WO2020196315A1 - 細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物 - Google Patents

細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物 Download PDF

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WO2020196315A1
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mmol
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solid
phase synthesis
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臼井　健郎
陽子 南雲
海凪 向山
良雄 林
敦彦 谷口
千尋 内山
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国立大学法人筑波大学
学校法人東京薬科大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a cell layer permeation promoter, a drug absorption assisting composition, and a pharmaceutical composition.
  • Biopharmacy and its candidate substances which have been actively developed in recent years, such as peptides, proteins, antibodies, vaccines, and nucleic acids, have low bioavailability, and the technology of drug delivery system (DDS) is that. Expand the range of applicability of such drugs, and improve the quality of life of patients by non-invasive, oral, transdermal, nasal, transpulmonary, transmucosal, etc. administration methods instead of injection administration. It also leads to the development of the technology.
  • DDS drug delivery system
  • Non-Patent Document 6 reports cyclic lipopeptide as an antibacterial substance derived from Pseudomonas aeruginosa.
  • Non-Patent Document 6 did not focus on the technique for promoting the permeation of substances into the cell layer.
  • an object of the present invention is to provide a technique for promoting permeation of a substance into a cell layer.
  • the present invention first provides a cell layer permeation enhancer composed of a compound represented by the following general formula (1).
  • R is an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • X is leucine or a conservative substitution thereof, more preferably leucine, isoleucine, norleucine, tert-butylalanine, tert-leucine, valine, cyclohexylglycine, or cyclohexylalanine, or alanine.
  • XX is valine or a conservative substitution thereof, more preferably valine, isoleucine, norleucine, tert-butylalanine, tert-leucine, leucine, cyclohexylglycine, or cyclohexylalanine, or alanine.
  • Y is glutamic acid or a conservative substitution thereof, more preferably glutamic acid or aspartic acid, or alanine.
  • Z is glutamine or a conservative substitution thereof, more preferably glutamine or asparagine, or alanine.
  • ZZ is any ⁇ -amino acid, more preferably glutamine or alanine.
  • YZ is serine, threonine, homoserine, diaminopropanoic acid, or diaminobutyric acid, R'is sec-butyl or a conservative substitution thereof, more preferably sec-butyl, isopropyl, isopentyl, n-butyl, tert-butyl, cyclohexyl, or cyclohexylmethyl.
  • the compound represented by the above general formula (1) is preferably a compound represented by the following general formula (2).
  • R is an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • ZZ is any ⁇ -amino acid, more preferably glutamine or alanine.
  • the present invention provides a composition for assisting drug absorption, which comprises the above-mentioned cell layer permeation promoter and is for assisting absorption of the drug into a living body.
  • the present invention also provides, thirdly, a pharmaceutical composition containing the above-mentioned cell layer permeation promoter and further containing a drug to be absorbed by a living body.
  • a specific cyclic lipopeptide has an action effect of promoting cell layer permeation of a substance, and by utilizing this, an excellent cell layer permeation promoter, a drug absorption assisting composition, and a drug absorption assisting composition, and A pharmaceutical composition can be provided.
  • Test Example 1 it is a chart which shows the result of having evaluated the influence of various cyclic polypeptis on the permeability of dextran having a molecular weight of 4000 in the permeability evaluation test using the model cell layer.
  • Test Example 2 it is a chart which shows the result of having evaluated the influence of various cyclic polypeptis on the permeability of dextran having a molecular weight of 4000 in the permeability evaluation test using the model cell layer.
  • FIG. 3 is a chart showing the results of evaluating the effects of various cyclic polypeptites on the permeability of dextran having a molecular weight of 4000 in a permeability evaluation test using a model cell layer in Test Example 3.
  • Test Example 4 it is a chart which shows the result of having evaluated the influence of various cyclic polypeptis on the permeability of dextran having a molecular weight of 4000 in the permeability evaluation test using the model cell layer.
  • R is an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • X is leucine (Leu) or a conservative substitution thereof, more preferably leucine (Leu), isoleucine (Ile), norleucine (Nle), tert-butylalanine (Ala ⁇ tBu ⁇ ), tert-leucine (tert-Leu). ), Valin, cyclohexylglycine (Chg), or cyclohexylalanine (Cha), or alanine (Ala).
  • XX is valine (Val) or a conservative substitution thereof, more preferably valine (Val), isoleucine (Ile), norleucine (Nle), tert-butylalanine (Ala ⁇ tBu ⁇ ), tert-leucine (tert-Leu). ), Leucine (Leu), cyclohexylglycine (Chg), or cyclohexylalanine (Cha), or alanine (Ala).
  • Y is glutamic acid (Glu) or a conservative substitution thereof, more preferably glutamic acid (Glu) or aspartic acid (Aspart), or alanine (Ala).
  • Z is glutamine (Gln) or a conservative substitution thereof, more preferably glutamine (Gln) or asparagine (Asn), or alanine (Ala).
  • ZZ is any ⁇ -amino acid, more preferably glutamine glutamine (Gln) or alanine (Ala).
  • YZ is serine (Ser), threonine (Thr), homoserine, diaminopropanoic acid, or diaminobutyric acid.
  • R' is sec-butyl or a conservative substitution thereof, more preferably sec-butyl, isopropyl, isopentyl, n-butyl, tert-butyl, cyclohexylmethyl, cyclohexyl.
  • R' is sec-butyl
  • the ⁇ -amino group and the ⁇ -carboxyl group of isoleucine (Ile) have a peptide bond between adjacent amino acids, and similarly isopropyl.
  • valine (Val) when it is isoleucine, leucine (Leu), when it is n-butyl, it is norleucine (Nle), and when it is tert-butyl, it is tert-butylalanine (Ala ⁇ tBu ⁇ ).
  • the compound represented by the above general formula (1) may be a compound represented by the following general formula (2).
  • R is an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • ZZ is any ⁇ -amino acid, more preferably glutamine or alanine.
  • the compound represented by the general formula (1) may be a compound represented by the following general formula (3) in which the DL isomer structure of the peptide bond is specified.
  • R is an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms which may have a substituent.
  • ZZ is any ⁇ -amino acid, more preferably glutamine or alanine.
  • R is represented as an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms which may have a substituent, but typically, the alkyl group may optionally have a hydroxyl group. More typically, it may be an alkyl group having only 1 to 4 hydroxyl groups as a substituent, and even more typically, it may be an alkyl group having only 1 to 2 hydroxyl groups as a substituent. .. Further, the alkyl group length may be 1 to 6 carbon atoms or 1 to 3 carbon atoms. Further, in consideration of the examples described later, it is more typical that R is a group represented by the following formula (4) or (5). The alkyl group length of the group represented by the following formula (4) or (5) has 9 carbon atoms, but the alkyl group length may have 6 carbon atoms or 3 carbon atoms.
  • Non-Patent Document 6 at least one of the above compounds used in the present invention has been clarified to be contained in a certain Pseudomonas bacterium, and such strains and mutations have been clarified. It may be prepared by extracting from a strain, a gene-introduced strain, or the like, or it may be prepared by extracting from other biological resources such as other microorganisms, but it is artificially synthesized from the viewpoint of industrial production. It is more preferable that the product is a product. Examples of the synthesis method include a liquid phase method, an adiphase method, and a solid phase method. Of these, it is more preferable to synthesize by the solid phase method because purification of the intermediate can be omitted.
  • the procedure for the Fmoc solid-phase synthesis method is to first react the Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) group, which is a protecting group on the resin, in a 20% (v / v) piperidine / DMF solution at room temperature for 20 minutes. Remove. After washing the resin, amino acids are condensed using various condensing agents. The target peptide is obtained by repeating this cycle.
  • the condensing agent a carbodiimide reagent, diphenylphosphoryl azide, BOP reagent, HATU reagent and the like are used.
  • solid-phase synthesis can be performed, for example, starting from the 13th D-Gln residue from the N-terminal. That is, after deprotecting the Fmoc group on the resin with a 20% (v / v) piperidine / DMF solution, Fmoc-D-Glu-Oallyl without side chain protection is condensed. Repeated deprotection and condensation to extend to the 8th D-Val residue.
  • N (((9H-fluorene-9-yl) methoxy) carbonyl) -O-((2R) -2-(((allyloxy) carbonyl) amino) -3-methylpentanoyl) -Introduce D-serine into the resin.
  • a palladium catalyst is used to remove the allyl group and the Alloc (allyloxycarbonyl) group. After removal, a ring is formed on the resin.
  • the target peptide can be obtained by sequentially extending from the C-terminal side in the same manner as in the case of Fmoc-D-Glu-Oallyl.
  • various cyclic peptides can be synthesized on the resin by changing the amino acid to be condensed. For example, if you want to change the 13th D-Gln residue from the N-terminal to another amino acid, you can replace it by changing the binding position with the resin from the 13th to 10th D-Gln.
  • the cell layer permeation promoter according to the present invention comprises the above compound or uses the above compound. That is, as shown in Examples described later, when the above compound acts on the cell layer, it has some effect on the cell adhesion structure, and the permeability of the substance in the intercellular space pathway is enhanced.
  • specific examples of the application target include skin, lung, nose, digestive tract, intestinal tract, and other mucosal tissues, and the type of tissue is not particularly limited.
  • the type of layer shape regardless of whether the cells are formed in a single layer or in multiple layers.
  • cell layers derived from animals such as pets and livestock may be targeted. Further, in some cases, it may be applied to a cell layer formed in vitro as needed.
  • the drug absorption assisting composition according to the present invention contains a cell layer permeation promoter composed of the above compound, and is a composition for assisting the absorption of the drug into a living body. That is, in this composition, as the cell layer to be applied, for example, skin, lung, nose, gastrointestinal tract, intestinal tract, other mucosal tissues, etc. are treated with a desired drug to be absorbed by the living body, thereby Since the compound becomes an active ingredient and substances and the like in the intercellular pathway are enhanced, the absorption rate of a desired drug by the pathway into a living body can be improved.
  • the form of the composition may contain the above compound and is not particularly limited, but a preparation known to those skilled in the art together with a pharmaceutical base material as appropriate according to the type of cell layer to be applied.
  • a pharmaceutical base material as appropriate according to the type of cell layer to be applied.
  • ointments, creams, lotions, emulsions and other coating agents, patches, patches, aerosols, suction agents, suppositories, troches, sublingual tablets, oral disintegrants, jelly-like agents, liquids, Forms such as soft capsules, hard capsules, powders, granules and tablets can be adopted.
  • the content of the compound in the composition is, for example, 0.0001 to 100% by mass, more typically 0.001 to 75% by mass, still more typically 0.01 to 50% by mass, particularly typical. It is 0.1 to 30% by mass, and more typically 1 to 20% by mass or the like.
  • the agent to which the present invention is applied is not particularly limited, but is not particularly limited, such as low molecular weight compounds, peptides, proteins, antibodies, vaccines, and nucleic acids which may be hydrophilic, lipophilic, or amphipathic. It is applied to a substance having a molecular weight of at least 500 or more, more preferably 1000 or more, and even more preferably 2000 or more to improve the absorption rate into the living body, expand the range of applicability of the substance as a drug, and also. , It is preferable to develop a non-invasive, oral, transdermal, nasal, transpulmonary, transmucosal, etc. administration method instead of injection administration, because it leads to improvement of the patient's Quality of Life.
  • the above-mentioned compound and a desired drug to be absorbed by a living body are contained in the same form in the form of the above-mentioned drug absorption assisting composition, and the pharmaceutical composition is prepared. It may be in the form.
  • the dose of the above-mentioned compound according to the present invention varies depending on the type of cell layer to be applied and the type of drug to be absorbed by the living body, and is not unconditional, but for example, typically,
  • the single application amount per 1 cm 2 of the surface area may be about 0.01 ⁇ g to 10 mg, more typically about 0.1 to 1 mg, and even more typically about 1 ⁇ g to 0.1 mg. It may be.
  • the cell gap opening action by the above compound is reversible rather than irreversible as in the conventionally known actin polymerization inhibitors, and is compared after treatment. Since the normality of cell adhesion structures such as tight junctions is restored promptly and probably by the action of maintaining biological homeostasis, it can be used safely without impairing the barrier function against foreign substances.
  • Fmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol / g, Watanabe Kagaku Kogyo Co., Ltd.) 300 mg (0.111 mmol) was weighed on a PP filtration column, and the resin was swollen in a dimethylformamide (DMF) solution at room temperature for 40 minutes. After swelling, the protecting group Fmoc (9-fluorenylmethosikicarbonyl) on the resin was removed by reacting in a 20% (v / v) piperidine / DMF solution at room temperature for 20 minutes.
  • DMF dimethylformamide
  • the protecting group Fmoc group on the resin was removed by washing with DMF 10 times and reacting in a 20% (v / v) piperidine / DMF solution at room temperature for 20 minutes.
  • Fmoc-Leu-OH (0.333 mmol, 3 eq)
  • Fmoc-Leu-OH (0.333 mmol, 3 eq)
  • Fmoc-Gln are sequentially applied from the C end.
  • the resin was dried after washing 5 times with DMF, 5 times with methanol, and 5 times with diethyl ether.
  • the dry resin was reacted in DCM at room temperature for 180 minutes in the presence of tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (0.111 mmol, 1 eq) and phenylsilane (1.11 mmol, 10 eq) on the resin.
  • the allyl group and Alloc (allyloxycarbonyl) group were removed.
  • the Fmoc groups on the resin were removed by washing with DMF 10 times and reacting in a 20% (v / v) piperidine / DMF solution at room temperature for 5 minutes. Washed 10 times with DMF, N, N '- diisopropylcarbodiimide (DIPCI, 0.333 mmol, 3 eq ), 1- hydroxy -1H- benzotriazole hydrate (HOBt ⁇ H 2 O, 0.333 mmol, 3 eq) under present in , Fmoc-Gln (Trt) -OH (0.333 mmol, 3 eq) was reacted in DMF for 90 minutes at room temperature to introduce amino acids onto the resin.
  • DIPCI N, N '- diisopropylcarbodiimide
  • HOBt ⁇ H 2 O 0.333 mmol, 3 eq
  • the Fmoc groups on the resin were removed by washing 10 times with DMF and reacting in a 20% (v / v) piperidine / DMF solution at room temperature for 20 minutes.
  • Fmoc-D-Glu-Oallyl in the same manner as in the case of Fmoc-D-Glu-Oallyl, Fmoc-D-Leu-OH (0.333 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Val-OH (0.333 mmol, 3 eq), Fmoc are sequentially applied from the C end.
  • Fmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol / g, Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.) 100 mg (0.037 mmol) was weighed on a PP filtration column, and the resin was swollen in a dimethylformamide (DMF) solution at room temperature for 40 minutes.
  • the synthesis method uses the same method as cu538-1,2, and extends to leucine at the first residue at the N-terminal.
  • N, N '- diisopropylcarbodiimide (DIPCI, 0.111 mmol, 3 eq ), 1- hydroxy -1H- benzotriazole hydrate at (HOBt ⁇ H 2 O, 0.111 mmol, 3 eq) in the presence, Decanoic acid (0.111 mmol, 3 eq) was introduced, washed 5 times with DMF, washed 5 times with methanol, washed 5 times with diethyl ether, and then the resin was dried. The reaction was carried out in 3.8 ml of trifluoroacetic acid (TFA) in the presence of water (0.2 ml) for 3 hours to remove various side chain protecting groups and remove the resin.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Fmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol / g, Watanabe Kagaku Kogyo Co., Ltd.) 50 mg (0.0185 mmol) was weighed on a PP filtration column, and the resin was swollen in a dimethylformamide (DMF) solution at room temperature for 40 minutes.
  • the synthesis method uses the same method as cu538-1,2, and sequentially from the C end, moc-D-Glu-Oallyl (0.0555 mmol) Fmoc-Leu-OH (0.0555 mmol, 3eq), Fmoc-Leu-OH (0.0555).
  • Fmoc group on the resin is deprotected, and Fmoc-Ala-OH (0.0555 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Leu-OH (0.0555 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Val-OH (0.0555 mmol).
  • Fmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol / g, Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.) 100 mg (0.037 mmol) was weighed on a PP filtration column, and the resin was swollen in a dimethylformamide (DMF) solution at room temperature for 40 minutes.
  • DMF dimethylformamide
  • the synthesis method uses the same method as cu538-1,2, and sequentially from the C end, Fmoc-D-Glu-Oallyl (0.111 mmol), Fmoc-Leu-OH (0.111 mmol, 3eq), Fmoc-Leu-OH ( 0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Ala-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Leu-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Val-OH (0.111 mmol, 3 eq) ), N (((9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) -O-((2R) -2-(((allyloxy) carbonyl) amino) -3-methylpentanoyl) -D-serine (0.111) Introduce mmol, 3eq).
  • the cyclization reaction is carried out using the same method as cu538-1,2. After that, the Fmoc group on the resin is deprotected, and Fmoc-Ala-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Leu-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Val-OH (0.111 mmol).
  • Fmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol / g, Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.) 100 mg (0.037 mmol) was weighed on a PP filtration column, and the resin was swollen in a dimethylformamide (DMF) solution at room temperature for 40 minutes.
  • DMF dimethylformamide
  • the synthesis method uses the same method as cu538-1,2, and sequentially from the C-terminal to Fmoc-D-Glu-Oallyl (0.111 mmol), Fmoc-D-Leu-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D- Val-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Ser-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-Gln (Trt) -OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Leu-OH ( 0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Val-OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Gln (Trt) -OH (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-D-Glu (OtBu) -OH Introduced (0.111 mmol, 3 eq), Fmoc-Leu-OH
  • N with respect to dry resin, N '- diisopropylcarbodiimide (DIPCI, 0.185 mmol, 5 eq ), pyridine (0.185 mmol, 5 eq), N, N- dimethyl-4-aminopyridine (0.185 mmol, 5 eq) presence , Fmoc-Ile-OH (0.111 mmol, 3 eq) is reacted in anhydrous DMF for 120 minutes at room temperature. This operation was performed twice to introduce amino acids onto the resin.
  • DIPCI N '- diisopropylcarbodiimide
  • Fmoc-D-Ala-OH (0.111 mmol, 3 eq)
  • Fmoc-Leu-OH (0.111 mmol, 3 eq)
  • Fmoc-Leu-OH (0.111 mmol, 3 eq)
  • the resin was dried after washing 5 times with DMF, 5 times with methanol, and 5 times with diethyl ether.
  • the dry resin was reacted in DCM at room temperature for 180 minutes in the presence of tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (0.111 mmol, 1 eq) and phenylsilane (1.11 mmol, 10 eq) on the resin.
  • the allyl group was removed.
  • wash 5 times with DCM wash 5 times with 0.5% (w / v) sodium N, N-diethyldithiocarbamate trihydrate / DMF solution, wash 5 times with DMF, Fmoc group After deprotection, a ring was formed. After removing the resin by the same method as cu538-1,2, it was purified by high performance liquid chromatography to obtain a white solid (11 mg, yield 17%).
  • MS (mass) of the obtained compound was analyzed, the following data were obtained.
  • Example 1 Using MDCK II cells derived from canine kidney epithelial cells, a transwell-based model of the epithelial cell layer was created and a substance permeability evaluation test was conducted. Specifically, MDCK II cells in the logarithmic growth phase were transwelled (6.5 mm diameter, collagen coat, pore size 0.4 ⁇ m) with a cell number of 3.4 to 4.0 ⁇ 10 4 cells (trade name “ The cells were seeded in corning transwell 3495 (manufactured by Corning), and 600 ⁇ L of cell growth medium was placed in each of the apical well and the basal well using a 24-well well plate as the basal well.
  • the medium is changed daily to form a layer, and 3 days after seeding, the medium is changed to Hank's balanced salt solution (HBSS) for measurement, and after incubation at 37 ° C. for 1 hour, the layer formation is performed by a resistance measurement system (trade name). It was confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) using "Millicell-ERS" (manufactured by Millipore). After confirming the layer formation, the medium on the apical side was replaced with 100 ⁇ L of HBSS added with a marker substance (FD4: fluorescently labeled dextran) (manufactured by Sigma) having a molecular weight of 4000 at a concentration of 1.0 w / v%.
  • a marker substance FD4: fluorescently labeled dextran
  • each test substance was added to the final concentration shown below. Transfer the transwell to the basal well containing the new HBSS every 30 minutes for 30 minutes up to 5 hours after the addition of the marker substance, and the remaining basal well HBSS (hereinafter referred to as “receiver solution”) is 50 ⁇ L thereof. Each was collected in one well of a 96-well well plate. With respect to the recovered HBSS, the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 528 nm using a fluorescent plate reader (trade name “Wallac 1420 ARVO MX”, manufactured by PerkinElmer).
  • Test Example 2 A substance permeability evaluation test was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the test substance was replaced as shown below.
  • Negative control None (1v / v% DMSO only)
  • Test group 3 cu538-2 0.003 mM (in 1 v / v% DMSO)
  • Test group 4 NY-38 0.003 mM (in 1 v / v% DMSO)
  • Positive control Latrunclin A (LatA) 0.0001 mM (in 1 v / v% DMSO)
  • Test Example 3 A substance permeability evaluation test was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the test substance was replaced as shown below.
  • Test Example 4 A substance permeability evaluation test was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the test substance was replaced as shown below.

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Abstract

物質の細胞層透過を促進させるための技術を提供する。　下記一般式（１）で表わされる化合物からなる細胞層透過促進剤を提供するものである。また、上記細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するためのものである、薬剤吸収補助用組成物を提供するものである。また、上記細胞層透過促進剤を含み、生体に吸収させるべき薬剤を更に含む、医薬組成物を提供するものである。

Description

細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物
　本発明は、細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物に関する。
　上皮組織等を形成する細胞層では、隣り合う細胞同士の間隙がタイトジャンクション（TJ: Tight Junction）等の細胞接着構造によりシールされ、異物に対するバリア機能を果たしている。このため、細胞と細胞の間をすり抜ける細胞間隙経路での物質透過は、生体の恒常性維持のためには、きわめて制限的といえる。この細胞接着構造を一次的に緩和して、所望の物質を細胞間隙経路で透過させることにより、薬剤等の生体内への吸収を高めようとするドラッグデリバリーシステム（DDS: Drug Delivery System）の考え方がある（非特許文献１～５）。ペプチド、タンパク質、抗体、ワクチン、核酸など、近年開発の盛んなバイオ医薬品やその候補物質の中には低バイオアベイラビリティーのものもあり、ドラッグデリバリーシステム（DDS: Drug Delivery System）の技術は、そのような薬剤の適用可能性の範囲を広げ、また、注射投与ではなく、非侵襲的な、経口、経皮、経鼻、経肺、経粘膜などの投与方法により、患者のQuality of Lifeの向上にも繋がるので、その技術の開発が望まれている。
　一方、下記非特許文献６には、シュードモナス菌由来の抗菌性物質として、環状リポペプチドの報告がある。
Kondoh M., et al.「Tight junction modulators: promising candidates for drug delivery.」Curr Med Chem. (2007) 14(23), pp2482-2488. Gonzalez-Mariscal L., et al.「Strategies that Target Tight Junctions for Enhanced Drug Delivery.」Curr Pharm Des. (2016) 22(35), pp5313-5346. Eichner M., et al.「Targeting and alteration of tight junctions by bacteria and their virulence factors such as Clostridium perfringens enterotoxin.」Pflugers Arch. (2017) 469(1), pp77-90. 藤井良和「アンピシリン坐薬」Jpn. J. Antibiot., (1986) 39, pp1-8. 山本昌「ペプチド・タンパク性医薬品の経粘膜透過促進」薬剤学, (2014) 74 (1), pp19-26. Wen Li, et al. 「The Antimicrobial Compound Xantholysin Defines a New Group of Pseudomonas Cyclic Lipopeptides」PLoS One, (2013) 8(5), e62946.
　しかしながら、上記非特許文献６は、物質の細胞層透過を促進させる技術について、着眼するものではなかった。
　よって、本発明の目的は、物質の細胞層透過を促進させるための技術を提供することにある。
　上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意研究した結果、特定の環状リポペプチドには、物質の細胞層透過を促進する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、第１に、下記一般式（１）で表わされる化合物からなる細胞層透過促進剤を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（一般式（１）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
　Ｘは、ロイシン又はその保存的置換、より好ましくは、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ－ブチルアラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、バリン、シクロへキシルグリシン、又はシクロヘキシルアラニン、又はアラニンであり、
　ＸＸは、バリン又はその保存的置換、より好ましくは、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ－ブチルアラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ロイシン、シクロへキシルグリシン、又はシクロヘキシルアラニン、又はアラニンであり、
　Ｙは、グルタミン酸又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン酸又はアスパラギン酸、又はアラニンであり、
　Ｚは、グルタミン又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン又はアスパラギン、又はアラニンであり、
　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンであり、
　ＹＺは、セリン、スレオニン、ホモセリン、ジアミノプロパノイックアシッド、又はジアミノブチリックアシッドであり、
　Ｒ’は、ｓｅｃ－ブチル又はその保存的置換、より好ましくは、ｓｅｃ－ブチル、イソプロピル、イソペンチル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、シクロへキシル、又はシクロへキシルメチルである。）
　本発明においては、上記一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（２）で表わされる化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（一般式（２）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）
　また、本発明は、第２に、上記細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するためのものである、薬剤吸収補助用組成物を提供するものである。
　また、本発明は、第３に、上記細胞層透過促進剤を含み、生体に吸収させるべき薬剤を更に含む、医薬組成物を提供するものである。
　本発明によれば、特定の環状リポペプチドには、物質の細胞層透過を促進する作用効果があるので、これを利用して、優れた細胞層透過促進剤、薬剤吸収補助用組成物、及び医薬組成物を提供することができる。
試験例１において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。 試験例２において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。 試験例３において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。 試験例４において、モデル細胞層を用いた透過性評価試験において、分子量４０００のデキストランの透過性に与える各種環状ポリペプチの影響を評価した結果を示す図表である。
　本発明においては、下記一般式（１）で表わされる化合物を用いる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（一般式（１）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
　Ｘは、ロイシン（Ｌｅｕ）又はその保存的置換、より好ましくは、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ｔｅｒｔ－ブチルアラニン（Ａｌａ｛ｔＢｕ｝）、ｔｅｒｔ－ロイシン（ｔｅｒｔ－Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、シクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）、又はシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
　ＸＸは、バリン（Ｖａｌ）又はその保存的置換、より好ましくは、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ｔｅｒｔ－ブチルアラニン（Ａｌａ｛ｔＢｕ｝）、ｔｅｒｔ－ロイシン（ｔｅｒｔ－Ｌｅｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、シクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）、又はシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
　Ｙは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又アスパラギン酸（Ａｓｐ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
　Ｚは、グルタミン（Ｇｌｎ）又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン（Ｇｌｎ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）、又はアラニン（Ａｌａ）であり、
　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミングルタミン（Ｇｌｎ）又はアラニン（Ａｌａ）であり、
　ＹＺは、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ホモセリン、ジアミノプロパノイックアシッド、又はジアミノブチリックアシッドであり、
　Ｒ’は、ｓｅｃ－ブチル又はその保存的置換、より好ましくは、ｓｅｃ－ブチル、イソプロピル、イソペンチル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、シクロへキシルメチル、シクロへキシルである。）
　なお、一般式（１）中、Ｒ’がｓｅｃ－ブチルであるときイソロイシン（Ｉｌｅ）のαアミノ基とαカルボキシル基が隣接するアミノ酸との間でペプチド結合する構成を有することとなり、同様にイソプロピルであるときはバリン（Ｖａｌ）が、イソペンチルであるときはロイシン（Ｌｅｕ）が、ｎ－ブチルであるときはノルロイシン（Ｎｌｅ）が、ｔｅｒｔ－ブチルであるときはｔｅｒｔ－ブチルアラニン（Ａｌａ｛ｔＢｕ｝）が、シクロへキシルであるときはシクロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）が、シクロへキシルメチルであるときはシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）が、それぞれ隣接するアミノ酸との間でペプチド結合する構成を有することとなる。
　より具体的には、本発明においては、上記一般式（１）で表わされる化合物としては、下記一般式（２）で表わされる化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（一般式（２）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）
　下記には、上記一般式（２）で表わされる化合物において、
　（Ａ）ＺＺ6がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ａ）で表わし、
　（Ｂ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｂ）で表わし、
　（Ｃ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がアラニン（Ａｌａ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｃ）で表わす。
　（Ｄ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｄ）で表わす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記一般式（１）で表わされる化合物としては、そのペプチド結合のＤＬ異性体構造が特定された、下記一般式（３）で表わされる化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（一般式（３）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）
　下記には、上記一般式（３）で表わされる化合物において、
　（Ａ）ＺＺ6がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（３ａ）で表わし、
　（Ｂ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がアラニン（Ａｌａ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（３ｂ）で表わし、
　（Ｃ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がアラニン（Ａｌａ）である場合を、より詳細に化学構造式（３ｃ）で表わす。
　（Ｄ）ＺＺ6がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ10がグルタミン（Ｇｌｎ）、ＺＺ13がグルタミン（Ｇｌｎ）である場合を、より詳細に化学構造式（２ｄ）で表わす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記化合物の一般式中、Ｒは置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基として表わされるが、典型的には、そのアルキル基は任意に水酸基を有していてもよく、より典型的には置換基として１～４個の水酸基のみを有するアルキル基であってもよく、更により典型的には置換基として１～２個の水酸基のみを有するアルキル基であってもよい。また、アルキル基長としては炭素数１～６であってもよく、炭素数１～３であってもよい。更に、後述の実施例を考慮すると、Ｒとしては下記式（４）又は（５）で表わされる基であることが、より典型的である。また、下記式（４）又は（５）で表わされる基のアルキル基長は炭素数９であるが、アルキル基長としては炭素数６であってもよく、炭素数３であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　本発明に用いる上記化合物としては、上記非特許文献６に示されるように、少なくともその１種は、ある種のシュードモナス菌に含まれていることも明らかとなっており、そのような菌株、変異株、遺伝子導入株等から抽出して調製してもよく、その他の微生物等の他の生物資源から抽出して調製してもよいが、工業的に生産する観点からは、人工的に合成されたものであることがより好ましい。合成法としては、液相法、アジフェーズ法、固相法等が挙げられる。なかでも、中間体の精製を省略可能であることから固相法によって合成することがより好ましい。
　以下には、固相法の一例として、Fmoc固相合成法の具体例を述べる。ただし、以下に示す好ましい合成法の記載は、本発明の範囲が、それらの方法で得られたものに限る趣旨のものではない。
　（Fmoc固相合成法）
　Fmoc固相合成法の手順としてはまず、樹脂上の保護基であるFmoc(9-フルオレニルメトシキカルボニル)基を20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させ除去する。樹脂を洗浄後、種々の縮合剤を用い、アミノ酸を縮合する。このサイクルを繰り返すことで目的ペプチドを獲得する。縮合剤としてはカルボジイミド試薬、ジフェニルリン酸アジド、BOP試薬、HATU試薬などが用いられる。
　本発明においては、固相合成は、例えば、N末端から13番目のD-Gln残基を起点に合成を行うことができる。すなわち、樹脂上のFmoc基を20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液にて脱保護後、側鎖無保護のFmoc-D-Glu-Oallylを縮合する。脱保護と縮合を繰り返し、8番目のD-Val残基まで伸長する。伸長後、脱保護を行い、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-O-((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリンを樹脂に導入する。樹脂上で環を形成するために、パラジウム触媒を用い、アリル基、Alloc(アリルオキシカルボニル)基を除去する。除去後、樹脂上で環を形成する。以降、Fmoc-D-Glu-Oallylの場合と同様にして順次C末端側から伸長を行うことで、目的ペプチドを得ることができる。
　なお、この手法では、縮合させるアミノ酸を変更することにより様々な環状ペプチドが樹脂上で合成できる。例えば、N末端から13番目のD-Gln残基を他のアミノ酸に変更したい場合、樹脂との結合位置を13番目から10番目のD-Glnへ変更することで置換可能である。
　本発明に係る細胞層透過促進剤は、上記化合物からなる、もしくは上記化合物を用いる。すなわち、後述する実施例で示されるように、上記化合物を細胞層に作用させるとその細胞接着構造に何らかの影響を与えて、細胞間隙経路の物質の透過性が亢進する。この場合、適用対象としては、具体的には、皮膚、肺、鼻、消化管、腸管、その他粘膜組織等が挙げられ、組織の種類に特に制限はない。また、細胞同士が単層に形成した形態であろうと、多層に形成した形態であろうと、その層形状の種類にも特に制限はない。また、ヒトを対象にするばかりではなく、ペット、家畜等の動物に由来する細胞層が対象であってもよい。更に、場合によっては、必要に応じて生体外に形成させた細胞層に適用してもよい。
　一方、本発明に係る薬剤吸収補助用組成物は、上記化合物からなる細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するための組成物である。すなわち、この組成物で、適用の対象とする細胞層として、例えば、皮膚、肺、鼻、消化管、腸管、その他粘膜組織等を、生体に吸収させるべき所望の薬剤とともに処置することで、上記化合物が有効成分となって細胞間隙経路での物質等が亢進するので、その経路による所望の薬剤の生体への吸収率を向上させることができる。この場合、組成物の形態は、上記化合物を含んでいればよく、特に制限はないが、適用の対象とする細胞層の種類に応じて、適宜製剤的基材とともに当業者に知られた製剤手法により、例えば、軟膏、クリーム、ローション、乳液等の塗布剤、パッチ剤、貼付剤、エアロゾル剤、吸引剤、坐剤、トローチ剤、舌下錠剤、口腔内崩壊剤、ゼリー状剤、液剤、ソフトカプセル、ハードカプセル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤等の形態を採用し得る。組成物中の上記化合物の含有量としては、例えば０．０００１～１００質量％、より典型的には０．００１～７５質量％、更により典型的には０．０１～５０質量％、特に典型的には０．１～３０質量％、特により典型的には１～２０質量％等である。
　本発明を適用する薬剤としては、親水性、親油性、もしくは両親媒性であってもよい低分子化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、ワクチン、核酸など、特に制限されるものではないが、例えば、少なくとも分子量５００以上、より好ましくは１０００以上、更により好ましくは２０００以上の物質に適用して、その生体への吸収率を向上して、その物質の薬剤としての適用可能性の範囲を広げ、また、注射投与ではなく、非侵襲的な、経口、経皮、経鼻、経肺、経粘膜などの投与方法の開発により、患者のQuality of Lifeの向上にも繋がるので、好ましい。
　本発明による他に形態としては、上記薬剤吸収補助用組成物の形態中に、上記化合物と、生体に吸収させるべき所望の薬剤とを、その同一の形態中に含有せしめて、医薬組成物の形態と成してもよい。
　本発明に係る上記化合物の投与量としては、適用の対象とする細胞層の種類や、生体に吸収させるべき薬剤の種類によっても異なり、一概ではないが、例えば、典型的には、細胞層の表面積１ｃｍ2当りへの１回適用量として０．０１μｇ～１０ｍｇ程度であってよく、より典型的には０．１～１ｍｇ程度であってよく、更により典型的には１μｇ～０．１ｍｇ程度であってよい。また、後述する実施例で示されるように、上記化合物による細胞間隙の開口作用は、従来知られたアクチン重合阻害剤のような不可逆的なものではなく、可逆的であり、処置後には、比較的速やかに、おそらくは生体恒常性維持作用によりタイトジャンクション等の細胞接着構造の正常性が回復するので、異物に対するバリア機能を損ねることなく安全に使用することが可能である。
　以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　［調製例１］（cu538-1及びcu538-2の固相合成）
　Fmoc固相合成法により、下記に示すcu538-1及びcu538-2を合成した。なお、これらの化合物は下記に化学構造式とともに矢印で示したＯＨ基の位置に異性体が存在しラセミ体として得られ、これをＨＰＬＣにより分離精製することにより調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　具体的には、以下のとおり合成した。
　PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 300 mg (0.111 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。膨潤後、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上の保護基Fmoc(9-フルオレニルメトシキカルボニル) 基を除去した。DMFで10回洗浄し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール (HOAt, 0.333 mmol, 3 eq)、O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N, N, N', N' -テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホルファート(HATU, 0.333 mmol, 3 eq)、N, N-ジイソプロピルアミン (DIPEA, 0.333 mmol, 3 eq)存在下で、Fmoc-D-Glu-Oallyl(0.333 mmol, 3 eq)を室温で30分間DMF中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。次のアミノ酸を縮合させるために、DMFで10回洗浄し、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上の保護基Fmoc 基を除去した。以下、Fmoc-D-Glu-Oallylの場合と同様にして順次C末端からFmoc-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.333 mmol, 3 eq)を導入してペプチド鎖を伸長させた。20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上のFmoc基を除去した。DMFで10回洗浄し、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.333 mmol, 3 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.333 mmol, 3 eq)存在下で、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-O-((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリン(0.333 mmol, 3 eq)を室温で90分間DCM(ジクロロメタン)中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。導入後、DMFで5回洗浄、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂に対して、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (0.111 mmol, 1 eq)、フェニルシラン(1.11 mmol, 10 eq)存在下、室温で180分間DCM中にて反応させ、樹脂上のアリル基、Alloc(アリルオキシカルボニル)基を除去した。樹脂上で環を形成するため、DCMで5回洗浄、0.5% (w/v)　ソディウムN,N-ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート/DMF溶液で5回洗浄、DMFで5回洗浄し、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.555 mmol, 5 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.555 mmol, 5 eq)存在下、室温で90分間DMF中にて環を形成した。樹脂上のFmoc基を除去するため、DMFで10回洗浄し、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で5分間反応させることで樹脂上のFmoc 基を除去した。DMFで10回洗浄し、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.333 mmol, 3 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.333 mmol, 3 eq)存在下で、Fmoc-Gln(Trt)-OH(0.333 mmol, 3 eq)を室温中90分間DMF中にて反応させ、樹脂上にアミノ酸を導入した。次のアミノ酸を縮合させるために、DMFで10回洗浄し、20% (v/v) ピペリジン/DMF溶液中、室温で20分間反応させることで樹脂上のFmoc 基を除去した。以下、Fmoc-D-Glu-Oallylの場合と同様にして順次C末端からFmoc-D-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.333 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.333 mmol, 3 eq)、 Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(0.333 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.333 mmol, 3 eq)、(±)-3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.333 mmol, 3 eq)を導入し、DMFで5回洗浄、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。各種側鎖保護基の除去および脱樹脂のため、水(0.6 ml)存在下でトリフルオロ酢酸 (TFA) 11.4ml中にて3時間反応させた。反応液を濾過し、濾液を集め、窒素気流下でTFAを揮発させることにより留去し、ジエチルエーテルで洗浄し、デカンテーションにより溶液を除去した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、70%(v/v)アセトニトリル水溶液に溶解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(cu538-1 : 8.18 mg, 収率8%、cu538-2：7.75 mg, 収率 8%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）、及びcu538-2のＮＭＲを分析したところ、下記のデータを得た。
　（ＭＳデータ）
　cu538-1 :HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O23 [M+H]+ 1776.0886 found 1776.0884
　cu538-2 :HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O23 [M+H]+ 1776.0886 found 1776.0886
（ＮＭＲデータ）
　cu538-2 : 1H NMR (600 MHz, MeOD) : δ 4.62 (bs, 1H), 4.42-4.28 (m, 7H), 4.2 (dd, 1H, J = 3.9, 11.2 Hz), 4.16-4.11 (m, 3H), 4.08-4.03 (m, 1H), 4.00 (t, 1H, J = 6.7 Hz), 3.87 (bs, 1H), 3.78 (d, 2H, J = 9.3 Hz), 2.52-2.50 (m, 3H),2.42-2.30(m, 13H), 2.24-1.99 (m, 12H), 1.94-1.83 (m, 6H), 1.71-1.32 (m, 29H), 1.22-1.17 (m, 1H), 1.09 (d, 3H, J = 6.5 Hz), 1.04 (d, 3H, J = 6.6 Hz), 1.00-0.87 (m, 54H)
　13C NMR (150 MHz, MeOD) : 175.5, 174.8, 174.7, 174.6, 174.6, 174.3, 173.5, 173.2, 171.9, 69.8, 64.9, 64.3, 58.7, 58.6, 57.3, 57.1, 56.6, 55.7, 55.6, 54.9, 54.8, 54.6, 54.5, 54.3, 53.9, 53.8, 53.8, 44.4, 41.6, 41.5, 40.5, 40.5, 38.4, 37.4, 33.2, 33.0, 32.9, 32.7, 32.6, 31.1, 31.0, 30.7, 30.6, 30.5, 30.4, 27.7, 27.4, 27.4, 26.9, 26.6, 26.1, 26.0, 25.9, 25.8, 25.8, 25.6, 23.7, 23.7, 23.6, 23.5, 22.6, 22.5, 22.1, 21.6, 21.1, 20.9, 20.7, 19.7, 19.4, 16.2, 14.4, 11.3
　［調製例２］（NY-38の固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すNY-38を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　具体的には、以下のとおり合成した。
　PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 100 mg (0.037 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、N末端1残基目のロイシンまで伸長を行う。Fmoc基を除去後、N, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.111 mmol, 3 eq)、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾールハイドレート(HOBt・H2O, 0.111 mmol, 3 eq)存在下で、デカン酸(0.111 mmol, 3 eq)を導入し、DMFで5回洗浄後、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。各種側鎖保護基の除去および脱樹脂のため、水(0.2 ml)存在下でトリフルオロ酢酸 (TFA) 3.8 ml中にて3時間反応させた。反応液を濾過し、濾液を集め、窒素気流下でTFAを揮発させることにより留去し、ジエチルエーテルで洗浄し、デカンテーションにより溶液を除去した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、70%(v/v)アセトニトリル水溶液に溶解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(2.6 mg, 収率 4%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。
　（ＭＳデータ）
　NY-38 : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0916
　［調製例３］（cu592の固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すcu592を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　具体的には、以下のとおり合成した。
　PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 50 mg (0.0185 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、順次C末端からmoc-D-Glu-Oallyl(0.0555 mmol)Fmoc-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル) -O-((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリン(0.0555 mmol, 3 eq)を導入する。導入後、cu538-1,2と同様の手法を用い、環化反応を行う。その後、樹脂上のFmoc基を脱保護し、Fmoc-Ala-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt) -OH(0.0555 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Glu(OtBu) -OH(0.0555 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.0555 mmol, 3 eq)、(+)-3- (tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.0555 mmol, 3 eq)を導入する。cu538-1,2と同様の手法で脱樹脂後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(3.18 mg, 収率 10%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。
　（ＭＳデータ）
　cu592 :HRMS(ES+) calcd for C82H144N17O22 [M+H]+ 1719.0672 found 1719.0659
　［調製例４］（cu605の固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すcu605を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　具体的には、以下のとおり合成した。
　PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 100 mg (0.037 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、順次C末端からFmoc-D-Glu-Oallyl(0.111 mmol)、Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Ala-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、N(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル) -O- ((2R)-2-(((アリルオキシ)カルボニル)アミノ)-3-メチルペンタノイル)-D-セリン(0.111 mmol, 3 eq)を導入する。導入後、cu538-1,2と同様の手法を用い、環化反応を行う。その後、樹脂上のFmoc基を脱保護し、Fmoc-Ala-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、(+)-3- (tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.111mmol, 3 eq)を導入する。cu538-1,2と同様の手法で脱樹脂後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(1.53 mg, 収率 2%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。
　（ＭＳデータ）
　cu605 : HRMS(ES+) calcd for C82H144N17O22 [M+H]+ 1719.0672 found 1719.0677
　［調製例５］（cu619の固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すcu619を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　具体的には、以下のとおり合成した。
　PP 製濾過カラムにFmoc-NH-SAL Resin (0.37 mmol/g, 渡辺化学工業株式会社) 100 mg (0.037 mmol) を量りとり、ジメチルホルムアミド (DMF) 溶液中室温で40分間樹脂を膨潤させた。合成法はcu538-1,2と同様の手法を用い、順次C末端からFmoc-D-Glu-Oallyl(0.111 mmol)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Ser-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Val-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Gln(Trt) -OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(0.111 mmol, 3 eq)、 Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、(+)-3-(tert-ブチルジメチルシロキシ)デカン酸(0.111mmol, 3 eq)を導入し、DMFで5回洗浄後、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、減圧下で樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂に対してN, N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCI, 0.185 mmol, 5 eq)、ピリジン(0.185 mmol, 5 eq)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン(0.185 mmol, 5 eq)存在下、Fmoc-Ile-OH(0.111 mmol, 3 eq)を室温で120分間無水DMF中にて反応させる。この操作を二回行い、樹脂上にアミノ酸を導入した。イソロイシン残基のFmoc基を脱保護後、Fmoc-D-Ala-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)、Fmoc-Leu-OH(0.111 mmol, 3 eq)を導入する。導入後、DMFで5回洗浄、メタノールで5回洗浄、ジエチルエーテルで5回洗浄後、樹脂を乾燥させた。乾燥樹脂に対して、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (0.111 mmol, 1 eq)、フェニルシラン(1.11 mmol, 10 eq)存在下、室温で180分間DCM中にて反応させ、樹脂上のアリル基を除去した。樹脂上で環を形成するため、DCMで5回洗浄、0.5% (w/v)　ソディウムN,N-ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート/DMF溶液で5回洗浄、DMFで5回洗浄し、Fmoc基を脱保護後、環を形成した。cu538-1,2と同様の手法で脱樹脂後、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た(11 mg, 収率 17%)。なお、得られた化合物のＭＳ（質量）を分析したところ、下記のデータを得た。
　（ＭＳデータ）
　cu619 : HRMS(ES+) calcd for C82H143N17O22 Na [M+Na]+ 1741.0491 found 1741.0494
　［調製例６］（L-Leu1L-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すL-Leu1L-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 収率 10%
（ＭＳデータ）
　L-Leu1L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H143N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0393
　［調製例７］（D-Glu2D-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Glu2D-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 収率 8%
（ＭＳデータ）
　D-Glu2D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C82H145N18O21 [M+H]+ 1718.0832 found 1718.0809
　［調製例８］（D-Gln3D-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Gln3D-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 収率 10%
（ＭＳデータ）
　D-Gln3D-Ala : HRMS(ES+) calcd C82H144N17O22 [M+H]+ 1719.0672 found 1719.0649
　［調製例９］（D-Val4D-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Val4D-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 収率 9%
（ＭＳデータ）
　D-Val4D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C82H143N18O23 [M+H]+ 1748.0573 found 1748.0537
　［調製例１０］（D-Leu5D-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Leu5D-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 収率 9%
（ＭＳデータ）
　D-Leu5D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0397
　［調製例１１］（D-Val8D-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Val8D-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 収率 1%
（ＭＳデータ）
　D-Val8D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C82H142N18O23Na [M+Na]+ 1770.0393 found 1770.0393
　［調製例１２］（D-Leu9D-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により、下記に示すD-Leu9D-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 収率 3%
（ＭＳデータ）
　D-Leu9D-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H140N18O23Na [M+Na]+ 1756.0236 found 1756.0238
　［調製例１３］（L-Leu11L-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu11L-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 収率 5%
（ＭＳデータ）
　L-Leu11L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H143N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0393
　［調製例１４］（L-Leu12L-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu12L-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 収率 1%
（ＭＳデータ）
　L-Leu12L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H143N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0393
　［調製例１５］（L-Ile14L-Alaの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Ile14L-Alaを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 収率 26%
（ＭＳデータ）
　L-Ile14L-Ala : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O23 [M+H]+ 1734.0417 found 1734.0420
　［調製例１６］（cu632の固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すcu632を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 収率 5%
（ＭＳデータ）
　cu632 : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O22 [M+H]+ 1718.0468 found 1718.0468
　［調製例１７］（cu633の固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すcu633を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 収率 5%
（ＭＳデータ）
　cu633 : HRMS(ES+) calcd for C81H141N18O23 [M+H]+ 1675.9998 found 1676.0007
　［調製例１８］（L-Leu1D-Leuの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu1D-Leuを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 収率 12%
（ＭＳデータ）
　L-Leu1D-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0928
　［調製例１９］（D-Glu2L-Gluの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Glu2L-Gluを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 収率 16%
（ＭＳデータ）
　D-Glu2L-Glu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0923
　［調製例２０］（D-Gln3L-Glnの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Gln3L-Glnを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 収率 11%
（ＭＳデータ）
　D-Gln3L-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0920
　［調製例２１］（D-Val4L-Valの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Val4L-Valを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 収率 11%
（ＭＳデータ）
　D-Val4L-Val : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0920
　［調製例２２］（D-Leu5L-Leuの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Leu5L-Leuを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 収率 5%
（ＭＳデータ）
　D-Leu5L-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0920
　［調製例２３］（L-Gln6D-Glnの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Gln6D-Glnを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 収率 21%
（ＭＳデータ）
　L-Gln6D-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0923
　［調製例２４］（D-Val8L-Valの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Val8L-Valを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 収率 9%
（ＭＳデータ）
　D-Val8L-Val : HRMS(ES+) calcd for C84H146N18O22Na [M+Na]+ 1782.0757 found 1782.0748
　［調製例２５］（D-Leu9L-Leuの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Leu9L-Leuを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 収率 4%
（ＭＳデータ）
　D-Leu9L-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0938
　［調製例２６］（D-Gln10L-Glnの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Gln10L-Glnを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 収率 12%
（ＭＳデータ）
　D-Gln10L-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H146N18O22Na [M+Na]+ 1782.0757 found 1782.0753
［調製例２７］（L-Leu11D-Leuの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu11D-Leuを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 収率 6%
（ＭＳデータ）
　L-Leu11D-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1782.0757 found 1782.0753
　［調製例２８］（L-Leu12D-Leuの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Leu12D-Leuを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 収率 14%
（ＭＳデータ）
　L-Leu12D-Leu : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0938
　［調製例２９］（D-Gln13L-Glnの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すD-Gln13L-Glnを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 収率 7%
（ＭＳデータ）
　D-Gln13L-Gln : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0928
　［調製例３０］（L-Ile14D-Ileの固相合成）
　調製例１と同様にして、Fmoc固相合成法により下記に示すL-Ile14D-Ileを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 収率 16%
（ＭＳデータ）
　L-Ile14D-Ile : HRMS(ES+) calcd for C84H147N18O22 [M+H]+ 1760.0937 found 1760.0942
　＜試験例１＞
　イヌ腎臓上皮細胞由来のMDCK II細胞を使用して、トランスウェルを用いた上皮細胞層のモデルを作成し、物質透過性評価試験を行った。具体的には、対数増殖期のMDCK II細胞を、３．４～４．０×１０4 cellsの細胞数でトランスウェル（６．５ｍｍ径、コラーゲンコート、孔サイズ０．４μｍ）（商品名「corning transwell 3495」、コーニング社製）に播種し、基底部側ウェルとして２４穴ウェルプレートを使用して、頂端側のウェルと基底部側のウェルの各ウェルに細胞生育培地６００μＬを入れた。毎日培地交換して層形成させ、播種から３日後に培地を測定用の Hank's balanced salt solution（ＨＢＳＳ）に交換して、３７℃で１時間インキュベート後、層形成を、抵抗値測定システム（商品名「Millicell-ERS」、ミリポア社製）を使用して経上皮電気抵抗（TEER）を測定することにより確認した。その層形成の確認後、頂端側の培地を、分子量４０００のマーカー物質（ＦＤ４：蛍光標識デキストラン）（シグマ社製）を１．０w/v％の濃度となるよう添加したＨＢＳＳの１００μＬに置換し、各試験物質を下記に示す最終濃度となるよう添加した。マーカー物質の添加後５時間まで３０分間３０分間おきにトランスウェルを新しいＨＢＳＳが入った基底部側ウェルに移し、残った基底部側ウェルのＨＢＳＳ（以下「レシーバー溶液」という。）は、その５０μＬずつを９６穴ウェルプレートの１ウェルに回収した。その回収したＨＢＳＳについて、蛍光プレートリーダー（商品名「Wallac 1420 ARVO MX」、パーキンエルマー社製）を使用して、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ｎｍで蛍光強度を測定した。
　（試験物質の最終濃度）
　陰性対照：　なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
　試験群１：cu538-1         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　試験群２：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　陽性対照：Latrunclin A（LatA）　０．０００１ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　結果を図１に示す。
　図１に示されるように、陰性コントロールでは、分子量４０００のマーカー物質であるＦＤ４のレシーバー溶液への透過は限定的であった。一方、陽性コントロールとして、アクチン重合阻害剤であるLatrunclin A（LatA）を添加すると、試験開始５時間にわたり、継続的なマーカー物質のレシーバー溶液への透過量の増加・蓄積がみられた。アクチン重合阻害により、細胞接着構造を不可逆的に緩和することが知られている。
　これに対し、「cu538-1」や「NY-9」の添加により、試験開始２時間の時点で、陰性コントロールに比べてほぼ４倍、「cu538-2」の添加では、陰性コントロールに比べてほぼ８倍、レシーバー溶液への透過量が増加した。ただし、試験開始２時間以降５時間までに、レシーバー溶液への透過量の増加・蓄積がほとんどみられなかった。
　これは、「cu538-1」や「cu538-2」や「NY-38」の添加により、細胞間隙経路の物質透過の亢進が起こるものの、その効果は可逆的、すなわちタイトジャンクション等の細胞接着構造の正常性の回復が速やかで、それ以上の細胞間隙経路の物質透過量の増加・蓄積がみられなかったものと考えられた。
　＜試験例２＞
　試験物質を下記に示すように代えた以外は、試験例１と同様にして、物質透過性評価試験を行った。
　（試験物質の最終濃度）
　陰性対照：　なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
　試験群３：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　試験群４：NY-38    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　陽性対照：Latrunclin A（LatA）　０．０００１ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　結果を図２に示す。
　図２に示されるように、「NY-38」にも細胞層透過促進の効果が認められた。その効果は、試験例１において細胞層透過促進の効果が明らかにされた「cu538-2」よりも顕著であった。
　＜試験例３＞
　試験物質を下記に示すように代えた以外は、試験例１と同様にして、物質透過性評価試験を行った。
　（試験物質の最終濃度）
　陰性対照：　なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
　試験群５：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　試験群６：cu592    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　結果を図３に示す。
　図３に示されるように、試験例１において細胞層透過促進の効果が明らかにされた「cu538-2」のアラニンスキャン体である「cu592」でも、「cu538-2」と同等の効果が認められた。
　＜試験例４＞
　試験物質を下記に示すように代えた以外は、試験例１と同様にして、物質透過性評価試験を行った。
　（試験物質の最終濃度）
　陰性対照：　なし（１v/v％ＤＭＳＯのみ）
　試験群７：cu538-2         ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　試験群８：cu605    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　試験群９：cu619    ０．００３ｍＭ（１v/v％ＤＭＳＯ中）
　結果を図４に示す。
　図４に示されるように、試験例１において細胞層透過促進の効果が明らかにされた「cu538-2」のアラニンスキャン体である「cu605」や「cu619」でも効果が認められた。特に、「cu619」では、細胞層透過促進の効果が「cu538-2」よりも顕著であった。

Claims (4)

  1. 　下記一般式（１）で表わされる化合物からなる細胞層透過促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （一般式（１）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
    　Ｘは、ロイシン又はその保存的置換、より好ましくは、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ－ブチルアラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、バリン、シクロへキシルグリシン、又はシクロヘキシルアラニン、又はアラニンであり、
    　ＸＸは、バリン又はその保存的置換、より好ましくは、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ－ブチルアラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ロイシン、シクロへキシルグリシン、又はシクロヘキシルアラニン、又はアラニンであり、
    　Ｙは、グルタミン酸又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン酸又はアスパラギン酸、又はアラニンであり、
    　Ｚは、グルタミン又はその保存的置換、より好ましくは、グルタミン又はアスパラギン、又はアラニンであり、
    　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンであり、
    　ＹＺは、セリン、スレオニン、ホモセリン、ジアミノプロパノイックアシッド、又はジアミノブチリックアシッドであり、
    　Ｒ’は、ｓｅｃ－ブチル又はその保存的置換、より好ましくは、ｓｅｃ－ブチル、イソプロピル、イソペンチル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、シクロへキシル、又はシクロへキシルメチルである。）
  2. 　前記一般式（１）で表わされる化合物は、下記一般式（２）で表わされる化合物である、請求項１記載の細胞層透過促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式（２）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数１～９のアルキル基であり、
    　ＺＺは、任意のα－アミノ酸、より好ましくは、グルタミン又はアラニンである。）
  3. 　請求項１又は２に記載の細胞層透過促進剤を含み、生体への薬剤の吸収を補助するためのものである、薬剤吸収補助用組成物。
  4. 　請求項１又は２に記載の細胞層透過促進剤を含み、生体に吸収させるべき薬剤を更に含む、医薬組成物。
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