BRPI0614530A2 - uso de um peptìdeo, peptìdeo, composição farmacêutica, e, ácido nucleico - Google Patents

Abstract

<B>USO DE UM PEPTìDEO, PEPTIDEO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, áCIDO NUCLEICO<D>Um método de tratamento de infecções fungais por tratamento com peptídeos CAP37 e derivados dos mesmos, incluindo análogos de peptídeo tendo substituições de serina ou treonina em pelo menos um dos dois resíduos de cisteina no mesmo. Outras substituições dos resíduos de aminoácidos do peptídeo são também contempladas.

Description

"USO DE UM PEPTÍDEO, PEPTÍDEO, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, E, ÁCIDO NUCLEICO"

ANTECEDENTES

CAP37 (proteína antimicrobiana catiônica de Mr 37 kDa) foioriginalmente identificada como um componente de mecanismo de matarindependente de oxigênio do neutrófilo humano (PMN) e foi demonstradacomo tendo uma forte atividade bactericida para organismos Gram negativosincluindo Salmonella typhimurium, Escherichia coli, e Pseudomonasaeruginosa (Shafer et al., 1984; Shafer et al., 1986; Spitznagel 1990). Distintode seu efeito em bactérias, a proteína CAP37 nativa tem efeitos regulatóriospotentes em células hospedeiras. Ele é um regulador efetivo de células dosistema fagocítico mononuclear como monócitos (Pereira et al.,1990),microglia (Pereira et al., 2002) e macrófagos (Larrick et al., 1991 ). Tambémregula as funções epitelial corneal (Ruan et al., 2002), endotelial (Lee et al.,2002; Lee et al., 2003) e células de músculos lisos (Gonzalez et al., 2004).

A análise de função de estrutura de CAP37 permitiu aosrequerentes delinear seu domínio anti-bacteriano para uma regiãocorrespondendo a resíduos 20 a 44 da molécula nativa (Pereira et al., 1993).Um peptídeo compreendendo esta seqüência de 25 aminoácidos (CAP37(20-44)nat) imitou a atividade antimicrobiana da molécula nativa (Pereira et al.,1993) e estendeu sua faixa de atividade para englobar Staphylococcus aureuse Enteroeoeeus faeealis, dois organismos Gram positivos. A atividadebactericida do peptídeo foi dependente de pH, com atividade máxima obtidaentre pH 5,0 e 5,5. A substituição de resíduos cisteína em posições 26 e 42com resíduos serina (CAP37(20-44)ser26/42) resultou em um composto inativo(Pereira et al., 1993). As experiências in vivo demonstraram a eficácia de(CAP37(20-44)nat na atenuação dos efeitos letais de lipopolissacarídeos de E.coli (LPS) em um modelo de rato consciente de choque endotóxico (Bracketetal., 1997).

As infecções devido às várias espécies de Cândida podemresultar em manifestações de doença na faixa de infecções superficiais auto-limitantes a infecções sistêmicas em risco de vida (Nola et al, 2003). Nopassado recente, se notou um aumento dramático em infecções fungaisinvasivas e as espécies Cândida estão começando a contribuirsubstancialmente para sérias infecções adquiridas em hospitais (Clark eHajjeh, 2002; Hobson 2003, Nola et al., 2003; Rapp 2004). As razões paraisto são complexas mas podem ser atribuídas, em maior parte, aos últimosavanços em medicina levando a uma sobrevivência aumentada de pessoasimunocomprometidas e ao uso de dispositivos médicos localizados e cateterespara o tratamento de pacientes hospitalizados (Clark e Hajjeh 2002; Nola etal., 2003). A incidência em desenvolvimento de resistência a fármacos anti-fiingos disponíveis ainda compõe os problemas clínicos e de saúde públicaassociados com as infecções micóticas. Novos fármacos tendo atividade anti-füngica são necessários. E a este objeto que a presente invenção é dirigida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG 1. é um gráfico mostrando a atividade Candidacida dequatro peptídeos CAP37. Atividade de CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26,CAP3 7(20-44)ser42, e CAP37(20-44)ser26/42, a 400 mg/ml (barra sólida) e 200mg/ml (tiras diagonais) foi testada contra isolados clínicos de Candidaalbicans A-155, A-22 e A-111 (conhecidos como sendo sensível a fluconazol)e isolados A-5, A-20 e A-46 (conhecidos como sendo resistente a fluconazol).A porcentagem de mortes é determinada como detalhado na seção demateriais e métodos. Os valores são expressados como + erro padrão damédia de três experiências independentes realizadas em triplicata.

A figura 2 é um gráfico de atividade de peptídeos CAP37 naforma hifal de C. albicans. Atividade de CAP37(20-44)nat) CAP37(20-44)ser26,CAP3 7(20-44)ser42, e CAP37(20-44)ser26/42, a 400 mg/ml (barra sólida) e 200mg/ml (tiras diagonais) foi testada contra as formas hifais dos isoladosclínicos de Candida albicans A-155, A-22 e A-111, A-5, A-20 e A-46. Aporcentagem de mortes é determinada como detalhado na seção de materiais emétodos. Os valores são expressados como + erro padrão da média de trêsexperiências independentes realizadas em triplicata.

FIG 3. é um gráfico mostrando a atividade de peptídeosCAP37 contra várias espécies de Cândida. A atividade fungicida deCAP3 7(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26, CAP37(20-44)ser42, e CAP37(20-44)ser26/42 foi testada em C. guilliermondii, C. parapsilosis, C.pseudotropicalis, C. tropicalis, um isolado de sangue de C. albicans, doisisolados de C. dubliniensis, três isolados de C. glabrata, um isolado de C.krusei e dois isolados de S. cerevisiae. As concentrações de peptídeo para C.guilliermondii e C. parapsilosis foram de 100 μ§/πι1 (37.5 μΜ) enquantotodas as outras cepa foram testadas com as concentrações de peptídeo a 400μg/ml (150 μΜ). Os valores são expressados como + erro padrão da média detrês experiências independentes realizadas em triplicata.

A figura 4 mostra a atividade íungicidas de CAP37determinada com o corante FUN-I vital e microscopia confocal. Osrequerentes selecionaram um isolado de C. albicans sensível a fluconazol(imagens Α-C), C. pseudotropicalis (imagens D-F), um isolado de C.glabrata (imagens G-I) e um isolado de S. cerevisiae (imagens J-L) pararealizar estes estudos. Os isolados fungicos foram incubados com peptídeoCAP37(20-44)nat, peptídeo CAP37(20-44)ser26/42 e na ausência de peptídeo. Ascélulas que coloriram de vermelho estão vivas e as que coloremuniformemente verde ou verde-amarelo estão mortas. As imagens digitaisrepresentativas são de três experiências independentes são mostradas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Aqui é demonstrada a atividade anti-fungica de peptídeos combase na seqüência nativa da proteína antibiótica CAP37. Os peptídeos podemser usados como agentes anti-fungicos, particularmente contra Cândida sp.

CAP37 foi tradicionalmente considerado como uma proteínaderivada de PMN porque é constitutivamente expressado nos grânulos destescélulas. No entanto, mais recentemente, os requerentes demonstraram que apresença de uma forma indutível de CAP37 (Lee et al., 2002; Pereira et ai.,1997; Ruan et al., 2003; Gonzalez, et al., 2004; e Pereira et al., 2004). CAP37pode ser expressado em células endoteliais forrando a vasculatura em doençasmediadas inflamatórias, como mal de Alzheimer (Pereira et al., 1997) eaterosclerose(Lee et al., 2002). Os estudos in vitro indicam que a indução édevido a mediadores inflamatórios como fator de necrose de tumor α (TNF-a), interleucina 1 - (IL-1 ) e substâncias imunomodulatórias como LPS. Osestudos in vivo empregando um modelo de coelho de queratite de S. aureus,demonstraram que a indução muito prematura de CAP37 no epitélio corneal,e nos vasos forrando o endotélio na circulação límbica em resposta a infecção(Ruan et al., 2002). Adicionalmente, os requerentes demonstraram que aexpressão de CAP37 em células epiteliais escamosas da pele, células forrandoo folículo do cabelo, células acinares das glândulas sebáceas e célulasendoteliais forrando os vasos sangüíneos em resposta a feridas usando ummodelo de rato in vivo de reparo de feridas (Pereira et al., 2004). Osantibióticos epiteliais tem sido demonstrados na pele (Nizet et al., 2001;Sorensen et al., 2003; Shirafuji et al., 1999; Oren et al., 2003), superfíciesmucosais forrando o trato gastrointestinal (Frohm-Nilsson et al., 1999;Fellermann e Stange, 2001), superfície orais (Dale 2000; Dale 2001;), tratorespiratório (Hiemstra 2001; Diamond et al., 2000; Huttner e Bevins, 1999) etrato genitourinário (Frohm-Nilsson et al., 1999; Malm et al., 2000). Estasproteínas antibióticas estão idealmente localizadas para servir como umaprimeira linha de defesa contra os patógenos invasores. Se a expressão deCAP37 ocorre nos forros mucosais do hospedeiro em resposta a infecções porCândida ou se a indução de CAP37 é comprometida em superfícies mucosaise epiteliais em pacientes com candidíase recorrente sugerindo um papelfisiológico para CAP37 na proteção do hospedeiro contra as infecções fungaisé atualmente desconhecido. O estudo relatado aqui descreve, pela primeiravez, que os peptídeos CAP37 e análogos e derivados com base na seqüêncianativa de CAP37 possuem atividade antifungica potente e sugerem umaatividade anti-infectiva mais de amplo espectro para o peptídeo do queoriginalmente proposto.

Em uma série de experiências, os requerentes usarampeptídeos com base em seqüência CAP37 nativa incluindo CAP37(20-44)nat etrês análogos de peptídeos (CAP37(20-44)ser26, CAP37(20-44)ser42,CAP37(20-44)ser26/42) em que os resíduos de cisteína em posições 26 e/ou 42foram substituídos por resíduos de serina como indicado na tabela 1. Osrequerentes investigaram o efeito de substituições nestas duas posições sobrea eficácia de matar in vitro em uma faixa de espécies de Cândida. Asdescobertas dos requerentes demonstram uma atividade significante contra C.albicans pelo peptídeo com base na seqüência nativa (CAP37(20- 44)nat) e osdois análogos em que somente um resíduo de cisteína único foi substituído(CAP37(20- 44)ser26 e CAP37(20-44)ser42). A substituição de ambas ascisteínas significantemente anulou a atividade contra C. albicans e muitas dasespécies de Cândida testadas. Apesar de não desejar se limitar por teoria, estesdados sugeriram que a ligação de dissulfeto intramolecular foi importante masque a formação de um composto cíclico não foi essencial para a atividadeanti-fungica porque as interações intermoleculares entre dois resíduos decisteína, que é possível com as duas substituições de mono-cisteína, resultouem um peptídeo que reteve a atividade de matar.

Tabela 1

Peptídeos e derivados CAP37

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A atividade de peptídeos CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26e CAP37(20-44)ser42 contra os isolados mucosais resistentes a fluconazol (A-5,A-20, A-46) foi surpreendente, com mortes elevadas (<5% sobrevivência)obtidos contra dois dos isolados (A-5 e A-20) e > 75% de mortes obtidascontra o isolado A-46 (figura 2). Estas descobertas são particularmentepertinentes para a emergência recente de isolados resistentes a fluconazol deCândida albicans e espécies não albicans que irão requerer tratamento comnovas terapêuticas com novos ou alternativos mecanismos de ação (Jabra-Rizk et al., 2004; Sullivan et al., 2004). Além da descoberta importante de queos peptídeos CAP37 tem atividade contra isolados mucosais resistentes afluconazol de C. albicans, figura 3 indica que os peptídeos mostraram umaatividade potente contra C. guilliermondii, e C. parapsilosis a 37.5 μΜconcentração. C. parapsilosis é mais freqüentemente isolado de pacientescriticamente doentes em unidades de cuidado intensivo que tipicamente temcateteres presos e dispositivos enquanto sofrendo tratamento (Kuhn et al.,2004). Quase 100% dos inóculos de partida de C. pseudotropicalis e C.tropicalis foram mortos com concentrações de peptídeo de 150 μΜ. C.tropicalis está sendo cada vez mais isolado de culturas de sangue de pacientescom leucemias, outras neoplasias e os em unidades de cuidado intensivo(Warn et al., 2002). Dentre os peptídeos, CAP37(20-44)ser42 foi mais efetivocontra C. dubliniensis do que CAP37(20-44)nat. C. dubliniensis é uma espécierecentemente identificada que é raramente encontrada em pessoas saudáveismas tende a ser encontrada como o agente causador de infecçõesorofaringeais, principalmente em indivíduos infectados por HTV (Sullivan etal, 2004). Os peptídeos não foram ativos contra C. glabrata, C. krusei e S.cerevisiae e tinham uma atividade modesta contra as formas hifais de C.albicans.

As concentrações de peptídeo requeridas para obter umaatividade fungicidas são aproximadamente de duas vezes a demonstrada paramatar os isolados Gram negativos de S. typhimurium, E. coli e P. aeruginosa(Pereira et al., 1993). Esta faixa em atividade não é incomum dentre peptídeosantimicrobianos catiônicos que tendem a ter especificidade e potência paraalgumas espécies bacterianas, fungos, parasitas e ou vírus. Além de CAP37, oPMN contém vários peptídeos antimicrobianos catiônicos incluindo asdefensinas, hCAP18/LL37, proteína de aumento da permeabilidadebactericida (BPI), e lactoferrina (Spitznagel, 1990: Ganz e Weiss, 1997). Asdefensinas são particularmente ativas contra C. albicans (Selsted et al., 1985;Hoover et al., 2003). Os peptídeos sintéticos com base no primeiro domíniocatiônico do amino-término de lactoferrina humana foram mostrados comotendo atividades candidacidas em níveis micromolares (Lupetti et al., 2000).Os peptídeos antimicrobianos de plaquetas humanas também foram mostradoscomo tendo atividades antimicrobianas (Tang et al., 2002). Dentre os setepeptídeos isolados de plaquetas, somente a proteína denominada "Regulatedupon Activation Normal T cell Expressed and Secreted" (RANTES) e fator-4de plaquetas (PF-4) demonstraram atividade candidacida. Sua atividade comoos peptídeos CAP37 foi dependente de pH, sendo maximamente ativa a pH5,5 (Tang et al., 2002). As concentrações de peptídeo ativo usadas estavam nafaixa entre 150 μg e 1.0 mg/ml dependendo do peso molecular de cadapeptídeo (Tang et al., 2002). Outra molécula candidacida bem conhecida éhistatina- 5 salivar (Tsai e Bobek 1997; Edgerton et al., 2000). Asconcentrações de histatina-5 salivar de 15 μΜ foram demonstradas comomatando entre 80 e 100% de blastosporos de C. albicans (Tsai e Bobek,1996). Os análogos de histatina sintética com base em domínio C-terminalfungicida de histatina-5 foram demonstrados como sendo efetivos contra C.albicans (Helmerhorst et al., 1997), C. krusei, cepas resistentes a fluconazolde C. glabrata e Aspergillus fumigatus (Helmerhorst et al., 1999).

O uso de peptídeos catiônicos naturais como novosterapêuticos no tratamento de infecções está obtendo entusiasmo nascomunidades científicas e de biotecnologia. O maior inconveniente para osantibióticos convencionais é a rapidez com que os microorganismos podemganhar padrões de resistência múltipla. O mecanismo exato de modo estespeptídeos antimicrobianos catiônicos incluem os descritos aqui, matam osmicroorganismos não é completamente conhecido. No entanto, sem desejar selimitar por teoria, acredita-se que o mecanismo bactericida principal é apermeabilização da membrana do microorganismo através de canais de porinae vias de absorção auto-promovidas (Hancock, 1997). Os peptídeosantimicrobianos catiônicos não parecem estar envolvidos nas vias metabólicasdos organismos e assim podem não estar envolvidos em mecanismos deresistência comuns. Hancock (1997) mostrou que os peptídeos catiônicos nãoinduzem os mutantes resistentes mesmo após tanto quanto 20 passagens emconcentrações de antibióticos próximas de concentração inibitória mínima.Claramente, apesar do modo de ação dos peptídeos CAP37 não ser aindadeterminado, sem desejar se limitar por teoria, parece ser diferente domecanismo de ação de fármacos à base de azol, porque ele mata as cepasresistentes e sensíveis a fluconazol igualmente bem.

MATERIAIS E MÉTODOS

Síntese de peptídeos

Os peptídeos foram sintetizados por síntese em fase sólida emum sintetizador de peptídeo como previamente descrito (Pereira et al., PNAS1993). A pureza dos peptídeos foi verificada. A massa do peptídeo foiconfirmada por espectrometria de massa. Os peptídeos foram sintetizadoscom previsão em prévias descobertas de que um peptídeo sintético(CAP37(20-44)nat com base em seqüência de aminoácido nativa de CAP37consistindo de resíduos 20 a 44 tinha atividade bactericida potente para váriosorganismos Gram negativos (Pereira et ai., PNAS 1993). Um análogo inativodeste peptídeo em que os resíduos de cisteína em posições 26 e 42 foramsubstituídos por resíduos serina (CAP37(20-44)ser26/42) (Pereira et al., PNAS1993) foi usado como um peptídeo de controle inativo. Além disso doisoutros análogos de peptídeo foram sintetizados. Um peptídeo tinha o resíduocisteína em posição 26 substituído por serina (CAP37(20-44)ser26) e o outrotinha o resíduo cisteína em posição 42 substituído por uma serina (CAP37(20-44)ser42).

Isolados fúngicos e condições de cultura

Os isolados usados neste estudo incluíram [Candida albicans(ATCC 28367), três isolados mucosais sensíveis a fluconazol de C. albicans,designados A-22, A-Ill e A-155, e três isolados mucosais resistentes afluconazol de C. albicans designados A-46, A-5, e A-20, e um isolado desangue de C. albicans designado WDO. Isolados foram armazenadoscongelados a - 70 0C e passados em riscas sobre placas de agar DextroseSabouraud (Sigma, St. Louis, MO) e mantidos em placas a 4 0C, com sub-cultura sobre novas placas aproximadamente a cada 10 dias pela duração dosestudos. A resistência a fluconazol foi avaliada. Três isolados clínicos de C.glabrata, dois isolados clínicos de C. dubliniensis, e um único isolado de cadaum dentre C. krusei, C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis eC. tropicalis e dois isolados de Saccharomyces cerevisiae foram tambémusados neste estudo e foram mantidos em placas de agar Dextrose Sabourauda 4 0C. Uma única colônia de levedura foi cultivada durante a noite a 33 0Cem um caldo a 1% fitona peptona (Becton Dickinson, Sparks MD) com 0.1%D-glicose (Sigma).

Indução de hifasPara induzir a formação hifal de colônia única, isolados de C.albicans A-5, A-20, A-22, A-46, A-11 e A-155 de uma placa de agarDextrose Sabouraud foram transferidos a caldo a 1 % fitona peptona com 0.1glicose e cultivados durante a noite a 33 °C. Uma alíquota (500 μl) de culturanoturna foi subcultivada em 5 ml de RPMI-1640 (Cellgro Mediatech Inc5Herndon, VA)) com 10% soro de bezerro fetal(Invitrogen, Grand Island, NY)durante 90 min a 37°C. A formação hifal foi determinada sob microscopia defase.

Teste Candidacida in vitro

As soluções de carga de todos os peptídeos foram feitas emconcentrações de 1 mg/ ml em água isenta de endotoxina estéril para irrigação(Baxter, Deerfield, IL). As subseqüentes diluições foram todas feitas emsolução salina de triptona pH 5.5 (Shafer et al., Infect lmmun, 1984). Umaalíquota (100 μl) de uma cultura noturna de uma única colônia cultivada a 33°C em caldo 1% fitona peptona com 0.1% glicose foi subcultivada em 5ml de1% caldo fitona peptona com 0.1% glicose e incubada em um banho de águaem agitação (80 oscilações por min, Precision, Winchester, VA) durante 90min a 33 °C para dar uma cultura logarítmica. As culturas de células sob estascondições foram verificadas como consistindo predominantemente deblastosporos como determinado por microscopia de contraste de fase. Adensidade óptica foi lida e a cultura ajustada a 500 blastosporos /100μl emsolução salina de triptona pH 5.5 (Shafer et al., Infect lmmun, 1984). A 100 μlda suspensão de organismo em uma placa de microtitulação de poliestirenoestéril de 96 cavidades (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) foramadicionados 100 μl do peptídeo (concentrações finais 400 μg/ml e 200 μg/ml)ou 100 μl de solução salina de triptona. A última serviu como um controle. Aplaca de microtitulação foi incubada a 37°C durante 4 h e 100 μl dosconteúdos de cada cavidade foram colocados em placas de agar DextroseSabouraud e incubados a 37 °C durante a noite. As unidades formadoras decolônias (cfu) foram contadas e a atividade fungicida foi expressada comoporcentagem de mortos e calculada de acordo com a seguinte equação: [(cfude controle - cfu de teste )/cfu de controle] χ 100 = % mortos. Cfu de controleé indicados pelo número de colônias presentes após 60 min de incubação emsolução salina de triptona sozinho na ausência de peptídeo. O cfu de teste édeterminado por contagem do número de colônias presentes após incubaçãoem solução salina de triptona contendo o peptídeo. Cada ponto experimentalfoi realizado em triplicata.

Métodos para o teste fungicida

A viabilidade de levedura foi também avaliada usando o kit deviabilidade de levedura FUN-I Live/Dead Yeast (Molecular Probes, Eugene,OR). A metodologia empregada foi essencialmente de acordo com oprotocolo provido pelo vendedor para uso com microscopia fluorescente.Brevemente, as culturas de levedura foram preparadas exatamente comodescrito acima. C. glabrata, C. pseudotropicalis, C. albicans (isolado sensívela fluconazol) e S. cerevisiae (5 χ 10^5 cfu em 100 μl de solução salina triptona)foram incubados (37 C durante 2 h) na ausência ou presença de peptídeo(CAP3 7(20-44)nat e CAP37(20-44)ser26/42) em uma concentração final de 400μg/ml. No final do período de incubação, as amostras foram transferidas paratubos de microcentrífuga e centrifugadas (10,000 χ g durante 3min atemperatura ambiente). O sobrenadante foi removido e a pelota colocada emsuspensão em 25 μl de solução GH (2% D-glicose contendo 10 mM Na-HEPES, pH 7.2) como descrito na folha de dados técnicos provida pelovendedor. Uma solução de trabalho do reagente FUN-I (100 μl de 10 μΜ) foipreparada de 10 mM de solução de carga e 25μl (concentração final 5 μΜ)adicionado à levedura e incubados a temperatura ambiente durante 30 min.

Uma amostra (10μ1) foi colocada em uma lâmina de microscópio e acoloração observada sob um microscópio confocal Leica TCS NT usandolaseres Ar- 488 e Kr-568 e objetiva de imersão em água 63x Plan APO 1.2NA. As imagens foram varridas e analisadas usando o software Leica TCS.Análise estatística

Dados são apresentados como erro médio +.padrão a partir detrês ou quatro experiências independentes realizadas em triplicata.

RESULTADOS

Síntese de peptídeos

Os peptídeos sintetizados para estes estudos são representadosna tabela l.CAP37(20-44)nat contém dois resíduos de cisteína correspondendoàs posições 26 e 42 proteína CAP37 nativa que forma uma ponte dissulfeto namolécula de CAP37 nativa (Pohl et al., FEBS Lett 1990). Assim, aimportância destes dois resíduos de cisteína foi avaliada para atividade dopeptídeo por substituição de ambas as cisteínas com resíduos serina(CAP37(20-44)Ser26/42) ou uma cisteína única com uma serina em posição 26(CAP37(20-44)ser26) ou 42 (ΟΑΡ37(20-44)56γ42)· A substituição de um ou deambos os resíduos de cisteína confere sobre o peptídeo a incapacidade deformar uma ligação dissulfeto e assim interfere com a formação possível deuma estrutura cíclica. Sem desejar se limitar por teoria, a substituição de umacisteína em uma posição interfere com a formação de uma estrutura cíclicamas ainda permite a dimerização.

Padronização de teste candidacida in vitro.

C. albicans (ATCC 28367) foi usado para padronizar o testede morte in vitro. Os requerentes exploraram as condições de crescimentoótimas (temperatura e tempo 25 0C durante 5 h e 33 0C durante 90 min),números de blastosporos por cavidade (200, 400, 500, 600, 800, e 1000 cfu),faixa de concentrações de peptídeo (750, 500, 400, 200 e 100 μg/ml) e otempo de contato entre o peptídeo e Candida (1, 2 e 4 horas) para a morteocorrer. Os dados indicaram que não se nota uma diferença significante entreusar Candida que tinha sido cultivada durante 5h a 25 0C ou durante 90 min a33 0C. A incubação de 90 minutos foi mais conveniente de ponto de vistatécnico e foi assim empregada como rotina. Os números ótimos de cfu porcavidade foram determinados como sendo de 500 e um tempo de incubaçãode 4 horas a 37 0C entre Candida e peptídeo foi requerido para obter umamorte ótima. A morte dependente de dose foi obtida nas concentraçõesvariadas de CAP37(20-44) nat. No entanto, a melhor distinção entre peptídeoativo e inativo foi obtida a 400 μ^ιτιΐ ou 150 μΜ.

Atividade fungicida de peptídeos CAP37 em cepas resistentes e sensíveis afluconazol de C. albicans.

Peptídeos CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26, e CAP37(20-44)ser42 eram fortemente ativos contra os isolados clínicos sensíveis afluconazol A-155, A-22 e A-Ill a 400 μ§/πύ, com uma faixa de atividadeentre 60% e 94% de mortes dependendo do isolado (Fig. 1). Isolado A-155pareceu ser o mais sensível com 80-94% de organismos mortos. Não se notauma diferença estatística entre as atividades dos três peptídeos para qualquerdado isolado. Em contraste marcado com a atividade destes três peptídeos foia falta de atividade de CAP37(20-44)ser26/42 em que ambos resíduos de cisteínaforam substituídos por resíduos de serina.

Peptídeos CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26, e CAP37(20-44)ser42 foram altamente ativos contra isolados resistentes a fluconazol A-5 eA-20 com uma atividade significante obtida mesmo na menor concentração(200 μg/ml ou 75 μΜ) de peptídeo. Maiores concentrações (400 μg/ml) dospeptídeos foram requeridas para atividade contra o isolado resistente afluconazol A-46. Ao contrário, o peptídeo CAP37(20-44)ser26/42 consideradocomo inativo foi moderadamente ativo contra os isolados A-5 e A-20. O efeito de peptídeos CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26 eCAP37(20-44)ser42 sobre as espécies resistentes a fluconazol A-5, A-20, e A-46 e a cepa sensível a fluconazol A-155 foi fungicida em vez de fungistáticoporque as contagens de colônia viáveis na presença dos peptídeos forammenores do que o inoculo de partida.Atividade fungicida de peptídeos CAP 37 em formas hifais de C. albicans

Os peptídeos CAP37 são menos ativos nas formas hifais dosisolados clínicos de C. albicans quando comparados com suas atividades nosblastosporos (figura 2). Quando comparando a atividade entre peptídeosCAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26, e CAP37(20-44)ser42, pode parecer que amaior atividade foi obtida com CAP37(20-44)ser42 contra as formas hifais doque com os outros peptídeos CAP37.

Atividade fungicida de peptídeos CAP 3 7 em várias espécies de Cândida

O efeito dos peptídeos CAP37 em várias espécies Candida.Variou dependendo das diferentes espécies de Candida testadas (Fig. 3). Ospeptídeos CAP37 foram os mais efetivos em C. guilliermondii e C.parapsilosis. As concentrações de peptídeos tão baixas como 100 μg/ml (37.5μΜ) foram fungicidas para estas duas espécies. C. pseudotropicalis foitambém extremamente sensível a todos os peptídeos CAP37. Como com C.guilliermondii e C. parapsilosis alguma atividade foi também obtida compeptídeo CAP37(20- 44)ser26/42 apesar de significantemente menor do que comos outros três peptídeos CAP37. C. tropicalis e um isolado de sangue deCandida também foram mortos por CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26, eCAP37(20-44)ser42. A atividade em todas as espécies acima foi fungicida emvez de fungistática. Os peptídeos CAP37 (CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26, e CAP37(20-44)ser42) foram efetivos contra ambos os isolados de C.dubliniensis e um isolado de C. glabrata, apesar de em uma menor extensão.Os peptídeos CAP37 foram ineficazes contra os dois dos isolados de C.glabrata, C. krusei e os dois isolados de S. cerevisiae.

A atividade antifungica de peptídeos CAP37 é fungicida. Osrequerentes usaram microscopia confocal e corante fluorescente FUN-I paraavaliar a viabilidade celular. Os requerentes selecionaram um isolado de C.albicans sensível a fluconazol e sensível a C. pseudotropicalis que eramsensíveis a CAP3 720. 44, e um dos isolados de C. glabrata e S. cerevisiaecomo exemplos de fungos que não foram afetados pelos peptídeos comodeterminada pelo teste CFU. Usando esta técnica, os requerentes observaramuma boa correlação entre os dados anteriores usando contagens de colônias ea avaliação microscópica. As vistas representativas de dados confocais (figura4) mostram que aproximadamente 70-80% de todos as blastoconidias de C.albicans coloriram de verde ou verde-amarelo indicando que a maior partedas células de leveduras estavam mortas quando incubadas com peptídeoCAP3 7(20-44) nat. Por outro lado, o peptídeo relativamente inativo(CAP37(20-44)ser26/42) mostrou somente 30% das blastoconidias como estandovivas. O tratamento de C. pseudotropicalis com peptídeo CAP37(20-44)natmostrou morte de >95% das células. Resultados similares foram obtidos como peptídeo inativo (CAP37(20-44)ser26/42), confirmando os resultados obtidoscom os requerentes com o teste de unidade formadora de colônia. Estudosrealizados com C. glabrata e S. cerevisiae espelharam os dados obtidos com oteste de unidade de formação de colônia, aproximadamente 10-15% dascélulas foram mortas pelo peptídeo ativo e virtualmente todas as célulasforam viáveis na presença do peptídeo inativo. Um controle em que as célulasde levedura foram incubadas na ausência de peptídeo não teve efeito sobre aviabilidade.

UTILIDADE

Os peptídeos que podem ser usados como terapêuticas anti-fungicas de acordo com API Corporation incluem os peptídeos descritos aquiassim como peptídeos descritos nas patentes US 6.107.460; 6.514.701; e6.730.659; cujo relatório década é aqui expressamente incorporado porreferência em sua totalidade.

Com notado em outra parte aqui, a invenção contempla, emformas de realização preferidas, o uso de CAP37(20-44)nat (linear, ouciclizado entre as cisteínas), CAP37(20-44)ser26, CAP37(20-44)ser42, eCAP37(20-44)Ser26/42 como tratamentos anti-fungicos. A invenção aindacompreende o uso de peptídeos similares aos peptídeos CAP37(20-44)nat,CAP37(20-44)ser26, CAP37(20-44)ser42) e CAP37(20-44)ser26/42 exceto em queos três aminoácidos N-terminais e os dois aminoácidos C-terminais sãotruncados. (CAP37(23-42)nat (linear, ou ciclizado entre as cisteínas),CAP37(23-42)ser26, CAP37(23-42)ser42, e CAP37(23-42)ser26/42).

Alternativamente, cada um destes peptídeos substituídos por serina pode seralternativamente substituído com treonina, (isto é, SEQ ID NO. 9-14). Alémdisso, o peptídeo CAP37 ou derivado de peptídeo usado aqui podecompreender pelo menos uma das seguintes substituições: fenilalaninasubstituída por tirosina; glicinas substituídas por alaninas; valina substituídapor alanina, leucina, ou isoleucina; alanina substituída por leucina, isoleucinaou valina; leucina substituída por alanina, isoleucina ou valina; isoleucinasubstituída por valina, leucina ou alanina; serina substituída por histidina,arginina, ou lisina; e treonina substituída por serina.

Como notado em algum ponto, o derivado de peptídeo podeser um derivado de peptídeo CAP37(20-44) ou CAP37(23-42) modificadocomo descrito acima. Em uma forma de realização alternativa, o peptídeousado pode compreender CAP37(120-146), isto é, SEQ ID NO: 16.Alternativamente, toda a proteína CAP37 pode ser usada no tratamentoantifungico da presente invenção.

A presente invenção contempla um método de tratamento deuma infecção fungica em um paciente, indivíduo ou mamífero, ouprofilaticamente evitando uma infecção fungica em um paciente, indivíduo oumamífero compreendendo a administração ao paciente, indivíduo oumamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo descritoaqui.

Além disso, o peptídeo contemplado aqui para uso como umtratamento antifungico pode compreender um peptídeo tendo 20, 21, 22, 23,24, ou 25 resíduos e compreendendo seqüência (SEQ ID NO: 15):R-H-X3 -X4-X5 -Xg-Xy-Xg-X 9-H-X11-R-X13-X14-M-X16 - X17-X18-X19-X20

Em que X3 e X13 são fenilalanina, tirosina, arginina, lisina ouhistidina; X4 é selecionado dentre cisteína, serina, treonina, arginina, lisina ouhistidina; X5 e X$ são selecionados dentre glicina, alanina, arginina, lisina ouhistidina; X7, Xn, e Xu são selecionados dentre alanina, leucina, isoleucina,valina, arginina, lisina ou histidina. X9, Xj7, e X]g são selecionados dentrealanina, leucina, isoleucina e valina; X]6 é serina ou treonina; X19 éselecionado dentre serina, treonina, histidina, arginina e lisina; X2o éselecionado dentre cisteína, serina e treonina; R é arginina; H é histidina; e Mé metionina, e em que o peptídeo pode compreender um, dois, ou três resíduosadicionais na extremidade N-terminal e um ou dois resíduos adicionais naextremidade C-terminal do peptídeo e em que em uma forma de realizaçãopor exemplo X3-X7 pode ser arginina e Xn- Xi4 pode ser lisina.

Qualquer um dos peptídeos descritos aqui pode ser usadosozinho ou em combinação como tratamentos antifungicos. No exemplo,qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1-16 pode ser usado sozinho ou emcombinação como um "coquetel" de peptídeos, ainda mais onde os peptídeossão conjugados a um polímero como um PEG, vários dos peptídeos de SEQID NO: 1-16 podem ser fixados à mesma molécula PEG. Além disso,qualquer um dos peptídeos da presente invenção pode ser dimerizado, porexemplo, para formar homodímeros ou heterodímeros, como um dímeroCAP3 7(20-44)nat, um dímero CAP37(20-44)ser26, um dímero CAP37(20-44)ser42, ou um dímero CAP37(20-44)set26 - CAP37(20-44)ser42, por exemplo.Para a ciclização intramolecular, uma ponte dissulfeto entre as duas cisteínasé formada. A dimerização de peptídeos e ciclização intramolecular entre osgrupos tiol é bem conhecida técnica, e uma explicação detalhada não éconsiderada necessária aqui. No entanto, um exemplo destes processos sãoconhecidos a partir do Technical Report TI-PEP05- 0405 de Thermo ElectronCorp. 2005, incluído aqui por referência em sua totalidade. Dímeros podemser ligados via "oxidação intermolecular", por exemplo, o grupo tiol fixadoem cys em posição 26 pode ser ligado a um grupo SH de outro peptídeo tendouma 26 dando um homodímero. Similarmente, pode-se ciclizar o grupo SHem cys 42 com um grupo SH em um cys 42 de outro peptídeo, dando umhomodímero cys 42. Em uma terceira alternativa, os grupos tiol entre cys 42 ecys 26 podem ser ligados para dar um heterodímero. Outras referências quemostram o estado da técnica de ciclizações e dimerização incluem J. Davies,J. Peptide Sei. 9:471- 501 (2003); P. Li e P. Roller. Can. Top. in Med. Chem.2:325-341 (2002); e M. Hornef, et al. Nat. Immunol. 5(8):836-843(2004)todos sendo expressamente incorporados aqui por referência em suatotalidade.

A presente invenção ainda compreende uma molécula de DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos codificando um peptídeo tendo umaseqüência de aminoácidos como definido em qualquer uma das seqüências deaminoácidos descritas aqui, particularmente as tendo resíduos de cisteínasubstituídos nas posições 26 e 42.

A presente invenção contempla usar peptídeos descritos aquie/ou subunidades efetivas das mesmas para tratar infecções fungicas emandamento e para tratar profilaticamente um indivíduo que pode ter um riscode tal infecção.

O peptídeo usado na presente invenção, produzido de modosintético ou recombinante, pode ser usado como uma composiçãofarmacêutica quando combinado com veículo farmaceuticamente aceitável.Esta composição pode conter, além do peptídeo e veículo, diluentes, cargas,sais, tampões, estabilizadores, solubilizadores, e outros materiais bemconhecidos na técnica. Os veículos, carreadores apropriados e outroscomponentes da formulação são descritos, por exemplo, em Remingtons'Pharmaceutical Sciences, (Mack Publishing Co., 1980 ou a última edição). Otermo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico quenão interfere com a eficácia da atividade biológica do(s) ingrediente (s)ativo(s). As características do veículo irão depender da via de administração.

A composição farmacêutica da invenção pode estar na formade um lipossoma em que peptídeo isolado é combinado, além de outrosveículos farmaceuticamente aceitáveis com agentes anfipáticos como lipídeos,que existem em forma agregada como micelas, monocamadas insolúveis,cristais líquidos, ou camadas lamelares em solução aquosa. Os lipídeosapropriados para formulação lipossomas incluem, sem limitação,monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatídeos, lisolecitina, fosfolipídeos,saponina, ácidos de bile e outros. A preparação de tais formulaçõeslipossomais está dentro do nível do versado na técnica, como descrito porexemplo, na patente US 4.235.871; Patente No. 4.501.728; Patente U.S. No.4.837.028; e Patente U.S. No. 4.737.323, todas sendo expressamenteincorporados aqui por referência em sua totalidade.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dapresente invenção refere-se a uma quantidade que é eficaz no controle,redução, ou inibição de uma infecção fungica. O termo "controle" se destina areferir a todos os processos em que pode-se ter um retardo, interrupção,parada ou suspensão da progressão da infecção e não indica necessariamenteuma eliminação total dos sintomas da infecção.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é aindasignificado para definir uma quantidade resultante na melhora de quaisquerparâmetros ou sintomas clínicos característicos de uma infecção fungica. Adose real irá variar com a condição global do paciente, a seriedade dossintomas, e contra-indicações.

Como usado aqui, o termo "indivíduo" ou "paciente" refere-sea um animal de sangue quente, particularmente um mamífero, que é afetadocom uma infecção fungica. Entende-se que porquinhos da índia, cachorros,gatos, ratos, camundongos, cavalos, cabras, ovelhas, animais de zôo, animaisde criação, primatas e humanos são exemplos de animais dentro do escopo dosignificado do termo.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto usadono tratamento descrito aqui pode ser prontamente determinada pelo clínicoatendente diagnosticador, como um versado na técnica, pelo uso de técnicasconvencionais, e por observação dos resultados obtidos sob circunstânciasanálogas. Na determinação da dose terapeuticamente eficaz, vários fatores sãoconsiderados pelo atendente, incluindo mas não limitados à espécies domamífero, seu tamanho, idade, e saúde geral, a doença fungica específica oucondição envolvida, o grau de ou envolvimento ou a severidade da doença oucondição fungica, a resposta do indivíduo, o composto particularadministrado, o modo de administração, a biodisponibilidade característica dapreparação administrada, o regime de dose selecionado, o uso de medicaçãoconcomitante, e outras circunstâncias relevantes.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dapresente invenção também refere-se a uma quantidade do composto que éeficaz no controle ou redução da infecção fungica.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições dapresente invenção irá geralmente conter ingrediente ativo suficiente (isto é, opeptídeo) para distribuir de cerca de 0,1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg (peso doingrediente ativo/ peso corporal do paciente). Preferivelmente, a composiçãoirá dar pelo menos 0,5 μg kg a 50, mg/kg, e mais preferivelmente pelo menos1 μg/kg a 10 mg/kg.

A prática do método da presente invenção compreende aadministração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz dopeptídeo em qualquer formulação sistêmica ou local apropriada, em umaquantidade eficaz para distribuir as dosagens listadas acima. Uma dosagemeficaz, particularmente preferida do peptídeo para inibir substancialmente ainfecção fungica é de 1 μΒ/kg a 1 mg/kg do peptídeo. A dosagem pode seradministrada em uma base de uma vez, ou (por exemplo) de uma a cincovezes por dia ou uma vez ou duas por semana, ou continuamente via umgotejamento venoso, dependendo do efeito terapêutico desejado.

Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz) significa a quantidade total de cada componente ativo da composiçãofarmacêutica ou método que é suficiente para mostrar um benefício aopaciente significante, isto é, redução da infecção fungica. Quando aplicado aum indivíduo, ingrediente ativo, administrado sozinho, o termo refere-se aoingrediente sozinho. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se aquantidades combinadas de ingredientes ativos que resultam em efeitoterapêutico, seja administrado em combinação, serial ou simultaneamente.

Na prática, o método de tratamento ou uso da presenteinvenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição do peptídeoé administrada a um mamífero tendo um estado de doença fungica. Opeptídeo pode ser administrado de acordo com o método da presente invençãosozinho ou em combinação com outras terapias.

A administração do peptídeo usado na composiçãofarmacêutica ou para praticar o método da presente invenção pode serrealizada em vários modos convencionais, incluindo oralmente, por inalação(por exemplo para infecções fungicas dos sinos), retalmente, ou cutânea,subcutânea, intraperitoneal, vaginal ou injeção intravenosa. As formulaçõesorais podem ser formuladas de modo que o peptídeo passa através de umaporção do sistema digestivo antes de ser liberado, por exemplo ele pode nãoser liberado até alcançar o intestino delgado, ou o cólon.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo éadministrada oralmente, o peptídeo estará na forma de um comprimido,cápsula, pó, solução ou elixir. Quando administrada em forma decomprimido, a composição farmacêutica da invenção pode adicionalmenteconter um veículo sólido como gelatina ou um adjuvante. O comprimido,cápsula ou pó preferivelmente contém de cerca de 5 a 95% de peptídeo.Quando administrado em forma líquida, um veículo líquido, como água,petróleo, óleos de origem animal ou planta como óleo de amendoim, óleomineral, óleo de soja, ou óleo de sésamo, ou óleos sintéticos podem seradicionados. A forma líquida da composição farmacêutica pode ainda contersolução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo, ou glicóiscomo etileno glicol, 35 propileno glicol ou polietileno glicol. Quandoadministrada em forma líquida, a composição farmacêutica preferivelmentecontém de cerca de 0,005 a 95 % em peso de peptídeo. Por exemplo, 100-1000 mg de ingrediente ativo uma vez a duas vezes por dia podem seradministrados oralmente.

Para administração oral, os compostos podem ser formuladosem preparações sólidas ou líquidas como cápsulas, pílulas, comprimidos,pastilhas, fusões, pós, suspensões, ou emulsões. As formas de dosagemunitária sólida podem ser cápsulas de tipo de gelatina comum, contendo, porexemplo, tensoativos, lubrificantes, e cargas inertes como lactose, sacarose eamido de milho ou elas podem ser preparações de liberação prolongada.

Em outra forma de realização, os compostos desta invençãopodem ser formados em bases de comprimidos convencionais, como lactose,sacarose, e amido de milho em combinação com aglutinante s, como acácia,amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes, como amido de batata ouácido algínico, e um lubrificante como ácido esteárico, ou estearato demagnésio. As preparações líquidas são preparadas por dissociação doingrediente ativo em um solvente farmaceuticamente aceitável aquoso ou nãoaquoso que pode também conter agentes de suspensão, agentes adoçantes,agentes aromatizantes e agentes conservantes, como são bem conhecidos natécnica.

Para administração parenteral, os compostos podem serdissolvidos em um veículo farmacêutico fisiologicamente aceitável eadministrados como uma solução ou uma suspensão. São ilustrativos deveículos farmacêuticos apropriados água, solução salina, soluções dedextrose, soluções de frutose, etanol ou óleos de origem animal, vegetativa ousintética. O veículo farmacêutico também pode conter conservantes e tampõescomo bem conhecidos na técnica.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de peptídeo éadministrada por injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, o peptídeo estápreferivelmente na forma de uma solução ou suspensão aquosa isenta depirogênio, parenteralmente aceitável. A preparação destas soluções depeptídeo parenteralmente aceitáveis, tendo devida relação a pH, isotonicidade,estabilidade e outros, é bem conhecida na técnica. Uma composiçãofarmacêutica preferida para injeção intravenosa, cutânea ou subcutâneacontém, além do peptídeo, um veículo isotônico como injeção de cloreto esódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose, injeção de dextrose e cloreto desódio, injeção de Ringer lactada, tampão citrato pH 5,5, ou outro veículocomo bem conhecido na técnica. A composição farmacêutica da presenteinvenção pode também conter estabilizantes, conservantes, tampões,antioxidantes, ou outro aditivo bem conhecido do versado na técnica.

Como notado acima, as composições também podem incluir

um veículo apropriado. Para uso tópico, qualquer um dos excipientesconvencionais pode ser adicionado para formar os ingredientes ativos em umaloção, ungüento, pó, creme, pulverização ou aerossol. Para implante cirúrgico,os ingredientes ativos podem ser combinados com qualquer um dos veículosbem conhecidos biodegradáveis e bioerodíveis, como ácido poliláctico eformulações de colágeno. Estes materiais podem estar na forma de implantessólidos, suturas, esponjas, curativos de feridas, etc. Em qualquer evento, parauso local dos materiais, os ingredientes ativos geralmente estão presentes noveículo ou excipiente em uma relação em peso de cerca de 1:1000 a 1:20.000,mas não são limitados a relações dentro desta faixa. A preparação decomposições para uso local é detalhada em Remington's PharmaceuticalSciences, última ed. (Mack Publishing).

Em um método terapêutico preferido, a composição depeptídeo é provida em uma infusão de IV na faixa de 1 mg de ingredienteativo/ 4 mg/kg de peso corporal uma vez por dia.

Como notado, quantidades preferidas e modos deadministração são capazes de serem determinados por um versado na técnica.Um versado na técnica de preparação de formulações pode prontamenteselecionar a forma apropriada e modo de administração dependendo dascaracterísticas particulares do composto selecionado, a infecção a ser tratada,o estágio da infecção, e outras circunstâncias relevantes usando tecnologia deformulação bem conhecida na técnica, descrita, por exemplo, em Remington'sPharmaceutical Sciences, última ed. (Mack Publishing).

As composições farmacêuticas podem ser fabricadas usandotécnicas bem conhecidas na técnica. Tipicamente, a quantidadeterapeuticamente eficaz do peptídeo será misturada com um veículofarmaceuticamente aceitável.

A invenção ainda inclui um método de tratamento de infecçãofüngica tópica por aplicação típica de uma quantidade do peptídeo suficientepara tratar a infecção, por exemplo 0,5 - 10%. A medicação tópica pode tervárias formas padrões como pastas, géis, cremes, e ungüentos. A aplicaçãotópica pode ser obtida por simples preparação de uma solução do composto aser administrado, preferivelmente usando um solvente conhecido comopromovendo absorção transdérmica como etanol ou sulfóxido de dimetila(DMSO) com ou sem outros excipientes. Preferivelmente, a administraçãotópica será obtida usando um curativo ou do tipo de reservatório e demembrana porosa de uma variedade de matriz sólida.

A quantidade de peptídeo na composição farmacêutica dapresente invenção irá depender da natureza e severidade da condição sendotratada, e da natureza de tratamentos anteriores que o paciente sofreu. Por fim,o médico atendente irá decidir a quantidade de peptídeo com que tratar cadapaciente individual. Inicialmente, o médico irá preferivelmente administrardoses pequenas de peptídeo e observar a resposta do paciente. Maiores dosesdo peptídeo podem ser administradas até o efeito terapêutico ótimo ser obtidopara o paciente e neste ponto a dosagem não é mais aumentada. Sem desejarse manter a uma dosagem específica, contempla-se que as várias composiçõesfarmacêuticas usadas para praticar o método da presente invenção devemconter cerca de 0,1 mg a cerca de 1000 mg de peptídeo por kg de pesocorporal por dose.

A duração de terapia intravenosa usando a composiçãofarmacêutica da presente invenção irá variar, dependendo da severidade dadoença sendo tratada e a condição e resposta idiossincrática potencial de cadapaciente individual. Contempla-se que a duração de cada aplicação dopeptídeo estará na faixa de 1 a 2 h e dada uma vez a cada 12 ou 24 h poradministração intravenosa contínua. Por fim, o médico irá decidir sobre aduração apropriada de terapia intravenosa usando a composição farmacêuticada presente invenção.

Outros antibióticos, fluidos intravenosos, suportecardiovascular e respiratório podem ser também providos se requerido pelomédico em um modo bem conhecido do versado na técnica.

As doenças fungicas que podem ser tratadas pelascomposições de peptídeo descritos aqui incluem mas não são limitadas a:Candida spp., Saccharomyces eerevisiae, Histoplasma eapsulatum e outrasespécies de histoplasmo, que causam histoplasmose, Aspergillus fumigatus eoutras espécies (ocorrendo principalmente no pulmão, que causa Aspergilose,e Cryptoeoecus neoformans (às vezes encontrado no pulmão masprincipalmente no sistema nervoso central), que causa uma doença conhecidacomo criptococcose.

Os métodos farmacêuticos adicionais podem ser empregadospara controlar a duração de ação do peptídeo. As preparações de liberaçãocontrolada e meia-vida aumentada podem ser obtidas através do uso depolímeros para conjugar, completar com, ou absorver o peptídeo aquidescrito. A liberação controlada e/ou meia-vida aumentada podem ser obtidaspor selecionado de macro-moléculas apropriadas (por exemplopolissacarídeos, poliésteres, poliaminoácidos, homopolímeros, polivinilpirrolidona, etileno acetato de vinila, metilcelulose, ou carboximetilcelulose, eacrilamidas, como N-(2-hidroxiproipil) metacrilamida, e a concentraçãoapropriada de macromoléculas assim como os métodos de incorporação, a fimde controlar a liberação.

Outro método possível utilizável no controle da duração deação por preparações de liberação controlada e meia-vida é a incorporação demolécula de peptídeo ou seus derivados funcionais em partículas de ummaterial polimérico como poliésteres, poliamidas, poliaminoácidos, hidrogéis,poli (ácido láctico), copolímero de etileno acetato de vinila, micelas decopolímero de, por exemplo, PEG e poli (L-aspartamida).

A meia-vida dos peptídeos descritos aqui pode ser estendidapor serem conjugados a outras moléculas como polímeros usando métodosbem conhecidos na técnica para formar conjugados de fármaco- polímero. Porexemplo, o peptídeo pode ser ligado (por exemplo, covalentemente) amoléculas de polímeros inertes bem conhecidos na técnica, como molécula depolietileno glicol (PEG) em um método conhecido como "peguilação". Apeguilação pode assim estende o tempo de vida in vivo e assim a eficáciaterapêutica da molécula de peptídeo. A peguilação também reduz aantigenicidade potencial da molécula de peptídeo. A peguilação também podemelhorar a solubilidade dos peptídeos, assim melhorando seu efeitoterapêutico. PEGS usados podem ser de cadeia linear ou ramificada.As moléculas PEG podem ser modificadas por gruposfuncionais, por exemplo como mostrado em Harris et al., "Pegylation, ANovel Process for Modifying Phararmacokinetics", Clin Pharmacokinet2001:40(7); 539-551, e o grupo amino do resíduo amino terminal do peptídeoou resíduo de cisteína interno ou outro aminoácido tendo um grupo de ligação(por exemplo arginina, lisina, histidina, serina, treonina ou metionina) nomesmo pode ser ligado ao mesmo em que a molécula e PEG pode transportaum ou uma pluralidade de um ou mais tipos dos peptídeos ou o peptídeo podetransportar mais de uma molécula PEG.

Por "peptídeo peguilado", significa-se um peptídeo da presenteinvenção tendo uma porção polietileno glicol (PEG) covalentemente ligada aum resíduo de aminoácido ou grupo de ligação do peptídeo. A molécula PEGtambém pode ser fixada ao peptídeo via um ligador compreendendo um a dezaminoácidos, por exemplo.

Por "polietileno glicol" ou "PEG" significa-se um compostopolialquileno glicol ou um derivado do mesmo, com ou sem agentes decopulação ou derivatização com porções de copulação e ativação (porexemplo com tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, ou preferivelmentecom uma porção maleimida). Os compostos como PEG maleimidomonometóxi são compostos PEGs exemplares ou ativados da invenção.Outros compostos polialquileno glicol como polipropileno glicol, podem serusados na presente invenção. Outros conjugados de polímeros apropriadosincluem, mas não são limitados a polímeros não polipeptídeo, polímeroscarregados ou neutros dos seguintes tipos: dextrano, ácidos colomínicos, ououtros polímeros à base de carboidratos, derivados de biotina e dendrímeros,por exemplo. O termo PEG também significa incluir outros polímeros daclasse de óxidos de polialquileno.

O PEG pode ser ligado a qualquer aminoácido N-terminal dopeptídeo, e/ou pode ser ligado a um resíduo aminoácido a jusante doaminoácido N-terminal, como lisina, histidina, triptofano, ácido aspártico,ácido glutâmico, serina, treonina, metionina, e cisteína, por exemplo ou outrostais aminoácidos bem conhecidos do versado na técnica. Os peptídeospeguilados por cisteína por exemplo são criados por fixação de polietilenoglicol a um grupo SH em um resíduo cisteína do peptídeo.

Os peptídeos quimicamente modificados contém pelo menosuma porção PEG, preferivelmente pelo menos duas porções PEG5 até umnúmero máximo de porções PEG ligadas ao peptídeo sem abolir a atividade,por exemplo, porções PEG são ligadas a um resíduo de aminoácidopreferivelmente em ou próximo da porção N-terminal do peptídeo.

A porção PEG fixada à proteína preferivelmente está na faixade peso molecular de cerca de 200 a 30.000 MW. Preferivelmente a porçãoPEG terá de cerca de 1.000 a 8.000 MW, mais preferivelmente de cerca de3,250 a 5.000 MW, o mais preferivelmente cerca de 5.000 MW.

O número real de moléculas PEG covalentemente ligadas porpeptídeo quimicamente modificado da invenção pode variar amplamentedependendo da estabilidade do peptídeo desejada (isto é, meia-vida no soro).

As moléculas de peptídeo contempladas para uso aqui podemser ligadas a moléculas PEG usando técnicas mostradas, por exemplo (masnão são limitada a ) Patentes U.S. Nos., 4.179.337; 5.382.657; 5.972.885;6.177.087; 6.165.509; 5.766.897; e 6.217.869, cujos relatórios e desenhos sãoexpressamente incorporados aqui por referência em sua totalidade.

Alternativamente, é possível aprisionar os peptídeos emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação, ou porpolimerização interfacial (por exemplo, cápsulas de hidroximetilceluloseorgelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, emsistemas de liberação de drogas coloidais (por exemplo lipossomas,microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas, e nanocápsulas),ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas na última edição deRemington1S Pharmaceutical Sciences.

Patente US No. 4,789,734 descreve métodos de encapsularbioquímicos em lipossomas e é aqui expressamente incorporada porreferência. Essencialmente, o material é dissolvido em uma solução aquosa,os fosfolipídeos e lipídeos apropriados adicionados, junto com tensoativos, serequerido, e o material dialisado ou sonicado, como necessário. Um estudo demétodos conhecidos é feito por G. Gregoriadis, Cap. 14. "Liposomes", DrugCarriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979). Asmicroesferas formadas de polímeros ou proteínas são bem conhecidas doversado na técnica e podem ser adequadas para passagem através do tratogastrointestinal diretamente na corrente sangüínea. Alternativamente, osagentes podem ser incorporados e as microesferas, ou compósito das mesmasimplantados para liberação lenta durante um período de tempo, na faixa dedias a meses. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 4.906.474; 4.925.673; e3.625.214, incorporadas aqui por referência.

Quando a composição deve ser usada como um materialinjetável, ela pode ser formulada em um veículo injetável convencional. Osveículos apropriados incluem soluções salinas tamponadas com fosfatobiocompatíveis e farmaceuticamente aceitáveis, que são preferivelmenteisotônicas.

Para reconstituição de um produto liofilizado de acordo com ainvenção, pode-se empregar um diluente estéril, que pode conter materiaisgeralmente reconhecidos para se aproximar de condições fisiológicas e/oucomo requerido por regulação governamental. Neste aspecto, o diluenteestéril pode conter um agente tampão para obter um pH fisiologicamenteaceitável como cloreto de sódio, solução salina, solução salina tamponadacom fosfato, e/ou outras substâncias que são fisiologicamente aceitáveis e/ouseguras para uso. Em geral, o material para injeção intravenosa em humanosdeve ser conformar a regulações estabelecidas pelo Food and DrugAdministration, que são disponíveis para os no campo.

A composição farmacêutica também pode estar na forma deuma solução aquosa contendo muitas das mesmas substâncias como descritoacima para a reconstituição de um produto liofilizado.

Os compostos também podem ser administrados como um salde adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitável, formado por reaçãocom ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácidoperclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfurico, e ácido fosfórico, eácidos orgânicos como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácidoglicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malônico, ácidosuccínico, ácido maleico, e ácido fumárico, ou por reação com baseinorgânica como hidróxido de sódio, hidróxido de amônio, hidróxido depotássio, e bases orgânicas como mono-, di-, trialquil e aril aminas eetanolaminas substituídas.

Como acima mencionado, os compostos da invenção podemser incorporados em preparações farmacêuticas que podem ser usadas parafins terapêuticos. No entanto, o termo "preparação farmacêutica" se destinaem um sentido mais amplo aqui a incluir preparações contendo umacomposição de peptídeo de acordo com a invenção, usada não somente parafins terapêuticos para também para fins reagentes ou diagnósticos como bemconhecido na técnica, ou para cultura de tecido. A preparação farmacêuticadestinada para uso terapêutico deve conter uma "quantidadefarmaceuticamente aceitável" ou "terapeuticamente aceitável" de umpeptídeo, isto é, a quantidade necessária para medidas de saúde preventiva oucurativa. Se a preparação farmacêutica for empregada como um reagente oudiagnóstico, então ela deve conter quantidades reagentes ou diagnosticas deum peptídeo.

Todos os métodos de teste dados aqui são bem conhecidos doversado na técnica comum dados os ensinamentos aqui.Apesar da invenção ter sido descrita em conexão com algumasformas de realização de modo que seus aspectos podem ser maiscompletamente entendidos e apreciados, não se pretende que a invenção sejalimitada a estas formas de realização particulares. Ao contrário, pretende-se que todas as alternativas, modificações e equivalentes são incluídos no escopoda invenção como aqui definido. Assim, os exemplos descritos acima, queincluem formas de realização preferidas, irão servir para ilustrar a prática dainvenção, sendo entendido que os particulares mostrados são a título deexemplo e para fins de discussão ilustrativa de formas de realização preferidas da presente invenção somente e são apresentados para prover o que seacredita ser a descrição mais utilizável e prontamente entendida deprocedimentos, assim como dos princípios e aspectos conceituais dainvenção. Mudanças podem ser feitas na formulação de várias composiçõesdescritas aqui ou nas etapas ou a seqüência das etapas dos métodos descritos aqui sem sair do espírito e escopo da invenção, como descrita aqui.

Todas as referências, artigos e pedidos de patente citados aquisão o expressamente incorporados aqui por referência em sua totalidade.

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<110> Peretra1HeIoiseAnneFídel, Paul

<120> Peptxdeos anti-fúngicos e uso dos mesmos

<130> 5835.081wo

<150> 60/704,256<151> 2005-08-01

<1B0> 16

<170> Patentln Versão 3.3

<210> 1

<211 > 25

<212> PRT

<213> Homosapiens

<400> 1

Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu lie Hts Ala Arg Phe1 5 10 15

Vat Met ThrAIa Ala Ser Cys Phe Gln20 25

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> Homosaptens

<400> 2

Asn Gln Gly Aeq His Phe Ser Gly Gfy Ala Leu Ile I Hs Ala Arg Phe1 5 10 15

Val Met Tbr Ala Ala ser Cys Phe Gln20 25

<210> 3<211> 25<212> PRT<213> Homosapíens

<400>· 3

Asn Gln Gly Ar^ His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ite Hls Ala Arg Phe1 5 10 15Val Met Thr Ate Ala Sef Ser Pfce Gtn20 25

<21Q> 4<211> 25<212> PRT<213> Homosapisns

<400> 4

Asn Gln Gly Arg His Phe Ser Gly Gly Ate Leu Ile Hts Ala Arg Phe15 10 16

Val Mei Thr Als Ala Ser Ser Phe Glr»20 25

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Atig Hls Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ite His AJa Arg Phe Val Met Thr1 5 10 15

Afã Alâ Ser Cys20

<210> 6<211> 20<212> PRT<213> Homosapiens

<400> 6

Arg Hls Phe Ser Gly GIyAIa Leu Ife His Alâ Aig Phe Val Met Tfir1 5 10 15

Ate Ala SerCys20

<210> 7<211> 20<212> PRT<213> Homo sapfens

<400> 7Arg Hls Phe Cys GIy Gty AIa Leu Ile His Ala Arg Fhe Val Met Thr1 5 10 15

Ala Aia Ser Ser20

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> Hoirrosaptens

<400> 8

Arg His Phe Ser Gly GIyAIa Leu Ile His Ala Ang Phe Val Met Thr1 5 10 15

Ala Ala Ser Ser20

<210> δ<211> 25<212> PRT<213> Homo sapienis

<400> 9

Asn Gln Gly Afg His Phe Tlir Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe1 '6 10 15

Val Met Thr AIa Ala Ser Cys Phe Gln20 25

<210> 10<211> 25<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Asn Gln Gly Arg His Pte Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe1 5 10 15

VaJ Met Thr Al® Ala Ser Thr Phe Gfn20 25

<210> 11<211> 25<212> PRT

<213> Homosapiens

<400> 11

Asn Gfn Gly Aig His Phe Tfrisf GIy Gly Ala Uu Ile His Afa Arg Phe1 5 10 15

Val Met Thr Ala Ala Ser Thr Phe Θίπ20 25

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> Homosapiens

<400> 12

Arg His Phe Thr Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr1 5 10 15

AIaAIa Ser Cys20

<210> 13<211> 20<212> PRT<213> Homosapiens

<400> 13

Arg His Phe Cys Gly Gty Ala Leu He His Ala Arg Phe Val Met Thr1 5 10 15

AIaAla SerThr20

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> Homosaptens

<400> 14

Arg Hfe Phe Thr Gty Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr1 5 10 15

Ala Ala Ser Thr20<210> 15<211> 20<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Completamente sintetizado

<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (3)..(3)

<223> phe, tyr, arg, lys, ouhis<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (4) .(4)

<223> cys, ser, thr, ang, iys.ou his<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (5)..(5)

<223> gty» ala, arg, lys, ouhis<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (G)..(6)

<223> gly, ala, arg, lys, ouhis<220>

<221> Misc_Aspecto

<222> (7).,(7)

<223> ala, Ieut ile, vai, arg, lys, ou his<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (8)..(8)<223> ala, teu, ile, ou vai

<220>

<221> Misc_Aspecto<222> <9),.(9)<223> ala. Seu, Sle.ou vat

<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (11)411)

<223> ala, leu, ile, vai, arg, lys, ou his<22Q>

<221> Misc_Aspecto<222> (13)..(13)<223> pheoutyr<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (14}.,(14)<223> ala, leu, ile.ouval

<220><221 > Misc_Aspecto<222> (16)„(16)<223> serorthr

<220><221> Misc_Aspecto<222> (17). .(17)<223> ala, Ieul ile, ouval

<220>

<221> Misc_Aspecto<222> (18>..(18)<223> ala, leu, í!e,ouvaI

<220><221> Misc_Aspecto<222> (19), .(19)<223> ser, íhr, his, ang, oulys

<220><221> Misc_Aspecto<222> (20)-.(20><223> cys, ser.outhr

<400> 15

Arg Hls Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Hls Xaa Arg Xaa Xaa Met Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa20

<210> 16<211> 27<212> PRT<213> Homosapfens

<400> 16

Gly Thr Arg Cys Oln Val Aia Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gty Gly15 10 15

Ang Leu SerArg Fhe Pro Arg Phe Val Asn Val20 25

Claims (25)

1. Uso de um peptídeo, caracterizado pelo fato de ser para apreparação de um medicamento para o tratamento ou inibição de umainfecção fungica em um indivíduo, em que o peptídeo tem 20-25 aminoácidose compreende SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 5 ou um derivado de peptídeode SEQ ID NO: 5, em que pelo menos um dos resíduos de cisteína noderivado de peptídeo é substituído com um resíduo de serina ou treonina, eem que o peptídeo ou derivado de peptídeo é disposto em um veículofarmaceuticamente aceitável.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o resíduo de cisteína mais N-terminal do peptídeo derivado deSEQ ID NO: 5 é substituído com serina ou treonina.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o resíduo de cisteína mais C-terminal do peptídeo derivado deSEQ ID NO: 5 é substituído com serina ou treonina.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o derivado de peptídeo de SEQ ID NO: 5 aindacompreende pelo menos uma das substituições compreendendo:uma fenilalanina substituída por tirosina;uma glicina substituída por alanina;uma valina substituída por alanina, leucina, ou isoleucina;uma alanina substituída por leucina, isoleucina ou valina;uma leucina substituída por alanina, isoleucina ou valina;uma isoleucina substituída por valina, leucina ou alanina;uma serina substituída por histidina, arginina, ou lisina; euma treonina substituída por serina.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a infecção fungica tratada ou inibida é causadapor Candida spp., Saccharomyces eerevisiae, Histoplasma spp., Aspergillusspp., e Cryptococcus.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem de um a três aminoácidosadicionais em uma extremidade N-terminal do peptídeo e um a doisaminoácidos adicionais em uma extremidade C-terminal do peptídeo.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende a seqüência (SEQ IDNO: 15):R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-X11-R-X13-X14-M-X16-X-17-X18-X19-X20, em queX3 é phe, tyr, arg, lys ou his;X4 é cys, ser, thr, arg, lys ou his;X5 é gly, ala, arg, lys ou his;X6 é gly, ala, arg, Iys ou his;X8, X9, X17, e Xi8 são ala, leu, ile ou vai;X7, Xn e X14 são ala, leu, ile, vai, arg, lys, ou his;X13 é phe, tyr, arg, lys ou his;Xi6 é ser ou thr;Xi9 é ser, thr, his, arg ou lys;X20 é ser, cys ou thr;R é arg;H é his; eM é met.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o X4 é cys e o X20 é ser ou thr.

10. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o X20 é cys e o X4 é ser ou thr.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é peguilado.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que o peptídeo é covalentemente peguilado para uma molécula depolietileno glicol via uma molécula de ligador compreendendo 1 a 15aminoácidos.

13. Peptídeo, caracterizado pelo fato de ter 20-25 aminoácidose compreender a seqüência (SEQ ID NO: 15):R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-X11-R-X13-X14-M-X16-X17-X18-Xi9-X2oemque:X3 é phe, tyr, arg, Iys ou his;X4 é cys, ser, thr, arg, Iys ou his;X5 é gly, ala, arg, Iys ou his;Xó é gly, ala, arg, Iys ou his;X8, X9, X17, e Xi8 são ala, leu, ile ou vai;X7, Xn e Xi4 são ala, leu, ile, vai, arg, lys, ou his;Xi3 é phe, tyr, arg, lys ou his;Xi6 é ser ou thr;Xi9 é ser, thr, his, arg ou lys;X20 é ser, cys ou thr;R é arg;H é his; eM é met, eem que pelo menos um de X3, X4, X5, X6, Χ7, Xn, X13 e Xj4 éarginina, lisina ou histidina.

14. Peptídeo de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que adicionalmente compreende um, dois ou três resíduos deaminoácido adicionais se estendendo em uma direção N-terminal a partir do RN-terminal de SEQID NO: 15.

15. Peptídeo de acordo com a reivindicação 13 ou 14,caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende um ou doisresíduos de aminoácido adicionais estendendo em uma direção C-terminal apartir de X20 de SEQ ID NO: 15.

16. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-13 a 15, caracterizado pelo fato de que o X4 é cys e o X2o é ser ou thr.

17. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-13 a 15, caracterizado pelo fato de que o X20 é cys e o X4 é ser ou thr.

18. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-13 a 17, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é conjugado a polietilenoglicol.

19. Peptídeo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o peptídeo é conjugado à molécula de polietileno glicol viauma molécula de ligador compreendendo 1 a 15 aminoácidos.

20. Peptídeo quimérico, caracterizado pelo fato de quecompreende um primeiro peptídeo compreendendo o peptídeo como definidoem qualquer uma das reivindicações 13 a 17 que é ligado a um segundopeptídeo compreendendo o peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 13 a 17.

21. Peptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o peptídeo quimérico é um homodímero.

22. Peptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o peptídeo quimérico é um heterodímero.

23. Peptídeo conjugado, caracterizado pelo fato de quecompreende o peptídeo ou peptídeo quimérico como definido em qualqueruma das reivindicações 13 a 22 que é conjugado a uma molécula depolietileno glicol.

24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende o peptídeo, peptídeo quimérico ou conjugado de peptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 13 a 23, disposto em um veículofarmaceuticamente aceitável.

25. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica opeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 23.