CN118005809A - 一组Kunitz型嵌合多肽及其应用 - Google Patents
一组Kunitz型嵌合多肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118005809A CN118005809A CN202410222639.8A CN202410222639A CN118005809A CN 118005809 A CN118005809 A CN 118005809A CN 202410222639 A CN202410222639 A CN 202410222639A CN 118005809 A CN118005809 A CN 118005809A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- namp
- namp48
- sequence
- wild
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 153
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 152
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 151
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 22
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 8
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241001147657 Ancylostoma Species 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 241001465677 Ancylostomatoidea Species 0.000 description 12
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 12
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 12
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 11
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 10
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 8
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 8
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 8
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 description 4
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 4
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100268602 Arabidopsis thaliana ABCI7 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 229940019334 heparin group antithrombotic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- -1 acAP6 Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 241000498253 Ancylostoma duodenale Species 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013142 Disinhibition Diseases 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical class [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一组Kunitz型嵌合多肽及其应用，所述Kunitz型嵌合多肽的序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明还涉及所述嵌合多肽在抗凝血中的应用。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一组Kunitz型嵌合多肽及其应用。
背景技术
抗凝药物对于血栓栓塞性等相关疾病的治疗具有重要的意义[1]。钩虫是一种常见的吸血性的人体寄生虫，主要寄生于宿主小肠及十二指肠等部位，以其口囊咬附于肠黏膜上吸血为生，寄生人体中的钩虫主要有美洲钩虫和十二指肠钩虫。钩虫在长期进化过程中，为了适应摄食和自身生存，而进化出有效的抗血液凝固机制，钩虫的分泌物中有抗血液凝固的物质，使宿主被咬伤的肠黏膜不易凝血，有利于钩虫吸取宿主的血液，这一特性暗示钩虫分泌的抗凝多肽为很有前景的抗凝多肽药物[2]。
迄今为止已发现的钩虫抗凝多肽有20种，来源于犬钩虫、十二指肠钩虫、锡兰钩虫(表1)。其中犬钩虫来源的抗凝多肽有14种：AcAP、AcAPc2、NAPc2、AcAPc3、AcAPc4、AcAP5、NAP5、AcAP6、NAP6、AcaNAP7、AcaNAP8、AcaNAP10、AcaNAP11、Ac-AP-12；十二指肠来源的抗凝多肽有3种：AduNAP1、AduNAP4、AduNAP7；锡兰钩虫来源的抗凝多肽有3种：AceAP、AceKI、AceKI-1。结构上，现在已报到的钩虫抗凝多肽都含有l0个半胱氨酸残基，可以形成5对分子内二硫，具有典型的Ascaris型结构模体[3,4]。这些结构高度相似的钩虫抗凝多肽，分别通过抑制凝血过程中关键因子FXa、FXIa、TF/VIIa复合物等而发挥抗凝作用。其中FXa抑制剂有10种：AcAP、AcAP5、NAP5、AcAP6、NAP6、Ac-AP-12、AduNAP4、AceAP1、AceKI和AceKI-1；FXIa抑制剂有3种：AduNAP4、AcaNAP10和AcaNAP11，它们都是双靶点抑制剂；TF/VIIa抑制剂有7种：AcAPc2、NAPc2、AcAPc3、AcAPc4、AcaNAP10、AcaNAP11及AceAP1。还有AcaNAP7、AcaNAP8、AduNAP1、AduNAP7进行了体外凝血时间测定，发现可以明显延长PT、APTT，具有抗凝的功能，但是作用机制不清楚，有待进一步研究[5,6]。
目前已发现的钩虫抗凝多肽都为Ascaris家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有高度的序列同源性和相同的二硫键配对，相似的β-链，并包含一个C端扩展。特别是NAP5和NAP6序列同源性高达90％，C端延伸是严格保守的。而AcAPc2与NAP5只有45％的序列相同，AcAPc2的C端扩展更长[7,8]。Kunitz型多肽，是一类广泛分布的丝氨酸蛋白酶抑制剂[9.10]。基于钩虫基因组和转录组的生物信息学分析显示：钩虫中有大量的Kunitz型多肽序列资源，但是其抗凝功能研究未见报道[11]。据此，课题组前期开展了十二指肠钩虫Kunitz多肽的抗凝功能筛选的研究，发现了两个Kunitz型钩虫抗凝多肽Adk3和Namp48。提示：钩虫体内的Kunitz型多肽功能和作用机制的研究还具有很大的潜力和研究前景。
基于此，提出本发明。
[参考文献]
[1]Zhang L,Li Z,Ye X,et al.Mechanisms of thrombosis and researchprogress on targeted antithrombotic drugs[J].Drug Discov Today,2021,26(10):2282-2302.
[2]Abuzeid AMI,Zhou X,Huang Y,et al.Twenty-five-year researchprogress in hookworm excretory/secretory products[J].Parasit Vectors,2020,13(1):136.
[3]Zhu Y,Lin Y,Liu X,et al.Identification of AcAP5 as a novel factorXa inhibitor with both direct and allosteric inhibition[J].BiochemBiophys ResCommun,2017,483(1):495-501.
[4]Jiang D,Zhan B,Mayor RS,et al.Ac-AP-12,a novel factor Xaanticoagulant peptide from the esophageal glands of adult Ancylostoma caninum[J].Mol BiochemParasitol,2011,177(1):42-8.
[5]陈耀哲,邓莉,邵正,et al.十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1的原核表达及其抗凝活性研究[J].中国病原生物学杂志,2016,11(07):611-614+619.
[6]彭礼飞,邓莉,杨陈,et al.十二指肠钩虫抗凝蛋白AduNAP7的原核表达、纯化及抗凝活性鉴定[J].中国人兽共患病学报,2007,(10):1021-1025.
[7]Huang Y,Abuzeid AMI,Liu Y,et al.Identification and localization ofhookworm platelet inhibitor in Ancylostomaceylanicum[J].Infect Genet Evol,2020,77:104102.
[8]Zhu W,Gao H,Luo X,et al.Cloning and identification of a newmultifunctional Ascaris-type peptide from the hemolymph of ButhusmartensiiKarsch[J].Toxicon,2020,184:167-174.
[9]Gan W,Deng L,Yang C,et al.An anticoagulant peptide from the humanhookworm,Ancylostoma duodenale that inhibits coagulation factors Xa and XIa[J].FEBS Lett,2009,583(12):1976-80.
[10]Mohammed BM,Matafonov A,Ivanov I,et al.An update on factor XIstructure and function[J].Thrombosis Research,2018,161:94-105.
[11]Chapman PR,Giacomin P,Loukas A,et al.Experimental humanhookworminfection:a narrative historical review[J].PLoSNegl Trop Dis,2021,15(12):e0009908.
发明内容
本发明首先涉及一组Kunitz型嵌合多肽，所述嵌合多肽为，以野生型Namp48多肽为骨架，使用野生型Adk3多肽的部分氨基酸序列，替换骨架部分对应的序列后获得的多肽；
所述的野生型Namp48多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，所述的野生型Adk3多肽的序列如SEQIDNO.14所示；
优选的，所述的替换指，
(1)使用野生型Adk3的KNWTHICSLDP序列，替换野生型Namp48多肽的DONLFCLMPP序列
(2)使用野生型Adk3的EEGPCRALFV序列，替换野生型Namp48多肽的DPGFCRAILR序列
(3)使用野生型Adk3的NYYFDKDTGK序列，替换野生型Namp48多肽的RWAWNPVEER序列
(4)使用野生型Adk3的CEQFIYGGCE序列，替换野生型Namp48多肽的CERFEYGGCG序列
(5)使用野生型Adk3的GNDNNFEDEA序列，替换野生型Namp48多肽的GNRNNFKTQK序列
(6)使用野生型Adk3的ECRRRCGAR序列，替换野生型Namp48多肽的ECLYECWNKFV序列。
更优选的，所述的嵌合多肽为
Namp48-T1，氨基酸的序列如SEQIDNO.1所示，编码核酸的序列如SEQIDNO.7所示；
Namp48-T2，氨基酸的序列SEQIDNO.2所示，编码核酸的序列如SEQIDNO.8所示；
Namp48-T3，氨基酸的序列SEQIDNO.3所示，编码核酸的序列如SEQIDNO.9所示；
Namp48-T4，氨基酸的序列SEQIDNO.4所示，编码核酸的序列如SEQIDNO.10所示；
Namp48-T5，氨基酸的序列SEQIDNO.5所示，编码核酸的序列如SEQIDNO.11所示；
Namp48-T6，氨基酸的序列SEQIDNO.6所示，编码核酸的序列如SEQIDNO.12所示。
本发明还涉及包含所述嵌合多肽或其编码核酸的药物组合物，所述的药物组合物包括，治疗有效量的所述嵌合多肽或其编码核酸，以及必要的药用辅料。
本发明还涉及所述嵌合多肽或其编码核酸在制备抗凝血药物中的应用，优选的，所述的抗凝血药物为抗内源性凝血(APTT途径)的药物或抗外源性凝血(PT或TT途径)的药物。
本发明的有益效果在于，
利用生物信息学分析，基于两个Kunitz型钩虫抗凝多肽Adk3和Namp48，设计新型嵌合突变体；利用天然多肽抗凝活性检测平台，从中筛选出具有抗凝活性的多肽，为活性多肽抗凝药物的研发提供新型先导多肽。
附图说明
图1、pET-28a质粒图谱。
图2、野生型Namp48与野生型Adk3的序列比对，可以看出Namp48和Adk3都是典型的Kunitz多肽，6个半胱氨酸形成3对二硫键。
图3、野生型多肽Namp48与Adk3的空间结构比对，A为美洲钩虫抗凝多肽Namp48的三维空间结构，B为十二指肠钩虫抗凝多肽Adk3的三维空间结构。
图4、新型突变体多肽Namp48-T1～Namp48-T6的设计，Namp48-T1为Namp48Ⅰ区替换为Adk3的Ⅰ区，Namp48-T2为Namp48Ⅱ区替换为Adk3的Ⅱ区，Namp48-T3为Namp48的Ⅲ区替换为Adk3的Ⅲ区，Namp48-T4为Namp48的Ⅳ区替换为Adk3的Ⅳ区，Namp48-T5为Namp48的Ⅴ区替换为Adk3的Ⅴ区，Namp48-T6为Namp48的Ⅵ区替换为Adk3的Ⅵ区。
图5、新型突变体多肽Namp48-T1～Namp48-T6的RP-HPLC纯化，图A、B、C、D、E、F分别为Namp48-T1、Namp48-T2、Namp48-T3、Namp48-T4、Namp48-T5、Namp48-T6这6个突变体蛋白的HPLC纯化图。X轴为程序HPLC的运行时间，Y轴为吸光度的数值，波长设置为230nm。
图6、野生型Namp48与Namp48-T1～Namp48-T6的抗凝活性评价，图A、B、C分别表示，野生型多肽Namp48与6个新型突变体多肽对APTT、PT、TT延长时间倍数的差异。X轴为野生型多肽Namp48(519.11nM)与6个新型突变体多肽Namp48-T1(511.88nM)、Namp48-T2(520.57nM)、Namp48-T3(524.12nM)、Namp48-T4(517.6nM)、Namp48-T5(523.58nM)、Namp48-T6(537.37nM)，Y轴分别为APTT、PT、TT时间倍数。
图7、Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对三个凝血途径的影响，A、B、C为多肽Namp48-T2延长APTT、PT和TT的时间倍数图，X轴为多肽Namp48-T2的浓度梯度(0、7.8125nM、15.625nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM)，Y轴分别为APTT时间倍数、PT时间倍数和TT时间倍数；D、E、F为多肽Namp48-T4延长APTT、PT和TT的时间倍数图，X轴为多肽Namp48-T4的浓度梯度(0、7.8125nM、15.625nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM)，Y轴分别为APTT时间倍数、PT时间倍数和TT时间倍数；G、H、I为多肽Namp48-T6延长APTT、PT和TT的时间倍数图，X轴为多肽Namp48-T6的浓度梯度(0、7.8125nM、15.625nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM)，Y轴分别为APTT时间倍数、PT时间倍数和TT时间倍数。
图8、Namp48及3个突变体多肽对四个凝血因子抑制活性评价，A表示312.5nM多肽Namp48及突变体与Kallikrein孵育后，Kallikrein的残留酶活性；X轴为312.5nM多肽Namp48及3个突变体；Y轴为Kallikrein的残留酶活性；B表示10nM多肽Namp48及3个突变体与FXIa孵育后，FXIa的残留酶活性；X轴为10nM多肽Namp48及3个突变体；Y轴为FXIa的残留酶活性；C表示625nM多肽Namp48及3个突变体与FXa孵育后，FXa的残留酶活性；X轴为625nM多肽Namp48及3个突变体；Y轴为FXa的残留酶活性；D表示625nM多肽Namp48及3个突变体与Plasmin孵育后，Plasmin的残留酶活性；X轴为625nM多肽Namp48及3个突变体；Y轴为Plasmin的残留酶活性。
图9、突变体多肽Namp48-T6的4个凝血因子抑制活性评价，A、B、C、D、分别表示设置的浓度梯度的多肽Namp48-T6与Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin这4个不同凝血因子孵育后，这4个凝血因子残留酶活性的变化曲线。X轴为多肽Namp48-T6的浓度梯度，针对Kallikrein、FXa和Plasmin，多肽浓度设置为(0、78.125nM、156.25nM、312.5nM、625nM、1250nM、2500nM)，针对活性更好的凝血因子FXIa，多肽浓度设置为(0、10nM、20nM、40nM、80nM、160nM、320nM)，Y轴为这4个不同凝血因子的残留酶活性。
图10、Namp48及Namp48-T6体内出血风险评价，X轴为生理盐水对照组、10mg/kgNamp48组、10mg/kg Namp48-T6组、10mg/kg肝素组，Y轴为小鼠尾部出血时间。采用GraphPadPrism 8.0.1软件对数据进行单因素方差分析。
具体实施方式
表达质粒
原核表达体系中的pET28a质粒由本实验室保存，质粒图谱如图1所示。本实验选择两个酶切位点为：Nde I和Xho I，其余试剂和耗材等为常规可商购试剂/耗材。
抗凝多肽Namp48结构区域划分和新型多肽嵌合体的分子设计
用DNAMAN软件对Kunitz多肽Namp48和Adk3的氨基酸序列分析比对(图2)，根据序列和结构特征设计嵌合体Kunitz多肽。
Namp48的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，SEQIDNO.13：
DONLFCLMPPDPGFCRAILRRWAWNPVEERCERFEYGGCGGNRNNFKTQKECLYECWNKFV
Adk3的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示，SEQIDNO.14：
KNWTHICSLDPEEGPCRALFVNYYFDKDTGKCEQFIYGGCEGNDNNFEDEAECRRRCGAR
具体的，
(1)将钩虫抗凝多肽Namp48与Adk3进行序列比对和结构比对，发现二者都有三级结构保守性和一级结构的多样性(图3)。
(2)根据野生型多肽Namp48和野生型多肽Adk3序列比对的结果和模拟的蛋白构型，把Namp48和Adk3分别划分为6个区域，再利用嵌合的方法设计出Namp48-T1至Namp48-T6这6个突变体多肽。这6个突变体Namp48-T1～Namp48-T6是以野生型Namp48为骨架，嵌合野生型Adk3的序列(图4)：
Namp48-T1为Namp48Ⅰ区替换为Adk3的Ⅰ区，序列如SEQIDNO.1所示，SEQIDNO.1：
KNWTHICSLDPDPGFCRAILRRWAWNPVEERCERFEYGGCGGNRNNFKTQKECLYECWNKFV
Namp48-T2为Namp48Ⅱ区替换为Adk3的Ⅱ区，序列如SEQIDNO.2所示；SEQIDNO.2：
DQNLFCLMPPEEGPCRALFVRWAWNPVEERCERFEYGGCGGNRNNFKTQKECLYECWNKFV
Namp48-T3为Namp48的Ⅲ区替换为Adk3的Ⅲ区，序列如SEQIDNO.3所示；SEQIDNO.3：
DQNLFCLMPPDPGFCRAILRNYYFDKDTGKCERFEYGGCGGNRNNFKTQKECLYECWNKFV
Namp48-T4为Namp48的Ⅳ区替换为Adk3的Ⅳ区，序列如SEQIDNO.4所示；SEQIDNO.4：
DQNLFCLMPPDPGFCRAILRRWAWNPVEERCEQFIYGGCEGNRNNFKTQKECLYECWNKFV
Namp48-T5为Namp48的Ⅴ区替换为Adk3的Ⅴ区，序列如SEQIDNO.5所示；SEQIDNO.5：
DQNLFCLMPPDPGFCRAILRRWAWNPVEERCERFEYGGCGGNDNNFEDEAECLYECWNKFV
Namp48-T6为Namp48的Ⅵ区替换为Adk3的Ⅵ区，序列如SEQIDNO.6所示，SEQIDNO.6：
DQNLFCLMPPDPGFCRAILRRWAWNPVEERCERFEYGGCGGNRNNFKTQKECRRRCGAR。
编码嵌合体多肽的核苷酸序列为：
实施例1、寄生钩虫Kunitz家族多肽的表达、纯化和定量
1.1寄生钩虫表达载体的转化
1、生工生物公司以pET-28a为载体，合成重组质粒。将质粒干粉于12000rpm、2min条件下进行离心，并按照相对应的说明书将质粒干粉配制为溶液，并震荡离心。最后取2μL质粒溶液加入感BL21受态细胞中，于冰上冰浴30分钟。剩余的质粒溶液，封口后于-20℃储存。
2、将转化的EP管于42℃金属浴中热激90秒，再立即放置于冰上冰浴5分钟。
3、在超净工作台中，向转化的EP管里加入500μL无抗性Luria-Bertani液体培养基，后于37℃、180rpm条件下培养45分钟。
4、将复苏扩增后的菌液于3700rpm、5min条件下离心，吸取450μL上清弃去，反复吹打余下的菌液使沉淀重悬。
5、将重悬后的菌液涂布于浓度为0.003％Kana的Luria-Bertani平板中，平板在37℃恒温培养箱中培养14～18个小时。
6、37℃恒温培养结束后，从平板上挑取3个大小一致的单克隆菌落接种于500μL含0.003％Kana的Luria-Bertani液体培养基，于37℃、250rpm条件下培养9小时。培养好的菌液为了长久保存，加入250μL 75％的甘油，做好标记后用封口膜封口，于-20℃冰箱保存。
1.2寄生钩虫Kunitz家族多肽的大肠杆菌异源蛋白表达
1、将100μL Namp系列的蛋白表达菌液，接入0.003％ Kana的Luria-Bertani液体培养基中，置于气浴恒温振荡器中，于37℃、150rpm条件下培养11-12小时。
2、用量筒取50mL过夜活化的表达菌液，接入1000mL含0.003％ Kana的Luria-Bertani液体培养基中，于37℃、210rpm条件下培养2小时左右，当菌液的OD值为0.4左右时，加入IPTG进行诱导，再37℃、210rpm条件下继续培养4小时。
3、诱导结束后，利用Eppendorf低温高速离心机于4℃、6000rpm条件下6～8min进行收菌。向收集的菌体中加入25mL的冰PBS，使菌体重悬。再使用超声破壁机进行超声破壁，破壁的条件为：80W，工作3秒，间歇8秒，共22min。经过超声破壁后的菌体于4℃、12000rpm的条件下离心20min，弃上清收集底下的沉淀，此沉淀即为包涵体。
4、在收集的包涵体中加入10mL的冰PBST，并充分混匀，再冰浴10～30min，于4℃、5000g条件下离心15min，弃去上清。再重复此步骤一次，得到纯度较高的包涵体蛋白。
5、包涵体蛋白变性：在5mL变性液中加入0.15g的GSH，并搅拌均匀，放于25℃变性2小时。
6、包涵体蛋白的复性：将变性完成的包涵体于20℃、12000rpm条件下离心20min，弃沉淀取上清。在500mL冰复性液中加入0.06g GSSG，将离心后的上清逐滴加入500mL的复性液中，边滴加边搅拌。滴加完成后将复性液于16℃复性16小时。
1.3寄生钩虫Kunitz家族多肽的包涵体蛋白纯化
1、将复性后的蛋白液于4℃、12000rpm条件下离心20分钟，弃沉淀。使用3KD的超滤管将复性液上清于4℃、4000rpm条件下离心40分钟，直至蛋白浓缩液的体积＜5mL。
2、将蛋白浓缩液按1mL/管进行分装，每1mL蛋白浓缩液中加入10μL 10％ TFA，于4℃、12000rpm条件下离心20min，将离心后的上清液移至新EP管中，做好标记后再次离心5min，用RP-HPLC仪进行蛋白浓缩液的纯化。
3、HPLC仪器的流速为4mL/分钟，上样体积＜5mL。HPLC仪器使用的是C18反向柱，其流动相为溶液B-0.1％ TFA(体积比)，溶液D-90％乙腈+0.1％ TFA。洗脱梯度为60分钟的线性洗脱梯度，初始时B液为95％，D液为5％；结束时B液为5％，D液为95％；检测波长为230nm。
4、纯化的蛋白液收集后，先标记清楚，再放于-80℃冰箱保存。
结果显示，采用和野生型多肽Namp48使用同样的表达方式，利用大肠杆菌异源表达体系，成功制备了Namp48的这6个突变体蛋白Namp48-T1、Namp48-T2、Namp48-T3、Namp48-T4、Namp48-T5、Namp48-T6，出峰时间约为23min(图5)。
1.4寄生钩虫Kunitz家族多肽的冻干和分装
将HPLC纯化后的蛋白液放于-80℃冰箱预冻8小时以上，再使用真空冷冻冻干机把预冻好的蛋白液冻干成粉末，再往蛋白干粉中加灭菌好的冰ddH2O。加灭菌冰ddH2O原则是5万峰面积加1mL灭菌冰ddH2O，其中蛋白的峰面积是HPLC程序自动计算出来的。
把重新溶解的蛋白液再分装至1.8mL的冻存管中，每管装500μL。把分装好的蛋白液用冷冻干燥机再次冻干为蛋白干粉，标注好蛋白的名称、分装时间等信息。
实施例2、寄生钩虫Kunitz家族多肽的抗凝功能筛选
2.1多肽的APTT功能检测
1、打开MD Pacific TSA 9000C全自动凝血仪，根据标本数量计算所需的清洗液、APTT试剂、CaCl2溶液，其中APTT试剂50μL/次、CaCl2溶液50μL/次，并把这些试剂放入规定区间。
2、把配制好浓度的多肽取25μL和50μL健康人血浆进行混匀，再冰上孵育15min。
3、在全自动血凝仪上输入样品信息，并设置进行APTT检测。
4、15min冰浴后，把样品按照设置的位置一一对应放置。
5、将仪器检测的数据导入Graph Pad Prism，绘制多肽的浓度依赖曲线图。
2.2多肽的PT功能检测
1、打开MD Pacific TSA 9000C全自动凝血仪，根据标本数量计算所需的清洗液、PT试剂，其中PT试剂100μL/次，PT试剂并把这些试剂放入规定区间。
2、把配制好浓度的多肽取25μL和50μL健康人血浆进行混匀，再冰上孵育15min。
3、在全自动血凝仪上输入样品信息，并设置进行PT检测。
4、15min冰浴后，把样品按照设置的位置一一对应放置。
5、将仪器检测的数据导入Graph Pad Prism，绘制多肽的浓度依赖曲线图。
2.3多肽的TT功能检测
1、打开MD Pacific TSA 9000C全自动凝血仪，根据标本数量计算所需的清洗液、PT试剂，其中TT试剂100μL/次，并把这些试剂放入规定区间。
2、把配制好浓度的多肽取25μL和100μL健康人血浆进行混匀，再冰上孵育15min。
3、在全自动血凝仪上输入样品信息，并设置进行TT检测。
4、15min冰浴后，把样品按照设置的位置一一对应放置。
5、将仪器检测的数据导入Graph Pad Prism，绘制多肽的浓度依赖曲线图。
结果显示
(1)对野生型多肽Namp48及Namp48-T1～Namp48-T6这6个新型突变体蛋白进行APTT功能检测，比较延长APTT时间倍数的差异。PBS为阴性对照，延长的APTT时间倍数为1。当多肽终浓度为5μg/mL时，
Namp48延长的APTT时间倍数为>29.27(由于Namp48的APTT检测时间超过仪器检测的上限1200秒，故仪器检测结果只能显示为>1200秒)，
Namp48-T1峰1延长的APTT时间倍数为8.54±0.25，
Namp48-T1峰2延长的APTT时间倍数为7.19±0.14，
Namp48-T2延长的APTT时间倍数为22.41±0.002，
Namp48-T3峰1延长的APTT时间倍数为5.34±0.13，
Namp48-T3峰2延长的APTT时间倍数为3.71±0.03，
Namp48-T4延长的APTT时间倍数为9.99±0.09，
Namp48-T5延长的APTT时间倍数为15.83±0.001，
Namp48-T6延长的APTT时间倍数为22.42±0.002(图6A)。
(2)对野生型多肽Namp48及Namp48-T1～Namp48-T6这6个新型突变体蛋白进行PT功能检测，比较延长PT时间倍数的差异。PBS为阴性对照，延长的PT时间倍数为1。当多肽终浓度为5μg/mL时，
Namp48延长的PT时间倍数为>7.66(由于Namp48的PT检测时间超过仪器检测的上限120秒，故仪器检测结果只能显示为>120秒)，
Namp48-T1峰1延长的PT时间倍数为1.19±0.03，
Namp48-T1峰2延长的PT时间倍数为1.16±0.01，
Namp48-T2延长的PT时间倍数为>9.84(由于Namp48-T2的PT检测时间超过仪器检测的上限120秒，故仪器检测结果只能显示为>120秒)，
Namp48-T3峰1延长的PT时间倍数为1.25±0.08，
Namp48-T3峰2延长的PT时间倍数为1.08±0.008，
Namp48-T4延长的PT时间倍数为4.76±0.04，
Namp48-T5延长的PT时间倍数为>8.51(由于Namp48-T5的PT检测时间超过仪器检测的上限120秒，故仪器检测结果只能显示为>120秒)，
Namp48-T6延长的PT时间倍数为1.96±0.02(图6B)。
(3)对野生型多肽Namp48及Namp48-T1～Namp48-T6这6个新型突变体蛋白进行TT功能检测，比较延长TT时间倍数的差异。PBS为阴性对照，延长的PT时间倍数为1。当多肽终浓度为5μg/mL时，
Namp48延长的TT时间倍数为3.98±0.15，
Namp48-T1峰1延长的TT时间倍数为1.01±0.01，
Namp48-T1峰2延长的TT时间倍数为0.99±0.00，
Namp48-T2延长的TT时间倍数为6.51±0.47，
Namp48-T3峰1延长的TT时间倍数为1±0.005，
Namp48-T3峰2延长的TT时间倍数为0.99±0.01，
Namp48-T4延长的TT时间倍数为6.62±0.46，
Namp48-T5延长的TT时间倍数为2.38±0.07，
Namp48-T6延长的TT时间倍数为1±0.01(图6C)。
通过APTT、PT、TT活性比较，我们对其中三个突变体Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6进行抗凝机制的研究。
先对筛选出来的Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6这三个突变体进行APTT、PT、TT浓度依赖，比较这三个肽抗凝活性的差异。
(1)Namp48-T2对三个凝血途径都有很强的抑制作用，在最高浓度500nM时，对APTT、PT、TT这三个途径延长的时间倍数分别为22.21、10.59、5.9；
(2)Namp48-T4对这三个凝血途径也都有抑制作用，但没有Namp48-T2的抗凝活性强，Namp48-T4在最高浓度500nM时，对APTT、PT、TT这三个途径延长的时间倍数分别为8.88、4.68、5.91；
(3)Namp48-T6对APTT途径有很强的抑制作用，但是对PT途径的抑制作用几乎没有，对TT途径的抑制作用完全丧失，在最高浓度500nM时，对APTT、PT、TT这三个途径延长的时间倍数分别为15.98、1.76、1.01(图7)。
综上，通过嵌合体设计，我们发现了对APTT、PT和TT三个途径都有较好抑制活性的 多肽Namp48-T2和Namp48-T4，这与野生型Namp48一致，但是具体抑制活性有差异；同时，发 现一个选择性APTT途径的多肽Namp48-T6。
实施例3、寄生钩虫抗凝多肽的抗蛋白酶功能研究
3.1 Kallikrein、FXIa和FXa的抑制活性检测
1、取25μL工作浓度的酶和25μL不同浓度的多肽依次加入96孔板孔内，阴性对照为凝血因子Buffer。
2、另一排孔中加入80μL工作浓度的发光底物溶液。
3、加样完成后将96孔板于37℃、90rpm条件下孵育15min，孵育完成后置于酶标仪上。
4、用排枪向每个[E]-[I]混合物孔中加入50μL工作浓度的发光底物溶液，把酶标仪检测波长设置为405nm，检测时间设置为6min，每隔1分钟检测1次，共检测7次。
5、将测得数据导入Graph Pad Prism，绘制浓度依赖曲线，计算抑制率。
3.2 Plasmin的抑制活性检测
1、取50μL工作浓度的Plasmin和50μL不同浓度的多肽依次加入96孔板孔内，阴性对照为凝血因子Buffer。
2、另一排孔中加入120μL的纤溶酶发光底物。
3、加样完成后将96孔板于37℃、90rpm条件下孵育15min，孵育完成后置于酶标仪上。
4、用排枪向每个[E]-[I]混合物孔中加入100μL工作浓度的发光底物溶液，把酶标仪检测波长设置为405nm，检测时间设置为6min，每隔1分钟检测1次，共检测7次。
5、将测得数据导入Graph Pad Prism，绘制浓度依赖曲线，计算抑制率。
由于野生型多肽Namp48对Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin这四个凝血因子有很强的抑制活性，所以我们检测Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6这三个新型突变体对以上四个凝血因子的抑制活性，同样使用底物发光法的方法进行检测。结果显示，
(1)多肽Namp48及三个突变体Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对Kallikrein的抑制结果：
当多肽浓度为312.5nM时，多肽Namp48及三个突变体多肽Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对Kallikrein的抑制率分别为63.54％、98.27％、30.4％、76.32％(图8A)。
(2)多肽Namp48及三个突变体多肽Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对FXIa的抑制结果：
当多肽浓度为10nM时，多肽Namp48及三个突变体多肽Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对FXIa的抑制率分别为89.29％、96.63％、47.03％、88.86％(图8B)。
(3)多肽Namp48及三个突变体Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对FXa的抑制结果：
当多肽浓度为625nM时，多肽Namp48及三个突变体多肽Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对FXa的抑制率分别为64.32％、80.54％、25.98％、78.78％(图8C)。
(4)多肽Namp48及三个突变体Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对Plasmin的抑制结果：
当多肽浓度625nM时，多肽Namp48及三个突变体多肽Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6对Plasmin的抑制率分别为93.76％、97.11％、95.68％、90.66％(图8D)。
进一步的，通过对筛选出来的突变体多肽Namp48-T2、Namp48-T4、Namp48-T6进行抗凝功能和抗凝机制的综合评价，我们筛选出Namp48-T6这个抑制内源性凝血途径的突变体多肽，且Namp48-T6对FXIa也有很好的抑制作用。于是我们对Namp48-T6进行Kallikrein、FXIa、FXa和Plasmin抑制活性检测，对其抗凝机制进行初步评价(图9)。
实施例4、小鼠断尾模型检测抗凝药效
1、实验分组
将24只健康的且体重相近的C57BL/6雄性小鼠分为三组，每组有6只小鼠。按照体重相近为一组原则，把这24只老鼠分为生理盐水组、多肽Namp48组(10mg/kg)、多肽Namp48-T6组(10mg/kg)、肝素组(10mg/kg)。
2、建立C57BL/6断尾模型的方法
以生理盐水组为例进行操作展示：
用10％水合氯醛，按4mL/kg剂量对C57BL/6雄性小鼠进行腹腔麻醉。在手术板上将小鼠仰卧固定，用细线或橡皮筋适当扎紧老鼠尾巴的根部，捏住尾尖，用暖风机吹暖鼠尾，使尾部静脉血管充盈便于注射。距离尾尖1/3～1/2处注射100μL供试品。计时15分钟后，量取尾尖5mm处剪断鼠尾，立即计时小鼠尾尖的出血时间。
实验结果(图10)显示，
生理盐水组出血时间为54.67±7.97秒，
Namp48组出血时间为396.67±34.99秒，
Namp48-T6组出血时间为161.83±8.28秒，
肝素组出血时间为4725.5±303.04秒。
综上实施例可见，本工作通过设计新型嵌合突变体，
(1)发现了两个新的抗凝活性多肽，其对PT途径或TT途径的抑制，相比野生型多肽Namp48多肽有明显的提高；
(2)发现一个选择性抑制APTT途径的抗凝多肽Namp48-T6，对筛选出来的Namp48-T6利用断尾模型评估出血风险，发现与野生型多肽Namp48比，给药后出血风险较低。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质内容，不用于限定本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一组Kunitz型嵌合多肽，所述嵌合多肽为，以野生型Namp48多肽为骨架，使用野生型Adk3多肽的部分氨基酸序列，替换骨架部分对应的序列后获得的多肽；
所述的野生型Namp48多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的野生型Adk3多肽的序列如SEQ ID NO.14所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合多肽，其特征在于，所述的替换指，
(1)使用野生型Adk3的KNWTHICSLDP序列，替换野生型Namp48多肽的DONLFCLMPP序列
(2)使用野生型Adk3的EEGPCRALFV序列，替换野生型Namp48多肽的DPGFCRAILR序列
(3)使用野生型Adk3的NYYFDKDTGK序列，替换野生型Namp48多肽的RWAWNPVEER序列
(4)使用野生型Adk3的CEQFIYGGCE序列，替换野生型Namp48多肽的CERFEYGGCG序列
(5)使用野生型Adk3的GNDNNFEDEA序列，替换野生型Namp48多肽的GNRNNFKTQK序列
(6)使用野生型Adk3的ECRRRCGAR序列，替换野生型Namp48多肽的ECLYECWNKFV序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合多肽，其特征在于，所述的嵌合多肽为
Namp48-T1，其氨基酸的序列如SEQ ID NO.1所示，编码核酸的序列如SEQ ID NO.7所示；
Namp48-T2，其氨基酸的序列SEQ ID NO.2所示，编码核酸的序列如SEQ ID NO.8所示；
Namp48-T3，其氨基酸的序列SEQ ID NO.3所示，编码核酸的序列如SEQ ID NO.9所示；
Namp48-T4，其氨基酸的序列SEQ ID NO.4所示，编码核酸的序列如SEQ ID NO.10所示；
Namp48-T5，其氨基酸的序列SEQ ID NO.5所示，编码核酸的序列如SEQ ID NO.11所示；
Namp48-T6，其氨基酸的序列SEQ ID NO.6所示，编码核酸的序列如SEQ ID NO.12所示。
4.包含权利要求1-3任一所述嵌合多肽或其编码核酸的药物组合物，所述的药物组合物包含：治疗有效量的所述嵌合多肽或其编码核酸，以及必要的药用辅料。
5.权利要求1-3任一所述嵌合多肽或其编码核酸在制备抗凝血药物中的应用，优选的，所述的抗凝血药物为抗内源性凝血(APTT途径)的药物或抗外源性凝血(PT或TT途径)的药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410222639.8A CN118005809A (zh) | 2024-02-28 | 2024-02-28 | 一组Kunitz型嵌合多肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410222639.8A CN118005809A (zh) | 2024-02-28 | 2024-02-28 | 一组Kunitz型嵌合多肽及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118005809A true CN118005809A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90956185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410222639.8A Pending CN118005809A (zh) | 2024-02-28 | 2024-02-28 | 一组Kunitz型嵌合多肽及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118005809A (zh) |
-
2024
- 2024-02-28 CN CN202410222639.8A patent/CN118005809A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9187524B2 (en) | Broad spectrum antibiotic arylomycin analogs | |
| US20160297851A1 (en) | Broad spectrum antibiotic arylomycin analogs | |
| Hooda et al. | Neisserial surface lipoproteins: structure, function and biogenesis | |
| Ren et al. | Design and evaluation of a multi-epitope assembly peptide vaccine against Acinetobacter baumannii infection in mice | |
| NZ229206A (en) | Hybrid-dna molecule from s. dysgalactiae coding for a protein or peptide with fibronectin binding properties | |
| CN102639140A (zh) | 新型肽、其制备方法及其用途 | |
| Bahrani et al. | Proteus mirabilis fimbriae: N-terminal amino acid sequence of a major fimbrial subunit and nucleotide sequences of the genes from two strains | |
| CN118005809A (zh) | 一组Kunitz型嵌合多肽及其应用 | |
| Podbielski et al. | Cysteine protease SpeB expression in group A streptococci is influenced by the nutritional environment but SpeB does not contribute to obtaining essential nutrients | |
| Chow et al. | Characterization of Pen n 13, a major allergen from the mold Penicillium notatum | |
| Astaneh et al. | Filamentous hemagglutinin adhesin FhaB limits A. baumannii biofilm formation | |
| CN114206371A (zh) | 用于控制克雷伯氏菌属的克雷伯菌素 | |
| CN108404119B (zh) | Fgf-21类似物的制备及在血栓治疗中的应用 | |
| CN114057866B (zh) | 一种具有抑菌和溶血功效的水蛭多肽及其应用 | |
| EP0342173A2 (en) | Fibronectin binding protein as well as its preparation | |
| Nguyen et al. | Cloning, high-level expression, purification and characterization of a staphylokinase variant, SakøC, from Staphylococcus aureus QT08 in Escherichia coli BL21 | |
| CN118005776A (zh) | 一种埃及血吸虫Kunitz多肽变体及其应用 | |
| CN110437328A (zh) | 一种猪干扰素α突变体YNS及其制备方法和应用 | |
| CN118005775A (zh) | 一组选择性抑制游离凝血酶激活的凝血反应的抗凝多肽 | |
| JPH11235181A (ja) | 新規ｔｉｇ | |
| US6342233B1 (en) | Pseudomonas treatment composition and method | |
| CN109456388B (zh) | 提高重组HpaA对幽门螺旋杆菌感染保护的脂肽及其激发机体免疫应答的方法和制剂 | |
| KR100230959B1 (ko) | 갈색거저리 유충에서 분리한 항진균 단백질 및재조합 미생물을 이용한 그의 제조방법 | |
| WO2005023851A1 (en) | Plasminogen/plasmin binding polypeptides and nucleic acids therefore | |
| Chow et al. | Expression of recombinant human glucose-dependent insulinotropic polypeptide in Escherichia coli by sequence-specific proteolysis of a protein A fusion protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |