン、フィブリノゲン、およびシステムの効率をさらに増強する剤、並びに安定化剤、例えば炭水化物、被覆タンパク質、pH緩衝剤、洗浄剤、水分および湿潤調節剤、システムの長期貯蔵寿命を提供するラジカルクエンチ剤、UV吸着剤および抗菌剤などをさらに含むことができる。

第二態様では、本発明は、望ましくない全身性血液凝固を防止しながら迅速な止血を促進するために本発明のシステムを使用する方法に関する。かかる方法では、出血を停止可能にする期間にわたり、該システムが身体の損傷部分に適用される。

図１は、活性化されたドレッシング材（創傷被覆材）への組織因子の固定化という、本発明の原理を示している。タンパク質をドレッシング材に固定する単一または複数の結合、様々な長さおよび種類のリンカーが示される。リンカーは短くても長くてもよい。リンカーは、主に半屈曲性である。また、以下の図１～７で使用される様々な構成成分が図１に要約される。 図２は、ドレッシング材に組織因子を結合させる様々な可能な方法の例を示す。（a）短いリンカーを介した固定化、（b）より長いリンカーを介した（一部のリンカーは使用されずクエンチされる）固定化、（c）中性または活性成分と共に固定化、（d）数か所の地点で組織因子を結合および架橋するリンカーを介した固定化、いわゆる多点結合、（e）ドレッシング材に固定化され、別の活性成分例えば第VII因子で覆われた組織因子、または（f）吸収性であるドレッシング材に固定化された組織因子。様々な例を組み合わせることができる。 図３は、ポリマーおよび基材を組み合わせて、組織因子をドレッシング材に結合する様々な可能な方法の例を示す。（a）より長いスペーサーアームを提供する、ポリマー（例えばPEI、キトサンまたはポリリジン）を介してドレッシング材に固定化された組織因子、（b）デンドリマーまたは分岐リンカーシステムを介してドレッシング材に固定化された組織因子、（c）ドレッシング材に固定され、他の活性成分例えば第VII因子を含む他の活性成分で被覆された組織因子であって、追加の化合物と一緒に湿性または乾性マトリックス中で固定化された組織因子、（d）他のドレッシング材層と組み合わせて、ドレッシング材に固定化された組織因子。様々な例を組み合わせることができる。 図４は、本発明の原理を示し、（a）組織因子および他のタンパク質（例えばＢＳＡ）のドレッシング材への共有結合であって、組織因子に対する安定化作用を有し得る共有結合、（b）縫合糸（直線状糸）への組織因子の共有結合。 図５は、ドレッシング材に固定化された組織因子により触媒される、凝血塊を生成する架橋フィブリンネットワークの形成を示す。 図６は、ドレッシング材に固定化された組織因子および第VII因子によって触媒された、凝血塊を形成する架橋フィブリンネットワークの形成を示す。 図７は、血管中の損傷からの出血を止めるために凝血塊形成を触媒する、被覆材に固定化された組織因子を用いる、本発明の原理を示す。 図８は、ヒドロキシルドレッシング材のジビニルスルホン（DVS）活性化の反応スキームであって、ビニルスルホン活性化ドレッシング材をもたらす。この活性化ドレッシング材は、タンパク質、例えば、組織因子と反応することができる。より低いpHでは、チオールが最初に反応しやすく、より高いpHでは、アミンが反応して共有結合を形成するだろう。 図９は、ヒドロキシルドレッシング材のエピクロロヒドリン活性化の反応スキームを示し、結果として反応性エポキシ基が活性化されたドレッシング材をもたらす。このエピクロロヒドリン活性化ドレッシング材は、タンパク質、例えば、組織因子と反応することができる。より低いpHでは、チオールが最初に反応しやすく、より高いpHでは、アミンが反応して共有結合を形成するだろう。 図１０は、実施例３に見られるような、様々な量のカップリングした蛍光標識試験タンパク質BSAを有するドレッシング材の写真を示す。 図１１は、実施例４、５、６の実験的開示に従った生体外（ex vivo）血液凝固実験の写真を示す。

発明の詳細な説明

本発明は、ドレッシング材に固定化された薬理活性剤を含むシステムと、ヒトなどの哺乳動物における外傷に関連した大量出血の効率的止血からなる治療法における該システムの使用とに関する。このシステムは、迅速かつ持続的な止血を促進する。

より具体的には、本システムは、ドレッシング材上に固定化された組織因子によって開始される迅速な止血を促進し、それにより、該化合物が血流中に放出されることを防止する。これにより、該化合物は、血管損傷上に直接配置されたドレッシング材に結合された組織因子の適用部位のところで、直接的に血液凝固の開始を誘導することができる。これは、同時に、使用するのに安全である効率的な止血を創出する。

従って、本発明は、第VII／VIIa因子との直接相互作用によって薬理学的効果を発揮する部位に、補助薬剤と共にまたは伴わずに活性型外因性薬剤の局所適用を可能にし、ここで、前記外因性薬剤が生物体の血管床に侵入するのを防止し、それによって血管内全身曝露を妨げることができる。

本発明で使用される組織因子は、以下にさらに説明されるような組織因子の任意の変異体であることができ、細胞外ドメインを含んでいてもよく、またはそれから成っていてもよい。上述のように組織因子の機能に関して知られているものに照らせば、組織因子の膜貫通部分をもたない細胞外ドメインでも凝固カスケードを開始することができ、それによって積極的に止血に貢献することは、非常に驚くべきことである。

さらに、ドレッシング材に連結された組織因子は、組織因子への第VII／VIIa因子の正しい結合を妨害せず、その結果として結合した組織因子が凝固カスケードを開始できるようにすることは、驚くべきことである。

また、本発明者らは、ドレッシング材にしっかりと（共有結合で）連結した組織因子とともに、未結合型で遊離形の第VII因子が、止血の速度と効率の両方において、凝固カスケードを増強することを見出した。

更に、本発明は、同じ課題を解決することを目的とした他のドレッシング技術と適合している。例えば、ゼオライトおよびカオリンを含有するドレッシング材、キトサンベースのドレッシング材、フィブリノゲンまたはトロンビンを含有するドレッシング材と組み合わせることができる。さらに他の例は、本発明の背景の項目において記載され、それらは本発明に使用することができる。

本発明は、非吸収性と吸収性のドレッシング材を含む、様々に異なる形状、サイズおよび材料タイプに適合する。

以下では、本発明に関連する組織因子、組織因子源、第VII因子、固定化、固定化方法、架橋剤、リンカー系、ドレッシング材、および補助因子について、より詳細に説明する。

組織因子の定義

第III因子またはCD142としても知られる組織因子（TF）は、第VII凝固因子および活性化第VII因子（第VIIa因子）に対する高親和性受容体として機能する細胞外ドメインを有する、膜貫通型糖タンパク質である。本発明の文脈において、「組織因子」または「TF」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシおよびヒト組織因子を含む、内因性または組換えのいずれかの細胞外ドメインを少なくとも含む、任意の哺乳動物の組織因子を指す。

ヒト（外因性）組織因子は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを構成する263アミノ酸から成る。219アミノ酸からなる可溶性組織因子は、細胞外ドメインのみに相当する。

ヒト組織因子の細胞外ドメインは、以下のDNAおよびアミノ酸配列を有する（それぞれ配列番号１および２にも示される）

本発明の文脈では、「組織因子の変異体」とは、哺乳動物全血と反応するようにドレッシング材構造に共有結合的にまたは化学的に結合されるとき、組織因子の活性が維持される限り、第VII因子および／または第VIIa因子に結合することができる任意の変異体として解釈されるべきである。従って、変異体は、上述したヒト組織因子の細胞外ドメイン、または本明細書に記載の他の組織因子分子、分子または部分のいずれかであり得る。第VII因子を結合する組織因子変異体の能力は、それぞれのタンパク質のタグ付変異体の標準的プルダウンアッセイなどの任意の適切な相互作用アッセイによって評価することができる。

哺乳動物の凝固経路は、高度に保存された堅牢な機序である。周知の整列ソフトウェア、例えばNational Center for Biotechnology Information （NCBI）からの標準タンパク質BLASTを適用することにより、ヒト組織因子の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）は、マウス組織因子の細胞外ドメインと59％の同一性を共有し、ノルウェーラットと59％の同一性、モルモットと69％の同一性、ネコと79％の同一性、イヌと76％の同一性、ウシと75％の同一性、ブタと74％の同一性を共有していることが理解され得る。種を超えた組織因子のアミノ酸配列保存に加えて、組換え可溶性ヒト組織因子は、ラット全血に曝露されると凝固を開始することができ、同様に、組換え可溶性ヒト組織因子がブタ全血に曝露されると凝固を開始することができることが見出された。

したがって、本発明の文脈では、「組織因子の変異体」は、少なくとも細胞外ドメインを含む組織因子として更に定義することができ、細胞外ドメインは、ヒト組織因子の細胞外ドメインと少なくとも59％のタンパク質配列同一性、例えば少なくとも69％のタンパク質配列同一性、好ましくは少なくとも75％のタンパク質配列同一性、より好ましくは少なくとも79％のタンパク質配列同一性、さらに好ましくは少なくとも85％のタンパク質配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも90％のタンパク質配列同一性、最も好ましくは少なくとも95％のタンパク質配列同一性を共有している。

FVIIaとの相互作用に関与するモチーフは、aa16－aa24、aa37－aa51、aa56－aa61、aa74－aa76、aa91－aa96、aa109－aa110、aa128－aa135、aa140、aa158－aa164、aa186－aa188、aa203－aa209を含む。

種を超えて保存される配列は、
aa8－aa79
(AY NLTWKSTNFK TILEWEPKPV NQVYTVQIST KSGDWKSKCF YTTDTECDLT DEIVKDVKQT YLARVFSYP)
および
aa91－aa214
(EPLYENSPEF TPYLETNLGQ PTIQSFEQVG TKVNVTVEDE RTLVRRNNTF LSLRDVFGKD LIYTLYYWKS SSSGKKTAKT NTNEFLIDVD KGENYCFSVQ AVIPSRTVNR KSTDSPVECM GQEK)
を含む。

特に保存される配列は、aa9－aa70およびaa108－aa210であり、さらにより保存される配列は、特定配列aa17－aa19、aa34－aa39、aa52－aa68、aa125－aa129、aa132－aa137、aa159－aa167、aa184－aa187、およびaa209を含む。高度に保存される配列は、種を超えた組織因子の細胞外ドメインの全体的に高い相同性と同一性に反映される。

本明細書で使用される組織因子の変異体は、上記の保存配列またはモチーフのうちの１つ以上を含む分子であり得る。

組織因子の供給源

本発明の文脈での使用に適した組織因子は、哺乳動物の全血、好ましくはヒト全血から、または標準的な組換え技術により、得ることができる。

標準的な工業用組換え技術は、ヒト胎児腎臓HEK、ヒト293/T、HEK-F、ハムスターBHK21、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、SF9昆虫、マウス、大腸菌（E coli）または酵母〔サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）〕細胞系の使用を含む。

ヒト細胞を含む哺乳動物細胞において実施される翻訳後修飾は、凝固因子の特性にとって非常に重要であることが多い、グリコシル化、リン酸化、カルボキシル化、パルミトイル化、およびノイラミノ－グリコシル化などの幾つかの物理的および化学的性質に影響を及ぼす。

ヒトグリコシル化のためには、HEK293ts細胞などのヒト細胞株の使用が好ましい。一般に組換えタンパク質のグリコシル化、特にヒト被験体への可能な投与を目的とするものは、以前に考えられていたよりもはるかに大きい重要性をもつ。グリコシル化は、生物学的活性、機能、循環からのクリアランスに影響を与え、そして抗原性には決定的な影響を与える。

A Brooks Review［Brooks, S.A., Molecular Biotechnology（2004）Vol 28, 241-256（16）］は、ヒトＮ-およびＯ-結合型タンパク質グリコシル化の簡単な概要を与え、非ヒト種の細胞のグリコシル化ポテンシャルが知られているものを要約し、そしてバイオ技術産業にとっての意味を提示している。

HEK293ts細胞株は、懸濁細胞培養として無血清培地中で培養することができるため、300万細胞数／mLを超える細胞濃度に、または最適条件下では1000万細胞数／mLの細胞培養濃度に、そして容器中での最適酸素供給と必要なガスおよび圧力の供給を伴ってpH 6.8～7.4のような非常に一定の生理的pHレベルの下で実行される場合にはさらに高い細胞濃度にさえも拡大することができる。この場合、それらの細胞は、使い捨て細胞培養バッグを使って100リットル／GEまでに培養する、単回使用バイオリアクターシステム（GE-WAVE）における高細胞密度還流プロセス、またはEX-CELL（商標）293を使った同等なバイオリアクターウエーブバッグを用いて培養される。

１つの好ましい実施形態では、組換えヒト組織因子は、配列番号１の配列を有する組織因子をHEK293ts細胞において発現させることによって得られる。

クローニング用にpST2ベクターおよびクローニング後にpST2-HF3ベクターなど、組織因子の発現用に任意の適切な発現ベクターを使用することができる。

変異体または細胞外ドメインを含む組織因子はまた、合成法によって、または組換え法を併用して、続いて化学修飾することによって、合成することもできる。段階的に保護されたアミノ酸または他の多官能性ビルディングブロック（構成要素）を一緒に段階的に結合することによって段階的に伸長していくペプチドの合成方法は、例えば、古典的なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）または液相法からよく記載されている。様々な化学的選択的および直交型保護基としては、特にＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、ベンジルまたはｔ－Ｂｕｔが挙げられる。アミド形成は、例えばカルボジイミド、効率的な活性エステル、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔまたは同様の反応を使って行われる。ＳＰＰＳ試薬および方法の概要は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒ．Ｂ．著、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｇｕｔｔｅ， Ｂ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９５， ｐｐ ９３－１６８中、またはＦｅｒｎａｎｄｏ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ編、“Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ”， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ２０００中に見ることができる。

第VII因子の定義

プロコンベルチン（EC 3.4.21.21）としても知られる第VII因子、血液凝固第VIIａ因子、活性化血液凝固第VII因子は、組織因子誘導性凝固（外因性経路）の開始に重要である、肝臓によって合成される50 kDaのビタミンＫ依存性チモーゲンである。本発明の文脈において、第VII因子は、しばしば第VIIａ因子と呼ばれる活性化形態を含み、血友病患者における無制御の出血の治療薬として開発された、組換えヒト第VIIａ因子（エプタコグアルファ、NovoSeven（商標）、Novo Nordisk社、デンマーク国）、および組換え活性化第VII因子の生物学的類似体（バイオシミラー）（AryoSeven（商標）、AryoGen社、イラン国）を包含する。

固定化

本発明にかかるシステムは、組織因子、好ましくは細胞外ドメイン、またはドレッシング材上に固定化された任意の変異体を含む。

「固定化された」および「連結された」という用語は互換的に用いられ、そして本発明の文脈では、生理学的条件下で、例えば本システムを哺乳動物の全血に曝したとき、ドレッシング材から組織因子が放出されるのを防ぐために十分に高い強度を有するドレッシング材に、組織因子を分子結合することとして解釈すべきである。これは、例えば蛍光標識技術に従って測定したときに、組織因子の有意な測定可能な漏出を防ぐのに十分なほど高い結合強度を有する、ドレッシング材と組織因子との間で連結された分子結合を提供することによって達成され得る。好ましくは、結合強度は、例えば、蛍光または放射性標識技術により測定した場合に、ビオチンとストレプトアビジンとの間の参照結合強度の少なくとも１/100000倍である。ストレプトアビジンとビオチンの解離定数は約10^－１５モル／Lである。

組織因子をドレッシング材に固定化するために適用される分子結合は、好ましくは少なくとも10^－１０モル／L、より好ましくは少なくとも10^－１２モル／Lの解離定数（Ｋd）を有する。かかる分子結合の好ましい例は共有結合である。

共有結合性または共有結合に近い（near covalent）結合という用語は、生理的条件において、好ましい安定な化学共有結合を介して、活性化合物をドレッシング材に実質的に不可逆的に結合させることである。

好ましい共有結合は、Ｃ－Ｃ、Ｃ－Ｏ、Ｃ－Ｎ、Ｃ－ＳまたはSi－Ｏ化学結合およびその組み合わせであり、結合解離エネルギー（平均結合解離エンタルピー）が10 kcal／モル超、好ましくは30 kcal／モル超、さらに好ましくは75 kcal／モル超であり、創傷内への活性成分の放出のリスクがほとんどまたは全くない安定な結合をもたらす。

固定化方法

特定のペプチド配列と試薬の組み合わせによる位置選択的および化学選択的カップリング方法、および保護基を使用しないものは、正確な結合を誘導することができ、かつペプチドの機能性を保持することができる。様々な「連結（ライゲーション）」方法を含むいくつかの方法が知られている。初期の概要は、例えば、Ｊａｍｅｓ Ｔａｍ 他、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ”， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２００１；６０（３）：１９４－２０５およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ “Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｐ．Ｒ．， Ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｄｉｒｋ Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００８， ４７， １００３０－１００７４に見ることができる。

翻訳後修飾およびドレッシング材へのカップリングに有用な種々の連結方法は、Staudinger連結、アジド－アルキンクリック反応、および金属媒介メタセシス反応を含む。

いくつかの連結方法、または「バイオ直交化学」と呼ばれる場合がある方法は、例えばシステイン、リジンまたはチロシンに対して化学選択的である。さらに、いくつかの連結技術は、グリコシル化タンパク質と適合性があり、複雑な環境で使用される。

技術の現状を網羅する一般的な概説は、例えば、Ｂｏｕｔｕｒｅｉｒａ ＆ Ｂｅｒｎａｒｄｅｓによる“Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ” Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ２０１５， １１５， ５， ２１７４－２１９５およびＳｐｅａｒｓ ＆ Ｆａｓｃｉｏｎｅによる“Ｓｉｔｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ”， Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０１６， １４， ７６２２をはじめとする多数の参考文献中に見られる。

特に関連性があるものは、Ｇｌｙ－ＨｉｓまたはＬｙｓ－Ｈｉｓタグのような末端官能基、例えばｐ－メトキシフェニルエステルでの選択的アミンアシル化による活性化ドレッシング材への化学選択的カップリングに利用可能である末端官能基を有する、ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞から発現される組織因子である。Ｇｌｙ－Ｈｉｓタグは、Ｍａｒｔｏｓ－Ｍａｌｄｏｎａｄｏ他により“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｃｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｇｌｙ－Ｈｉｓ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９巻、文献番号３３０７（２０１８）に記載されている。

本発明の文脈において適当である代替の分子結合メカニズムは、イオン結合または非共有結合であるが、それらがドレッシング材と組織因子との間の解離定数10^－１０モル／L超、より好ましくは少なくとも10^－１２モル／Lをもたらすことを前提とする。

他の好ましい結合としては、ビオチン－ストレプトアビジン、レクチン対、DNA－DNA、DNA－PNA、DNA－LNA、金属キレートまたは他のリガンド対が挙げられ、これらは共有結合の結合強度に近い。

架橋剤およびリンカー系

ドレッシング材への組織因子の固定化は、組織因子とドレッシング材との間に架橋剤を使用する直接分子結合によって、またはリンカーもしくはリンカー系を介した間接結合によって達成され得る。

アフィニティークロマトグラフィーカラム媒体、膜、および診断装置をはじめとする基材（支持体）にタンパク質を固定化するための、コンジュゲーション（結合）化学における架橋剤およびリンカーの使用は、技術的に成熟しており、多くの利用可能な文献供給源および経験的知識を有する。多数の一般的な参考文献が利用可能であり、例えば概説書の”ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２０１３、第三版）、Ｇｒｅｇ Ｔ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ａ． Ｋｒｉｓｈｎａ Ｍａｌｌｉａ， Ｐａｕｌ Ｋ Ｓｍｉｔｈ による“Ｉｍｍｎｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９２）、Ｓｈａｎ Ｓ． Ｗｏｎｇによる“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ”（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）およびＳｏｎｎｙ Ｓ． Ｍａｒｋによる“ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ － Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ”（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２０１１）が利用可能である。

組織因子をドレッシング材に固定するリンカーは、伸長した形状をとれるように、好ましくは生理学的pHにおいて水中で半屈曲性であり、それにより止血を開始する効率がより高くなるだろう。

本明細書では、リンカーの長さは、結合の数によって定義され、結合はＣ－Ｃ、Ｃ－Ｎ、Ｃ－Ｓ、Ｃ－Ｃ(Ｏ)および／またはＣ－Ｏ結合である。本発明に従って好ましいリンカーは、アミド、カルバミド、スルホン、エーテルおよび立体障害基を含み、これらはリンカーが完全に屈曲性になるのを防ぐ。

リンカーは、伝統的な直鎖型または架橋型および分岐型とすることができる。これらの例には、直鎖PEGリンカーまたはアクリルアミド系分岐リンカーが含まれる。

さらに、組織因子は、個別にまたは高密度デンドリマー系上のクラスターとしてドレッシング材に固定化されてもよい。多分岐またはデンドリマーリンカー系の例としては、組織因子に結合することができる種々の表面官能基を有する様々な世代のポリアミドアミン（PAMAM）デンドリマーが挙げられる（例えばMerck社から入手可能）。診断や医薬用途からの他の周知の系としては、ポリリジン、ポリエチレンイミン、およびポリエステル系デンドリマー並びにデンドロンが挙げられる。

リンカーを化学的に導入する代わりに、それらを組換えタンパク質に直接導入して、固定化の位置選択性を容易にする（高める）こと、および周知の分子量と特性を有する高分子リンカーを作出することもできる。このタイプの連結（ライゲーション）技術の例は、Novo Nordisk社のThomas Kjeldsen他による“Dually Reactive Long recombinant Linkers for Bioconjugations as an Alternative to PEG”, ACS Omega 2020年７月に記載されている。

組織因子のクラスターは、組織因子の２以上の反復を含む、例えば単一のタンパク質中に配列番号２の配列の２以上の反復を含む、組換え反復組織因子タンパク質を使用することによって達成されてもよい。

本発明者らは、哺乳動物組織因子の細胞外ドメインが、側鎖中に第１級アミンを有するリジンを多数含んでおり、これは化学選択的結合によって化学的に標的指向化され得ることを見出した。内因性組織因子は、第20、28、41、46、48、65、68、122、149、159、165、166、169、181、201、214位に16個の潜在的な結合能のある（conjugatable）リジンを含む。

加えて、本発明者らは、第11位、第124位、第137位―特に第124位と第137位―における重要な予想グリコシル化部位が、コンジュゲーション（結合）に適したリジン残基から離れて位置していることを認識した。従って、リジンを標的とする結合は、組織因子の機能性を保存し、すなわち、第VII因子を結合しそれによって凝固カスケードを開始する組織因子の能力を保存する、適切な方法である。

さらに、発明者らは、第57位、第186位および第209位に位置する３つのシステインを、位置選択的および化学選択的結合に適した潜在的標的として同定した。

ドレッシング材への組織因子の固定化は、好ましくは、ドレッシング材上のヒドロキシル基を活性化し、それらをそのアミノ基およびチオール基を介して組織因子にカップリングさせるか、またはドレッシング材と組織因子との間に追加のリンカーを導入することによって達成される。

多数の結合方法、例えばエポキシド、ビニルスルホン、アザラクトン、シアノブロミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステルおよび他の活性エステル、ハロゲン化アリール、イソチオシアネート、アルデヒド、マレイミド、ジスルフィド、環状ラクトン、トリアジンまたはベンゾキノンの使用を含む結合方法は、組織因子をドレッシング材材料に固定するのに適していることを理解されたい。

リジンを標的とする好ましい化学選択的結合（コンジュゲーション）方法は、エピクロロヒドリンからのエポキシドの開環、またはジビニルスルホンからのマイケル付加を使用するものである。これらの方法は、一般に、主に第１級アミンまたはチオールを介して結合することが知られており、結果として、高収率で安定した共有結合をもたらす。

エピクロロヒドリンは、例えば、エラストマー、架橋食用デンプン、界面活性剤、可塑剤、染料および接着剤の製造に使用される、様々な用途で使用される多用途の化学的中間体、一般的な架橋剤および有機シントンであり、例えば、反応性エポキシ基を例えばヒドロキシル表面に導入するのに有用である。これは、例えばＧｒｅｇ Ｔ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ＧＴ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ； Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌ：（２００８）に記載されており、またはヒドロキシル表面を活性化し、第２のリンカーを導入し、レクチンの一種コンカナバリンＡおよび小麦胚芽アグルチニンをグルタルジアルデヒドとカップリングするための具体例が、Ａｎｉｕｌｙｔｅ Ｊｏｌｉｔａ他による“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｗｉｔｈ ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｈｅｘａｍｉｎｅ”， Ｐｒｏｃ． Ｅｓｔｏｎｉａｎ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｃｈｅｍ．２００６年１月１日（２００６－０１－０１）、６１～６９頁に記載されている。

ジビニルスルホン（DVS）は、より特殊な試薬であり、Hermanson書籍中の多数の試薬の中にも挙げられており、その特性はさらに、JULIA MORALES, SANFRUTOS他、“Vinyl sulfone: a versatile function for simple bioconjugation and immobilization", ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY、第８巻、第３号、2010年１月１日(2010-01-01), 667頁に列挙されている。

DVSは、DNA架橋用、高分子ネットワーク中の架橋剤として、およびPinheiro他、ACTA PAEDIATICA、増補、第130巻、798-809頁により記載されているとおり、ポリエステルの有機合成用ツールを開発するためのジビニルスルホン活性化キトサンを使ったカンジダ・アンタルクティカ（Candida antarctica）リパーゼＢ酵素の固定化のためといった、多数の用途に用いられている。

コンジュゲーション（結合）化学および方法の選択は、自明（trivial）ではなく、特に、組織因子分子の感受性を考慮するときにそうでなく、無制御な多点付着によって活性が失われ、多くのアミノ基やチオールを架橋してしまう危険性があることを理解すべきである。架橋剤の探索は、多くの組み合わせおよび用途を伴って数千件の参考文献を生ずるだろうが、組織因子、凝血塊または出血に関するものは１つも存在しない。

架橋試薬、エピクロロヒドリンまたはDVSは、ヒドロキシ基またはアミノ基を有する全てのドレッシング材と組織因子との間に結合を形成させるのに好ましい。ドレッシング材は、最初にエピクロロヒドリンまたはDVSで活性化して活性化ドレッシング材とし、これをエポキシまたはビニルスルホン官能基を介して組織因子に結合させることができる。

ドレッシング材に関する塩基性条件下でのヒドロキシル基のDVS活性化は、反応性ビニルスルホン基をもたらす。ビニルスルホン活性化ドレッシング材は、水中で保存することができる。

ビニルスルホンは、わずかに塩基性のｐＨ条件下で、組織因子タンパク質中の第１級アミンとゆっくり反応する。任意の潜在的なラジカルで開始される副反応は、ラジカルクエンチャー（ラジカル消去促進剤）を添加することによって低減することができる。この方法は、ドレッシング材とタンパク質との間に安定な短鎖リンカーを与える。システイン由来のチオールは、より低いｐＨでビニルスルホンと迅速に反応する。これにより、ドレッシング材とタンパク質とのカップリングの間、ｐＨを調整することによって、マイケル付加反応の化学選択性および位置選択性の部分的制御が可能になる〔Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．， Ｌａａｓ， Ｔ．およびＪａｎｓｓｏｎ， Ｊ．－Ｃ． （１９７５） “Ａｇａｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｌ－ｂｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ． ＩＩＩ Ｒｉｇｉｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ， ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ （ＤＶＳ）．” Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １０３， ４９－６２〕。

別の好ましい方法は、ドレッシング材上にエポキシドを導入するエピクロロヒドリンの使用である。この官能成分は、結合の間のpHに依存して、アミンおよびチオールと反応するだろう。

さらに、DVSまたはエピクロロヒドリンのいずれかを使用することにより活性化されたドレッシング材は、組織因子の固定化の前に保存しておくことができる。

タンパク質コンジュゲーションの間pHを９以下に調節することにより、組織因子の第74位、131位、135位、136位、144位のアルギニン中のグアニジノ基が、標的されにくくなるであろう。これは、pKaの差によるものであり、そしてその差により結合部位がリジンまたはシステイン残基に限定され得るので、前記アルギニン中グアジニノ基がリジンよりも多くプロトン化されるためである。

驚くべきことに、組織因子の細胞外ドメインのみを含む最小成分を、ドレッシング材に固定化することができ、全身性暴露を伴わずに天然の凝固カスケードを開始させて、それによって例えば出血性創傷の局所治療法として利用できる、というその機能性を依然として維持していることが見いだされた。

適切なリンカー技術は、当業者に知られているが、両系とも組織因子を機能性を保持できるようにするのでDVSおよび／またはエピクロロヒドリン系を含むのが有利である。さらに、両系とも、ドレッシング材の適切な活性化の程度を提供し、続いて、活性タンパク質の負荷および結合の程度を提供する。最後に、両系ともに、低コストで容易に入手可能であり、良好な再現性を提供する。最も好ましいエピクロロヒドリン系は、親水性の第２級アルコール部分を含みかつ無電荷である、短鎖のおよび半剛性のリンカーを提供する。

本発明の文脈において、代わりにタンパク質を最初に活性化し、ドレッシング材に結合するか、またはドレッシング材とタンパク質との間に様々なリンカーを導入することができることを理解されたい。

ドレッシング材の定義

ドレッシング材は、その上に組織因子が固定化されてもよく、それ自体が出血性外傷などの出血性創傷を介して血液循環に入ることがない、任意の材料として解釈されるべきである。ドレッシング材は、任意の好適な形態、例えば、ポリマー、ビーズ、マトリックス、固形担体、パッチ、包帯、ガーゼ、膜、バリア、圧縮材、足場、または縫合材料であり得る。したがって、一般にドレッシング材は、シート、ネット、織布および不織布シート、縫合糸、糸、タンポン、フォームおよび球体をはじめとする多数の物理的形態をとる、固形材料であることができる。

ドレッシング材は、それ自体が、裂傷、切り傷、擦り傷などの出血性創傷の局所的管理のための局所用ドレッシング材を構成してもよく、またはかかる局所用ドレッシング材に統合されてもよい。好ましくは、このようなドレッシング材は、創傷または裂傷、切り傷および擦り傷に押し付けられるか、またはその周りに巻き付けられるのに十分な物理的完全性を有する。ドレッシング材は、創傷とまたはそこから出る血液もしくは流体と直接接触するだろう。しばしば、ドレッシング材は、包帯または圧迫包帯によって所定の場所に保持される。

本発明によるシステムを含むドレッシング材は、機能化されたドレッシング材を構成し、創傷からの流体を吸着するため大きな表面積を有するように設計することができ、または凝血塊（血栓）の形成を強化するために接触面積を最適化するように設計することができる。

適切なドレッシング材としては、綿、セルロース、セルロースエーテル、再生セルロース、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリウレタン、アガロースまたは紙ベースの膜、ポリアミド、ポリスルホンエーテル、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、ニトロセルロース混合エステル、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデンまたはポリプロピレン、ポリエチレンおよびブロックコポリマー、ブレンドおよびその組み合わせが挙げられる。

これは、止血を触媒および促進することが知られている、天然または人工ポリマーを含む材料、例えば炭水化物、より具体的にはキトサンおよびキトサン誘導体、ミクロフィブリル状コラーゲンまたはトロンビン、ポリ－Ｎ－アセチルグルコサミン、酢酸ポリプロラート（polyprolate）、Ｄ－グルコサミンまたはアルギン酸カルシウムを含むドレッシング材、および塩化カルシウムまたは他の塩をはじめとする、止血を触媒および促進することが知られている無機または他の塩を含有するドレッシング材が挙げられる。

ドレッシング材は、身体が該材料を自然に分解して経時的に吸収するかどうかに応じて、吸収性または非吸収性のいずれかに分類される。本発明の文脈において、好適な吸収性材料は、少なくとも15分、例えば20分、好ましくは数日間までおよび200日間以下にわたり、哺乳動物血漿と接触したときにその構造的完全性を維持するであろう。

吸収性ドレッシング材は、酸化セルロース、シルク、腸線（カットグット）、合成ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリジオキサノン、およびカプロラクトンを含む。１個以上の五環式モノマー：グリコリド、Ｌ－ラクチド、ｐ－ジオキサノン、トリメチレンカーボネートまたはｓ－カプロラクトン、をベースにしたポリマーおよびブロックコポリマーを包含する。

吸収性ドレッシング材は、縫合糸を提供するのに特に好ましい。縫合糸は、モノもしくはマルチフィラメント縫合糸であってよく、そして例えばコラーゲン皮膜のような別の材料で前処理（プレコンディショニング）コーティングされてもよい。

本発明にかかるシステムを含む創傷ドレッシング材は、柔軟性のある形態または機械的に不安定な形態、例えば、接着剤、粉末、スプレー、ゲル、顆粒、機械的に圧縮されたスポンジまたは顆粒、膨潤性スポンジ、ゼラチン、ペースト、流体、または創傷と直接接触するように塗布されるクリームであってもよい。組織因子は、ドレッシング材上に固定化され、好ましくはドレッシング材に共有結合されており、ドレッシング材の構成要素であってもよく、その中に組み込まれていてもよい。固定化は、組織因子の全身投与を防止する。
好ましいドレッシング材は、綿、セルロースまたは酸化セルロースベースのものである。

第VII因子

本発明にかかるシステムは、第VII因子をさらに含むことができる。

第VII因子は、好ましくは、使用直前にドレッシング材に被覆されるかまたはドレッシング材に噴霧される。

第VII因子を出血部位に局所的に適用することによって、全身性曝露が低減される。全身療法で普通使用されるよりも一桁少ない量の第VII因子を使用することが有利である。これにより、安全性の懸念を大幅に低減することができる。

本発明による結合型組織因子と第VII因子との好ましい組み合わせは、全身療法において通常使用されるよりも、出血部位で1/10未満の量を使用することによるものである。

補助活性剤（co-active agent）

本発明にかかるシステムは、補助活性剤をさらに含んでもよい。補助活性剤の例には様々な薬剤が含まれ、それらは止血をさらに増強する剤、および出血している創傷をもつ患者に有益でありうる他の薬剤、例えば創傷を冷却するかまたは明らかな疼痛を軽減することができる薬剤などである。

好ましくは、かかる補助活性剤は、止血促進剤、例えば無機塩、ゼラチンもしくはゼラチン誘導体、シクロデキストリンまたはキトサンのようなバイオポリマー、またはそれらの組み合わせである。コラーゲンもしくはトロンビン、ポリ－Ｎ－アセチルグルコサミン、酢酸ポリプロラート、Ｄ－グルコサミン、アルギン酸カルシウム、カオリン、止血を触媒し促進することが知られている塩類、例えば塩化カルシウムまたは他の塩を含む。

補助活性剤は、組織因子とともにドレッシング材上に固定化されてもよい。

本発明にかかるシステムは、安定化剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤は、活性化合物の止血活性とは無関係であり得るタンパク質を含む。好ましい安定化剤は、活性化合物の周辺のドレッシング材の表面空間に受動的に充填されるであろう。好ましい安定化剤は、血清アルブミン、魚ゼラチン、カゼインもしくはタンパク質混合物またはタンパク質分解ゼラチンまたは他のタンパク質を含む。

安定化剤は、組織因子とともにドレッシング材上に固定化されてよく、それによって血管系への放出および全身曝露が最小化される。

本発明にかかるシステムは、化学薬品および緩衝剤によって被覆または膨潤させることができ、これは、保管や輸送時の機能性を更に安定させるであろう。これらの剤は、抗菌剤またはpHを安定化させるための緩衝剤、または凍結もしくはUV照射からの損傷に対して保護する剤を包含する。

本発明者らは、驚くべきことに、固定化リンカーおよび固定化組織因子を有するドレッシング材が、炭水化物、タンパク質、アルコールおよび保存剤からなる混合物によってコーティング（「グレージング（つや出し）」）されていなくても、長期保存時に止血を開始する機能性を保持していることを見出した。

さらなる貯蔵安定化のための好ましい炭水化物としては、トレハロース、ラクチトール、イノシトール、グルコース、スクロース、マンノース、サッカロース、デキストラン、ジエチルアミノエチル（DEAE）－デキストランおよび／またはアガロースが挙げられる。

好ましいタンパク質としては、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（BSA）、組換え血清アルブミンおよびそれらの誘導体、脱脂粉乳、カゼインまたはカゼイン塩、魚ゼラチンが挙げられる。好ましいアルコールはグリセロールを含み、保存剤は創傷ドレッシング材または局所使用に適した２－クロロアセトアミドまたは他の抗菌剤を含む。

本発明にかかるシステムは、出血部位において第VII／VIIa因子と接合することができる、より少量の内因性外分泌組織因子に依存する代わりに、出血した血管を通して血流中に組織因子を漏出させることなく、身体が出血を普通に停止させる方法を模倣した方法において、組織因子またはその変異体を提供する。

特に、縫合糸、粉剤、粒剤、ゲル剤、フォーム、スプレーまたはスポンジを使用することによって、到達困難な出血へのアクセスを促進することができる。

本発明のシステムは、例えば、手動によるかまたはデバイスによるかいずれかで、創傷にまたは創腔に適用される、ゲルの形態であってもよい。その利点は、出血部位に到達する際の柔軟性と、任意のタイプのドレッシング材またはデバイスと結合して、創傷にさらに圧力を加える可能性である。ゲルは、利用できる最も手近のドレッシング材に直接または間接的に分配することができる。これは、例えば、夜間の軍事作業中や病院外の民間事故時などの状況のために正確なサイズやタイプのドレッシング材を所有していないという状況において重要である。

フォームはゲルの変形であり、これは、例えばそのガス含有量によって膨張性である。更なる変形は、共有結合された組織因子を有する吸収性ポリマーを含む噴射フォームである。創傷またはドレッシング材に噴霧されると、中性溶媒またはガスが蒸発した後、残ったゲルが出血部位に近づきそして濃縮されるだろう。また、出血部位にまたはドレッシング材に間接的に適用できる柔軟性を高めるだろう。

さらに別の変形例は、圧縮性スポンジを含むスポンジの使用である。小ビーズの形態のスポンジは、手動でまたはデバイスによって創腔の中に送達させることができ、そして機械的に膨張させた後または膨潤させた後に、出血部位上でさらに圧力を加えることができる。

別の変形は、粘着性のある接着剤の形態であり、典型的には吸収性であり、これは、組織を一緒に保持し、同時に止血を開始するために、手動でまたはスプレーもしくはチューブ状デバイスから適用することができる。

迅速な止血

静止全血は、平均10～30分後に自発的に凝固するが、それを採取したヒトによって大幅に異なる。性別、年齢、種族、一般的な体調、疾患または服用している医薬、例えば抗凝固剤に依存して、大きな変動が見られる。

したがって、能動的な止血ドレッシング材の効率の尺度は、受動的なドレッシング材またはドレッシング材なしの場合と比較して、時間の短縮として最もよく説明することができ、または、ドレッシング材を出血部位に保持するのにどれ程長い時間を要するかとして最もよく説明することができる。

分単位での止血時間の短縮は、迅速な止血でかつ価値がある（有用である）と考えられる。１分という短縮であっても実用的な価値があり、２分以上は有意な改善である。しかし、多くの場合、その効果は、出血部位を覆うドレッシング材に圧力を加えた後に出血を停止させるのか停止させないのか、という基本的問題でありうる。

望ましくない血液凝固

出血部位から離れた血管系または臓器での、ドレッシング材により開始される任意の止血または血液凝固は、無制御であり望ましくない。

出血部位から離れて止血を開始または誘導する任意のドレッシング材は、凝血塊（血餅）を引き起こす可能性があり、重要な場所にある細い血管は、血餅で目詰まりを起こす可能性がある。脳内で詰まった血管は、心臓に通じる血管の閉塞および発作（stroke）を引き起こす可能性があり、心臓発作を引き起こす可能性がある。脚、骨盤、または腹部の静脈からの凝血塊の小片は、血流を通って肺に移動し、主動脈を閉塞して肺塞栓症を引き起こし得る。望ましくない血液凝固を防止することは，安全な止血用ドレッシング材を有するために不可欠である。

本出願の実験例では、ドレッシング材は、連結工程の後、様々な緩衝液で広範囲に洗浄される。本発明者らは、組織因子を連結した洗浄済ドレッシング材が、激しい出血を伴う動物モデルにおいて迅速な止血を促進するのに使用することができたことから、組織因子が（血液で）洗い流されてしまわないことを例証した。

効果を生体外（ex vivo）で測定する方法

止血を導入するドレッシング材の効果は、実施例８に記載されているとおり、ヒト実験およびいくつかの動物モデルにおいて、もちろん測定可能である。

実施例１０では、様々なドレッシング材が全血、血小板と血漿タンパク質の混合物、または純粋な血漿と共にバイアル内で混合される、単純なアッセイを説明する。

ドナーからプールした血漿を使用することのみによって、初期の止血過程が測定され、ドナー間の変動が低減されると考えられる。一方、該アッセイはトロンビンバースト効果を示さないだろう。

このアッセイでは、バイアルを37℃に加熱し、特定の時間間隔で反転させる。止血は、バイアルを上下反転させたときに、形成されたゲルまたは凝血塊が流れ落ちるまでの時間として測定される。止血を開始するためのドレッシング材の効率は、ドレッシング材、未処理のドレッシング材、またはダミータンパク質を有するドレッシング材と比較したときの、時間の短縮として推定される。

トロンボエラストグラフ（TEG）粘弾性止血アッセイを使用して、自由溶液の組織因子によって開始された凝血塊形成の総粘弾性応答を測定することができる。例えば、全血、血小板と血漿タンパク質との混合物、または純粋な血漿を使用する。

実施形態（Embodiments）

一実施形態において上記に概説したように、本発明にかかるシステムは、例えば、適切なドレッシングの形態でドレッシング材上に固定化された組織因子またはその変異形を含み、出血性外傷と接触状態にして、それにより該システムが第VII／VIIa因子と相互作用する組織因子を大量出血領域に提供することができる。これは、通常はより少量の出血（これは通常短時間の圧迫により停止させることができる出血を意味する）に起因する凝固カスケードを活性化することができる、任意の他の内因性細胞に結合した組織因子（例えば内因性組織もしくは白血球由来のもの）を上回る十分な量で起こるであろう。しかしながら、およそ100 ccの篩過血液を超えるような大量出血（より少量の静脈出血から始まり、裂傷がより大きな血管および特に動脈血管を含むかどうかを意味する）が始まると、組織因子またはその一部分が適用される限り、かなり優れた方式で、おそらく多量の組織因子が更なる大量出血を防止するのであろう。

一実施形態では、組織因子は、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかで共有結合によってドレッシング材に固定化される。これにより、組織因子は、血管の損傷部位において、臨床的に有意な量でドレッシング材から血管の内側に放出されることはない。かくして、血流中で血栓症または塞栓作用を引き起こしうる、臨床的に意義のある量での血流中への曝露が回避される。

一実施形態では、本発明にかかるシステムを含むドレッシング材（創傷ドレッシング材）が提供され、より具体的には、ドレッシング材は、ヒト組織因子の細胞外ドメインまたは組換え体となるその任意変異体、すなわち組換え可溶性ヒト組織因子を含むことができ、それは、ドレッシング材に共有結合で固定化されているかまたはドレッシング材を構成するドレッシングに組み込まれている。ドレッシング材は、外部からの適用により引き起こされる血管内血栓を防止する。固定化された組織因子を有するドレッシング材を出血領域に適用すると、どれくらい多量の出血があるかに依存して、組織因子が、凝固カスケードを活性化する十分量の第VII／VIIａ因子と相互作用することが推定される。十分量の凝固因子が利用可能であり、従って適切な止血を成功させるのに十分な凝固因子が得られるならば、（１または複数の）出血部位での出血を遅らせるかまたは停止させるように効率的に止血を確立できるものと考えられる。

さらに別の実施形態では、本発明にかかるシステムは、固定化組織因子と非結合第VII因子とをドレッシング材中に結合させて、出血領域内の止血をさらに高速化する。

一実施形態では、本発明にかかるシステムは、縫合糸の形態で提供される。縫合糸は、典型的には、ある長さの糸が取り付けられた針から構成される。すべての縫合糸は、体が自然に分解し、縫合材料を経時的に吸収するかどうかによって、吸収性または非吸収性のいずれかに分類される。追加の好ましい実施形態は、吸収性であるとして、または代替的に非吸収性であるとしてドレッシング材を定義する。

好ましい実施形態は、シート、糸、繊維、または糸の束の形態で本発明のシステムを提供する。次いで、糸または糸の束は、様々な形態の創傷ドレッシング材（創傷被覆材）へと織られ、接着され、または他の方法で一体化することができる。これは、既存の生産技術を使用して、多数の異なる創傷ドレッシング材への、集中的かつ標準化された生産および容易な実装を可能にする。活性シート、糸、繊維または束の密度は、特定の用途に合わせて最適化される。

本発明者らは、驚くべきことに、ある実験において、組織因子の局所濃度が、止血を非常に迅速に誘発して（triggering）トロンビン産生を局所維持することを見出した。このステップが本発明のきっかけとなる。

実施例は、エピクロロヒドリン活性化およびDVS活性化を開示すること、試験用の間隙充填タンパク質および組織因子を使用してカップリングを最適化すること、ドレッシング材の生体外機能試験、第VII因子溶液で被覆されたドレッシング材を用いた試験、大規模調製、およびミニブタにおける２種類の出血性能試験によって、本発明を例証する。
以下では、ドレッシング材のDVS活性化およびエピクロロヒドリン活性化が開示される。

実施例１：ドレッシング材のDVS活性化
３種類のドレッシング材、すなわちＡ：織ガーゼ、Ｂ：歯科用ドレッシング材、およびＣ：織目の細かい綿シートを、緩衝液（50m M炭酸塩、pH 11.6）で洗浄し、穏やかに攪拌しながら50 mM炭酸塩 pH 11.6中5％DVSで１時間または４時間、密閉容器内で処理した。DVS溶液をデカンテーションし、廃棄した。ドレッシング材を脱イオン水で７回洗浄した後、約50 ppmのハイドロキロンを添加した脱イオン水中に保存した。

実施例２：ドレッシング材のエピクロロヒドリン活性化

上記の３種類のドレッシング材を、密閉容器中で穏やかに攪拌しながら、緩衝液（2 N NaOH、1：1水－DMSO）で洗浄し、次いで2 N NaOH、1：1の水－DMSO中５％エピクロロヒドリン（Merck）で１時間または４時間処理した。

溶液をデカンテーションし、収集し、廃棄した。ドレッシング材を脱イオン水で７回洗浄した後、脱イオン水中で保存した。
ドレッシング材をより小さい小片に切断した。

以下に、DVSまたはエピクロロヒドリンで活性化したドレッシング材への蛍光標識BSA試験タンパク質のカップリングを開示する。

実施例３：蛍光標識BSA試験タンパク質のカップリング

試験タンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）は、ドレッシング材中の充填剤またはスペーサーとして有用であり、商業的に入手可能なイノビン（デイド イノビン）中の一成分であるため、モデルとして適当である。

BSAは、pH 7において、5/6-カルボキシフルオレセインNHSエステル（Thermo Fisher製）の2 mg/mL DMF（Merck製）溶液0.525 mLを、0.20 M HEPES（Merck製）中のBSA（Merck製）の1.00％攪拌溶液10 mLに滴下添加することによって蛍光標識した。室温で１時間攪拌後、さらに精製せずに溶液を使用した。
BSAを含まない同溶液を対照として調製した。

フルオレセイン標識BSAをDVSまたはエピクロロヒドリン活性化ドレッシング材に結合させた。異なるタイプのドレッシング材を試験した。

様々なpHと時間における種々のドレッシング材を、室温（21℃）で一般的な手順に従って、1.0 mg/mLのフルオレセイン標識BSA濃度を有する：ドレッシング材（約２×２cm）を、反応緩衝液、すなわち0.10 M炭酸塩 pH 10.0、0.10 M 炭酸塩 pH 9.0または0.10 M HEPES pH 8.0中で、それぞれ第１回洗浄した。

ドレッシング材を、ペーパータオル上で簡単に振とうし乾燥させた後、フルオレセイン
標識BSA反応溶液または対照溶液に浸漬した。様々な反応混合物を、水、pH緩衝剤およびフルオレセイン標識BSA溶液を添加することによって調製した。

反応後、残りの活性基を停止緩衝液（0.20 Mエタノールアミン、0.20 M炭酸塩、pH 9.0）で15分間クエンチした（エポキシ活性アフィニティークロマトグラフィー用樹脂の標準的クエンチ手順と同様）。脱イオン水中で４回振盪することにより、ドレッシング材を徹底的に洗浄した。ドレッシング材をpH 7.0で10 mM HEPES中に保存した。

湿ったドレッシング材を標準光学顕微鏡のスライドガラス上に配置した後、蛍光スライドスキャナにおいて蛍光強度を測定した。顕微鏡のスライド走査フレームを用いて、CellReporterXpress（商標）ソフトウェア（Molecular Devices）を備えたImageXpress^ＴＭ（商標）-Picoシステムを使用して、蛍光画像を記録し、蛍光強度を比較した。
要約すると、以下のことが観察された。

実験は、最初にドレッシング材を活性化し、異なるpHと時間でカップリングすることによって試験タンパク質の負荷を制御できるかどうかの可能性を示す。pHが高くなるほど、より多くカップリングされた。そして、反応時間が長いほど、より多くの負荷が得られた。pHの効果が優勢的であるように見える。しかし、タンパク質とのカップリング時間が長くなっても、蛍光の量はそれほど多くならなかった。この情報を使用して組織因子のカップリングを最適化した。

以下に、組織因子のDVSまたはエピクロロヒドリン活性化ドレッシング材へのカップリングを開示する。

実施例４：異なるpHおよび濃度での、DVS活性化ドレッシング材への組織因子または組織因子とBSAとの混合物のカップリング、および凝固効率の試験

数個のグリコシル化部位を有する組織因子（配列番号２）
（SGTT
NTVAAYNLTWKSTNFK
TILEWEPKPVNQVYTVQIST
KSGDWKSKCFYTTDTECDLT
DEIVKDVKQTYLARVFSYPA
GNVESTGSAGEPLYENSPEF
TPYLETNLGQPTIQSFEQVG
TKVNVTVEDERTLVRRNNTF
LSLRDVFGKDLIYTLYYWKS
SSSGKKTAKTNTNEFLIDVD
KGENYCFSVQAVIPSRTVNR
KSTDSPVECMGQEKGEFRE)

は、Human Cell Inc. （米国イリノイ州Naperville）から入手し、2006－R022, 0103に発行されたManisha Sahni他によるResearch Report、SAFE Biosciences、www.Safcbiosciences.comによる、「HEK 293 Cell Growth and Virus Production in EX-CELL^ＴＭ 293 Serum-Free Medium」というタイトルのSahni,M.、Wilcox, S.他のSAFC Biosciences Research Reportに記載されたとおりに、EX-CELL（商標）293無細胞培地中での細胞増殖生産システム中で産生した。タグ付されていない組織因子は、イオン交換とヘパリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、炭酸塩緩衝液から1 mgバイアル中に凍結乾燥した。

標準溶液は、0.250 mLの脱イオン水に1.00 mgの組織因子を溶解することによって調製した（4.0 mg/mL）。溶液は透明であり、白濁がなかった。

カップリングは、実施例３に記載されているように行われたが、コンジュゲーションの一部は、組織因子とフルオレセイン標識BSAとの混合物を用いて行われた。以下の表（実施例５）は、これらの組み合わせを要約する。

反応を停止緩衝液で15分間クエンチした。脱イオン水中で３回振盪することによってドレッシング材を十分に洗浄し、続いて、pH 7.0で20 mM Tris、および水で１回洗浄した。ドレッシング材をpH 7.0で10 mM HEPES中に保存し、その後、止血を開始させる能力について試験した。

実施例５：組織因子で機能化されたドレッシング材の生体外（ex vivo）試験

組織因子で機能化されたドレッシング材（約２×２cm）並びに陰性対照および陽性対照を小さなバイアルに入れ、5.0 mLの新鮮なヒト血液を添加した。室温で20分後、ドレッシング材をバイアルから取り出し、顕微鏡のスライドグラス上に置いた。血液凝固および被覆は、ピペットを使って血液成分をドラッグすることによって評価した。陽性結果の例は、全て黒っぽい塊（dark lump）および／または線維構造の形をした透明な血液凝固塊を有していた。最も陽性であるのは、連続的でかつ密な塊に含まれるゲル状または半固体状であった。陰性結果は、塊のない低粘度の血液を有していた。凝固は、２名の専門家によって「-」から「++++」までスコア付けされた。

以下の表は、エピクロロヒドリン活性化ドレッシング材の様々な組み合わせおよび結果を要約する。

結論として、本実験は、組織因子が結合されたドレッシング材による血液凝固塊の形成を示した。

以下では、より低いpHおよび濃度での還元型DVS活性化ドレッシング材への組織因子のカップリング（１時間活性化）並びに凝固効率の試験を記載する。

本実験は、実施例４の通りであるが、より低いpHおよび濃度を使用する。pH 8.0では、反応緩衝液が0.10 M HEPES pH 8.0であった。血液凝固は、上記のように評価された。

下表は、様々な組み合わせおよびDVS活性化ドレッシング材の結果を要約する。

要約すると、本実験は、低い組織因子濃度およびpH 8.0でカップリングしたときであっても、ドレッシング材に結合された組織因子により血液凝固を開始する能力があることを例証した。これは、組織因子タンパク質上のチオールを介したカップリング後の良好な活性を表し得る。

実施例６：３７℃にて組織因子で機能化されたドレッシング材および第VII因子で被覆された同ドレッシング材の生体外（ex vivo）試験

NovoSeven（商標）バイアル（NovoNordisk社、デンマーク国）を開け、1.0 mgの凍結乾燥粉末を、供給された緩衝液1.00 mLに溶かして第VII因子原液を作製した。

第VII因子溶液で覆ったサンプルの場合、最初の余分な水分をドレッシング材から取り除いた後、水で1：10希釈された第VII因子溶液でそれらを覆った。

組織因子で機能化されたドレッシング材の新たなセットは、ビニルスルホンおよびエピクロロヒドリンで活性化されたドレッシング材「Ｃ」の綿シートをベースに作製した。炭酸塩緩衝液中の0.050 mg/mLの組織因子pH 8.00を室温で60分間カップリングし、エタノールアミンでクエンチし、水とトリス緩衝液で洗浄した。活性化されたドレッシング材のタイプと、第VII因子の添加（「Ｆ７」）のみを変更した。

生体外（ex vivo）試験は、実生活の状況をよりシミュレートするために、加熱ブロック中での37℃のインキュベーション温度と５分後のモニタリングとを除いて、上記のように実施した。すべてのサンプルを二重反復で試験した。

結果は下表に要約される。

結論として、組織因子を有するドレッシング材は凝血塊を生成し、プラセボは生成しなかった。

第VII因子で被覆されたドレッシング材は、他のドレッシング材のいずれと比較しても、非常に濃密な凝血塊を生成した。第VII因子を有するプラセボ（非活性化）ドレッシング材は、幾らかの透明な凝血塊を生成したが、組織因子を有するドレッシング材を用いた場合ほどにそれらが濃密またはゴム状ではなかったことが認められた。エピクロロヒドリンは、本実験におけるDVSドレッシング材よりも優れていると思われる。本発明者らは、ドレッシング材に連結された組織因子と組み合わせた第VII因子が、血液凝固をより一層強化すると結論付けた。

実施例７：組織因子を有するドレッシング材の大規模調製

活性化ドレッシング材（タイプＣ）は、実施例１および２と同様に調製した。
DVS活性化ドレッシング材は、10×10 cmの綿ドレッシング材（約10グラム）の小片６枚について200 mLの５％DVS、炭酸塩pH 10.6を使って調製した。
エピクロロヒドリン活性化ドレッシング材は、10×10 cmの綿ドレッシング材（約10グラム）の小片６枚について200 mLの５％エピクロロヒドリン、50％DMSO／水中の2N NaOHを用いて、調製した。

DVS活性化ドレッシング材は、長さが約５％収縮し、エポキシドレッシング材は長さが約10％収縮した。

ドレッシング材を2.5 cm×2.5 cmの小片に切断し、上述したとおりpH 8で１時間、0.050 mg/mLまたは0.100 mg/mLの組織因子を用いて組織因子と結合させ、エタノールアミン緩衝液でクエンチし、水およびトリス緩衝液で洗浄した。水中に冷蔵保存した。ドレッシング材は、次の表中、TL-1、TL-2、TL-3、およびTL-4として要約される。

未処理の綿ドレッシング材は、水とトリス緩衝液で洗浄し、TL-5と命名され、プラセボドレッシング材とした。

ドレッシング材はいずれも２～６℃で水中に保存され輸送され、調製後３日目と６日目にミニブタ出血試験に用いられた。

ミニブタ試験
以下の実施例では、脾臓損傷および頸動脈出血において止血を誘導する、組織因子ドレッシング材の止血能力の試験が開示される。

本発明に記載されているドレッシング材は、ミニブタを使った脾臓損傷および頸動脈出血モデル（Ellegaard Gottingen Minipigs A/S、Dalmose、デンマーク国）において、生体内で評価されそして市販のドレッシング材と比較された。
以下のドレッシング材を生体内（in vivo）モデルで試験した。

７～９箇月齢の６頭の雄ミニブタ（15～18 kg）を生体内試験に使用した。Zoletilミックス〔Zoletil（商標）50（50 mg/mL）＋6.25 mLキシラジン（20 mg/mL）＋1.25 mLケタミン（100 mg/mL）＋2.5 mLブトルファノール（10 mg/mL）〕の筋肉内（i.m.）注射によって麻酔を誘導した。用量は1 mL/10 kg 筋肉内。誘導後、イソフルラン（0～4％）で麻酔を持続させた。

静脈内（i.v.）カテーテル（耳静脈または大腿静脈）を、動脈内血圧探査針（大腿動脈内）に付加して配置した。クエン酸ナトリウムガラスバイアル中の4.5 mLサンプルを、トロンボエラストグラフィック（TEG 6ｓ、Haemonetics社、米国マサチューセッツ州）による血液凝固測定のために採取した。ブタに25 i.u.のヘパリン／kg i.v.を投与し、10分後に新たなTEG測定を行って、凝固がヒト特性、すなわち、ヒトスペクトルのよりハイエンドの部分に対応するTEG値に到達するようにした。基準容量での治療は、静脈内カテーテルでのリンガー液－乳酸塩の点滴注入（約5～15 mL/h）により維持した。

次の実験の間、ミニブタを血圧、酸素飽和度および心拍数について連続的にモニタリングした。

実施例８：脾臓損傷

尾方向に直下8 cmの剣状の正中線切開を配置した。脾臓を位置決めし、腹部の上に配置した。脾臓を必要に応じて等張NaClにより湿らせた。脾臓損傷は、２組の２個の標準化された外科用メス損傷（深さ3 mm、長さ1.5 cm）として扱い、脾臓損傷１および２は、脾臓の遠位部分に作られ、そして脾臓損傷３および４は脾臓の尾部分に作られた。非拘束出血の20秒後、ドレッシング材2 cm×2 cmを損傷の頂部の中央に配置した。手指による圧迫を１分間または３分間行った。圧迫後、約０、３、５または６分後および10分後に止血を評価した。評価後、等張NaClを使って脾臓を1層のガーゼで包み、腹部に再配置した。

脾臓損傷モデルで検査したドレッシング材およびドレッシング材の止血効果は、下表に要約される。

実験は、組織因子が結合されたドレッシング材の、脾臓損傷モデルにおいて止血を誘導する能力を例証している。Tachosil（商標）またはプラセボ（TL-5）と比較して、組織因子ドレッシング材は、同時またはより速く止血を誘発した。

一般に、Tachosilの場合、初期の止血の後に再び出血が始まった。組織因子ドレッシング材は、濃厚な凝血塊を形成し、出血を効果的に停止し、それが機械的に安定した閉塞をもたらした。なお、組織因子ドレッシング材は、流出している血液の粘稠化を導くように見えるのに対し、Tachosilドレッシング材からの流血は液状のままであることが認められた。

実施例９：頸動脈出血モデル

脾臓モデル実験を終了した後、動脈損傷モデルの準備として、リンガー液－乳酸塩の輸液速度を約50 mL/時間に増加させた。それ以降、輸液速度の調節は血圧（BP）に基づき、試験中65 mmHgを超える平均血圧（BP）を維持することを目的とする。頸動脈は、試験中に切開および出血制御のために動脈をリフトできるように、露出させ、誘導線を上下に配置させた。ガーゼ上の20％リドカイン１～３ mLを動脈の上に直接載せた。動脈をリフトしている間、動脈内の血流を遮蔽し、14Ｇカニューレでの穿刺により損傷を誘導した。動脈のリフトを緩めることで、動脈出血を示した。出血が脈動的でない場合、損傷サイズを増加させた。細動脈切開から20秒後、出血を抑制し、２層のドレッシング材を損傷の上に配置し、２層のガーゼを一番上に置き、続いて手動での圧迫を行った。５分後、手動圧迫をゆっくり解除し、損傷部位を出血について検査した。出血が認められなかった場合、ガーゼを慎重に取り外し、ドレッシング材を約３～５分間触らないでおいた。止血が得られなかった場合、別のドレッシング材（２層）を出血部位上に配置し、続いて５分間の手動圧迫を行った。試験中、BPを厳密にモニタリングした。

本研究は、ペントバルビタールの静脈内（i.v.）注入によって終結した。
頸動脈出血モデルで得られた結果を以下に要約する。

頸動脈出血モデルにおいて得られた結果は、試験した組織因子結合ドレッシングが、大量の動脈出血を停止させることができることを示す。

本実験の１つの例で機能したQuikClotドレッシング材は、別の例では機能しなかった。組織因子ドレッシング材は、全ての例において効率的に機能を果たした。ミニブタＣについて示される通り、QuikClotやプラセボが機能しなかった後であっても、効率的に機能し、圧迫後およびTL-3での止血後には血圧も回復した。

実施例１０：組織因子および組織因子結合ドレッシング材の安定性

実施例７からのドレッシング材（３片、約３×３cm）をミニブタ出血実験（実施例８と９）において使用し、保存剤なしで４～７℃で500 mLの濾過済MilliQ水中で10か月間保存した。円形の小片を打ち抜き、標準化された生体外（ex vivo）アッセイ設定において、血漿を凝固させる能力を試験した。

より詳細には、調製したドレッシング材からドレッシング材片を打ち抜いた。打ち抜いたドレッシング材（直径4 mmまたは5 mm）を、1.5 mLのポリプロピレン弱付着性バイアル（Corning社製）に入れ、５頭の被験体からプールした340μLの冷却血漿、20μL CaCl_２および40μL 緩衝液Ａ（１％BSA）を添加した。バイアルを37.0℃の加熱ブロック内に配置した。各バイアルを規則的間隔（30～60秒）で外観検査した：バイアルを手動で上下反転させ、混合物がバイアルの底部に滞留した場合には、該サンプルが凝固していると解釈した。血漿の添加から凝固までの時間を記録した。全ての測定を二重反復で行った。

HEK 293から新たに調製された組織因子（配列番号２）の緩衝液Ａ中の標準希釈系列（実施例４と同じ）を、比較参照に用いた。
結果を下表に要約する。

結論として、10箇月齢のTL-3ドレッシング材は、依然として、血漿の凝固を開始することができた。実施例８と９のミニブタの実験と同じドレッシング材を使用した。

異なる結合比を有するTL-4は、依然として凝固を開始することができた。DVS活性化および異なる結合比で作製された同様のドレッシング材、TL-1およびTL-2も凝固を開始することができた。

また、組織因子は、10か月の保存後に大容量の液体中に漏出していないようだ。

上記結果は、３片のTL-3ドレッシング材が１片のものより短い凝固時間を与えたという、用量応答効果をさらに示す。

組織因子希釈系列から判断されるように、直径４ mmのTL-3の３枚の円形片の凝固効率は、約0.010 mg/mLの遊離組織因子よりも良好であるが、ドレッシング材中の組織因子が遊離溶液中の等価量よりも密である可能性が高いため、これらの数値を直接比較することはできない。

実施例１１：ドレッシング材の再現性およびドレッシング材からの漏出

本実施例では、組織因子の漏出を伴わない新鮮な組織因子ドレッシング材を調製する際の再現性をさらに検討した。QuikClot（商標）ドレッシング材は比較のために含められた。

0.05 mg/mLの組織因子とpH 8にて１時間カップリングさせた、エピクロロヒドリン活性化ドレッシング材Ｃ（上記実施例7でTL-3として調製したもの）を、緩衝化エタノールアミン（10 mL）でのクエンチ工程の後、10 mLの水で7回洗浄した。上記実施例10で説明したように、ドレッシング材と洗浄液を、生存アッセイにおいて血漿を凝固する能力について二重反復試験で（ａとｂ）分析した。凝固時間を記録した。

直径4 mmのQuikClotドレッシング材（Z-Medical、カオリンを含浸させたもの）の20枚の円形小片を、比較用に順次洗浄した（4 mmの円形小片一枚あたり100μLの水）。特に、第１回洗浄サイクルおよび以後の全ての洗浄サイクルにおいて、洗浄液中に白色沈殿物が視認された。６枚のドレッシング材片を、１回、３回、７回洗浄後の試験用に取り出し、洗浄液を収集した。サンプルを手動バイアルアッセイで試験した。下表は、本実験を要約する。

結論として、組織因子活性化ドレッシング材は、コンジュゲーション後に未結合組織因子を含まないように洗浄することができる。７回の反復洗浄工程の後、洗浄液は凝固を開始することができないのに対して、ドレッシング材上に結合した組織因子は凝固を開始することができた。

結果は再び、３片の新TL-3ドレッシング材が1片よりも短い凝固時間を与えるという、用量応答効果を例証している。

比較すると、QuikClotのカオリンは一部流出することができ、その洗浄液は、７回洗浄後であっても凝固を開始することができた。洗浄後のQuikClotは、依然として凝固を開始することができた。２つの異なるタイプのドレッシング材は、異なるメカニズムによって凝固を開始することが注目される。

実施例１２：大腸菌由来の組織因子を有するドレッシング材

非グリコシル化組換え組織因子（配列番号２）（上記実施例4のアミノ酸配列参照）を、大腸菌から発現させ、Elabscience Biotechnology Inc.（Wuhan、China & Houston、米国テキサス州）から入手した。より詳細には、pET-28aベクターを使って、Ｎ末端にGSTタグが融合した形で発現させ、アフィニティー精製し、タグを切断し、そしてSECおよびイオン交換精製した。0.10 mgのバイアルで凍結乾燥して郵送された。

大腸菌（E-coli）およびHEK293細胞から新たに調製された組織因子の緩衝液Ａ（BSA、PBS）中での標準的な希釈系列を、標準の生体外TEG（登録商標）5000 Haemostant Analyzer System （トロンボエラストグラフィー、Haembonetics Corporation製）で比較した。

凝固因子単独の酵素反応からの凝固時間をＲ値として記録した。血液凝固のカイネティクス（動力学的）パラメータも記録した。

要約すると、測定対象の緩衝液Ａ中の40 uLサンプルを、TEG装置内の測定カップ内で５体の被験者からプールされた20μLのCaCl_２を340μLの血漿中に添加した。凝固因子単独から凝固時間としてＲ値を記録した。全ての測定を二重反復実験で行った。

大腸菌由来組織因子を結合させたドレッシング材を、実施例7に記載したように調製し、バイアルアッセイで試験した。

また、HEK293由来組織因子が結合された実施例１１の新たに調製されたドレッシング材、および未改変のドレッシング材を試験に含めた。
結果を以下の表に要約する。

結論として、大腸菌由来の遊離TFは、血漿の凝固を開始することができるが、明らかに、HEK293由来のTFよりやや低い効率であった。大腸菌由来TFで連結されたドレッシング材は、比較参照のドレッシング材よりもわずかに良好に凝固を開始することができた。HEK細胞由来組織因子について、同じ結合条件を用いた場合、大腸菌由来組織因子を有するドレッシング材の凝固時間の方がより長い時間であった。

Claims (15)

1. 望ましくない血液凝固のリスクを低減しながら迅速な止血を促進するためのシステムであって、
   －組織因子（TF）またはその任意変異体、および
   －ドレッシング材であって、生理学的環境に曝されたときに、該組織因子またはその任意変異体が該ドレッシング材から解離するのを防止するような様式で、該組織因子またはその任意変異体が結合されるドレッシング材
   を含んでなるシステム。
2. 前記組織因子またはその変異体がヒト、ブタ、ウマ、イヌまたはウシ起源のものである、請求項１に記載のシステム。
3. 前記組織因子またはその任意変異体がヒト組織因子である、請求項１または２に記載のシステム。
4. 前記組織因子がヒト組織因子の細胞外ドメインである、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
5. 前記組織因子が、配列番号２、または配列番号２と少なくとも60％、例えば少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の配列同一性を有するその任意変異体を含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
6. 前記組織因子が配列番号２を有する組換えヒト組織因子である、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
7. 前記ドレッシング材が、創傷ドレッシング材、パッチ、ガーゼ、細胞外マトリックス成分、ゲル、クリーム、軟膏、粒子、例えばナノ粒子、およびそれらの任意組み合わせからなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。
8. 前記ドレッシング材が、綿、セルロース、セルロースエーテル、再生セルロース、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリウレタン、アガロースまたは紙ベースの膜、ポリアミド、ポリスルホンエーテル、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、ニトロセルロース混合エステル、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデンまたはポリプロピレン、ポリエチレンおよびそれらのブロックコポリマー、ブレンドおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
9. 前記組織因子またはその任意変異体が、アザラクトン、エポキシド、シアノブロミド、Ｎ－ヒドロキシスクイシンイミドエステル、ニトロフェニルエステルおよび他の活性エステル、ハロゲン化アリール、イソチオシアネート、アルデヒド、マレイミド、ジスルフィド、環状ラクトン、トリアジン、ベンゾキノン、およびビニルスルホンからなる群より選択されるリンカーによって前記ドレッシング材に連結される、請求項７に記載のシステム。
10. 前記連結が共有結合に基づく、請求項１～９のいずれか一項に記載のシステム。
11. 前記ドレッシング材が、哺乳動物の血漿／血液中で吸収性および／または非吸収性である材料から作られている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステム。
12. 第VII／VIIa因子をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
13. 組織因子安定化剤をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
14. 前記組織因子安定化剤が、血清アルブミン、ゼラチン、カゼインおよびその誘導体を含む群から選択されるタンパク質である、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記組織因子安定化剤が、前記ドレッシング材に接着されている、請求項１３または１４に記載のシステム。

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