KR100755935B1

KR100755935B1 - 히스티딘 유도체 및 이를 이용한 금속 트리카보닐 착화물,이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 조영제

Info

Publication number: KR100755935B1
Application number: KR1020060085083A
Authority: KR
Inventors: 홍영돈; 최선주; 최강혁; 최옥자; 편미선; 이소영
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2006-09-05
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2007-09-06

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 히스티딘 유도체 및 이를 이용한 금속 트리카보닐 착화물, 이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 조영제에 관한 것으로, 본 발명의 히스티딘 유도체는 2개의 질소 및 산소를 포함하는 트리덴테이트 킬레이트화제로서, 방사선 핵종과의 결합력이 뛰어나고 헤테로사이클로아미노기가 생리활성물질과의 반응성이 뛰어난 기능기로 치환되어 있어 이기능성 킬레이트화제로서 사용할 수 있다. 또한, 이와 금속 트리카보닐 화합물이 결합된 금속 트리카보닐 착화물은 안정성이 뛰어나므로 조영제로서 사용할 수 있다.

<화학식 1>

(상기 화학식에서 R¹, R² 및 L은 본 명세서에서 정의한 바와 같다)

히스티딘 유도체, 금속 트리카보닐 착화물, 조영제

Description

히스티딘 유도체 및 이를 이용한 금속 트리카보닐 착화물, 이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 조영제{Histidine derivatives and metal tricarbonyl complexes thereof, preparation method thereof, and contrast mediums containing the same}

도 1은 본 발명의 일실시예에 의한 금속 트리카보닐 착화물을 HPLC로 분석한 그래프;

도 2는 본 발명의 일실시예에 의한 금속 트리카보닐 착화물을 HPLC로 분석한 그래프;

도 3은 본 발명의 일실시예에 의한 금속 트리카보닐 착화물을 HPLC로 분석한 그래프:

(a)[⁹⁹ ^mTcO₄]^-일때;

(b)[⁹⁹ ^mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺ 일때;

(c)[⁹⁹ ^mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺-착화물 일때;

도 4는 본 발명의 일실시예에 의한 금속 트리카보닐 착화물의 전기영동을 분 석한 그래프.

본 발명은 히스티딘 유도체 및 이를 이용한 금속 트리카보닐 착화물, 이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 조영제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 방사선 핵종과 결합력이 뛰어나고, 생리 활성화 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능기를 포함하고 있는 킬레이트화제인 히스티딘 유도체 및 이를 이용한 금속 트리카보닐 착화물, 이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 조영제에 관한 것이다.

방사선 영상화는 소량의 방사능 표지화합물을 체내로 주입한 후 그 분표를 검출함으로써, 특정 병리학적 질환을 찾아내거나 또는 증상 정도를 평가하는 것이다. 상기 조영제은 방사선 핵종에 킬레이트화제(chelating agent)가 결합되어 있는 것으로서, 사용되는 방사선 핵종은 검출의 효율을 최대화하고, 환자에게 흡수되는 방사선량을 최소화시킬 수 있는 요건을 만족해야 한다. 따라서 사용되는 조영제로는 물리적 반감기가 영상화 시간보다 짧은 방사선 핵종을 사용하며, 통상적으로는 99m-테크네튬(이하, ⁹⁹ ^mTc) 또는 188-레늄(이하, ¹⁸⁸Re)을 사용하고 있다.

⁹⁹ ^mTc 은 약 140 keV에서 감마 방사선을 방출하고, 6 시간의 물리적 반감기를 가지며, 몰리브덴-99/테크네튬-99m 발생기를 통해 쉽게 취득할 수 있어 조영제 제조시 사용되고 있다. 상기 ⁹⁹ ^mTc 을 포함한 전구체로서는 ⁹⁹ ^mTc과 일산화탄소(CO)가 배위 결합되어 있는 금속 트리카보닐 화합물이 공지되어 있다[Alberto R. et al., J. Am. Chem . Soc ., 1998, 120, 7987~7988; Egli A et al., J. Nucl . Med ., 1999, 40(11), 1913~1917; Alberto R et al., Radiochimica Acta ., 1997, 79, 99~103; Alberto R et al., Journal of Organometallic Chemistry, 1995, 493, 119~127; Reigys M et al., Bioorganic and medicinal chemistry letters, 1997, 7(17), 2243~2246; Alberto R. et al., K. Ortner, et al., J. Am. Chem . Soc ., 2001, 123, 3135~3136].

마찬가지로 ¹⁸⁸Re의 경우, 금속 트리카보닐 화합물인 ¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)³⁺를 물상에서 용이하게 제조할 수 있는 방법이 공지되어 있다[R. Schibli, R. Schwarzbach et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13, 750~756].

이와 같이 제조된 금속 트리카보닐 화합물인 ⁹⁹ ^mTc(CO)₃(H₂O)³⁺ 또는 ¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)³⁺는 물상에서 안정한 형태로 존재하며, 여기서 결합된 물분자는 배위 결합할 수 있는 킬레이트화제가 존재할 경우 금속 트리카보닐 착화물을 형성함으로써 조영제로 사용할 수 있다.

킬레이트화제에는 방사선 핵종과 쉽게 결합할 수 있는 전자-수용기적 특성(electron-accepting property)을 가진 카르복실기, 질소 또는 황이 포함되어 있다.

특히, 질소를 포함하는 방사성 킬레이터의 경우 방사성 동위원소와의 결합이 강하여 핵종과 안정한 결합을 형성할 수 있으며, 특히 헤테로사이클로로아민을 포함하고 있는 경우에는 방사성 동위원소 표지가 잘 되는 것으로 알려져 있다.

예를 들면, 히스티딘의 경우 강력한 킬레이트화제로서 방사성 트리카르보닐 제조시 생체내(in vivo) 및 생체외(in vitro)에서 안정성이 유지되는 것으로 알려져 있다. 상기 히스티딘처럼 트리덴테이트(tridentate) 형태의 경우 헤테로사이클로로아민 형태로 구성된 킬레이트화제가 방사선 핵종과 결합될 경우, 매우 낮은 농도에서도 원활히 표지됨을 확인할 수 있다.

그러나 질소를 함유하는 킬레이트화제가 금속 트리카보닐 화합물과 결합하여 바이덴테이트(bidentate) 금속 트리카보닐 착화물 [M(H₂O)L(CO)₃]⁺(M은 ⁹⁹ ^mTc ¹⁸⁸Re 또는 Mn, L은 바이덴테이트 리간드)이 될 경우, 상기 착화물이 생체내로 주입되면 방사선 핵종과 결합되어 있는 물분자와 혈장 단백질이 포함하고 있는 기능기 간에 치환 반응이 일어나 금속 트리카보닐 착화물과 혈장 단백질이 결합된 상태로 형성되므로 생체 내 체류 시간이 길어지는 문제가 있다. 반면, 금속 트리카보닐 착화물이 트리덴테이트 킬레이트화제와 결합할 경우, 체내에서 빠르게 배출된다[R. Schibli, R. La Bella et al., Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, 345~351].

방사선 핵종과 결합되는 킬레이트화제는 생리 활성화 물질과 쉽게 결합할 수 있도록 반응성이 뛰어난 기능기를 포함하고 있어야 한다. 즉 인체의 구성물질의 대부분을 차지하는 단백질의 구성성분인 아미노산과의 결합하여 아마이드 결합을 통한 펩티드를 쉽게 형성할 수 있어야 한다.

따라서, 방사선 핵종과 결합력이 뛰어나고, 생리 활성화 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능기를 포함하고 있는 킬레이트화제를 개발하고, 이를 금속 트리카보닐 화합물과 결합시킬 수 있는 금속 트리카보닐 착화물의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 방사선 핵종과 결합력이 뛰어나고, 생리 활성화 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능기를 포함하고 있는 킬레이트화제 및 이를 금속 트리카보닐 화합물과 결합시킬 수 있는 금속 트리카보닐 착화물을 개발하기 위하여 연구하던 중, 헤테로사이클로로아미노기가 치환된 히스티딘 유도체 킬레이트화제가 방사선 핵종과 결합력이 뛰어나고, 생리 활성 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능기를 포함하므로 조영제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 방사선 핵종과 결합력이 뛰어나고, 생리 활성 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능기를 포함하고 있는 킬레이트화제인 히스티딘 유도체를 제공하 는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 히스티딘 유도체의 금속 트리카보닐 착화물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히스티딘 유도체 및 이의 금속 트리카보닐 착화물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히스티딘 유도체 및 이의 금속 트리카보닐 착화물을 포함하는 조영제을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 방사선 핵종과 결합력이 뛰어나고, 생리 활성 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능기를 포함하고 있는 킬레이트화제로서, 하기 화학식 1로 표시되는 히스티딘 유도체를 제공한다.

상기 화학식 1에서,

R¹은 수소, 메틸기, 에틸기 또는 삼차부틸기이고;

R²는 수소, t-부톡시 카보닐기(이하, Boc), 아세틸기, 벤질기 또는 플루오레닐메톡시카보닐기(이하, Fmoc)기이고; 및

L은 그 말단이 카복실기, 아미노기, 할로겐 원자, 설퍼하이드린기 또는 하이드록시기인 분자단으로서, 구체적으로 상기 화학식 1의 L은

으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

상기 화학식 1의 L에 있어서, Y는 Cl, Br, I, N₃, NH₂, NCS, COOH 또는 SH이고, n은 1 ~ 10의 정수이고, m은 2이고, X는 H 또는 SO₃H이고, Z는 NH₂, NCS 또는 SH이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 히스티딘 유도체는 히스티딘의 2개의 질소와 산소가 금속과 배위 결합을 형성할 수 있어 금속과의 결합력이 뛰어나고, 히스티딘 말단에 생체내의 다른 분자들과 쉽게 결합할 수 있는 카복실기, 아미노기, 할로겐 원자, 하이드록시기 등을 함유하고 있어 이기능성 킬레이트화제(bifunctional chelating agent, BFCA)로서의 역할을 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 히스티딘 유도체는 알파 아미노기에 있는 질소가 치환되지 않은 상태로 되어 있어 금속과 직접 결합할 수 있으므로 금속과의 결합력이 뛰어나고, 유도체간의 이성체를 형성할 위험이 없어 조영제로 사용할 때 표지 효율이 감소되지 않는다. 또한, 카복실기에 있는 산소가 치환되지 않은 상태로 되어 있기 때문에 바이덴테이트 착화물보다는 안정한 트리덴테이트 착화물의 형성을 가능하게 함으로써 생체내에서 또는 생체외에서 착화물의 안정성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 히스티딘 유도체는 2개의 질소 및 산소를 포함하고 있는 트리덴테이트 킬레이트화제로서, 금속과의 결합력이 뛰어나므로 조영제 개발에 사용되는 금속 트리카보닐 화합물과 안정한 결합을 형성할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1로 표시되는 상기 화학식 1의 히스티딘 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

(상기 반응식에서 R¹, R² 및 L은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다)

구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법은 상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이

출발물질인 화학식 3의 히스티딘의 카복실기와 아미노기를 보호기로 보호하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 화학식 4의 화합물에 카복실기, 아미노기, 설퍼하이드린기, 하이드록시기 또는 알킬기를 포함하는 알킬레이션 반응물을 첨가하여 화학식 1의 히스티딘 유도체를 제조하는 단계(단계 2)로 이루어진다.

또한, 본 발명에 따른 히스티딘 유도체 제조방법은 상기 단계 2에서 제조된 화학식 1의 히스티딘 유도체에서 아미노기 또는 카복실기의 보호기가 탈보호된 히스티딘 유도체(1')를 제조하는 하기 반응식 2로 표시되는 단계(단계 3)를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 히스티딘 유도체의 제조방법을 상세히 설명한다.

먼저, 단계 1은 히스티딘의 카복실기와 아미노기를 보호기로 보호하는 단계이다.

상기 카복실기 보호는 출발물질인 히스티딘(3)과 알콜의 에스테르화 반응을 통하여 상기 히스티딘의 카복실기를 에스테르기로 전환시키는 것으로, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 t-부틸 에스테르로 전환시킨다. 상기 에스테르화 반응은 통상적인 방법으로 수행할 수 있는데, 상기 히스티딘과 알콜을 혼합한 후, 산 촉매 하에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 디시클로헥실카보이미드(이하, DCC),디메틸아미노피리딘(이하, DMAP) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 아미노기 보호는 출발물질인 히스티딘(3)과 무수화물(anhydride)의 아미드화 반응을 통하여 상기 히스티딘의 아미노기를 아미드기로 전환하는 것으로, 상기 아미드기는 t-부톡시카보닐 아미드기, 에톡시카보닐 아미드기, 벤질옥시카보닐 아미드기, 9-플로우레닐메톡시카보닐 아미드기 또는 p-메톡시카보닐 아미드기 등이 바람직하다.

상기 아미드화 반응은 통상적인 방법으로 수행할 수 있는데, 히스티딘(3)과 무수화물을 염기 조건하에서 반응시켜 수행한다. 바람직하게는 히스티딘(3)에 t-부톡시카르보닐 무수물(tert-butoxycarbonyl anhydride, (Boc)₂O)을 반응시켜 t-부톡시카르보닐 아미드기로 전환시킬 수 있다. 그 외에 아미노기의 보호기는 p-메톡시페닐기, 디페닐메틸기 또는 디페닐메틸렌기 등을 이용할 수 있다.

상기 단계 1에서 카복실기 보호는 하기 단계 2에서 히스티딘의 이민기와 결합하는 알킬레이션 반응물의 반응성에 따라 생략할 수 있다.

다음으로, 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 화합물(4)에 카르복실기, 아미노기, 설퍼하이드린기, 하이드록시기 또는 알킬기를 포함하는 알킬레이션 반응물을 첨가하여 화학식 1의 히스티딘 유도체를 제조하는 단계이다.

상기 알킬레이션 반응물은 카복실기, 아미노기, 할로겐 원자, 하이드록시기, 티오에스테르 또는 알킬기 등을 함유하는 할라이드(halide)이다. 상기 단계에서 반응은 상기 단계 1에서 제조된 화합물(4)에 알킬레이션 반응물을 첨가한 후, 염기 조건하에서 수행할 수 있다. 사용되는 염기로 소듐 하이드라이드(NaH), 소듐 메톡사이드, 소듐-t-부톡사이드 등을 바람직하게 사용할 수 있다.

다음으로, 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 화학식 1의 히스티딘 유도체에 서 아미노기 또는 카복실기의 보호기가 탈보호된 히스티딘 유도체(1')를 제조하는 단계이다. 이때, 바람직하게는 먼저 비누화 반응을 통하여 에스테르기를 제거한 후 트리플루오로아세트산(이하, TFA), 염산 등을 이용하여 아민을 보호하고 있는 보호기를 제거하는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 금속 트리카보닐 착화물을 제공한다.

(상기 화학식 2에서, L은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, M은 테크네튬 또는 레늄이다)

상기 화학식 2의 금속 트리카보닐 착화물은 상기 화학식 1의 히스티딘 유도체와 금속 트리카보닐 화합물이 결합된 금속 트리카보닐 착화물로서, 질소 및 산소가 금속 트리카보닐 화합물과 안정한 결합을 형성하고 있어 조영제로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 2의 금속 트리카보닐 착화물을 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 화학식 2의 착화물은 상기 화학식 1의 히스티딘 유도체에 금속 트리카보닐 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다.

상기 트리카보닐 착화물을 제조하기 위해서는 상기 아민 보호기가 제거된 히스티딘 유도체(1')를 생리 활성화 물질과 반응시킨 후, 금속 트리카보닐과 반응시켜 금속트리카보닐 화합물을 제조한다(Post-labeling Method).

또한, 상기 화학식 2의 금속 트리카보닐 착화물은 이민기의 말단에 카르복실기 또는 아미노기를 갖는 히스티딘 유도체(1)에 먼저 금속 트리카보닐과 반응시켜 금속 트리카보닐 착화물을 제조한 후 R-N=C=S 또는 생리 활성화 물질을 추가로 결합시켜 제조할 수 있다(Pre-labeling method).

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 히스티딘 유도체 또는 상기 화학식 2의 착화물을 포함하는 조영제를 제공한다.

본 발명에 의한 조영제는 상기 화학식 1의 히스티딘 유도체, 상기 화학식 2의 금속 트리카보닐 착화물 그 자체 또는 키트(kit)의 형태로 제공되어 사용될 수 있다. 상기 조영제는 히스티딘 유도체 또는 금속 트리카보닐 착화물과 함께 수성 식염 매질을 포함하고 있어 정맥내 주사를 통해 투여될 수 있다. 상기 매질에는 약제학적으로 허용되는 염, 완충액 또는 방부제와 같이 통상적으로 사용되는 약제 보조물이 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 히스티딘 유도체( N _α -t- 부톡시카보닐 -N _τ1 - 브로모알킬 -L-히스티딘 메틸에 스테르)의 제조

단계 1

질소 조건하에서 메탄올(20 ㎖)에 N_α-t-부톡시카보닐-L-히스티딘(5.00 g, 19.6 mmol)을 첨가하여 10분간 교반하여 균질 혼탁액이 되도록 한 다음, 디클로로메탄(CH₂Cl₂, 20 ㎖)에 녹인 디메틸아미노피리딘(DMAP, 2.87 g, 23.52 mmol)을 적가하였다. 5분 후, 0 ℃에서 상기 반응 혼합물에 디클로로메탄(CH₂Cl₂, 20 ㎖)에 녹인 디시클로헥실카르보이미드(DCC, 4.73 g, 23.52 mmol)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 적가 후, 상기 반응 혼합물을 상온 조건 하에서 24시간 동안 교반하고 용매를 제거하였다. 생성된 혼합 생성물을 클로로포름으로 처리한 후, 부유물을 거름 종이를 이용하여 걸러내고 잔유용액을 감압증류하여 제거하였다. 이후, 디클로로메탄/메탄올(15:1) 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 순수한 N_α-t-부톡시카보닐-L-히스티딘 메틸에스테르를 얻었다.

mp: 120℃,

NMR (CDCl₃)(δ ppm): 1.45(s, 9 H), 3.10(dd, 2 H), 3.73(s, 3H), 4.49(m, 1H), 5.73(br d, 1H, NH), 6.80(br s, 1H), 7.54(br s, 1H)

(LC/MSD M+1): 270.14 (이론치), 270.1(측정치)

단계 2

질소분위기하에서 디메틸포름아미드(이하 DMF, 10 ㎖)에 상기 단계 1에서 제조된 N_α-t-부톡시카보닐-L-히스티딘 메틸에스테르(1 g, 3.71 mmol)를 용해시킨 후, -15 ℃로 냉각시키고 교반하면서 나트륨하이드리드(NaH, 100 mg, 4.17 mmol)를 5분에 걸쳐 소량씩 첨가하여 상기 N_α-t-부톡시카보닐-L-히스티딘 메틸에스테르를 활성화시켰다. 활성화가 완료되는 시점은 더 이상 수소기체가 발생하지 않는 상태로 알 수 있으며, 활성이 완료되는 시점에 디클로로부탄(1.60 g 7.42 mmol)을 첨가한 후 혼합물의 온도를 0℃로 상승시켰다. 상기 반응물을 2시간 동안 교반한 후, 메탄올을 첨가하여 잔유 나트륨하이드리드를 제거하여 생성혼합용액을 얻었다. 얻어진 생성혼합용액은 감압증류하여 휘발성 용매와 2차 고감압증류를 하여 DMF를 제거하여 생성혼합물을 얻었다. 상기 생성혼합물은 디클로로메탄/메탄올(15:1) 혼합용 매를 이동상으로 하여 컬럼크로마토그래피를 이용하여 흰색 고체생성물(4.3 g, 80%)을 얻었다.

NMR (CDCl₃),δ(ppm): 1.42(s, 9H), 1.85(m. 4H, -CH₂-CH ₂ - CH ₂ -CH₂-), 3.05(dd, 2H), 3.38(t, 2H), 3.68(s, 3H), 3.91(t, 2H), 4.55(m, 1H), 5.96(br d, 1H, NH), 6.67(br s, 1H), 7.36(br s, 1H)

(LC/MSD M+1): 404.11(이론치) 404.1(실험치)

< 실시예 2> 히스티딘 유도체( N _α -t- 부톡시카보닐 -N _τ1 -(( 트리아즈 -1-엔-2-인-1-일)부틸)-L-히스티딘 메틸에스테르 )의 제조

질소분위기하에서 상기 실시예 1에서 제조된 N_α-t-부톡시카보닐-N_τ1-브로모알킬-L-히스티딘 메틸에스테르(300 mg, 1 eq)와 나트륨아지드(NaN₃, 58 mg, 1.2 eq)를 디메틸포름아미드(5 ㎖)에 녹인 후 24시간 동안 교반하였다. 교반된 반응생성혼합용액을 감압증류하여 용매를 제거하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출한 용액은 감압증류한 후 디클로로메탄/메탄올(15:1) 혼합용매를 이동상으로 하여 컬럼크로마토그래피를 이용하여 무색 오일을 얻었다.

NMR (CDCl₃), δ(ppm): 1.43(s, 9H), 1.54(m, 2H), 1.85(m, 2H), 3.05(dd, 2H), 3.31(t, 2H), 3.70(s, 3H), 3.92(t, 2H), 4.52(m, 1H), 5.93(br d, 1H, NH), 6.70(br s, 1H), 7.47(br s, 1H).

< 실시예 3> 히스티딘 유도체( N _α -t- 부톡시카보닐 -N _τ1 - 아민부틸 -L-히스티딘 메틸에스테르 )의 제조

테트라하이드로퓨란(THF, 5 ㎖)과 물(3 ㎖)에 상기 실시예 2에서 제조된 N_α-t-부톡시카보닐-N_τ1-브로모알킬-L-히스티딘 메틸에스테르(270 mg, 0.74 mmol)를 넣어 용해시킨 후, 트리페닐포스핀(389.25 mg, 1.48 mmol)을 소량씩 첨가하였다. 상온조건에서 24시간 동안 교반한 후 메탄올/핵산을 이용하여 메탄올 분획을 얻어 부탄올-메탄올-암모니아수(10:1.5:1) 조건에서 컬럼크로마토그래피를 이용하여 점성있는 무색의 오일을 얻었다.

NMR (CD₃OD), δ(ppm) 1.43(s, 9H), 1.53(m, 2H), 1.79(m, 2H), 3.00(dd, 2H), 3.37(t, 2H), 3.71(s, 3H), 4.01(t, 2H), 4.44(m, 1H), 6.70(br s, 1H), 7.62(br s, 1H) .

< 실시예 4> 히스티딘 유도체( 메틸 1-( 4(아세틸티오)부틸 )-N-(t- 부톡시카보닐 ) 히스 티디네이트 )의 제조

0℃에서 티오아세트산(67 ㎕, 0.89 mmol)을 0.5 M 소듐메톡사이드(NaOCH₃, 1.63 ㎖ 0.74 mmol)로 10분간 활성화시켰다. 여기에 상기 실시예 1에서 제조된 N_α-t-부톡시카보닐-N_τ1-아민부틸-L-히스티딘 메틸에스테르(300 mg, 0.742 mmol)를 첨가한 후 24시간 동안 교반하여 생성혼합용액을 얻었다. 얻어진 용액은 디클로로메탄/증류수로 분획한 후, 디클로로메탄 분획을 감압증류하였다. 증류 후 유기물은 디클로로메탄/메탄올(15:1) 혼합용매를 이동상으로 하여 컬럼크로마토그래피를 이용하여 순수한 화합물을 얻었다.

NMR (CDCl₃), δ(ppm): 1.40(s, 9H), 1.51(m, 2H), 1.78(m, 2H), 2.30(s, 3H), 2.83(t, 2H), 3.02(dd, 2H), 3.66(s, 3H), 3.86(t, 2H), 4.47(m, 1H), 5.93(br d, 1H, NH), 6.65(br s, 1H), 7.37(br s, 1H).

< 실시예 5> 히스티딘 유도체(N-(t- 부톡시카보닐 )-1-(4- 메르캅토부틸 )히스 티딘)의 제조

상온, 질소분위기하에서 상기 실시예 4에서 제조된 메틸 1-(4(아세틸티오)부틸)-N-(t-부톡시카보닐)히스티디네이트(80 mg, 0.2 mmol)를 메탄올/물(2 ㎖/3 ㎖)에 녹인 후 0.2 M의 NaOH를 첨가하고 2시간 동안 교반하여 생성혼합물을 얻었다. 상기 생성혼합물을 1 N의 HCl을 이용하여 중화시킨 후, 잔여 부유물은 종이크로마토그래피를 이용하여 제거하였다. 얻어진 생성물은 부탄올-메탄올-암모니아수(10:1.5:1) 조건에서 컬럼크로마토그래피를 이용하여 순수한 화합물을 얻었다.

NMR (D₂O), δ(ppm): 1.44(s, 9H), 1.61(m, 2H), 1.66(m, 2H), 1.97(m, 2H), 3.15(dd, 2H), 4.11(t, 2H), 4.21(m, 1H), 7.11(br s, 1H), 7.90(br s, 1H).

< 실시예 6> 히스티딘 유도체(N _α -t- 부톡시카보닐 -N _τ1 -(4-(4-(2- 메톡시페닐 )피페라진-1-일)부틸)-L-히스티딘 메틸에스테르 )의 제조

질소 조건하에서 상기 실시예 1에서 제조된 N_α-t-부톡시카보닐-N_τ1-브로모알킬-L-히스티딘 메틸에스테르(944 mg, 2.34 mmol)와 1-(2-메톡시페닐)피페라진(500 mg, 2.6 mmol)을 디메틸포름아미드(10 mmol)에 녹인 후 탄산칼륨(539 mg, 3.9 mmol)을 첨가하고 40 ℃에서 12시간 동안 교반하였다. 잔유 부유물은 거름종이를 이용하여 제거한 후 생성혼합용액을 감압증류하여 용매를 제거하였다. 생성혼합물은 디클로로메탄/메탄올(15:1) 조건에서 컬럼크로마토그래피를 이용하여 순수한 화합물을 얻었다.

NMR (CDCl₃), δ(ppm) 1.43(s, 9H), 1.53(p, 2H), 1.79(p, 2H), 2.40(t, 2H), 2.61(br s, 4H, 피페라진), 3.01(dd, 2H), 3.06(br s, 4H, 피페라진), 3.69(s, 3H), 3.85(s, 3H) 3.92(t, 2H), 4.55(m, 1H), 5.94(br d, 1H, NH), 6.67(br s, 1H), 6.87(m, 1H, 아릴) 6.94(m, 2H, 아릴), 7.01(m, 1H, 아릴) 7.37(br s, 1H)

(LC/MSD M+1): 517.31(이론치), 517.3 (실험치).

< 실시예 7> 히스티딘 유도체[N _τ1 -(4-(4-(2- 메톡시페닐 )피페라진-1-일)부틸)-L-히스티딘) 의 제조

실시예 6에서 제조된 N_α-t-부톡시카보닐-N_τ1-(4-(4-(2-메톡시페닐)피페라진-1-일)부틸)-L-히스티딘 메틸에스테르의 작용기의 보호기를 제거하기 위해, 트리플 루오로아세트산 및 디클로로메탄으로 상온에서 2시간 동안 처리한 후, 용매를 감압증류하여 제거하였다. 생성된 혼합물에 1 M의 NaOH(1 ㎖)을 첨가하고 12시간 동안 교반한 후, 0.1 M의 HCl을 이용하여 중화시켜 화합물을 얻었다. 생성물의 일부는 부탄올-메탄올-물-25% 암모니아수(1:1:1:0.1) 혼합용매를 통한 간이 크로마토그래피를 이용하여 분리하여 구조분석확인을 진행하였다.

NMR (CD₃OD), δ(ppm): 1.58(p, 2H), 1.85(p, 2H), 2.72(t, 2H), 2.79(br s, 4H, 피페라진), 3.05(dd, 2H), 3.10(br s, 4H, 피페라진), 3.33(m, 1H), 3.85(s, 3H), 4.05(t, 2H), 6.90(m, 1H, 아릴), 6.96(m, 2H, 아릴), 7.01(m, 1H, 아릴), 7.04(br s, 1H), 7.65(br s, 1H)

(LC/MSD M+1): 402.24(이론치), 402.2(실험치).

< 실시예 8> 방사성 금속 트리카르보닐 착화물의 제조

상기 실시예 5에서 제조된 화합물을 500 ㎕ 포스페이트 버퍼 용액(pH=7.4) (10^-3M)에 녹였다. 녹인 용액에 2 mCi의 [⁹⁹ ^mTc(CO)₃(H₂O)₃ ⁺]을 주입한 후, 75℃에서 30분 동안 반응시켰다. 생성된 착물은 HPLC로 분리하여 분석하였다.

HPLC 분석 방법은 다음과 같다. Waters HPLC에 μBondapak C-18 역상 컬럼(3.9 ×300 mm, 10 μm, waters)이 장착된 2개의 펌프를 이용하여 용매 0.05 M 트리에틸암모늄 포스페이트 완충용액(triethylammonium phosphate, TEAP, pH = 2.25)(이하, "용매 A"라고 함)과 메탄올(이하, "용매 B"라고 함)을 이용하여 분석하였다.

용매의 조건은 0 ~ 3 분 까지 용매 A를 100 %로 흘려보냈으며 3 ~ 9분까지 75 % 용매 A 및 25 % 용매 B로 전환후 9 ~ 20분까지는 66 % 용매 A 및 34 % 용매 B에서 100 % 용매 B로 선형 농도 구배 시스템으로 흘려보냈다. 이러한 조건에서 약 2분 동안 유지시킨 후 2분 후에는 100 % 용매 A로 전환시켰다. 이때 용매의 흐름속도는 1 ㎖/분으로 유지시켰다.

또한, 컬럼의 상태를 빠르게 평형화시키기 위하여 다음 5분 동안을 2분은 용매의 속도를 2 ㎖/분으로 다음 3분 동안은 이전의 용매 흐름속도로 유지시켰다. 상기 HPLC 분석 결과를 도 1에 나타내었다.

HPLC DATA(착화물): 17.6분

< 실시예 9> 금속 트리카보닐 착화물의 제조

상기 실시예 7에서 제조된 히스티딘 유도체(1 mmol)를 물에 녹이고, 여기에 1 당량의 테트라에틸암모늄하이드록사이드를 첨가하였다. 이후 상기 반응물에 물에 녹인 (NEt₄)₂[Re(CO)₃Br₃](80 mg, 1 mmol)을 주입하고, 50 ℃에서 3시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 생성된 착물은 HPLC로 분리하여 분석하였다.

상기 (NEt₄)₂[Re(CO)₃Br₃]은 공지의 방법으로 합성하여 사용하였다[Hawkes, M. J.; Ginsberg, A. P., inorg . Chem ., 1969, 10, 2189].

HPLC 분석 방법은 상기 실시예 8에서 실시한 방법과 동일하게 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

HPLC DATA

히스티딘 유도체 : 8.084 분

[Re(CO)₃]-히스티딘 유도체 착화물 : 18.16 분

< 실시예 10> 금속 트리카보닐 착화물의 제조

카르보닐 반응 제조시약(소듐브로노카보네이트(4.5 mg), 소듐테라보레이 트(2.5 mg), 소듐티트레이트(8.5 mg) 및 소듐카보네이트(7.15 mg))에 [⁹⁹ ^mTcO₄]^-식염수 용액을 넣어 110 ℃에서 15분간 방치하여 [⁹⁹ ^mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺를 제조한 후, 인산 완충용액(pH=7.4)에 상기 [^99mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺를 첨가하여 교반하였다. 이후, 상기 반응 용액에 상기 실시예 7에서 제조된 화합물을 75 ℃에서 30분 동안 반응시켜 목적화합물을 얻었다.

HPLC 분석 방법은 상기 실시예 8에서 실시한 방법과 동일하게 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

HPLC DATA

(a)[⁹⁹ ^mTcO₄]^-: 10.937분

(b)[⁹⁹ ^mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺ : 5.354분

(c)[⁹⁹ ^mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺-착화물 : 18.352분

도 3에 나타낸 바와 같이, ⁹⁹ ^mTc-트리카보닐 착화물은 Re-트리카보닐 착화물과 유사한 양상을 보임을 알 수 있다.

< 실험예 1> 전기영동( Electrophoresis ) 실험

포스페이트 버퍼 용액에 미리 담궈둔 거름종이(2 ㎝ × 35 ㎝)를 0.1 M 포스페이트 버퍼 용액(pH = 7.4)으로 채워진 전 영동 용기에 위치시켰다. 상기 거름 종이에 각 시료(⁹⁹ ^mTcO₄ ^-, [⁹⁹ ^mTc(H₂O)₃(CO)₃]⁺및 실시예 10의 ⁹⁹ ^mTc(CO)₃-히스티딘 유도체 착화물)를 찍고 300 V의 전압을 120분 동안 가하였다. 상기 거름종이들을 건조한 후, 각 거름종이들을 ITLC 스캐너를 사용하여 분석하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 ⁹⁹ ^mTc-착화물은 생리적인 환경하에서 전기적으로 중성이고, 또한 열역학적으로 2시간 이상 안정함을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 히스티딘 유도체는 2개의 질소 및 산소를 포함하는 트리덴테이트 킬레이트화제로서, 방사선 핵종과의 결합력이 뛰어나고 헤테로사이클로아미노기가 생리활성물질과의 반응성이 뛰어난 기능기로 치환되어 있어 이기능성 킬레이트화제로서 사용할 수 있다. 또한, 이와 금속 트리카보닐 화합물이 결합된 금속 트리카보닐 착화물은 안정성이 뛰어나므로 조영제로서 사용할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 히스티딘 유도체.

<화학식 1>

(상기 화학식 1에서,

R¹은 수소, 메틸기, 에틸기 및 삼차부틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종이고;

R²는 수소, t-부톡시 카보닐기, 아세틸기, 벤질기 및 플루오레닐메톡시카보닐기(이하, Fmoc)기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종이고;

L은 하기 구조식으로 표시된 군으로부터 선택되는 어느 1종이고:

상기 화학식 1의 L에 있어서, Y는 Cl, Br, I, N₃, NH₂, NCS, COOH 및 SH로 이루어지는 군으로부터 선택되고, n은 1 ~ 10의 정수이고, m은 2이고, X는 H 또는 SO₃H이고, Z는 NH₂, NCS 및 SH로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이다)
하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이

출발물질인 화학식 3의 히스티딘의 카복실기와 아미노기를 보호기로 보호하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 화학식 4의 화합물에 카르복실기, 아미노기, 설퍼하 이드린기, 하이드록시기 또는 알킬기를 포함하는 알킬레이션 반응물을 첨가하여 화학식 1의 히스티딘 유도체를 제조하는 단계(단계 2)를 포함하여 이루어지는 제1항의 히스티딘 유도체의 제조방법.

<반응식 1>

(상기 반응식에서 R¹, R² 및 L은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다)
제2항에 있어서, 단계 1의 카복실기 보호 반응에 사용되는 용매는 디시클로헥실카보이미드 또는 디메틸아모니피리딘인 것을 특징으로 하는 제1항의 히스티딘 유도체의 제조방법.
제2항에 있어서, 단계 1의 아미노기 보호를 위한 보호기는 t-부톡시카보닐 아미드기, 에톡시카보닐 아미드기, 벤질옥시카보닐 아미드기, 9-플로우레닐메톡시카보닐 아미드기, p-메톡시카보닐 아미드기, p-메톡시페닐기, 디페닐메틸기 및 디페닐메틸렌기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제1항의 히스티딘 유도체의 제조방법.
제2항에 있어서, 단계 2의 알킬레이션 반응물은 카복실기, 아미노기, 할로겐 원자, 하이드록시기, 티오에스테르 및 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 함유하는 할라이드인 것을 특징으로 하는 제1항의 히스티딘 유도체의 제조방법.
제2항에 있어서, 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 상기 단계 2에서 제조된 화학식 1의 히스티딘 유도체에서 아미노기 또는 카복실기의 보호기가 탈보호된 히스티딘 유도체(1')를 제조하는 단계(단계 3)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 히스티딘 유도체의 제조방법.

<반응식 2>

(상기 반응식에서 R¹, R² 및 L은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다)
하기 화학식 2로 표시되는 금속 트리카보닐 착화물.

<화학식 2>

(상기 화학식 2에서, L은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, M은 테크네튬 또는 레늄이다)
제1항의 히스티딘 유도체에 금속 트리카보닐 화합물을 반응시켜 제7항의 금속 트리카보닐 착화물을 제조하는 방법.
제7항의 금속 트리카보닐 착화물을 포함하는 조영제.