JPH10505581A

JPH10505581A - ビトロネクチン結合タンパク質

Info

Publication number: JPH10505581A
Application number: JP8504958A
Authority: JP
Inventors: ジャン−イングマルフロック，; トルケルヴァドストリョーム，; オリンリアング，
Original assignee: ジャン−イングマルフロック，; トルケルヴァドストリョーム，; オリンリアング，
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 1998-06-02
Also published as: EP0776336A1; SE9402490D0; WO1996002566A1

Abstract

(57)【要約】本発明はストレプトコッカス・アウレウス由来の新しいビトロネクチン結合タンパク質に関する。このタンパク質は微生物の感染プロセスに関与している。また本発明は、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質を製造しかつ該タンパク質のビトロネクチンへの結合部位を遮断するのに有用な、アミノ酸配列がAKKQRFRHRNRKGYRであるキンクエデカペプチドに関する。さらに本発明は該タンパク質に対する抗体、前記のタンパク質、ペプチドまたは抗体およびワクチンを含んでなる医薬組成物および診断キットもしくは分析キットに関する。最後に、本発明は、前記ビトロネクチン結合タンパク質をアフィニティーカラムに用いることによるビトロネクチンの精製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ビトロネクチン結合タンパク質発明の技術分野本発明は、ビトロネクチン結合タンパク質、その製造方法、上記タンパク質を製造するのに有用なキンクエデカペプチド（quinquedecapeptide）、上記タンパク質に対する抗体、前記タンパク質を含有する医薬組成物および診断キットもしくは分析キット、医薬組成物の製造のための上記タンパク質の使用、前記タンパク質に対する抗体を含有する診断キットもしくは分析キット、ならびにビトロネクチンの精製方法に関する。関連技術の説明ビトロネクチンは約３００ｍｇ／ｌの濃度で存在する血漿タンパク質である。血漿型のビトロネクチンの主要部分は、ヘパリンまたはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に結合しない。しかし、変性型または固定化型のビトロネクチンはヘパリンとエス・アウレウスの結合を補助している。また、ビトロネクチンが固定マトリックスタンパク質（Stationary matrix protei n）として含有されている場合、エス・アウレウス（S．aureus）はビトロネクチンに結合することができる。エス・アウレウスがマトリックスのビトロネクチンに結合するのを遮断することによって感染プロセスを強く阻害することは非常に有望である。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、細胞付着を行う支持体（substrate）として働く巨大分子の複合混合物で構成されている。潜在的に病原性のブドウ球菌株の多くは、フィブロネクチン［文献１と２］、コラーゲン［文献３，４，５］、ラミニン［文献６］、フィブリノーゲン［文献７］およびビトロネクチン（Ｖｎ）［文献８，９］のようなＥＣＭタンパク質、ならびにＥＣＭ中および真核細胞の表面上に存在するヘパラン硫酸グリコサミノグリカン類［文献１０］に結合する性能を有している。細菌は、宿主のＥＣＭ中のタンパク質の異なる部位と相互に作用する特異的な結合分子類を有している［文献１１］。この付着が感染プロセスにとって極めて重要であるということは早くから報告されている。したがって、これらの結合機能は、抗微生物治療および予防処置の適切な標的である。初期の研究で、スタフィロコッカス・アウレウス菌株Ｖ８の細胞は、受容体− リガンドタイプの相互作用で¹²⁵Ｉ標識化Ｖｎに結合することが実証されている［文献１２，９］。分子質量（molecular mass）が６０ｋＤａのタンパク質が、高アフィニティーブドウ球菌Ｖｎ結合タンパク質として現在同定されている。このタンパク質はキンクエデカペプチド（AKKQRFRHRNRKGYR）カラムで精製された。このペプチドはビトロネクチンのヘパリン結合ドメイン（Ａｌａ３４７〜Ａｒｇ３６１）から誘導される。上記タンパク質の別の精製法は、ＦＰＬＣ Mono − Ｑカラムに基づいた方法であり、ブドウ球菌細胞の表面タンパク質を分離し、Ｖｎ結合性能を保持する６０ｋＤａの細菌タンパク質が得られる。ビトロネクチンに結合する６０ｋＤａのタンパク質はすでに知られている［文献９］。しかしこのタンパク質は精製も特性評価もなされていない。感染症の過程で、細菌は、その表面結合付着素（surface-bound adhesin）を、上皮細胞、内皮細胞、白血球またはＥＣＭ上の利用できる特異的物質と連続して結合させることによって身体部位に定着する。この認識プロセスは、細菌を所定の部位に固定するのに必要であるということは一般に是認されている。これらの結合タンパク質は、宿主の要素を認識する性能に加えて、宿主−寄生虫の相互作用の開始を決定する際に実質的な役割を演じている。これらのタンパク質は、病原体の侵入を、それ自体でまたは二次分子のカスケードを組合せることによって開始させる。多数の細菌の表面結合タンパク質は、まだ開示されておらず、同定もされておらず、分離もされておらず特性評価もなされていないことは疑う余地がない。これらの研究は分子レベルで実施することが重要である。なぜならば、宿主要素と微生物の相互作用の高レベルの知識が得られる可能性があるだけでなく、これらの機構の特性評価を詳細に行うと、一般的な細胞付着方法および特に微生物の定着プロセスについて重要な情報が得られるからである。したがって、病原細菌と細胞外マトリックスの成分、例えばビトロネクチンとの相互作用の機構を理解することが一般に必要である。本発明は、ビトロネクチンに結合する新しいタンパク質およびビトロネクチンのヘパリン結合ドメインから誘導される新しいキンクエデカペプチドの両者を提供するものである。このキンクエデカペプチドは、上記の新しいタンパク質の捕捉に関与しているビトロネクチン領域を構成している。したがって本発明は上記相互作用の機構の一部を解明するものである。発明の要約本発明の第一の態様は、見掛け分子量が６０ｋＤａでキンクエデカペプチドAK KQRFRHRNRKGYRに対してアフィニティーを有しかつＮ末端の配列がMNKTDLINAVAEV ADLVGKVであるビトロネクチン結合タンパク質、またはその変異体、サブフラグメント、マルチプル（multiple）もしくは混合物で構成されている。該タンパク質のビトロネクチン結合領域の部分を、ヌクレオチド配列：がコードしていることが見出された。上記の第一ヌクレオチドで始まる読取り枠からみて、上記配列は次のアミノ酸配列：に相当している。上記ヌクレオチド配列中の文字Ｎは未同定のヌクレオチドであり、上記アミノ酸配列中の未同定のアミノ酸Ｘに相当する。４種の可能なヌクレオチドが４種の可能なアミノ酸：フェニルアラニン、セリン、チロシンまたはシステインを与える。クローンを得て、そのヌクレオチド配列を、K．JacobssonおよびL．Frykberg著（１９９５年）“BioTechniques，Cloning of Ligand-Bindin g Domains of Bacterial Receptors by Phage Display”１８巻、５号、８７８〜８８５頁に記載の一般的な方法で測定した。本明細書および請求の範囲におけるサブフラグメントは、同じ結合特性を相互にもっている各種ドメイン由来の部分を含有する所定のドメインまたはフラグメントの部分フラグメントを意味する。本明細書および請求の範囲における変異体は、元のアミノ酸配列が、１個以上のアミノ酸の挿入、付加、置換、反転（inve rsion）または排除（exclusion）によって修飾もしくは変更されているが結合特性が保持もしくは改善されているタンパク質またはペプチドを意味し機能誘導体も含まれる。また本発明は、結合特性を保持している、結合ドメインのいくつものアレイ（マルチプル）または結合ドメインの混合物を含有するタンパク質に関する。また本発明は、相互に同じ結合特性を有するアミノ酸配列の各種ドメインの混合物に関する。本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様によるビトロネクチン結合タンパク質の製造方法で構成されている。この態様は、ブドウ球菌の菌株、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）Ｖ８株を培養し、この細菌の細胞表面タンパク質の抽出物を製造し、次いで前記抽出物を、ペプチドAKKQRFRHRNRKGYRを用いるアフィニティー精製ステップにかけるかまたは前記抽出物をイオン交換精製ステップにかけることを含んでなる方法で実施することができる。後記の諸実施例に示すように、培養物１００ｍｌから細胞壁タンパク質のタンパク質抽出物０．２ｇを得て、その抽出物から本発明のタンパク質２〜３μｇを得た。エス・アウレウス以外の細菌、例えばスタフィロコッカス属の他の細菌も、上記タンパク質の製造に使用できる。各種の培地、例えばブレーン−ハート・インフュージョン（Brain-Heart Infusion）、ルリア・ブロス（Luria Broth）またはトッド−ヒューイット・ブロス（Todd-Hewitt Broth）（ＴＨＢ）が使用できる。特に好ましい培地はＴＨＢである。使用される培地は、好ましくは、濃厚（ rich）な複合培地（complex medium）でなければならない。上記細菌は、３３〜４２℃、好ましくは３５〜３９℃、そして最も好ましくは３７℃の温度で増殖させることができる。ｐＨは６．７〜７．８の範囲内が適切であり、好ましくは７．０〜７．５であり、そして最も好ましくは、培養は生理的ｐＨ７．３で実施する。ＬｉＣｌによる抽出に代わって酵素消化法も利用できる。また本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の遺伝子を付与されたイー・コリ（E．coli）のような遺伝子加工をなされた宿主を培養することによっても製造することができる。この場合、本発明のタンパク質は、細胞外タンパク質または細胞内タンパク質として提供される。細胞表面から本発明のタンパク質を取出す方法の代わりとして、細胞を崩壊させ、次にその崩壊物を例えば遠心分離、濾過または抽出によって透明にする方法がある。その崩壊は、例えばリゾチーム類、リソスタフィン、アルカリ類、溶媒類または界面活性剤類を用いる化学的方法；浸透圧ショック法、乾燥もしくは凍結−融解法のような物理的方法；高圧法、ビーズミリング法または超音波処理法のような機械的方法によって実施することができる。好ましい崩壊法ではリソスタフィンが使用される。後記実施例２に記載の方法は、以下のステップすなわち沈澱、各種の抽出、吸着、等電点電気泳動および蒸発の１種以上で１種以上のステップを置換するかまたは前記ステップの１種以上を付加することによって変えることができる。後記の実施例３と４に記載のクロマトグラフィーに代わるものとしてはゲル濾過、逆相ＨＰＬＣ、疎水性クロマトグラフィーなどが挙げられる。本発明の第三の態様は、キンクエデカペプチドAKKQRFRHRNRKGYRまたはその変異体；前記キンクエデカペプチドまたはその変異体の有功量ならびに医薬として許容しうる賦形剤、希釈剤および担体を含んでなる医薬組成物で構成されている。上記の賦形剤、希釈剤および担体としては、例えば眼もしくは鼻に用いるローション剤、パスタ剤、クリーム剤、軟膏、すすぎ液に、および局所用の他の組成物にそのまま用いるのに適したすべての公知の薬剤がある。またこの本発明の組成物は、直腸に投与したりまたは硬膏剤で投与することができる。添加剤および投与形態の諸実施例は本発明を限定すると解すべきではなく単に例示するだけである。第三の態様の目的は、細菌が感染して固定（stationary）ビトロネクチンに付着するのを阻害することである。この態様は、このような目的に使用できるペプチドを形成する。本発明の第四の態様は、第一の態様によるビトロネクチン結合タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のような抗体で構成されている。これらの抗体は、対象のタンパク質を投与することによって、動物を、例えば実施例８に示すようにラットを免疫化することによって製造することができた。動物を抗原で免疫化する方法は公知であり、この場合、本発明のタンパク質によって、血液を集め、血清を単離し、次いで該タンパク質と反応する抗体を使用する。またモノクローナル抗体は次のようにして製造することができる。すなわち a)本発明のタンパク質でマウスを免疫化し次いでさらにそれ自体公知の方法で、 b)リンパ球混合物をマウスから単離し、 c)Ｂ−リンパ球をＢ−骨髄腫マウス細胞と融合させてハイブリドーマを製造し、 d)生成したハイブリドーマと雑種を形成していないＢ−骨髄腫細胞との混合物を、生成したハイブリドーマ用の培地に移し、次いで生成したハイブリドーマを、雑種を形成していないＢ−骨髄腫上で培養して選択し、 e)本発明のタンパク質に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマをサブクローン化し、次いで任意に f)抗体を単離する；ことによって製造することができる，６巻，５１１〜５１９頁，１９７６年；Hochkeppelら，Eur．J．Immunol.，１１８巻，４３７〜４４２頁，１９８１年；Secherら，Nature（London），２８５巻，４４６〜４５０頁，１９８０年；MishellおよびShiigi編“Select ed Methods in Cellular Immunology“Freeman & Co．，サンフランシスコ，１９８０年，３７３〜３９７頁のVernonらの報告；Havellら，J．Antimicrob．Ag ．Chemotherap．，２巻，４７６〜４８４頁，１９７２年；Milstein，Scientifi c American，２４３巻，５６〜６４頁，１９８０年１０月；ならびにGrothおよびScheidegger，J．Immunological Methods，３５巻，１〜２１頁，１９８０年にはモノクローナル抗体の製造について記載されている。本発明の抗体は以下に述べるような診断キットまた分析キットに使用できる。また本発明の抗体は、例えば静脈内、筋肉内または皮下の投与に用いる予防剤または治療剤としても使用できる。本発明の抗体は、このように投与すると、処置された生物体に受動免疫が得られる。第三と第四の態様は、特にエス・アウレウスがヒトまたは動物の身体に生体内で侵入するのを阻害する手段を提供することに関する態様であるが、微生物がビトロネクチンに結合する他の微生物感染症は本発明に含まれる。多くの微生物は生物体への侵入を開始するとビトロネクチンに結合する。これらの微生物は、本発明の第三の態様のキンクエデカペプチドと相互に作用するので、かような微生物と本発明の物質の相互作用は本発明に含まれる。かような微生物はすべて本発明の第四態様の抗体と交差反応を行うことができる。したがってこれらの態様は、ビトロネクチンと相互に作用するすべての病原体と関連がある。本発明の第五の態様は、第一態様のビトロネクチン結合タンパク質の有効量および医薬として許容し得る賦形剤、希釈剤または担体を含んでなる医薬組成物；ならびに第一態様のビトロネクチン結合タンパク質の有効量および医薬として許容しうるアジュバントと賦形剤を含んでなるワクチン組成物で構成されている。本発明の医薬組成物に用いる賦形剤、希釈剤および担体には、例えば眼もしくは鼻に用いるローション剤、パスタ剤、クリーム剤、軟膏、すすぎ液に、および局所用の他の組成物にそのまま用いるのに適したすべての公知の薬剤が含まれる。医薬組成物は直腸に投与したりまたは硬膏剤で投与することもできる。添加剤および投与形態のこれらの例は本発明を限定するものではなく単に例示しているに過ぎないと解すべきである。適切なアジュバントは当該技術分野で通常使用されているアジュバントである。適切な賦形剤の例はマンニトール、ラクトース、デンプン、セルロース、グルコースなどであり、少数しか挙げていない。提示する諸実施例は、本発明を限定するとみなすべきではない。第五態様の目的は細菌の付着を競合によって阻害することである。本発明の医薬組成物は、局所に塗布するか、または静脈内、筋肉内、皮下などに投与して細菌の侵入を阻害することができる。本発明のワクチンは、ヒトの身体を含めた哺乳類または他の脊髄動物を免疫化するのに用いることができる。本発明の第六の態様は、第一態様のビトロネクチン結合タンパク質もしくは第三態様のキンクエデカペプチドを含んでなる診断キットもしくは分析キット、または抗体を含んでなる診断キットもしくは分析キットで構成されている。このキットは例えば、第一態様のＶｎＢＰに対する抗体を検定するのに用いることができる。このようにして、生物体が対象の細菌に感染しているか、または生物体が将来感染しないよう免疫によって充分に保護されていることを示すことができる。例えば、妊婦が彼女の子供をかような感染に対して保護するのに充分な抗体を持っているかどうかを確認することができる。または各種の試料も、第一態様のＶｎＢＰの存在について検定することができる。抗体類または本発明のキンクエデカペプチドはこの目的のために使用できる。キットには、第一態様のタンパク質を含有する血清または溶液が、標準物として使用するため入っている。本発明の第七の態様は、アフィニティーカラム内に固定化されたビトロネクチン結合タンパク質を用いることによってビトロネクチンを精製する方法で構成されている。ビトロネクチンは、例えば分子量が大であり凝集する傾向があるので不安定でかつ精製が困難である。本発明のこの第七態様によって、ビトロネクチンは一層容易にかつ安価に製造することができる。図面の簡単な説明図１は本発明のキンクエデカペプチドを認識する細菌タンパク質の単離を示す。６０ｋＤａのブドウ球菌タンパク質を、ペプチドアフィニティーカラムを用いて単離した。左のレーンは分子量マーカーを示す。図２は、Mono−ＱカラムのＦＰＬＣを用いて行ったブドウ球菌細胞表面タンパク質の分離を示す。推定のビトロネクチン結合タンパク質をＶｎＢＰとして示した。図３は、上記推定のＶｎＢＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析の試験結果を示す。レーンａは分子量マーカーであり、レーンｂは固定化Ｖｎに結合する性能を有する画分の銀染色を示し、６０ｋＤａの分子質量を有する単一のバンドを示している。ニトロセルロース膜にトランスブロットされた該タンパク質は、可溶性Ｖｎに結合することができ、続いてウサギ抗Ｖｎポリクローナル抗体（レーンｃ）またはＶｎに対するモノクローナル抗体（レーンｄ）を使って検出された。レーンｅとｆは、Ｖｎをはぶいた場合のそれぞれの対照にあった。図４は、ブドウ球菌細胞表面タンパク質の抽出物からの推定ＶｎＢＰの検出を示す。レーンａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜上でクーマシーブルーで染色したＬｉＣｌ−抽出物の図を示す。レーンｂは、分離されたタンパク質をＶｎでプローブし次いでウサギ抗Ｖｎポリクローナル抗体を用いて検出したことを示す。レーンｃは、Ｖｎをはぶいた場合の上記ウサギ抗体の対照実験の結果を示す。レーンｄは、高濃度の正常ウサギの血清（１：２００）を用いて、菌株Ｖ８由来のブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）を検出したことを示す。図５は、微量定量プレート上に固定化されたＶｎ、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲンに対する³Ｈ−標識化エス・アウレウスの結合に対する合成ペプチドの効果を示す。ペプチド競合の試験結果を、ＰＢＳ対照と比較した相対阻害率として示す。１５量体：キンクエデカペプチド；１３量体：トリデカペプチド。図６は、微量定量プレート検出法を用いて行った推定ＶｎＢＰの検出結果を示す。微量定量プレート上に固定化されたＶｎが捕捉した細菌タンパク質は、ＬｉＣｌによるタンパク質抽出物に対するラットの抗体を用いて検出され、次いでラットＩｇに対する二次抗体によってプローブされた。実施例下記諸実施例は、事実上例示しているだけである。本発明による他の方法は当該技術分野の当業者には分かるであろう。実施例１．細菌株と培養条件スタフィロコッカス・アウレウスの原型菌株Ｖ８すなわち公知のプロデアーゼ産生菌株を、スエーデン、ストックホルムのKarolinska InstituteのStaffan Ar vidsson博士から入手した。その細菌を、２ｌフラスコ内で１００ｍｌ接種物にてトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＢ）（Difco，米国ミシガン州デトロイト）中で旋回振盪器（New Brunswick，米国）上にて激しく攪拌しながら３７℃で２０時間増殖させた［文献１２］。細菌の細胞を後期定常増殖期に、遠心分離（５０００×ｇにて４℃で３０分間）で収穫し、次いで０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。共通の化学薬剤はすべて分析級のの成分には、細菌の付着相互作用に対する副作用は全くなかった［文献１５］。実施例２．細菌細胞表面タンパク質抽出物の調製細胞の溶解を最小にするため、ブドウ球菌細胞表面タンパク質のＬｉＣｌ抽出物を、別のところに記載されているようにして製造した［文献１０］。概略を述べると、細菌１ｇずつを１ＭＬｉＣｌ５ｍｌ中に再浮遊させ、次にその混合物を、旋回振盪器（New Brunswick，米国）上で激しく攪拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。遠心分離（５０００×ｇにて４℃で１５分間）にかけて細菌を沈降させた後、上澄み液を、０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）に対して一夜透析して（膜チュービングＭＷＣＯ：１２−１４０００，Sp ectrum Medical Ｉndustries Inc.，米国カリフォルニア州ロスアンゼルス）、ＬｉＣｌを除いた。透析を行った後、試料を遠心分離し（５０００×ｇ、４℃で１５分間）、次いで透明な上澄み液のタンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質検定法を用いて測定した。次にその抽出物を２ｍｌずつ−２０℃で貯蔵した。実施例３．ビトロネクチン結合タンパク質の精製ヒトビトロネクチンのヘパリン結合共通配列を含有するキンクエデカペプチド（AKKQRFRHRNRKGYR）を結合させた（couple）HiTrap NHSカラム（Pharmacia社）で、ＶｎＢＰを精製した。このようにして精製したＶｎＢＰを図１に示す。合成ペプチド（Ａｌａ³⁴⁷−Ａｒｇ³⁶¹）を認識する細菌タンパク質を下記の手順で単離した。１ｍｌのHiTrap（登録商標）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化アフィニティーカラムを、Pharmaci a社（スエーデン、ウプサラ）から購人した。合成ペプチド５ｍｇを用いて１ｍｌのカラムに結合させ、続いてメーカーの指示にしたがって洗浄と不活性化を行った。結合効率は一般に８５％より高かった。約２ｍｇのタンパク質を含有する約２０ｍｌのＬｉＣｌ抽出物（Bio-Radタンパク質検定法）を、上記ペプチド− カラムに、Ｐ−３ぜん動ポンプ（Pharmacia社）によって加え、続いて４℃にてＰＢＳで平衡化した。そのカラムを１．０ＭＮａＣｌで洗浄してゆるく結合した物質を除き次に０．１Ｍグリシン−ＨＣｌｐＨ３．０で溶離した。溶出液を集めて直ちにトリス（Tris）の結晶（Sigma社）の少数で中和し、次いでPhastSy stem（登録商標）（Pharmacia社）を用いて１２．５％分離ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。次いで、得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、Silver Plus Kit（B io-Rad社）を用いて染色し次いで６５℃のインキュベーター中で乾燥した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色の手順は、メーカーの指示どおりに実施した。上記カラムから、精製タンパク質２０〜３０μｇを得た。実施例４．ビトロネクチン結合タンパク質の精製法の別法ブドウ球菌細胞表面タンパク質を、Mono−ＱカラムのＦＰＬＣを用いて分離した。ＦＰＬＣ（登録商標）Systemによるイオン交換クロマトグラフィー（Pharma cia社、スエーデン、ウプサラ）をMono Ｑ（登録商標）High Resolution５／５カラム（Pharmacia社）で実施した。予備実験で最適化を行い、流量を０．５ｍｌ／ｍｉｎに、記録紙の記録速度を０．２ｃｍ／ｍｉｎに、時間ベースの収集を１ｍｉｎ／画分に、およびＯＤ_280nmを、ＵＶ−Ｍモニタ（Pharmacia社）を用い最適感度範囲として０．２にした。ブドウ球菌表面タンパク質のＬｉＣｌ抽出物の分画は次のようにして実施した。ＦＰＬＣ Systemをまず、最適の２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０（緩衝液Ａ）で平衡化し、次に０．５ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａ（緩衝液Ｂ）で次いで再び緩衝液Ａで平衡化した。パイロット実験で、約０．２ｍｇのタンパク質を含有する抽出液試料（２ｍｌ）を２ｍｌの負荷ループ（loading loop）（Pharmaci a社）を使って負荷し、続いて、安定したベースラインが得られるまで緩衝液Ａを用いて洗浄した。そのクロマトグラフィーの手順は次のとおりであった。緩衝液Ａで５分間平衡化し、試料を４分間Mono-Ｑカラムに負荷し、再び緩衝液Ａを５分間用いてベースラインに戻し、０〜７０％の緩衝液Ｂで３０分間勾配溶離し、７０〜７７．５％の緩衝液Ｂで１０分間勾配溶離し、７７．５〜１００％の緩衝液Ｂで１３分間勾配溶離し、１００％の緩衝液Ｂで５分間溶離し次いで１００％緩衝液Ａで溶離した。スケールアップ実験では１０ｍｌのスーパー負荷ループ（Pharmacia社）を、試料負荷時間２０分で使用したところ、タンパク質分離パターンは再現性があることが実証された。エス・アウレウスのＬｉＣｌ抽出液の分離グラフを図２に示す。上記クロマトグラフィーによって、ブドウ球菌細胞表面由来のいくつもの細菌タンパク質が最適に分割された。時々、いくつかのピークが１〜２分間（０．５〜２ｍｌ）のマージン（margin）で早くもしくは遅れて移動した。我々のパイロット実験と後のスケールアップ実験の両者で、そのクロマトグラムは、容易に再現できることが実証され、したがってすでに刊行されているブドウ球菌細胞表面タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図［文献１０］に対し相補的であった。したがって、細菌細胞表面タンパク質を放出させ分析する便利で安価でありかつ信頼性がある方法が開発されたのであり、多数のこれらタンパク質が同定され特性評価がなされている。実施例５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析ヒトＶｎをYatohgoら［文献１６］に記載されているようにして精製した。その精製した製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６５ｋＤａと７５ｋＤａに対応する２個のバンド）およびマウス抗ヒトＶｎモノクローナル抗体（Boehringer Mannheim GmbH社、ドイツ）によるウェスタンブロット分析で判定した結果均一であり、フィブロネクチンに対する抗体と交差反応を行わなかった。図２にＶｎＢＰとして示した、固定化Ｖｎに結合する有意な性能を有する実施例４由来の諸画分を、プールし、PhastSystem（登録商標）（Pharmacia社）を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥ（PhastSystem Homogenous１２．５％ゲル、Pharmacia社）に付し、次にそのゲルをSilver Stain Plus（Bio-Rad社）で染色した。ＬｉＣｌ −タンパク質抽出液を、４％濃縮用ゲルおよび７．５％の分離用ゲルが入ったMi ni−PROTEAN IIセル（Bio-Rad社）を用いて分離した。その分離されたタンパク質を、ウェスタンブロット実験で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて３０分間６５℃でニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell社）に移した。トランスブロットを行った後、ニトロセルロース膜を、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、室温にて約３時間ブロックし、次にＰＢＳＴ中５μｇ／ｍｌのＶｎとともに室温で１時間インキュベートした。その膜を次に、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの、ウサギ抗Ｖｎポリクローナル抗体（Calbiochem社）またはＶｎに対するモノクローナル抗体（Boehringer Mannheim Biochemica社）とともに、おだやかに攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼを接合されたウサギまたはマウスのＩｇに対する二次抗休を１：１０００に希釈して上記膜に添加した。最終的にこれらの膜を、メーカーの推奨にしたがってブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（Bio- Rad社）で展開した。各ステップ間で、これらの膜を、５ｍｌのＰＢＳＴで５分間ずつ２回洗浄した。図３に示すように、分子質量が６０ｋＤａの単一のタンパク質バンドが、このウェスタンブロット実験において銀染色後に出現した（レーンｂ）。ニトロセルロース膜にトランスブロットされたこのタンパク質は、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度で可溶性Ｖｎに結合する性能をもっており、次いで、ウサギ抗Ｖｎポリクローナル抗体またはＶｎに対するモノクローナル抗体（レーンｃとｅ）を用いて検出した。Ｖｎをはぶいた上記抗Ｖｎの両者による対照実験を行った（レーンｄとｆ）。平行実験で、ニトロセルロース膜にトランスブロットされたＬｉＣｌ抽出物をクーマシーブルーで染色した（図４、レーンａ）。分離したタンパク質をＶｎ（ＰＢＳ中５μ ｇ／ｍｌ）とウサギ抗Ｖｎでプローブしたところ分子質量が６０ｋＤａの単一バンドが出現し（図４、レーンｂ）たが、このことによって、プローブとして ¹² ⁵ Ｉ標識かＶｎを用いて我々が以前に行って刊行した観察結果が確認された。ウサギ抗Ｖｎポリクローナル抗体を用いる対照実験の結果をレーンＣに示してあるが、最も豊富なブドウ球菌表面タンパク質Ａでさえ検出されていなかった。Finc k-Barbanconらが報告した配列分析の結果［文献１３］が、エス・アウレウス菌株Ｖ８すなわちその研究に使用されている菌株由来のタンパク質Ａが、ＩｇＧ結合ドメイン（５８個のアミノ酸）および膜結合領域中に位置する２個のオクタペプチドの反復部分を欠いた新規な構造を有することを示した。高濃度の正常なウサギ血清（１：２００）を用いたところ、弱い（faint）バンドが、分子質量が４５ｋＤａをわずかに超える、菌株Ｖ８由来のブドウ球菌タンパク質Ａを示し（レーンｄ）。このことは既刊行のデータ［文献１３］と一致した。上記細菌細胞表面タンパク質抽出物中の他の成分が、正常なウサギの免疫グロブリンに結合する性能をもっていなかったことは明らかである。実施例６．アミノ酸分析アミノ酸分析を以下のようにして実施した。精製した６０ｋＤａのＶｎ結合タンパク質約５０μｇを、２ｍｇ／ｍｌのフェノールを含有する６ＭＨＣｌを用いて１１０℃で２４時間加水分解させた。そのアミノ酸組成を、ストックホルムのKarolinska InstituteのDepartment of Medical Biochemistry and B iophysicsにおけるProtein and Peptide Unitで測定した。約１．５nmolの精製タンパク質を用い、メタノール性ＨＣｌで脱ブロッキング（de-blocking）処理を行った後にＮ末端配列を測定した［文献１８］。概略を述べると、タンパク質試料を１ＮＨＣｌ含有無水、メタノールに溶解し、生成した混合物を３７℃で５時間インキュベートし、続いて脱イオン水に対し一夜４℃で透析を行い次いで凍結乾燥した。凍結乾燥を行った上記試料を３０％のアセトニトリルに溶解し、次いでスエーデン、ルンド所在のルンド大学のBiomolecular Resource Facility によって配列決定を行った。そのアミノ酸分析結果（表Ｉ）は、６０ｋＤａのＶｎ結合タンパク質が、全残基の２６．９％に相当する高含量のアスパラギン酸／アスパラギン（１２．０％）とグルタミン酸／グルタミン（１４．９％）を含有していることを示している。我々はここで、アミノ酸の組成を比較することによって、本願の研究に記載した６０ｋＤａのＶｎＢＰが、６０ｋＤａ／７２ｋＤａの入り混じったブドウ球菌のレクチン様タンパク質［文献１４］とは明確に異なっていることを示す。表II はＶｎＢＰのＮ末端アミノ酸配列を示す。実施例７．アミノ末端の配列決定エス・アウレウスはヘパリンとヘパラン硫酸に結合する性能を有している［文献１０］。エス・アウレウス抽出液をヘパリンカラムを通過させることによって、該抽出液からヘパリン結合タンパク質を精製した。得られた精製タンパク質を、実施例６にしたがってＮ末端アミノ酸の分析を行った。表IIに示すように、ヘパラン硫酸結合タンパク質とＶｎＢＰは同じタンパク質のようである。実施例８．ＬｉＣｌ抽出物に対する抗体の調製ＬｉＣｌ抽出物に対する抗体を、標準法によってウイスターラットに生成させた。概略を述べると、４頭のラットを各々、ブドウ球菌タンパク質抽出物１００ μｇずつを３週間間隔で３回皮下に注射することによって免疫化した。これら抗原は、第一回の注射ではフロイントの完全アジュバント（Sigma社）とともに投与し、続く２回の注射では不完全アジュバント（Sigma社）とともに投与した。ＬｉＣｌ抽出物に対する抗体力価を、上記細菌タンパク質抽出物でコートした微量定量プレート上でＥＬＩＳＡ法で監視し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（The Binding Sites社、英国バーミンガム）を接合した抗ラットＩｇＳを二次抗体として用いて検出した。そのラットの血清を集め、０．５ｍｌずつに分けて−２０℃で貯蔵した。実施例９．キンクエデカペプチドの合成１５個のアミノ酸の長さペプチド（Ａｌａ³⁴⁷〜Ａｒｇ³⁶¹）を、自動ペプチド合成器（モデル４３０Ａ、Applied Biosystems Inc．）で、ｔ−ブトキシカルボニルで保護された諸アミノ酸を用いて合成し、次にＦＰＬＣで精製した。その合成ペプチドのアミノ酸配列は、Applied Biosystems社からのメーカー指示にしたがって測定した。１３個のアミノ酸の長さのペプチド（Ａｓｎ³⁷¹−Ｌｅｕ³⁸³）ク）から提供していただいたものである。実施例１０．エス・アウレウスと上記キンクエデカペプチドとの間の相互作用キンクエデカペプチド（AKKQRFRHRNRKGYR）が、ビトロネクチンと結合するエス・アウレウスと相互に作用するときの特異性を、放射能標識化エス・アウレウス細胞を、固定化されたビトロネクチン、フィブロネクチンまたはフィブリノーゲンに添加して行う実験で試験した。図５は、ビトロネクチンに対する結合性はキンクエデカペプチド（AKKQRFRHRNRKGYR）によって遮断されたが対照のペプチド（NQNSRRPSRATWL）によっては遮断されなかったことを示している。フィブロネクチンまたはフィブリノーゲンに対する結合性には影響がなかった。細菌の一夜培養物０．５ｍｌを、５０μＣｉの（メチル −³Ｈ）チミジンを含有する５ｍｌＴＨＢで希釈し次いで旋回振盪器上で激しく攪拌しながらさらに５時間増殖させた。得られた³Ｈ標識化細菌をＰＢＳで充分に洗い、次に再び懸濁させて１ｍｌ当り１０⁸個の細胞の最終密度（比活性：約２００ＣＦＵ／ｃｐｍ）にし、直ちに微量定量プレートの付着性検定に使用した。微量定量プレート（９６ウエル）（Costar社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）を、１００μｌＰＢＳ中のＶｎｌ製剤、フィブロネクチン（Sigma Ch emical Co.）またはフィブリノーゲン（Kabi社、スエーデン、ストックホルム）を０．２μｇ／ウエルずつで、一夜４℃にてコートし、次いで余分の結合部位は刊行された方法［文献１７］と同様に、０．０５％Tween−２０含有ＰＢＳ中３％ＢＳＡを３７℃で２時間用いて遮断した。³Ｈ標識化細菌（約５×１０⁶ＣＦＵまたは２．５×１０⁴ｃｐｍ）５０μｌを、対照としてＰＢＳで一連の濃度にした競合ペプチド５０μｌずつとともにプレートに添加した。これら混合物を３７ ℃で１時間インキュベートし、次いで微量定量プレートと結合した細菌の最終量を、３％ＳＤＳ１５０μｌとともに室温で１時間インキュベートし次いで別の３％ＳＤＳ１５０μｌで洗浄することによって放出させた。Ready-Safe（登録商標）Liquid Scintillation Cocktail（Beckman社）５ｍｌを用い、Liquid Scint illation System LS 1801（Beckman社）で放射能を測定した。上記の各ステップ間で微量定量プレートをＰＢＳ−Tweenで３回ずつ洗浄することが不可欠であった。実施例１１．ビトロネクチン結合タンパク質の検出ビトロネクチン結合タンパク質（ＶｎＢＰ）を検出するため、微量定量プレート（９６ウエル、Costar社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）を、１００ μｌＰＢＳ中のＶｎ（０．２０μｇ／ウエル）を用いて４℃で一夜コートし、非特異的結合部位を、０．１％Tween−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中３％のＢＳＡを３７℃で２時間用いて遮断した。２ｍｌ試料（２００μｇタンパク質を含有）のパイロット実験で、実施例４のようにして得た、ＦＰＬＣからの１．５ｍｌずつの画分（３ｍｉｎ／ｍｌ）を集め、４℃で一夜、多量の脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥し最後に２００μｌのＰＢＳ中に再び懸濁させ、直ちに、Ｖｎ結合活性を試験するためＶｎでコートされた微量定量ウエルに加えた。これら混合物を３７℃で１時間インキュベートした。結合した細菌細胞表面タンパク質を、ＬｉＣｌ抽出物に対するラットの抗体（１：１０００）およびペルオキシダーゼ（The Binding Sites社、英国バーミンガム）を接合したラットＩｇに対する二次抗体（１：１０００）を用いて検出した。これら各ステップ間で微量定量プレートをＰＢＳＴで３回ずつ洗浄することが不可欠であった。これらのプレートを、メーカーが推奨するように、０．１Ｍクエン酸−リン酸塩緩衝液ｐＨ５．０および約０．０１％過酸化水素中の１，２−フェニレンジアミン（DAKO社、デンマーク、グローストラップ）で展開した。これらのプレートを、Bio-Rad ELISA読取り装置を用いて４９０ｎｍにて読取った。二重反復試験を何度も繰返し行い全体を平均した。この様な検定の代表的な結果を図６に示す。２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０中０．１５ＭＮａＣｌの溶離緩衝液Ｂの約３０％、すなわち９ｍｌの溶離容積において、Ｖｎ結合活性がピークになった。１８ｍｌの溶離容積すなわち緩衝液Ｂの７０％の直前でかなり高いバックグランドが検出された。これは恐らくその画分のかなり支配的なタンパク質内容物が原因である。１３．５ｍｌの溶離容積におけるピークおよび２２．５〜２７ｍｌの溶離容積間の二つのピークに、程度の小さい高バックグランドが生じた（６図）。２ｍｌの実験（２００μｇの細菌タンパク質を含有）から約２〜３μｇのＶｎＢＰを回収することができたが、これはブドウ球菌細胞表面タンパク質の約１〜１．５％が６０ｋＤａＶｎＢＰであったことを示唆している。このような推定は１０ｍｌの実験でも正しかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年８月１９日【補正内容】請求の範囲１．見掛けの分子量が６０ｋＤａでビトロネクチンおよびキンクエデカペプチドAKKQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）に親和性を有し、かつＮ末端配列MNKTDLINA VAEVADLVGKV（配列番号：１）を有するブドウ球菌から誘導しうるビトロネクチン結合タンパク質、ならびに本質的に同じ結合特性を有する、前記タンパク質の変異体、サブフラグメント、マルチプルまたは混合物。２．医療用途に用いる請求の範囲１記載のタンパク質。３．ブドウ球菌菌株、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス菌株Ｖ８を培養し、その細菌の細胞表面タンパク質の抽出物を調製し、次いで好ましくは前記抽出物を、ペプチドAKKQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）を用いるアフィニティー精製ステップに付すことによって前記タンパク質を精製することを含んでなる、請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質の製造方法。４．医療用途に用いる、キンクエデカペプチドAKKQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）、および前記キンクエデカペプチドと本質的に同じ結合特性を有する該キンクエデカペプチドの変異体。５．請求の範囲４に記載のペプチドの医薬として有効な量ならびに医薬として許容しうる賦形剤、希釈剤および担体を含んでなる医薬組成物。６．細菌の付着を阻害するのに用いる医薬組成物を製造するための請求の範囲４記載のペプチドの使用。７．ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のような、請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質に対する抗体。８．請求の範囲７記載の抗体、または請求の範囲１に記載のビトロネクチン結合タンパク質、そのタンパク質と本質的に同じ結合特性を有する、そのタンパク質の変異体、サブフラグメント、マルチプルもしくは混合物の医薬として有効な量、ならびに医薬として許容しうる賦形剤、希釈剤および／または担体を含んでなる医薬組成物。９．請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質の医薬として有効な量および医薬として許容しうるアジュバントおよび／または賦形剤を含んでなるワクチン組成物。１０．ブドウ球菌感染症に対する医薬組成物を製造するための、請求の範囲７記載の抗体または請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質の使用。１１．請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質および／または請求の範囲４記載のペプチドおよび／または請求の範囲７記載の抗体の有効量が入っている診断キットまたは分析キット。１２．請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質をアフィニティーカラムに用いることによるビトロネクチンの精製方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 7/08 7/08 16/12 16/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:445） (72)発明者フロック，ジャン−イングマルスウェーデン，エス−161 28 ブロンマ，ソンガルヴェーゲン２ (72)発明者ヴァドストリョーム，トルケルスウェーデン，エス−224 67 ルンド, レクトルスヴェーゲン７ (72)発明者リアング，オリンスウェーデン，エス−127 47 スケルホルメン，エクホルムスヴェーゲン 157 ボヴィン内

Claims

【特許請求の範囲】１．見掛けの分子量が６０ｋＤａでビトロネクチンとキンクエデカペプチドAK KQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）に対して親和性を有する、ブドウ球菌から誘導できるビトロネクチン結合タンパク質、ならびに本質的に同じ結合特性を有する、前記タンパク質の変異体、サブフラグメント、マルチプルまたは混合物。２．Ｎ−末端配列MNKTDLINAVAEVADLVGKV（配列番号：１）を有する請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質。３．ブドウ球菌菌株、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス菌株Ｖ８を培養し、その細菌の細胞表面タンパク質の抽出物を調製し、次いで好ましくは前記抽出物を、ペプチドAKKQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）を用いるアフィニティー精製ステップに付すことによって前記タンパク質を精製することを含んでなる、請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質の製造方法。４．キンクエデカペプチドAKKQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）、および前記キンクエデカペプチドと本質的に同じ結合特性を有する該キンクエデカペプチドの変異体。５．請求の範囲４に記載のキンクエデカペプチドAKKQRFRHRNRKGYR（配列番号：２）の医薬として有効な量ならびに医薬として許容しうる賦形剤、希釈剤および担体を含んでなる医薬組成物。６．ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のような、請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質に対する抗体。７．請求の範囲６記載の抗体、または請求の範囲１に記載のビトロネクチン結合タンパク質、そのタンパク質と本質的に同じ結合特性を有する、そのタンパク質の変異体、サブフラグメント、マルチプルもしくは混合物の医薬として有効な量、ならびに医薬として許容しうる賦形剤、希釈剤および／または担体を含んでなる医薬組成物。８．請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質の医薬として有効な量および医薬として許容しうるアジュバントおよび／または賦形剤を含んでなるワクチン組成物。９．ブドウ球菌感染症に対する医薬組成物を製造するための、請求の範囲６記載の抗体または請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質の使用。１０．請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質および／または請求の範囲４記載のキンクエデカペプチドおよび／または請求の範囲６記載の抗体の有効量が人っている診断キットまたは分析キット。１１．請求の範囲１記載のビトロネクチン結合タンパク質をアフィニティーカラムに用いることによるビトロネクチンの精製方法。