JPH08501070A

JPH08501070A - 抗生物クリプトジンペプチド及びその使用方法

Info

Publication number: JPH08501070A
Application number: JP6500852A
Authority: JP
Inventors: イー．セレステッド、マイケル; ジェイ．ウレット、アンドレ; アイ．ミラー、サミュエル
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1992-05-26
Filing date: 1993-05-26
Publication date: 1996-02-06
Also published as: DE69329337T2; ES2152253T3; CA2136103C; EP0642348B1; DE69329337D1; ATE195954T1; EP0642348A4; EP0642348A1; AU4402593A; WO1993024139A1; CA2136103A1; AU678362B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、陽イオン電荷を有すること、長さが３０〜４０のアミノ酸であること、小腸の上皮細胞において天然に見出されること、腸病原体に対する特異的な抗微生物活性を示すこと、並びに次の共通配列を有することを特徴とする実質的に精製されたクリプトジンペプチドを提供する：Ｘ１−Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｒ−Ｘ３−Ｃ−Ｘ４−Ｅ−Ｘ５−Ｇ−Ｘ６−Ｃ−Ｘ７−Ｃ−Ｃ−Ｘ８、ここでＸ１は３〜６アミノ酸；Ｘ２は１アミノ酸；Ｘ３は２又は３アミノ酸；Ｘ４は３アミノ酸；Ｘ５は３アミノ酸，Ｘ６は１アミノ酸，Ｘ７は６〜１０アミノ酸；Ｘ８は０〜７アミノ酸である。好ましい具体例では、マウスクリプトジン−１（配列番号９）、マウスクリプトジン−２（配列番号１０）、マウスクリプトジン−３（配列番号１１）、マウスリプトジン−４（配列番号１２）、マウスクリプトジン−５（配列番号１３）及びラットクリプトジン−１（配列番号１４）として説明されている。本発明は、患者における炎症性病因を検出する方法も提供され、更に、生理学的に許容可能な媒体中のクリプトジンペプチドを投与することによって、感染過程を治療する方法も提供する．

Description

【発明の詳細な説明】抗生物クリプトジンペプチド及びその使用方法本発明は、国立衛生研究所から授与された登録番号ＡＩ−22931 号の下で政府の支持を得て行われた。合衆国政府が本発明についての一定の権利を有する。発明の背景本発明は，抗微生物ペプチドに関し、特にクリプトジン(cryptdin)ペプチド及びその使用に関する。微生物と称される世界の生き残りは、宿主防御機構のネットワークに依存している。このような機構の中に貧食作用(phagocytosis)があり、これは、血液系中で循環している細胞が潜在的に傷害性の微生物を摂取し消化する。病原性微生物がかなり変化し得るが、貧食細胞は、細胞質内の液胞中にそれらを分離することによって、そのかなり大部分を破壊することができる。恐らく、貧食細胞の最も顕著な超構造特性は、その数千の細胞質顆粒であり、これは、普通、直径約０．３μｍの膜結合オルガネラである。貧食作用の間は、これらの顆粒の幾つかが融合して貧食小胞となって、顆粒の内容物を小胞の内腔へ進入可能にする。初期の観察では、この顆粒が、微生物の消化において食胞内死滅に寄与する因子を含むと正しく推測された。これらの顆粒は、所謂ディフェンシン(defensins)のような種々のペプチドを含む抗生物分子の混合物を含む。ディフェンシンは、脊椎動物の好中球及びマクロファージ顆粒における豊富な抗微生物ペプチド成分である。ディフェンシンファミリーのメンバーは、ヒト、ウサギ、モルモット及びラットの貧食細胞、貧食性顆粒球と称される初期のこのような貧食細胞において、既に同定されている。ディフェンシンは、陽イオン性ペプチドであり、一般には、３〜４ｋＤの大きさであり、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、多くのカビ並びに幾つかのエンベロープウィルスに対する広域の抗微生物活性を示す。このペプチドは、独特なジスルフィド部分を構成する６つの不変システイン残基を含む８つの不変アミノ酸によって特徴付けられる。３つのジスルフィドは、主としてβシートから成る三次構造を安定化する。高次構造であり、らせんを有しないことは、既知の抗微生物ペプチドの中でディフェンシンを独特なものにしている。ディフェンシンは、イオンチャンネルの形成を伴い得る機構によって、標的微生物の形質膜を透過性化して抗細菌作用を示すようである。最近までに、ディフェンシンは、ミエロイド起源の循環性又は組織貧食細胞からのみ同定されていた。しかし、同様のペプチドが特定のｍＲＮＡの存在に基づいて小腸の上皮細胞に存在し得ると推測されている。全身性循環に対する予防アクセスにおいて小腸は重要であるので、上皮性の細胞内部又は腸内腔の小腸において有効である活性を有するペプチドは、重要な治療的又は予防的な機構を提供することができる。本発明は、このようなペプチドを提供し、このような治療を可能にし、更に同様の更なる利益をもたらす。発明の概要本発明は、下記のような共通アミノ酸配列を有する実質的に精製されたクリプトジンペプチドを提供する。Ｘ₁-Ｃ-Ｘ₂-Ｃ-Ｒ-Ｘ₃-Ｃ-Ｘ₄-Ｅ-Ｘ₅-Ｇ-Ｘ₆-Ｃ-Ｘ₇-Ｃ-Ｃ-Ｘ₈ ここでＸ₁ は３〜６のアミノ酸であり、好ましくはＬＲＤＬＶ（配列番号１）、ＬＳＫＫＬＩ（配列番号２）、ＧＬＬ又はＬＫＱから選択される；Ｘ₂ は１のアミノ酸、好ましくはＹ又はＨであり；Ｘ₃ は２又は３のアミノ酸、好ましくはＫＦ、ＫＧＨ又は＊ＲＧであり、ここで＊はＳ、Ｔ、Ｋ又はＩであり；Ｘ₄ は３のアミノ酸、好ましくはＫＧＲ、ＲＰＹ又はＫＲ＊であり、ここで＊はＲ又はＧであり；Ｘ₅ は３のアミノ酸、好ましくはＲＭＮ、ＫＡＥ又はＲＶ＊であり、ここで＊はＲ又はＦであり；Ｘ₆ は１のアミノ酸、好ましくはＴ又はＳであり；Ｘ₇は６〜１０のアミノ酸、好ましくはＧＩＲＦＬＹ（配列番号４）、ＲＮＬＦＬＴＦＶＦ（配列番号４）、ＲＰＧＬＦＩＫＲＫＩ（配列番号５）又はＲＫＧＨＬ＊ＹＴＬ（配列番号６）であり、ここで＊はＬ又はＭであり；Ｘ₈ は０〜７のアミノ酸、好ましくはＲ、ＰＲ又はＩＱＱＷＴＰＧ（配列番号７）である。或いは、本発明は、下記の共通アミノ酸配列を有する実質的に精製されたクリプトジンを提供する。Ｘ₁-Ｌ-Ｘ₂-Ｃ-Ｙ-Ｃ-Ｒ-Ｘ₃-Ｃ-Ｋ-Ｘ₄-Ｅ-Ｒ-Ｘ₅-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｘ₆- Ｃ-Ｃ-Ｘ₇ ここでＸ₁ は１〜４のアミノ酸であり、好ましくはＬＲＤ、ＬＳＫＫ（配列番号８）又はＧから選択される；Ｘ₂ は１のアミノ酸、好ましくはＶ、Ｌ又はＩであり；Ｘ₃ は３のアミノ酸、ＫＧＨ又は＊ＲＧであり、ここで＊はＳ、Ｔ、Ｋ又はＩであり；Ｘ₄ は２のアミノ酸であり、好ましくはＧＲ、ＲＲ又はＲＧから成る群より選択される；Ｘ₅ は２のアミノ酸であり、好ましくはＭＮ、ＶＲ又はＶＦから選択される；Ｘ₆ は６〜９のアミノ酸、好ましくはＧＩＲＦＬＹ又はＲＮＬＦＬＴＦＶＦ又はＲＫＧＨＬ＊ＹＴＬであり、ここで＊はＬ又はＭであり；Ｘ₇ は０〜７のアミノ酸、好ましくはＲを含む。特定の具体例では、クリプトジンは、下記の配列から成る群より選択されるアミノ酸を有する。他の具体例では、本発明は第１のシステインのＮ末端までのアミノ酸を欠損したクリプトジン類似物を提供する。クリプトジンは、小腸の上皮細胞において天然に見出されること、陽イオン性であること、長さが３０〜４０のアミノ酸であること、第１のシステイン残基のＮ末端まで３〜６のアミノ酸があること、腸病原体に対して特異的な抗微生物活性を示すこと並びに、宿主生物の細胞に対して比較的、非毒性であることによって普通、特徴付けられる。しかし、これらの構造及び機能的な特徴において変異性であり得る。本発明は、被験者からの生物学的試料中のクリプトジンの量を測定し、この量を正常被験者における平均量と比較することによる被験者における炎症性病因を検出する方法を提供し、ここで、正常レベルによる顕著な偏差は炎症性病因を示す。このような顕著な偏差は、恐らく平均の上下１．０〜２．０の標準偏差、好ましくは１．５標準偏差である。このような診断方法は、炎症性大腸疾患、膵臓炎、悪性疾患、感染又は回腸炎の存在を決定するために使用することができる。更に、本発明は、生理的に許容可能な媒体中のクリプトジンを投与することによって、患者の小腸又は他の器官の感染過程を治療する方法を提供する。このような治療は、特に例えば、栄養失調、放射線熱傷、免疫抑制感染、自己免疫疾患、新生児状態、骨髄移植又は化学治療による免疫無防備状態の患者において有用である。クリプトジンを、経口、経鼻気管内挿入、経腹部カテーテル、静脈注入又はエアロゾル吸入によって投与することができる。経口投与の際には、好ましくは、小腸において放出されるように設計された遅延型放出配合物である。クリプトジンは、生理的に許容可能な媒体中で投与され、１以上のクリプトジンを同時に又は連続的に投与することができる。図面の簡単な説明図１は、マウスクリプトジン−１〜５及びラットクリプトジン−１の共通配列を提供する。アミノ酸残基は１文字表記で示されている。ダッシュライン（−）は、この共通配列を維持するためにマウスクリプトジン−４及びラットクリプトジン−１に含まれており、これらのペプチドは他のクリプトジンよりも短い。該腸クリプトジンペプチド中の不変残基はボックスで囲まれている。ジスルフィド結合部分は二重線で繋げて表示されている。図２は、腸クリプトジンの精製をクロマトグラム表示で示している。空腸及び回腸の酸抽出物を３０％酢酸中でＰ−６０カラムにおけるクロマトグラフにかけた。ブラケット（パネルＡ）で表示された分画を集めて、Ｐ６０カラムで再度クロマトグラフにかけた（パネルＢ）。クリプトジン含有フラクション（ブラケット、パネルＢ９を、集めて０．４６×２５ｃｍのバイダック(Vydac)Ｃ−１８カラム上でＲＰ−ＨＰＬＣにより更に精製した。改質剤として０．１３％(vol/vol )ＨＦＢＡを用いた水−アセトニトリル濃度勾配溶出（--）を用いてクリプトジン −１〜５を精製した。パネルＣのバケットは、各ピークに含まれるペプチドを示し、この各々の部分を２回目のＲＰ−ＨＰＬＣに付した。図３は、精製された腸クリプトジンの酸−尿素ＰＡＧＥを示している。Ｐ−６０ゲル濾過により得て（図２、［パネルＢ］）、精製された低分子量の腸ペプチドの試料を、１２．５％の酸−尿素ゲル上で電気泳動して、ホルマリン含有クマジーブルーで染色した。レーンＡ：約２０μｇのＰ−６０低分子量ペプチド分画；レーンＢ−Ｆ：１μｇの各々クリプトジン１−５。図４は、マウスクリプトジン１−５と部分精製された内腔ペプチドとを比較している。（Ａ）１２匹のマウスからの、小腸の凍結乾燥された内腔洗浄物をＰ −６０ゲル濾過によって分画化して、同様に調製した大腸組織（２０μｇ；レーン１）の試料と共に、酸−尿素アクリルアミドゲル（２０μｇ；レーン２）で電気泳動した。クリプトジン１〜５の位置は表示されている。（Ｂ）部分精製された内腔ペプチド（２０μｇ；レーン２と同様の物質）を、過ギ酸で処理済の同一試料と共に（レーン４）、第２の酸−尿素ゲルで電気泳動した（レーン３）。レーン４では、すぐに移動したが、システイン（シスチン）含有ペプチドは、システイン（シスチン）からシステイン酸残基への転化による増大されたネット負電荷のために存在しない。図５は、小腸上皮細胞のマウスクリプトジン１−５の同定を示している。全小腸（ｗ）又は上皮細胞シート（Ｅ）である腸の酸抽出物を、凍結乾燥して、試料液に溶解し、１２．５％の酸−尿素アクリルアミドゲルに再溶解させた。クリプトジン１−５は、数値的には同一である。図６は、小腸におけるクリプトジン−１の免疫組織化学的な局在を示している。成体マウス空腸の十分な厚みの切片を、前免疫（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は抗クリプトジン−ＣウサギＩｇＧ（Ｂ、Ｄ、Ｆ）と共にインキュベートして、ペルオキシダーゼ、抗ペルオキシダーゼを用いて現像した：二次抗体倍率：Ａ及びＢは４０×；Ｃ及びＤは２５０×；Ｅ及びＦは６４０× 図７は、マウスクリプトジン−１の抗微生物活性を示している。ウサギＮＰ− １又は精製された天然マウスクリプトジン−１の試料を、０．０１％の酢酸に溶解して、１×10⁶ の対数期の細菌細胞を含む０．６％アガロース／０．３％トリプトンプレートに設けられたウェルへピペット投入された。３７℃１８時間のインキュベーション後、抗微生物活性を、透明帯（クリアゾーン）の直径を測定することによって評価した。黒丸は野性型のS.typhimurium ；白丸は、ｐｈｏＰ変異体を表している。本発明の詳細な説明本発明は、小ペプチド分子を提供し、これはクリプトジンと称され、特に腸内病原体に対する広域の抗微生物活性を示し、このため、有用な抗微生物剤である。クリプトジンは小腸から単離され、腸の上皮管壁内部及び内腔内部の両方に作用する。炎症過程の指標のために、クリプトジンの存在を広範囲の炎症状態の診断に利用することができる。本文において用いる場合、“クリプトジン”又は“腸ディフェンシン”は、一般に約３０〜４０のアミノ酸を有し、６のシステイン残基を含有する共通配列を含むペプチドを言う。例示配列は図１に示されており、ここには不変性残基及びジスルフィド結合部分も示されている。更に、好ましくは不変性であるこれらの残基は同一である。クリプトジンは、その陽イオン電荷及びその広域の抗微生物活性によって更に特徴付けられる。白血球由来ディフェンシンに関連する一方で、クリプトジンは、第１のシステイン分子のＮ末端の３〜６のアミノ酸の存在によって他の分子と区別される。クリプトジンは、その上、Ｃ末端へも延びている。更に、腸障壁が破られた場合に血液由来の病原体となってしまう腸内微生物に対して作用する。更に、クリプトジンは、これを生成する細胞から産生され、白血球由来ディフェンシンと異なり、哺乳細胞に対して毒性ではない。種々の改変をクリプトジンアミノ酸配列に対して、このペプチドの抗微生物活性を減縮することなく、行うことができることは、理解されるべきである。アミノ酸の付加、欠損又は置換を含むこのような改変を示すペプチドは、本発明の範囲内にある。本明細書及び請求の範囲において、ペプチド又はタンパク質の修飾語としての “実質的に精製（純性）”という語句の使用は、このように呼ばれるペプチド又はタンパク質が、in xivo 細胞性環境から分離されていることを意味している。分離及び精製の結果、実質的に純性のペプチド及びタンパク質は、分離されていない非純性のペプチド又はタンパク質では有用でない場合でも有用である。本発明のクリプトジンペプチドは、好ましくは約３０〜４０のアミノ酸である。これらを当該技術分野の既知の方法によって合成することができ、例えば、自動ペプチド合成機の使用を通して、又はペプチド合成の既知の手動方法によって合成することができる。更に、天然の供給源例えば、脊椎動物、好ましくは哺乳類動物の起源の小腸上皮細胞から精製することができる。このような上皮細胞を、例えばラット、マウス又はヒトから、当業者に既知の方法によって得ることができる。例えば、腸上皮細胞を下層基底膜から分離して、その後、遠心分離によって濃縮し、酸で抽出した。酸抽出物を、凍結乾燥することができるが、その後、酸例えば酢酸に溶解して攪拌し、遠心分離した。上清を濃縮して、Ｐ−６０カラムでのクロマトグラフにかけて、３０％の酢酸で溶出した。分画を集めて各試料を凍結乾燥し、尿素を含有する酢酸に再溶解して、アクリルアミドゲルに電気泳動した。タンパク質バンドは、クマジーブルーを用いて可視化した。クリプトジンを含有する分画を酸−尿素ＰＡＧＥ上の迅速な移動によって、また約４ｋＤｄの見かけの分子量によって同定した。これらの分画を再度クロマトグラフにかけて、最終的にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することができる。アミノ酸配列は、当業者に既知の方法例えば、自動配列決定（シークエンサー）システムを使用して、決定することができる。抗クリプトジン抗体は、当該技術分野において慣用の方法によって作製することができる。例えは、ポリクローナル抗血清を適当な動物例えばウサギ、マウス又はラットから得ることができる。クリプトジンペプチドは、合成のものでも天然供給源から得てもよく、これを該動物の免疫に用いることができる。好ましくは、類似体、例えば、図１においてマウスクリプトジン−１の４〜３５残基に一致するクリプトジン−Ｃと呼ばれるものを免疫源として用いる。その後、クリプトジン免疫源を、当業者の既知の方法によって、動物を免疫化するために用いることができる。血清試料を抗クリプトジン力価が適当になるまで集める。ＩｇＧのような抗血清の種々の分画を、当業の技術分野において既知である方法によって分離することができる。或いはクリプトジン免疫源を用いて、これもまた当該技術分野において既知の方法によってモノクローナル抗体を得ることができる。例えば、ハロウ(Harlow)及びレーン(Lane)、Antibodies: A Laboratory Manual, （コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1988）を参照のこと。クリプトジンの抗微生物又は抗細菌活性を、種々の病原体に対して測定することができる。微生物は、適当な濃度で成育させ、適当な培地例えばアガロース− トリプチカーゼソイ培地に混合して、クリプトジンの溶液に接触させる。適当なインキュベーション期間の後、抗微生物活性を抗細菌試料を包囲する透明帯により明らかとなる。透明帯は濃度依存的である。抗クリプトジン抗体を、生物学的試料例えば組織試料におけるクリプトジンの存在を決定するために用いることができる。例えば、小腸の切片を当業者に既知の方法によって固定し、抗クリプトジン抗体例えば血清のＩｇＧ分画と共にインキュベートする。その後、適当な検出可能な二次抗体を用いて、例えは可視化により同定することができ、一次抗体はクリプトジンに付着している。検出方法には、放射性プロテインＡ又は酵素基質例えばペルオキシダーゼの使用が含まれる。生物学的試料、例えば細胞又は組織の破壊によって得た物質中での測定のような、トリプトジンの存在を測定する他の方法は、炎症過程の存在を測定することに有用である。炎症過程の存在では、クリプトジンの濃度は正常細胞において認められるよりも、かなり変化している。特に、１〜２の標準偏差の平均水準からの偏差は、炎症過程の指標となる。このような炎症過程には、例えば、炎症性大腸疾患、膵臓炎、悪性疾患、感染又は回腸炎が含まれる。その広域の抗微生物活性及びその腸上皮細胞及び／又は内腔内での作用能のために、クリプトジンは腸の感染に対する効力のある治療剤である。特に、クリプトジンは、被験者が、例えば、悪性疾患、栄養失調、化学療法、放射線熱傷、免疫抑制ウィルス、自己免疫疾患又は新生児状態にあるような免疫無防備状態である状況に有用である。更に、クリプトジンは、例えば、小腸を滅菌化するように機能することによって、外科的予防法においても有用である。クリプトジンは、天然供給源からの精製物でも合成物でも、経口投与、好ましくは、胃の内部で放出することを妨げるような遅延放出型配合物を含む種々の方法によって、このような治療を必要とする被験者に投与され得る。或いは、クリプトジンは、経鼻気管内挿入、経腹部カテーテル、静脈注入又はエアロゾル投与によって投与することができる。各種のクリプトジンを、単独で投与することができ、又は組み合わせ物を同時に若しくは連続的に投与することができる。クリプトジンの投与は必要に応じて繰り返される。マウス小腸ディフェンシンｃＤＮＡの特徴付けの前に、ディフェンシンの発現はプロフェッショナルな貧食細胞、即ち好中球及びマクロファージに限定されると考えた。パネートにおける高レベルのクリプトジンｍＲＮＡの存在は、小腸上皮細胞で合成されたディフェンシンが小腸において抗微生物障壁機能に寄与しているかもしれないという仮説を引き出した（ウレット(Ouellette)ら、J.Cell Bi ol.,108:1687-1695(1989a)）。５つのマウスクリプトジンペプチド及び１つのラットクリプトジンペプチドの単離及び特徴付け並びに、最も有効なマウスペプチド、マウスクリプトジン−１の抗細菌活性の証明は、小腸におけるディフェンシンの抗微生物的な役割に対して、更なる証拠を提供する。ペネート細胞に対するクリプトジンの免疫組織化学的な局在は、以前のin situ ハイブリダイゼーション解析と一致し、これは、これらの細胞により生成されるディフェンシンが、細菌による小腸のコロニー形成及び侵入を拘束することに寄与し得ることを示唆している。小腸ディフェンシンを精製するための最初の試みは、マウスクリプトジンの単離にあり、このペプチドはクリプトジンｃＤＮＡ配列から予想されていた。推測されたペプチドがかなり陽イオン性であるので、小腸ペプチドを３０％ギ酸中に無傷のマウス空腸及び回腸をホモジナイズすることによって安定化した。粗抽出物の酸−尿素ＰＡＧＥでは、ウサギのディフェンシンＮＰ−１及び、クリプトジン−１の４〜３５残基に相当する折り畳まれた合成ディフェンシンであるクリプトジンＣと同様なＲ_f 値を有する幾つかのバンドを示した。これらのバンドに一致するペプチドを、Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−６０上の連続ゲル濾過クロマトグラフ_ィによって、約２００倍に精製した（図２、上段及び中段パネル）。酸−尿素ゲルにおけるＰ−６０カラム分画試料の電気泳動は、２つの隆起したピーク（図２Ａ及び２Ｂ、ブラケット）の間に溶出した５の分画が、推測されたクリプトジンペプチドを含むことを示した（図３、レーンａ）。これらのＰ−６０分画のペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ディフェンシンの分子量と一致する約４ｋＤａｌのＭ_rｓで移動した（データ示さず）。更に、過ギ酸によるＰ−６０分画試料の処理は、酸−尿素ゲルにおける５つの推測マウスクリプトジンの電気泳動移動性を低下させ、この挙動は、複数のシステイン残基を含むディフェンシン及びポリペプチドの特徴である。Ｐ−６０分画に集められたディフェンシンを、異なるイオン対作用剤を用いた連続的なラウンドのＲＰ−ＨＰＬＣを用いて更に精製した。最初ＨＰＬＣ分画には、０．１３％のヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）をイオン対作用剤として含む水−アセトニトリル濃度勾配を用いて、集められたＰ−６０分画に含まれる５つのペプチド各々を１回のランで殆ど純性になるまで再溶解した（図２、下段パネル）。５つのペプチド、マウスクリプトジン１〜５の完全な精製は、その後の０．１％トリフルオロ酢酸を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって達成された（図３、レーンＢ〜Ｆ）。個々のペプチドの想定された抽出物は、酸−尿素ゲル電気泳動と予想クリプトジンを含むＰ−６０分画のＲＰ−ＨＰＬＣとの両方で等しく有効であり、これは該ペプチドの相対的な有効性はクリプトジン−１＞クリプトジン− ２＞クリプトジン−５＞クリプトジン−３＞クリトジン−４であることを示している。クリプトジン１〜５の相対量は、マウス小腸からの酸抽出物タンパク質の各調製物に定量的に寄与していた。クリプトジン１〜５の生化学的特性は、これらのペプチドがディフェンシンであることを証明した。各ペプチドのアミノ酸解析は、これらの成分がディフェンシン様分子：６の半システインを含む３０〜３５残基の陽イオンペプチドと互換性があった。マウスクリプトジン１〜５の完全配列は、カルボキシル末端キモトリプトペプチドの自動分解及びアミノ酸解析によって決定される。マウス小腸由来の５つの腸ディフェンシン及びラット腸由来のクリプトジンの一次構造には、ヒト、ウサギ、ラット及びモルモットの好中球ディフェンシンに特徴的な構造的形態が含まれ（レーラー(Lehrer)ら、Cell 64:229-230(1991a)、これは即ち、ミエロイドディフェンシンにかなり保存されている６の不変システイン残基並びに、グリシン及びグルタミン酸の位置である。マウスクリプトジン１〜５及びラットクリプトジン−１には、独特でミエロイド起源のディフェンシンと区別される特徴が含まれる。マウスクリプトジン−１、２及び３は殆ど同一であり、図１に示されるように１０番目（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＬｙｓ）、１５番目（Ｇｌｙ又はＡｒｇ）又は２９番目（Ｌｅｕ又はＭｅｔ）のみの配列が異なる。これらのアミノ酸の相違が起こるコドンの解析は、クリプトジン−１及び３の各々のＳｅｒ¹⁰からＬｙｓ¹⁰への転化が２つのヌクレオチド置換に要求されることが示される。一方、クリプトジン−２における単一のヌクレオチドの変更がクリプトジン−１及び３の両方で起こり得、これはクリプトジン−２遺伝子がクリプトジン−１及びクリプトジン−３の中間体又は先祖であり得ることを示唆している。既知のミエロイドディフェンシンの構造との相同性によって、クリプトジン− １のＮ末端が、Ｌｅｕ⁴ 又はＶａｌ⁵ 、第１の保存システインより前にあると予想されている。しかし、ミエロイドディフェンシンと比較して、腸ディフェンシンは、第１のシステインより前に、３（マウスクリプトジン−４及びラットクリプトジン−１）〜６（マウスクリプトジン−５）のアミノ酸を含む多様な延長されたＮ末端を有する。マウスクリプトジン１〜３及び５では、Ｎペプチド延長は、疎水性側鎖を有するアミノ酸によって折り畳まれた２つの帯電した内部の残基から成る。ディフェンンアミノ末端における天然の多様性が、in vitro で比較的抗微生物能を伴うことが示されている（ガンツ(Ganz)ら、J.Clin.lnvast.76:1 427-1435(1985)）ので、腸ディフェンシンの延長されたＮ末端は、腸において独特の役割を展開しているかもしれない。クリプトジン−４は最も陰極性であり、明らかに有効性が低い腸ディフェンシンであり、第４及び第５のシステイン残基の間の鎖長の変更を含むことが見出された最初のディフェンシンである。９のアミノ酸が第４及び第５のシステインを分けている（レーナーら、前述、1991a）主な既知のディフェンシンとは異なり、マウスクリプトジン−４は２つの同じアミノ酸の間に６残基のみを含む（図１）。更にラットクリプトジン−１は、第４及び第５のシステインの間に１０アミノ酸残基を含む。これらの発見は、ペプチド鎖のこの延びに関連するディフェンシンの折り曲がりが、ヒト及びウサギの好中球ディフェンシンの結晶及びＮＭＲ構造各々によって規定された不変ループサイズと比較して、ループのサイズにおける有意な変異性を与えることができることを示している。また、ラットクリプトジン−１は、第２及び第３のシステイン残基の間に、４つではなく、３つのアミノ酸残基を含む唯一のクリプトジンである。クリプトジンｍＲＮＡレベルがマウス小腸の生後の発達の過程で増加する（ウレットら、前述、1989a）ので、腸ディフェンシンの蓄積が同様に調節されるか否かが研究された。オス及びメスのマウスからの腸酸抽出物の解析は、マウスクリプトジン１〜３及び５が性に関係なく成体マウスにおいて存在することを示した。一方、９日齢のマウスからの抽出物はこのペプチドを欠き、これはクリプトジンｍＲＮＡの生後の蓄積と矛盾しない。マウスクリプトジン１〜５は腸上皮細胞から誘導される。ＥＤＴＡの存在下において、腸上皮細胞は下層基底膜に最早接着することはなく、穏やかな攪拌で固有層なく浮遊する（ビエルクネス(Bjerknes)及びチェン(Cheng)、Am.J.Anat.160 :51-63 (1981)）。このように単離した上皮細胞シートの調製物は、低速遠心分離によって濃縮し、３０％ギ酸で抽出した。単離上皮細胞シートから抽出されたペプチドは、酸−尿素ＰＡＧＥ（図５）によって解析したときに、クリプトジン１〜５と共に移動し、これは上皮細胞起源であることを証明している。抗クリプトジン抗体を用いた小腸の十分な厚みの切片の免疫ペルオキシダーゼ染色は、ペネート細胞におけるクリプトジン抗原を証明し、これはin situ ハイブリダイゼーションによるクリプトジンｍＲＮＡの局在と一致する（ウレットら、前述、(1989a)）。合成同種クリプトジン−Ｃで免疫したウサギによって生成されたポリクローナル抗クリプトジンＩｇＧと共にした成体マウス空腸及び回腸の切片のインキュベーションは、免疫ペルオキシダーゼ反応を全ての凹窩の基底で形態的にペネート細胞と定義される顆粒細胞に特定させる（図６）。染色パターンは、これら細胞中の細胞質の顆粒外見を強調し、免疫応答性は、ペネート細胞顆粒のところで特に強いようにみえる。該抗体はラット及びヒトのペネート細胞の両方で陰性であるので、マウスクリプトジンに特異的である（データは示していない）。繊毛の固有層の白血球もまた陰性であり、これは関連する腸ディフェンシンは貧食細胞又は白血球によって発現されていないことを示唆した。マウスクリプトジン１〜３（図１）の広範囲の類似性によって、クリプトジン−Ｃに対して生成されたポリクローナル抗体は恐らくこの３つのペプチドを認識する。逆にマウスクリプトジン４及び５は顕著にクリプトジン１〜３と異なるので、抗クリプトジン−Ｃ抗体はクリプトジン４及び５と反応しそうもなく、ペネート細胞での起源は未解決のままである。免疫組織化学的データはクリプトジンは腸内腔へ分泌されることを示唆している。小腸内腔の物質は、この抗体に強く陽性であるが、前免疫血清又はＩｇＧに対しては陰性である（図６Ａ及び６Ｂ）。ペネート細胞のディフェンシン分泌に対する作用剤が未知であるが、ペネート細胞顆粒のライソザイム、他のタンパク質組成がコリン作用性調節下で内腔へ分泌される。腸内腔内の抗クリプトジン− Ｃ陽性物質の免疫化学検出と矛盾せずに、成体の空腸及び回腸の生理水洗浄物の酸−尿素ＰＡＧＥは、クリプトジンの移動性とかなり類似しているが区別される移動性を有するペプチドの存在を検出する（図４）。それにも拘わらず、このペプチドは、酸−尿素ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣ解析のいずれによってもクリプトジン１〜５と同一ではなく、クリプトジンが更にプロセッシングされることと一致し得る。考えられることは、内腔クリプトジン又はクリプトジン様物質は、内腔の剥脱性ペネート細胞から誘導されるが、ペネート細胞の遅い速度のターンオーバー（代謝回転）はこれが起こりそうもないことを示唆する。クリプトジン又はプロセッシングされた変異体のペネート細胞による小腸への放出は、白血球によるディフェンシン分泌の明らかな欠落と対照的であり、分泌経路がペネート細胞による小腸内腔へのディフェンシンの本質的な送達のために存在し得ることが推測される。最も豊富なマウス腸ディフェンシンである精製マウスクリプトジン−１の抗微生物活性を、改変プレート拡散アッセイ（レーラーら、J.Imunol.Methods 137:1 67-173 (1991b)）を用いて野性型及びｐｈｏＰ変異体の S.typhimuriumに対して試験した。ｐｈｏＰはマクロファージの内部での S.typhimuriumの菌力及び生き残りに必須な２成分の調節遺伝子座であり（フィールド(Fields)ら、Science 24 3:1059-1062(1989) 、ミラー(Miller)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.86:5054-50 58 (1989)）、この遺伝子座の変異体は、野性型の親株と比較してウサギのディフェンシンＮＰ−１及びＮＰ−２に対して特に感受性である（フィールドら、前述、ミラーら、Infect.Immun.58:3706-3710(1990)）。記述されたアッセイ条件下では、野性型及びｐｈｏＰ変異体生物に対するウサギディフェンシンＮＰ−１の抗微生物活性は、かなり類似している（図８、下段パネル）。一方、希釈された変異体に対して有効なマウスクリプトジン−１の濃度では、野性型 S.typhimuri umは、このペプチドの効果に対して完全に耐性である（図８、上段）。無毒性の S.typhimurium に対するクリプトジン−１の特異な活性は、粘液ディフェンシンに対する耐性が腸内病原体における菌力の発生に特に重要なものであるかもしれない。参考文献を明細書全体にわたって引用する。これら全文の参考文献を援用して本文の一部とし、これに関連する特定の技術の水準をより十分に説明する。実施例１腸ディフェンシンの精製アウトブレッドスイスマウス［（Ｃｒｌ：ＣＤ−１）（ＩＣＲ）ＢＲ］、４５日齢オス（３０〜３５ｇ）又は妊娠期のメスを、チャールス・リバー・ブリーディング・ラボラトリーズ社（ノースウィルミントン、マサチューセッツ州）から入手した。新生児マウスの研究においては、同腹児は出産の１２時間以内の８匹を選別した。マウスを明暗１２時間サイクル下で収容し、餌及び水を与えなかった。空腸及び回腸を頸椎脱臼によって殺したマウスから、そのまま取り出した。個々のマウスの腸内腔を３５ｍｌのＰＢＳでリンスして、洗浄物を３．５ｍｌの氷酢酸を添加し、酸性化して凍結した。洗浄後、個々のマウスの腸をポリトロンホモジナイザ（ブリンクマン・インスツルメント社、ウェストバリー、ニューヨーク州）を用いて３５ｍｌの氷冷３０％ギ酸中で完全に破壊した。ホモジネート（粉砕物）を４℃で１８時間連続的に攪拌して、４℃で３０分間ＳＷ２８．１ロータ中、２７０００ｒｐｍでの遠心分離によって分離し、凍結解凍して８５℃で保存した。腸上皮細胞のシートをＥＤＴＡ灌流によって単離した（ブエルクメル及びチェン、前述）。腸内腔の洗浄の後、麻酔されたマウスを左心室注入によって３０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＣａ⁺⁺／Ｍｇ⁺⁺非含有ハンクス溶液で全身的に灌流した。上皮細胞シートを下層固有層の基底膜から、氷冷Ｍｇ⁺⁺非含有ハンクス緩衝液中で取り出した腸を穏やかに振盪することによって分離した。これら条件下で、純性腸上皮細胞のシートを固有層から剥がし、遠心分離によって濃縮した。低速遠心分離によって沈殿した細胞を３０％のギ酸１０ｍｌ中で前述と同様にホモジナイズした。凍結乾燥した酸抽出物を３０％のギ酸１００ｍｌ中に溶解して、２時間室温で攪拌し、２７０００×ｇで２２℃１時間遠心分離によって分離した。上清を遠心蒸発によって３０ｍｌまで濃縮し、３０％のギ酸に平衡化したＢｉｏ−ＧｅｌＰ −６０の２．５×５５ｃｍカラムによるクロマトグラフにかけた（投入当たり１５ｍｌ）。溶出を２８０ｎｍで連続的にモニターしながら、１５ｍｌ／時間で分画（７．５ｍｌ）を集めた。各分画の２００μｌの試料を凍結乾燥し、３．０Ｍの尿素を含有する５％酢酸３０μｌに溶解させ、１２．５％酸−尿素アクリルアミドゲルに電気泳動した（セルステッド(Selsted) 及びハルウィッグ(Harwig)、 Infect.Immun.55:2281-2286）。タンパク質のバンドをクマジーＲ−２５０で可視化した。推定ディフェンシンを含有する分画は、ペプチドが迅速に移動した（＞０．６ ×Ｒ_fのメチルグリーントラッキング染料）酸−尿素ＰＡＧＥによって、及びペプチドが約４ｋＤａｌのＭ_fｓを有したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、同定された。これらの分画を集めて凍結乾燥し、３０％酢酸６ｍｌに溶解して、Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−６０による再クロマトグラフにかけた。５つの腸ディフェンシンの最終精製を、上述したようにイオン対剤としてＨＦＢＡ及びＴＦＡを用いて、０．４６×２５ｃｍのバイダックＣ−１８カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣによって達成した。実施例２ペプチド特徴付けアミノ酸解析を未改変又は過ギ酸酸化ペプチドの６ＮのＨＣｌ加水分解産物（１５０℃、２時間）において実施した。加水分解産物をフェニルイソチオサイアネートで誘導し、フェニルチオカルバミルアミノ酸を記述されたように定量した（セルステッド及びハルウィッグ、前述、1987。これを援用して本文の記載の一部とする）。ペプチド試料をジチオスレイトールで還元して、配列決定のために４−ビニルピリジンでピリジルエチル化した（ヘンシェン(Henschen)、Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis, ウイットマンーリーボルド(Witt mann-Liebold),Ｂ.ら編、244-255 (1986)）。配列決定はＡＢＩモデル４７７システムにおける自動式エドマン分解（アプライド・バイオシステムス社、フォスターシティ、カリフォルニア州）により実施した。特定の場合にはＣ末端をトリプシンペプチドのアミノ酸解析によって確認した。実施例３抗微生物アッセイ抗微生物活性を、野性型 Salmonella typhimurium (ATTC 10428)又は同系S.ty phimuriumのｐｈｏＰ変異体(CS015 phoP102株::Tn10d-Cam 、ミラーら、前述 19 89)を用いて、寒天拡散アッセイ（レーナーら、前述、1991b)において測定した。 ATTC 10428及びCSO15 を、３７℃でトリプチカーゼソイプロスにおいて対数期まで成育させ、遠心分離により回収し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.４）にｍｌ当たり１×１０⁷ のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）で再懸濁した。各生物１００μｌを４２℃で０．０３％(w/v)トリプチカーゼソイ培地中１％のアガロース１０ｍｌと混合した。ペプチド溶液の試料（５μｌ）を、滅菌処理したパンチでアガロースに形成された3mm直径のウェルへピペット滴下した。３７℃３時間後に、インキュベートしたアガロールプレートを６％トリプチカーゼソイ培地含有１％アガロールで被覆した。１２〜１６時間後に、抗微生物活性を、抗微生物試料でロードされたウェルを包囲する透明帯として示し、この領域は濃度依存性であった。実施例４抗クリプトジン抗体ポリクローナルウサギ抗体を、クリプトジン−１の合成類似物に対して調製した。該ペプチドをクリプトジン−Ｃと称するが、これはクリプトジン−１（図４）の４〜３５残基と一致し、Ｎα−ブトキシカルボニル保護（ケント(Kent)、An n.Rex.Biochem.,57:957-989(1988)）を用いて固相化学法により合成した。合成クリプトジン−ＣのＴＦＡ−トリフルオロメタンスルホン酸を用いた開裂／脱保護の後に、該ペプチドをエチルエーテル中に沈殿させ、減圧下で乾燥させた。１００ｍｇの試料を、２０ｍｇのＤＴＴを含有する６．０Ｍのグアニジン−ＨＣ１、０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、１０ｍｌに溶解した。該試料を窒素でパージして、５０℃で４時間加熱して、脱イオン水で１００倍に希釈し、まず０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）、２０ｍＭのグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌに対して、次いで５％の酢酸に対して、完全に透析した。該試料を凍結乾燥し、５％の酢酸１０ｍｌに溶解し、１×２５ｃｍのバイダックＣ−１８カラムによるＲＰ−ＨＰＬＣに付した。最初の溶出ピークは、約０．５％の粗ペプチドに相当し、これを所望の組成を有するまでアミノ酸解析によって測定した。クリプトジン−Ｃの試料（１．５ｍｇ）を、キャリアに結合せずに、２匹のニュージーランド白ウサギを免疫するためにバークレー・アンチボディ社から得た。血清試料を抗クリプトジンＣ力価がＥＬＩＳＡによる測定で各ウサギに対して大体１：１００００に達するまで１２週間にわたって採取した。ＩｇＧを、ＤＥＡＥエコノ−パッククロマトグラフィ（バイオ・ラド社、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いて、取扱説明書に記載されているようにして抗血清から単離した。実施例５免疫組織化学ホルマリン固定のマウス中位小腸のパラフィン切片を脱パラフィンして、１．１％過酸化水素で４０分間処理し、水で次いでＰＢＳでよく洗浄した。スライドを２０分間３７℃でＰＢＳ中５００μｌ／ｍｌのトリプシンで処理し、ＰＢＳで２回洗浄して、５％のブタの血清で２０分間インキュベートすることによって保護（ブロック）した。スライドをウサギ抗クリプトジンＩｇＧ（血清ＩｇＧ濃度と比較して１：１０希釈）中で２０分間インキュベートして、ブロッキング血清で洗浄した。ブタ抗ウサギＩｇＧを一次抗体とウサギ抗ペルオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ結合物との間の連結試薬として用いた（ダコ・カルペンテリア、カリフォルニア州）。ジアミノベンジジンをペルオキシダーゼ基質として用い、平行インキュベーションを一次抗体と等倍希釈のウサギ前免疫ＩｇＧを用いて実施した。実施例６Ｆｍｏｃ合成、精製及びクリプトジン−１の特徴付けフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−アルギニンを酸不安定リンカーを介して結合したワン樹脂(Wang resin)を用いて、０．１３mmolスケールで合成を開始した。合成は、（樹脂置換と比較して）３倍量のＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）とＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）並びに６倍モル量のＮ−メチルモルホリン（Ｎｍｍ）によりin situ で活性化された３倍量のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で実施した。合成サイクルの間でのＦｍｏｃ除去は、ＤＭＦ中５０％及び２５％ピペリジンのサイクルを用いて達成した。側鎖保護スキームは、下記のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いた：即ち、ＯｔＢｕｔ−アスパラギン酸、Ｐｍｃ−アルギニン、ｔＢｕｔ−チロシン、ｔＢｕｔ−セリン、Ｔｒｔ−システイン、ｔＢｏｃ−リジン、ＯｔＢｕｔ−グルタミン酸、Ｔｒｔ−アスパラギン、ｔＢｕｔ−スレオニン及びＴｒｔ− ヒスチジン。ペプチド鎖を、２つ結合されているロイシン及びバリンを除く全ての付加で単カップリングを用いてシノスタット(Synostat)バッチ合成機において組み立てた。一連のサイクルを下記に挙げる：１．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；２．脱保護：５０％ピペリジンで５分間１×；３．脱保護：２５％ピペリジンで１５分間１×；４．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；５．ＤＭＦ中でアミノ酸＋ＢＯＰ＋ＨＯＢｔを溶解し、反応器へ移転；６．ＲＶへＮｍｍを添加して６０分間混合：並びに、７．ＤＭＦで２分間１×、洗浄アミノ末端残基のカップリングの後に、末端Ｆｍｏｃ基を下記のサイクルを用いて除去した：１．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；２．脱保護：５０％ピペリジンで５分間１×；３．脱保護：２５％ピペリジンで１５分間１×；４．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；５．ジクロロメタンで５分間１×、洗浄；６．イソプロパノールで５分間４×、洗浄；７．Ｎ₂の気流下で１０〜２０分間１×、乾燥；並びに、８．減圧下で１２分間１×、乾燥ペプチド−樹脂の重量を測定して増加量を測定した。ペプチド−樹脂を開裂し脱保護するために、まずジクロロメタンで再度膨潤する。その後、膨潤樹脂を試薬Ｒ９０％のトリフルオロ酢酸、３％のチオアニゾール、３％のエタンジチオール、２％のアニゾールをペプチド−樹脂当たり１０グラムの割合で添加することによって開裂し脱保護する。開裂／脱保護は室温において１８時間窒素下で実施される。開裂混合物を、１〜２ｍｌの新鮮な試薬Ｒで洗浄したシンタード(sci ntered) ガラス漏斗で濾過することによって、樹脂から分離し、５０％酢酸で５倍に希釈した。氷酢酸を最終酢酸濃度５０％まで添加した。この溶液を３回、０．３３容量の塩化メチレンで抽出した。水相を乾燥状態まで凍結乾燥して、５０％酢酸に溶解し、再度、凍結乾燥した。これを３〜４回繰り返した。乾燥ペプチドを３０％の酢酸に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０カラム８００ｍｌに通した。ペプチド含有分画を集めて凍結乾燥し、５％酢酸に溶解して、その後、水で１０倍希釈して、最終タンパク質濃度を約１ｍｇ／ｍｌにした。この溶液のｐＨを水酸化アンモニウムで８．０に調整し、室内空気に開口したビーカー内で室温で磁気攪拌機で迅速に混合した。この溶液のｐＨを４日にわたって定期的に８．０に調整した。その後、この溶液を酢酸でｐＨ３．５まで酸性化して、その後、凍結乾燥した。０．１％のＴＦＡ−水／アセトニトリル濃度勾配を用いてＣ−１８逆相ＨＰＬＣを用いて、折り畳みペプチドを精製した。分画を酸−尿素ゲルで解析して、天然クリプトジン−１と比較した。最初の粗ペプチド調製物５００ｍｇからの収量は、約３０ｍｇであった。合成クリプトジン−１の特徴付け合成クリプトジン−１を、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析において、及び酸−尿素ＰＡＧＥの３つの異なる条件下で、天然ペプチドと比較した。酸−尿素ＰＡＧＥによる解析のために、ペプチドをジチオスレイトールによる還元後又は過ギ酸酸化後に、修飾なしで電気泳動した。記述された全ての条件下で、天然及び合成クリプトジンは同一に挙動した。最終的には、天然及び合成クリプトジンのアミノ酸組成も区別不可能であった。本発明が包含される具体例を参照して記述されるが、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更を行うことができることは理解されるべきである。従って、本発明は下記の請求の範囲によってのみ制限される。配列リスト（１）一般情報 (i)出願人：セレステッド，マイケルＥ．ウレット，アンドレＪ．ミラー，サミュエルＩ． (ii)発明の名称：抗生物クリプトジンペプチド及びその使用方法 (iii)配列の数：１４ (iv)通信宛て先：（Ａ）宛て先：スタンレー，Ｐ．フィッシャー（Ｂ）通り：１３２０ハーバーベイパークウェイスート２２５（Ｃ）都市：アラメーダ（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国：ＵＳＡ（Ｆ）ジップ：９４５０１ (v) コンピュータ読取可能フォーム：（Ａ）媒体タイプ：フロッピディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウ_エア：Patentln Release #1.0 version #1.25 (vi) カレントアプリケーションデータ：（Ａ）出願番号：ＵＳ 07/930,649 （Ｂ）出願日：8月14日1992年（Ｃ）分類： (viii)代理人情報：（Ａ）氏名：スタンレーＰ．フィッシャー（Ｂ）登録番号：24,344 （Ｃ）リファレンス／整理番号：92-054-2PCT (ix) 通信情報：（Ａ）電話：510-748-6868 （Ｂ）テレファックス：510-748-6688 （２）配列番号１の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：５アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号１：（２）配列番号２の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号２：（２）配列番号３の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：６アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号３：（２）配列番号４の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号４：（２）配列番号５の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：１０アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号５：（２）配列番号６の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (ix) 形状：（Ａ）名称／キー：修飾部位（Ｂ）位置：（６）の１つ（Ｃ）他の情報：／note“X=L OR M” (xi) 配列種類：配列番号６：（２）配列番号７の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号７：（２）配列番号８の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：４アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号８：（２）配列番号９の情報 (i) 配列特性（Ａ）長さ：３５アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号９：（２）配列番号１０の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：３５アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号１０：（２）配列番号１１の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：３５アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号１１：（２）配列番号１２の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：３１アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号１２：（２）配列番号１３の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：３５アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号１３：（２）配列番号１４の情報 (i) 配列特性：（Ａ）長さ：３９アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状 (ii) 分子タイプ：ペプチド (xi) 配列種類：配列番号１４：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年５月２３日【補正内容】ペネート細胞顆粒のライソザイム、他のタンパク質組成がコリン作用性調節下で内腔へ分泌される。腸内腔内の抗クリプトジン−Ｃ陽性物質の免疫化学検出と矛盾せずに、成体の空腸及び回腸の生理水洗浄物の酸−尿素ＰＡＧＥは、クリプトジンの移動性とかなり類似しているが区別される移動性を有するペプチドの存在を検出する（図４）。それにも拘わらず、このペプチドは、酸−尿素ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣ解析のいずれによってもクリプトジン１〜５と同一ではなく、クリプトジンが更にプロセッシングされることと一致し得る。考えられることは、内腔クリプトジン又はクリプトジン様物質は、内腔の剥脱性ペネート細胞から誘導されるが、ペネート細胞の遅い速度のターンオーバー（代謝回転）はこれが起こりそうもないことを示唆する。クリプトジン又はプロセッシングされた変異体のペネート細胞による小腸への放出は、白血球によるディフェンシン分泌の明らかな欠落と対照的であり、分泌経路がペネート細胞による小腸内腔へのディフェンシンの本質的な送達のために存在し得ることが推測される。最も豊富なマウス腸ディフェンシンである精製マウスクリプトジン−１の抗微生物活性を、改変プレート拡散アッセイ（レーラーら、J.Imunol.Methods 137:1 67-173(199lb)）を用いて野性型及びｐｈｏＰ変異体の S.typhimuriumに対して試験した。ｐｈｏＰはマクロファージの内部での S.typhimuriumの菌力及び生き残りに必須な２成分の調節遺伝子座であり（フィールド(Fields)ら、Science 24 3:1059-1062(1989) 、ミラー(Miller)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.86:5054-50 58(1989)）、この遺伝子座の変異体は、野性型の親株と比較してウサギのディフェンシンＮＰ−１及びＮＰ−２に対して特に感受性である（フィールドら、前述、ミラーら、Infect.Immun. 58:3706-3710 (1990)）。記述されたアッセイ条件下では、野性型及びｐｈｏＰ変異体生物に対するウサギディフェンシンＮＰ−１の抗微生物活性は、かなり類似している（図７、下段パネル）。一方、希釈された変異体に対して有効なマウスクリプトジン−１の濃度では、野性型 S.typhimu riumは、このペプチドの効果に対して完全に耐性である（図７、上段）。無毒性の S．typhimurium に対するクリプトジン−１の特異な活性は、３．脱保護：２５％ピペリジンで１５分間１×；４．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；５．ＤＭＦ中でアミノ酸＋ＢＯＰ＋ＨＯＢｔを溶解し、反応器へ移転；６．ＲＶへＮｍｍを添加して６０分間混合；並びに、７．ＤＭＦで２分間１×、洗浄アミノ末端残基のカップリングの後に、末端Ｆｍｏｃ基を下記のサイクルを用いて除去した：１．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；２．脱保護：５０％ピペリジンで５分間１×；３．脱保護：２５％ピペリジンで１５分間１×；４．ＤＭＦで２分間４×、洗浄；５．ジクロロメタンで５分間１×、洗浄；６．イソプロパノールで５分間４×、洗浄；７．Ｎ₂の気流下で１０〜２０分間１×、乾燥；並びに、８．減圧下で１２分間１×、乾燥ペプチド−樹脂の重量を測定して増加量を測定した。ペプチド−樹脂を開裂し脱保護するために、まずジクロロメタンで再度膨潤する。その後、膨潤樹脂を試薬Ｒ９０％のトリフルオロ酢酸、５％のチオアニゾール、３％のエタンジチオール、２％のアニゾールをペプチド−樹脂当たり１０グラムの割合で添加することによって開裂し脱保護する。開裂／脱保護は室温において１８時間窒素下で実施される。開裂混合物を、１〜２ｍｌの新鮮な試薬Ｒで洗浄したシンタード(sci ntered) ガラス漏斗で濾過することによって、樹脂から分離し、５０％酢酸で５倍に希釈した。氷酢酸を最終酢酸濃度５０％まで添加した。この溶液を３回、０．３３容量の塩化メチレンで抽出した。水相を乾燥状態まで凍結乾燥して、５０％酢酸に溶解し、再度、凍結乾燥した。これを３〜４回繰り返した。乾燥ペプチドを３０％の酢酸に２０ｍｇ／ｍｌで溶解し、３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０カラム８００ｍｌに通した。請求の範囲１．下記のアミノ酸配列を有する腸起源の実質的に精製されたクリプトジンペプチド：Ｘ₁-Ｃ-Ｘ₂-Ｃ-Ｒ-Ｘ₃-Ｃ-Ｘ₄-Ｅ-Ｘ₅-Ｇ-Ｘ₆-Ｃ-Ｘ₇-Ｃ-Ｃ-Ｘ₈ ここで、Ｘ₁ は３〜６の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₂ は１の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₃ は２又は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₄ は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₅ は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₆ は１の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₇ は６〜１０の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₈ は０〜７の個別に選択されたアミノ酸である。２．下記のアミノ酸配列を有する腸起源の実質的に精製されたクリプトジンペプチド：Ｘ₁-Ｌ-Ｘ₂-Ｃ-Ｙ-Ｃ-Ｒ-Ｘ₃-Ｃ-Ｋ-Ｘ₄-Ｅ-Ｒ-Ｘ₅-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｘ₆-Ｃ-Ｃ- Ｘ₇ Ｘ₁ は１〜４の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₂ は１の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₃ は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₄ は２の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₅ は２の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₆ は６〜９の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₇ は０〜７の個別に選択されたアミノ酸である。３．前記Ｘ₁ がＬＲＤ、Ｇ及びＬＳＫＫから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。４．前記Ｘ₂ がＶ、Ｌ及びＩから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。５．前記Ｘ₃ が＊ＲＧ及びＫＧＨであって、ここで＊がＳ、Ｔ、Ｋ及びＩから成る群より選択されるもの、から成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。６．前記Ｘ₄ がＧＲ、ＲＲ及びＲＧから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。７．前記Ｘ₅ がＭＮ、ＶＲ、及びＶＦから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。８．前記Ｘ₆ がＲＫＧＨＬ（Ｌ／Ｍ）ＹＴＬ（配列番号６）、ＧＩＲＦＬＹ（配列番号３）及ひＲＮＬＦＬＴＦＶＦ（配列番号４）であって、ここで（Ｌ／Ｍ）はＬ又はＭが存在することを示すもの、から成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。９．前記Ｘ₇ がＲ、ＰＲ及びＱから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。１０．前記アミノ酸配列Ｘ₁ 、Ｌ、Ｘ₂ が存在しない請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。１１．下記のものから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する腸起源の実質的に精製されたクリプトジンペプチド：１２．下記の特性を有する実質的に精製されたクリプトジンペプチド：ａ．小腸の上皮細胞において天然にもたらされていること、ｂ．陽イオン電荷を有すること、ｃ．長さが３０〜４０のアミノ酸であること、ｄ．第１のシステイン残基のＮ末端まで３〜６アミノ酸を有すること、ｅ．腸病原体に対する抗微生物活性を示すこと、並びに、ｆ．哺乳細胞に対して、分泌されたときに毒性がないこと。１３．生理学的に許容可能なキャリア中に１以上のクリプトジンペプチドを含有する医薬組成物。１４．下記の工程を含む患者における炎症性病因を検出する方法：ａ．被験者からの生物学的試料中のクリプトジンの量を測定すること、並びに、ｂ．正常被験者における平均量と該量とを比較すること、ここで正常レべルからの有意な偏差は炎症性病因の提示とする。１５．前記クリプトジンの存在が、前記生物学的試料と検出可能な抗クリプトジン抗体とを接触し、該検出可能な抗クリプトジン抗体に対する特異的な結合を測定することによって測定される請求の範囲第１４項記載の方法。１６．前記生物学的試料が腸の組織及び内腔由来のものである請求の範囲第１４項記載の方法。１７．前記有意な偏差が平均の上下１．０と２．０標準偏差である請求の範囲第１４項記載の方法。１８．炎症性病因が炎症性腸疾患、膵臓炎、悪性疾患、感染又は回腸炎である請求の範囲第１４項記載の方法。１９．生理学的に許容可能な媒体中のクリプトジンを投与することを含む患者の腸の炎症を治療する方法。２０．前記患者が免疫無防備状態である請求の範囲第１９項記載の方法。２１．前記免疫無防備状態が、悪性疾患、栄養失調、放射線熱傷、免疫抑制感染、自己免疫疾患、新生児状態、骨髄移植又は化学治療によるものである請求の範囲第１９項記載の方法。２２．前記クリプトジンが、経口投与、経鼻気管内挿入、経腹部カテーテル、静脈投与及びエアロゾル吸入から成る群より選択される方法によって投与される請求の範囲第１９項記載の方法。２３．１以上のクリプトジンを同時に又は連続的に投与する請求の範囲第１９項記載の方法。２４．前記クリプトジンが小腸において放出可能となるように設計された遅延放出配合物で経口投与される請求の範囲第１９項記載の方法。２５．抗クリプトジン抗体。２６．前記抗体がポリクローナル起源である請求の範囲第２５項記載の抗クリプトジン抗体。２７．前記抗体がモノクローナル起源である請求の範囲第２５項記載の抗クリプトジン抗体。２８．保護されたアミノ酸と樹脂とを接触すること、追加の保護されたアミノ酸を連続的にカップリングして保護されたペプチド樹脂を得ること、該樹脂から該保護アミノ酸を開裂して該ペプチドを脱保護することによってペプチドを化学的に合成する方法において、開裂及び脱保護の前に、該保護ペプチド樹脂をジクロロメタンで再膨潤することを含む改良。２９．前記ペプチドがクリプトジンである請求の範囲第２８項記載の方法。３０．手術の前に生理学的に許容可能な培体中のクリプトジンを投与することを念む手術による炎症を防止する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＣＪ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ 9284−4ＣＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (71)出願人ザジェネラルホスピタルコーポレイションアメリカ合衆国 02114 マサチューセッツ州ボストンフルートストリート（番地なし) (72)発明者セレステッド、マイケルイー. アメリカ合衆国 92715 カリフォルニア州アーバインヤングコート 16 (72)発明者ウレット、アンドレジェイ. アメリカ合衆国 01902 マサチューセッツ州リンウルコットロード 16 (72)発明者ミラー、サミュエルアイ. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッツ州ブルックリンジョーダンロード 144 【要約の続き】る方法も提供する．

Claims

【特許請求の範囲】１．下記のアミノ酸配列を有する腸起源の実質的に精製されたクリプトジンペプチド：Ｘ₁-Ｃ-Ｘ₂-Ｃ-Ｒ-Ｘ₃-Ｃ-Ｘ₄-Ｅ-Ｘ₅-Ｇ-Ｘ₆-Ｃ-Ｘ₇-Ｃ-Ｃ-Ｘ₈ ここで、Ｘ₁ は３〜６の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₂ は１の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₃ は２又は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₄ は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₅ は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₆ は１の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₇ は６〜１０の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₈ は０〜７の個別に選択されたアミノ酸である。２．下記のアミノ酸配列を有する腸起源の実質的に精製されたクリプトジンペプチド：Ｘ₁-Ｌ-Ｘ₂-Ｃ-Ｙ-Ｃ-Ｒ-Ｘ₃-Ｃ-Ｋ-Ｘ₄-Ｅ-Ｒ-Ｘ₅-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｘ₆-Ｃ-Ｃ- Ｘ₇ Ｘ₁ は１〜４の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₂ は１の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₃ は３の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₄ は２の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₅ は２の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₆ は６〜９の個別に選択されたアミノ酸であり；Ｘ₇ は０〜７の個別に選択されたアミノ酸である。３．前記Ｘ₁ がＬＲＤ、Ｇ及びＬＳＫＫから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジンペプチド。４．前記Ｘ₂ がＶ、Ｌ及びＩから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。５．前記Ｘ₃ が＊ＲＧ及びＫＧＨであって、ここで＊がＳ、Ｔ、Ｋ及びＩから成る群より選択されるもの、から成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。６．前記Ｘ₄ がＧＲ、ＲＲ及びＲＧから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。７．前記Ｘ₅ がＭＮ、ＶＲ、及びＶＦから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。８．前記Ｘ₆ がＲＫＧＨＬ（Ｌ／Ｍ）ＹＴＬ（配列番号６）、ＧＩＲＦＬＹ（配列番号３）及びＲＮＬＦＬＴＦＶＦ（配列番号４）であって、ここで（Ｌ／Ｍ）はＬ又はＭが存在することを示すもの、から成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。９．前記Ｘ₇ がＲ、ＰＲ及びＱから成る群より選択される請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。１０．前記アミノ酸配列Ｘ₁ 、Ｌ、Ｘ₂ が存在しない請求の範囲第２項記載の実質的に精製されたクリプトジン。１１．下記のものから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する腸起源の実質的に精製されたクリプトジンペプチド：１２．下記の特性を有する実質的に精製されたクリプトジンペプチド：ａ．小腸の上皮細胞において天然にもたらされていること、ｂ．陽イオン電荷を有すること、ｃ．長さが３０〜４０のアミノ酸であること、ｄ．第１のシステイン残基のＮ末端まで３〜６アミノ酸を有すること、ｅ．腸病原体に対する抗微生物活性を示すこと、並びに、ｆ．哺乳細胞に対して、分泌されたときに毒性がないこと。１３．生理学的に許容可能なキャリア中に１以上のクリプトジンペプチドを含有する医薬組成物。１４．下記の工程を含む患者における炎症性病因を検出する方法：ａ．被験者からの生物学的試料中のクリプトジンの量を測定すること、並びに、ｂ．正常被験者における平均量と該量とを比較すること、ここで正常レベルからの有意な偏差は炎症性病因の提示とする。１５．前記クリプトジンの存在が、前記生物学的試料と検出可能な抗クリプトジン抗体とを接触し、該検出可能な抗クリプトジン抗体に対する結合を測定することによって測定される請求の範囲第１４項記載の方法。１６．前記生物学的試料が腸の組織及び内腔由来のものである請求の範囲第１４項記載の方法。１７．前記有意な偏差が平均の上下１．０と２．０標準偏差である請求の範囲第１４項記載の方法。１８．炎症性病因が炎症性腸疾患、膵臓炎、悪性疾患、感染又は回腸炎である請求の範囲第１４項記載の方法。１９．生理学的に許容可能な媒体中のクリプトジンを投与することを含む患者の腸の炎症を治療する方法。２０．前記患者が免疫無防備状態である請求の範囲第１９項記載の方法。２１．前記免疫無防備状態が、悪性疾患、栄養失調、放射線熱傷、免疫抑制感染、自己免疫疾患、新生児状態、骨髄移植又は化学治療によるものである請求の範囲第１９項記載の方法。２２．前記クリプトジンが、経口投与、経鼻気管内挿入、経腹部カテーテル、静脈投与及びエアロゾル吸入から成る群より選択される方法によって投与される請求の範囲第１９項記載の方法。２３．１以上のクリプトジンを同時に又は連続的に投与する請求の範囲第１９項記載の方法。２４．前記クリプトジンが小腸において放出可能となるように設計された遅延放出配合物で経口投与される請求の範囲第１９項記載の方法。２５．抗クリプトジン抗体。２６．前記抗体がポリクローナル起源である請求の範囲第２５項記載の抗クリプトジン抗体。２７．前記抗体がモノクローナル起源である請求の範囲第２５項記載の抗クリプトジン抗体。２８．ペプチドを化学的に合成する方法において、開裂及び脱保護の前に、保護ペプチド樹脂をＴＦＡ含有有機溶媒で再膨潤して、非ＴＦＡ試薬を全て除去することを含む改良。２９．前記ペプチドがクリプトジンである請求の範囲第２８項記載の方法。３０．手術の前に生理学的に許容可能な培体中のクリプトジンを投与することを含む手術による炎症を防止する方法。