KR20230113529A - 지혈 제어를 개선하기 위한 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상처 드레싱에 또는 상처 드레싱으로 사용에 적합한 드레싱 재료에 조직 인자 단백질의 고정화에 의해 조직 인자가 상처에 직접 접촉하게 하여 지혈 제어를 개선하기 위한 안전하고 효율적인 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 응고 캐스케이드의 가장 중요한 구성 성분인 트롬빈이 매우 신속히 방출되는 과정인 “트롬빈 버스트”를 생성하기 위해 고정된 조직 인자를 사용하는 것을 목표로 한다. 혈관 바탕으로 단백질 조직 인자의 전신(systemic) 방출이 없다. 연결된 단백질 조직 인자는 지혈을 최적화하기(optimise) 위하여 단독으로 또는 다른 인간 단백질들 또는 성분들과 조합하여 사용될 수 있다.

Description

지혈 제어를 개선하기 위한 시스템

본 발명은 바람직하지 않은 전신 응고 (systemic coagulation) (예를 들어, 파종 혈관내 응고 (disseminated intravascular coagulation))를 방지하면서 지혈(haemostasis)을 촉진하기 위한 빠르게 작용하고 안전한 시스템에 관한 것이다. 더 정확하게, 시스템은 드레싱 재료(dressing material) 상에 고정된(immobilised) 조직 인자 (TF)를 포함하는, 하나 이상의 지혈제(haemostatic agent)(들)을 포함하여, 시스템이 손상 부위(site of injury)에서 국소 클로트 형성을 개시할 수 있는 동시에 사용에 안전하다.

본 발명은 트롬빈이 신속히(rapidly) 방출되는 과정인 국소 "트롬빈 버스트(thrombin burst)"를 만들어내기 위해 고정된(immobilized) 조직 인자를 사용한다.

the American Association for the Surgery of Trauma에 따르면, 외상(trauma)은 1 및 45 세 사이의 모든 사람들에 대해 사망의 주된 원인이다. 전 세계적으로, 손상(injury)은 매년 5 백만 초과의 사망에 대한 원인이다. 외상성(traumatic) 이벤트 후 발생하는 방지 가능한 사망의 대부분은 민간인들(civilians) 및 군 인사(military personnel) 둘 다에서, 출혈(bleeding)(헤모리지(haemorrhage))의 결과이다 (Bellamy R.F. Causes of death in conventional warfare, Mil Med. 1984;149:55-62).

인자 III으로도 부르는, 조직 인자(Tissue Factor) (TF)는 세포외 성분들과 상호 작용에 이용가능한 세포외 도메인을 갖는 막관통 당단백질이다. 조직 인자는 전혈(whole blood)에 노출될 때 혈액 클로팅(blood clotting)을 개시하는 것으로 알려져 있다. 그것은 인자 VII 및 활성화된(activated) 인자 VII 에 대한 고-친화성 수용체로 기능한다. 결과로 생긴 복합체(complex)는 특정 제한된 단백질분해(proteolysis)에 의한 응고 프로테아제 카스케이드들(cascades)의 개시에 원인이 되는 촉매적(catalytic) 이벤트를 제공한다 (Grover S.P. and Mackman N. Tissue Factor An Essential Mediator of Hemostasis and Trigger of Thrombosis, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018;38:709-725).

응고 (혈전형성(thrombogenesis))는 혈액이 클로트들(clots)을 형성하는 과정이고, 그것은 지혈의 중요한 부분이다. 훼손된(damaged) 혈관(blood vessel) 또는 훼손된 관들(vessels)로부터의 혈액 상실의 중단(cessation), 여기서 피브린-함유 클로트 및 혈소판(platelet)에 의해 덮인 훼손된 혈관(들) 벽은 출혈을 멈추고 훼손된 관의 수선(repair)을 시작하는 데 필요하다. 응고의 장애들은 출혈(헤모리지), 또는 폐색성 클로팅(obstructive clotting)(혈전증(thrombosis))의 증가된 위험을 이끌 수 있다.

혈액 응고를 개시할 수 있는 두 가지 경로들이 있다는 일반적인 과학적 의견 일치(consensus)가 있다: 소위 외인성 경로(extrinsic pathway) 및 내인성(intrinsic) 경로 - 자주 접촉(contact) 경로로 나타내어진다.

내인성 경로는 그것과 관련된 알려진 출혈 병인(aetiology)이 없다; 따라서 이 경로는 지혈에 부수적인 것으로 생각된다.

외인성 경로는 혈관 벽 손상에 의해 활성화되며, 그 후, CD142, 또는 인자 III으로도 불리는 조직 인자가 내-피하 조직(sub-endothelial tissue)에 존재하는 혈관들을 둘러싼 세포들에 의해 항시적으로(constitutively) 발현된다. 활성화된 내인성 인자 VIIa는 조직 인자에 결합하고 조직 인자-FVIIa 복합체를 형성하는데, 이는 응고 프로테아제 카스케이드의 핵심 개시자(key initiator)이다. 조직 인자-FVIIa 복합체는 칼슘 의존적 방식으로 네거티브 차지된 막 표면 상에 조립되어 효소 복합체를 형성하고, 이는 인자 IX 및 X를 인자 Ixa 및 Xa로 각각 단백질분해적으로(proteolytically) 전환시킨다.

인자 IXa 및 인자 Xa는 각각 내인성 인자 Xase 및 프로트롬비나제(prothrombinase) 복합체들의 효소적 성분들(enzymatic components)이고, 이는 프로트롬빈(prothrombin) (인자 II)의 트롬빈(thrombin) (인자 IIa)으로의 전환을 유도한다. 활성화된 내인성 인자들의 조합된 활성(activity)은 트롬빈 (FIIa)의 폭발적 버스트(explosive burst)를 이끈다. 트롬빈이 생성되면(generated), 그것은 피브리노겐을 절단하여 피브리노펩타이드들 A 및 B를 방출하고(it cleaves fibrinogen releasing fibrinopeptides A and B) - 각각 흔히 FPA 및 FPB로 나타내어지고, 그리고 인자 XIII를 활성화시켜 가교된 피브린 클로트를 형성한다.

지혈은 세 가지 주요 단계들을 갖는다: 1) 혈관 수축(vasoconstriction), 2) 혈소판(platelet) 플러그에 의한 내피 결함(endothelial defect)의 일시적인 폐색(blockage), 및 3) 혈액 응고 또는 피브린 클로트의 형성으로, 이는 지혈의 필수 부분이다.

조직 인자-VIIa 복합체의 형성에 의한 응고 카스케이드의 트리거링(trigging)은 천연 기질들(natural substrates) 인자 IX, X, 및 VII에 대한 최대 단백질 분해(proteolytic) 활성을 나타내기(express) 위해- 적절한 막의 표면과 관련해 직접적으로 - 또는 막의 표면에 직접적으로 일어나야 한다고 추정된다 (W. Ruf, A. Rehemtulla, J. H. Morrissey, and T. S. Edgington "Phospholipid-independent and -dependent interactions required for Tissue Factor receptor and cofactor function" J. Bio. Chem., 266, 2158-2166, (1991); M. M. Fiore, P. F. Neuenschwander, and J. H. Morrissey "The biochemical basis for the apparent defect of soluble mutant Tissue Factor in enhancing the proteolytic activities of factor VIIa", J. Bio. Chem., 269 (1), 143-149, (1994)). 따라서, 조직 인자의 세포외 및 막관통 도메인들은 혈액 응고 과정에서 구별되는(distinct) 역할을 한다 (Saulius Butenas, "Tissue Factor Structure and Function", Scientifica (Cairo), 2012: 964862. (2012)). 또한, 문헌은 세포질 및 막관통 도메인들 둘 다가 결여된(lacking) 조직 인자 단백질들은 막에 결합할 수 없으며, 따라서, 인자 VIIa와 복합체들을 형성하더라도, 천연 기질들 인자들 IX, 및 X를 단백질 가수분해하는데(proteolyzing) 효율적이지 않다(적어도 활성이면(if active at all))고 교시한다 (W. Ruf, A. Rehemtulla, J. H. Morrissey, and T. S. Edgington "Phospholipid-independent and -dependent interactions required for Tissue Factor receptor and cofactor function" J. Bio. Chem., 266, 2158-2166, (1991); M. M. Fiore, P. F. Neuenschwander, and J. H. Morrissey "The biochemical basis for the apparent defect of soluble mutant Tissue Factor in enhancing the proteolytic activities of factor VIIa", J. Bio. Chem., 269 (1), 143-149, (1994)).

예컨대 Butenas (Saulius Butenas, "Tissue Factor Structure and Function", Scientifica (Cairo), 2012: 964862. (2012))에 의하여 요약되듯이, 세포외 도메인의 글리코실화 및 디설파이드들(disulphides)의 역할, 또는 번역후 변형들(posttranslational modifications), 조직 인자의 소스, 구조-활성 관계, 작용(action)의 특정 모드의 명확한 과학적 의견 일치가 없다.

혈액 클로트들(blood clots)이 형성될 수 있기 때문에, 순환(circulation)에서 고농도의 지혈 촉진 화합물이 잠재적으로 치명적일(fatal) 수 있다는 것은 임상 프랙티스에서 잘 알려져 있다. 이 이유로, 출혈을 제어하기 위한 다른 지혈 강화제들(haemostasis enhancing agents) 또는 인자 VII의 전신(systemic) 투여는 뇌를 포함한 여러 부위들에서 원치 않는 치명적인 혈액 클로팅(clotting)을 야기할 수 있고 따라서 이들 치료들은 다른 옵션이 이용할 수 없는 경우에만 사용된다 (O'Connell KA, Wood JJ, Wise RP, Lozier JN, Braun MM, JAMA. 2006 Jan 18; 295(3):293-8).

출혈을 제어하기 위한 국소 치료용 드레싱들은 전신(systemic) 투여에 대한 편리한 대안이 될 수 있다. 이 이유로, 상처들을 관리(managing) 및 보호하고 잠재적으로 치명적인 출혈을 멈출 필요에 대응하여, 지혈 제어(haemostatic control), 상처 치유(healing) 및 치료를 위한 많은 상처 드레싱들(wound dressings)이 개발되었다.

상처 드레싱들은 여러가지 형상들, 크기들 및 재료들, 예컨대 랩들(wraps), 거즈(gauze) 및 테이프(tape)같은 커버 드레싱들 및 이차 드레싱들(secondary dressings)에 더하여, 예컨대 시트들(sheets), 탐폰들(tampons), 또는 봉합사(suture)의 형태인, 층 구조들 또는 복합(composite) 재료들,로 이용가능하다.

다양한 상처 드레싱 재료들의 리뷰는 "Advances in Wound Healing Materials" by Willi Paul and Chandra P. Sharma (Smithers Rapra, 2015)에서 그리고 생물학적 재료들 "Wound Healing Biomaterials - Volume 2: Functional Biomaterials" by Magnus gren (Woodhead Publishing,　2016)에서 발견될 수 있다. 몇몇 안전성 이슈들 및 다양한 제품들 및 솔루션들 및 외상 및 응급 수술에서 국부 지혈제들(topical haemostats)의 사용에 대한 또다른 최근 리뷰는 Chiara et al. BMC Surgery (2018) 18:68에서 발견될 수 있다. 동일한 참조문헌(reference)이 지혈제들(haemostats)이 작용할 수 있는 다양한 외상 및 수술 조건들 및 복잡성을 또한 요약한다.

즉각적일 뿐 아니라 장기적인 상처 관리를 위해 많은 특수(specialized) 타입들의 상처 드레싱들이 개발되었다, 예를 들어: 화상(burns), 경미하거나 중간 정도의 배출 상처들(light to moderately draining wounds), 괴사성(necrotic) 상처들, 압박 랩 하(under compression wraps), 압력 궤양들(pressure ulcers) 및 정맥 궤양들(venous ulcers)에 사용되는, 하이드로콜로이드(Hydrocolloid) 드레싱들. 과도한 체액이 거의 또는 전혀 없는 상처들, 고통스러운 상처들, 괴사성 상처들, 압력 궤양들, 도너 부위들, 이 도 이상의 화상들 및 감염된 상처들에 대해 사용되는, 하이드로겔(Hydrogel) 드레싱들. 알지네이트(Alginate) 드레싱들은 III 또는 IV 기(stage)의 압력 궤양들, 패킹(packing) 상처들, 정맥 궤양들, 및 상처 배농(drainage)의 중간에서 많은 양(moderate to high amounts)에 대해 사용된다. 콜라겐 드레싱은 만성 또는 정지(stalled) 상처들, 궤양들(ulcers), 욕창들(bed sores), 이식 부위들(transplant sites), 수술 상처들, 이 도 이상의 화상들 및 표면적이 넓은 상처에 사용할 수 있다. 이들 타입들의 상처 드레싱들은 또한 모두 수동적인(passive) 방식으로 작용하여 급성 출혈을 멈추고 상처 치유를 촉진한다. 현재 상처 드레싱들 및 기술들의 역사적 개요는 "Wound dressings - a review", Biomedicine (Taipei). 2015 Dec.; 5(4): 22에서 발견될 수 있다.

최근, 과도하거나 또는 제어되지 않는(uncontrolled) 출혈의 상황들에서 사용을 위한 활성(active) 타입의 드레싱들을 제공함으로써 응급 개입(emergency intervention)의 효과를 향상시키기 위한 여러가지 드레싱들이 개발되었다. 이들 드레싱들은 젤라틴(gelatine)- 또는 다당류-기반 드레싱들, 글리콜산(glycolic acid) 또는 젖산-기반 드레싱들 및 콜라겐 매트릭스를 포함하는, 폴리머 네트워크들을 형성할 수 있는 기질들(substrates) 또는 드레싱들과 조합된 트롬빈, 피브린 및/또는 피브리노겐과 같은 활성 성분들(active components)을 함유한다. 그러한 활성 드레싱들의 예들은 USP 6,762,336, USP 6,733,774 및 PCT publication WO 2004/064878 Al에 개시되어 있다.

트롬빈 함유 제품들의 예들은 Pfizer로부터의 Thrombi-Gel 또는 Vascular Solutions/Mallinckrodt 로부터의 "D-Stat Dry"을 포함한다. 인간 피브리노겐 및 트롬빈 함유 드레싱의 예들은 Nycomed/Tadeka로부터의 TachoSil을 포함한다.

이들 드레싱들에서 인간 지혈 성분들(human haemostatic components)의 존재는, 때때로 권장되기는 하지만, 드레싱들의 비용을 증가시키고 병원체들(pathogens)의 전파(transmission)의 위험 및 특정 원료들(raw materials)의 이용가능성(availability)의 의문을 제기한다. Blood Reviews 30 35-48 by Di Minno et. Al, (2016)에서, 혈액/혈장-유래된 그리고 재조합 제품들의 병원체 안전이 논의된다.

조직 인자 함유 제품들의 예들은 특허 출원들 WO 2016/150449, WO 2006/047684 및 WO 2012/142317에 서술되어 있다.

조직 인자 및 드레싱 조합(combination)은 출혈을 멈추고 지혈을 적극적으로(actively) 촉진해보기 위하여 이전에 자세히 서술되었다. 예를 들어, WO 2016/150449 A1은 출혈을 멈추고 지혈을 촉진하기 위하여 상처와 밀접하게 접촉하게 가져와지는, 드레싱에 함침된, 특히 HEK 발현(expression) 시스템으로부터의, 다양한 재조합 가용성 인간 조직 인자 (recombinant soluble human tissue factor) (rshTF) 분자들을 서술한다. 혈류에 의해 조직 인자가 씻겨 나가는(washed away) 것을 방지하기 위한 드레싱에 조직 인자의 어떠한 연결(linkage)의 언급도 없다.

WO 2016/150449 A1의 발명자는, 출혈이 있는(bleeding) 상처에 투여되고 용해되기 쉬운, 동결-건조된(freeze-dried) 조직 인자 조성물을 갖는 것의 중요성을 서술한다. 다양한 당들 및 다른 요소들(components)의 여러 조성물들(compositions)이 언급되며, 모두 동결-건조된 조직 인자가 상처에 적용되고 용해되기 쉽다는 것을 확실히 하기 위한 것이다. 이것은 드레싱 또는 스캐폴드에 공유(covalently) 콘쥬게이트되고(conjugated) 영구적으로(permanently) 고정된 조직 인자를 사용하는 것에 대해(against) 교시한다.

WO 2016/150449 A1에 의해 교시된 결과로 생긴 산물은 인간 손상들의 치료를 위하여 당국으로부터 승인될 것 같지 않고 사용하기에 위험할 안전하지 않은 클로팅 제품을 잠재적으로 만들어 낼 것이다.

WO2016/150449 A1 (D1) 참조문헌은 rshTF를 지지 물질에 고정화하여 rshTF가 방출되고 그것의 지지 물질로부터 씻겨 나가는 것을 저해하는 것을 서술하지 않는다.

전술한 바와 같이, 지혈을 향상시키기 위한 다양한 활성 성분들을 갖는 다수의 드레싱들이 알려져 있다. 그것들은 함침된 활성 성분들을 갖는 드레싱들, 예컨대 지혈을 향상시킬 수 있는 다른 성분들 또는 피브린으로 함침된 드레싱들 또는 Kaolin (Quick-Clot, Z-Medical)으로 함침된 드레싱들을 포함한다.

용어 "함침된(impregnated)"은 물질(substance)의 공간들 또는 구멍들(pores)을 채우는 - 또는 주입하거나(infuse) 또는 흠뻑 적시는(saturate) 방법으로 흔히 그리고 기술적으로 이해된다. 활성 성분들이 어떻게 드레싱에 포함되는지(incorporated) 서술하기 위하여 때때로 대체 용어들 레이싱(lacing) 또는 코팅 또는 건조(dried into)가 사용된다.

기술 용어들에서, 코팅은 일반적으로 기질 또는 스캐폴드로 나타내어지는, 표면에 적용되는 커버링(covering)이다. 코팅된 시스템들은 논의가 되고 있는 활성 성분들을 보유하는(holding) 용액으로 드레싱을 단지 소극적으로(passively) 처리하고, 결국 건조 공정이 뒤따른다.

지혈제 예를 들어 조직 인자 및 인지질 시스템으로 함침된 또다른 상처 드레싱 시스템은 WO 2012/142317 A1에 서술되어 있다. 저자들은 빠른 클로팅 드레싱에 대한 긴급한 필요성들을 서술한다.

안전성이 아닌 효능에 대한 동일한 초점이 Morris et al.,에 의한 WO 2006/047684 A2에 서술되어 있으며, 이는 인간들 및 동물들에서 사용을 위한 치료적(therapeutic) 조성물들에서 사용되는 가용성(soluble) 나노스케일 입자들에 포함되는(incorporated) 천연 또는 재조합 절단형(truncated) 조직 인자에 관한 것이고 그리고 결과로 생긴 TF Nano 디스크들(discs)에서 최대(most) 활성을 갖는 인지질들 및 스캐폴드 단백질에 대한 몇몇 구조들(constructs)을 서술한다.

WO 2006/047684 A2는 명확히 담체 또는 드레싱 재료에 직접 콘쥬게이트된 조직 인자를 사용하는 것과 동떨어지게 교시한다(teaches away). 출원은 혈액 클로팅을 증가시키기 위한 기능적 시스템을 얻기 위하여 인지질-단백질 입자 구조들을 사용하는 것을 우리에게 교시한다. 입자들의 성분들, 또는 입자들, 표면들에 조직 인자의 직접적 연결(linkage)의 언급이 없고 그것들은 분명히 입자들로부터 혈관 바탕(vascular bed)으로 유리 조직 인자를 씻겨 내보내는(washing out) 안전성 문제를 예상하지 않았다.

특수 타입의 상처 드레싱의 또다른 예가 특허 출원 WO 2013/007266에 서술되어 있고, 여기서 상처 드레싱 매트릭스는 상처에서 지혈을 향상시키기 위하여 제어된 방식으로 연장된(extended) 기간에 걸쳐 상처로 유리 트롬빈을 천천히 방출하도록 디자인된 것으로 서술된다. 여기에서, 트롬빈은 전기 분무(electro spraying) 기술들에 의해 폴리우레탄 폼 재료의 상부(top)에 분포된다.

또한, 상처 드레싱들은 드레싱이 상대적으로(relatively) 빠르게 분해될지(degrade), 그렇지 않으면 시간이 지나면서(over time) 흡수될지에 따라 흡수성(absorbable) 또는 비-흡수성(non-absorbable)으로 분류될 수 있다. 폴리우레탄은 비-흡수성 드레싱의 예인데, 예컨대 산화 셀룰로오스 또는 키토산은 시간이 지나면서 흡수된다(absorbable).

전장 사상자들(battlefield casualties)에 사용을 위해 선택되는 두 자주 이용되는 제품들은 깊지 않은 자상들(superficial cuts) 또는 훼손된(damaged) 정맥들(veins)에 의해 자주 야기되는 상대적으로 마이너한 출혈들과 관련되어 사용되는 제올라이트 그래뉼레이트(zeolite granulate), 제올라이트 비드들(beads) 또는 카올린(kaolin)-코팅된 거즈 QuikClot (Z-Medica, Wallingford, CT) 제품들 및 키토산-기반 드레싱들 HemCon (HemCon Medical Technologies, Portland, OR)에 초점을 맞추어 왔다.

이용가능한 드레싱들 중 어느 것도 고정된 조직 인자를 기반으로 하지 않는다.

활성 성분들이 누출되는(leaking) 드레싱들에 대한 안전성 우려들(concerns)은 Polish Journal of Veterinary Sciences Vol. 19, No. 2 (2016), 337-343을 포함하여, 여러 번 서술되어 왔다. 현장(field)에서의 이러한 우려들에도 불구하고, 혈류(blood stream)로 조직 인자의 누출(leakage) 그리고 그것 때문에 환자에게 상당한 위험을 제기하는(posing) 바람직하지 않은 혈액 응고의 촉진과 관련된 안전성 위험들에 대하여 알려진 드레싱들에 초점이 거의 없었다.

우리가 아는 한, 모든 선행 기술은 명백하게 사용에 안전하면서(secure in use), 중증(severe) 헤모리지(haemorrhage)를 멈추기 위한 드레싱에 직접적으로 조직 인자의 영구적인 연결을 예상하지 않으며 동떨어지게 교시한다.

따라서, 알려진 상처 드레싱들로 치료의 바람직하지 않은 부작용들의 환자의 위험을 제한하기 위해 알려진 드레싱과 관련된 안전성 우려들을 다루는(addressing) 새로운 상처 드레싱들의 개발에 대한 필요성이 있다.

도 1은 본 발명의 원리, 활성화된 상처 드레싱에 대한 조직 인자의 고정화를 보여준다. 다양한 길이들 및 타입들의 링커들 및 드레싱에 단백질을 고정시키는(anchoring) 단일 또는 다중(multiple) 연결들. 짧거나 길쭉한(elongated) 링커들. 대부분 반 유연성인 링커들.
또한, 다음 도면들 1-7에서 사용되는 다양한 요소들이 도 1에 요약되어 있다.
도 2는 드레싱에 조직 인자를 결합시키는 다양한 가능한 방법들의 예들을 설명한다(illustrates). (a) 짧은 링커를 통해, (b) 켄칭되고(quenched) 사용되지 않는 몇몇 링커들 및, 더 긴 링커들을 통해, (c) 중성(neutral) 또는 활성 성분들과 함께 고정된, (d) 소위 멀티포인트 부착인, 몇몇 포인트들에서 조직 인자를 가교 및 결합하는 링커들을 통해, (e) 예를 들어 인자 VII을 포함하는, 다른 활성 성분들로 덮이고 드레싱에 고정된 조직 인자, 또는 (f) 흡수성인, 드레싱에 고정된 조직 인자. 다양한 예들이 조합될 수 있다.
도 3은 폴리머들 및 재료들을 조합하여, 드레싱에 조직 인자를 결합하는 다양한 가능한 방법들의 예들을 설명한다. (a) 더 긴 스페이서 암들(arms)을 주는, 폴리머, 예를 들어 PEI, 키토산 또는 폴리라이신을 통해 드레싱에 고정된 조직 인자, (b) 덴드리머(dendrimeric) 또는 분지된 링커 시스템을 통해 드레싱에 고정된 조직 인자, (c) 추가적인 화합물들과 함께 젖거나 또는 건조한(dried) 매트릭스에 있고 그리고 예를 들어 인자 VII를 포함하는, 다른 활성 성분들로 덮이고 드레싱에 고정된 조직 인자 (d) 다른 드레싱 겹들(layers)과 조합되고, 드레싱에 고정된 조직 인자. 다양한 예를이 조합할 수 있다.
도 4는 본 발명의 원리를 보여준다, (a) 조직 인자에 안정화 효과(들)을 가질 수 있는, (예컨대 BSA) 다른 단백질들 및 조직 인자의 상처 드레싱에 공유 부착, (b) 봉합사, 선형 트레드(linear tread)에 조직 인자의 공유 부착.
드레싱에 고정된 조직 인자에 의해 촉매작용되는(catalysed), 클로트를 형성하는 가교된 피브린 네트워크의 형성을 설명하는 도 5.
인자 VII 및 드레싱에 고정된 조직 인자에 의해 촉매작용되는, 클로트를 형성하는 가교된 피브린 네트워크의 형성을 설명하는 도 6.
도 7은 혈관(blood vessel)에서 손상으로부터 출혈을 멈추기 위해 혈액 클로트의 형성을 촉매작용하는 드레싱에 고정된 조직 인자로 본 발명의 원리를 보여준다.
비닐설폰(vinylsulfon) 활성화된 드레싱을 야기하는, 하이드록실릭(hydroxylic) 드레싱 재료의 디비닐설폰(divinylsulfon) (DVS) 활성화의 반응 도해(scheme)를 설명하는 도 8. 이 활성화된 드레싱은 단백질, 예를 들어 조직 인자와 반응할 수 있다. 더 낮은 pH에서, 티올들이 먼저 반응할 것으로 예상되고, 더 높은 pH에서, 아민들(amines)이 반응하여 공유 결합을 형성할 것이다.
도 9는 반응성(reactive) 에폭시(epoxy) 그룹 활성화된 드레싱을 야기하는, 하이드록실릭 드레싱 재료의 에피클로로히드린 활성화(activation)의 반응 도해를 설명한다. 이 에피클로로히드린 활성화된 드레싱은 단백질, 예를 들어 조직 인자와 반응할 수 있다. 더 낮은 pH에서, 티올들이 먼저 반응할 것으로 예상되고, 더 높은 pH에서, 아민들(amines)이 반응하여 공유 결합을 형성할 것이다.
도 10은 실시예 3에서 보여지는 다양한 양의 커플링된 형광 표지된 테스트 단백질 BSA를 가진 드레싱의 사진들을 보여준다.
도 11은 실시예들 4, 5 및 6에서 실험 개시에 따른 엑스-비보(ex-vivo) 혈액 클로팅 실험의 사진들을 보여준다.

발명의 개요

첫 번째 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 혈액 응고를 방지하면서 신속한 지혈을 촉진하기 위한 안전한 시스템에 관한 것이며, 상기 시스템은 조직 인자 성분(Component)으로도 나타내어지는, 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체(variant), 또는 적어도 그것의 세포외 도메인, 및 드레싱 재료, 예를 들어 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체를 보유하기 위한 매트릭스를 포함하고, 여기서 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체는 드레싱 재료와 관련되고, 그로써 혈액 응고가 개시될 수 있는 환경과 같은, 생리학적인(physiological) 환경에 노출될 때 드레싱 재료 및 조직 인자 또는 그것의 변이체 사이의 상호 작용 또는 연결이 조직 인자 또는 그것의 변이체가 드레싱 재료로부터 분리되는(dissociating) 것을 방지한다.

따라서, 구체적으로 말하면, 조직 인자 (TF) 또는 그것의 변이체, 및 생리학적인 환경에 노출될 때 드레싱 재료로부터 조직 인자 또는 그것의 변이체가 분리되는 것이 방지되는 식으로 조직 인자 또는 그것의 변이체가 연결된(linked) 드레싱 재료를 포함하는 시스템이 제공된다.

본 발명에 따른 시스템은 전신(systemic) 혈액 응고와 같은 바람직하지 않은 혈액 응고를 방지하면서 신속한 지혈을 촉진하는 데 적합하며, 따라서 예를 들어, 군대 또는 테러 관련 전투, 심각한 사고들(severe accidents), 및 다른 타입들의 손상(injury) 같은 다양한 원인(origin)으로부터 외상 피해자들인, 중증(severely) 출혈하는(bleeding) 외상 환자들의 치료를 위한 개선된 레메디(remedy)를 제공한다. 본 발명에 따른 시스템은 더 구체적으로 말하면 내생(endogenous) 트롬빈 버스트 및 지혈을 유도하는 외인성 및 내인성 응고 인자들을 함유하는 출혈과 외인성 인자를 조합함(combining)으로써 혈액 클로팅의 향상되고 효율적인 개시를 제공하고, 그것에 의하여 특히 상기 출혈 외상의 맥락에서, 지혈의 효율적인 국소적인 제어를 얻기 위한 적절한 접근법을 제공한다.

게다가, 본 발명에 따른 시스템은 조직 인자와 같은 외인성 인자를 사용하는 안전한 방법을 제공한다. 여기에서 외인성 인자는 혈류로 조직 인자 방출의 위험을 극복하는 출혈 외상 환자들의 치료 동안 드레싱에 연결되고, 이는 다른 한편 드레싱에 적용되는 "유리" 외인성 조직 인자를 사용하는 것을 시도하는 경우일 수 있고, 따라서 만약 중증 출혈하는 영역으로 마구잡이로(indiscriminately) 혼합되면, 거기에서(where) 인자가 혈관 바탕으로 들어가 혈관 바탕에서 전신(systemic) 혈액 클로트 형성의 탁월한(eminent) 위험을 쉽게 야기할 수 있다.

따라서, 본 발명의 핵심은 지혈을 개시 및 촉진하고 중증 헤모리지(severe haemorrhage)를 멈추는 - 동시에 조직 인자가 드레싱에 단단히(securely) 연결되어 있기 때문에, 사용하기에 안전하다는 것이다. 단백질은 지혈을 개시하기 위해 여전히 활성이지만, 영구적으로 고정되거나 또는 결합된다.

본 발명의 중요한 측면은 혈류, 창강(wound cavity) 또는 신체로 활성 조직 인자의 낮거나 또는 없는 누출(leakage) 때문에 효능 및 안전성 측면 둘 다의 특정 조합이다.

연결(linking)에 의한 영구적인 고정화(immobilization)에 의한 생물학적으로 활성인 조직 인자 단백질의 영구적인 결합은 누출된(leaked) 조직 인자가 혈관계(vascular system)에서 다른 곳들에서 제어되지 않는 지혈을 개시하는 것을 방지하고, 출혈의 부위에서 효율적인 지혈 둘 다를 얻기 위한 중대할 뿐 아니라 새로운 방법이다.

이 측면은 드레싱이 손상에 대해 기계적으로(mechanically) 압축되지만(compressed), 많은 양의 혈액이 연속적으로 흐르고 드레싱에서 결합되지 않은 조직 인자를 쉽게 씻어낼 수 있는, 중증 출혈들 및 헤모리지에 특히 중요하다. 조직 인자의 누출은 잠재적으로 용납할 수 없는 안전성 위험인, 혈관계에서 위험한 혈전증을 개시하고 야기할 수 있다.

본 발명의 이 측면은 최종 드레싱이 예를 들어, EMA 또는 FDA에 의하여 엄격한 정부 규제(regulatory) 가이드라인들에 의해 제어되기 때문에, 더 중요하다. 준수하기 위하여, 효능 및 안전성이 둘 다 입증되어야 한다.

조직 인자는 지혈을 촉매 작용하고(catalyses) 가교된 피브린의 형성된 네트워크에 참여하지 않는다. 그러므로, 드레싱 및 형성된 네트워크는 공유적으로 연결되어(covalently connected) 있지 않다. 이것은 형성된 네트워크에 포함되는 단백질 성분들을 이용하는 대부분의 다른 시스템들과 대조된다. 이것은 드레싱이 더 쉽게 제거되거나 바뀔 수 있기 때문에 유리하다.

출혈 환자에 대한 실제적인 적용에서, 바람직한 혈액 응고는 드레싱을 적용하여 기계적으로 안정적인 네트워크의 빠른 형성에 의하여 시작된다. 이것은 혈액의 겔화(gelling) 및 혈액 클로트들의 형성으로 보여지며, 이는 끈적거리고(sticky) 점탄성(viscoelastic) 특성들을 갖는다. 이것은 지혈, 훼손된 관(vessel)으로부터 혈액 상실의 종료, 이어서 수선이 이어지는 것을 야기한다.

본 발명에 따른 시스템은 인자 VII 또는 그것의 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 시스템은 공-활성제들(co-active agents), 예를 들어 키토산, 염들, 제올라이트들, 카올린, 트롬빈, 피브린, 피브리노겐, 그리고 시스템의 효율을 추가로 향상시키고, 그리고 시스템의 장기 저장 수명(prolonged storage life)을 제공하는 안정화제들(stabilizing agents), 예를 들어 탄수화물들, 코팅 단백질들, pH 버퍼들, 세정제들(detergents), 수분 및 습윤 조절제들(moisture and wetting controlling agents), 라디칼 켄처들(radical quenchers), UV 흡착제들(adsorbers) 및 항미생물 제제들을 추가로 포함할 수 있다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 전신 혈액 응고를 방지하면서 신속한 지혈을 촉진하기 위한 본 발명의 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다. 그러한 방법에서 시스템은 출혈이 멈추는 것을 가능하게 하는 기간(a period of time) 동안 신체의 손상된(injured) 부분에 적용된다.

발명의 상세한 서술

본 발명은 드레싱 재료 상에 고정된 약리학적으로(pharmacologically) 활성인 제제(active agent)를 포함하는 시스템 및 인간과 같은 포유동물의 외상과 관련된 심각한 출혈의 효율적인 지혈로 이루어진 치료에서의 그것의 용도에 관한 것이다. 시스템은 신속하고 지속된(sustained) 지혈을 촉진한다.

더 구체적으로 말하면, 시스템은 드레싱 재료 상에 고정된 조직 인자에 의해 개시되는 신속한 지혈을 촉진하여, 화합물이 혈류로 방출되는 것을 방지한다. 그렇게 함으로써, 화합물은 혈관 손상(vascular injury) 상에 직접 배치된(placed) 드레싱 재료에 연결된 조직 인자의 적용의 부위에서 바로(directly) 시작하는 응고를 개시할 수 있다. 이것은 사용하기에 안전한 동시에 효율적인 지혈을 야기한다.

따라서 본 발명은 부위에서 공-제제들(co-agents)과 함께 또는 공-제제들 없이 활성 외인성 제제의 국소 적용을 가능하게 하고 거기에서 그것들은 인자 VII/VIIa와 직접적인 상호작용에 의해 그것들의 약리학적 효과를 발휘하고 거기에서 외인성 제제가 생물(organism)의 혈관 바탕에 들어가는 것이 방지되고 그렇게 함으로써 혈관-내(intra-vascular) 시스템(systemic) 노출을 저해한다.

본 발명에서 사용되는 조직 인자는 하기 추가로 서술되는 대로 조직 인자의 임의의 변이체일 수 있고 세포외 도메인으로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 상기 서술된 대로 조직 인자의 기능과 관련하여 알려진 것을 고려하여, 조직 인자의 막관통 부분이 없는 세포외 도메인이 응고 카스케이드를 개시하고 그때문에 지혈에 적극적으로(actively) 기여할 수 있다는 것은 매우 놀랍다.

게다가, 드레싱 재료에 단단히(firmly)(공유적으로(covalently)) 연결된 조직 인자가 조직 인자에 인자 VII/VIIa의 올바른(correct) 결합을 방지하지 않고, 따라서 연결된 조직 인자가 클로팅 카스케이드를 개시하는 것을 할 수 있게 하는 것은 놀랍다.

또한, 발명자들은 드레싱 재료에 단단히(공유적으로) 연결된 조직 인자와 함께 결합되지 않은 그리고 유리 인자 VII가 지혈의 효율성 및 속도에 대하여 둘 다, 응고 카스케이드를 향상시킨다는 것을 발견하였다.

게다가, 본 발명은 동일한 문제를 해결하는 것을 목표로 하는 다른 드레싱 기술들과 양립 가능(compatible)하다. 예를 들어, 제올라이트 및 카오린 함유 드레싱들, 키토산-기반 드레싱들 또는 트롬빈 또는 피브리노겐을 함유하는 드레싱들과 조합으로. 또 다른 예들은 발명의 배경 섹션에서 언급되며 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명은 비-흡수성 및 흡수성 드레싱 재료들을 포함하여 여러가지 형상들, 크기들 및 재료 타입들과 양립가능하다.

다음에서, 본 발명과 관련된 보조-인자들(co-factors) 및 조직 인자, 조직 인자의 소스(source), 인자 VII, 고정화, 고정화의 방법들, 가교제(crosslinker), 링커-시스템, 드레싱들이 더 상세히 서술된다.

조직 인자의 정의

인자 III 또는 CD142로도 알려진 조직 인자 (TF)는 응고 인자 VII 및 활성화된(activated) 인자 VII (인자 VIIa)에 대한 고-친화성(high-affinity) 수용체로 기능하는(functioning) 세포외 도메인을 가진 막관통 당단백질이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "조직 인자(Tissue Factor)" 또는 "TF"는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 개(dog), 고양이, 포르사인(porcine), 젖소(cow) 및 인간 조직 인자를 포함하는, 내생 또는 재조합, 적어도 세포외 도메인을 포함하는, 임의의 포유동물 조직 인자를 나타낸다.

인간(외인성) 조직 인자는 세포외, 막관통, 및 세포질 도메인들을 구성하는(constituting) 263개 아미노산들로 구성된다. 219 개 아미노산들로 구성된 가용성 조직 인자는 세포외 도메인에만 해당한다.

인간 조직 인자의 세포외 도메인은 다음의 DNA 및 아미노산 서열을 갖는다 (각각 SEQ ID NO: 1 & 2에 보여진다).

본 발명의 맥락에서, "조직 인자의 변이체(a variant of Tissue Factor)"는 포유동물 전혈과 반응하기 위하여 드레싱 구조에 공유적으로 또는 화학적으로 연결될 때, 전사 인자의 활성이 유지되는 조건에서(provided) 인자 VII 및/또는 인자 VIIa과 결합할 수 있는 임의의 변이체로 해석되어야 한다. 따라서, 변이체는 상기 서술된 인간 조직 인자의 세포외 도메인, 또는 여기에서 서술된 임의의 다른 조직 인자 분자들, 분자들 또는 부분들일 수 있다. 인자 VII에 결합하는 조직 인자 변이체의 능력은 각각의 단백질들의 태그된(tagged) 버전들의 표준 풀 다운 분석들(standard pull down assays)과 같은 임의의 적합한 상호작용 분석에 의해 평가될 수 있다.

포유동물 응고 경로는 고도로 보존되고(conserved) 강력한(robust) 메커니즘이다. National Center for Biotechnology Information (NCBI)로부터의 Standard Protein BLAST와 같은, 잘 알려진 정렬(alignment) 소프트웨어를 적용하면, 인간 조직 인자의 세포외 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID 2)이 마우스 조직 인자의 세포외 도메인과 59% 동일성(identity), Norwegian 래트(rat)와 59%, 기니피그와 69%, 고양이와 79%, 개(dog)와 76%, 소(cattle)와 75% 및 돼지(pig)와 74%를 공유한다는 것이 인식될 수 있다. 종들에 걸친(across) 조직 인자의 아미노산 서열 보존성(conservatism)에 더하여, 재조합 가용성 인간 조직 인자는 래트 전혈에 노출되는 때 그리고 마찬가지로 재조합 가용성 인간 조직 인자가 포르사인(porcine) 전혈에 노출되는 때에 응고를 개시하는 것을 할 수 있었다는 것이 발견되었다.

따라서, 본 발명의 맥락에서, "조직 인자의 변이체"는 적어도 세포외 도메인을 포함하고 세포외 도메인이 인간 조직 인자의 세포외 도메인과 적어도 69% 단백질 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75% 단백질 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 79% 단백질 서열 동일성, 또 더 바람직하게는 적어도 85% 단백질 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90% 단백질 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 단백질 서열 동일성과 같은, 적어도 59% 단백질 서열 동일성을 공유하는(shares) 조직 인자로 추가로 정의될 수 있다.

FVIIa와 상호작용들과 관련된 모티프들(Motifs)은 aa16-aa24, aa37-aa51, aa56-aa61, aa74-aa76, aa91-aa96, aa109-aa110, aa128-aa135, aa140, aa158-aa164, aa186-aa188, aa203-aa209 를 포함한다.

종들에 걸친 보존된 서열들은 aa8-aa79 (AY NLTWKSTNFK TILEWEPKPV NQVYTVQIST KSGDWKSKCF YTTDTECDLT DEIVKDVKQT YLARVFSYP) 및 aa91-aa214 (EPLYENSPEF TPYLETNLGQ PTIQSFEQVG TKVNVTVEDE RTLVRRNNTF LSLRDVFGKD LIYTLYYWKS SSSGKKTAKT NTNEFLIDVD KGENYCFSVQ AVIPSRTVNR KSTDSPVECM GQEK)를 포함한다. 특정 보존된 서열들은 aa9-aa70 and aa108-aa210을 포함하고 더욱 더 보존된 것은 특정 서열들 aa17-aa19, aa34-aa39, aa52-aa68, aa125-aa129, aa132-aa137, aa159-aa167, aa184-aa187 및 aa209 이다. 고도로(highly) 보존된 서열들은 종들에 걸쳐 조직 인자의 세포외 도메인들의 전반적인(overall) 큰 상동성(homology) 및 동일성에 반영된다.

여기에서 사용되는 대로 조직 인자의 변이체는 상기-서술된 보존된 서열들 또는 모티프들 중 하나 이상을 포함하는 분자일 수 있다.

다른 종들과 동일성:

조직 인자의 소스

본 발명의 맥락에서 사용에 적합한 조직 인자는 포유동물 전혈로부터, 바람직하게는 인간 전혈로부터 또는 표준 재조합 기술에 의하여 얻어질 수 있다.

인간 배아(embryonic) 신장 HEK, 인간 293/T, HEK-F, 햄스터(hamster) BHK 21, 중국 햄스터 난소 세포들 (Chinese Hamster ovarian cells) (CHO), SF9 곤충(insect), 마우스(mouse), E. coli, 또는 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 세포 시스템들의 사용을 포함하는 표준 산업(industrial) 재조합 기술.

인간 세포들을 포함하는 포유동물 세포들에서 수행되는 번역 후 변형(Posttranslational modification)은 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 카르복실화(carboxylation), 팔미토일화(palmitoylation) 및 뉴로아미노-글리코실화 (neuramino-glycosylation) 등과 같은, 몇몇 물리적 및 화학적 특성들에 영향을 미치며, 이는 종종 응고 인자의 특성들에 매우(significant) 중요하다.

인간 글리코실화 때문에 HEK293ts 세포들과 같은 인간 세포주 사용이 선호된다. 일반적으로 재조합 단백질들의 글리코실화, 특히 인간 대상체들(subjects)에게 잠재적인 투여가 예정된(destined) 그것들은, 이전에 여겨졌던(believed) 것보다 훨씬 크게 중대하게 중요하다. 글리코실화는 생물학적 활성, 기능, 순환으로부터의 클리어런스(clearance from circulation) 및 결정적으로 항원성(antigenicity)에 깊이 영향을 미친다.

A Brooks Review (Brooks, S A, Molecular Biotechnology, (2004) Vol 28, 241-256(16))은 인간의 N- 및 O-연결된 단백질 글리코실화의 간단한 개관(overview)을 주고, 비인간(nonhuman) 종의 세포들의 글리코실화 가능성의 알려진 것을 요약하고, 그리고 생명공학 산업에 대한 영향들(implications)을 제시한다.

세포주가 세포 현탁 배양(suspension cell culture)으로 무혈청 배지(serum free medium)에서 배양될 수 있기 때문에 HEK293ts 세포들이 더 선호되고, 세포 배양(cell culture)은 3 백만 세포들/ml 초과(over)의 세포 농도로 또는 심지어 최적 조건 하에서는 1 천만 세포들/ml의 세포 배양 농도까지, 그리고 EX-CELL™293을 이용하여 비슷한(comparable) Bioreactor Wave 백 또는 GE 당 100 리터까지 일회용 세포 배양 백들(disposable cell culture bags)로 배양하는 단일 사용 생물반응기(bioreactor) 시스템들 (GE-Wave)에서 높은 세포 밀도 관류 공정(High cell density perfusion process)과 같이 이들 세포들이 배양되는, 용기(vessel)에서 필요한 가스들 및 압력의 공급 및 최적 산소 공급(oxygenation)를 가진 pH 6.8 - 7.4 사이와 같은, 극히 변함없는(extremely constant) 생리학적인 pH 레벨들 하 진행할(run) 때 훨씬 더 높이 확장될 수 있다.

하나의 바람직한 구현예에서, 재조합 인간 조직 인자는 HEK293ts 세포들에서 서열 SEQ ID 1을 갖는 조직 인자를 발현함으로써 얻어진다.

임의의 적합한 발현 벡터가 조직 인자의 발현을 위해 사용될 수 있으며 예를 들어 클로닝(cloning)을 위한 pST2 벡터 및 클로닝 후 pST2-HF3 이다.

변이체 또는 세포외 도메인을 포함하는 조직 인자는 또한 합성 방법들에 의해, 또는 재조합 방법들 뒤이어 화학적 변형들을 조합함으로써 합성될 수 있다. 보호되는 아미노산들 또는 다른 다기능(multifunctional) 빌딩 블록들을 함께 단계적으로(stepwise) 커플링하여 펩타이드들을 단계적으로 연장하는(elongating) 합성 방법들은 예를 들어 고전적인 Merrifield 고상 펩타이드 합성 (Merrifield solid phase peptide synthesis) (SPPS) 또는 용액에서 잘-서술된다. 다양한 화학 선택적(chemo selective) 및 직교(orthogonal) 보호 그룹들은 특히 Boc, Fmoc, 벤질(Benzyl) 또는 t-But을 포함한다. 아마이드(amide) 형성은 예를 들어 카르보디이미드들(carbodiimides), 효율적인 활성 에스테르, HATU/HOAt 또는 유사한 반응들을 사용하여 수행된다. SPPS 시약들 및 방법들의 개요는 예를 들어 Merrifield, R. B. In Peptides: "Synthesis, Structures and Applications"; (Gutte, B., Ed.); Academic Press: San Diego, CA, 1995; pp 93-168 또는 Fernando Albericio (ed.): "Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide", CRC Press 2000에서 발견될 수 있다.

인자 VII의 정의

인자 VII, 혈액-응고 인자 VIIa, 활성화된 혈액 응고 인자 VII, 프로콘베르틴(proconvertin) (EC 3.4.21.21)으로도 알려짐,은 조직 인자-유도된 응고 (외인성 경로)의 개시에 대단히 중요한 간에서 합성되는 비타민 K-의존적 자이모겐(zymogen), 50-kDa이다. 본 발명의 맥락에서, 인자 VII는 종종 인자 VIIa로 나타내어지는, 인자 VII의 활성화된 형태를 포함한다. 재조합 인간 인자 VIIa (eptacog alfa, NovoSeven, Novo Nordisk, Denmark)를 포함하여, 혈우병(hemophilia) 환자들에서 제어되지 않는 출혈의 치료, 및 재조합 활성화된 인자 VII의 바이오시밀러(biosimilar) 형태가 (AryoSeven, AryoGen, Iran) 개발되었다.

고정화

본 발명에 따른 시스템은 바람직하게는 드레싱 재료 상(on)에 고정된 세포외 도메인, 또는 그것의 임의의 변이체인, 고정 인자를 포함한다.

용어 “고정된(immobilized)” 및 “연결된(linked)”은 상호교환가능하게(interchangeably) 사용되며 본 발명의 맥락에서 예컨대 시스템이 포유동물 전혈에 노출되는 때인, 생리학적인 조건들(conditions) 하 조직 인자가 드레싱 재료로부터 방출되는 것을 방지하기에 충분히 높은 세기(strength)를 갖는 드레싱 재료에 대한 조직 인자의 분자 결합으로 이해되어야 한다. 이것은 예를 들어 형광(fluorescent) 라벨 기술들에 따라 측정되는 때 조직 인자의 상당한 측정가능한(measurable) 누출을 방지하기에 충분히 높은 결합 세기(binding strength)를 갖는 드레싱 재료 및 조직 인자 사이에 연결된 분자 결합(molecular binding)을 제공함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 결합 세기는 적어도 예를 들어 형광 또는 방사성(radioactive) 라벨 기술들에 의해 측정되는 대로 스트렙타비딘(streptavidine) 및 비오틴 사이 참조(reference) 결합 세기의 팩터(factor) 1/100000 이다. 비오틴 및 스트렙타비딘(streptavidin)에 대한 해리 상수(dissociation constant)는 약(approx.) 10^-15 mol/L 이다.

드레싱 재료에 대한 조직 인자의 고정화를 달성하기 위하여 적용되는 분자 결합은 바람직하게는 적어도 10^-10 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 10^-12 mol/L의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 그러한 분자 결합의 선호되는 예는 공유 결합이다.

용어 공유 또는 거의(near) 공유 결합(covalent binding)은 생리학적인 조건들에서 바람직한 안정한 화학적 공유 결합들을 통한 드레싱 재료에 대한 활성 화합물의 실질적으로 비가역적인(practically irreversible) 결합이다.

선호되는 공유 결합들(covalent bonds)은 10 kcal/mol 초과, 바람직하게는 30 kcal/mol 초과이고 더욱 더 바람직하게는 75 kcal/mol 초과의 결합 해리 에너지 (평균 결합 해리 엔탈피(mean bond dissociation enthalpy))를 갖는, C-C, C-O, C-N, C-S 또는 Si-O 화학적 결합들 및 이것의 조합들이고, 상처 내로 활성 성분들의 방출의 위험이 없거나 또는 거의 없는 안정한 결합들을 야기한다.

고정화의 방법들

특정 펩타이드 서열들 및 시약들의 조합에 의해 그리고 보호 그룹들이 없이 레기오(regio) 및 화학(chemo) 선택적 커플링 방법들은 정확한 커플링 부위(site)를 인도하고(guide) 펩타이드 기능성(functionality)을 보존할 수 있다. 다양한 “라이게이션(ligation)” 방법들을 포함하여 몇몇 방법들이 알려져 있다. 초기 개관(overview)은 예를 들어 “Methods and strategies of peptide ligation” by James Tam et. al. in Biopolymers. 2001; 60(3): 194-205 및 단백질 합성 “Chemoselective Ligation and Modification Strategies for Peptides and Proteins” Christian P. R. Hackenberger and Dirk Schwarzer in Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 10030 - 10074에서 발견될 수 있다.

드래싱 재료에 커플링 및 번역-후 변형들(post-translational modifications)에 유용한 다양한 라이게이션 방법들은 Staudinger 라이게이션, 아자이드-알킨 클릭(azide-alkyne click) 반응들, 및 금속 매개 복분해 (metal mediated metathesis) 반응들을 포함한다.

일부 라이게이션 방법들, 또는 때때로 '바이오직교 화학(bioorthogonal chemistry)'으로 나타내어진다.는 예를 들어 시스테인(cysteine), 라이신(lysine) 또는 티로신(tyrosine)에 대해(towards) 화학 선택적이다. 게다가 일부 라이게이션 기술들은 글리코실화된(glycosylated) 단백질들과 양립가능하며 복잡한(complex) 환경들에서 사용된다.

최신 기술(state of art)을 커버하는 일반적인 리뷰는 예를 들어 Advances in Chemical Protein Modification by Boutureira and Bernardes in Chem. Rev. 2015, 115, 5, 2174-2195 및 Spears and Fascione에 의해, Site-selective incorporation and ligation of protein aldehydes", in Org. Biomol. Chem., 2016, 14, 7622 를 포함하는, 많은 참고문헌들에서 발견된다.

특히 관련된 것은 활성화된 드레싱 재료에 예를 들어 p-메톡시 페닐 에스테르(p-methoxy phenyl ester)와 예를 들어 선택적 아민 아실화(selective amin acylation)에 의해 화학 선택적 커플링에 대해 준비된(ready), Gly-His 또는 Lys-His 태그들과 같은, 최종 기능성(end functionality)을 갖고 CHO 또는 HEK 세포들로부터 발현되는 조직 인자이다. Gly-His 태그들은 Martos-Maldonado et.al. in "Selective N-terminal acylation of peptides and proteins with a Gly-His tag sequence", in Nature Communications volume 9, Article number: 3307 (2018)에 서술되어 있다.

본 발명의 맥락에서 적합한 대체 분자 결합 메커니즘들은 그것들이 10^-10 mol/L 초과, 더 바람직하게는 적어도 10^-12 mol/L 의 드레싱 재료 및 조직 인자 사이에 해리 상수를 야기한다면(provided), 이온(ionic) 또는 비-공유(non-covalent) 결합들이다.

다른 바람직한 결합들은 비오틴-스트렙타비딘, 렉틴 쌍들(lectine pairs), DNA-DNA, DNA-PNA, DNA-LNA, 금속-킬레이트들 또는 다른 리간드 쌍들을 포함하며, 이는 거의 공유 결합 세기들(covalent binding strengths)을 야기한다.

가교제들 & 링커 시스템들

드레싱 재료에 대한 조직 인자의 고정화는 링커 또는 링커 시스템을 통한 간접적인 결합에 의해 또는 조직 인자 및 드레싱 재료 사이의 가교제를 사용하는 직접적인 분자 결합에 의해 달성될 수 있다.

친화성 크로마토그래피 컬럼 미디어(affinity chromatography columns media), 멤브레인들 및 진단 장치들을 포함하는 기질들에 단백질들을 고정하기 위한 컨쥬게이션(conjugation) 화학에서 링커들 및 가교제들의 사용은 큰 이용 가능한 소스의 문헌(literature) 및 경험적(empiric) 지식과 함께, 기술적으로 성숙하다. 많은 일반적인 참고문헌들이 리뷰 책들 “BioConjugation Techniques” (Elsevier 2013, 3. ed), “Immobilized affinity ligand techniques” by Greg T Hermanson, A. Krishna Mallia, Paul K Smith (Academic Press, 1992), ”Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking” by Shan S. Wong (CRC Press 1991) 및 ”BioConjugation Techniques - Strategies and Methods by Sonny S. Mark (Springer, 2011) 를 포함하여, 이용가능하다.

드레싱 재료에 조직 인자를 고정시키는(anchors) 링커는 바람직하게는 생리학적인 pH에서 물에서 반-유연성(semi flexible)이어서 스트레치된 구성(stretched configuration)을 가능하게 하고 그렇게 함으로써 지혈 개시를 위한 더 높은 효율이 되어야 한다.

본 문맥에서, 링커의 길이는 결합들의 수에 의해 정의되며, 여기서 결합들은 C-C, C-N, C-S, C-C(O) 및/또는 C-O 결합들이다. 본 발명에 따라 선호되는 링커는 아마이드(amide), 카바마이드(carbamide), 설폰들(sulfones), 에테르들(ethers) 및 입체 장애 그룹들(sterically hindered groups)을 포함하며, 이는 링커가 완전히 유연해지는(flexible) 것을 방지한다.

링커는 전통적인 선형 또는 가교의 및 분지된(branched) 타입들일 수 있다. 이것들의 예들은 선형 PEG 링커들 또는 아크릴아마이드(acrylamide) 기반 분지된 링커들을 포함한다.

게다가, 조직 인자는 고밀도(high density) 덴드리머(dendrimer) 시스템 상에 클러스터들(clusters)로 또는 개별적으로 드레싱 재료에 고정될 수 있다. 다중분지된(multibranched) 또는 덴드리머 링커 시스템들의 예들은 (예를 들어 Merck로부터 이용가능한) 조직 인자에 콘쥬게이트될 수 있는 상이한(different) 표면 작용기들(surface functional groups)을 갖는 상이한 세대들(generations)의 폴리아미도아민(Polyamidoamine) (PAMAM) 덴드리머들을 포함한다. 진단 및 제약(pharmaceutical) 적용들로부터의 다른 잘-알려진 시스템들은 폴리라이신(polylysine), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 폴리에스테르(polyester)-기반 덴드리머들 및 덴드론들(dendrons)을 포함한다.

링커들을 화학적으로 도입하는 대신, 그것들은 또한 잘-알려진 분자량과 특성들을 가진 폴리머(polymeric) 링커들을 만들어내고 고정화의 레기오선택성(regioselectivity)을 용이하게 하기 위하여 재조합 단백질 내에 직접 도입할 수도 있습니다. 이 타입의 라이게이션 기술의 예는 Novo Nordisk by Thomas Kjeldsen et. al, "Dually Reactive Long Recombinant Linkers for Bioconjugations as an Alternative to PEG" in ACS Omega　2020, July 2020 에 의해 서술된다.

조직 인자의 클러스터들은 또한 예를 들어 단일 단백질에 SEQ ID 2의 둘 이상의 반복들(repeats)을 포함하는 것인, 조직 인자의 둘 이상의 반복들을 포함하는 재조합 반복된(repeated) 조직 인자 단백질을 사용함으로써 달성될 수 있다.

발명자들은 포유동물 조직 인자의 세포외 도메인이 화학 선택적 콘쥬게이션에 의해 화학적으로 타겟될(targeted) 수 있는, 측쇄(side chain)에 일차 아민들(primary amines)을 갖는, 많은 라이신들(lysines)을 포함한다는 것을 발견하였다. 내생 조직 인자는 위치들: 20, 28, 41, 46, 48, 65, 68, 122, 149, 159, 165, 166, 169, 181, 201, 214 에서 16 개의 잠재적 콘쥬게이션가능한(conjugatable) 라이신들을 함유한다.

또한, 발명자들은 위치들 11, 124, 137 - 특히 124 및 137 에서 예상되는 중요한 글리코실화 부위들이 콘쥬게이션에 적합한 라이신들로부터 떨어져 위치된다는 것을 인식하였다. 그러므로, 즉, 인자 VII에 결합하여 응고 카스케이드를 개시하는 그것의 능력을 보존하기 위하여, 라이신들을 타겟으로 하는 콘쥬게이션은 조직 인자의 기능성을 보존하는 적절한 방법이다.

게다가, 발명자들은 레기오 및 화학 선택적 콘쥬게이션에 적합한 잠재적 타겟들로 위치 57, 186 및 209에서 위치되는 세 시스테인들(cysteines)을 확인하였다.

드레싱 재료에 조직 인자의 고정화는 바람직하게는 드레싱 재료 상의 하이드록실(hydroxyl) 그룹들을 활성화하고 이것들을 그것의 아미노(amino) 및 티올(thiol) 그룹들을 통해 조직 인자에 커플링하거나(couple) 또는 드레싱 및 조직 인자 사이에 추가적 링커를 도입함으로써 달성된다.

많은 콘쥬게이션 방법들이 에폭사이드들(epoxides), 비닐설폰들(vinylsulfones), 아즈락톤들(azlactones), 시아노브로마이드(cyanobromide), N-하이드록시숙신이미드 에스테르들(N-Hydroxysuccinimide esters), 나이트로페닐 에스테르들(nitrophenyl esters) 및 다른 활성 에스테르들(active esters), 아릴 할라이드들(aryl halides), 이소티오시아네이트들(isothiocyanates), 알데하이드들(aldehydes), 말레이미드(maleimide), 디설파이드들(disulphides), 사이클릭 락톤들(cyclic lactones), 트리아진들(triazines) 또는 벤조에퀴논(benzoequinone)의 사용을 포함하여, 드레싱 재료에 조직 인자를 고정화하기에 적합하다는 것이 이해되어야 한다.

라이신들을 타겟팅하기 위한 선호되는 화학 선택적 콘쥬게이션 방법은 디비닐설폰(divinylsulfon)으로부터의 Michael 첨가(addition) 또는 에피클로로히드린(epichlorohydrin)으로부터의 에폭사이드들의 개환(ring-opening)을 사용하는 것이다. 이들 방법들은 일반적으로 주로 일차 아민들 또는 티올들을 통해 커플링되어(couple) 높은 수율로 안정한 공유 연결들(covalent links)을 야기하는 것으로 알려져 있다.

에피클로로히드린은 예를 들어 하이드로질 표면들(hydrozylic surfaces)에 예를 들어 반응성(reactive) 에폭시 그룹들을 도입하는데 유용한, 접착제들(adhesives) 및 염료들(dyestuffs), 가소제들(plasticizers), 계면활성제들(surfactants), 가교된 식품 전분(cross-linked food starch), 엘라스토머들(elastomers)의 제조에 예를 들어 사용되는, 여러가지 적용들에서 사용되는 유기 신톤(synthon) 및 일반적인 가교제(general crosslinker), 다용도(versatile) 화학 중간체(chemical intermediate)이다. 예를 들어 Greg T. Hermanson GT. Bioconjugate techniques. Elsevier; Rockford, Il: 2008.)에 또는 하이드록실 표면(hydroxylic surface)을 활성화하고, 이차(second) 링커를 도입하고 글루타릭디알데하이드(glutaricdialdehyde)와 렉틴들 콘카나발린 A(lectins Concanavalin A) 및 Wheat Germ Agglutinin을 커플링(couple)하기 위한 특정 예가 Aniulyte Jolita et.al.에 의해 : "Activation of cellulose-based carriers with pentaethylenehexamine", Proc. Estonian Acad. Sci. Chern, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 61-69에 서술되어 있다.

디비닐설폰 (Divinylsulfon) (DVS)은 더 특이한 시약이며, Hermanson 책에서 많은 시약들 중에 열거되며(listed), 그것의 특성들은 추가로 JULIA MORALES-SANFRUTOS ET AL: "Vinyl sulfone: a versatile function for simple bioconjugation and immobilization", ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY, vol. 8, no. 3, 1 January 2010 (201 0-01-01), page 667에 열거된다.

DVS는 폴리에스테르들(polyesters)의 유기 합성을 위한 도구를 개발하기 위해 디비닐 설폰(divinyl sulfone) 활성화된 키토산을 이용하여 효소 Candida antarctica 리파제(lipase) B를 고정화하고 폴리머 네트워크들에서 가교제, DNA 가교(crosslinking)를 포함하는, 다양한 응용들을 위해 사용되어 왔다. Pinheiro et al 에 의해, ACTA PAEDIATRICA. SUPPLEMENT, vol. 130, pages 798-809 서술된 대로.

콘쥬게이션 화학 및 방법들의 선택이 사소하지(trivial) 않다는 것이 이해되어야 한다; 많은 아미노 그룹들 및 티올들을 가교하는 것 및 제어되지 않는 멀티포인트 부착(multipoint attachment)에 의한 활성을 잃을 위험, 및 조직 인자 분자의 민감한 성질(nature)을 고려할 때 특히 그렇지 않다. 교차 링커들(cross linkers)의 검색은 많은 조합들 및 응용들(applications)을 가진 1000 개의 참고문헌들(1000´s of references)을 생성할 것이지만, 조직 인자, 혈액 클로트들 또는 헤모리지에 관한 것은 없다.

가교 시약들(crosslinking reagents), 에피클로로히드린 또는 DVS는 조직 인자 및 하이드록시 또는 아미노 그룹들을 갖는 모든 드레싱들 사이의 연결(linkage)을 형성하는 데 선호된다. 먼저, 드레싱은 에피클로로히드린 또는 DVS로 활성화되어 활성화된 드레싱을 생산하며, 이는 에폭사이드(epoxid) 또는 비닐설폰(vinylsulfon) 작용기들(functionalities)을 통해 조직 인자에 커플링될(coupled) 수 있다.

드레싱 상에 염기성 조건들에서 하이드록실 그룹들의 DVS 활성화는 반응성 비닐설폰 그룹들을 야기한다. 비닐설폰 활성화된 드레싱은 물에 보관될 수 있다.

비닐설폰은 약염기성(slightly basic) pH 조건들에서 조직 인자 단백질에서 주로(primarily) 아민들과 천천히 반응한다. 라디칼 켄처(quencher)의 첨가에 의하여 임의의 잠재적인 라디칼-개시되는 부반응들(side reactions)이 감소될 수 있다. 이 방법은 드레싱 및 단백질 사이에 안정하고 짧은 링커를 준다. 시스테인으로부터의 티올들은 더 낮은 pH에서 비닐설폰과 신속히 반응한다. 이것은 드레싱 및 단백질 사이의 커플링 동안 pH를 조정함으로써 레기오 선택성 및 Michael 첨가 화학(addition chemo)의 부분적 제어를 가능하게 한다. (Porath, J., Laas, T., and Jansson, J.-C. (1975) Agar derivatives for chromatography, electrophoresis and gel-bound enzymes. III Rigid agarose gels, cross linked with divinyl sulfone (DVS). J. Chromatogr.　103, 49-62),

또다른 선호되는 방법은 드레싱 상(on)에 에폭사이드(epoxide)를 도입하는 에피클로로히드린의 사용이다. 이 기능적 모이어티는 콘쥬게이션 동안 pH에 따라, 티올들 및 아민과 반응할 것이다.

게다가, 에피클로로히드린 또는 DVS를 사용하여 활성화된 드레싱은 조직 인자의 고정화 전에 보관될 수 있다.

단백질 콘쥬게이션 동안 9 미만으로 pH를 조정함으로써, 조직 인자의 위치 74, 131, 135, 136, 144 에서 아르기닌들(arginines)에서 구아니디노(guanidino) 그룹이 덜 타겟될 것인데, 그것들이 pKa에서 차이 때문에 라이신들보다 더 양성자화될(protonated) 것이고 콘쥬게이션 부위는 그 때문에 라이신 또는 시스테인 잔기들로 제한될 수 있기 때문이다.

조직 인자의 세포외 도메인만을 포함하는 최소 성분이 드레싱 재료에 고정될 수 있고 시스테믹(systemic) 노출 없이 자연적인 응고 카스케이드를 개시할 수 있는 그것의 기능성을 여전히 유지하고 이로써 예를 들어 출혈(bleeding) 상처들인, 국소 치료로 사용될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

적절한 링커 기술은 통상의 기술자에게 알려져 있지만 유리하게는 DVS 및/또는 에피클로로히드린 시스템(들)을 포함할 수 있는데 둘 다 조직 인자가 기능성을 보존하는 것을 가능하게 하기 ‹š문이다. 게다가, 시스템들 둘 다 드레싱 재료의 활성화의 적합한 정도, 뒤이어 활성 단백질의 결합(binding) 및 로딩(loading)의 정도(degree)를 제공한다. 마지막으로, 시스템들 둘 다 낮은 비용으로 쉽게 이용가능하며 좋은 재현성(reproducibility)을 제공한다. 가장 선호되는 에피클로로히드린 시스템은 전하(charges)가 없고 친수성 이차 알코올 모이어티를 함유하는 짧고 어느정도-딱딱한(semi-stiff) 링커를 제공한다.

본 발명의 맥락에서, 양자택일로 먼저 단백질을 활성화시키고 드레싱에 커플링(couple)하거나 또는 드레싱 및 단백질 사이에 다양한 링커들을 도입할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

드레싱의 정의

드레싱 재료는 조직 인자가 그 상에(on which) 고정될 수 있고 출혈(bleeding) 외상과 같은, 출혈 상처를 통해(via) 혈액 순환에 그것 자체가 들어가지 않을 임의의 재료로 해석되어야 한다. 드레싱 재료는 예를 들어 폴리머, 비드들, 매트릭스, 고체 담체, 패치, 붕대(bandage), 거즈(gauze), 멤브레인(membrane), 배리어(barrier), 컴프레스(compress), 스캐폴드 또는 봉합사 재료(suture material)인, 임의의 적합한 형태일 수 있다. 따라서, 일반적으로 드레싱 재료는 시트들, 네트들(nets), 직물(woven) 및 부직포(non-woven) 시트들, 봉합사들(sutures), 실들(threads), 탐폰들(tampons), 폼들(foams) 및 볼들(balls)을 포함하는 많은 물리적 형태들로 들어오는(comes) 고체 재료일 수 있다.

드레싱 재료는 그것 자체가 예를 들어 열상들(lacerations), 절단들(cuts) 및 찰과상들(abrasions)인, 출혈 상처들의 국소 관리를 위한 국부(topical) 드레싱을 구성할 수 있거나 또는 이러한 국부 드레싱에 통합될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 드레싱은 상처들 또는 열상들, 절단들 및 찰과상들 주위에 둘러싸거나(wrapped) 또는 밀어넣기(pushed into)에 충분한 물리적 온전함(integrity)을 갖는다. 드레싱은 거기서부터 상처나 혈액 또는 체액들(fluids)과 직접적인 접촉에 있을 것이다. 자주, 드레싱(dressing)은 붕대(bandage) 또는 압박 붕대(compressing bandage)에 의해 제자리에 고정된다.

본 발명에 따른 시스템을 포함하는 드레싱은 기능적으로 된(functionalized) 드레싱을 구성하고(constitutes) 혈액 클로트의 형성을 향상시키기 위해 접촉 면적(area)을 최적화하거나(optimize) 또는 상처로부터 체액(fluid)을 흡착하기(adsorbing) 위해 큰 표면적을 갖도록 디자인될 수 있다.

적합한 드레싱 재료들은 면(cotton), 셀룰로오스(cellulose), 셀룰로오스 에테르들(cellulose ethers), 재생 셀룰로오스(regenerated cellulose), 산화된 셀룰로오스(oxidized cellulose), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 폴리우레탄(polyurethane), 아가로스(agarose) 또는 종이-기반 멤브레인들(paper-based membranes), 폴리아마이드들(polyamides), 폴리 설폰 에테르(poly sulfone ether), 폴리비닐 알코올들(polyvinyl alcohols), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 니트로셀룰로오스 혼합된 에스테르들((nitrocellulose mixed esters), 나일론들(nylons), 폴리카르보네이트(polycarbonate), 폴리설폰(polysulfone), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride) 또는 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene) 및 코-블록 폴리머들(co-block polymers), 블렌드들(blends) 및 이것의 조합들을 포함한다.

이것은 탄수화물들, 더욱 더 특이적으로 키토산 및 키토산 유도체들(derivatives)을 포함하는, 지혈을 촉매 작용하고(catalyse) 향상시키는 것으로 알려진, 천연 또는 인공 폴리머들을 함유하는 재료들, 마이크로피브릴(microfibrillar) 콜라겐 또는 트롬빈, 폴리-N-아세틸 글루코사민(poly-N-acetyl glucosamine), 폴리프롤레이트 아세테이트(polyprolate acetate), D-글루코사민(D-glucosamine) 또는 칼슘 알지네이트(calcium alginate)를 함유하는 드레싱들, 및 칼슘 클로라이드 또는 다른 염들을 포함하는, 지혈을 촉매 작용하고 향상시키는 것으로 알려진 무기 또는 다른 염들을 함유하는 드레싱들을 포함한다.

드레싱 재료들은 신체가 시간이 지나면서 재료를 자연적으로 분해하고 흡수할지 여부에 따라 흡수성 또는 비-흡수성으로 분류된다. 본 발명의 맥락에서, 적합한 흡수성 재료는 적어도 15분(min), 예를 들어 20 분, 바람직하게는 수 일(days)까지, 그리고 200일 이하로 포유동물 혈장과 접촉할 때 그것의 구조적 온전함(structural integrity)을 유지할 것이다.

흡수성 드레싱 재료들은 산화 셀룰로오스(oxidised cellulose), 실크, 장선(catgut), 합성 폴리글리콜산(synthetics polyglycolic acid), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리디옥사논(polydioxanone), 및 카프로락톤(caprolactone)을 포함한다. 글리콜라이드(glycolide), l-락타이드(l-lactide), p-디옥사논(p-dioxanone), 트리메틸렌 카보네이트(trimethylene carbonate) 또는 ε-카프로락톤(ε-caprolactone): 다섯 개 사이클릭 모노머들 중 하나 이상에 기반하는 폴리머 및 코-블록-폴리머들을 포함하는 것.

흡수성 드레싱 재료들은 봉합사들을 제공하는 데 특히 선호된다. 봉합사 실(suture thread)은 예를 들어 콜라겐 코트와 같은 또다른 재료로 전-컨디션-코팅될(pre-condition-coated) 수 있고 모노 또는 멀티 필라멘트 봉합사일 수 있다.

본 발명에 따른 시스템을 포함하는 상처 드레싱은 예를 들어 상처와 직접 접촉으로 적용되는 크림, 또는 유체(fluid), 페이스트, 젤라틴, 팽윤성(swellable) 스폰지, 기계적으로 압축된(compressed) 스폰지 또는 그래뉼레이트들(granulates), 그래뉼레이트, 겔, 스프레이, 분말, 글루(glue)인, 유연성(flexible) 또는 기계적으로 불안정한 형태일 수 있다. 조직 인자는 드레싱 재료 상에 고정되고, 바람직하게는 드레싱 재료에 공유 결합되며, 이는 드레싱의 성분이거나 또는 그 안에 통합될(integrated) 수 있다. 고정화는 조직 인자의 전신(systemic) 투여를 방지한다.

선호되는 드레싱 재료는 면, 셀룰로오스 또는 산화된 셀룰로오스를 기반으로 한다.

인자 VII

본 발명에 따른 시스템은 인자 VII를 추가로 포함할 수 있다.

인자 VII는 바람직하게는 드레싱에서 덮이거나 사용 직전에 드레싱에 분무된다.

출혈 부위에 국소적으로 인자 VII를 적용함으로써 전신(systemic) 노출이 감소된다. 전신(systemic) 치료에 사용되는 것보다 대규모로 적은 양(an order of magnitude less amount)의 인자 VII를 사용하는 것이 유리하다. 그렇게 함으로써, 안전 우려들이 상당히 감소될 수 있다.

인자 VII 및 본 발명에 따른 결합된 조직 인자의 선호되는 조합은 일반적으로 전신(systemic) 치료에 사용되는 것보다 출혈 부위에서 1/10 미만의 양을 사용함으로써이다.

공-활성제

본 발명에 따른 시스템은 공-활성제(co-active agent)를 추가로 포함할 수 있다. 공-활성제의 예들은 분명한 통증을 감소시키거나 또는 상처를 진정시킬(cool down) 수 있는 제제들과 같은, 출혈 상처를 갖는 환자에게 유익할 수 있는, 다른 제제들 및 지혈을 추가로 향상시키는, 다양한 제제들을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 그러한 공-활성제는 지혈 향상시키는 제제 예를 들어 무기 염, 젤라틴 또는 젤라틴 유도체들, 키토산 또는 사이클로덱스트린 같은 바이오폴리머들 또는 이것의 조합들이다. 콜라겐 또는 트롬빈, 폴리-N-아세틸 글루코사민, 폴리프롤레이트 아세테이트(polyprolate acetate), D-글루코사민, 칼슘 알지네이트(calcium alginate), 카올린, 다른 염들, 또는 칼슘 클로라이드를 포함하는, 지혈을 향상시키고 촉매 작용하는 것으로 알려진 염들.

공-활성제는 조직 인자와 함께 드레싱 재료 상에 고정화될(immobilized) 수 있다.

본 발명에 따른 시스템은 안정화제(stabilizing agent)를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제는 활성 화합물의 지혈(haemostatic) 활성과 무관할 수 있는 단백질들을 포함한다. 선호되는 안정화제는 활성 화합물 주위의 드레싱 재료의 표면 공간을 소극적으로 채울 것이다. 선호되는 안정화제들은 혈청 알부민, 어류 젤라틴, 카제인 또는 단백질 혼합물들 또는 단백질분해(proteolytic) 분해된(degraded) 젤라틴 또는 다른 단백질들을 포함한다.

안정화제는 조직 인자와 함께 드레싱 재료 상에 고정될 수 있으며, 그로써 혈관계(vascular system)로 방출 및 전신(systemic) 노출이 최소화된다.

본 발명에 따른 시스템은 화학물질들 및 완충제들로 덮이거나 또는 팽윤될(swelled) 수 있으며, 이는 보관 및 운송 시 기능성을 더 안정화할 것이다. 이것은 결빙(freezing) 또는 UV 조사(irradiation)로부터 훼손(damage)에 대해 보호하는, 제제들, 또는 pH를 안정화하기 위한 버퍼들 또는 항미생물 제제들을 포함한다.

발명자들은 놀랍게도 고정화된 조직 인자 및 고정화된 링커를 가진 드레싱이, 탄수화물들, 단백질, 알코올들 및 방부제들(preservatives)로 구성된 혼합물로 코팅("글레이징(glazing)")하지 않고도, 장기 보관 시 지혈을 개시하기 위한 그것의 기능성을 보존한다는 것을 발견했다.

추가적인 보관(storage) 안정화를 위한 선호되는 탄수화물들은 트레할로스(trehalose), 락티톨(lactitol), 이노시톨(inositol), 글루코스, 수크로스, 만노스, 사카로스(saccharose), 덱스트란(dextran), 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl) (DEAE)-덱스트란 및/또는 아가로스(agarose)를 포함한다.

선호되는 단백질들은 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin) (BSA), 재조합 혈청 알부민들 및 유도체들, 무지방 분유(Non-fat dry milk), 카제인(Casein) 또는 카제이네이트(caseinate), 어류 젤라틴을 포함한다. 선호되는 알코올들은 글리세롤을 포함하고 방부제들은 2-클로로아세트아마이드(2-chloroacetamide) 또는 국소 사용 또는 상처 드레싱들에 적당한(suited) 다른 항미생물 제제들을 포함한다.

본 발명에 따른 시스템은 신체가 일반적으로 출혈을 멈추는 방식과 비슷한 방식으로 조직 인자 또는 이것의 임의의 변이체를 제공하고, 출혈 혈관들(bleeding vessels)을 통해 혈류로 조직 인자의 유리(liberation) 없이, 출혈 부위에서 인자 VII/VIIa와 연결할 수 있는 더 적은 양의 내생 외분비(exocrine) 조직 인자에 의존하는 대신, 지혈 제어를 가능하게 할 것이다.

특히, 봉합사들, 분말, 그래뉼레이트들, 젤들(gels), 폼들(foams), 스프레이들 또는 스폰지들을 사용함으로써 도달하기 어려운(hard-to-reach) 출혈에 대한 접근이 향상될 수 있다.

본 발명의 시스템은 예를 들어 손으로 또는 장치로, 상처 또는 창강에 적용되는 젤(gel) 형태일 수 있다. 장점은 상처에 압력을 추가로 가하기(put) 위해, 장치들 또는 드레싱들의 임의의 타입과 조합하는 가능함(possibility) 및 출혈 부위에 닿는 데 있어 유연성(flexibility)이다. 젤은 가장 가까운 이용가능한 드레싱에 간접적으로 또는 상처에 직접 분포될 수 있다. 이것은 예를 들어 병원 외부의 민간인 사고들 또는 야간 군사 작전(military operations) 중인 상황을 위해 맞는(correct) 크기 또는 타입의 드레싱을 갖고 있지 않을 수 있는 상황에서 중요하다.

폼은 젤의 변형(variation)으로, 예를 들어 그것의 가스 함량 때문에 팽창할 수 있다. 추가의 변형은 공유 부착된(covalent attached) 조직 인자를 가진 흡수성 폴리머들을 가진 스프레이된(sprayed) 폼이다. 상처 또는 드레싱에 뿌려지면, 중성 용제(solvent) 또는 가스가 증발된 후, 남은 젤이 출혈 부위에 가깝워지고 농축될(concentrated) 것이다. 다시(Again), 드레싱들에 간접적으로 또는 출혈 부위에 적용하기 위해 유연성을 증가시키기 위한 것이다.

또 또다른 변형은 압축성(compressible) 스폰지들을 포함하는, 스폰지들의 사용이다. 작은 비드들의 형태의 스폰지들은 손으로 또는 장치로 창강 내로 전달될 수 있으며 기계적 확장(expansion) 후 또는 팽윤(swelling) 후 출혈 부위들에 추가의 압력을 가할 수 있다.

또 다른 변형은 일반적으로 흡수성인, 끈적끈적한 글루의 형태이며, 이는 지혈을 개시하는 것과 동시에 함께 조직을 유지하기(hold) 위하여 손으로(manually) 또는 스프레이 또는 튜브 장치로부터 적용될 수 있다.

신속한 지혈

정적(Static) 전혈은 평균 10-30 분 후에 자연스럽게(spontaneously) 응고하며, 그것이 취해지는 사람에 매우 의존한다. 예를 들어 성별(gender), 연령, 인종, 일반적인 신체 컨디션, 질병들 또는 복용한 약 (medication taken), 예를 들어 항응고제들(anticoagulants)에 따라 큰 변형이 있다.

그러므로, 적극적인(active) 지혈 드레싱의 효율의 척도(measure)는 출혈 부위 상에 드레싱을 유지하기 위해 얼마나 긴 시간이 필요한가 - 또는 드레싱이 없거나 또는 수동적(passive) 드레싱에 비해 시간의 감소로 가장 잘 서술될 수 있다.

몇 분 지혈까지 시간의 감소는 가치가 있고 신속한 지혈로 간주된다. 일 분 감소도 실질적인 가치가 있으며 이 분 이상은 상당한 개선들이다. 그러나 종종 효과는 출혈 부위(bleed site)를 덮고 있는 드레싱에 압력을 적용한 후 출혈을 멈추지 않거나 또는 멈추는 근본적인(fundamental) 문제일 수 있다.

바람직하지 않은 혈액 응고:

출혈 부위에서 떨어진 장기들 또는 혈관계에서 드레싱에 의해 개시되는 임의의 혈액 응고 또는 지혈는 제어되지 않으며(uncontrolled) 바람직하지 않다.

출혈 부위에서 떨어져 지혈을 개시하거나 또는 유도하는 임의의 드레싱은 혈액 클로트들을 야기할 수 있으며 중요한 곳들에서 작은 혈관들(blood vessels)이 클로트들로 막힐 수 있다. 뇌에서 막힌 혈관들(vessels)은 뇌졸중들(strokes)을 야기할 수 있고 심장으로 이어지는 막힌 혈관들은 심장 마비들(heart attacks)을 야기할 수 있다. 다리들, 골반(pelvis) 또는 복부(abdomen)의 정맥들(veins)로부터의 클로트들의 조각들은 혈류를 통해 폐로 이동하고 주요 동맥들을 막아(block) 폐색전증(pulmonary embolism)을 줄 수 있다. 안전한 지혈 드레싱을 갖기 위해서 바람직하지 않은 혈액 응고를 방지하는 것이 의무적(mandatory)이다.

본 출원의 실험예들에서, 드레싱들은 콘쥬게이션 단계 후 다양한 버퍼들로 광범위하게 세척된다. 우리는 연결된 조직 인자를 가진 세척된 드레싱들이 심각한(severe) 헤모리지(haemorrhage)가 있는 동물 모델에서 신속한 지혈을 촉진하는 데 사용될 수 있기 때문에 조직 인자가 씻겨나갈(washed away) 수 없다는 것을 설명했다(illustrated).

엑스-비보에서 효과를 측정하는 방법

지혈을 시작하는(introduce) 드레싱의 효과는 물론 실시예 8에 서술된 대로, 몇몇 동물 모델들에서 그리고 인간 실험들에서 측정 가능하다.

실시예 10에서, 우리는 다양한 드레싱들이 전혈, 트롬보사이트들(thrombocytes)과 혈장 단백질들의 혼합물 또는 순수한 혈장과 바이알에서 혼합되는, 간단한 분석을 서술한다.

도너들(donors)의 풀(pool)로부터의 혈장을 사용하는 것만으로, 초기(initial) 지혈 과정이 측정되고 아마 도너 변동들(variations)이 감소한다. 반면, 분석은 트롬빈 버스트 효과를 나타내지 않을 것이다.

분석에서 바이알은 37 ℃로 가열되고 특정 시간 간격들로 뒤집힌다(turned over). 지혈은 바이알을 거꾸로 뒤집을 때 형성된 젤 또는 클로트가 흐르지(running down) 않을 때까지의 시간으로 측정된다. 지혈을 개시하는 드레싱의 효율은 드레싱이 없거나, 처리되지 않은 드레싱 또는 더미(dummy) 단백질을 가진 드레싱들과 비교하여 시간 감소로 추정된다.

트롬보엘라스토그래픽(Thromboelastographic) (TEG) 점탄성 지혈 분석은 유리(free) 용액 조직 인자에 의해 개시된 클로트 형성의 총 점탄성 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 전혈, 트롬보사이트들(thrombocytes)과 혈장 단백질들의 혼합물 또는 순수 혈장을 사용하는 것.

구현예들

하나의 구현예에서 상기 약술된 대로, 예를 들어 적합한 드레싱의 형태인, 드레싱 재료 상에 고정된 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체를 포함하는 본 발명에 따른 시스템은 출혈 외상과 접촉하게 가져와질 수 있어 그로써 시스템은 인자 VII/VIIa와 상호작용하는, 조직 인자를 다량(profusely) 출혈 영역에 제공한다. 이것은 짧은 시간 압박(compression)에 의해 보통 멈춰질 수 있는 혈액을 의미하는, 더 작은 출혈들로부터 유래하는 응고 카스케이드를 보통 활성화할 수 있는, 예를 들어 내피(endothelial) 조직 또는 백혈구로부터, 임의의 다른 내생 세포 결합 조직 인자를 능가하는 상당한 양으로 일어날 것이다. 그러나 (만약 열상이 더 큰 혈관들(vessels) 그리고 특히 동맥 혈관들(arterial vessels)을 포함하는 경우를 의미하는, 더 작은 정맥 출혈들로부터) 체질된(sieving) 혈액의 약 100 cc를 다량의 출혈들이 초과하기 시작하면, 조직 인자 또는 그것의 일부들이 적용되는 한 많은 양의 조직 인자가 추가의 다량 출혈들을 방지하기 위하여 훨씬 우수한 방식일 수 있다.

하나의 구현예(embodiment)에서, 조직 인자는 링커를 통해 또는 직접적으로 공유 결합에 의해 드레싱 재료에 고정된다. 그렇게 함으로써, 조직 인자는 혈관 손상(vascular injury)의 부위에서, 혈관들(vessels) 내부의 임의의 임상적으로 상당한 양으로 드레싱 재료로부터 방출되지 않을 것이다. 따라서, 혈류에서 혈전증 또는 색전(embolic) 효과를 야기할 수 있는, 임상적으로 관련된(relevant) 양으로 혈류에서 노출이 피해진다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 시스템을 포함하는 상처 드레싱이 제공되며, 더 구체적으로 상처 드레싱은 상처 드레싱을 형성하는 드레싱에 포함되거나(incorporated) 또는 형성하는 드레싱 재료에 공유적으로(covalently) 고정된, 인간 조직 인자 또는 재조합으로 만들어진 그것의 임의의 변이체, 즉 재조합 가용성 인간 조직 인자의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 상처 드레싱은 외부에서(externally) 적용되는 조직 인자에 의해 야기되는 혈관-내 혈전증을 방지한다. 출혈 영역에 고정된 조직 인자를 가진 드레싱을 적용할 때, 출혈이 얼마나 대량인지에 따라, 클로팅 카스케이드를 활성화하는, 충분한 양의 인자 VII/VIIa와 조직 인자가 상호작용하는 것으로 추정된다. 적절한 지혈에 성공하기에 충분히 이용가능한 클로팅 인자들이 있으면 충분한 응고 인자들이 이용 가능하고 그러므로 출혈 부위(들)에서 출혈을 멈추거나 또는 지연시키기(delay) 위해 지혈이 효과적으로 확립될 수 있다고 추정된다.

또 또다른 실시예에서, 본 발명에 따른 시스템은 출혈 영역에서 지혈을 더 속도를 내기 위해 드레싱에서 고정된 조직 인자 및 결합되지 않은 인자 VII를 조합한다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 시스템은 봉합사의 형태로 제공된다. 봉합사는 일반적으로 부착된 실 한 가닥(attached length of thread)을 가진 바늘로 구성된다. 모든 봉합사들은 신체가 시간이 지남에 따라 봉합사 재료를 자연적으로 분해하고 흡수할지 여부에 따라 흡수성 또는 비-흡수성으로 분류된다. 추가의 선호되는 구현예는 드레싱들을 흡수성 또는 그렇지 않으면 비-흡수성으로 정의한다.

선호되는 구현예는 시트, 실들, 섬유 또는 실들의 번들(bundle)의 형태로 본 발명에 따른 시스템을 제공한다. 그 다음 실들 또는 실들의 번들은 직조(woven), 붙이기(glued) 또는 그렇지 않으면 다양한 형태들의 상처 드레싱으로 포함될(integrated) 수 있다. 이것은 기존 제조 기술들을 사용하여 많은 상이한 상처 드레싱들로 쉬운 수행(implementation) 및 중앙집중되고(centralized) 그리고 표준화된 제조(manufacturing)를 가능하게 한다. 활성(active) 시트, 실들, 섬유(fibre) 또는 번들의 밀도는 특정 응용에 대해 최적화된다(optimized).

발명자들은 놀랍게도 실험에서 조직 인자의 국소 집중(concentration)이 국소 지속 트롬빈 생성(generation)의 다음으로(secondary) 매우 신속하게 지혈을 촉발한다(triggers)는 것을 발견하였다. 이 단계는 현 발명으로 이어진다.

실시예들:

실시예들(examples)은 드레싱들의 에피클로로히드린 및 DVS 활성화, 조직 인자 및 공간 채움(space filling) 단백질 및 테스트를 사용하여 커플링을 최적화(optimizing), 드레싱의 엑스-비보 기능 테스트, 인자 VII 용액으로 덮인 드레싱으로 테스트, 미니 돼지들에서 두 개의 상이한 출혈 퍼포먼스 테스트들 및 대규모 제조(large scale preparation)를 개시함으로써 발명을 설명한다.

하기에서, 드레싱들의 DVS 및 에피클로로히드린 활성화가 개시된다.

실시예 1 - 드레싱의 DVS 활성화:

세 가지 타입들의 드레싱, A 직조 가제(gaze), B 치과용(dental) 드레싱 및 C 조밀하게 직조된 면 시트들이 버퍼 (50 mM 카보네이트(Carbonate), pH 11.6)에서 세척되었고 부드럽게 저으면서(stirred) 밀폐된 컨테이너에서 pH 11.6, 50 mM 카보네이트에서 5% DVS로 1 또는 4 시간 동안 처리되었다. DVS 용액은 따라내고(decanted) 버려졌다(discarded). 대략 50 ppm 하이드로퀴논(hydroquinone)이 첨가된 탈이온수에 보관되기 전에, 드레싱들은 탈이온수로 7회 세척되었다.

실시예 2 - 드레싱의 에피클로로히드린 활성화:

상기 세 가지 타입들의 드레싱이 버퍼 (2 N NaOH, 1:1 물- DMSO)로 세척되었고 부드럽게 저으면서 밀폐된 컨테이너에서 1:1 물-DMSO, 2 N NaOH에서 5% 에피클로로히드린으로 1 또는 4 시간 동안 처리되었다.

용액은 따라내고, 수집되고, 버려졌다. 드레싱들은 탈이온수(deionized water)에 보관되기 전에, 탈이온수로 7회 세척되었다.

드레싱들은 더 작은 조각들로 잘라졌다.

하기에서, DVS 또는 에피클로로히드린 활성화된(activated) 드레싱에 대한 형광 표지된 BSA 테스트 단백질의 커플링이 개시된다.

실시예 3 - 형광 표지된 BSA 테스트 단백질의 커플링:

테스트 단백질, 소 혈청 알부민 (Bovine Serum Albumine) - BSA, 는 이것이 드레싱 재료에서 스페이서 또는 필러로 유용하고 상업적으로 이용가능한 인노빈(innovin)에서 성분이기 때문에, 모델로 적절하다(relevant).

BSA는 pH 7에서 0.20 M HEPES (Merck)에서 저어진 10 ml 1.00% BSA의 용액 (Merck)에 0.525 ml의 5/6-카르복시 플루오레세인(5/6-carboxy fluorescein) NHS 에스테르 (Thermo Fisher) 2 mg/ml DMF (Merck) 용액을 한 방울씩(dropwise) 첨가하여 형광 표지되었다. 실온에서 한 시간 동안 저은(stirring) 후, 용액은 추가의 정제 없이 사용되었다.

BSA 가 없는 유사한 용액이 대조군으로 준비되었다(prepared).

플루오레세인 표지된 BSA 는 DVS 또는 에피클로로히드린 활성화된 드레싱들에 커플링되었다. 여러가지 타입들의 드레싱들이 테스트되었다.

실온(21 ℃)에서 일반적 절차에 따라 1.0 mg/ml 플루오레세인 표지된 BSA 농도로, 다양한 pH들 및 시간에서 여러가지 드레싱들: 먼저 즉 각각 0.10 M 카보네이트 pH 10.0, 0.10 M 카보네이트 pH 9.0 또는 0.10 M HEPES pH 8.0 인, 반응 버퍼에서 드레싱을 (약 2x2 cm) 세척하는 것.

대조군 용액 또는 플루오레세인 표지된 BSA 반응 용액에 담가지기(immersed) 전, 드레싱이 흔들어지고 페이퍼 타월로 간단히 건조되었다. 물, pH 버퍼 및 플루오레세인 표지된 BSA 용액을 첨가함으로써 다양한 반응 혼합물들이 제조되었다.

반응 후, 임의의 남아있는 활성 그룹들이 정지(stop) 버퍼, (0.20 M 에탄올아민(ethanolamine), 0.20 M 카보네이트(carbonate), pH 9.0)로 15 분 동안 켄칭되었다(quenched). (에폭시(epoxy) 활성화된 친화성(affinity) 크로마토그래피 수지들에 대한 표준 켄칭(quenching) 절차와 유사). 드레싱들은 탈이온수에서 사 회 흔들어져(shaking) 광범위하게(extensively) 세척되었다. 드레싱들은 pH 7.0에서 10 mM HEPES에서 보관되었다.

형광 슬라이드 스캐너에서 형광 강도(fluorescent intensity)가 측정되기 전에 젖은(wet) 드레싱들이 표준 유리 현미경 유리 상에 놓여졌다. 현미경 슬라이드 스캐닝 프레임으로, CellReporterXpress 소프트웨어 (Molecular Devices)를 가진 ImageXpress-Pico를 사용하여, 강도들이 비교되고 형광 이미지들이 기록되었다.

요약하면, 다음이 관찰되었다:

이 실험은 먼저 드레싱들을 활성화하고 다른 pH 및 시간에서 커플링하여 테스트 단백질의 로딩(loading)을 제어하는 가능성(possibility)을 보여주었다(illustrated). pH 가 높을수록 - 더 많이 커플링된다. 그리고 반응 시간이 길수록, 로딩이 더 많다. pH 의 영향이 우세한 것으로 보였다. 그렇지만, 단백질과 더 긴 커플링 시간은 많은(much) 엑스트라(extra) 형광을 주지 않았다. 이 정보는 조직 인자의 커플링을 최적화하는 데 사용되었다.

하기에서, DVS 또는 에피클로로히드린 활성화된 드레싱에 조직 인자의 커플링이 개시된다.

실시예 4 - 응고 효율의 테스트 및 다른 pH 및 농도에서 DVS 활성화된 드레싱들에 BSA 및 조직 인자의 혼합물들 또는 조직 인자의 커플링.

몇몇 글리코실화 부위들을 가진 조직 인자 (SEQ ID　NO:　2)가,

(SGTTNTVAAYNLTWKSTNFK

TILEWEPKPVNQVYTVQIST

KSGDWKSKCFYTTDTECDLT

DEIVKDVKQTYLARVFSYPA

GNVESTGSAGEPLYENSPEF

TPYLETNLGQPTIQSFEQVG

TKVNVTVEDERTLVRRNNTF

LSLRDVFGKDLIYTLYYWKS

SSSGKKTAKTNTNEFLIDVD

KGENYCFSVQAVIPSRTVNR

KSTDSPVECMGQEKGEFRE)

Human Cell Inc. (Naperville, US-IL)로부터 얻어졌고 Sahni, M, Wilcox, S, et al, SAFC Biosciences Research Report called “HEK 293 Cell Growth and Virus Production in EX-CELL™293 Serum-Free Medium, by Manisha Sahni, et.al. Research Report, SAFE Biosciences, www.Safcbiosciences.com issued 2006-R022, 0103에 의해 서술된 대로 EX-CELL293 무-혈청 배지(serum-free medium)에서 세포 성장 생산 시스템(Cell Growth Production system)에서 생산되었다. 태그되지 않은(untagged) 조직 인자가 1 mg 바이알들에서 카보네이트 버퍼로부터 동결-건조(freeze-dried)되기 전 헤파린 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환에 의해 정제되었다.

0.250 ml 탈이온수 (4.0 mg/ml)에서 1.00 mg 조직 인자를 용해하여 표준 용액이 제조되었다. 용액은 클리어(clear)하고 어떤 흐림(cloudiness)도 없었다.

실시예 3에 서술된 대로 커플링이 수행되었다. 콘쥬게이션들의 일부가 조직 인자 및 플루오레세인 표지된 BSA의 혼합물로 수행된 것을 제외하고. 아래 표 (실시예 5)는 조합들을 요약한다.

반응은 15 분 동안 정지 버퍼로 켄칭되었다. 드레싱들은 광범위하게 탈이온수에서 삼 회 흔들어져 세척되고 뒤이어 20 mM Tris로 pH 7.0에서 그리고 물로 한 번이었다. 지혈을 개시하는 능력에 대해 테스트되기 전에, 드레싱들이 pH 7.0에서 10 mm HEPES에서 보관되었다.

실시예 5 - 조직 인자 기능화된 드레싱들의 엑스-비보 테스트

조직 인자 기능화된(functionalized) 드레싱들 (약 2x2 cm) 및 음성(negative) 및 양성 대조군이 작은 바이알들에 놓여지고 5.0 ml 신선한 인간 혈액이 첨가되었다. 실온에서 20분 후, 바이알로부터 드레싱들이 제거되었고 현미경 유리들 상에 놓여졌다. 피펫들을 사용하여 혈액 성분들이 드래그(dragging)되어 혈액 클로팅 및 드레싱이 평가되었다. 양성 실시예들은 모두 어두운 덩어리들(lumps) 및 또는 섬유 구조들의 형태인 클리어한(clear) 혈액 클로트들을 가졌다. 가장 양성(positive)은 연속적이고 조밀한(dense) 덩어리들 함유(contained) 젤-같은 또는 반고체 상태였다. 음성(negative)은 클로트들 없는 낮은 점도 혈액을 가졌다. 클로팅은 두 명의 전문가들에 의해 '-'부터 '++++'까지 점수가 매겨졌다.

다음 표는 에피클로로히드린 활성화된 드레싱들에 대한 다양한 조합들 및 결과들을 요약한다.

결론적으로, 실험은 조직 인자 커플링된 드레싱들에 의한 혈액 클로트들의 형성을 설명했다.

하기에서는, 응고 효율의 테스트 및 더 낮은 pH 및 농도들에서, 감소된 DVS 활성화된 드레싱들 (1 시간 활성화)에 조직 인자의 커플링이 서술된다.

이 실험은 실시예 4를 - 그러나 더 낮은 pH 및 농도들로 수행된다. pH 8.0에서, 반응 버퍼는 0.10 M HEPES pH 8.0이었다. 혈액 클로팅은 상기와 같이 평가되었다.

다음 표는 DVS 활성화된 드레싱들에 대한 다양한 조합들 및 결과들을 요약한다:

요약하면, 실험은 낮은 조직 인자 농도들 및 pH 8.0에서 커플링의 경우에도, 혈액 클로팅을 개시하는 드레싱에 연결된 조직 인자에 의한 능력을 설명했다. 이것은 조직 인자 단백질 상에서 티올들(thiols)을 통한 커플링 후 좋은 활성을 나타낼 수 있다.

실시예 6 - 인자 VII로 덮이고 37 ℃에서 조직 인자 기능화된 드레싱들의 엑스-비보 테스트

NovoSeven (NovoNordisk, Denmark)의 바이알이 열렸고 1.0 mg 동결 건조된 분말이 1.00 ml의 공급된(supplied) 버퍼 용액에 용해되어, 인자 VII 원액(stock solution)을 만들었다.

인자 VII 용액으로 덮인 샘플들에서, 첫 번째 과량의 물이 그것들이 물에 1:10 희석된 인자 VII 용액으로 덮이기 전에 드레싱들로부터 제거되었다.

비닐설폰(vinylsulfon) 및 에피클로로히드린 활성화된 "C" 드레싱들, 면 시트들을 기반으로, 새로운 세트의 조직 인자 기능화된 드레싱들이 만들어졌다. 실온에서 60분 동안 커플링, 카보네이트 버퍼에서 pH 8.00, 0.050 mg/ml 조직 인자, 에탄올아민으로 켄칭되고, 물 및 Tris 버퍼에서 세척되었다. 인자 VII ("F7")의 추가 및 활성화된 드레싱의 타입만 다양했다.

실제 상황을 더 잘 시뮬레이션하기 위해, 가열 블록(heating block)에서 37 ℃의 인큐베이션 온도 및 5 분 후 모니터링을 제외하고, 상기 서술된 대로 엑스-비보 테스트가 수행되었다. 모든 샘플들은 이중으로(duplex) 테스트되었다.

결과들은 아래 표에 요약되어 있다.

결론적으로, 조직 인자를 가진 드레싱들은 클로트들을 생산했지만 플라시보는 그렇지 않았다.

인자 VII로 덮인 드레싱들은 임의의(any) 다른 드레싱들과 비교하여, 매우 조밀한 혈액 클로트를 생산했다. 우리는 인자 VII를 가진 플라시보 (활성화되지 않은) 드레싱이 약간의 클리어한 클로트들을 생산했지만, 그것들이 조직 인자를 가진 드레싱들이 가진 대로 탄성있거나(rubbery) 또는 조밀하지 않았다는 것을 주목했다. 이 실험에서는 에피클로로히드린이 DVS 드레싱들보다 더 좋은 것으로 보인다. 우리는 드레싱과 연결된(linked) 조직 인자를 가진 인자 VII가 혈액 클로팅을 훨씬 더 향상시킨다고 결론내렸다.

실시예 7 - 조직 인자를 가진 드레싱의 대규모 제조

활성화된 드레싱 (타입 C, )가 실시예들 1 및 2에서와 같이 제조되었다.

DVS 활성화된 드레싱은 6 조각들(pieces)의 10x10 cm 면 드레싱 (약 10 그램)에 대해 200 ml 5% DVS, pH 10.6 카보네이트를 사용하여 제조되었다.

에피클로로히드린 활성화된 드레싱은 6 조각들의 10x10 cm 면 드레싱 (약 10 그램)에 대해 50% DMSO/물에서 2 N NaOH, 200 ml 5% 에피클로로히드린을 사용하여 제조되었다.

에폭시(epoxy) 드레싱들은 길이가 약 10%, 그리고 DVS 활성화된 드레싱들은 길이가 약 5% 줄어들었다.

드레싱들은 2.5 cm에(by) 2.5 cm 조각들로 잘렸고 0.050 mg/ml 또는 0.100 mg/ml 조직 인자와, 한 시간 동안 상기 서술된 대로 pH 8에서 조직 인자와 커플링되었고, 에탄올 아민(ethanol amin) 버퍼와 켄칭되었고 그리고 물 및 Tris 버퍼로 세척되었다. 추위에서 물에 보관되었다. 드레싱들은 다음 표에 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 요약되어 있다.

처리되지 않은 면 드레싱이 물 및 Tris 버퍼로 세척되었고 TL-5, 플라시보 드레싱으로 명명되었다.

드레싱들은 2-6 ℃에서 물에 보관되고 운송되었고 제조 후 3 및 6 일에 미니-돼지 출혈 테스트들에 사용되었다.

미니 돼지 출혈 테스트들

다음 실시예에서, 비장(spleen) 병변(lesion) 및 경동맥(carotid arterial) 출혈에서 지혈을 유도하는 조직 인자 드레싱들의 능력의 테스트가 개시된다.

본 발명에 서술된 드레싱들이 미니 돼지들 (Ellegaard Gottingen Minipigs A/S, Dalmose, Denmark) 을 사용한 비장 병변 및 경동맥 출혈 모델들에서, 인 비보(in vivo)에서 상업적으로 이용가능한 드레싱들과 비교되었고 평가되었다.

인 비보 모델에서 다음 드레싱들이 테스트되었다:

여섯 마리 수컷 미니 돼지들, 7-9 개월령 (15-18 kg)이 인 비보 연구들에서 사용되었다. 마취는 졸레틸 믹스 (zoletil mix) (졸레틸(Zoletil) 50 (50 mg/ml) + 6.25 ml 자일라진(xylazine) (20 mg/ml) + 1.25 ml 케타민(Ketamine) (100 mg/ml) + 2.5 ml 부토르판올(butorphanol) (10 mg/m))의 i.m. 주입(injection)에 의해 유도되었다. 도즈(Dose) 1 ml/10 kg i.m.. 유도 후, 마취는 이소플루란 (isofluran) (0-4%) 으로 지속되었다.

I.v. 카테터 (귀 정맥 또는 대퇴(femoral) 정맥)이 (대퇴 동맥(arteria)에서) 동맥내(intraarterial) 혈압 프로브에 추가로 놓여졌다. 소듐-시트레이트 유리 바이알들 안에 4.5 ml의 샘플이 트롬보엘라스토그래픽 (TEG 6s, Haemonetics, MA- USA) 에 의하여 응고 측정을 위해 취해졌다(drawn). 돼지들은 25 i.u. 헤파린(heparin)/kg i.v.이 주어졌고 새로운 TEG 측정이 응고가 인간 캐릭터(character), 즉 인간 스펙트럼의 더 높은 끝(end)에 해당하는 TEG 값,에 도달하는 것을 확실히 하기(ensure) 위하여 10 분 후 수행되었다. i.v. 카테터에서 링거(ringer)-락테이트(대략 5-15 ml/h)의 주입(infusion)에 의해 기본(Basic) 볼륨(volume)-요법이 지속되었다.

다음 실험들 동안, 미니 돼지들은 혈압, 산소 포화도 및 맥박(pulse)에 대해 계속해서(continuously) 모니터링되었다.

실시예 8 - 비장 병변들

꼬리(caudal) 방향으로 검상돌기(xyphoid) 바로 아래 8 cm의 정중 절개(midline incision)가 두어졌다(placed). 비장은 국소화되어(localized) 복부(abdomen) 상에 놓여졌다. 비장은 필요에 따라 등장성(isotonic) NaCl에 의해 촉촉하게(moistened) 유지되었다. 비장 병변들은 2 세트들의 2 표준화된 메스(scalpel) 병변들로 수행되었고 (3 mm 깊이, 및 1.5 cm 길이), 비장의 꼬리 부분(caudal part)에 비장 병변 3 및 4 그리고 먼 부분(distal part)에 비장 병변들 1 및 2가 만들어졌다. 20초의 억제되지 않은(unrestrained) 출혈 후, 드레싱 2 cm x 2 cm가 병변들의 상부(top) 중앙에(centrally) 놓여졌다. 손가락으로 수동 압박(Manually compression)이 1 또는 3 분 동안 놓여졌다. 압박 후, 지혈은 대략 0, 3, 5 또는 6 및 10 분 후 평가되었다. 평가(evaluation) 후, 비장은 등장성 NaCl이 있는 단일 겹(single layer)의 거즈에 싸였고(wrapped) 복부로 이동되었다.

비장 병변 모델에서 테스트된 드레싱들 및 드레싱들의 지혈 효과는 아래 표에 요약되어 있다:

실험은 비장 병변 모델에서 지혈을 유도하는 조직 인자 커플링된(coupled) 드레싱들의 능력을 설명한다. Tachosil 또는 플라시보 (TL-5)에 비교하여, 조직인자 드레싱들은 동시에 또는 더 빠르게 지혈을 유도하였다.

일반적으로, Tachosil에 대하여, 출혈은 초기(initial) 지혈 후 다시 시작한다. 조직 인자 드레싱들은 조밀한 혈액 클로트를 형성하였으며, 이는 효과적으로 출혈을 멈췄고 기계적으로 안정한 폐색을 만들었다. 조직 인자 드레싱들이 흐르는 혈액의 농화(thickening)를 시작하는(introduce) 것으로 보이지만, Tachosil 드레싱으로부터 흐르는(running) 혈액은 액체로 남아 있었다는 것이 주목되었다.

실시예 9 - 경동맥(Carotid arterial) 출혈 모델:

비장 모델 실험이 완결된 후, 동맥(arterial) 병변 모델을 위한 준비로서 링거-락테이트 주입(infusion) 속도가 대략 50 ml/hr으로 증가되었다. 이후, 주입(infusion) 속도의 조정은 연구 동안 65 mmHg 초과로 평균 BP를 유지하는 것을 목적으로 혈압(blood pressure) (BP)에 기반하였다. 연구 동안 절개(incision) 및 출혈 제어를 위해 동맥(arteria)을 들어올릴 수 있도록 가이드 라인(guiding line)이 상부 및 하부에 놓여졌고 경동맥(carotid artery)이 노출되었다. 거즈 상에 1-3 ml 리도카인(lidocaine) 20%가 동맥(artery) 상에 직접 놓여졌다. 들어 올리는 동안, 동맥의 혈-류(blood-flow)가 막혔고(obstructed) 14G 캐뉼라(cannula)로 천자(puncture)에 의한 병변이 유도되었다. 동맥의 들어올리기(lifting)의 이완(Relaxing)은 동맥 출혈을 보였다. 출혈이 맥동하지(pulsative) 않으면, 병변 크기가 증가되었다. 동맥 절개(arteriotomy) 및 억제되지 않은 출혈 20 초 후, 병변 상에 두 겹(layers)의 드레싱이 놓여졌고, 그 위에 2겹의 거즈를 갖고 뒤이어 수동(manual) 압박이 있었다. 5 분 후, 수동 압박이 천천히 대신되었고(displaced) 부위가 출혈에 대해 조사되었다. 출혈이 보이지 않았으면, 거즈가 주의깊게 제거되었고 드레싱은 대략 3 - 5 분 동안 손대지 않고 그대로 두었다. 지혈이 되지 않았으면, 또다른 드레싱(두 겹)이 출혈 상에 놓여졌고 뒤이어 5 분의 수동(manual) 압박이 이어졌다. 연구 동안, BP는 면밀히 모니터링되었다.

펜토바르비탈(pentobarbital) i.v.의 주입(injection)에 의해 연구가 종료되었다.

경동맥(carotid arterial) 출혈 모델에서 얻은 결과들은 아래에 요약된다:

경동맥(carotid arterial) 출혈 모델에서 얻은 결과들은 테스트된 조직 인자 커플링된 드레싱들이 과도한(excessive) 동맥(arterial) 출혈을 멈출 수 있다는 것을 보여준다.

QuikClot 드레싱은 실시예들 중 하나에서 작동했지만 다른 실시예들에서는 실패했다. TL-3로 압박 및 지혈 후 혈압 또한 회복된, 미니 돼지 C에 대하여 설명된 대로, QuikClot 및 플라시보가 실패한 후에도 - 조직 인자 드레싱들은 모든 실시예들에서 효율적으로 수행했다.

실시예 10 - 조직 인자 커플링된 드레싱들 및 조직 인자의 안정성

실시예들 8 및 9, 미니 돼지 출혈 실험들에서 사용된 그리고 (3 조각들, 약 3x3 cm) 실시예 7로부터의 드레싱들이 어떠한 방부제들 없이 4-7 ℃에서 500 ml 여과된(filtered) MilliQ 물에서 10 달 동안 어둠에서 보관되었다. 둥근 조각들이 펀칭되었고(punched out) 혈장을 응고하는 능력이 표준화된 엑스-비보 분석 셋업에서 테스트되었다:

더 상세하게, 드레싱 조각들이 제조된(prepared) 드레싱들로부터 펀칭되었다(punched out). 펀칭된(Punched) 드레싱들 (직경 4 mm 또는 5 mm)가 1.5 ml 폴리프로필렌 저 결합 (low binding) 바이알들 (Corning)에 놓여졌고 5 명의 대상체들로부터 모은(pooled) 차가운 340ul 혈장(blood plasma), 20 ul CaCl₂ 및 40 ul 버퍼 A (1% BSA) 가 첨가되었다. 바이알들은 37.0 ℃에서 가열 블록에 놓였다. 각 바이알들은 일정한 간격들 (30-60 초(sec.))로 시각적으로(visually) 검사되었다(inspected): 바이알은 수동으로 거꾸로 뒤집어졌고 혼합물이 바이알의 바닥에 남으면, 샘플이 클로팅된(clotted) 것으로 해석되었다. 첨가된 혈장부터 클로트까지 시간이 기록되었다. 모든 측정들은 더블릿으로(in doublets) 수행되었다.

실시예 4와 동일하게, HEK293으로부터의 새롭게 제조된(prepared) 조직 인자의 버퍼 A에서 표준 희석 시리즈가, (SEQ ID　NO:　2) 참조(reference)로 사용되었다.

결과들은 아래 표에 요약되어 있다.

결론적으로, 10개월된(10-month-old) TL3 드레싱은 여전히 혈장의 클로팅을 개시할 수 있었다. 동일한 드레싱이 실시예 8 및 9의 미니 돼지 실험에서 사용되었다.

상이한 콘쥬게이션 비율을 가진 TL4는 클로팅을 여전히 개시할 수 있었다. 상이한 콘쥬게이션 비율들 및 DVS 활성화로 만들어진, TL1 및 TL2, 유사한 드레싱이 또한 클로팅을 개시할 수 있었다.

또한, 조직 인자는 보관 10 달 후 큰 용량(large volume) 액체로 누출되지(leaked out) 않은 것으로 보인다.

3 조각들의 TL3 드레싱이 1 조각 보다 (as 1 piece) 더 짧은 클로팅 시간을 주었기 때문에, 결과들은 도즈(dose)-반응 효과를 추가로 설명한다.

드레싱 재료에서 조직 인자가 유리(free) 용액에서 동등한(equivalent) 양보다 더 조밀할 것으로 예상되기 때문에 값들을 직접 비교할 수 없기는 하지만, 조직 인자 희석 시리즈로부터 판단하면, 직경 4 mm의 TL3의 3 둥근(round) 조각들의 클로팅 효율은 대략 0.010 mg/ml 유리(free) 조직 인자보다 더 좋다.

실시예 11 - 드레싱으로부터의 누출 및 재현성

이 실시예에서, 조직 인자의 누출이 없는 새로운(fresh) 조직 인자 드레싱들을 제조하는 것(preparing)의 재현성(reproducibility)이 추가로 조사되었다. QuikClot 드레싱이 비교를 위해 포함되었다.

(상기 실시예 7에서 TL-3로 제조된) pH 8에서 1 hr. 동안 0.05 mg/ml 조직 인자로 커플링된, 에피클로로히드린 활성화된 드레싱 C가 버퍼(buffered) 에탄올아민 (10 ml)으로 켄칭(quenching) 단계 후 10 ml 물로 7 회 세척되었다. 상기 실시예 10에서 서술된 대로, 더블렛으로(in doublets) (a 및 b), 바이알 분석에서 혈장을 응고시키는 능력에 대해 드레싱 및 세척액(wash liquid) 둘 다가 분석되었다. 클로팅 시간이 기록되었다.

직경 4 mm QuikClot 드레싱 (Z-Medical, 카올린으로 함침)의 20 개의 둥근 조각들이 비교를 위해 연속적으로 세척되었다 (4 mm 둥근 조각 당 100 ul 물). 특히 첫 번째 세척 주기 및 모든 다음의 세척 주기들에서, 세척액에서 흰색 침전물이 보였다. 6 개의 드레싱 조각들이 1, 3 및 7 세척들 후 테스트를 위해 제거되었고 세척액이 수집되었다. 수동 바이알 분석에서 샘플들이 테스트되었다. 아래 표는 실험들을 요약한다:

결론적으로, 조직 인자 활성화된 드레싱은 콘쥬게이션 후 결합되지 않은 조직 인자 없게(free) 세척될 수 있다. 7 세척 주기들 후, 세척액은 클로팅을 개시할 수 없지만, 드레싱 상에 결합된 조직 인자는 클로팅을 개시할 수 있었다.

새 TL-3 드레싱의 3 조각들이 1 조각보다(as 1 piece) 더 짧은 클로팅 시간을 주기 때문에, 결과들은 도즈-반응 효과를 다시 설명한다.

비교에서, QuikClot의 카올린은 부분적으로 씻겨나갈(washed out) 수 있었고 세척액은 7 세척 주기들 후에도 클로팅을 개시할 수 있었다. 세척된 QuikClot는 여전히 클로팅을 개시할 수 있었다. 두 다른 타입들의 드레싱이 다른 메커니즘들로 개시한다는 것이 주목된다.

실시예 12 - e-coli로부터의 조직 인자로 드레싱

비-글리코실화된 재조합 조직 인자 (SEQ ID　NO:　2) (상기 실시예 4에서 아미노산 서열 참조)이 e-coli　로부터 발현되었고 Elabscience　Biotechnology　Inc.　(Wuhan, China and Houston,　US-Tx)으로부터 얻어졌다. 더 상세히, pET-28a 벡터를 사용, GST 태그와 융합된 N-말단(terminal)으로 발현(expressed), 친화성 정제(affinity purified), 태그 절단(Tag cleaved) 및 SEC 및 이온 교환 정제(ion exchange purified). 0.10 mg의 바이알들에 냉동건조로 수송(Shipped lyophilized)).

HEK293 및 e-coli로부터 새롭게 제조된(prepared) 조직 인자의 버퍼 A (BSA, PBS)에서 표준 희석 시리즈가 표준 엑스-비보 TEG® 5000 지혈 분석기 시스템(Haemostasis Analyzer System) (Thromboelastography, Haemonetics Corporation) 에서 비교되었다.

응고 인자들 단독의 효소 반응으로부터의 클로팅 시간이 R 값으로 기록되었다. 클로트 동력학(kinetics) 파라미터들 또한 기록되었다.

요컨대, 측정되는 버퍼 A에서 40 ul 샘플들이 TEG 기구에서 측정 컵(measuring cup)에 5 대상체들로부터 모은(pooled) 20 ul CaCl2 340 ul 혈장을 첨가되었다. R 값은 응고 인자들 단독으로부터 클로팅 시간으로 기록되었다. 모든 측정들은 더블렛(doublet) 실험들로 수행되었다.

e-coli로부터의 커플링된 조직 인자를 가진 드레싱이 실시예 7에 서술된 대로 제조되었고 바이알 분석에서 테스트되었다.

또한, 변형되지 않은 드레싱 및 HEK293으로부터의 조직 인자를 가진, 실시예 11로부터의 새롭게 제조된(prepared) 드레싱이 포함되었다.

결과들은 아래 표에 요약된다.

결론적으로, e-coli로부터의 유리(free) TF는 혈장의 클로팅을 개시할 수 있었지만, 분명히 HEK293으로부터의 TF보다 다소 더 낮은 효율을 가졌다. e-coli로부터의 TF와 커플링된 드레싱은 참조 드레싱보다 약간(slightly) 더 잘 클로팅을 개시할 수 있었다. 동일한 콘쥬게이션 조건들(conditions)로, HEK 세포들로부터의 조직 인자에 대해 말하자면, e-coli 드레싱으로부터의 조직 인자에 대한 클로팅 시간이 더 길었다.

SEQUENCE LISTING <110> Tissue-Link ApS <120> A SYSTEM TO IMPROVE HAEMOSTATIC CONTROL <130> 160098 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> extracellular domain of human Tissue Factor <222> (1)..(663) <400> 1 tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60 acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact 120 aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc 180 gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca 240 gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc 300 acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga 360 acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc 420 ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct 480 tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat 540 aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg 600 aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagagaatga 660 taa 663 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> extracellular domain of human Tissue Factor <222> (1)..(219) <400> 2 Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln 20 25 30 Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175 Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val 180 185 190 Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205 Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu 210 215 <210> 3 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Conserved sequence Tissue Factor <222> (1)..(71) <400> 3 Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu 1 5 10 15 Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr 20 25 30 Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu 35 40 45 Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu 50 55 60 Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro 65 70 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Tissue Factor conserved sequence <222> (1)..(124) <400> 4 Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr 1 5 10 15 Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys 20 25 30 Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn 35 40 45 Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr 50 55 60 Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr 65 70 75 80 Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser 100 105 110 Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys 115 120

Claims (15)

1. 바람직하지 않은 혈액 응고의 위험을 감소시키며 신속한 지혈을 촉진하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은 하기를 포함하는 시스템:
   ● 조직 인자 (TF) 또는 그것의 임의의 변이체(variant),
   ● 생리학적 환경에 노출되는 때 상기 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체가 상기 드레싱 재료에서 분리되는(dissociating) 것이 방지되는 방식으로 상기 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체가 연결되는(linked) 드레싱 재료.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체는 인간, 포르사인(porcine), 말(equine), 개(canine) 또는 소(bovine) 기원의 것인,
   시스템.
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체가 인간 조직 인자인,
   시스템.
   
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조직 인자는 인간 조직 인자의 상기 세포외 도메인(extracellular domain)인,
   시스템.
   
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조직 인자는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그것의 임의의 변이체를 포함하는,
   시스템.
   
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조직 인자는 SEQ ID NO: 2를 갖는 재조합 인간 조직 인자인,
   시스템.
   
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 드레싱 재료는 상처 드레싱들(wound dressings), 패치들(patches), 거즈들(gauzes), 세포외 기질 성분들(extracellular matrix components), 젤들(gels), 크림들, 연고들(ointments), 입자들(particles), 예를 들어 나노입자들(nanoparticles), 및 그것의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는,
   시스템.
   
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 드레싱 재료는 면, 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르들, 재생 셀룰로오스, 산화된 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리우레탄, 아가로스 또는 종이 기반 멤브레인들, 폴리아마이드들. 폴리 설폰 에테르(poly sulfone ether), 폴리비닐 알코올들, 니트로셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 혼합된 에스테르들(nitrocellulose mixed esters), 나일론들, 폴리카르보네이트, 폴리설폰(polysulfone), 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 코-블록 폴리머들, 블렌드들 및 그것의 조합들로 구성되는 군으로부터 선택되는,
   시스템.
   
9. 제 7항에 있어서,
   상기 조직 인자 또는 그것의 임의의 변이체는 아즈락톤들(azlactones), 에폭사이드들, 시아노브로마이드(cyanobromide), N-하이드록시숙신이미드 에스테르들, 나이트로페닐 에스테르들 및 다른 활성 에스테르들, 아릴 할라이드들, 이소티오시아네이트들, 알데하이드들, 말레이미드, 디설파이드들, 사이클릭 락톤들, 트리아진들, 벤조에퀴논(benzoequinone) 및 비닐설폰들(vinylsulfones)로 구성되는 군으로부터 선택되는 링커에 의해 상기 드레싱 재료에 연결되는,
   시스템.
   
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연결은 공유 결합(covalent bonding)에 기초하는,
    시스템.
    
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 드레싱 재료는 포유동물 혈장/혈액에서 흡수성 및/또는 비-흡수성인, 재료로 만들어지는,
    시스템.
    
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    인자 Vll/VIIa를 추가로 포함하는,
    시스템.
    
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직 인자 안정화제(stabilizing agent)를 추가로 포함하는,
    시스템.
    
14. 제 13항에 있어서,
    상기 조직 인자 안정화제는 혈청 알부민, 젤라틴(gelatin), 카제인(casein) 및 그것의 유도체들을 포함하는 군으로부터 선택되는 단백질인,
    시스템.
    
15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서,
    상기 조직 인자 안정화제는 상기 드레싱 재료에 부착되는(attached) 시스템.