CN101300022A - 抗真菌肽和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了通过用CAP37和其衍生物治疗真菌感染的方法，所述衍生物包括在其中的两个半胱氨酸残基的至少一个处具有丝氨酸或苏氨酸替代的肽类似物。还设想该肽的氨基酸残基的其他替代。

Description

抗真菌肽和其使用方法
背景
CAP37(Mr 37kDa的阳离子抗微生物蛋白)最初被鉴定为人嗜中性粒细胞的不依赖于氧的杀灭机制的组分并且被证明对于包括鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的革兰氏阴性生物具有强的杀细菌活性(Shafer等人，1984；Shafer等人，1986；Spitznagel 1990)。与它对细菌的作用不同，天然CAP37蛋白质对宿主细胞具有有效的调节作用。它是单核细胞吞噬系统的细胞如单核细胞(Pereira等人，1990)、小胶质细胞(Pereira等人，2002)和巨噬细胞(Larrick等人，1991)的有效调节剂。它还调节角膜上皮功能(Ruan等人，2002)、内皮功能(Lee等人，2002；Lee等人，2003)和平滑肌细胞功能(Gonzalez等人，2004)。
CAP37的结构功能分析使得我们可以将它的抗细菌结构域描绘为对应于天然分子的残基20到22的区域(Pereira等人，1993)。包含该25个氨基酸序列(CAP37(20-44)nat)的肽模拟天然分子的抗微生物活性(Pereira等人，1993)并且将其活性范围延伸到包括两种革兰氏阳性生物：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。该肽的杀细菌活性是pH依赖性的，在pH5.0到5.5之间得到最大活性。用丝氨酸残基替换26和42位的半胱氨酸残基(CAP37(20-44)ser26/42)导致无活性化合物(Pereira等人，1993)。体内实验表明CAP37(20-44)nat在内毒素休克的有意识大鼠模型中减弱大肠杆菌脂多糖(LPS)的致死效应中的功效。
由于多种念珠菌物种的感染可以导致从自限性表面感染到威胁生命的全身性感染的疾病表现(Nola等人，2003)。近来，侵入性真菌感染有了显著增加，并且念珠菌物种开始大量引起严重的医源性感染(Clark和Hajjeh，2002；Hobson 2003，Nola等人，2003；Rapp 2004)。其原因是负杂的但是可以主要归因于医学最近的发展，导致免疫减弱的人的存活增加和使用内置医学装置和导管来治疗住院患者(Clark和Hajjeh 2002；Nola等人，2003)。对现有抗真菌药物抗性的不断产生抗性进一步使得与真菌感染相关的临床和公共健康问题复杂化。需要具有抗真菌活性的新药物。这就是本发明的目的。
附图简述
图1显示了四种CAP37肽的杀念珠菌活性。测试了400mg/ml(实心条形)和200mg/ml(对角线斜纹)的CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26、CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44)ser26/42对白色念珠菌A-155、A-22和A-111(已知为氟康唑敏感的)和分离物A-5、A-20和A-46(已知为氟康唑抗性的)的活性。如在材料和方法部分中详述的测定被杀灭的百分比。数值被表示为来自一式三份进行的三个独立实验的平均值±标准误差。
图2显示了CAP37肽对白色念珠菌的菌丝型的活性。测试了CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26、CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44)ser26/42对白色念珠菌A-155、A-22和A-111、A-5、A-20和A-46的活性。如在材料和方法部分中详述的那样测定被杀灭的百分比。数值被表达为来自一式三份进行的三个独立实验的平均值±标准误差。
图3显示了CAP37肽对多种念珠菌种的活性。测试了CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26、CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44)ser26/42对高里念珠菌(C.guilliermondii)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、假热带念珠菌(C.pseudotropicalis)、热带念珠菌(C.tropicalis)、白色念珠菌的血液分离物、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)的两种分离物、克柔念珠菌(C.glabrata)的三种分离物、光滑念珠菌(C.krusei)的一种分离物和酿酒酵母的两种分离物的杀真菌活性。高里念珠菌(C.guilliermondii)和近平滑念珠菌的肽浓度为100μg/ml(37.5μM)，而用400μg/ml(150μM)的肽浓度测定所有其他菌株。数值被表示为以一式三份进行的三到四个独立实验的平均值±标准误差。
图4显示了用FUN-1活体染料和共焦显微镜检查测定的CAP37的杀真菌活性。我们选择氟康唑敏感性白色念珠菌分离物(图像A-C)、假热带念珠菌(C.pseudotropicalis)(图像D-F)、克柔念珠菌(C.glabrata)分离物(图像G-I)和酿酒酵母分离物(图像J-L)进行这些研究。将真菌分离物与CAP37(20-44)nat肽、CAP37(20-44)ser26/42肽和不存在肽的情况下温育。被染成红色的细胞为活的，一致地染色绿色或者黄绿色的细胞为死的。显示了来自三个独立实验的代表性数字图像。
发明详述
本文阐明了基于抗生素蛋白质CAP37的天然序列的肽的抗真菌活性。所述肽可以用作抗真菌剂，尤其抗念珠菌的抗真菌剂。
常规地认为CAP37是PMN-来源的蛋白质，因为它在这些细胞颗粒中以组成型方式表达。然而，最近我们已经阐明存在可诱导形式的CAP37(Lee等人，2002；Pereira等人，1997；Ruan等人，2003；Gonzalez，等人，2004；和Pereira等人，2004)。CAP37可以在炎症介导的疾病如阿尔茨海默氏病(Pereira等人，1997)和动脉粥样硬化(Lee等人，2002)的脉管系统内衬的内皮细胞中表达。体外研究指出诱导是由于炎症介质，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和免疫调节物质，如LPS。使用金黄色葡萄球菌角膜炎的兔模型进行的体内研究在角膜上皮和边缘循环中血管内衬的内皮中非常清楚的应答感染的诱导(Ruan等人，2002)。此外，我们已经使用伤口修复的体内大鼠模型阐明，在皮肤鳞状上皮细胞、毛囊内衬细胞、皮脂腺的腺泡细胞和血管内衬的内皮细胞中应答创伤而发生的CAP37表达(Pereira等人，2004)。已经在皮肤(Nizet等人，2001；
Figure A20068003429400071
等人，2003；Shirafuji等人，1999；Oren等人，2003)、胃肠道内衬的粘膜表面(Frohm-Nilsson等人，1999；Fellermann和Stange，2001)、口面(Dale 2000；Dale 2001；)，呼吸道Hiemstra 2001；Diamond等人，2000；Huttner和Bevins，1999)和泌尿生殖道(Frohm-Nilsson等人，1999；Malm等人，2000)中阐明了上皮抗生素类。这些抗生素蛋白质被理想地定位用于作为针对入侵病原体的第一道防线。不管CAP37的表达是应答念珠菌而发生在宿主粘膜衬细胞，还是CAP37的诱导在具有复发的念珠菌病的患者中的粘膜和上皮表面受损而提示CAP37在保护宿主免于真菌感染中的生理学作用在当前都还是未知的。本文报导的研究首次描述CAP37肽和基于CAP37的天然序列的类似物和衍生物具有有效的抗真菌活性并且提示该肽比最初提出的具有更广谱的抗感染活性。
在一系列实验中，我们使用基于天然CAP37序列的肽，包括CAP37(20-44)nat和三种肽类似物(CAP37(20-44)ser26、CAP37(20-44)ser42、CAP37(20-44)ser26/42)，其中在26和/或42位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代，如表1所示。我们研究了在这两个位置的替代对多种念珠菌种的体外杀灭效果。我们的发现表明基于天然序列的肽(CAP37(20-44)nat)和仅仅半胱氨酸残基被替代的两种类似物(CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42)对白色念珠菌的显著活性。两个半胱氨酸的替代显著消除了针对白色念珠菌和所测试的许多念珠菌中的活性。尽管不希望被理论束缚，但是这些数据提示分子内二硫键是重要的，但是环状化合物的形成对于抗真菌活性不是必需的，因为两个半胱氨酸残基之间的分子间相互作用(使用两个单半胱氨酸替代的情况下是可能的)导致保留杀灭活性的肽。
表I.CAP37肽和衍生物
肽名称 肽序列 SEQ ID NO.
CAP37(20-44)nat              28                              42N-Q-G-R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C-F-Q 1
 CAP37(20-44)ser26  N-Q-G-R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C-F-Q  2
 CAP37(20-44)ser42  N-Q-G-R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-S-F-Q  3
 CAP37(20-44)ser28/42  N-Q-G-R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-S-F-Q  4
 CAP37(23-42)nat  R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C  5
 CAP37(23-42)ser28  R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C  6
 CAP37(23-42)ser42  R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-S  7
 CAP37(23-42)ser26/42  R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-S  8
 CAP37(20-44)thr28  N-Q-G-R-H-F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C-F-Q  9
 CAP37(20-44)thr42  N-Q-G-R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-T-F-Q  10
 CAP37(20-44)thr26/42  N-Q-G-R-H-F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-T-F-Q  11
 CAP37(23-42)thr28  R-H-F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C  12
CAP37(23-42)thr42 R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-T 13
 CAP37(23-42)thr26/42  R-H-F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-T  14
CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42肽对氟康唑抗性真菌分离物(A-5，A-20，A-46)的活性是显著的，得到对两种分离物(A-5和A-20)的强的杀灭(＜5％存活)并得到对分离物A-46的＞75％的杀灭(图2)。这些发现对于最近出现白色念珠菌的氟康唑抗性分离物和具有新的活性替代作用机理的需要用新的治疗剂治疗的非念珠菌物种是尤其合适的(Jabra-Rizk等人，2004；Sullivan等人，2004)。除了CAP37肽对白色念珠菌的氟康唑抗性真菌分离物具有活性这一重要发现外，图3表明所述肽在37.5μM浓度下显示出对高里念珠菌和近平滑念珠菌的有效活性。近平滑念珠菌最通常从加强医疗病房中严重患者分离，所述患者通常在经历治疗时具有内置插管和装置(Kuhn等人，2004)。假热带念珠菌(C.pseudotropicalis)和热带念珠菌(C.tropicalis)的几乎100％的起始接种物都被150μM的肽浓度杀灭。热带念珠菌正不断从白血病、其他瘤形成患者和加强医疗病房的那些患者的血液培养物中分离(Warn等人，2002)。这些肽中，CAP37(20-44)ser42对都柏林念珠菌比CAP37(20-44)nat更有效。都柏林念珠菌是新近鉴定的物种，其很少在健康人中发现，但是倾向于作为主要在HIV感染的个体中口咽感染的病原体被发现(Sullivan等人，2004)。这些肽对于克柔念珠菌、光滑念珠菌和酿酒酵母无活性，并且对白色念珠菌的菌丝形式有中等活性。
实现杀真菌活性所需的肽浓度为杀死革兰氏阴性分离物鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌所表现出的活性的大约两倍(Pereira等人，1993)。该活性范围在阳离子抗微生物肽中不是罕见的，所述肽倾向于对某些细菌种、真菌、寄生虫和/或病毒具有特异性和功效。除了CAP37外，PMN也含有几种阳离子抗微生物肽，包括防卫素、hCAP18/LL37、杀细菌通透性增强蛋白(BPI)和乳铁蛋白(Spitznagel，1990：Ganz和Weiss，1997)。防卫素对于白色念珠菌尤其有活性(Selsted等人，1985；Hoover等人，2003)。表明基于人乳铁蛋白的氨基末端的第一个阳离子结构域的合成肽在微摩尔水平具有杀念珠菌活性(Lupetti等人，2000)。也已经表明来自人血小板的抗微生物肽具有抗微生物活性(Tang等人，2002)。在从血小板分离的几种肽中，仅仅“当活化正常T细胞表达和分泌时被调节”的蛋白质(RANTES)和血小板因子-4(PF-4)显示出杀念珠菌活性。像CAP37肽一样，它们的活性是pH依赖性的，在pH5.5时具有最大活性(Tang等人，2002)。取决于每种肽的分子量，使用的活性肽浓度为150μg到1.0mg/ml。另一种公知的杀念珠菌分子是唾液富组蛋白(histatin)-5(Tsai和Bobek 1997；Edgerton等人，2000)。已经表明15μM的唾液富组蛋白-5浓度杀死80到100％的白色念珠菌芽生孢子(Tsai和Bobek，1996)。已经表明基于富组蛋白-5的C-末端杀真菌结构域的合成富组蛋白类似物有效抵抗白色念珠菌(Helmerhorst等人，1997)、光滑念珠菌、克柔念珠菌和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的氟康唑抗性菌株(Helmerhorst等人，1999)。
科学和生物技术团体对天然阳离子肽作为感染治疗中新的治疗剂的用途的热情高涨。常规抗生素的主要缺点是微生物很快产生多种抗性模式。这些阳离子抗微生物肽(包括本文描述的那些)怎样杀死微生物的确切机理还不是完全已知。然而，不希望被理论束缚，认为主要的杀细菌机理是微生物膜通过孔蛋白通道的通透性和自身促进的摄入途径(Hancock，1997)。阳离子抗微生物肽似乎不参与生物的代谢途径并且从而可能不参与共同的抗性机制。Hancock(1997)已经证明阳离子肽甚至在多达20次传代后也不诱导对接近最小抑制浓度的抗生素浓度的抗性突变体。显然，尽管CAP37肽的作用模式还未确定，不希望被理论束缚，似乎其作用模式与基于吡咯的药物的作用机理不同，因为它同样好地杀灭氟康唑抗性和敏感菌株。
材料和方法
肽合成
如以前所述的(Pereira等人，PNAS 1993)在肽合成仪上通过固相合成法合成肽。测定肽的纯度。通过质谱法验证肽的质量。合成的肽断定了以前的发现，即基于CAP37的天然氨基酸序列的由残基20到44的合成肽(CAP37(20-44)nat)对于许多革兰氏阴性生物具有有效的杀细菌活性(Pereira等人，PNAS 1993)。该肽的无活性类似物(其中26和42位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代(CAP37(20-44)ser26/42))(Pereira等人，PNAS 1993)用作无活性对照肽。此外，合成两种其他的肽类似物。一种肽的26位半胱氨酸残基被丝氨酸替代(CAP37(20-44)ser26)，另一种的42位半胱氨酸残基被丝氨酸替代(CAP37(20-44)ser42)。
真菌分离物和培养条件
用于该研究中的分离物包括白色念珠菌(ATCC 28367)、白色念珠菌的三种氟康唑敏感型粘膜分离物(称作A-22、A-111和A-155)、白色念珠菌的三种氟康唑抗性粘膜分离物(称作A-46、A-5和A-20)，和白色念珠菌的血液分离物(称作WDO)。将分离物在-70℃冷冻保存并在萨布罗右旋糖琼脂(Sigma，St.Louis，MO)平板上划线接种并在平板上在4℃下保持，在培养期间约每10天在新平板上传代培养。评估氟康唑抗性。克柔念珠菌在三种临床分离物、都柏林念珠菌的两种临床分离物、光滑念珠菌、高里念珠菌、近平滑念珠菌、假热带念珠菌和热带念珠菌各一种分离物和酿酒酵母的两种分离物也用于该研究中并且在萨布罗右旋糖琼脂平板上在4℃下保持。在具有0.1％D-葡萄糖(Sigma)的1％植物蛋白胨培养液(Becton Dickinson，Sparks MD)中33℃过夜培养单个酵母菌落。
菌丝的诱导
为了诱导菌丝形成，将来自萨布罗右旋糖琼脂平板的白色念珠菌分离物A-5、A-20、A-22、A-46、A-11和A-155的单个菌落转移到具有0.1％葡萄糖的1％植物蛋白胨培养液并在33℃过夜培养。在具有10％胎牛血清(Invitrogen，Grand Island，NY)的5ml RPMI-1640(Cellgro Mediatech Inc，Herndon，VA)中37℃下传代培养过夜培养物的等分试样(500μl)90分钟。在相差显微镜下确定菌丝形成。
体外杀念珠菌测定法
用用于冲洗的无菌的无内毒素水(Baxter，Deerfield，IL)以1mg/ml浓度配制所有肽的储存液。随后的稀释都用胰蛋白胨盐水pH 5.5进行(Shafer等人，Infect lmmun，1984)。将在具有0.1％葡萄糖的1％植物蛋白胨培养液中生长的单个菌落的过夜培养物的等分试样(100μl)在5ml具有0.1％葡萄糖的1％植物蛋白胨培养液中传代培养并在振动型恒温水浴(每分钟80次振动，Precision，Winchester，VA)中在33℃下温育90分钟以产生对数培养物。如通过相差显微术测定的，发现在这些条件下的细胞培养物主要由芽生孢子组成。读出光密度并将培养液用pH5.5的胰蛋白胨盐水(Shafer等人，Infect lmmun，1984)调节到500芽生孢子100μl。向96孔无菌聚苯乙烯微量滴定板(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中的100μl生物悬浮液加入100μl肽(终浓度400μg/ml和200μg/ml)或100μl胰蛋白胨盐水。将后者用作对照。将微量滴定板在37℃温育4小时并在萨布罗右旋糖琼脂板上接种来自每孔的100μl内含物并在37℃过夜温育。计数菌落形成单位(cfu)并将杀真菌活性表达为杀灭百分数并根据下面的等式计算：[(对照cfu-试验cfu)/对照cfu]×100＝杀灭的％。通过不存在肽的情况下仅在胰蛋白胨盐水中温育60分钟后存在的菌落数目表示对照cfu。通过计数在含有所述肽的胰蛋白胨盐水中温育后存在的菌落数目来测定试验cfu。每个实验点以一式三份进行。
杀真菌测定法的方法
还使用FUN-1活/死酵母活力试剂盒(FUN-1 Live/Dead YeastViability Kit)(Molecular Probes，Eugene，OR)评估酵母活力。使用的方法是基本上根据销售商提供的关于使用荧光显微术的方案。简言之，完全如上述制备酵母培养物。在不存在或存在终浓度为400μg/ml的肽(CAP37(20-44)nat和CAP37(20-44)ser26/42)的情况下温育(37℃3小时)克柔念珠菌、假热带念珠菌、白色念珠菌(氟康唑敏感分离物)和酿酒酵母(100μl胰蛋白胨盐水中5×105cfu)。在温育期结束时，将样品转移到微量离心管中并离心(室温下10,000×g 3分钟)。除去上清液并将沉淀物重悬浮在25μl GH溶液(含有10mM Na-HEPES的2％D-葡萄糖，pH7.2)中，如销售商提供的技术数据表中所述。从10mM贮存液制备FUN-1试剂的工作液(100μl 10μM)并向酵母中加入25μl(终浓度5μM)并在室温温育30分钟。将样品(10μl)置于显微镜载玻片上并在莱卡TCSNT共焦显微镜下使用Ar-488和Kr-568激光器和63x Plan APO 1.2 NA水浸没物镜观察染色。扫描图像并使用激光器TCS软件分析。
统计学分析
数据以来自以一式三份进行的三或四个独立实验的平均值±标准误差给出。
结果
肽的合成
从这些研究合成的肽在表1中表示。CAP37(20-44)nat含有两个半胱氨酸残基，其对应于天然CAP37蛋白质的26和42位，它们在天然CAP37分子中形成二硫键(Pohl等人，FEBS Lett 1990)。因此，通过将两个半胱氨酸用丝氨酸残基(CAP37(20-44)ser26/42)替换或者将26位的单个半胱氨酸用丝氨酸替换(CAP37(20-44)ser26)或者将42位的单个半胱氨酸用丝氨酸替换(CAP37(20-44)ser42)，评估这两个半胱氨酸残基对肽的活性的重要性。一个或两个半胱氨酸残基的替换导致该肽不能形成二硫键并且因此干扰可能的环状结构的形成。不希望被理论束缚，替换任一位置处的一个半胱氨酸干扰环状结构的形成但是仍然能够二聚化。
体外杀念珠菌测定法的标准化
将白色念珠菌(ATCC 28367)用于标准号体外杀灭测定法。我们研究了最佳生长条件(温度和时间，在25℃下5小时和在33℃下90分钟)、每孔芽生孢子数目(200、400、500、600、800和1000cfu)、肽浓度范围(750、500、400、200和100μg/ml)以及肽和念珠菌之间发生杀灭的接触时间(1、2和4小时)。数据表明使用在25℃生长5小时或在33℃生长90分钟的念珠菌之间没有显著性差异。90分钟温育在技术上更方便并且因此被常规地使用。测定每孔cfu的最佳数目为500并且需要念珠菌和肽之间在37℃4小时的温育时间来得到最佳杀灭。用不同浓度的CAP37(20-44)nat得到剂量依赖性杀灭。然而，在400μg/ml或150μM下得到活性和无活性肽之间的最佳区别。
CAP37肽对白色念珠菌的氟康唑敏感性和抗性菌株的杀真菌活性
肽CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42在400μg/ml下对于氟康唑敏感性临床分离物A-155、A-22和A-111具有强烈活性，取决于分离物，具有60％到94％之间的杀灭活性范围(图1)。分离物A-155似乎最敏感，80-94％的生物被杀灭。对于任何给定分离物，三种肽之间的活性没有统计学差异。与这三种肽的活性鲜明对比的是两个半胱氨酸残基都被丝氨酸残基替代的CAP37(20-44)ser26/42没有活性。
肽CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42对于氟康唑抗性分离物A-5和A-20具有高度活性，甚至在较低浓度(200μg/ml或75μM)的肽下得到显著活性。针对氟康唑抗性分离物A-46的活性需要较高浓度(400μg/ml)的肽。而被认为无活性的CAP37(20-44)ser26/42肽对分离物A-5和A-20具有适度活性。
肽CAP37(20-44)nal、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42对氟康唑抗性物种A-5、A-20和A-46和氟康唑敏感菌株A-155的作用是杀真菌的而不是抑制真菌的，因为在所述肽存在下活菌落数小于起始接种物。
CAP37肽对白色念珠菌的菌丝形式的杀真菌活性
CAP37肽对白色念珠菌的菌丝形式的杀真菌活性
当将它们对芽生孢子的活性比较时，CAP37肽对白色念珠菌的临床分离物的菌丝形式的活性较低(图2)。当比较肽CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42之间的活性时，似乎用CAP37(20-44)ser42得到了比其他CAP37肽更大的抗菌形式的活性。
CAP37肽对多种念珠菌种的杀真菌活性
CAP37肽的作用取决于所测试念珠菌的不同种而变(图3)。CAP37肽对高里念珠菌和近平滑念珠菌最有效。对于这两个种，低至100μg/ml(37.5μM)的肽浓度是杀真菌的。假热带念珠菌对于所有CAP37肽也是极度敏感的。对于高里念珠菌和近平滑念珠菌，用肽CAP37(20-44)ser26/42也得到了一定的活性，尽管显著小于其他三种CAP37肽。念珠菌的血液分离物也被CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42杀灭。对所有上面的种的活性都是杀真菌的而不是抑制真菌的。CAP37肽(CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42)有效抗都柏林念珠菌的两种分离物和克柔念珠菌的一种分离物(尽管程度较低)。CAP37肽对两种克柔念珠菌分离物、光滑念珠菌和酿酒酵母的两种分离物是无效的。
CAP37肽的抗真菌活性是杀真菌的。我们使用共焦显微术和荧光染料FUN-1评估细胞活力。我们选择了氟康唑敏感性白色念珠菌分离物和对CAP3720-44敏感的假热带念珠菌，和克柔念珠菌和酿酒酵母分离物之一作为如通过CFU测定法测定不受所述肽影响的真菌实例。使用该技术，我们观察到以前使用菌落计数的数据和显微镜评估之间良好相关性。共焦数据的代表图(图4)显示约70-80％的所有白色念珠菌芽生孢子染成绿色或黄绿色，表明当用CAP37(20-44)nat肽温育时多数酵母细胞都是死亡的。另一方面，相对无活性肽(CAP37(20-44)ser26/42)表明仅仅30％的芽生孢子是活的。用肽CAP37(20-44)nat处理假热带念珠菌显示＞95％的细胞被杀死。用无活性肽(CAP37(20-44)ser26/42)得到类似的结果，证实了我们用菌落形成单位测定法得到的结果。用克柔念珠菌和酿酒酵母进行的研究验证了用菌落形成单位测定法得到的数据；约10-15％的细胞被活性肽杀死并且在无活性肽存在下几乎所有细胞都是活的。对照(其中不存在肽的情况下温育酵母细胞)对活力没有影响。
实用性
可以用作根据本发明的抗真菌治疗剂的肽包括本文描述的肽以及美国专利号6,107,460；6,514,701；和6,730,659中描述的肽；将它们的说明书完整地明确引入本文作为参考。
如本文别处的指出的，本发明在优选实施方案中设想将CAP37(20-44)nat(线性的或者半胱氨酸之间环化的)、CAP37(20-44)ser26CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44)ser26/42用作抗真菌治疗。本发明还包括类似于肽CAP37(20-44)nat，CAP37(20-44)ser26、CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44)ser26/42的肽的用途，只是其中N-末端三个氨基酸和C-末端两个氨基酸是被截短的(CAP37(23-42)nat(线性的或者半胱氨酸之间环化的)、CAP37(23-42)ser26、CAP37(23-42)ser42和CAP37(23-42)ser26/42)。备选地，这些丝氨酸替代的肽的每一种可以备选用苏氨酸替代(即，SEQ IDNO.9-14)。此外，本文使用的CAP37肽或肽衍生物可以包含至少一个下面的替代：苯丙氨酸被酪氨酸替代；甘氨酸被丙氨酸替代；缬氨酸被丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸替代；丙氨酸被亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸替代；亮氨酸被丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸替代；异亮氨酸被缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸替代；丝氨酸被组氨酸、精氨酸或赖氨酸替代；苏氨酸被丝氨酸替代。
如本文别处指出的，所述肽衍生物可以是如上述修饰的CAP37(20-44)肽或CAP37(23-42)的衍生物。在一个备选的实施方案中，使用的肽可以包含CAP37(120-146)，即SEQ ID NO：16。备选地，完整CAP37蛋白质可以用于本发明的抗真菌治疗中。
本发明设想治疗患者、受试者或哺乳动物中真菌感染或者预防性预防患者、受试者或哺乳动物中真菌感染的方法，其包括对该患者、受试者或哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的肽。
此外，本文设想的用作抗真菌治疗的肽可以包含具有20、21、22、23、24或25个残基并且包含序列(SEQ ID NO：15)的肽：
R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-X11-R-X13-X14-M-X16-X17-X18-X19-X20
其中X3和X13是苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸；X4选自半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸；X5和X6选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸；X7、X11，和X14选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸。X9、X17和X18选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；X16是丝氨酸或苏氨酸；X19选自丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；X20选自半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸；R是精氨酸；H是组氨酸；M是甲硫氨酸，并且其中该肽可以在N-末端包含一个、两个或三个额外残基并且在肽的C末端包含一个或两个额外的残基并且其中在一个实施方案中，例如，X3-X7可以是精氨酸并且X11-X14可以是赖氨酸。
任一种本文所述的肽可以单独或者组合用作抗真菌治疗。例如，SEQ ID NO：1-16中的任一个可以单独或组合用作肽的“混合物”，此外，当肽缀合到聚合物如聚乙二醇时，SEQ ID NO：1-16的多种肽可以连接到相同的聚乙二醇分子。此外，可以将本发明的任一种肽二聚化，例如，以形成同型二聚体或异二聚体，如CAP37(20-44)nat二聚体、CAP37(20-44)ser26二聚体、CAP37(20-44)ser42二聚体或CAP37(20-44)set26-CAP37(20-44)ser42二聚体。对于分子内环化，在两个半胱氨酸之间形成二硫键。肽的二聚化和巯基之间的分子内环化是本领域公知的并且认为其详细解释不是本文所必要的。然而，这些方法的一个实例在ThermoElectron Corp.2005的技术报告TI-PEP05-0405中说明，将其完整包括在本文中作为参考。二聚体可以通过“分子间氧化”连接，例如，连接在26位cys上的巯基将连接到来自具有cys 26的另一肽的SH基团，得到同型二聚体。类似地，可以将cys 42上的SH基团与来自另一肽的cys42上的SH基团环化，得到cys 42同型二聚体。在第三个备选方案中，cys 42和cys 26之间的巯基可以连接而得到杂二聚体。显示本领域环化和二聚化现状的其他参考文献包括J.Davies，J.Peptide Sci.9：471-501(2003)；P.Li和P.Roller.Can.Top.In Med.Chem.2：325-341(2002)；和M.Hornef，等人Nat.Immunol.5(8)：836-843(2004)，将它们都完整的明确引入本文作为参考。
本发明还包含DNA分子，其具有编码如本文所列或所述的任一氨基酸序列中定义的氨基酸序列的肽，尤其在26或42位具有被取代的半胱氨酸残基的核苷酸序列。
本发明设想使用本文所述的肽和/或其有效亚基治疗进行中的真菌感染和预防性治疗具有发生此类感染风险的个体。
合成或重组产生的用于本发明中的肽当与可药用载体组合时可以用作治疗组合物。这种组合物除了含有所述肽和载体、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂之外，还含有本领域公知的其他物质。所述制剂的合适的载体、运载体和其他组分例如在Remingtons′Pharmaceutical Sciences，(Mack Publishing Co.，1980或最新版本)中描述。术语“可药用的”是指无毒物质，其不干扰活性成分的生物活性的有效性。载体的特征将取决于施用途径。
本发明的药物组合物可以为脂质体的形式，其中分离的肽除了与其他可药用载体组合外，还与两亲性试剂如脂类组合，所述两亲性试剂以聚集体的形式存在，如胶束、不溶性单层、液晶、或者水溶液中的片层。脂质体制剂的合适的脂类包括但不限于，甘油一酯、甘油二酯、硫肝脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等等。此类脂质体制剂的制备在本领域技术水平之内，如美国专利号4,235,871、美国专利号4,501,728、美国专利号4,837,028和美国专利号4,737,323中公开，将它们都明确地完整引入本文作为参考。
本发明化合物的治疗有效量指有效控制、减轻或者抑制真菌感染的量。术语“控制”意在指所有过程，其中可以有感染进展的减慢、中断、阻止或停止，并且不必要指出感染症状的完全消除。
术语“治疗有效量”还意在定义导致真菌感染特征性的任何参数或临床症状的改善的量。实际剂量将随着患者的总体状况、症状的严重性和计数指示而变。
如本文使用的术语“受试者”或“患者”是指温血动物，尤其哺乳动物，其受到真菌感染的侵袭。可以理解豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、家畜、灵长类动物和人是该术语意义范围内的动物的实例。
用于本文所述的治疗中的化合物的治疗有效量可以由作为本领域技术人员的主治诊断医生通过使用常规技术和通过在类似环境下得到的观察结果容易地确定。在测定治疗有效剂量时，主治诊断医生考虑多种因素，包括但不限于哺乳动物种类、其大小、年龄、一般健康、有关的特定真菌疾病或状况、真菌疾病或病症的涉及程度或严重性、个体受试者的应答、施用的具体化合物、施用方式、施用的制剂的生物利用率特征、所选的剂量方案、相伴药物治疗的使用和其他相关情况。
本发明化合物的治疗有效量也指有效控制或减轻真菌感染的化合物的量。
本发明组合物的治疗有效量将一般含有足够的活性成分(即肽)以递送约0.1μg/kg到约100mg/kg(活性成分的重量/患者的体重)。优选地，组合物将递送至少0.5μg/kg到50mg/kg，更优选至少1μg/kg到10mg/kg。
本发明方法的实施包括对受试者以任何合适的全身或局部制剂，以有效递送上面列出剂量的量递送治疗有效量的肽。肽的基本上抑制真菌感染的有效的、特别优选的剂量是1μg/kg到1mg/kg肽。剂量可以一次施用，或者(例如)每天施用一次到五次或者每周一次或两次，或者通过经脉滴注连续施用，这取决于所希望的治疗效果。
如本文使用的，术语“治疗有效量”是指治疗组合物或方法的每种活性组分的总量，其足够显示出有意义的患者益处，即减轻真菌感染。当应用于单独施用的个别活性成分时，该术语仅仅指该成分。当应用于组合时，该术语是指导致治疗效果的多种活性成分的组合量，不管它们是组合顺序还是同时施用。
在实践本发明的治疗方法或用途时，将肽组合物的治疗有效量施用于具有真菌疾病状态的哺乳动物。可以根据本发明的方法单独或与其他疗法组合施用肽。
用于治疗组合物中或实施本发明方法中的肽的施用可以以多种常规方法进行，包括经口、通过吸入(例如，用于窦真菌感染)、经直肠，或者通过皮肤、皮下、腹膜内、阴道或静脉内注射。可以配制口服制剂使得肽在被释放之前穿过一部分消化系统，例如，它可以在到达小肠或结肠时才被释放。
当经口施用治疗有效量的肽时，肽将为片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂形式施用时，本发明的药物组合物可以额外含有固态载体，如明胶或辅剂。片剂、胶囊剂和粉剂优选含有约5到95％肽。当以液体形式施用时，可以加入液态载体，如水、石油、动物或植物来源的油，如花生油、矿物油、大豆油、或者芝麻油，或合成油。药物组合物的液体形式可以还含有生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液，或者二醇，如乙二醇、35丙二醇或者聚乙二醇。当以液体形式施用时，药物组合物优选含有按重量计约0.005到95％的肽。例如，可以经口施用100-1000mg活性成分，每天一到两次。
对于经口施用，可以将化合物配制成固体或液体制剂，如胶囊剂、丸剂、片剂、锭剂、熔化物、粉剂、混悬剂、或者乳剂。固体单位剂型可以是普通明胶型胶囊剂，其含有例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，如乳糖、蔗糖和玉米淀粉或者它们可以是缓释制剂。
在另一实施方案中，本发明的化合物可以用常规片剂基质如乳糖、蔗糖和玉米淀粉与黏合剂如阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶、崩解剂如马铃薯淀粉或者藻酸和乳化剂如硬脂酸或硬脂酸镁相组合来压片。通过将活性成分溶解在水性或者非水性可药用溶剂中制备液体制剂，所述溶剂还可以含有如本领域中已知的悬浮剂、增甜剂、调味剂和防腐剂。
对于肠胃外施用，可以将化合物溶解在生理学上可接受的药物载体中并作为溶液或者悬浮液施用。合适的药物载体的实例是水、盐水、葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇，或者动物、植物或合成来源的油。药物载体还可以含有本领域中已知的防腐剂和缓冲剂。
当通过静脉内、皮肤或皮下注射施用治疗有效量的肽时，肽通常为无致热原的、肠胃外可接受的水溶液或混悬液。此类肠胃外可接受的具有应当的pH、等渗性、稳定性等等的肽溶液在本领域技术之内。用于皮内、皮肤或者皮下注射的优选药物组合物除了含有肽之外，还应该含有等渗载体，如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)，或者本领域已知的其他载体。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂，或者本领域技术人员已知的其他添加剂。
如上面指出的，组合物还可以包含合适的载体。对于局部使用，可以加入任一种常规赋形剂以将活性成分配制成洗剂、软膏剂、粉剂、霜剂、喷雾剂或者气雾剂。对于手术植入，可以将活性成分与任一种公知的生物可降解的和生物蚀解的载体，如聚乳酸和胶原制剂组合。此类材料可以为固体植入物、缝线、海绵、伤口敷剂等等的形式。在任一情况下，对于材料的局部使用，活性成分通常以约1∶1000到1∶20,000的重量比存在于载体或赋形剂中，但是不限于该范围内的比例。用于局部使用的组合物的制备被详述在Remington′s Pharmaceutical Sciences，最近版本(Mack Publishing)中。
在优选治疗方法中，以静脉内灌注以1mg活性成分/kg-4mg/kg体重的范围每天一次提供肽组合物。
如所指出的，本领域技术人员可以确定优选的量和施用方式。制备制剂领域中的技术人员可以根据所选化合物的具体特征、待治疗的感染、感染阶段和其他相关情况，使用本领域已知的，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences，最新版本，Mack Publishing Co中描述的配制技术容易地选择施用形式和方式。
利用本领域已知的技术可以生产药物组合物。通常，将治疗有效量的肽与可药用载体混合。
本发明还包括通过应用足够治疗感染的肽量，如0.5-10％来治疗局部真菌感染的方法。局部药疗法可以采用任一种标准形式，如糊剂、凝胶剂、霜剂和软膏剂。通过简单地制备待施用化合物的溶液，优选使用已知促进经皮吸收的溶剂，如乙醇或者二甲基亚砜(DMSO)，用或不用其他赋形剂来制备溶液，完成局部应用。优选地，将使用贮库制剂和多孔膜形式或者固体基质形式的贴剂完成局部施用。
本发明中药物组合物的肽量将取决于被治疗的状况的性质和严重性和患者已经经历的先前治疗的性质。最后，主治医生将决定治疗每个个体患者所用的肽量。最初，主治医生将优选施用低剂量的肽，并观察患者的反应。将施用较大剂量的肽直到为该患者得到最佳的治疗效果，并且在此时剂量不进一步增加。不希望被具体剂量限制，预期用于实施本发明方法的多种药物组合物应该含有约0.1mg到约1000mg肽/kg体重/剂。
使用本发明的药物组合物的静脉内疗法的持续实践将取决于被治疗的疾病和状况的严重性和每名患者的潜在的特应性反应。预期肽的每次应用的持续时间将在1到2小时范围内并且通过连续静脉内施用被每12或24小时给药一次。最后，主治医生将决定使用本发明的药物组合物的静脉内治疗的适当的持续时间。
如果主治医生要求，那么也可以以本领域普通技术人员已知的方式提供其他抗生素、静脉内液体、心血管和呼吸支持体。
可以被本文所述的肽组合物治疗的真菌疾病包括但不限于：念珠菌、酿酒酵母、引起组织胞浆菌病的夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)和其他组织胞浆菌种、烟曲霉和引起曲霉菌病的其他物种(多数发生在肺中)，和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(有时在肺中被发现，但是多数在中枢神经系统中被发现)，其引起被称作隐球菌病的疾病。
可以用额外的药学方法控制肽的作用持续时间。通过使用聚合物缀合、复合或者吸收本文的肽可以实现增加的半寿期和控释制剂。通过选择合适的大分子和大分子的合适浓度以及掺入方法以便控释，可以实现受控的递送和/或增加的半寿期，所述大分子为例如，多糖、聚酯、聚氨基酸、均聚物聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯基酯、甲基纤维素或者羧甲基纤维素和丙烯酰胺类如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺。
用于控制控释制剂的作用持续时间和半寿期的另一可能的方法是将肽分子或其功能衍生物掺入到聚合物材料颗粒中，如聚酯、聚酰胺、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)、乙烯乙酸乙烯基酯共聚物、例如聚乙二醇和聚(1-天冬酰胺)的共聚物胶束。
通过使用本领域已知的方法将本文所述的肽缀合到其他分子，如聚合物以形成药物-聚合物缀合物，可以延长所述肽的半寿期。例如，用被称作“聚乙二醇化”的方法可以将肽(例如共价)结合到本领域已知的惰性聚合物分子，如聚乙二醇(聚乙二醇)的分子上。因此，聚乙二醇化可以延长肽分子的体内寿命从而延长治疗有效性。聚乙二醇化还可以减小肽分子的潜在抗原性。聚乙二醇化还可以增强肽的溶解度从而提高它们的治疗效果。使用的聚乙二醇可以是线性或支链的。
聚乙二醇分子可以被官能团修饰，如Harris等人，″聚乙二醇ylation，A Novel Process for Modifying Phararmacokinetics″，Clin Pharmacokinet2001：40(7)；539-551中所示，并且肽的氨基末端残基的氨基或者内部半胱氨酸残基或其中具有连接基团的其他氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸)可以连接到聚乙二醇分子，其中聚乙二醇分子可以携带一个或多个一种或多种类型的肽，或者肽可以携带一个以上的聚乙二醇分子。
“聚乙二醇化的肽”是指本发明的肽，其具有共价结合到该肽的氨基酸残基或连接基团的聚乙二醇(聚乙二醇)部分。聚乙二醇分子还可以通过例如包含1到10个氨基酸的接头连接到肽。
“聚乙二醇”是指聚(亚烷基)二醇化合物或其衍生物，使用或不适用偶联剂或者用偶联或活化部分(例如，用巯基、三氯甲磺酸基、三氟乙基磺酸基、氮丙啶、环氧乙烷或者优选用马来酰亚胺部分)衍生。化合物如马来酰亚胺单甲氧基聚乙二醇是本发明的示例性或活化的聚乙二醇化合物。其他聚(亚烷基)二醇化合物，如聚丙二醇可以用于本发明。其他合适的聚合物缀合物包括，但不限于，非多肽聚合物、下面类型的带电或中性聚合物：例如，葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸或其他基于糖类的聚合物、生物素衍生物和树状聚合物。术语聚乙二醇还意在包括聚环氧烷类型的其他聚合物。
聚乙二醇可以被连接到肽的任一N-末端氨基酸和/或可以被连接到N-末端氨基酸的下游氨基酸，如赖氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸或者本领域技术人员已知的其他此类氨基酸。例如，通过将聚乙二醇连接到肽的半胱氨酸残基上的SH基团产生半胱氨酸-聚乙二醇化的肽。
化学修饰的肽含有至少一个聚乙二醇部分，优选至少两个聚乙二醇部分，至多到连接到肽而不去除其活性的最大数目的聚乙二醇部分，例如，聚乙二醇部分连接到优选在该肽的N-末端部分或其附近的氨基酸残基。
连接到蛋白质的聚乙二醇部分的分子量优选为约200到30,000MW。优选地，聚乙二醇部分将为约1,000到8,000MW，更优选为约3,250到5,000MW，最优选为约5,000MW。
本发明的每个化学修饰的肽的共价结合的聚乙二醇分子的实际数目可以取决于所希望的肽的稳定性(即，血清半寿期)在宽范围内变动。
使用例如(但不限于)美国专利号4,179,337；5,382,657；5,972,885；6,177,087；6,165,509；5,766,897；和6,217,869中所示技术，可以将预期用于本文的肽分子连接到聚乙二醇分子；将所述专利各自的说明书和附图完整地明确引入本文作为参考。
备选地，可以将肽捕获在微囊、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和毫超微囊剂)中，所述微囊为例如通过凝聚技术或者通过界面聚合法制备(例如，分别为羟基甲基纤维素或明胶微囊和聚(异丁酸甲酯)微囊)。此类技术被公开于Remington′sPharmaceutical Sciences的最新版本中。
美国专利号4,789,734描述了在脂质体中包囊在生物化学品中的方法并且从而将其在明确引入本文作为参考。大体上，将材料溶解在水溶液中，加入合适的磷脂和脂类以及表面活性剂(如果需要)，并将材料透析或超声处理(如果必要)。已知方法的综述见G.Gregoriadis，第14章.″Liposomes″，Drug Carriers in Biology and Medicine，pp.287-341(Academic Press，1979)。聚合物或蛋白质形成的微球体是本领域技术人员已知的，并且可以被定制用于穿过胃肠道直接浸入血流中。备选地，可以将试剂掺入并将微球体或者微球体复合物植入用于在几天到几个月的时间内缓慢释放。见例如，美国专利号4,906,474；4,925,673；和3,625,214，将它们引入本文作为参考。
当组合物将被用作可注射物质时，可以将其配制到常规的可注射载体中。合适的载体包括生物相容的和和可药用的磷酸盐缓冲盐溶液，其优选是等渗的。
为了重构根据本发明的冻干产物，可以使用无菌稀释剂，其可以含有公认被用于近似生理条件和/或政府规定所要求的物质。在这方面，无菌稀释剂可以含有缓冲剂以得到生理上可接受的pH，如氯化钠、盐水、磷酸缓冲盐水和/或其他生理学上可接受的和/或安全使用的物质。通常，用于人体中静脉内注射的物质应该符合食品和药物管理局(Food andDrug Administration)的规定，其是本领域技术人员可得到的。
药物组合物也可以是含有与上面关于冻干产物重构所述的相同物质的水溶液。
化合物还可以作为可药用酸或碱加成盐施用，所述盐通过与无机酸如氢氯酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应形成，或者通过与无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱如单-、二-、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺反应形成。
如上述，可以将本发明的化合物被掺入到可以用于治疗目的的药物组合物中。然而，术语“药物制剂”在本文中以更广义包括含有根据本发明的肽组合物的制剂，其不仅用于治疗目的而且用于如本领域已知的试剂或诊断目的，或者用于组织培养。意在用于治疗用途的药物制剂应该含有“可药用的”或者“治疗有效量”的肽，即预防性或治疗性健康措施必需的量。如果药物制剂将被用作试剂或诊断，那么它应该含有试剂或诊断量的肽。
考虑到本文提供的教导，本文列出的所有测定方法都在本领域普通技术人员能力范围之内。
尽管本文关于某些实施方案描述了本发明，从而可以更完全地理解和明白本发明的方面，但是本发明不意在局限于这些具体实施方案。相反，预期所有备选方案、修饰和等同方案都包括在如本文定义的本发明的范围内。从而，包括优选实施方案的上述实施例将用于阐明本发明的实践，应该理解这些细节仅仅是作为举例和为了阐明性讨论本发明的优选实施方案而说明，并且是为了提供被认为最有用并且容易理解本发明的步骤以及原理和概念方面的描述而提供。可以对本文所述的多种组合物的配制或者本文所述的步骤或方法步骤的顺序进行改变而不背离本文所述的精神和范围。
将本文引用的所有参考文献、文章和专利申请都明确完整地引入本文作为参考。
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序列表
<110>Pereira，Heloise Anne
Fldel，Paul
<120>抗真菌肽和其使用方法
<130>5835.081 wo
<150>60/704,256
<151>2005-08-01
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>1
Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1               5                   10                 15
Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln
            20                  25
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>2
Asn Gln Gly Arg His Phe Ser Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1               5               10                 15
Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln
            20                 25
<10>3
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>3
Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1              5                       10              15
Val Met Thr Ala Ala Ser Ser Phe Gln
           20                  25
<210>4
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>4
Asn Gln Gly Arg His Phe Ser Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1               5                  10                  15
Val Met Thr Ala Ala Ser Ser Phe Gln
            20                 25
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>5
Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5                   10                 15
Ala Ala Ser Cys
            20
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>6
Arg His Phe Ser Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5                   10                 15
Ala Ala Ser Cys
            20
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>7
Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5               10                 15
Ala Ala Ser Ser
            20
<210>8
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>8
Arg His Phe Ser Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5                  10                  15
Ala Ala Ser Ser
            20
<210>9
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>9
Asn Gln Gly Arg His Phe Thr Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1               5                  10                  15
Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln
            20                 25
<210>10
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>10
Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1               5                   10                 15
Val Met Thr Ala Ala Ser Thr Phe Gln
           20                  25
<210>11
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>11
Asn Gln Gly Arg His Phe Thr Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe
1               5                   10                 15
Val Met Thr Ala Ala Ser Thr Phe Gln
            20                 25
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>12
Arg His Phe Thr Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5                  10                  15
Ala Ala Ser Cys
            20
<210>13
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>13
Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5                   10                15
Ala Ala Ser Thr
            20
<210>14
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>14
Arg His Phe Thr Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
1               5                   10                 15
Ala Ala Ser Thr
            20
<210>15
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>完全合成的
<220>
<221>混杂的特征
<222>(3)..(3)
<223>phe，tyr，arg，lys，或his
<220>
<221>混杂的特征
<222>(4)..(4)
<223>cys，ser，thr，arg，lys，或his
<220>
<221>混杂的特征
<222>(5)..(5)
<223>gly，ala，arg，lys，或his
<220>
<221>混杂的特征
<222>(6)..(6)
<223>gly，ala，arg，lys，或his
<220>
<221>混杂的特征
<222>(7)..(7)
<223>ala，leu，ile，val，arg，lys，或his
<220>
<221>混杂的特征
<222>(8)..(8)
<223>ala，leu，ile，或val
<220>
<221>混杂的特征
<222>(9)..(9)
<223>ala，leu，ile，或val
<220>
<221>混杂的特征
<222>(11)..(11)
<223>ala，leu，ile，val，arg，lys，或his
<220>
<221>混杂的特征
<222>(13)..(13)
<223>phe或tyr
<221>混杂的特征
<222>(14)..(14)
<223>ala，leu，ile，或val
<220>
<221>混杂的特征
<222>(16)..(16)
<223>ser或thr
<220>
<221>混杂的特征
<222>(17)..(17)
<223>ala，leu，ile，或val
<220>
<221>混杂的特征
<222>(18)..(18)
<223>ala，leu，ile，或val
<220>
<221>混杂的特征
<222>(19)..(19)
<223>ser，thr，his，arg，或lys
<220>
<221>混杂的特征
<222>(20)..(20)
<223>cys，ser，或thr
<400>15
Arg His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Arg Xaa Xaa Met Xaa
 1              5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa
            20
<210>16
<211>27
<212>PRT
<213>人
<400>16
Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val
            20                  25

Claims (24)

1.治疗或抑制受试者中真菌感染的方法，其包括：施用治疗有效量的具有20-25个氨基酸并且包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：5的肽或SEQ ID NO：5的肽衍生物，其中在该肽衍生物中至少一个半胱氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基替代。
2.权利要求1的方法，其中所述肽衍生物包含SEQ ID NO：5，其N-末端第一个半胱氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基替代。
3.权利要求1的方法，其中所述肽衍生物包含SEQ ID NO：5，其C-末端第一个半胱氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基替代。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中SEQ ID NO：5的肽衍生物还包含至少一个替代，所述替代包括：
苯丙氨酸被酪氨酸替代；
甘氨酸被丙氨酸替代；
缬氨酸被丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸替代；
丙氨酸被亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸替代；
亮氨酸被丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸替代；
异亮氨酸被缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸替代；
丝氨酸被组氨酸、精氨酸或赖氨酸替代；和
苏氨酸被丝氨酸替代。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中被治疗或抑制的真菌感染由念珠菌、酿酒酵母、组织胞浆菌、曲霉和隐球菌引起。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述肽在该肽的N末端上具有1到3个额外的氨基酸并且在该肽的C-末端上具有1到2个额外的氨基酸。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述肽包含序列(SEQ IDNO：15)：
R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-X11-R-X13-X14-M-X16-X17-X18-X19-X20
其中：
X3是phe、tyr、arg、lys或his；
X4是cys、ser、thr、arg、lys或his；
X5是gly、ala、arg、lys或his；
X6是gly、ala、arg、lys或his；
X8-X9、X17和X18是ala、leu、ile或val；
X7、X11和X14是ala、leu、ile、val、arg、lys或his；
X13是phe或tyr；
X16是ser或thr；
X19是ser、thr、his、arg或lys；
X20是ser、cys或thr；
R是arg；
H是his；以及
M是met。
9.权利要求8的方法，其中X4是cys并且X20是ser或thr。
10.权利要求8的方法，其中X20是cys并且X4是ser或thr。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述肽被聚乙二醇化。
12.权利要求11的方法，其中所述肽被通过包含1到15个氨基酸的接头分子共价聚乙二醇化到聚乙二醇分子上。
13.肽用于制备用于治疗或抑制受试者中真菌感染的药物的用途，其中所述肽具有20-25个氨基酸并且包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：5的肽或SEQ ID NO：5的肽衍生物，其中在该肽衍生物中至少一个半胱氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基替代。
14.权利要求13的药物的肽，其中所述SEQ ID NO：5的肽衍生物的N-末端第一个半胱氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基替代。
15.权利要求13的药物的肽，其中所述SEQ ID NO：5的肽衍生物的C-末端第一个半胱氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基替代。
16.权利要求13-15中任一项的药物的肽，其中SEQ ID NO：5的肽衍生物还包含至少一个替代，所述替代包含：
苯丙氨酸被酪氨酸替代；
甘氨酸被丙氨酸替代；
缬氨酸被丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸替代；
丙氨酸被亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸替代；
亮氨酸被丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸替代；
异亮氨酸被缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸替代；
丝氨酸被组氨酸、精氨酸或赖氨酸替代；和
苏氨酸被丝氨酸替代。
17.权利要求13-16中任一项的药物的肽，其中被治疗或抑制的真菌感染由念珠菌、酿酒酵母、组织胞浆菌、曲霉和隐球菌引起。
18.权利要求13-17中任一项的药物的肽，其中所述受试者是哺乳动物。
19.权利要求13-18中任一项的药物的肽，其中所述肽在该肽的N末端上具有1到3个额外的氨基酸并且在该肽的C-末端上具有1到2个额外的氨基酸。
20.权利要求13-19中任一项的药物的肽，其中所述肽包含序列(SEQ ID NO：15)：
R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-X11-R-X13-X14-M-X16-X17-X18-X19-X20
其中：
X3是phe、tyr、arg、lys或his；
X4是cys、ser、thr、arg、lys或his；
X5是gly、ala、arg、lys或his；
X6是gly、ala、arg、lys或his；
X8-X9、X17和X18是ala、leu、ile或val；
X7、X11和X14是ala、leu、ile、val、arg、lys或his；
X13是phe或tyr；
X16是ser或thr；
X19是ser、thr、his、arg或lys；
X20是ser、cys或thr；
R是arg；
H是his；
M是met。
21.权利要求20的药物的肽，其中X4是cys并且X20是ser或thr。
22.权利要求20的药物的肽，其中X20是cys并且X4是ser或thr。
23.权利要求13-22中任一项的药物的肽，其中所述肽被聚乙二醇化。
24.权利要求23的药物的肽，其中所述肽被通过包含1到15个氨基酸的接头分子共价聚乙二醇化到聚乙二醇分子上。
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