KR101381285B1

KR101381285B1 - 항균활성 및 항염증활성을 갖는 신규한 펩티드

Info

Publication number: KR101381285B1
Application number: KR1020120100762A
Authority: KR
Inventors: 방정규
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2014-04-04
Also published as: KR20140034451A

Abstract

본 발명은 광범위한 항균활성과 항염증활성을 나타내면서도 세포독성이 낮고, 대량생산이 용이하며, 안정성이 우수한 펩티드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 일반식 1의 히스티딘 유도체와 아르기닌을 함유하는 것을 특징으로 하는 펩티드에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩티드 제조를 위한 히스티딘 유도체와 상기 펩티드의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
[일반식 1]

이때 R=-(CH₂)_n-CH3, -(CH₂)_n-Ph 또는 (CH₂)_n-Cyclohexyl기이며, n=1~7인 정수이다.

Description

항균활성 및 항염증활성을 갖는 신규한 펩티드{Novel Peptide having Antimicrobial Activity and Anti-inflammatory Activity}

본 발명은 서열 중 히스티딘 유도체와 아르기닌을 함유하는 항균 및 항염증 활성을 갖는 신규한 펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 펩티드 제조를 위한 히스티딘 유도체와 상기 펩티드의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

항균성 펩티드(antimicrobial peptide, AMPs)는 대부분의 생명체들에게서 감염에 대한 방어물질로 생산되는 양이온성 양친매성 물질(amphiphiles)이다. AMPs는 상대적으로 크기가 작고 그람-양성이나 그람-음성 박테리아 뿐 아니라 곰팡이나 바이러스에도 광범위한 항균활성을 나타낸다. 통상의 항균성 저분자 물질과는 달리 AMPs는 양이온성의 서로 분리되어 있는 친수성 영역과 소수성 영역 모두가 음이온성의 박테리아 등의 막과 동시에 반응하여 다양한 기작으로 이들을 사멸시키기 때문에, 미생물들이 이들에 대항하여 생존하기가 어렵다. 따라서, AMPs는 특히 내성을 갖는 병원성 박테리아에 대해 현재 항균제의 가능한 대안으로 기대되고 있다.

엔도톡신으로 알려진 리포다당류(liposaccharide, LPS)는 그람-음성 박테리아의 세포벽 외각의 주요 성분으로 감염과 패혈증 쇼크의 발병에 주요한 역할을 한다. 엔도톡신은 세포 분화나 특히 감염에 대한 항균제의 처리에 따른 세포 사멸의 과정에서 박테리아에서 분비된다. 선천성 면역계의 가장 잠정적인 면역자극 물질인 LPS는 숙주의 식세포에 의해 인식되어 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), and IL-1β(interleukin-1β)와 같은 전염증 사이토카인(cytokine)의 분비를 유도한다. 병균의 침입에 대해 사이토카인을 분비하는 것은 선천성 면역계의 정상적인 반응이지만, 사이토카인의 과대 생산 및 불균형은 패혈증 쇼크를 일으켜 사망을 이르기도 한다. 최근 인간의 LL-37, 토끼의 CAP-18, 양의 SAMP-29를 포함한 몇몇 AMPs 유도체는 항균활성 이외에도 LPS의 독성을 효과적으로 중화하는 것이 보고되었다. 항균활성 및 LPS-중화활성을 나타내는 AMPs들은 엔도톡신 쇼크나 박테리아 감염에 의한 패혈증의 치료에 대한 항균제로서 더욱 관심을 받고 있다.

상기와 같은 장점에도 불구하고 AMPs는 그 크기가 크기 때문에 합성 과정이 복잡하고, 프로테아제에 대한 안정성이 낮으며, 생산 단가가 높은 등 많은 문제점을 내포하기 때문에 신약 개발에 많은 제약이 따른다. 이러한 문제를 해소하기 위한 하나의 방법은 자연에 존재하지 않는 아미노산을 이용하여 항균활성을 가지면서 독성이 작은 짧은 펩타이드 미메틱을 (peptide mimetic) 고안하고 합성하는 것이다. 이를 위해 지금까지 고리화펩티드(cyclicpeptides), 펩토이드(peptoids), 베타-펩티드(β-peptides), 올리고 아실 리신(oligo-acyl lysines), 아로마틱 올리고머(aromatic oligomers) 및 리포펩티드(lipopeptide)를 포함한 다양한 유도체 합성들이 시도되어 왔으나, 항균활성이나 선택성을 높이기 위한 다양한 기능기의 도입이 어렵고, 합성 방법이 복잡하여 대량생산에 이르지는 못하였다.

히스티딘은 이미다졸(imidazole)을 곁사슬로 가지고 있는 아미노산으로 의약품의 소재로 많은 연구가 진행되어 왔다. 히스티딘 또는 메틸히스티딘에 β-알라닌이 결합한 안세린(N-β-알라닐-1-메틸-L-히스티딘) 및 카르노신((N-β-알라닐-L-히스티딘)은 포유류, 조류, 파충류, 양서류 등의 근육 내에 많이 존재하는 히스티딘 유도체로서, 면역 조절, 항스트레스, 혈압 상승 억제, 철 흡수 촉진, 학습능력 향상, 항산화, 노화방지 및 항암작용 등을 갖는 것이 알려져 있다. 또한, 이미다졸의 N(π) 부분에 여러 치환기를 도입하여 단백질-단백질 저해제의 합성에 사용된 예가 있다.

하지만 히스티딘의 이미다졸에 N(π)와 N(τ)에 모두 치환된 아미노산 유도체들은 지금까지 중간체로 여겨져 분리된 사례가 없다. 히스티딘의 이미다졸에 N(π)와 N(τ)에 모두 치환된 양이온성 화합물을 제조하고 단리하여 동정한다면, 분자내 소수성 영역과 친수성 영역을 도입하는 것에 의해 APMs의 상술한 문제점을 해소하면서도 항균/항염증 활성을 모두 갖는 새로운 유도체들을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 짧은 서열로 이루어져 대량생산이 가능하면서도 항균활성 및 항염증활성이 우수하고 세포독성이 적은 신규한 히스티딘 유도체를 포함하는 펩티드를 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드 제조를 위한 중간체로서 히스티딘 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히스티딘 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항균제 또는 항염증제의 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열 중 하기 일반식 1의 히스티딘 유도체와 아르기닌을 함유하는 것을 특징으로 하는 펩티드에 대한 것이다.

[일반식 1]

상기 히스티딘 유도체는 히스티딘의 N(π)-와 N(τ)- 모두에 치환기가 도입된 것을 특징으로 한다.

상기 펩티드는 합성이 간단하여 대량생산과 상업화가 용이하도록 2~3개의 아미노산으로 이루어진 다이머(dimer) 또는 트라이머(trimer)인 것이 바람직하다. 펩티드 화합물은 길이가 길어짐에 따라 프로테아제에 대한 안정성이 낮아 약효가 급격히 감소하거나 소멸되는 문제가 있다. 본 발명의 펩티드는 프로테아제 처리 후에도 항균활성이 유지되어 종래 펩티드 항균제들의 불안정성으로 인한 항균제 개발의 문제점을 해소할 수 있다.

본 발명에 의한 펩티드는 그람-양성 박테리아와 그람-음성 박테리아 모두에 광범위한 항균활성을 나타내면서도 종래 항균활성을 갖는 화합물들이 독성이 강한 반면 본 발명에 의한 펩티드 들은 약물치료에 필요한 농도보다 훨씬 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않아 안전하게 이용될 수 있다. 또한 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 자극된 세포에서 나이트라이트(나이트릭 옥사이스, NO) 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증활성을 나타내었다. 종래 항균제에서 항균활성과 동시에 항염증활성을 보이는 것은 극히 예외적으로, 항균치료를 할 때 나타나는 부작용인 염증반응을 제어할 수 있어 엔도톡신 쇼크나 박테리아 감염에 의한 패혈증의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 펩티드 제조를 위한 중간체인 하기 일반식 2의 히스티딘 유도체에 관한 것이다.

일반식 2

이때, R은 상기 일반식 1에서의 정의와 동일하며, P는 보호기로서 펩티드 제조 시 통상적으로 사용되는 아미노산의 보호기는 모두 가능하다. 하기 실시예에서는 대표적으로 보호기가 Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)인 것에 대해서만 기재하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업자라면 t-Boc(t-butyloxycarbonyl), CBz(Carbobenzyloxy) 또는 Nsc(2-(4-nitrophenyl)sulfonylethoxycarbonyl) 역시 종래 기술을 사용하여 용이하게 적용할 수 있을 것이다.

상기 히스티딘 유도체에 의한 펩티드의 합성은 종래 보호기를 갖는 아미노산을 이용한 펩티드 반응을 응용하여 동일한 과정에 의해 진행할 수 있다. 그 일 예를 실시예에 기재하였으나, 하기 조건에 의해 한정되지 않음은 당연하다.

본 발명의 다른 일양태는 히스티딘의 N(π)가 Trityl(triphenylmethyl)기로 보호된 화합물 C와 알콜(R-OH)을 축합반응하는 단계; 및 (B) 축합반응의 산물인 화합물 D의 에스테르기를 산 존재하에서 가수분해하는 단계;를 포함하는 하기 반응식 1에 의한 제 3 항의 히스티딘 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

반응식 1

상기 (A) 단계인 알콜과의 축합반응은 알콜의 ―OH기를 활성화 시킨 후, 화합물 C와 반응시키는 것에 의해 이루어 질 수 있다. 일예로 하기 실시예에서는 ―OH기를 ―triflate의 형태로 전환하여 활성화하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

축합반응이 완료되면 염산이나 황산과 같은 산 존재하에서 에스테르기를 가수분해하여 최종 히스티딘 유도체를 얻는다.

본 발명의 또 다른 일양태는 상기 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항균제 약제학적 조성물 및/또는 항염증제 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드가 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 이들을 경구 또는 비경구로 투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 제제로 제형화하여 항균제 및/또는 항염증제의 효과를 갖는 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

이상과 같이 본 발명의 펩타이드에 의하면 광범위한 항균활성과 항염증활성을 나타내면서도 세포독성이 낮고, 길이가 짧아 대량생산이 용이하고, 안정성이 우수하여 항균제 및/또는 항염증제로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 히스티딘 유도체는 펩타이드 합성의 중간체로서 간편하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예 및 비교예의 펩티드의 용혈활성을 보여주는 그래프.
도 2는 본 발명의 일실시예 및 비교예의 펩티드의 RAW264.7 세포에 대한 세포독성을 보여주는 그래프.
도 3은 본 발명의 일실시예 및 비교예의 펩티드의 LPS 자극-RAW264.7 세포에서의 나이트라이트 생성 정도를 나타내주는 그래프.
도 4는 본 발명의 일실시예 및 비교예의 펩티드의 농도에 따른 LPS 자극-RAW264.7 세포에서의 나이트라이트 생성 정도를 나타내주는 그래프.
도 5는 본 발명의 일실시예 및 비교예의 펩티드의 프로테아제에 대한 안정성을 보여주는 사진 및 그래프.

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

실시예 1 : 히스티딘 유도체의 제조

제조예 1 : 화합물 E5( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (7-phenyl-heptyl) -L-histidine )의 제조

1) 화합물 C( N(α)-Fmoc-N(π)-trityl-L-histidine methylester )의 제조

100mL 쉬링크(Schlenk) 플라스크에 Fmoc-His(Trt)-OH 10g(16.14mmol), HOBt(Hydroxybenzotriazole) 3.27g(24.2mmol)을 넣고 진공화-Ar 충진을 반복하여 공기를 제거하였다. 건조된 THF(tetrahydrofuran) 81mL를 가하여 모든 고체를 용해시킨 후 얼음-아세톤 조(bath)를 사용하여 -13℃로 냉각하였다. 상기 혼합액에, DCC(dicyclohexylcarbodiimide) 3.33g(16.14mmol)을 건조된 THF에 녹인 용액을 메탄올(MeOH) 12.4mL와 함께 30분에 걸쳐 적가한 후, 서서히 상온으로 승온하여 밤새(~16시간) 교반하며 반응시켰다. 반응 과정에서 석출된 고상의 dicyclohexylurea를 여과하여 제거하고 여액을 농축하였다. 오일 형태의 농축 잔사를 DCM(dichloromethane)으로 다시 용해시킨 후 NaHCO₃ 포화 용액으로 세 번, 증류수로 세 번 순차적으로 세척하였다. 유기층을 분리하여 MgSO₄로 건조한 후 농축하여 얻은 크루드 상태의 노란 고체를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여(실리카 겔, 1% MeOH-DCM) 화합물 C(FmocHis(Trt)-OMe) 6.89g(83.6%)을 얻었다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (d, 2H, 7.5 Hz), 7.62 (t, 2H, 7 Hz), 7.42-7.24 (m,17H), 7.14-7.09 (m, 7H), 6.57 (s, 1H), 6.51 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 4.38-4.22 (m, 2H), 4.12 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.06 (m, 2H).

2) 화합물 D5( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (7-phenylheptyl) -L-histidine methylester )의 제조

triflic anhydride 0.939mL(5.58mmol)과 DCM 35mL의 혼합액을 교반하면서 7-phenyl-1-heptanol 1.12mL(5.58mmol), diisopropylethylamine(DIEA) 0.973mL (5.58mmol), DCM 48 mL의 혼합액을 -75℃, Ar 분위기 하에서 10분에 걸쳐 적가하였다. 적가가 완료되면 -75℃에서 20분간 추가로 교반한 후, 24mL DCM에 1)에서 제조한 FmocHis(Trt)-OMe 1.767g(2.79mmol)을 용해시킨 용액을 적가하고 서서히 상온으로 승온하여 18시간 교반하였다. 반응액에 NaHCO₃수용액을 가하고 30분간 격렬하게 교반하여 반응을 종결시켰다. 반응액의 유기층을 DCM으로 희석한 후 NaHCO₃수용액과 소금물로 순차적으로 세척하고 MgSO₄로 건조한 후 점성이 있는 오일상태로 농축하였다. 농축잔사에 DCM 22mL, TFA(trifluoroacetic acid) 2mL(27.9mmol), triisopropylsilane(TIS) 0.629mL(3.069mmol)를 가한 후 2시간동안 혼합물을 교반하여 반응을 완결시켰다. 반응이 완결되면 진공상태에서 용매를 제거한 후 남은 잔사를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여(실리카 겔, 1%→5% MeOH-DCM) 엷은 노란색의 검(gum) 상태의 화합물 D5 1.73g(85%)을 얻었다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.61 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.41Hz, 2H), 7.62 (d, J = 6.99Hz, 2H), 7.40 (t, 14.23 Hz, 3 H), 7.32 (q, J = 11.83Hz, J = 17.71Hz, 5H), 7.18 (t, J = 7.71Hz, 6H), 6.23 (d, J = 6.45Hz, 1H), 4.48-4.69 (m, 1H), 4.37 (d, J = 5.97Hz, 2H), 4.21 (t, J =13.35Hz, 1H), 4.05 (t, J = 9.51Hz, 2H) 3.78 (s, 3H), 3.49 (s, 3H), 3.23 (s, 2H), 2.53-2.67 (m, 4H), 1.69-78 (m, 3H), 1.47-1.66 (m, 5H), 1.38-1.47 (m, 3H), 1.23 (s, 9H).

3) 화합물 E5( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (7-phenylheptyl) -L-histidine )의 제조

2)에서 제조한 화합물 D5 1.6g(2.2mmol)에 2N HCl 50mL와 1,4-Dioxane 50mL의 혼합물을 가하여 3시간동안 환류시켰다. 혼합물을 상온으로 냉각한 후 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거하여 남은 수용액을 DCM으로 추출하였다. 유기층은 NaHCO₃수용액과 소금물로 순차적으로 세척하여 MgSO₄로 건조한 후 점성이 있는 오일상태로 농축하고 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여(실리카 겔, 5%→20% MeOH-DCM) 밝은 노란색의 검 상태의 화합물 E5(Cl^- 염) 0.90g(43%)을 얻었다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.47 (s, 1H), 7.72 (d, J =7.35Hz, 2H), 7.61 (dd, J = 7.08Hz, 7.02Hz, 2H), 7.34 (t, J =7.38 Hz, 2H), 7.27 (m, 6 H), 7.16 (m, 6H), 6.84 (m, 1H), 4.28-4.47 (m, 1H), 4.03-4.28 (m, 3H), 3.82-4.03 (m, 2H), 3.49-3.73 (m, 2H), 2.98-3.33 (m, 2H), 2.35-2.72 (m, 4H), 1.59-1.89 (m, 4H), 1.41-1.59 (m, 4H), 1.21 (s, 12H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ176.1, 156.1, 144.4, 144.0, 141.2, 134.7, 129.1, 128.3, 128.2, 127.7, 127.1, 125.6, 125.2, 125.6, 125.2, 125.1, 120.3, 120.9, 119.4, 67.0, 55.0, 47.0, 46.6, 35.8, 31.2, 30.1, 29.0, 28.8, 26.4, 26.3, 21.1.

MS (MALDI-TOF) m/z 726.43[M]+.

제조예 2 : 화합물 E8( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (3-cyclohexylpropyl) -L- histidine )의 제조

1) 화합물 D8( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (3-cyclohexylpropyl) -L-histidine methylester )의 제조

7-phenyl-1-heptanol 대신 cyclohexanol 0.872mL(5.58mmol)를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 2)와 동일한 방법에 의해 화합물 D8을 70%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.97 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.20Hz, 2H), 7.52-7.71(m,2H), 7.36-7.48 (t, 14.38 Hz, 3H), 7.21-7.36 (t, 15.97Hz, 3H), 6.74 (d, J = 7.77Hz, 1H), 4.50-4.66 (m, 1H), 4.27-4.36 (m, 2H), 4.19 (t, J =13.92Hz, 1H), 3.97-4.06 (m, 4H) 3.79 (s, 3H), 3.28 (s, 2H), 1.49-1.83 (m, 15H), 1.09-1.30 (m, 12H), 0.83-0.90 (s, 3H).

2) 화합물 E8( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (3-cyclohexylpropyl) -L-histidine )의 제조

화합물 D5 대신 화합물 D8 1.407g(2.2mmol)을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 3)과 동일한 방법에 의해 화합물 E8(Cl^- 염)을 69%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.78 (s, 1H), 7.75 (d, J =7.44Hz, 2H), 7.52-7.70 (dd, J = 7.32Hz, J=9.21Hz, 2H), 7.38 (t, J =7.35 Hz, 2H), 7.26-7.31 (m, 2 H), 6.69 (d, J=5.94Hz, 1H), 4.38-4.53 (m, 1H), 4.21-4.34 (m, 2H), 4.11-4.21 (m, 1H), 4.01-4.11 (m, 2H), 3.85-4,01 (m, 2H), 3.10-3.33 (m, 2H), 1.68-1.82 (m, 4H), 1.56 (s, 10H), 0.95-1.31 (m, 12H), 0.64-0.95 (m, 4H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ173.3, 156.5, 144.4, 144.1, 141.7, 135.8, 128.1, 127.4, 125.6, 125.5, 120.5, 120.4, 67.1, 55.0, 50.4, 47.8, 47.6, 37.5, 37.4, 34.2, 34.1, 33.5, 28.1, 28.0, 27.0, 26.8, 26.5

MS (MALDI-TOF) m/z 626.33[M]+.

제조예 3 : 화합물 E10( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (3-phenylpropyl) -L- histidine )의 제조

1) 화합물 D10( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (3-phenylpropyl) -L-histidine methylester )의 제조

7-phenyl-1-heptanol 대신 3-phenylpropanol 0.759mL(5.58mmol)를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 2)와 동일한 방법에 의해 화합물 D10을 89%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.91 (s, 1H), 7.80 (d, J = 7.44Hz, 2H), 7.63 (d, J = 7.65Hz, 2H), 7.39 (t, 7.29 Hz, 2H), 7.04-7.33 (m, 12H), 6.63 (d, J = 7.59Hz, 1H), 4.39-4.59 (m, 1H), 4.20-4.39 (m, 5H), 3.76 (s, 3H) 3.15 (s, 2H), 2.70 (t, J = 7.14Hz, 2H), 2.59 (t, J = 7.14, 2H), 2.20-2.04 (m, 4H).

2) 화합물 E10( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (3-phenylpropyl) -L-histidine )의 제조

화합물 D5 대신 화합물 D10 1.387g(2.2mmol)을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 3)과 동일한 방법에 의해 화합물 E10(Cl^- 염)을 67%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.43 (s, 1H), 7.69 (d, J =7.05Hz, 2H), 7.52-7.59 (dd, J = 6.48Hz, J=8.97Hz, 2H), 7.34 (t, J =7.41 Hz, 2H), 7.03-7.28 (m, 12 H), 6.61 (m, 1H), 4.18-4.33 (m, 2H), 4.01-4.18 (m, 4H), 3.88-4.01 (m, 2H), 3.01-3.24 (m, 2H), 2.45-2.69 (m, 4H), 1.93-2.16 (m, 4H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ173.2, 156.5, 144.3, 144.0, 141.7, 140.0, 139.9, 135.6, 132.4, 129.1, 129.0, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.2, 127.5, 126.8, 125.5, 125.4, 121.1, 73.2, 67.2, 54.4, 49.6, 49.6, 49.5, 47.1, 34.3, 33.0, 32.7, 32.6, 31.5, 31.4, 26.6, 26.0, 25.4, 25.3

MS (MALDI-TOF) m/z 614.30[M]+.

제조예 4 : 화합물 E11( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (n-heptyl) -L-histidine )의 제조

1) 화합물 D11( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (n-heptyl) -L-histidine methylester )의 제조

7-phenyl-1-heptanol 대신 1-heptanol 0.65g(5.58mmol)를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 2)와 동일한 방법에 의해 화합물 D11을 ~85%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.43 (s, 1H), 7.77-7.62 (m, 5), 7.37-7.32 (m, 6H), 6.68 (s, 1H), 5.14 (br, 2H) 4.41-4.09 (m, 11H), 3.65-3.61 (m, 2H), 3.39 (s, 3H)1.68-1.51 (br, 6H), 1.24-1.16 (m, 24H), 0.87-0.79 (m, 48H), 1.93-2.16 (m, 4H).

MS (MALDI-TOF) m/z 590.53[M]+.

2) 화합물 E11( N(α)-Fmoc-N(π)-,N(τ)-bis- (n-heptyl) -L-histidine )의 제조

화합물 D5 대신 화합물 D11 1.3g(2.2mmol)을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 3)과 동일한 방법에 의해 화합물 E11(Cl^- 염)을 57%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.43 (s, 1H), 7.72-7.60 (m, 5), 7.35-7.31 (m, 6H), 6.68 (s, 1H), 5.11 (br, 2H) 4.43-4.12 (m, 11H), 3.67-3.61 (m, 2H), 1.70-1.51 (br, 6H), 1.26-1.16 (m, 24H), 0.87-0.79 (m, 48H), 1.93-2.16 (m, 4H).

MS (MALDI-TOF) m/z 575.36[M]+.

비교예 1 : 화합물 E14( N(α)-Fmoc-N(π)- (7-phenyl-heptyl) -L-histidine )의 제조

1) 화합물 D14( N(α)-Fmoc-N(π)- (7-phenylheptyl) -L-histidine methyl- ester )의 제조

triflic anhydride 0.443mL(1.11mmol)과 DCM 12mL의 혼합액을 교반하면서 7-phenyl-1-heptanol 0.526mL(2.63mmol), DIEA 0.458mL(1.11mmol), DCM 12mL의 혼합액을 -75℃, Ar 분위기 하에서 10분에 걸쳐 적가하였다. 적가가 완료되면 -75℃에서 20분간 추가로 교반한 후, 20mL DCM에 제조예 1의 1)에서 제조한 FmocHis(Trt)-OMe 1.5g(2.37mmol)을 용해시킨 용액을 적가하고 서서히 상온으로 승온하여 16시간 교반하였다. 반응액에 NaHCO₃수용액을 가하고 30분간 격렬하게 교반하여 반응을 종결시켰다. 반응액의 유기층을 DCM으로 희석한 후 NaHCO₃수용액과 소금물로 순차적으로 세척하고 MgSO₄로 건조한 후 점성이 있는 오일상태로 농축하였다. 농축잔사에 DCM 13mL, trifluoroacetic acid 1.58mL(23.7 mmol), TIS 0.507mL(2.48 mmol)를 가한 후 2시간동안 혼합물을 교반하여 반응을 완결시켰다. 반응이 완결되면 진공상태에서 용매를 제거한 후 남은 잔사를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여(실리카 겔, 1%→5% MeOH-DCM) 무색의 검 상태의 화합물 D14 0.870g(65%)을 얻었다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.77 (d, J = 7.47Hz, 1H), 7.57 (d, J = 6.99Hz, 2H), 7.16-7.43 (m, 8H), 6.86(s, 1H), 5.92-6.16 (m, 1H), 4.53-4.77 (m, 1H), 4.41 (d, J = 6.99Hz, 1H), 4.22 (t, J = 6.84 Hz, 1H), 3.79-3.97 (m, 2H) 3.69 (s, 3H), 3.16 (s, 2H), 2.61 (t, J = 7.35Hz, 2H), 1.67-1.86 (m, 2H), 1.47-1.66 (m, 2H) 1.32 (s, 6H).

MS (MALDI-TOF) m/z 566.14[M]+.

2) 화합물 E14( N(α)-Fmoc-N(π)- (7-phenylheptyl) -L-histidine )의 제조

1)에서 제조한 화합물 D14 0.635g(1.13mmol)에 2N HCl 21mL와 1,4-Dioxane 21mL의 혼합물을 가하여 3시간동안 환류시켰다. 혼합물을 상온으로 냉각한 후 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거하여 남은 수용액을 DCM으로 추출하였다. 유기층은 NaHCO₃ 수용액과 소금물로 순차적으로 세척하여 MgSO₄로 건조한 후 점성이 있는 오일상태로 농축하고 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여(실리카 겔, 5%→20% MeOH-DCM) 밝은 노란색의 검 상태의 화합물 E14(Cl^- 염) 0.50g(80%)을 얻었다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.41 (s, 1H), 7.72 (d, J = 6.99Hz, 2H), 7.46-7.63 (m, 2H), 7.30-7.43 (m, 2H), 7.19-7.30 (m, 5 H), 7.03-7.19 (m, 4H), 6.51 (m, 1H), 4.38-4.53 (m, 1H), 4.22-4.37 (m, 2H), 4.10-4.21 (m, 1H), 3.85-4.10 (m, 2H), 3.13-3.38 (m, 2H), 2.43-2.60 (m, 2H), 1.60-1.77 (m, 2H), 1.40-1.59 (m, 2H), 1.20 (s, 6H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ176.1, 156.1, 144.4, 144.0, 143.1, 141.6, 134.7, 131.7, 128.7, 128.6, 128.1, 127.4, 125.9, 125.8, 120.4, 120.0, 66.9, 55.8, 47.4, 46.9, 36.2, 31.7, 30.4, 29.6, 29.5, 29.3, 26.7.

MS (MALDI-TOF) m/z 552.12[M]+.

비교예 2 : 화합물 E15( N(α)-Fmoc-N(π)- (3-cyclohexylpropyl) -L- histidine )의 제조

1) 화합물 D15( N(α)-Fmoc-N(π)- (3-cyclohexylpropyl) -L-histidine methylester )의 제조

7-phenyl-1-heptanol 대신 3-cyclohexylpropanol 0.412mL(2.63mmol)를 사용한 것을 제외하고는 비교예 1의 1)과 동일한 방법에 의해 화합물 D15를 87%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.62 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.41Hz, 2H), 7.58 (d, J = 7.23Hz, 2H), 7.35-7.45 (m, 2H), 7.26-7.35 (m, 2H), 7.19 (s, 1H), 6.22(d, J = 7.11Hz, 1H), 4.48-4.69 (m, 1H), 4.27-4.45 (m, 2H), 4.13-4.23 (m, 1H), 3.93-4.13 (m, 2H) 3.76 (s, 3H), 3.10-3.32 (m, 2H), 1.72-1.90 (m, 2H), 1.51-1.73 (m, 5H), 1.02-1.31 (m, 6H) 0.84 (s, 2H).

2) 화합물 E15( N(α)-Fmoc-N(π)- (3-cyclohexylpropyl) -L-histidine )의 제조

화합물 D14 대신 화합물 D15 0.583g(1.13mmol)을 사용한 것을 제외하고는 비교예 1의 2)와 동일한 방법에 의해 화합물 E15(Cl^- 염)를 43%의 수율로 제조하였다.

^lH NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.29 (s, 1H), 7.77 (d, J =7.26Hz, 2H), 7.47-7.68 (m, 2H), 7.33-7.47 (m, 2H), 7.22-7.33 (m, 2 H), 7.14 (s, 1H), 6.20-6.45 (m, 1H), 4.42-4.58 (m, 1H), 4.26-4.42 (m, 2H), 4.11-4.26 (m, 1H), 3.83-4.11 (m, 2H), 3.29 (s, 2H), 1.45-1.83 (m, 7H), 0.97-1.25 (m, 6H), 0.59-0.96 (m, 2H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ173.3, 156.5, 144.3, 144.1, 142.0, 135.7, 128.2, 127.6, 125.6, 125.5, 120.5, 120.4, 67.1, 50.4, 47.8, 47.6, 37.5, 37.4, 34.2, 34.1, 28.1, 27.0, 26.5

MS (MALDI-TOF) m/z 502.26[M+H]+.

실시예 2 : 펩티드의 제조

실시예 1에서 제조한 히스티딘 유도체와 Fmoc-Arg(pbf)-OH(Novabiochem) 및 Fmoc-Trp-OH(Novabiochem)을 사용하여 다음의 일반화된 Fmoc-SPPS(Solide Phase Peptide Synthesis) 방법에 따라 하기 표 1의 펩티드를 제조하였다. 하기 표 1에서 W는 트립토판을, R은 아르기닌을 의미하며 별도의 표기가 없다면 L-이성질체를 나타낸다.

보다 구체적으로, free 아민기를 갖는 아미노산을 링크 아마이드인 MBHA(4-methylbenzhydrylamine, Novabiochem) 레진에 0.61mmol/g의 농도로 흡착시켜 준비하였다. MBHA는 합성 전에 DMF(N,N-dimethylformamide)에 45분간 팽윤시켜 사용하였다. Fmoc으로 보호된 아미노산(5.0eq.)을 2mL DMF에서 HBTU(1-O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)(5.0eq.), HOBt(5.0eq.), DIEA(10eq.)로 2분간 처리하여 활성화시킨 후, 위에서 준비한 아미노산이 준비된 레진에 넣고 볼텍스 교반기를 사용하여 1시간 동안 격렬하게 교반하며 반응시켰다. 반응이 완료되면, DMF로 레진을 세척하고 20% 피페리딘-DMF용액으로 10분간 1회, 3분간 2회 처리하여 Fmoc기의 탈보호를 수행하였다. 레진을 다시한번 세척한 후 다음 서열의 Fmoc으로 보호된 아미노산과 동일한 방법에 의해 순차적으로 반응하여 펩티드를 합성하였다.

펩티드의 모든 서열에 해당하는 아미노산과의 반응이 종료되면, 레진을 DMF, 메탄올, DCM, 에테르를 사용하여 순차적으로 세척하고 진공하에서 건조하였다.

건조된 레진 100mg에 5%(v/v) TIS와 5%(v/v) 물이 함유된 2mL의 TFA를 넣고 2시간 동안 교반하여 레진으로부터 펩티드를 분리하였다. 2시간 후 레진을 제거한 용액에 차가운 에테르를 가하여 펩티드를 침전시키고 여과 및 세척하여 약 95% 순도의 크루드 상태의 펩티드를 수득하였다. 크루드 펩티드는 프랩용 Vydac C₁₈column(15㎛, 20 mm*250 mm)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 98% 이상의 순도가 되도록 정제하여 이후 실험에 사용하였다. 하기 표 1에는 정제된 펩티드의 MALDI-TOF(Shimadzu, Japan)에 의한 분석 data와 소수성의 지표가 되는 HPLC에서의 retention time(Rt)을 함께 기재하였다. HPLC는 Vydac C18 컬럼(4.6mmㅧ250mm, 5㎛)을 사용하였으며, 10-90% 물/아세토 니트릴의 선형구배(25m) → 90% 아세토니트릴을 용출액으로 사용하였다.

실시예 3 : 펩티드의 항균활성 측정

실시예 2에서 제조한 펩티드에 대해 그람-음성 박테리아와 그람-양성 박테리아에 대한 향균활성을 BDM(broth microdilution method)을 이용하여 살균된 96-웰 플레이트에서 측정하였다. 그람-양성 박테리아로는 Staphylococcus epidermidis [KCTC 1917]와 Staphylococcus aureus[KCTC 1621]를 그람-음색 박테리아로는 Escherichia coli[KCTC 1682]와 Pseudomonas aeruginosa[KCTC 1637]를 한국생명공학연구원으로부터 각각 분주받아 사용하였다.

보다 구체적으로 1% peptone에 2×10⁶ cfu/mL 농도의 박테리아를 현탁한 용액을 웰 플레이트에 100㎕씩 분주하고, 실시예 2에서 제조한 펩티드 용액 100㎕(1% peptone을 사용하여 2배씩 순차적으로 희석된 용액)를 각각 가하였다. 37ㅀC에서 18~20시간 배양한 후 Microplate Autoreader EL 800(Bio-Tek Instruments, VT)를 사용하여 600nm에서의 흡광도를 측정하여 박테리아의 성장 저해도를 평가하였다. 최소 저해 농도(MIC)를 박테리아의 성장을 저해하는 최소 펩티드 농도로 정의하고, 그 값과 4가지 박테리아에 대한 MIC의 기하 평균을 하기 표 2에 기재하였다. 비교를 위하여 광범위한 항균활성을 갖는 26개의 아미노산으로 구성된 Melittin(에니젠)과 LL-37(에니젠) 각각에 대해 동일 실험을 실시하고 그 결과를 함께 기재하였다.

트립토판과 아르기닌으로 구성된 펩티드인 A-1은 대조군인 Melittin과 유사한 항균활성을 나타내었으나, 펩티드 내 아미노산의 수가 줄어듬에 따라 항균활성이 크게 저하되어 A-2는 A-1에 비해 크게 저하된 항균활성을 나타냈으며, A-3은 256㎍/mL의 농도에서도 항균활성을 나타내지 않았다.

그러나, A-3의 트립토판을 본 발명의 히스티딘 유도체로 치환한 A-7, A-8 및 A-10의 경우에는 세 개의 아미노산 만으로 구성된 펩티드임에도 불구하고 Melittin이나 A1과 유사한 항균활성을 나타내었으며, 특히 P. aeruginosa에 대해서는 대조군보다도 우수한 항균활성을 보여주었다. 곁가지의 길이가 더 짧은 A-10의 경우 A-7에 비해 항균활성이 낮은 것으로부터, 본 발명에 의한 아미노산의 소수성의 증가가 항균활성의 증가와 밀접한 연관이 있음을 유추할 수 있다. A-7, A-8 및 A-10에 대해 retention time으로 확인한 소수성의 정도와 항균활성과도 일치된 관계를 나타내었다. 또한 벤젠 고리가 사이크로헥실 고리로 치환된 A-8의 경우 항균활성이 A-7과 큰 차이가 없어 방향성 고리가 항균활성에 절대적으로 필요한 것은 아님을 알 수 있다.

펩티드 내 아르기닌 한 분자가 줄어든 A-11~A-13의 경우에도 항균활성은 A-7, A-8 및 A-10과 유사하거나 약간 감소하였는데, 이때 곁가지의 길이가 길수록, 즉 소수성이 클수록 아르기닌의 제거에 의한 항균활성의 영향이 적었다. 이로부터, 항균활성은 아르기닌에 의한 양이온성의 감소보다는 소수성에 의해 더 큰 영향을 받는 것을 알 수 있다.

실시예 1에서 제조한 비교예의 아미노산을 포함하는 펩티드인 A-14와 A-15는 A-7과 A-8에 비해 소수성이 크게 감소한 것을 알 수 있으며, 그람-음성 박테리아에 대해서는 항균활성을 거의 나타내지 않았다. 반면, 그람-양성 박테리아에 대해서는 항균활성이 크게 영향을 받지 않았다.

D-아미노산으로 구성된 펩티드는 항균활성이 다소 저하되나 안정성이 크게 증가하는 것으로 알려져 있다. L-아르기닌 대신 D-아르기닌을 포함하는 펩티드인 A-16은 예상한 바와 같이 항균활성이 약 1/4로 감소하였으나, A-17은 항균활성에 거의 영향을 받지 않았다.

히스티딘 유도체의 위치에 따른 항균활성을 확인하기 위하여 N-말단 또는 C-말단에 히스티딘 유도체를 각각 배치한 A-18과 A-19의 항균활성은 A-8과 큰 차이가 없어, 펩티드 내 소수성 영역인 히스티딘 유도체의 위치는 중요하지 않음을 알 수 있었다.

실시예 4 : 펩티드의 세포 독성 측정

1) 펩티드의 용혈활성 측정

포유동물에 대한 펩티드의 세포독성은 적혈구에 대한 용혈활성으로 측정할 수 있으므로, 실시예 2에서 제조한 펩티드에 대해 인간 적혈구(hRBCs)에 대한 용혈활성을 측정하였다. 신선한 hRBCs는 PBS(150mM NaCl을 함유하는 35mM phosphate buffer, pH 7.4)를 넣고 1000×g에서 10분간 원심분리하고 재부유하는 것을 3회 반복하여 세척하였다. 실시예 2에서 제조한 펩티드를 PBS 용액에 2배씩 순차적으로 희석하여 펩티드 용액을 제조하고, hRBCs 100㎕에 넣고 최종 부피가 200㎕가 되도록 하여 적혈구 농도가 4%(v/v)인 현탁액을 제조하였다. 현탁액을 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 1000×g에서 10분간 원심분리한 후 상등액의 405nm에서의 흡광도를 측정하여 방출된 헤모글로빈을 측정하였다. 펩티드 용액 대신 PBS와 0.1% Triton X-100 용액을 각각 사용하여 동일 실험을 수행한 후 블랭크와 100% 용혈의 데이터로 사용하였다. 다음 식에 의해 용혈 비율을 계산하여 도 1에 도시하고, 그 값으로부터 50% 용혈을 일으키는 펩티드의 농도(HC₅₀)를 측정하여 하기 표 3에 기재하였다. 항균제는 포유류에는 중대한 영향을 미치지 않으면서 원핵생물인 박테리아를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 선택성이 중요하다. 이러한 선택성은 HC₅₀/GM으로 정의되는 치료지수(therapeutic index, TI)에 의해 가늠할 수 있으므로 표 3에 TI를 계산하여 함께 나타내었다.

용혈(%) = [(OD_405nm _of _sample－OD_405nm _of _zero _lysis)/(OD_405nm _of _100% _lysis－OD_405nm _of _zero _lysis)×100

트립토판과 아르기닌으로 구성된 펩티드인 A-1~A-3은 유사한 용혈활성을 나타내었으나, A1의 항균활성이 높기 때문에 TI 값은 A-1>A-2>A-3의 순서를 나타내었다.

A-3의 트립토판을 본 발명의 히스티딘 유도체로 치환한 A-7은 A-1~A-3에 비해서는 용혈활성이 다소 증가하였으나, 대조군인 Melittin에 비해서는 11배 이상 용혈활성이 감소하였다. A-7보다 곁가지의 길이가 감소한 A-10의 경우에는 고농도에서도 용혈활성을 나타내지 않아, 곁가지의 길이가 증가함에 따라 용혈활성을 증가함을 시사하였다. 또한 벤젠 고리가 사이크로헥실 고리로 치환된 A-8의 경우에도 용혈활성이 A-7보다 크게 낮아져, TI 값이 크게 증가하였다.

펩티드 내 아르기닌 한 분자가 줄어든 A-11의 경우 항균활성은 큰 변화가 없었으나 용혈활성이 다소 증가하여 TI 값이 1/2로 감소하였으며, A-12는 용혈활성은 큰 변화가 없었으나 항균활성의 감소로 TI값이 약 1/5로 감소하였다.

실시예 1에서 제조한 비교예의 아미노산을 포함하는 펩티드인 A-14 및 A-15와, 히스티딘 유도체를 N-말단 또는 C-말단에 각각 배치한 A-18과 A-19는 A-7과 A-8에 비해 용혈활성에 큰 변화가 없었다. L-아르기닌 대신 D-아르긴을 포함하는 펩티드인 A-16은 용혈활성이 감소하였으나, A-17은 오히려 증가하였다.

2) 펩티드의 RAW264.7 세포에 대한 세포독성 측정

Raw 264.7 세포(American Type Culture Collection에서 구입)은 10% 소태아혈청(FBS)(HyClone)과 항생제(100units/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신, 25㎍/mL 암포테리신 B)가 첨가된 DMEM 배지(HyClone)에서 가습된 5% CO₂ 분위기하의 37℃에서 배양하였다. 2~3일마다 계대 배양하였으며, 세포는 트립신(trypsin) 처리에 의해 분리하고 역상 현미경으로 관찰하였다.

Raw 264.7 세포에 대한 펩티드의 세포독성은 MTT assay(Cancer Res . 48, 4827－4833, 1988)를 약간 수정하여 측정하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM 150㎕가 담겨있는 96-웰 플레이트의 각 웰 당 2×10⁴세포를 함유하도록 Raw 264.7 세포를 접종하고 가습된 5% CO₂ 분위기하의 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 각 웰에 실시예 2에서 제조한 펩티드 용액 20㎕(DMCM 배지에 2배씩 순차적으로 희석하여 사용)씩을 가하고 2일간 추가로 배양하였다. 이어서, 각 웰에 5㎎/mL 농도의 MTT(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, Sigma) 용액 20㎕를 가한 후 37℃에서 추가로 4시간 비양하였다. 침전된 MTT 포르마잔(formazan)을 0.01M HCl을 포함하는 20%(w/v) SDS 용액 40㎕에 용해시켰다. microplate ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 570nm에서의 흡광도를 측정하고 다음 식에 의해 세포 생존률을 계산하여 도 2에 도시하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 대부분의 펩티드들은 높은 농도에서도 세포독성을 거의 나타내지 않았다. 세포독성이 관찰된 A-7, A-11, A-16 및 A-17의 경우에도 IC₅₀ 값은 GM 값보다 약 4배 정도 높아 모든 펩티드가 안전하게 사용될 수 있음을 나타내었다. 대조군 중 Melittin은 IC₅₀ 값이 GM 값 다소 낮게 측정되었다.

3) LPS 자극-RAW264.7 세포에서의 나이트라이트 생성 정량

배양액에서 나이트라이트의 축적량은 nitric oxide(NO)의 지표로 활용될 수 있다. 96-웰 플레이트의 각 웰 당 5×10⁵/mL의 농도로 RAW264.7 세포를 분주하고, 펩티드를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 E. coli O111:B4 유래의 LPS(Lipopolysaccharide)(Sigma)로 자극하였다. 상등액을 분리하여 동일 부피의 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 2% phosphoric acid)와 혼합하고 상온에서 10분간 배양하였다. 나이트라이트의 생성은 540nm에서의 흡광도로 측정하였으며, NaNO₂의 표준곡선을 참조하여 나이트라이트 농도로 환산하고 그 결과를 도 3과 도 4에 도시하였다.

도 3에서 LPS에 의해 유도된 NO 분비는 RAW264.7 세포에서 A-7, A-11. A-16 및 A-17에 의해 저해되는 것을 확인하였다. 상기 펩티드들의 NO 분비 저해도를 0~8㎍/mL 농도 범위에서 확인한 도 4로부터 NO 분비는 펩티드에 도스(농도)-의존적으로 저해됨을 알 수 있었다. 이 중에서 A-11이나 A-17보다 높은 TI 값을 나타내었던 A-7은 LL-37에 비해 높은 NO 저해도를 나타냈다. 반면 높은 TI 값을 가지면서도 세포독성을 거의 보여주지 않던 A-8, A-10, A-16 및 A-18은 NO 저해활성을 거의 나타내지 않아, 본 발명의 히스티딘 유도체의 구조로 인한 소수성의 증가가 LPS-중화(LPS-neutralizing) 활성과 밀접한 연관이 있음을 시사하였다. D-아르기닌을 포함하는 펩티드인 A-16은 indolicine(IN)과 유사한 IC₅₀ 값 및 NO 저해도를 갖는다.

4) LPS 자극- RAW204 .7 세포에서 TNF -α 생성 정량

마우스 TNF-α(mTNF-α)의 항체 0.2-0.8㎍/mL PBS 용액을 상온에서 밤새 배양하여 immunoplate에 고정화하였다. 플레이트를 PBS와 0.1% Tween 20(PBST)으로 순차적으로 세척하여 PBS에 3% 소혈청알부민(BSA)와 0.02% NaN₃가 혼합된 용액 200㎕을 넣고 상온에서 밤새 배양하여 차단(block)하였다. 순차적으로 희석된 펩티드와 함께 배양된 LPS-자극 PAW264.7 세포로부터 얻은 상등액을 상기 플레이트의 웰에 가하고 상온에서 2시간 배양하였다. 웰을 PBST로 3회 세척하고, 0.1% BSA로 희석한 biotin과 결합된 anti-mTNF-α 항체 0.4㎍/mL를 가하여 다시 2시간 배양하였따. 다시 PBST로 3회 세척하고 PBS에 희석된 streptavidin peroxidase 0.3㎍/mL와 함께 추가로 2시간 배양하였다. PBS로 세척하고, SureBlue 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine peroxidase substrate(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)를 가하고 발색이 되도록 상온에서 반응시킨 후 1M 황산 100㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. microplate reader를 사용하여 405nm의 흡광도로 mTNF-α의 생성량을 측정하여 도 5에 도시하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이 mTNF-α 분비량의 저해도는 나이트라이트 생성량의 저해도와 유사한 경향을 나타내었다.

실시예 5 : 펩티드의 프로테아제에 대한 안정성 측정

Escherichia coli와 Staphylococcus aureus를 10mL LB 배지에서 37℃, 18시간 동안 배양하고, 배양액 10㎕를 신선한 BL 배지 10mL에 접종한 후 3시간동안 추가로 배양하여 중-대수기(mid-logarithmic phase)의 세균을 얻었다. 방사확산정량법(radial diffusion assay method)을 위해 박테리아 현탁액(2×10⁶ CFU/mL in LB)을 0.7% agarose와 혼합하여 빠르게 분산시킨 후, 혼합액을 10cm 페트리디쉬에 부였다. 펩티드의 스톡 용액(10 mg/mL) 5㎕씩을 트립신 용액(0.2㎍/mL in PBS) 25㎕에 각각 넣은 후 37℃에서 6시간 배양하였다. 액체 질소로 동결하여 반응을 종결시키고 10㎕씩을 취하여 상기 agarose가 담긴 페트리디쉬 상에 올려진 6mm 직경의 원형 종이위에 각각 분주시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 저해활성의 정량을 위해 원형 종이 주변의 박테리아의 클리어런스 존(clearance zones)을 측정하고 트립신을 추가하지 않고 배양한 펩티드 용액을 사용한 실험결과를 대조군으로 하여 그 결과를 도 6에 함께 도시하였다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, Mellitin과 LL-37은 트립신의 처리에 의해 항균활성을 거의 상실하였음에 반해, 본 발명에 의한 펩티드들은 항균활성에 거의 변화가 없었다.

Claims

서열 중 하기 일반식 1로 표시되는, 이미다졸기의 N(π)와 N(τ) 위치가 모두 치환된 히스티딘 유도체와 아르기닌을 함유하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
일반식 1

이때 R=-(CH₂)_n-CH3, -(CH₂)_n-Ph 또는 (CH₂)_n-Cyclohexyl기이며, n=1~7인 정수.
제 1 항에 있어서,
상기 펩티드는 다이머 또는 트라이머인 것을 특징으로 하는 항균성 펩티드.
펩티드 제조를 위한 중간체인 하기 일반식 2의 히스티딘 유도체.
일반식 2

이때 R=-(CH₂)_n-CH3, -(CH₂)_n-Ph 또는 (CH₂)_n-Cyclohexyl, n=1~7인 정수이며, P=Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl), t-Boc(t-butyloxycarbonyl), CBz(Carbobenzyloxy) 또는 Nsc(2-(4-nitrophenyl)sulfonylethoxycarbonyl).
제 3 항에 있어서,
P=Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)인 것을 특징으로 하는 일반식 2의 히스티딘 유도체.
(A) 히스티딘의 N(π)가 Trityl(triphenylmethyl)기로 보호된 화합물 C와 알콜(R-OH)을 축합반응하는 단계; 및
(B) 축합반응의 산물인 화합물 D의 에스테르기를 산 존재하에서 가수분해하는 단계;
를 포함하는 하기 반응식 1에 의한 제 3 항의 히스티딘 유도체의 제조방법.
반응식 1

이때 R=-(CH₂)_n-CH3, -(CH₂)_n-Ph 또는 (CH₂)_n-Cyclohexyl, n=1~7인 정수이며, P=Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl), t-Boc(t-butyloxycarbonyl), CBz(Carbobenzyloxy) 또는 Nsc(2-(4-nitrophenyl)sulfonylethoxycarbonyl).
제 1 항 또는 제 2 항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항균제 약제학적 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항염증제 약제학적 조성물.